EA031278B1 - Парвовирус свиней 5а, способы применения и вакцина - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение обеспечивает новые нуклеотидные последовательности, белковые последовательности, иммуногенные композиции, вакцины и способы, которые относятся к созданию или применению нового парвовируса свиней 5A (PPV5A), который инфицирует, среди прочих, домашних свиней. Композиции и способы обеспечивают определение инфекций, вызванных указанным новым вирусом, мониторинг генетических изменений в вирусных последовательностях у диких и домашних животных и в стадах, а также создание и применение новых вакцин для защиты животных от инфекции этим вирусом.

Description

Настоящее изобретение обеспечивает новые нуклеотидные последовательности, белковые последовательности, иммуногенные композиции, вакцины и способы, которые относятся к созданию или применению нового парвовируса свиней 5А (?ГУ5А), который инфицирует, среди прочих, домашних свиней. Композиции и способы обеспечивают определение инфекций, вызванных указанным новым вирусом, мониторинг генетических изменений в вирусных последовательностях у диких и домашних животных и в стадах, а также создание и применение новых вакцин для защиты животных от инфекции этим вирусом.

Список последовательностей

Данная заявка содержит список последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. 1.821-1.825. Список последовательностей, который сопровождает данную заявку, является введенным в нее в качестве ссылки. Указанная ASCII копия, созданная 21 марта 2013 г., имеет название 10-0150-WO-l-SEQ.txt и размер 34,542 бит.

Предпосылки создания изобретения

A. Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение является связанным с областью здоровья животных и относится к новым штаммам парвовируса свиней, которые включают аттенуированные штаммы для вакцинации, способам производства и способам лечения при использовании вакцин, полученных из указанных новых штаммов парвовируса.

B. Описание области техники

Парвовирусы инфицируют широкое разнообразие видов животных, и некоторые из них являются ответственными за тяжелые клинические заболевания, однако большинство этих вирусов вызывают только слабые или субклинические инфекции. Они принадлежат к семейству Parvoviridae и образуют два подсемейства: Densovirinae, члены которого инфицируют насекомых, и Parvovirinae, члены которого инфицируют позвоночных животных. Последнее подсемейство в настоящее время включает 5 родов: Dependovirus, Erythrovirus, Amdovirus, Bocavirus и Parvovirus (1).

Вирионы парвовируса не имеют оболочки и содержат одноцепочечные, линейные геномы на основе ДНК размером приблизительно 5-6 килобаз (кб). Геном состоит из двух основных открытых рамок считывания (ORF), которые кодируют неструктурные и капсидные белки. Недавно описанные Bocaviruses содержат третью ORF между двумя основными ORF (1).

Классические штаммы парвовируса свиней (PPV1) рода Parvovirus широко распространены во всем мире и являются ответственными за репродуктивные расстройства у свиней, в частности в стадах, где протоколы вакцинации не соблюдаются правильно или эффективность вакцины снижается из-за иммуносупрессивных факторов. В течение последнего десятилетия ряд новых парвовирусов был обнаружен у свиней. Они включают в себя парвовирус свиней 2 (PPV2) (2) и родственные вирусы (3). Новая группа парвовирусов свиней и коров, а именно группа гоковирусов (PHoV, BHoV), была обнаружена в Гонконге (4), и эти вирусы были определены как такие, которые являются генетически сходными с человеческими PARV4 и 5. Несмотря на то, что они первоначально назывались гоковирусами в честь Гонконга, была предложена новая классификация PHoV как PPV3 (5). PPV4 демонстрирует наибольшее сходство с коровьим парвовирусом 2, но кодирующая способность и организация генома являются аналогичными таковым бокавирусов, поскольку PPV4 кодирует дополнительную ORF3, как и бокавирусы, расположенную между ORF1 и ORF2. Однако кодируемый PPV4 путативный белок ORF3, существенно отличается от такого бокавирусов (5).

Существует постоянная потребность в мониторинге свиней в отношении появления новых вирусов и для разработке вакцин, лечения и способов обнаружения новых вирусов.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к новым нуклеотидным последовательностям, последовательностям белка, иммуногенным композициям, вакцинам и способам, которые относятся к созданию и применению новых штаммов парвовируса, которые заражают, в частности, домашних свиней. Эти штаммы относятся к новым парвовирусам свиней, идентифицированным в образцах тканей, полученных от клинически больных домашних свиней; на основе гомологии последовательности с известными видами и штаммами парвовируса свиней, новый вирус был обозначен как парвовирус свиней 5А или PPV5А.

Композиции и способы в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают обнаружение инфекций с помощью указанного нового вируса, мониторинг генетических изменений в вирусных последовательностях у диких и домашних животных и скота, а также создание и применение новых вакцин для защиты животных от инфекции вирусом.

Иммуногенные композиции и вакцины в соответствии с изобретением включают полипептидные последовательности, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, или их иммуногенные фрагменты, необязательно включающие адъюванты для индуцирования более мощного иммунного ответа.

Типичные композиции в соответствии с изобретением включают любую из полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ NO: 4 или их фрагменты, которые являются иммунореактивными с антителами, специфичными для PPV5А. Предпочтительные полипептиды в соответствии с изобретением включают последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, в частности SEQ ID NO: 4. Предпочтительно такие полипептиды или их фрагменты являются иммунореактивными с антителами, специфичными для PPV5А.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют один или несколько полипептидов, конструкции антител или конъюгаты антител. Генные последовательности, кодирующие полипептиды, включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая является по крайней мере на 95%, 90%, 85% или даже 80% гомологичной и/или иден

- 1 031278 тичной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1, в частности нуклеотидные последовательности 2845-5547 SEQ ID NO: 1 (белок капсида) или фрагменты SEQ ID NO: 1, кодирующие полипептид, который является иммунореактивным с антителами, специфичными для PPV5A. Примеры последовательностей нуклеиновых кислот в соответствии с изобретением включают любую из последовательностей нуклеотидов 1975-2844 SEQ ID NO: 1, нуклеотиды 2845-5547 SEQ ID NO: 1, и фрагменты, которые кодируют полипептид, который является иммунореактивным с антителами, специфичными для PPV5A. Предпочтительно, когда последовательности нуклеиновых кислот или гены представляют собой такие, которые кодируют полипептид или пептид, который является иммунореактивным с антителом, специфичным для PPV5A.

Кроме того, полипептид в соответствии с изобретением, как используется в данной заявке, включает, но без ограничения таковым, полипептид, который включает:

i) полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4;

ii) полипептид, который является по крайней мере на 80% гомологичным и/или идентичным с полипептидом i);

iii) фрагмент полипептидов соответствии с i) и/или ii);

iv) фрагмент iii) или iv), который включает по крайней мере 5, предпочтительно 8, более предпочтительно 10, еще более предпочтительно 15 последовательных аминокислот, включенных в последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4;

v) полипептид, который кодируется полинуклеотидом, который включает последовательность нуклеотидов 1975-2844 SEQ ID NO: 1, или нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1;

vi) полипептид, который кодируется полинуклеотидом, который является по крайней мере на 80% гомологичным или идентичным полинуклеотиду в соответствии с vi);

vii) фрагмент белка, который кодируется полинуклеотидом, который включает по крайней мере 15, предпочтительно 24, более предпочтительно 30, даже более предпочтительно 45 смежных нуклеотидов, которые включены в последовательности нуклеотидов 1975-2844 SEQ ID NO: 1 или нуклеотидов 28455547 SEQ ID NO: 1.

Иммуногенные композиции в соответствии с настоящим изобретением, которые содержат по крайней мере один или более полипептидов PPV5A, как определено в данной заявке, могут дополнительно содержать физиологически приемлемый носитель, такой как фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант или их комбинации.

Любой из полипептидов PPV5A, которые обеспечиваются в данной заявке, или любая из иммуногенных композиций, содержащих один или более полипептидов PPV5A, которые обеспечиваются в данной заявке, могут быть использованы в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве вакцины или иммуногенной композиции, предпочтительно для профилактики или для лечения субъекта от инфекции PPV5A,

Особенно предпочтительные PPV5A полипептиды включают такие с иммуногенными эпитопами, которые индуцируют иммунологический ответ, специфический для PPV5A. Предпочтительные PPVA полипептиды включают те, которые имеют аминокислотные последовательности, прогнозируемые в родственных PPV1 в качестве поверхностных антигенов (Simpson и др. JMB 315, 2002) и включают, но не ограничиваются таковыми, остатки 141-156, 272-278, 329-339 последовательности SEQ ID NO: 4.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что композиции, используемые в данной заявке, могут включать известные инъекционные, физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентерального введения или инфузии являются доступными водные изотонические растворы, например, физиологический раствор или растворы белка плазмы крови. Кроме того, иммуногенные композиции и вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут включать приемлемые для ветеринарии носители, разбавители, изотонические агенты, стабилизаторы или адъюванты.

Способы в соответствии с изобретением включают, но не ограничиваются таковыми, способ индукции иммунного ответа против PPV5A инфекции у субъекта, включающий стадию введения субъекту иммуногенной композиции, содержащей один или более PPV5A полипептидов, как определено в данной заявке. Предпочтительно, когда иммунный ответ индуцируется против более чем одного серотипа или штамма PPV5A. Композиции в соответствии с изобретением могут быть использованы для лечения или, в качестве альтернативы, для предотвращения инфекции PPV5A. Предпочтительно такой иммунный ответ снижает частоту возникновения и тяжесть одного или более клинических симптомов, связанных с или вызванных инфекцией одним или более серотипами PPV5A.

В данной заявке подходящие субъекты и субъекты, которые в этом нуждаются и которым могут быть введены композиции в соответствии с изобретением, включают животных, нуждающихся в профилактике или лечения инфекции, заболевания или состояния, ассоциированного с вирусами, микробами, паразитами, простейшими, бактериями или грибами. Животные, у которых стимулируется иммунная реакция при использовании композиций или способов в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя домашний скот, например, свиней, коров, птиц (например, курей, уток, гусей или индюков), коз и овец, а также домашних животных, таких как мыши, кролики, собаки, кошки и лошади. Предпоч

- 2 031278 тительные животные включают свиней, муридовых, непарнокопытных, зайцеобразных и полорогих. Наиболее предпочтительным является, когда иммунная реакция стимулируется у свиней.

Изобретение также обеспечивает способ снижения частоты или тяжести одного или более симптомов, ассоциированных с или вызванных PPV5A инфекцией, включающий стадию введения иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, которая включает один или более пептидов PPV5A в соответствии с данной заявкой и предпочтительно молекулу носителя, например, так, что частота или тяжесть клинического признака PPV5A инфекции уменьшается по крайней мере на 10%, предпочтительно по крайней мере на 20%, еще более предпочтительно по крайней мере на 30%, даже более предпочтительно по крайней мере на 50%, даже более предпочтительно по крайней мере на 70%, наиболее предпочтительно по крайней мере на 100% по сравнению с субъектом, который не получает иммуногенную композицию, как это предусмотрено в настоящей заявке. Такие признаки включают виремию и иммуносупрессию как результат инфекции PPV5A. Такие клинические признаки могут включать неврологические симптомы (депрессия, атаксия, вялость), диарею, одышку, ухудшение состояния организма, отек суставов (который приводит к хромоте и лежачему положению), снижение среднего прироста веса за сутки, смертность и полисерозит в результате сочетанной инфекции другим организмом, например, Mycoplasma hyorhinis.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к способу профилактики инфекции PPV5A, в котором указанные PPV5A инфекции могут быть вызваны PPV5A, имеющим 100% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4, имеющим по крайней мере 95% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4, имеющим по крайней мере 90% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4, или имеющим по крайней мере 85% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4, включающий стадию введения иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, которая включает один или более пептидов PPV5A, как это предусмотрено в соответствии с данной заявкой,

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение также относится к способу профилактики инфекции PPV5A, в котором указанная PPV5A инфекция может быть вызвана PPV5A, имеющим 100% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4, имеющим по крайней мере 95% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4, имеющим по крайней мере 90% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4 или имеющим по крайней мере 85% идентичности последовательности с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3 и/или 4, включающий в себя стадию введения иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, которая включает один или более пептидов PPV5A, как это предусмотрено в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к способу получения любой из иммуногенных композиций, которые обеспечиваются в данной заявке, который включает смешивание одного или более пептидов PPV5A, как это предусмотрено настоящим изобретением, с молекулой носителя, предпочтительно таким образом, что один или более пептидов PPV5A и молекула носителя являются ковалентно связанными или конъюгированными друг с другом. Такие конъюгаты могут быть поливалентными или одновалентными. Поливалентные композиции или вакцины включают иммунную конъюгацию нескольких пептидов PPV5A с молекулой носителя. В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения одного или более пептидов PPV5A, где способ включает трансформацию клеткихозяина, предпочтительно прокариотической клетки, такой как E.coli, с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой из пептидов PPV5A в соответствии с данной заявкой. Альтернативно, клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, такой как клетка животного, клетка насекомого, клетка простейшего, растительная клетка или клетка грибов. Предпочтительно эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка СНО, BHK или COS или клетку грибов, таких как Saccharomyces cerevisiae, или клетку насекомых, такую как Sf9. Также предпочтительной является бакуловирусная экспрессия нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения одного или более пептидов PPV5A, которые индуцируют иммунный ответ против по крайней мере одного генетического варианта PPV5A и, более предпочтительно двух или более генетических вариантов PPV5A. Этот способ включает культивирование трансформированного экспрессионного вектора, кодирующего и экспрессирующего один или более пептидов PPV5A, раскрытых в данной заявке. Экспрессированные белки либо удерживаются организмом, в котором они были экспрессированы, либо секретируется в культуральную среду. Экспрессию проводят в условиях, достаточных для получения PPV5A пептида, способного индуцировать иммунный ответ на PPV5A. PPV5A серотипы, к которым PPV5A пептиды индуцируют иммунный ответ, включают, но не ограничиваются таковыми, как последовательности, которые имеют по крайне мере 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 или 90% идентичности.

Способы получения композиций в соответствии с настоящим изобретением могут дополнительно включать смешивание конъюгата одного или более пептидов PPV5A и молекулы носителя с физиологически приемлемым носителем, таким как фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъ

- 3 031278 ювант или их комбинации. Специалистам в данной области техники будет понятно, что выбор носителя, адъюванта или комбинации будет зависеть от пути доставки, личных предпочтений и видов животных, среди прочих.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики инфекции PPV5A у субъекта. Этот способ включает введение одного или более пептидов PPV5A; приведение в контакт одного или более пептидов PPV5A с образцом, полученным от субъекта; и идентификацию субъекта как такого, который имеет PPV5A инфекцию, если в образце обнаружено антитело, которое способно связываться с одним или более пептидов PPV5A.

В другом аспекте изобретение относится к способу установления факта того, что субъект ранее подвергался PPV5A инфекции и способен формировать иммунный ответ на PPV5A. Этот способ включает введение одного или более пептидов PPV5A; приведение в контакт одного или более пептидов PPV5A с образцом, полученным от субъекта; и идентификацию субъекта как такого, который имеет PPV5A инфекцию, если в образце обнаружено антитело, которое способно связываться с одним или более пептидов PPV5A.

Изобретение также относится к наборам, которые включают иммуногенную композицию, которая содержит один или более пептидов PPV5A, предпочтительно вместе с молекулой носителя; контейнер для упаковки иммуногенной композиции; набор напечатанных инструкций; и дозатор, способный к введению иммуногенной композиции животному. Необязательно, один или более PPV5A пептидов и молекула носителя могут быть упакованы в виде конъюгата или в виде отдельных соединений. При отдельной поставке также обеспечиваются средства конъюгации одного или более пептидов PPV5A и молекулы носителя, а также соответствующие напечатанные инструкции.

Изобретение также относится к наборам для вакцинации животного, включающим набор распечатанных инструкций; дозатор, способный к введению иммуногенной композиции, как обеспечивается в данной заявке, включающей один или более PPV5A пептидов животного; и где по крайней мере один из пептидов PPV5A эффективно иммунизирует животных против по крайней мере одного заболевания, связанного с инфекцией PPV5A. Предпочтительно один или более PPV5A пептидов выбирают из тех, которые предусмотрены в соответствии с настоящим изобретением. Наборы в соответствии с настоящим изобретением могут дополнительно содержать ветеринарно приемлемый носитель, адъювант или их комбинацию.

Дозатор в наборе в соответствии с изобретением способен выделять свое содержимое в виде капель; а содержащаяся в наборе иммуногенная композиция, которая включает в себя PPV5A пептиды, как это предусмотрено настоящим изобретением, способна уменьшать выраженность по крайней мере одного клинического признака при PPV5A инфекции при введении интраназально, перорально, подкожно или внутримышечно в организм животного. Предпочтительно тяжесть клинических симптомов уменьшается по крайней мере на 10%, предпочтительно по крайней мере на 20%, еще более предпочтительно по крайней мере на 30%, даже более предпочтительно по крайней мере на 50%, даже более предпочтительно по крайней мере на 70%, наиболее предпочтительно по крайней мере на 100%, по сравнению с зараженными животными, не подвергшимися лечению.

Также раскрываются способы лечения или профилактики инфекций, вызванных PPV5A. Способ включает введение эффективного количества иммуногенной композиции в соответствии с настоящим изобретением субъекту, который отличается тем, что лечение или профилактику выбирают из группы, которая состоит из снижения симптомов PPV5A инфекции, снижение тяжести или частоты клинических симптомов инфекции PPV5A, уменьшения смертности субъектов в результате PPV5A инфекции, и их комбинации.

Композиции в соответствии с изобретением дополнительно содержат ветеринарно приемлемый носитель, адъювант или их комбинации. Такие композиции могут использоваться в качестве вакцины и включать одну или более дополнительные аттенуированные вакцины, инактивированные вакцины или их комбинации. Такие вакцины вызывают протективный иммунный ответ по крайней мере против одного заболевания, связанного с вирусами, выбранными из группы, состоящей из свиных парвовирусов 1, 2, 3, 4, 5Л, 5В, других видов парвовирусов свиней, других патогенных вирусов и бактерий свиньи и их комбинации. Другие типы вакцин, которые могут быть совместно введены в комбинации с вакциной к PPV5A, включают, но не ограничиваются таковыми, как цирковирус свиней типа 2 (например, Ingelvac® CircoFLEX, Ingelvac® CircoFLEX-Mycoflex), вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (например, Ingelvac® PPCC ATH, Ingelvac® PPCC MLV), парвовирус свиней (например, ReproCyc® PPCC-PLE), микоплазму (например, Ingelvac® Mycoflex) и т.д.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что композиции, используемые в данной заявке, могут включать известные инъекционные, физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к использованию раствора для парентерального введения или инфузии водные изотонические растворы, например, физиологические растворы или растворы белка плазмы крови, является легко доступными. Кроме того, иммуногенные композиции и вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут включать в себя фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители, раз

- 4 031278 бавители, изотонические агенты, стабилизаторы или адъюванты.

Способы в соответствии с изобретением могут также включать смешивание композиции в соответствии с изобретением с ветеринарно приемлемым носителем, адъювантом или их комбинацией. Специалистам в данной области техники будет понятно, что выбор основы, адъюванта или комбинации будет зависеть от способа доставки, личных предпочтений, видов животных и других факторов.

Изобретение также относится к способу снижения тяжести существующей РРУ5Л инфекции у животного путем введения композиции животному. Композиция может включать аттенуированную культуру вируса или один или более пептидов РРУ5Л в сочетании с приемлемым в ветеринарии носителем.

Предпочтительные способы введения включают назальный, пероральный (например, в питьевой воде), внутрикожный и внутримышечный. Внутримышечное введение, наиболее предпочтительно в виде единичной дозы, является предпочтительным. Специалисту в данной области будет понятно, что композиции в соответствии с изобретением могут также быть введены в виде двух или более доз, а также при использовании других путей введения. Например, такие другие способы включают подкожное, внутрикожное, внутривенное, интраваскулярное, внутриартериальное, интраперитонеальное, интратекальное, внутритрахеальное, внутрикожное, интракардиальное, интралобалльное, интрамедуллярное, внутрилегочное или интравагинальное введение. В зависимости от желаемой продолжительности и эффективности лечения, композиции в соответствии с изобретением могут быть введены один или несколько раз, а также могут вводиться периодически, например, на ежедневной основе в течение нескольких дней, недель или месяцев и в различных дозировках.

Изобретение также относится к наборам для вакцинации животного, включающим комплект напечатанных инструкций; дозатор, способный к введению вакцины для животного; и по крайней мере один изолят из клеточной культуры, в том числе, но не ограничиваясь таковым, из культуры клеток бактерий, грибов, насекомых или млекопитающих, который эффективно иммунизирует животных против по крайней мере одного заболевания, ассоциированного с РРУ5Л, другие штаммы парвовируса, другие патогены и/или их комбинацию. Наборы в соответствии с настоящим изобретением могут дополнительно включать ветеринарно приемлемый носитель, адъювант или их комбинацию.

Устройство для дозированного введения в наборе в соответствии с изобретением является способным высвобождать свое содержимое в виде капель; а изолят, который входит в состав набора, способен уменьшать выраженность по крайней мере одного клинического симптома инфекции РРУ5Л при введении интраназально, перорально, подкожно или внутримышечно в организм животного. В некоторых наборах изолят также является способным снижать тяжесть по крайней мере одного клинического симптома инфекции РРУ5Л. Предпочтительно тяжесть клинического симптома уменьшается по крайней мере на 10% по сравнению с необработанным инфицированным животным.

Другие объекты, признаки и преимущества настоящего изобретение будут очевидными из приведенного ниже подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, показывающие предпочтительные варианты осуществления изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема изобретения будут очевидными для специалистов в данной области техники из этого подробного описания.

Краткое описание фигур

Следующие чертежи являются частью настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть более понятным со ссылкой на одну или более из этих фигур в сочетании с подробным описанием специфических вариантов осуществления изобретения, представленных в данной заявке.

Фиг. 1 показывает последовательность нуклеиновой кислоты РРУ5Л (SEQ ID NO: 1).

Фиг. 2 показывает последовательность белка репликазы РРУ5Л (SEQ ID NO: 2).

Фиг. 3 показывает последовательность открытой рамки считывания (ORF) белка РРУ5Л (SEQ ID NO: 3).

Фиг. 4 показывает белковую последовательность капсидного белка РРУ5Л (SEQ ID NO: 4).

Фиг. 5 показывает попарное сравнение идентичности аминокислот белковых последовательностей капсидного белка РРУ5Л и многочисленных других вирусных последовательностей. Ссылки на вирусные последовательности являются приведенными в табл. 1.

- 5 031278

Таблица 1

Последовательность [1] Крупный рогатый скот [2] Мелкие собачьи_____ [3] GboV [4] PBoVla [5] PBoVlb [6] HuBoca [7] HuBoca2 [8] НиВосаЗ [9] HuBoca4 [10] Densovirus [И] Hokovirusa [12]

Hokovirusb

Последовательность— [13] PPV4a [14] PPV4b [15] PPV5A [16] PPV1

Идентифик. номер GenBank

DQ 335247

NP 758521

NC 014358

HM 053693

HM 053694

NC 007455

NC 012042

NC 012564

NC 012729

NC_004287

GQ 869543

EU 200677

Идентифик. номер GenBank

HM031135

GQ_3 87499

NC001718

Информация о журнале__________

J. Virol. 81 (21), 12080-12085 (2007) Virology 302 (2), 219223 (2002___________

PLoS ONE 5 (7),

El 1948 (2010)

PLoS ONE 5 (10),

E13583 (2010)

PLoS ONE 5 (10),

E13583 (2010)

Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 102 (36),

12891-12896 (2005)

J. Infect. Dis. 199(2),

196-200 (2009

PLoS Pathog. 5 (4),

E1000391(2009)

J. Infect. Dis. 201 (11),

1633-1643 (2010)

DIRECT

SUBMISSION TO

GENBANK______

Virol. J. 7, 171 (2010)

J. Gen. Virol. 89 (PT

8), 1840-1848 (2008)

Информация о журнале________

Virol. J. 7 (1), 333 (2010)

Arch. Virol. 155 (5),

801-806 (2010)

Virology 197 (1), 8698 (1993)

Авторы__________________

Qiu,J., Cheng,F., Johnson,F.B. и Pintel,D___________________________

Schwartz,D., Green,B., Carmichael,L.E. и Parrish,C.R. Kapoor,A., Mehta,N., Esper,F., Poljsak-Prijatelj,M., Quan,P.L., Qaisar,N., Delwart,E. и Lipkin,W.I Cheng,W.X., Li,J.S., Huang,C.P., Yao,D.P., Liu,N„ Cui,S.X„ Jin,Y. и Duan,Z.J._______________________

Cheng,W.X., Li,J.S„ Huang,C.P., Yao,D.P„ Liu,N., Cui,S.X., Jin,Y. и Duan,Z,J._______________________

Allander,T., Tammi,M.T., Eriksson,M., Bjerkner,A., Tiveljung-Lindell,A. и

Andersson,В.____________________

Kapoor,A., Slikas,E., Simmonds,P., Chieochansin,T., Naeem,A., Shaukat,S., Alam,M.M., Sharif,S., Angez,M., Zaidi,S. и Delwart,E, Arthur,J.L., Higgins,G.D., Davidson,G.P., Givney,R.C. и Ratcliff.R.M.______________________

Kapoor,A., Simmonds,P., Slikas,E., Li,L., Bodhidatta,L., Sethabutr,O., Triki,H., Bahri,O., Oderinde,B.S., Baba,M.M., Bukbuk,D.N., Besser,J., Bartkus,J. и Delwart,E. Nonaka,K., Chiba,T., Nakahara,S., Kajiura,Z. и Nakagaki,M.

Adlhoch,C., Kaiser,M.,

Ellerbrok,H. и Pauli,G.___________

Lau,S.K„ Woo,P.C., Tse,H„ Fu,C.T„ Au,W.K., Chen,X.C., Tsoi,H.W„ Tsang,Т.Н., Chan,J.S., Tsang,D.N., Li,K.S., Tse,C.W„ Ng,T.K„ Tsang,O.T., Zheng,B.J., Tam,S„ Chan,K.H„ Zhou,B. и Yuen,К.Y.

Авторы__________________

Huang,L., Zhai,S.L.,

Cheung,A.K., Zhang,H.B., Long,J.X. и Yuan,S.S_________

Cheung,A.K., Wu,G., Wang,D., Bayles,D.0., Lager,K.M. и Vincent,A,L,

Bergeron,J., Menezes,J. и Tijssen,P.

Фиг. 6 показывает филогенетический анализ участка VP1/CAP PPV5A по сравнению с вирусным VP1 и капсидными белками, приведенными в табл. 1.

Фиг. 7 показывает идентичность капсидного белка PPV5A (остатки 55-792 последовательности SEQ ID NO: 4) по отношению к самому близкому родственному белку PPV4 (номер доступа GenBank # AFM73871 (SEQ ID NO: 5)), который демонстрирует идентичность последовательности на уровне 40% (310/774).

Фиг. 8 показывает идентичность белка репликазы PPV5A (остатки 15-516 последовательности SEQ ID NO: 2) по отношению к самому близкому родственному белку PPV4 (номер доступа GenBank # ADB20210 (SEQ ID NO: 11)), который демонстрирует идентичность последовательности на уровне 58% (292/504).

Подробное описание

Изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты и их фрагменты, полипептиды и их иммунологически эффективные фрагменты, вакцины, иммунологически эффективные препараты, антитела, диагностические анализы и наборы, а также способы получения и использования указанных составов и препаратов, связанных с раскрытым в данной заявке новым парвовирусом свиней 5 А и его вариантами.

Осуществление настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, традиционные методики молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белка и иммунологии, которые являются известными специалистам в данной области техники. Такие методики являются под- 6 031278 робно описанными в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1, II и III, 2-е изд. (1989); DNA Cloning, Vols. I и II (D. N. Glover ред. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ред. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins ред. 1984); Animal Cell Culture (R. K. ред., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL изд., 1986); Perbal, В., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); серии, Methods In Enzymology (S. Colowick и N. Kaplan ред., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris и S. Angal ред., IRL Press at Oxford University Press); и Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV (D. M. Weir и С. С. Blackwell ред., 1986, Blackwell Scientific Publications).

Перед описанием настоящего изобретения более подробно следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретной ДНК, полипептидом или последовательностями или параметрами процессов, которые, конечно, могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в данной заявке терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения. Следует отметить, что, как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа любой или этот включают ссылки на множественное число, если из содержания явно не следует иное. Так, например, ссылка на любой антиген включает в себя смесь двух или более антигенов, ссылка на любой наполнитель включает смеси двух или более наполнителей и тому подобное.

А. Определения

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же значение, как обычно это понимается специалистом в данной области техники, к которой относится это изобретение, на момент подачи заявки. Смысл и объем терминов должен быть ясен; однако, в случае какой-либо скрытой двухсмысленности, определения, представленные в данной заявке, главенствуют над любым словарем или внешним определением. Кроме того, если иное не предусмотрено контекстом, то особые условия должны включать множества, а множественные термины будут включать единственном число. При этом использование союза или означает и/или, если не указано иное. Кроме того, использование термина включающий, а также других форм, таких как включает и включенный не является ограничивающим. Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем документе, являются введенными в данную заявку в качестве ссылки.

Защита от болезни, протективный иммунитет, функциональный иммунитет и подобные фразы, означают ответ, направленный против заболевания или состояния, который вызывается путем введения одной или более терапевтических композиций в соответствии с изобретением, или их комбинации, что приводит к более сниженным вредным эффектам, чем можно было бы ожидать у неиммунизированного субъекта, который подвергся заболеванию или инфекции. То есть, тяжесть вредных эффектов инфекции уменьшается у вакцинированного субъекта. Заражение может быть снижено, замедлено или, возможно, полностью предотвращено, у вакцинированного субъекта. При этом когда подразумевается полное предотвращение инфекции, то это специально указывается. Если полное предотвращение не указано, то термин включает в себя частичное предотвращение.

В данной заявке снижение частоты возникновения заболевания и/или клинических признаков или снижение клинических симптомов означает, но не ограничивается таковыми, уменьшение количества инфицированных субъектов в группе, уменьшение или устранение количества субъектов, которые проявляют клинические признаки инфекции, или уменьшение тяжести каких-либо клинических симптомов, которые присутствуют у одного или более субъектов, по сравнению с инфекцией дикого типа. Например, следует упомянуть любое снижение нагрузки патогена, выделения патогена, снижение передачи патогена или уменьшение любого клинического признака симптоматической инфекции PPV5А. Предпочтительно, когда эти клинические признаки снижаются у одного или более субъектов, получающих терапевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением по крайней мере на 10% по сравнению с субъектами, не получающими композицию и которые являются инфицированными. Более предпочтительно, когда клинические признаки уменьшаются у субъектов, получающих композицию в соответствии с настоящим изобретением по крайней мере на 20%, предпочтительно по крайней мере на 30%, более предпочтительно по крайней мере на 40% и даже более предпочтительно по крайней мере на 50%.

Термин повышенная защита в данном документе означает, но не ограничивается таковыми, как значительное снижение одного или более клинических симптомов, которые связаны с инфицированием с помощью инфекционного агента, предпочтительно PPV5А, в группе вакцинированных субъектов против невакцинированной контрольной группы испытуемых. Термин значительное снижение клинических симптомов означает, но без ограничения таковым, частоту возникновения по крайней мере одного клинического симптома в группе вакцинированных субъектов, которая является по крайней мере на 10%, предпочтительно на 20%, более предпочтительно на 30%, еще более предпочтительно на 50% и даже более предпочтительно на 70% ниже, чем в невакцинированной контрольной группе после заражения инфекционным агентом.

Длительная защита относятся к улучшению эффективности, которая сохраняется в течение не менее 3 недель, но более предпочтительно по крайней мере 3 месяца, еще более предпочтительно по крайней мере 6 месяцев. У крупного рогатого скота наиболее предпочтительно, когда длительная защита

- 7 031278 будет сохраняться до достижения среднего возраста, при котором животные продаются на мясо.

Иммуногенная или иммунологическая композиция относится к композиции вещества, которая содержит по крайней мере один белок или полипептид PPV5A, или его иммуногенную часть, которая вызывает у хозяина опосредованный клетками или антителами иммунный ответ на композицию. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенная композиция вызывает иммунный ответ и более предпочтительно обеспечивает протективный иммунитет в отношении одного или более из клинических признаков инфекции PPV5A.

Термин иммуногенный PPV5A полипептид или антиген, используемый в данной заявке, относится к полипептиду или белку, который вызывает иммунный ответ, как описано в настоящем описании. Иммуногенный белок или полипептид PPV5A содержит полноразмерную последовательность любой из кодируемых последовательностей, указанных в настоящем документе, или их аналоги или их иммуногенные фрагменты. Термин иммуногенный фрагмент или иммуногенная часть относится к фрагменту или усеченной и/или замещенной форме аминокислотной последовательности PPV5A белка, которая включает один или более эпитопов и, таким образом, вызывает иммунный ответ, описанный в данной заявке. В общем случае, такие усеченные и/или замещенные формы или фрагменты будут содержать или кодировать по крайней мере шесть последовательных аминокислот из полноразмерного белка, например, белка капсида. Более предпочтительно, когда усеченные или замещенные формы или фрагменты будут содержать по крайней мере 10, более предпочтительно по крайней мере 15 и еще более предпочтительно по крайней мере 19 и даже более предпочтительно 30 смежных аминокислот из полноразмерного белка, например, белка капсида.

Термин эпитоп означает сегмент или фрагмент композиции вещества, например, белка или полипептида, который распознается иммунной системой, в частности, антителами, В-клетками или Тклетками. В настоящем изобретении, как правило, эпитоп в общем случае представляет собой фрагмент или фрагменты полипептидной последовательности вирусного белка.

Такие фрагменты могут быть идентифицированы при использовании любой из ряда методик, которые используются для картирования эпитопов и которые являются хорошо известными в данной области техники. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, ред., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут быть определены с помощью одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых подложках, определения пептидов, соответствующих частям белковой молекулы и взаимодействия пептидов с антителами, в то время как пептиды все еще остаются присоединенными к подложкам. Такие методики известны и описаны в данной области техники, смотри, например, патент СШЛ № 4708871; Geysen и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; и Geysen и др. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Аналогично, конформационные эпитопы легко идентифицируются с помощью определения пространственной конформации аминокислот, например, путем рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См. Epitope Mapping Protocols, как описано выше. Синтетические антигены также являются включенными в определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. См., например, Bergmann и др. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann и др. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol, и Cell Biol. 75:402-408; и Gardner и др., (1998) 12-ая всемирная конфенренция по СПИДу, Женева, Швейцария, 28 июля 1998 года. (Раскрытие и содержание которых являются включенными в данную заявку в качестве ссылки.)

Иммунный ответ или иммунологический ответ означает, но не ограничивается таковыми, развитие клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на композиции или вакцины, представляющие интерес. Как правило, иммунный или иммунологический ответ включает в себя, но не ограничивается таковыми, как один или более из следующих эффектов: продукция или активация антител, В-клеток, Т-хелперов, супрессорных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, непосредственно направленны на антиген или антигены, включенные в композиции или вакцины, представляющие интерес. Предпочтительно хозяин будет демонстрировать либо терапевтический, либо защитный иммунологический (иммунологическая память) ответ так, что сопротивление новой инфекции будет усиливаться и/или клиническая тяжесть заболевания будет снижаться. Такая защита будет демонстрироваться либо сокращением количества симптомов, тяжести симптомов, либо отсутствием одного или более симптомов, связанных с инфекцией патогеном, задержкой наступления вирусемии, снижением вирусной персистенции, снижением общей вирусной нагрузки и/или уменьшением экскреции вируса.

В данной заявке специфически иммунореактивный относится к иммунореактивному белку или полипептиду, который распознает антиген, характерный для PPV5A инфекции, но не реагирует с антигеном строгого имуногенного контроля. Для того чтобы определить специфичность потенциального PPV5A иммунореактивного белка или полипептида или другого полипептида, можно использовать различные иммунологические анализы (ELISA, IFA, вестерн-блоттинг анализ) для исследования белка, направленного против сыворотки животного, содержащей генетически подобные вирусы. Белок будет также подвергаться анализу в различных иммунологических анализах против материала, содержащего белки, связанные со способом экспрессии (бакуловирус, клетки Sf9 и т.д.).

Как используется в данной заявке, термин фармацевтически или ветеринарно приемлемый носи

- 8 031278 тель или наполнитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие адсорбцию, и подобные им. В некоторых предпочтительных вариантах реализации, и особенно в тех, которые включают лиофилизированные иммуногенные композиции, стабилизирующие агенты для использования в настоящем изобретением, включают стабилизаторы для лиофилизации или сушки вымораживанием.

В некоторых воплощениях иммуногенная композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит адъювант. Адъюванты, как используется в данной заявке, могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), эмульсию вода-в-масле, масло-в-воде, вода-вмасле-в-воде. Эмульсия может основываться, в частности, на легком вазелиновом масле (в соответствии с европейской фармакопеей); изопреноидном масле, таком как сквалан или сквален; масле, полученном в результате олигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; сложных эфирах кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, в частности растительное масло, этилолеат, пропиленгликоль ди-(каприлат/капрат), глицерил три-(каприлат/капрат) или пропиленгликоль диолеат; сложных эфирах разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, сложных эфирах изостеариновой кислоты. Масло используют в комбинации с эмульгаторами с образованием эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионные поверхностно-активные вещества, в частности сложные эфиры сорбитана, маннита (например, олеат ангидроманнита), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блоки сополимера полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты Pluronic, в частности L121. См. Hunter и др., The Theory и Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, стр. 51-94 (1995) и Todd и др., Vaccine 15:564570 (1997). Типичные адъюванты представляют собой SPT эмульсию, описанную на стр. 147 Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach под ред. М. Powell и М. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на стр. 183 этого же источника.

Еще одним примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных. Предпочтительные адъювантные соединения представляют собой полимеры акриловой или метакриловой кислоты, которые являются перекрестно связанными, в частности, с полиалкениловыми этерами сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения являются известными под термином карбомер (Фармакопея том 8, № 2, июнь 1996 г.). Специалисты в данной области техники могут также сослаться на патент США № 2909462, который описывает такие акриловые полимеры, перекрестно сшитые с полигидроксилированным соединением, имеющим по крайней мере, 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода по крайней мере трех гидроксильных групп заменяются ненасыщенными алифатическими радикалами, содержащими по крайней мере 2 атома углерода. Предпочтительные радикалы представляют собой такие, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы сами по себе могут содержать другие заместители, такие как метил. Продукты, которые продаются под названием Carbopol; (BF Goodrich, штат Огайо, США) являются особенно приемлемыми. Они являются перекрестно сшитыми с аллилсахарозой или пентаэритритолом. Среди них могут быть упомянуты Carbopol 974Р, 934Р и 971P. Наиболее предпочтительным является использование Carbopol 971P. Среди сополимеров малеинового ангидрида и производного алкенила следует упомянуть сополимеры EMA (Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде приводит к получению кислотного раствора, который будет нейтрализован, предпочтительно до физиологического значения рН, для того, чтобы ввести раствор адъювант, в который будет включена иммуногенная или иммунологическая вакцина.

Другие подходящие вспомогательные вещества представляют собой, но не ограничиваются таковыми, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), монофосфорил липид А, адъювант Avridine на основе липид-амина, термолабильный энтеротоксин из E.coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид, либо природные, либо рекомбинантные цитокинины или их аналоги, или стимуляторы высвобождения эндогенных цитокинов, среди прочих.

Ожидается, что адъювант может быть добавлен в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу, предпочтительно в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, более предпочтительно в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу, а большинство предпочтительно в количестве приблизительно 1 мг на дозу. Кроме того, адъювант может находиться в концентрации приблизительно от 0,01 до 50%, предпочтительно в концентрации приблизительно от 2 до 30%, более предпочтительно в концентрации приблизительно от 5 до 25%, еще более предпочтительно в концентрации приблизительно от 7 до 22% и наиболее предпочтительно в концентрации от 10 до 20% от объема конечного продукта.

Разбавители могут включать воду, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное.

- 9 031278

Изотонические агенты могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу, среди прочих. Стабилизаторы включают альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, среди прочих.

Изолированный означает измененный рукой человека по сравнению с его естественным состоянием, то есть, если это происходит в природе, то он был изменен или удален из своей первоначальной окружающей среды или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, который естественным образом присутствуют в живом организме не является изолированным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от сосуществующих с ним материалов в его естественном состоянии, является изолированным в том значении, как этот термин используется в данном документе.

Безопасность относится к отсутствию побочных эффектов у вакцинированных животных после вакцинации, в том числе, но не ограничиваясь таковыми: потенциальное превращение живой вирусной вакцины в вирулентную, клинически значимые побочные эффекты, такие как стойкие, системные болезни или неприемлемое воспаления в сайте введения вакцины.

Термины вакцинация или вакцинирующий или их варианты, как они используются в данной заявке, означают, но не ограничивается такими, как процесс, который включает в себя введение иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, которая при введении в организм животного, вызывает или может вызывать - непосредственно или опосредовано - иммунный ответ у животного против PPV5A.

Смертность в контексте настоящего изобретения относится к смерти, вызванной инфекцией PPV5A и/или сопутствующими инфекциями другими организмами, которые усиливаются PPV5A инфекцией, и включает ситуацию, когда инфекция является настолько тяжелой, что животное подвергают эвтаназии, чтобы предотвратить страдания и обеспечить гуманное окончание его жизни.

Лттенуирование означает снижение вирулентности возбудителя. В настоящем изобретении аттенуирование является синонимом авирулентности. В настоящем изобретении аттенуированный вирус представляет собой такой, в котором вирулентность была уменьшена так, что он не вызывает клинических признаков инфекции PPV5A, но способен индуцировать иммунный ответ у целевого млекопитающего, а также может означать, что клинические признаки снижаются в отношении частоты возникновения заболевания или тяжести у животных, зараженных ослабленным PPV5A, по сравнению с контрольной группой животных, инфицированных с помощью неаттенуированного PPV5A, и тех, которые не получают аттенуированный вирус. В этом контексте термин снижение/сниженный означает уменьшение по крайней мере на 10%, предпочтительно на 25%, еще более предпочтительно на 50%, еще более предпочтительно на 60%, даже более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 100%, по сравнению с контрольной группой, как определено выше. Таким образом, аттенуированный авирулентный штамм PPV5A представляет собой такой, который является приемлемым для включения в состав иммуногенной композиции, содержащей модифицированный живой вирус PPV5A.

Убитый или инактивированный означает обработанный с помощью физического или химического агента, который приводит к тому, что вирус PPV5A становится мертвым и/или иным неспособным к размножению. PPV5A может быть убит с помощью обычных средств таких как, например, воздействие тепла, радиации или псоралена в присутствии ультрафиолетового света. PPV5A можно инактивировать с помощью обычных средств, таких как, например, с помощью химической инактивации с использованием одного или более химических агентов для инактивации, включая, но не ограничиваясь таковыми, один или более из бинарного этиленимина (BEI), пропиолактона, формалина, глутаральдегида и/или додецилсульфата натрия. Способы ослабления вирулентных штаммов этих вирусов и способы получения инактивированного вирусного препарата являются известными в данной области и описаны, например, в патентах СШЛ № 4567042 и 4567043. Антигены из PPV5A для использования в вакцинных композициях в соответствии с настоящим изобретением могут, таким образом, быть в виде цельного вируса, который представляет собой модифицированный и/или аттенуированный живой вирусный препарат, или убитый, или инактивированный вирусный препарат, среди прочих.

Термин антитела, как используется в данной заявке, включает в себя анти-PPV5Л антитела, например, моноклональные и поликлональные антитела, одноцепочечные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, свиньи и CDR-привитые антитела, в том числе соединения, которые включают CDR последовательности, которые специфически распознают полипептид PPV5A в соответствии с изобретением. Термин специфические для указывает на то, что вариабельные области антител в соответствии с изобретением узнают и связывают исключительно PPV5A полипептид (т.е. являются в состоянии отличить единственный PPV5A полипептид от родственных полипептидов, несмотря на идентичность последовательностей, гомологию или сходство, которое обнаруживается в семействе полипептидов), и которые могут (не обязательно) взаимодействовать с другими белками (например, белком A S. aureus или другими стафилококковыми антителами в методах ELISA) посредством взаимодействия с последовательностями за пределами вариабельного участка антител и, в частности, в константном участке молекулы антитела. Лнализы скрининга для определения специфичности связывания антитела в соответствии с изобретением являются хорошо известными и обычно практикуется в дан

- 10 031278 ной области техники. Для всестороннего обсуждения таких анализов смотри Harlow и др. (ред.), Antibodies A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), глава 6. Антитела, которые распознают и связывают фрагменты PPV5А полипептидов в соответствии с настоящим изобретением, также рассматриваются, при условии, что антитела являются, в первую очередь, специфичными для PPV5А полипептида в соответствии с изобретением, как определено выше, из которого этот фрагмент получен. Для целей ясности следует уточнить, что антитело относится к молекуле иммуноглобулина, которая может связываться со специфическим антигеном в результате иммунного ответа на этот антиген. Иммуноглобулины представляют собой сывороточные белки, состоящие из легких и тяжелых полипептидных цепей, имеющих константные и вариабельные участки и делятся на классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) на основе состава константного участка. Антитела могут существовать в различных формах, включая такие формы, как Fv, Fab', F(ab')2, а также в виде одиночных цепей, и включают синтетические полипептиды, которые содержат все или часть одной или более полипептидных последовательностей одиночной цепи антитела.

В данной заявке эффективная доза означает, но не ограничивается таковыми, как количество антигена, которое вызывает или способно вызывать иммунный ответ, который обеспечивает уменьшение клинических симптомов у животного, которому вводят антиген.

Как используется в данной заявке, термин эффективное количество означает в контексте композиции количество иммуногенной композиции, способной индуцировать иммунный ответ, который уменьшает частоту или тяжесть инфекции, или частоту возникновения заболевания у животного. В частности, эффективное количество препарата живого аттенуированного вируса, как измеряется количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на дозу или в эквивалентной мере, подвергается мониторингу при использовании средней инфекционной дозы культуры ткани (TCID5₀), то есть количества патогенного агента, который будет вызывать патологические изменения в 50% инокулированных и чувствительных клеток культуры. Для убитой вакцины или антигенной субъединицы эффективное количество относится к относительному содержанию антигена (RAC), то есть к уровню включения антигена на эффективную дозу. Кроме того, в контексте терапии термин эффективное количество относится к количеству терапии, которое является достаточным для того, чтобы снизить или ослабить тяжесть или продолжительность заболевания или расстройства, или их одного или более симптомов, предотвратить развитие заболевания или расстройства, вызвать регрессию заболевания или расстройства, предотвратить рецидив, развитие, начало или прогрессирование одного или более симптомов, связанных с заболеванием или расстройством, или усиливать, или улучшить профилактику или лечения другой терапии или терапевтического агента.

Идентичность последовательности, как это является известным в данной области техники, относится к отношениям между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, в частности референтной последовательности и заданной последовательности, для того, чтобы сравнить ее с референтной последовательностью. Идентичность последовательности определяется посредством сравнения данной последовательности и референтной последовательности после того, как последовательности были оптимально выровнены для получения самой высокой степени сходства последовательности, как определяется путем сравнения цепочек таких последовательностей, при использовании пробелов, введенных в случае необходимости. После такого выравнивания идентичность последовательности определяется на основе положение-к-положению, например, последовательности являются идентичными в определенном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки являются идентичными. Общее количество таких идентичных положений затем делится на общее число нуклеотидов или остатков в референтной последовательности, чтобы получить % идентичности последовательности. Идентичность последовательностей может быть легко вычислена с помощью известных способов, включая, но не ограничиваясь таковыми, как те, что описаны в Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ред., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ред., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, часть 1, Griffin, A.M., и Griffin, H.G., ред., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. и Devereux, J., ред., M. Stockton Press, New York (1991); и Carillo, H., и Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988); раскрытие которых является введенным в данную заявку в качестве ссылки. Предпочтительные способы определения идентичности последовательностей разработаны для того, чтобы обеспечить наибольшее совпадение между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности последовательностей кодифицированы в общедоступных компьютерных программах, определяющих идентичность между данными последовательностями. Примеры таких программ включают, но не ограничиваются таковыми как пакет программ GCG (Devereux, J., и др., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN и BLASTX (Altschul, S.F. и др., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Программа BLASTX является доступной от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, С. и др., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, SF и др., J. Biol Molec, 215:.... 403-410 (1990), содержание которых является включенным в настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы оптимально выравнивают последовательности при использовании штрафов за

- 11 031278 открытие гэпа по умолчанию для того, чтобы получить самый высокий уровень идентичности при сравнении рассматриваемой и референтной последовательностей. В качестве иллюстрации, под полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов, являющуюся по крайней мере, например, на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентичной с референтной нуклеотидной последовательностью, понимают тот факт, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида является идентичной референтной последовательности за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов референтной нуклеотидной последовательности. Другими словами, в полинуклеотиде с последовательностью нуклеотидов, имеющей по крайней мере 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности по сравнению с референтной нуклеотидной последовательностью, вплоть до 15%, предпочтительно 10%, даже более предпочтительно 5% нуклеотидов в референтной последовательности может быть удалено или заменено другим нуклеотидом или несколькими нуклеотидами, или вплоть до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего объема нуклеотидов в референтной последовательности может быть встроено в референтную последовательность. Эти мутации референтной последовательности могут иметь место в 5' или 3' концевых положениях референтной нуклеотидной последовательности или где-нибудь между этими концевыми положениями, при этом они могут перемежаться либо индивидуально среди нуклеотидов в референтной последовательности, либо в одной или более смежных группах референтной последовательности. Аналогично, под полипептидом, характеризующимся заданной аминокислотной последовательностью, имеющим по крайней мере, например, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности по отношению к референтной аминокислотной последовательности, понимают тот факт, что данная аминокислотная последовательность полипептида является идентичной референтной последовательности за исключением того, что данная последовательность полипептида может включать в себя вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот референтной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая имеет по крайней мере 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности последовательности с референтной аминокислотной последовательностью, вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% остатков аминокислот в референтной последовательности может быть удалено или замещено другой аминокислотой или количество аминокислот вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в референтной последовательности может быть встроено в референтную последовательность. Эти изменения референтной последовательности могут иметь место в амино- или карбокситерминальных положениях референтной аминокислотной последовательности, перемежаясь либо индивидуально между остатками в референтной последовательности, либо в одной или более смежных групп в пределах референтной последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Тем не менее, консервативные замены не включены как совпадения при определении идентичности последовательности.

Гомология последовательности, как используется в данной заявке, относится к способу определения родства двух последовательностей. Для того чтобы определить гомологию последовательности две или более последовательностей подвергаются оптимальному выравниванию, и, при необходимости, вводятся пробелы. Тем не менее, в отличие от идентичности последовательности, консервативные замены аминокислот, также считаются как совпадения при определении гомологии последовательности. Другими словами, для получения полипептида, имеющего 95% гомологии последовательности с референтной последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, даже более предпочтительно 95%, остатки аминокислот в референтной последовательности должны совпадать или содержат консервативную замену другой аминокислотой, или количество аминокислот вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков, в том числе неконсервативных замен, в референтной последовательности может быть встроено в референтную последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность включает по крайней мере участок из 50, даже более предпочтительно из 100, даже более предпочтительно из 250, даже более предпочтительно из 500 нуклеотидов, кодирующих гомологичные аминокислоты.

Термин консервативная замена относится к замене аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, который имеет аналогичные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., таким образом, что общая функциональность существенно не изменяется. Это также может означать нуклеотидную замену, которая приводит к консервативной аминокислотной замене.

В. Молекулы носителя

Молекулы носителя, с которыми могут быть конъюгированы или ковалентно связаны РРУ5А белки или пептиды в соответствии с изобретением, предпочтительно представляют собой те, которые описаны выше. Предпочтительные носители для использования у животных представляют собой бычий сывороточный альбумин и гемоцианин лимфы улитки. Предпочтительно, когда сам белок носителя представля

- 12 031278 ет собой иммуноген.

PPV5A белки или пептиды в соответствии с изобретением могут быть ковалентно связаны с носителем любым удобным способом, известным в данной области техники. Несмотря на то, что использование симметричного линкера, такого как дигидразид адипиновой кислоты, как описано Schneerson и др., J. Experimental Medicine, 152, 361-376 (1980), или гетеробифункционального линкера, такого как Nсукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, как описано Fattom и др., Infection и Immunity, 56, 22922298 (1988), находится в пределах объема настоящего изобретения, является предпочтительным избежать использования какого-либо линкера, но вместо этого соединять PPV5A пептид в соответствии с изобретением непосредственно с молекулой носителя. Такое соединение может быть получено посредством восстановительного аминирования, как описано Landi и др., J. Immunology, 127, 1011-1019 (1981).

Размер иммуногенной композиции, как определяется средним молекулярным весом, является переменной величиной и зависит от выбранного(ых) PPV5A белка(ов) или пептида(ов) и способа слияния PPV5A белка(ов) или пептида(ов) с носителем. Таким образом, он может сбыть таким малым, как 1000 Да (10³) или большим чем 10⁶ Да. При использовании способа слияния путем восстановительного аминирования молекулярная масса PPV5A белка(ов) или пептида(ов), как правило, находится в диапазоне от 5000 до 500000 Да или более; например, для капсидного белка последовательности SEQ ID NO: 4, молекулярная масса, как ожидается, составит примерно 80000 Да, что, как предполагают, обеспечивает образование вирусоподобных частиц (VLP), состоящих из 60 мономерных белков.

Молекулы носителя, т.е. пептиды, их производные и аналоги, а также пептидные миметики, которые специфически связываются с белком PPV5A или пептидом в соответствии с изобретением, могут быть получены различными способами, известными в данной области техники, в том числе, но не ограничиваясь таковыми, как твердофазный синтез или при использовании раствора (Nakanishi и др., 1993, Gene 137: 51-56; Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 15: 2149-2154; Neurath, H. и др., ред., The Proteins, том II, 3-я ред., стр. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976), указанные источники являются введенными в данное описание в качестве ссылки).

PPV5A белки или пептиды в соответствии с изобретением или антитела или их связывающие части в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены при использовании инъецируемых дозированных форм в виде раствора или суспензии в разбавителе с фармацевтическим или ветеринарным носителем.

Безопасность и эффективность таких молекул определяется с помощью стандартных процедур на клеточных культурах или на экспериментальных животных, как описано и регулируется Центром ветеринарной медицины (CVB). Токсичность и терапевтическая эффективность таких молекул может быть определена с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, которая является летальной для 50% популяции).

Вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой поливалентные или одновалентные. Поливалентные вакцины получают путем иммуноконъюгации множественных белков или пептидов PPV5A с молекулой носителя.

В одном из аспектов белок или пептидные композиции PPV5A содержат эффективное иммунизирующее количество иммуногенного конъюгата, предпочтительно в комбинации с иммуностимулятором; и физиологически приемлемый носитель. Как используется в данном контексте, иммуностимулятор охватывает любое соединение или композицию, которая обладает способностью усиливать активность иммунной системы, будь-то специфический эффект потенцирования в комбинации со специфическим антигеном, или просто независимое влияние на активность одного или более элементов иммунного ответа. Иммуностимуляторные соединения включают, но не ограничиваются таковыми, как минеральные гели, например, гидроксид алюминия; поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы Pluronic; полианионы; пептиды; масляные эмульсии; квасцы и MDP. Способы с использованием этих материалов являются хорошо известными в данной области техники, и в пределах компетенции специалиста в данной области является определить оптимальное количество стимулятора для данной вакцины. В данной композиции может использоваться более чем один иммуностимулятор. Иммуноген может также быть включен в липосомы или конъюгирован с полисахаридами и/или другими полимерами для использования в композиции вакцины.

Композиции, если это является желательным, могут быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которое может содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую упаковку, такую как блистерная упаковка. Упаковка или устройство дозатора может сопровождаться инструкциями в отношении введения, предпочтительно для введения млекопитающему, в частности свинье.

С. Адъюванты

Для дополнительного повышения иммуногенности иммуногенные композиции, которые обеспечиваются в данной заявке и которые содержат один или более PPV5A белков или пептидов, могут также содержать один или более адъювантов.

Адъювант может быть очищен с помощью любого из способов, описанных ранее или известных в

- 13 031278 данной области техники. Предпочтительным способом очистки является хроматография на силикагеле, в частности, флэш (быстрый) хроматографический способ, как описано W. Clark и др., J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978). Тем не менее, другие хроматографические способы, в том числе ВЭЖХ, могут быть использованы для очистки адъюванта. Кристаллизация также может использоваться для очистки адъюванта. В некоторых случаях никакой очистки не требуется, поскольку продукт с аналитической степенью чистоты получают непосредственно путем синтеза.

Вакцинные композиции в соответствии с настоящим изобретением получают путем физического смешивания адъюванта с PPV5 А белком(ами) или пептида(ами) в соответствующих стерильных условиях в соответствии с известными методами для получения композиции с адъювантом. Комплексообразование PPV5А белка(ов) или пептида(ов) и адъюванта облегчается наличием суммарного отрицательного заряда на конъюгате, который электростатически притягивается к положительному заряду, присутствующему на длинноцепочечных алкильных соединениях адъюванта.

D. Физиологически приемлемые носители

Вакцинные композиции в соответствии с данным изобретением могут быть приготовлены с использованием способов, аналогичных тем, которые используются для других фармацевтических полипептидных композиций. Таким образом, адъювант и PPV5А белок(белки) или пептид(ы), предпочтительно конъюгированный(е) с молекулой носителя и/или смешанный(е) с адъювантом, могут храниться в лиофилизированной форме и могут восстановливаться в физиологически приемлемом носителе с образованием суспензии перед введением. Кроме того, конъюгат и адъювант могут храниться в носителе. Предпочтительные носители представляют собой стерильные растворы, в частности стерильные буферные растворы, такие как фосфатно-солевой буфер. Любой способ сочетания адъюванта и конъюгата в носителе, таким образом, что улучшается иммунологическая эффективность иммуногенной композиции, является приемлемым.

Объем единичной дозы вакцины в соответствии с данным изобретением может варьировать, но будет в общем случае находиться в пределах диапазонов, которые обычно используются в обычных вакцинах. Объем единичной дозы предпочтительно составляет приблизительно от 0,1 мл приблизительно до 3 мл, предпочтительно приблизительно от 0,2 до 1,5 мл, более предпочтительно приблизительно 1,0 мл при концентрации конъюгата и адъюванта, указанных выше.

Вакцинные композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены с помощью любого удобного средства.

E. Композиция

Иммуногенные конъюгаты, включающие PPV5А белок(белки) или пептид(ы), слитый(е) с молекулой носителя, могут быть использованы в качестве вакцины для иммунизации против одного или более серотипов PPV5А. Вакцины, содержащие иммуногенный конъюгат в физиологически приемлемом носителе, являются пригодными в способе иммунизации животных, предпочтительно свиней, для лечения или профилактики инфекций, вызванных PPV5А.

Антитела, полученные против иммуногенных конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением путем иммунизации при использовании иммуногенного конъюгата, могут быть использованы в пассивной иммунотерапии и для получения антиидиотипических антител для лечения или профилактики инфекции PPV5А.

Субъект, которому вводится композиция, предпочтительно представляет собой животных, в том числе, но не ограничиваясь таковыми, как коровы, лошади, овцы, свиньи, домашняя птица (например, куры) козы, кошки, собаки, хомяки, мыши и крысы; наиболее предпочтительными являются свиньи.

Композиции в соответствии с изобретением содержат эффективное иммунизирующее количество одной или более иммуногенных композиций или антитела к ним и физиологически приемлемый носитель. Вакцины содержат эффективное иммунизирующее количество одной или более иммуногенных композиций и физиологически приемлемый носитель. Композиция должна быть приемлемой для способа введения.

Иммуногенная композиция, если это является желательным, может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН буферирующих агентов. Иммуногенная композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетки, пилюли, капсулы, композицию замедленного высвобождения или порошок. Пероральные препараты могут включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п.

F. Эффективная доза

Соединения, описанные в данной заявке, могут быть введены субъекту в терапевтически эффективных дозах для лечения ассоциированных с PPV5А заболеваний. Дозировка будет зависеть от хозяина, который получает вакцину, а также от таких факторов, как размер, вес и возраст хозяина.

Точное количество иммуногенного конъюгата или антитела в соответствии с изобретением, которое используется в композиции, будет зависеть от пути введения и природы субъекта (например, вид, возраст, размер, стадия/уровень развития заболевания), и этот вопрос должен быть решен в соответствии с заключением лечащего врача и обстоятельствами для каждого субъекта в соответствии со стандартными

- 14 031278 клиническими методиками. Эффективное иммунизирующее количество представляет собой количество, достаточное для лечения или профилактики РРУ5А инфекционного заболевания у субъекта. Эффективные дозы могут также быть выведены из кривых зависимости ответа от дозы, полученных из тест-систем для животных моделей, и могут изменяться от 0,1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 1 до 10 мг/кг.

Иммуногенность композиции может быть определена с помощью мониторинга иммунного ответа исследуемых субъектов после иммунизации при использовании композиции с помощью любого иммуноанализа, известного в данной области техники. Получение гуморального (антитела) ответа и/или опосредованного клетками иммунитета, может быть принято в качестве показателя иммунного ответа. Исследуемые субъекты могут включать в себя животных, таких как свиньи, мыши, хомяки, собаки, кошки, кролики, коровы, лошади, овцы и птицы (например, куры, утки, гуси, индюки).

Иммунный ответ исследуемых субъектов может быть проанализирован с помощью различных подходов, таких как реактивность полученной иммунной сыворотки по отношению к иммуногенному конъюгату, как оценивается с помощью известных методов, например, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноблоттинга, иммунопреципитации и т.д.; или путем защиты иммунизированных хозяев от инфекции патогеном и/или ослабления симптомов, вызванных инфекцией патогеном, у иммунизированных хозяев, как определяется в соответствии с любым из способов, известных в данной области техники для количественной оценки уровней агента инфекционного заболевания, например, количественной ПЦР, выделения вируса или другого способа, известного в данной области техники. Уровни агента инфекционного заболевания также могут быть определены путем измерения уровней антигена, против которого направлен иммуноглобулин. Снижение уровней агента инфекционного заболевания или облегчение симптомов инфекционной болезни показывает, что композиция является эффективной.

Терапевтические средства в соответствии с изобретением могут быть проанализированы in vitro на желаемую терапевтическую или профилактическую активность перед использованием в условиях in vivo у животных. Например, анализы in vitro, которые могут использоваться для того, чтобы определить, является ли показанным введение конкретного терапевтического агента, включают анализы in vitro в культуре клеток, в которых соответствующие клетки из клеточной линии или культивируемые клетки субъекта, имеющего конкретное заболевание или расстройство, подвергаются воздействию или иным образом вводятся терапевтически, и наблюдается эффект терапевтического агента на клетки.

Альтернативно, терапевтический агент может быть определен путем контактирования терапевтического агента с клетками (либо поученных от субъекта, либо клеток культивируемой линии), которые являются восприимчивыми к инфекции, вызванной агентом инфекционного заболевания, и последующего определения, является ли показатель инфекции клеток, контактировавших с терапевтическим агентом, ниже, чем показатель инфекции клеток, не контактировавших с терапевтическим агентом. Заражение клеток агентом инфекционного заболевания может быть определено с помощью любого способа, известного в данной области техники.

Кроме того, терапевтический агент может быть оценен путем измерения уровня молекулы, против которой направлено антитело, у субъекта в модели животного при приемлемых интервалах времени до, во время или после лечения. Любое изменение или отсутствие изменений в количестве молекулы может быть идентифицировано и коррелирует с эффектом лечения субъекта. Уровень молекулы может быть определен любым способом, известным в данной области техники.

После вакцинации животного против PPV5А при использовании способов и композиций в соответствии с настоящим изобретением для оценки связывания полученного антитела и конкретной молекулы может быть использован любой анализ связывания, известный в данной области техники. Такие анализы могут быть также проведены для отбора антител, которые проявляют более высокое сродство или специфичность в отношении конкретного антигена.

G. Определение и диагностические способы

Антитела или их связывающие части, полученные в результате применения нативного PPV5А, аттенуированных вирусов, белков или пептидов в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться для обнаружения в образце присутствие PPV5А. Этот способ обнаружения включает следующие этапы: обеспечение изолированного антитела или его связывающих частей, образовавшихся против нативного PPV5А, аттенуированного вируса, белка или пептида в соответствии с изобретением, прибавление к изолированному антителу или его связывающим частям образца, предположительно содержащего некоторое количество вируса PPV5А, и обнаружение присутствия комплекса, содержащего изолированное антитело или его связывающие части, связанного с вирусом PPV5А.

Антитела или их связывающие части в соответствии с настоящим изобретением также являются полезными для обнаружения в образце наличия белка или пептида PPV5А. Этот способ обнаружения включает следующие этапы: обеспечение изолированного антитела или его связывающих частей, индуцированных против нативного PPV5А, ослабленного вируса, белка или пептида, прибавление к изолированному антителу или его связывающей части образца, предположительно содержащего некоторое количество белка или пептида PPV5А, и обнаружение присутствия комплекса, содержащего выделенное антитело или его связывающие части, связанного с белком или пептидом PPV5А.

Иммуноглобулины, в частности антитела (и функционально активные фрагменты), которые связы

- 15 031278 ваются со специфической молекулой, которая является членом связывающей пары, могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических агентов, как описано в данной заявке. В различных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает измерение члена пары связывания, и использование таких измерений в клинической практике. Иммуноглобулины в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться, например, при обнаружении антигена в биологическом образце, посредством чего субъекты могут подвергаться анализу на аберрантные уровни молекулы, с которой связывается иммуноглобулин и/или на присутствие аномальных форм таких молекул. Под термином аномальный уровень подразумевается увеличенное или уменьшенное по сравнению с присутствующим или стандартным уровнем, который присутствует в аналогичном образце из субъекта или из части тела субъекта, не имеющего этого заболевания. Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть также включены в качестве реагента в виде набора для применения в диагностической или прогностической методике.

В одном аспекте антитело в соответствии с изобретением, которое иммуноспецифически связывается с РРУ5А нативного или аттенуированного вируса, белком или пептидом, может использоваться для диагностики, прогнозирования или скрининга на РРУ5А инфекцию.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики или скрининга на наличие РРУ5А инфекции или иммунитета к ней, включающему измерение у субъекта уровня иммуноспецифического связывания антитела с образцом, полученным от субъекта, у котором антитело иммуноспецифически связывает белок или пептид РРУ5А, в котором увеличение уровня связывания указанного иммуноспецифического связывания по отношению к уровню иммуноспецифического связывания в аналогичном образце от субъекта, не имеющего агента инфекционного заболевания, указывает на наличие РРУ5А.

Примеры подходящих анализов для обнаружения присутствия пептидов или антагонистов РРУ5А включают, но не ограничиваются таковыми как ELISA, радиоиммуноанализ, анализ на основе гельдиффузионной реакции преципитации, иммунодиффузия, анализ агглютинации, реакция флуоресцентного иммуноанализа, иммуноанализ на основе белка А или иммуноэлектрофоретический анализ.

Иммуноанализы для конкретной молекулы будут типично включать инкубацию образца, такого как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки или лизаты культивируемых клеток, в присутствии антитела с меткой и обнаружение связанного антитела с помощью любого из ряда способов, хорошо известных в данной области техники.

Связывающая активность данного антитела может быть определена в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения с использованием обычного экспериментирования.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к диагностическим наборам для обнаружения или измерения РРУ5А. Обеспечиваются наборы для диагностики, которые содержат в одном или более контейнерах антитела против РРУ5А и, необязательно, меченый партнер связывания для антитела. Кроме того, антитела против РРУ5А могут подвергаться мечению (со способным к выявлению маркером, например, хемилюминесцентным, ферментативным, флуоресцентным или радиоактивным фрагментом). Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает диагностический набор, включающий, анти-РРУ5А антитела и контрольный иммуноглобулин. В конкретном варианте осуществления одно из указанных выше соединений контейнера можно пометить с помощью способной к обнаружению метки. Комплект может дополнительно содержать в контейнере предварительно определенное количество вируса, белка или пептида РРУ5А, распознаваемого антителом набора, для использования в качестве стандарта или контроля.

Н. Введение субъекту

Способы введения включают, но не ограничиваются таковыми, как интраназальное, пероральное (например, в питьевой воде), внутрикожное и внутримышечное введение. Внутримышечное введение является особенно предпочтительным. Специалисту в данной области техники будет понятно, что композиции в соответствии с изобретением могут также быть введены в виде одной, двух или более доз, а также при использовании других путей введения. Например, такие способы включают также подкожное, внутрикожное, внутривенное, интраваскулярное, внутриартериальное, интраперитонеальное, интратекальное, внутритрахеальное, внутрисердечное, интралобуллярное, интрамедуллярное, внутрилегочное и интравагинальное введение. В зависимости от желаемой продолжительности и эффективности лечения композиции в соответствии с изобретением могут быть введены один или несколько раз, а также периодически, например, на ежедневной основе в течение нескольких дней, недель или месяцев и в разных дозировках.

Следующие ниже примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятным, что способы, раскрытые в примерах, представляют собой методы, раскрытые изобретателями для нормального осуществления настоящего изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться как предпочтительные способы его практического применения. Тем не менее, специалистам в данной области техники должно быть очевидным в свете настоящего описания, что многие изменения могут быть сделаны в конкретных вариан

- 16 031278 тах, которые раскрыты, и при этом также удается получить похожий или аналогичный результат без отступления от сущности и объема настоящего изобретения.

Данная заявка является связанной с заявкой, поданной с той же датой под названием Парвовирус свиней 5В, способы применения и вакцины, номер дела патентного поверенного BIC-1153, содержание которой является включенным в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.

Примеры

Материалы и методы

Источник материалов: Гомогенаты ткани от трех свиней были получены в результате нестандартной вспышки заболевания. Клиническая история на ферме представляла собой свиней весом 200 фунтов с мышечным тремором всего тела, который присутствовал в состоянии покоя, но усиливался во время движения. После тщательного исследования в ветеринарной диагностической лаборатории, которая предположила наличие вирусного агента (на основе микроскопических повреждений), но приводила только к идентификации агента X (неклассическая чума свиней, ассоциированная с пестивирусом), образцы были предоставлены изобретателям, чтобы помочь определить основную причину симптомов со стороны ЦНС у этих животных.

Анализ ДНК и белка: Анализ ДНК образцов, полученных от заболевших свиней, был проведен при использовании высокоэффективного секвенирования от 454 Life Sciences (Branford CT) (454 технология), которое осуществляли при использовании Operon (Huntsville AL). Образцы были обогащены вирусными последовательностями благодаря обработке нуклеазой защищенных нуклеиновых кислот вирусной частицы с последующей экстракцией, случайной амплификацией и высокоэффективным секвенированием; которые осуществляли так, как описано у Victoria и др. PLoS pathogen 2008 Sep 26;4(9): el000163.

Полученные последовательности изначально характеризовали при использовании BLASTX анализа как девергентные члены семейства Parvoviridae. Последовательности собирали с использованием программного обеспечения Sequencher, и результаты этих анализов ДНК сочетали с нацеленным секвенированием, что обеспечивало получение последовательности ДНК SEQ ID NO: 1, которая представляла собой путативную полную кодирующую последовательность вируса, который обозначается как PPV5А. Дальнейший анализ последовательности ДНК при использовании программного обеспечения Sequencher приводил к идентификации трех путативных кодирующих участков, соответствующих тем, которые встречаются у других видов парвовируса, включая вирусную репликазу (SEQ ID NO: 2), открытую рамка считывания ORF3 (SEQ ID NO: 3) и белок вирусного капсида (SEQ ID NO: 4).

Пример 1. Идентификация нового вируса

Последовательности ДНК были определены с помощью 454 технологии (вирусная метагеномика) в образцах гомогенатов легких двух неродственных свиней из различных штатов. BLASTN и BLASTX анализ показал тесную идентичность с парвовирусом свиней 4, максимум 67% идентичности нуклеотидов в консервативных участках гена репликазы (REP), в то время как кодирующие участки капсида (САР) не проявляли заметного совпадения на уровне нуклеотидов. На уровне белка определяли, что белок путативной репликазы продемонстрировал ~60% идентичности аминокислот, а капсидный белок показал ~50% идентичности. Вирус был определен в качестве нового вида, парвовируса свиней 5А (PPV5А). Специфические праймеры были разработаны на основе кодирующей последовательности капсида и скрининга гомогенатов на основе ПЦР, которые были подобными в отношении тканевых и патологических/клинических характеристик, что выявило присутствие агента в ~16% образцов. На основании проведенных клинических симптомов и вирусологических данных, ассоциированных с тканями, которые подвергали скринингу, наблюдали статистически значимую связь с некоторыми другими вирусными агентами и клинической патологией/гистопатологией.

Пример 2. Идентификация PPV5А в качестве нового парвовируса и филогенетический анализ

Попарная идентичность аминокислот как для путативной репликазы (REP), так и белков капсида (VP1/CAP), для различных известных видов вирусов является представленной на фиг. 5. Идентичность последовательности PPV5А с таковой PPV4, ближайшим родственным организмом в отношении как REP, так и САР (~60%/50% соответственно) поддержали определение PPV5А в качестве нового вида.

Филогенетический анализ (фиг. 6) выявил, что вирус относится к новому виду парвовируса в рамках семейства Parvoviridae на основе консервативного участка белка САР. Подобные результаты получали при использовании более консервативной белковой последовательности REP (не показано).

Пример 3. Подтверждение PPV5А в качестве агента заболевания

Три позитивных по PPV5a ПЦР гомогената ткани ISU были использованы для инокуляции полученных путем кесарева сечения, неполучающих молозива (CDCD) животных для амплификации вируса и определения, приводила ли совместная инфекция новыми парвовирусами и PRRSV к увеличению клинических респираторных симптомов. В этом исследовании неожиданно получали большое количество случаев смертности (20-22%) в группах, инокулированных при использовании гомогената ткани, содержащего новые парвовирусы, и высокие титры PPV5А были определены в сыворотке с помощью специфического для PPV5А ПЦР нацеливания на кодирующую область капсида. Ткани из одного животного в этом исследовании затем использовали для индукции CDCD свиней для воспроизведения клинических

- 17 031278 признаков. В этом исследовании были показаны системные инфекции с высокими титрами виремии у большинства зараженных животных. В группах, которые получали инокуляты, содержащие РРУ5Л, было высокое значение смертности (20%), хромота, снижался среднесуточный прирост, наблюдалась гипертермия, а также макро- и микроскопические повреждения.

Пример 4. Культивирование, изоляция и очистка РРУ5Л

Небольшие участки ПЦР положительных тканей (например, селезенки, головного мозга, легких, кишечника и т.д.) измельчали при использовании стерильной ступки и пестика. Измельченную ткань ресуспендировали в 5-10 мл модифицированной среды ЕМЕМ, содержащей HEPES буфер и антибиотики, и осветляли для устранения больших кусочков ткани. Супернатанты собирали и последовательно пропускали через различные фильтры, чтобы устранить большинство крупных частиц, включая бактерии. Кроме того, образцы суспензии фекалий и сыворотку положительных по ПЦР животных также обрабатывали путем последовательной фильтрации для выделения вируса.

Разведения фильтрата обрабатывали трипсином или оставляли без обработки и адсорбировали на стабильных первичных клеточных культурах (перечисленных ниже) в планшетах на 6 ячеек при определенных температурах. Отсасывали жидкость из инокулята и заменяли 2 мл свежей поддерживающей среды. Затем планшеты инкубировали при 33-37°С в атмосфере 5% CO₂ и ежедневно наблюдали за появлением цитопатического эффекта, такого как округление клеток, клеточное слияние, некротизация клеток, клеточная кластеризация и т.д., по сравнению с контрольной обычной средой (среда без агента). Потенциальные положительные ячейки подвергали скринингу на рост вируса/изоляцию с помощью ПЦР.

Стабильные клеточные линии, используемые для изоляции вируса, включали: ST (свиные яички), SK6 (почка свиньи), BHK-21 (почка хомячка), УIDO R1 (сетчатка плода свиньи), РК-15 NADC (почка свиньи), РК/WRL (почка свиньи), HRT-180 (колоректальная аденокарцинома человека), Нер2 (человеческие эпителиальные клетки), Уего (почка африканской зеленой обезьяны) и RK-13 (почка кролика) и другие.

Первичные культуры клеток, используемые в способе, включали: эмбриональные ткани легкого свиньи, почки, семенники, трахеи и культуру кишечника, среди прочих.

Поскольку вирус изолировали, то его подвергали очистке при использовании нескольких циклов очистки бляшек или предельного разведения и размножали в больших количествах для получения маточных культур для экспериментов на животных.

Пример 5. Получение инактивированного вируса и вакцины

Инактивацию осуществляли при температурах приблизительно 35-39°С и в присутствии от 2 до 15 мМ BEI, еще более предпочтительно в присутствии примерно 10 мМ BEL. Инактивацию осуществляли в течение по крайней мере 24 ч, вплоть до 24-72 ч. Затем добавляли эквивалентное количество агента, который нейтрализует агент инактивации в растворе; например, тиосульфата натрия. Инактивированный препарат вируса готовили в соответствии со способами, известными в данной области техники, например, как описано у rreuss. Т., и др., Comparison of Two Different Methods for Inactivation of Уiгuses in Serum, CLINICAL and DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, (1997), 504-508 или Bahnemann, H.G., Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine, УACCINE, (1990), 299-303. После получения инактивированного вируса материал соединяли с препаратом носителя для рецептирования заключительной вакцины.

Пример 6. Получение аттенуированного вируса и вакцины

Препарат аттенуированного вируса получали в соответствии с методами, известными в данной области техники, например, как раскрыто в Уaccine Frotocols, 2-ое изд.; Robinson, Husdon, Cranage, ред., Humana Press 2003. Например, ... вирусы дикого типа экстенсивно пассируют в тканевой культуре/животных-хозяевах, до тех пор, пока не будет достигнут приемлемый баланс между потерей вирулентности и сохранением иммуногенности ....

Лттенуированный вирус очищали при использовании множества циклов очистки бляшек или путем предельных разведений. ПЦР анализы, глубокое секвенирование или иммунофлюоресцентные анализы использовали для определения специфичности культурального материала.

Лттенуированную вирусную вакцину получали путем соединения препарата очищенного аттенуированного вируса с препаратом носителя.

Пример 7. Получение субъединичной вакцины, включающей капсидный белок

Капсидный белок последовательности SEQ ID NO: 4 получали путем экспрессии клонированной последовательности SEQ ID NO: 4 или ее фрагментов в различных системах экспрессии белка.

Бакуловирусная экспрессия: Капсидный белок РРУ5Л последовательности SEQ ID NO: 4 экспрессировали в бакуловирусной системе экспрессии, как правило, в соответствии со способами, описанными у Kost и др. (6), 2012: Этот белок был обнаружен в незначительном количестве в нерастворимой фракции после начальной очистки. Способы для повышения выхода и растворимости включали, но не ограничивались таковыми, как использование альтернативных буферных условий (например, гидрохлорида гуанидина или мочевины), альтернативное связывание и условия очистки (например, кобальтовые или никелевые аффинные колонки, анионо- или катионо-обменные колонки) или альтернативные условия экспрессии (например, температура, время, альтернативные линии клеток).

- 18 031278

Бактериальная экспрессия: Капсидный белок PPV5А последовательности SEQ ID NO: 4 экспрессировали в бактериальной системе экспрессии, как правило, в соответствии со способами, описанными в EMD Chemicals Inc. Novagen User Protocol ТВ 184. Этот способ включал добавление присущей His-метки, содержащейся в бактериальном векторе (EMD Chemicals Inc., 2011 (7)), чтобы способствовать очистке полученного белка. Экспрессированный в бактериях меченый капсидный белок очищали, как правило, в соответствии со способами, описанными в GE Healthcare, 2012 (8), и полученные продукты использовали для получения специфических антител к PPV5А, как описано в примере 8.

Аттенуированную субъединичную вакцину получали путем соединения препарата очищенного капсидного белка с препаратом носителя.

Пример 8. Получение антител, которые специфически связываются с PPV5А

Антитела, которые специфически связываются с PPV5А, получали путем иммунизации кроликов с помощью антигенных препаратов вируса PPV5А или субъединичных препаратов белков капсида (SEQ ID NO: 4) или их фрагментов. Образцы сыворотки, полученные от инокулированных кроликов, подвергали скринингу на поликлональные антитела, которые связываются с антигенами PPV5А. Селезенки, полученные из инокулированных мышей, которые были определены для получения антител к антигену, сливали с клетками миеломы для получением гибридом. Гибридомы затем подвергали скринингу на связывание с антигеном PPV5А.

Поликлональные антитела: Меченный с помощью HIS экспрессированный в бактериях капсидный белок, полученный в соответствии с Примером 7, использовали при иммунизации двух новозеландских белых кроликов в службе производства антител на заказ (Rockland Antibodies and Assays; Gilbertsville, PA).

Кроликов иммунизировали при использовании приблизительно 100 мкг антигена/кролик в DO, D7, D14 и D28. Для инокуляции в DO и D7 животных инокулировали интрадермально; инокуляции, которые проводили в D14 и D28, осуществляли подкожно. Полный адъювант Фрейнда использовали в первой инокуляции; неполный адъювант Фрейнда использовали для последующих прививок. Образцы сыворотки от обоих кроликов собирали до иммунизации и через 38 и 45 дней после иммунизации.

Препараты поликлональных антител подвергали скринингу на анти-PPVSA специфичность в соответствии с Rockland Antibodies and Assays. Были получены антитела, имеющие специфичность связывания с очищенным или частично очищенным белком PPV5А, с помощью иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), вестерн-блоттинга и твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Параметры для специфичности каждого анализа были следующими: специфичность в вестерн-блоттинге измеряли с помощью обнаружения прогнозируемого белка весом 88,8 кДа, IFA специфичность измеряли по сравнению с неинфицированными клетками, a ELISA специфичность определяли путем покрытия планшетов при использовании нерелевантного белка.

Моноклональные антитела: Меченный с помощью HIS экспрессированный в бакуловирусах капсидный белок, полученный в соответствии с Примером 7, использовали для создания моноклональных антител у Balb/c мышей в службе производства антител на заказ (Rockland Antibodies and Assays; Gilbertsville, PA). Мышей иммунизировали при использовании различных антигенных препаратов PPV5А в соответствии со стандартными прописями, разработанными на службе производства антител на заказ. Иммунный ответ после инокуляции подвергали мониторингу в службе по производству антител. Стандартные прописи для получения моноклональных антител являются хорошо известными специалистам в данной области техники, например, как раскрывается у Gabriele и др. (9), стр. 117-135.

Гибридомы получали путем слияния опухолевых В-клеток, культивируемых в среде для выращивания гибридомы до фазы пролиферации, с клетками селезенки, полученными от инокулированных мышей, которых определяли как таких, которые вырабатывают антитела к антигенам PPV5А в соответствии со стандартными прописями, как описано у Gabriele и др. (9), стр. 117-135. После слияния и культивирования гибридомы подвергали скринингу на связывания с PPV5А антигенами, и отбирали анти-PPV5А антитела, которые вырабатываются гибридомами. Моноклональные антитела, которые вырабатываются гибридомами, очищали при использовании аффинной хроматографии в соответствии со стандартными прописями, как описано у Gabriele и др. (9), стр. 209-232.

Высокоафинные антитела, специфические для PPV5А, идентифицировали и дополнительно характеризовали, включая определение эпитопов, с которыми они связываются, специфичности антитела в отношении родственных видов вирусов, и отбирали приемлемые высокоаффинные антитела с высокой специфичностью для PPV5А вирусного(ых) антигена(ов), при использовании иммунологических методик, хорошо известных в данной области техники, например, ELISA, вестерн-блоттинг анализ и картирование эпитопов (Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66 (Glenn E. Morris, ред., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey).

Пример 9. Диагностические анализы для PPV5А

Анализ ELISA: Антитела, полученные в соответствии с Примером 8, использовали для измерения PPV5А в биологическом образце с применением ELISA процедур. Анализ осуществляли так, как описано ниже.

Антиген для покрытия, выбранный из капсидного белка последовательности SEQ ID NO: 4, разво

- 19 031278 дили в буфере для покрытия (0,05 М карбонат-бикарбонатный буфер; рН 9,6) для получения заключительной концентрации 8 нг/мкл. Планшеты (планшеты для высокоэффективного связывания ELISA на 96 ячеек Phenix каталожный номер MPG-655061) покрывали при использовании 50 мкг/ячейка антигена для покрытия. Планшеты закрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С или в течение ночи при 4°С. Удаляли раствор для покрытия и планшеты промывали три раза с помощью 200 мкл/ячейка PBST (IX PBS + 0,05% Твин-20). Планшет покрывали при использовании 300 мкл/ячейка блокирующего раствора (0,5% вес./об. обезжиренного сухого молока в PBS), закрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Блокирующий раствор удаляли, и планшет три раза промывали с помощью 200 мкл/ячейка PBST. Образцы разводили 1:100 в блокирующем растворе; прибавляли к планшету 100 мкл/ячейка образцов крови, Планшеты закрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Удаляли образцы сыворотки и планшеты трижды промывали с помощью 200 мкл/ячейка PBST. Вторичное антитело (конъюгированный с пероксидазой хрена козий анти-свиной IgG (H+L); Jackson Immuno-Research 114-035-003) разводили до 1:10000 в блокирующем растворе и использовали для покрытия планшета из расчета 100 мкл/ячейка. Планшеты закрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Вторичное антитело удаляли и планшет три раза промывали с помощью 200 мкл/ячейка PBST. Планшеты покрывали при использовании 50 мкл/ячейка ТМВ (3,5,3',5'-тетраметилбензидин; KPL каталожный номер 53-00-01). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в темноте приблизительно в течение 10 мин. Планшеты покрывали при использовании стоп-раствора из расчета 50 мкл/ячейка (2 М H2SO4; KPL каталожный номер 50-85-04). Считывали оптическую плотность при 450 нм.

ПЦР анализы: Оптимизировали анализы ПЦР в геле и количественную ПЦР для PPV5A. Эти анализы осуществляли так, как описано ниже: Для количественного анализа ПЦР каждую реакцию осуществляли при прибавлении следующих реагентов: 10 мкл/реакция 2Х SsoFast Probe Supermix (BioRad, каталожный номер 172-5233), 5 мкл/реакция обработанной DEPC воды, 1 мкл/реакция прямого праймера при концентрации 6 мкМ (ЛЛТ GCG TGT GCT ТЛС GCT ТЛ: SEQ ID NO: 6), 1 мкл/реакция обратного праймера при концентрации 6 мкМ (TGG GTT CGA ATA TGA AGA GG: SEQ ID NO: 7), 1 мкл/реакция зонда при концентрации 4 мкМ (6-FAM/TC ЛТС AGG ЛЛС ССТ GGA GTG ЛТС ТСЛ /BHQ_1: SEQ ID NO: 8) и 2 мкл/реакция экстрагированной ДНК. Реакцию осуществляли на Т100 термоблоке для проведения реакций (BioRad) в течение одного цикла при 95°С на протяжении 2 мин, после чего осуществляли сорок циклов при следующих температурах: 95°С в течение 5 с, а потом 60°С в течение 5 с. Данные считывали при использовании системы для формирования изображений (Bio-Rad). Для гелевого анализа каждую реакцию осуществляли путем прибавления следующих реагентов: 12,5 мкл/реакция 2Х AmpliTaq Gold Mastermix (Applied Biosystems, каталожный номер 4302758), 8,0 мкл/реакция обработанной DEPC воды, 1,25 мкл/реакция прямого праймера (GTA СТЛ TGA ЛТТ ТСС ЛЛЛ CGA ТСТ ТСС ТТТ CG: SEQ ID NO: 9) при концентрации 10 мкМ, 1,25 мкл/реакция обратного праймера (ТТЛ СЛС СЛЛ ЛТС TGG GAC ТСТ ЛЛЛ CAG GC: SEQ ID NO: 10) при концентрации 10 мкМ и 2 мкл/реакция экстрагированной ДНК. Реакцию осуществляли на Т100 термоблоке для проведения реакций (Bio-Rad) в течение одного цикла при 95°С на протяжении 5 мин, после чего осуществляли сорок циклов при следующих температурах: 95°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 45 с, и далее проводили заключительное удлинение при 72°С в течение 10 мин.

Пример 10. Оценка эффективности PPV5Л вакцины у свиней

Для оценки эффективности композиции вещества, которое содержит по крайней мере один белок или полипептид PPV5Л (прототипная вакцина PPV5Л) у свиней, осуществляли рандомизированное исследование при использовании полученных путем кесарева сечения животных в возрасте пяти недель, которые не получали молозива (CDCD), рандомизированных в три группы (см. табл. 2). Животные были вакцинированы с помощью композиции или плацебо (физиологический раствор с фосфатным буфером; PBS) в день исследования 0 (D0) и D14. Животным в D28 вводили материал, который содержал PPV5Л. Осуществляли клинические наблюдения, измеряли ректальные температуры, вес и брали анализы крови. В D56 животных забивали и осуществляли вскрытие для оценки макроскопических повреждений. Эффективность вакцины PPV5Л определялась статистически путем сравнения процента смертности, виремии (титры и длительность), сероконверсии (титры и длительность) и клинических признаков вакцинированных и невакцинированных животных.

Таблица 2 _____________________________________________

Номер группы	Группа	Кол-во	Клетка	Вакцинация	Стимуляция антигеном
1	PPV5A-VX	10	1 и2	PPV5A прототип	Да
2	PBS-Vx	10	1 и2	PBS	Да
3	Строгий контроль	5	3	Отсутствует	Нет

Все композиции и способы, раскрытые и заявленные в данной заявке, могут быть получены и осуществлены без излишних экспериментов в свете настоящего описания. Хотя композиции и способы в соответствии с данным изобретением были описаны в контексте предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники будет очевидным, что в композиции и способы могут быть внесены изменения, а также в этапы или в последовательности этапов описанного в данной заявке

- 20 031278 способа без отступления от концепции и объема настоящего изобретения. Более конкретно, будет очевидным, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически, родственными, могут быть заменены на агенты, описанные в данной заявке в то время как будут достигнуты те же или аналогичные результаты. Все такие подобные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, подразумеваются как такие, которые соответствуют объему и концепции изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Ссылки

Следующие ссылки в той степени, в которой они обеспечивают иллюстративные или другие детали, дополнительные к тем, которые изложены в данном описании, специально включены в данную заявку в качестве ссылки.

(1) Csagola А, и др., Detection, prevalence and analysis of emerging parvovirus swine infections. Arch Virol. Jun; 157(6):1003-10 (2012).

(2) Hijikata M, и др., Identification of new parvovirus DNA sequence in swine sera from Myanmar. Jpn J Infect Dis 54:244-245 (2001).

(3) Wang F, и др., Novel parvovirus sublineage in the family of Parvoviridae. Virus

Genes 41:305-308 (2010).

(4) Lau SK, и др., Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related to human parvovirus 4. J Gen Virol 89:1840-1848 (2008).

(5) Cheung AK, и др., Identification and molecular cloning of a novel porcine parvovirus. Arch Virol 155(5):801-806 (2010).

(6) Kost и др., Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors,

Trends in Biotechnology, 20, 173-180, Apr. 2002. цитируются другими .

(7) EMD Chemicals Inc. 2011. Xa/LIC Kits, User Protocol ТВ 184.

(8) GE Healthcare. Recombinant Protein Purification Handbook. 18-1142-75.

(9) Gabriele и др. (eds.), Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular

Biology, 2012, том 901, глава 7.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк.

<120> ПАРВОВИРУС СВИНЕЙ 5А, СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ И ВАКЦИНА <130> 10-0150-PCT <140>

<141>

<150> 13/796,621 <151> 2013-03-12 <150> 61/738,110 <151> 2012-12-17 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5853 <212> ДНК <213> Парвовирус свиней 5A <400> 1

tatttgcagg cttttccctg atattgggaa gattcctggg gtgactcctg	agcggtatat	60
ttatgctgta aacgtgagta cccgtaatgg gcaaaagtgg ccgaaagttg	ggaccgaggg	120
gccattggct gcaggtgtct tacaggggga ggcccttttc cgtgagaccc	ttaaagaggt	180
ccggaaggtg tgccggctgc cgcaagaccc cccatctttt ctttcaattg	gagaaagttg	240

- 21 031278

attccaaagg	gggtcttcac	cttcattttt	gtattagtgt	tgctgctggc	actcctagag	300
atgtgtcttc	gatgtttaaa	gccattgagc	gtcgagtttc	cttttactac	tttggtgtag	360
agggcttgac	tttttttact	cctcataaaa	ataagcatgg	ggcttggaag	agtaatgatg	420
agggctttat	tgtgaattat	cttcttaaaa	aattgccttt	gtctgagtgt	gtgtatgcgt	480
ggactaatat	ggatggggtg	attggcgatg	cctgtctgaa	tgaagataag	cgcagggaat	540
tgttgtctga	gcgtcaagat	cagggagtca	ttaaagagct	cactgctcct	acttttaaag	600
ctgctacggg	tgataaaatg	ttgagtgtgg	tggattggat	gtgtgataat	gatgtgacta	660
cggagcgccg	atgggaggaa	atatcggctg	cgtccctgta	ctctttcctt	gctaccccag	720
ctggcactca	tttggctaaa	cagtgtctta	gagctgcgaa	tcagcgtatt	gtgagcacta	780
aaacctcttg	gttgagtctc	tgtaaatttg	ccagtgaaaa	ggagcttcgt	gcttttcaaa	840
atggggatcc	tgagttgtct	tcagacaaca	ataggatcta	ttacttattt	gctatgaata	900
attactgccc	tgatatggcc	agtatgattt	tcttttggtg	gtctatgcgc	caaacgggta	960
agagaaacag	tatttggctg	tttggacctg	ctacaaccgg	taaaaccaat	ttagcaagtg	1020
ctattgcaca	tactgctgcc	agttatgggt	gtgttaactg	gaataacgca	aatttcccgt	1080
ttcaagacat	tgtgaatgtg	caactgggtt	ggtgggagga	aggaaagatg	acagaggatg	1140
tggttgaatg	tgctaaggca	ttgctagggg	gaagtaatgt	aagagttgac	cgcaaatgta	1200
tgcaatctgc	ggaagtgcaa	tctcctcctt	ttattatcac	atccaatacg	gatatgtgcc	1260
ttgtttctca	aggcagttac	atcagttttg	agcaccagca	gcctctccag	gatagaatga	1320
ttaaatttga	gtttaaccat	gttcttcctg	gcaatttcgg	cctcatttct	gaagatgaag	1380
ttgtggcctt	cttcagaaat	ggtgcttata	atgtgttgaa	gcatgcgtac	atgagaaagg	1440
cccagctttt	tgctctcggt	ccagcttcct	tgccatataa	gccccctacg	ggtgaattag	1500
tgtgtataga	ccaagctaag	tctccttctc	cctctgcttc	tcgccgcagt	gtgagaaatt	1560
ggatgacgtg	tccccctgat	cctgtccagg	acgatcccgc	tgaactggac	gagtattttc	1620
ctccagatac	tcctccagag	gattgtcctt	gtcctatttc	tcctgtgagg	gagtcttgtc	1680
cctcgccagg	gccttgccct	acccctcctc	gcaaaaaaca	acggaagagc	aagcattgct	1740
ccttgtctgt	ctctgcgggt	aaagttcctg	tggtggttgt	gggtgattct	gactcagtcc	1800
cccccgaaga	aaaagaaaaa	gaggaagttt	ccgtggggga	atcccaggat	ccacaactgt	1860
actgggacct	aactctcagt	caatccgacg	ttcctgtgcc	tgaagacgag	agtacccagt	1920
ttcctgacga	cgctgtggac	gcttctgatc	tcattgctga	acagtagtta	aggtatgagc	1980
cgttctactc	aaagagatct	ttggtctttg	ttaagggaga	gacttgaaag	gtataaggat	2040
cgagttaaat	attatggtat	tttggtgcca	gaacgtcctt	ctaccttagc	atcttatttt	2100

- 22 031278

agtaaagacc	cacctccaga	tcctccaact	gttaaatttg	ataaacccta	tcaggatgta	2160
gatagattct	ggtttccaac	agacgattat	actgactggt	atgtctggca	tggagaggac	2220
agacctccta	gatttaccga	gcattccggt	gttcagggtt	ttaaaactag	gtgtgagggg	2280
gggcttcctt	taatgcccag	tgatcccaaa	ttttgcccca	tacaaaattt	ttgggatcag	2340
ttcgctaatt	ttgatgaggg	gtctccgtcc	acccagatcg	gtgagagtgt	ttcatggagt	2400
gatcattttg	gaagtcccga	tccctctcat	catcaggagg	tgagggatgc	tgatgaagtt	2460
acttccgagc	ggcagcaata	taaaaatagg	attgtcacct	tactaagaaa	agtttattgg	2520
gctaagcagt	ggtctgggaa	attacaaatt	aatgttcctt	ccctcgaaag	cctttatgag	2580
cagatcccct	atatgctagc	ctatatggac	gccgataatt	ggcgtcagaa	tttgttagct	2640
gctaaaactc	tgcgaaccac	tttggaagca	ttttcctgtg	ttccagatcc	ttccacgtgc	2700
gatgtcacaa	tctccacacc	cctatctggt	gaaacggatc	ccgcctcttt	tgcaaaatac	2760
ttatgttccc	ttgtatgcaa	caggtctcaa	gaaaaagaac	aggcgcagac	gccttctttg	2820
tctccatcta	agcaaaaagg	gcagatgtca	agtcctgatt	ctgcatcgat	ctcccaacct	2880
ccccctgaaa	gtcacaagga	tagactgctt	cctaaaactg	atccccttca	ggaagcaggg	2940
ccccttcccg	ctccccctac	agctcagaag	cctattatct	ctaagggtgc	aggcggtgga	3000
gggtcgtctg	gcttcataat	ccctccaaaa	cctcctagcc	ccgatcatac	taaagatccc	3060
ccccctcctc	ctcctccctc	tccaattcct	cctcctacat	ctgcgcctga	cgcagaggag	3120
cacgagctag	agcgtgctaa	gcaggagaaa	caagaggaag	atgagctcat	tgaaagaatc	3180
aaatcaggag	aaggagaagg	agaacgagga	ggcttcgtct	tgccttctca	ccactacact	3240
ggtcctagaa	atcctgtccc	agctggcaag	cctgctgacc	ccgttgatga	atcttctgcg	3300
agacatgaca	tcaggtatgg	gcaacgtctt	aaacatggag	actggccata	cctgtggggg	3360
aaggacttgg	ataatgctca	gcgagatgag	attatcaaag	ctcttcatag	tcatgtcaaa	3420
gtgggaaccc	aattggcagg	gaatatagtg	aggagtatct	ggaaggctaa	ggagctctta	3480
acagaacctg	tgtatgagct	gttaaagtct	attctccctc	cttcagattt	atctaaagtt	3540
cctcttcctc	attcccaaca	gacagacaga	acagaagatc	cagaaactcc	aggggagact	3600
agaggaactg	gatcagacag	tcctcgatct	cctcggcctt	ctggatcaac	tgaagacggg	3660
ggaggtcctt	cttccgagtc	cagattacct	gggagtaaag	ttccagtaga	cccatctgcc	3720
accacgtctg	aagcaaagag	gcagaggact	gaggagggga	tggacatatc	ttcatgcggt	3780
ccagggggga	tttctgcttc	tggggctgct	tcaaataact	ctggtcttgc	ttgtgggggt	3840
ggggggggta	ctaatttagg	gacagaatct	cttgtatccg	gctgtcagtt	tggtaaaaac	3900
tctgtgatca	cttcatcttt	tagacgatgt	cttatttcac	cctggcctga	taaatactgt	3960
tgttcttctg	ctcacgatct	tattcccgga	gtggtctacg	agaccccttg	gtgctattat	4020

- 23 031278

gatctgaacg	tcatctcaag	ctacattttt	tctccttctg	cttggcagag	gcttttggag	4080
gattatgatg	cctttcgacc	taaatccctt	aaagttacca	tccagtcttt	agttttaaag	4140
atgtctgtca	aggtgcagaa	aaaacaaact	acagttcagg	attcccagtc	agccactatt	4200
gctatctttg	aggataaaga	ctatgactac	ccctatgtga	tgggaggggg	tcaaaaaaca	4260
gttccgggtc	acttgcccgg	tcaaccttat	aatcttccca	agtattctta	cagaaccctt	4320
ggttcagtca	aagaaagtaa	tagggccagt	atgggcggtt	cagggtacac	tttcaaatcc	4380
aatcaagata	cggaattgtt	cctgcttgaa	acacatgatg	ccactcttat	tcgaggcggg	4440
ggtacttttg	agcagtacta	tgaatttcca	aacgatcttc	ctttcgaaaa	tttgactcag	4500
tatccttggg	atatccgccg	tcaggataac	cccctctatc	agcagaggat	cactgtcatg	4560
tcaggttctg	acagagatac	ggtaggcatt	ctagatggag	atttttactc	tccttttcgg	4620
ttcaaaggac	atgatagacc	cgccatgtgg	ctgccaggac	agaggttgat	tcagggcaaa	4680
ttcatagata	cgcacccaat	acccaataca	gggaggagtg	gggttcatcc	taatgatttt	4740
cacacaaggg	gcgatggtca	tggtgacacc	catagaacac	atgaagagag	gatctacagt	4800
ctagatacag	gtcttgctgc	tatgccacgt	gccgctcata	gacccaccct	tcagcccgga	4860
cctaggactc	tgtctcatgc	cgtacgcaga	cccgatggtt	ccaccgtggt	cacggctaat	4920
gcgtgtgctt	acgcttacac	ccaggagaat	cctcatcagg	aaccctggag	tgatctcaat	4980
gtcagacata	ccatgtatag	gttagcctat	caacgtcaaa	aaggttttca	gcaacccggg	5040
gaccctcttc	atattcgaac	ccatgcttgt	tatggggacg	gggatgttac	cattccaaaa	5100
gaagagtcct	tatggcctac	tgttctgggt	agttgcacag	aaaagtcccc	tgcctgttta	5160
gagtcccaga	tttggtgtaa	aacaccaaat	gtggacatgg	tctatggaga	acacacaccc	5220
cctcttgctt	tatggggtat	gcatgctccc	ccaccccatg	tatttctcag	gatgcttgct	5280
caagagggtc	ctcctaatgt	cagtacttgc	agaccggctc	aatctggtca	gaccttcatc	5340
aatcaatatg	gtcagtttct	cctctgtttt	accatggtat	gggaagttaa	gcctagaccc	5400
aagtccatca	agcagtggaa	tccacgtccg	cccatcagca	ttcctgttgg	tcagtctggt	5460
cctgctttca	ttctcgatca	agatggctac	taccgtctcc	cagaacatgt	ctggtctgcc	5520
agggaacgta	tccgcagcaa	acgctagtgc	ccccagcaat	acacttacta	cagtattgat	5580
gtgtcaggca	ttctggttga	ttgttttatt	ttggctccgc	ctactgtatg	gcccatgtaa	5640
acgcatctat	tatgaaaata	aaatacgtca	attgctgatg	taattcgtgt	tgtaattctt	5700
gttttgaaaa	gcgcatattt	tcttgccggt	ctgagtaaca	ccacctatga	catcatataa	5760
atttgattac	gtaacttcct	ctttttactt	ccgtcttttt	ttgattacgc	aatatacaca	5820
attctagcag	ttaactatta	cacaatatca	cac			5853

- 24 031278 <210> 2 <211> 626 <212> Белок <213> Парвовирус свиней 5A

<400> 2

Arg

Gly His

Trp

Leu 15

Gln

Met 1

Gly

Lys

Ser

Gly 5

Arg Lys

Leu

Gly

Pro 10

Val

Ser

Tyr

Arg

Gly

Arg

Pro

Phe

Ser

Val

Arg

Pro

Leu

Lys

Arg

Ser

20

25

30

Gly

Arg

Cys

Ala

Gly

Cys

Arg

Lys

Thr

Pro

His

Leu

Phe

Phe

Gln

Leu

35

40

45

Glu

Lys

Val

Asp

Ser

Lys

Gly

Gly

Leu

His

Leu

His

Phe

Cys

Ile

Ser

50

55

60

Val

Ala

Ala

Gly

Thr

Pro

Arg

Asp

Val

Ser

Ser

Met

Phe

Lys

Ala

Ile

65

70

75

80

Glu

Arg

Arg

Val

Ser

Phe

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Val

Glu

Gly

Leu

Thr

Phe

85

90

95

Phe

Thr

Pro

His

Lys

Asn

Lys

His

Gly

Ala

Trp

Lys

Ser

Asn

Asp

Glu

100

105

110

Gly

Phe

Ile

Val

Asn

Tyr

Leu

Leu

Lys

Lys

Leu

Pro

Leu

Ser

Glu

Cys

115

120

125

Val

Tyr

Ala

Trp

Thr

Asn

Met

Asp

Gly

Val

Ile

Gly

Asp

Ala

Cys

Leu

130

135

140

Asn

Glu

Asp

Lys

Arg

Arg

Glu

Leu

Leu

Ser

Glu

Arg

Gln

Asp

Gln

Gly

145

150

155

160

Val

Ile

Lys

Glu

Leu

Thr

Ala

Pro

Thr

Phe

Lys

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

165

170

175

Lys

Met

Leu

Ser

Val

Val

Asp

Trp

Met

Cys

Asp

Asn

Asp

Val

Thr

Thr

180

185

190

Glu

Arg

Arg

Trp

Glu

Glu

Ile

Ser

Ala

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ser

Phe

Leu

195

200

205

Ala

Thr

Pro

Ala

Gly

Thr

His

Leu

Ala

Lys

Gln

Cys

Leu

Arg

Ala

Ala

210

215

220

- 25 031278

Asn 225

Gln

Arg

Ile

Val

Ser 230

Thr

Lys

Thr

Ser

Trp 235

Leu

Ser

Leu

Cys

Lys 240

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

Leu

Arg

Ala

Phe

Gln

Asn

Gly

Asp

Pro

Glu

245

250

255

Leu

Ser

Ser

Asp

Asn

Asn

Arg

Ile

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Ala

Met

Asn

Asn

260

265

270

Tyr

Cys

Pro

Asp

Met

Ala

Ser

Met

Ile

Phe

Phe

Trp

Trp

Ser

Met

Arg

275

280

285

Gln

Thr

Gly

Lys

Arg

Asn

Ser

Ile

Trp

Leu

Phe

Gly

Pro

Ala

Thr

Thr

290

295

300

Gly

Lys

Thr

Asn

Leu

Ala

Ser

Ala

Ile

Ala

His

Thr

Ala

Ala

Ser

Tyr

305

310

315

320

Gly

Cys

Val

Asn

Trp

Asn

Asn

Ala

Asn

Phe

Pro

Phe

Gln

Asp

Ile

Val

325

330

335

Asn

Val

Gln

Leu

Gly

Trp

Trp

Glu

Glu

Gly

Lys

Met

Thr

Glu

Asp

Val

340

345

350

Val

Glu

Cys

Ala

Lys

Ala

Leu

Leu

Gly

Gly

Ser

Asn

Val

Arg

Val

Asp

355

360

365

Arg

Lys

Cys

Met

Gln

Ser

Ala

Glu

Val

Gln

Ser

Pro

Pro

Phe

Ile

Ile

370

375

380

Thr

Ser

Asn

Thr

Asp

Met

Cys

Leu

Val

Ser

Gln

Gly

Ser

Tyr

Ile

Ser

385

390

395

400

Phe

Glu

His

Gln

Gln

Pro

Leu

Gln

Asp

Arg

Met

Ile

Lys

Phe

Glu

Phe

405

410

415

Asn

His

Val

Leu

Pro

Gly

Asn

Phe

Gly

Leu

Ile

Ser

Glu

Asp

Glu

Val

420

425

430

Val

Ala

Phe

Phe

Arg

Asn

Gly

Ala

Tyr

Asn

Val

Leu

Lys

His

Ala

Tyr

435

440

445

Met

Arg

Lys

Ala

Gln

Leu

Phe

Ala

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Tyr

450

455

460

Lys

Pro

Pro

Thr

Gly

Glu

Leu

Val

Cys

Ile

Asp

Gln

Ala

Lys

Ser

Pro

465

470

475

480

- 26 031278

Ser

Pro

Ser Ala

Ser 485

Arg Arg

Ser Val

Arg 490

Asn

Trp

Met

Thr

Cys 495

Pro

Pro

Asp

Pro

Val

Gln

Asp

Asp

Pro

Ala

Glu

Leu

Asp

Glu

Tyr

Phe

Pro

500

505

510

Pro

Asp

Thr

Pro

Pro

Glu

Asp

Cys

Pro

Cys

Pro

Ile

Ser

Pro

Val

Arg

515

520

525

Glu

Ser

Cys

Pro

Ser

Pro

Gly

Pro

Cys

Pro

Thr

Pro

Pro

Arg

Lys

Lys

530

535

540

Gln

Arg

Lys

Ser

Lys

His

Cys

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

Ala

Gly

Lys

Val

545

550

555

560

Pro

Val

Val

Val

Val

Gly

Asp

Ser

Asp

Ser

Val

Pro

Pro

Glu

Glu

Lys

565

570

575

Glu

Lys

Glu

Glu

Val

Ser

Val

Gly

Glu

Ser

Gln

Asp

Pro

Gln

Leu

Tyr

580

585

590

Trp

Asp

Leu

Thr

Leu

Ser

Gln

Ser

Asp

Val

Pro

Val

Pro

Glu

Asp

Glu

595

600

605

Ser

Thr

Gln

Phe

Pro

Asp

Asp

Ala

Val

Asp

Ala

Ser

Asp

Leu

Ile

Ala

610

615

620

Glu Gln

625 <210> 3 <211> 290 <212> Белок <213> Парвовирус свиней 5A

<400> 3

Arg

Glu 15

Arg

Met 1

Ser

Arg

Ser Thr Gln 5

Arg

Asp

Leu

Trp 10

Ser Leu

Leu

Leu

Glu

Arg

Tyr

Lys

Asp

Arg

Val

Lys

Tyr

Tyr

Gly

Ile

Leu

Val

Pro

20

25

30

Glu

Arg

Pro

Ser

Thr

Leu

Ala

Ser

Tyr

Phe

Ser

Lys

Asp

Pro

Pro

Pro

35

40

45

Asp

Pro

Pro

Thr

Val

Lys

Phe

Asp

Lys

Pro

Tyr

Gln

Asp

Val

Asp

Arg

50

55

60

- 27 031278

Phe 65

Trp

Phe

Pro

Thr

Asp 70

Asp

Tyr

Thr

Asp

Trp 75

Tyr

Val

Trp

His

Gly 80

Glu

Asp

Arg

Pro

Pro

Arg

Phe

Thr

Glu

His

Ser

Gly

Val

Gln

Gly

Phe

85

90

95

Lys

Thr

Arg

Cys

Glu

Gly

Gly

Leu

Pro

Leu

Met

Pro

Ser

Asp

Pro

Lys

100

105

110

Phe

Cys

Pro

Ile

Gln

Asn

Phe

Trp

Asp

Gln

Phe

Ala

Asn

Phe

Asp

Glu

115

120

125

Gly

Ser

Pro

Ser

Thr

Gln

Ile

Gly

Glu

Ser

Val

Ser

Trp

Ser

Asp

His

130

135

140

Phe

Gly

Ser

Pro

Asp

Pro

Ser

His

His

Gln

Glu

Val

Arg

Asp

Ala

Asp

145

150

155

160

Glu

Val

Thr

Ser

Glu

Arg

Gln

Gln

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ile

Val

Thr

Leu

165

170

175

Leu

Arg

Lys

Val

Tyr

Trp

Ala

Lys

Gln

Trp

Ser

Gly

Lys

Leu

Gln

Ile

180

185

190

Asn

Val

Pro

Ser

Leu

Glu

Ser

Leu

Tyr

Glu

Gln

Ile

Pro

Tyr

Met

Leu

195

200

205

Ala

Tyr

Met

Asp

Ala

Asp

Asn

Trp

Arg

Gln

Asn

Leu

Leu

Ala

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Leu

Arg

Thr

Thr

Leu

Glu

Ala

Phe

Ser

Cys

Val

Pro

Asp

Pro

Ser

225

230

235

240

Thr

Cys

Asp

Val

Thr

Ile

Ser

Thr

Pro

Leu

Ser

Gly

Glu

Thr

Asp

Pro

245

250

255

Ala

Ser

Phe

Ala

Lys

Tyr

Leu

Cys

Ser

Leu

Val

Cys

Asn

Arg

Ser

Gln

260

265

270

Glu

Lys

Glu

Gln

Ala

Gln

Thr

Pro

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Lys

Gln

Lys

275

280

285

Gly Gln

290 <210> 4 <211> 792 <212> Белок

- 28 031278 <213> Парвовирус свиней 5A

<400> 4

Arg

Ile Asn Ser Gly Glu Gly Glu

Gly Glu

Arg

Gly

Gly 15

Phe

Met 1

Gln

5

10

Val

Leu

Pro

Ser

His

His

Tyr

Thr

Gly

Pro

Arg

Asn

Pro

Val

Pro

Ala

20

25

30

Gly

Lys

Pro

Ala

Asp

Pro

Val

Asp

Glu

Ser

Ser

Ala

Arg

His

Asp

Ile

35

40

45

Arg

Tyr

Gly

Gln

Arg

Leu

Lys

His

Gly

Asp

Trp

Pro

Tyr

Leu

Trp

Gly

50

55

60

Lys

Asp

Leu

Asp

Asn

Ala

Gln

Arg

Asp

Glu

Ile

Ile

Lys

Ala

Leu

His

65

70

75

80

Ser

His

Val

Lys

Val

Gly

Thr

Gln

Leu

Ala

Gly

Asn

Ile

Val

Arg

Ser

85

90

95

Ile

Trp

Lys

Ala

Lys

Glu

Leu

Leu

Thr

Glu

Pro

Val

Tyr

Glu

Leu

Leu

100

105

110

Lys

Ser

Ile

Leu

Pro

Pro

Ser

Asp

Leu

Ser

Lys

Val

Pro

Leu

Pro

His

115

120

125

Ser

Gln

Gln

Thr

Asp

Arg

Thr

Glu

Asp

Pro

Glu

Thr

Pro

Gly

Glu

Thr

130

135

140

Arg

Gly

Thr

Gly

Ser

Asp

Ser

Pro

Arg

Ser

Pro

Arg

Pro

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

Thr

Glu

Asp

Gly

Gly

Gly

Pro

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Leu

Pro

Gly

Ser

165

170

175

Lys

Val

Pro

Val

Asp

Pro

Ser

Ala

Thr

Thr

Ser

Glu

Ala

Lys

Arg

Gln

180

185

190

Arg

Thr

Glu

Glu

Gly

Met

Asp

Ile

Ser

Ser

Cys

Gly

Pro

Gly

Gly

Ile

195

200

205

Ser

Ala

Ser

Gly

Ala

Ala

Ser

Asn

Asn

Ser

Gly

Leu

Ala

Cys

Gly

Gly

210

215

220

Gly

Gly

Gly

Thr

Asn

Leu

Gly

Thr

Glu

Ser

Leu

Val

Ser

Gly

Cys

Gln

225

230

235

240

- 29 031278

Phe

Gly Lys

Asn

Ser Val 245

Ile

Thr

Ser

Ser 250

Phe

Arg

Arg

Cys

Leu 255

Ile

Ser

Pro

Trp

Pro

Asp

Lys

Tyr

Cys

Cys

Ser

Ser

Ala

His

Asp

Leu

Ile

260

265

270

Pro

Gly

Val

Val

Tyr

Glu

Thr

Pro

Trp

Cys

Tyr

Tyr

Asp

Leu

Asn

Val

275

280

285

Ile

Ser

Ser

Tyr

Ile

Phe

Ser

Pro

Ser

Ala

Trp

Gln

Arg

Leu

Leu

Glu

290

295

300

Asp

Tyr

Asp

Ala

Phe

Arg

Pro

Lys

Ser

Leu

Lys

Val

Thr

Ile

Gln

Ser

305

310

315

320

Leu

Val

Leu

Lys

Met

Ser

Val

Lys

Val

Gln

Lys

Lys

Gln

Thr

Thr

Val

325

330

335

Gln

Asp

Ser

Gln

Ser

Ala

Thr

Ile

Ala

Ile

Phe

Glu

Asp

Lys

Asp

Tyr

340

345

350

Asp

Tyr

Pro

Tyr

Val

Met

Gly

Gly

Gly

Gln

Lys

Thr

Val

Pro

Gly

His

355

360

365

Leu

Pro

Gly

Gln

Pro

Tyr

Asn

Leu

Pro

Lys

Tyr

Ser

Tyr

Arg

Thr

Leu

370

375

380

Gly

Ser

Val

Lys

Glu

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Met

Gly

Gly

Ser

Gly

Tyr

385

390

395

400

Thr

Phe

Lys

Ser

Asn

Gln

Asp

Thr

Glu

Leu

Phe

Leu

Leu

Glu

Thr

His

405

410

415

Asp

Ala

Thr

Leu

Ile

Arg

Gly

Gly

Gly

Thr

Phe

Glu

Gln

Tyr

Tyr

Glu

420

425

430

Phe

Pro

Asn

Asp

Leu

Pro

Phe

Glu

Asn

Leu

Thr

Gln

Tyr

Pro

Trp

Asp

435

440

445

Ile

Arg

Arg

Gln

Asp

Asn

Pro

Leu

Tyr

Gln

Gln

Arg

Ile

Thr

Val

Met

450

455

460

Ser

Gly

Ser

Asp

Arg

Asp

Thr

Val

Gly

Ile

Leu

Asp

Gly

Asp

Phe

Tyr

465

470

475

480

Ser

Pro

Phe

Arg

Phe

Lys

Gly

His

Asp

Arg

Pro

Ala

Met

Trp

Leu

Pro

485

490

495

- 30 031278

Gly

Gln

Arg

Leu 500

Ile

Gln

Gly

Lys

Phe 505

Ile

Asp

Thr

His

Pro 510

Ile

Pro

Asn

Thr

Gly

Arg

Ser

Gly

Val

His

Pro

Asn

Asp

Phe

His

Thr

Arg

Gly

515

520

525

Asp

Gly

His

Gly

Asp

Thr

His

Arg

Thr

His

Glu

Glu

Arg

Ile

Tyr

Ser

530

535

540

Leu

Asp

Thr

Gly

Leu

Ala

Ala

Met

Pro

Arg

Ala

Ala

His

Arg

Pro

Thr

545

550

555

560

Leu

Gln

Pro

Gly

Pro

Arg

Thr

Leu

Ser

His

Ala

Val

Arg

Arg

Pro

Asp

565

570

575

Gly

Ser

Thr

Val

Val

Thr

Ala

Asn

Ala

Cys

Ala

Tyr

Ala

Tyr

Thr

Gln

580

585

590

Glu

Asn

Pro

His

Gln

Glu

Pro

Trp

Ser

Asp

Leu

Asn

Val

Arg

His

Thr

595

600

605

Met

Tyr

Arg

Leu

Ala

Tyr

Gln

Arg

Gln

Lys

Gly

Phe

Gln

Gln

Pro

Gly

610

615

620

Asp

Pro

Leu

His

Ile

Arg

Thr

His

Ala

Cys

Tyr

Gly

Asp

Gly

Asp

Val

625

630

635

640

Thr

Ile

Pro

Lys

Glu

Glu

Ser

Leu

Trp

Pro

Thr

Val

Leu

Gly

Ser

Cys

645

650

655

Thr

Glu

Lys

Ser

Pro

Ala

Cys

Leu

Glu

Ser

Gln

Ile

Trp

Cys

Lys

Thr

660

665

670

Pro

Asn

Val

Asp

Met

Val

Tyr

Gly

Glu

His

Thr

Pro

Pro

Leu

Ala

Leu

675

680

685

Trp

Gly

Met

His

Ala

Pro

Pro

Pro

His

Val

Phe

Leu

Arg

Met

Leu

Ala

690

695

700

Gln

Glu

Gly

Pro

Pro

Asn

Val

Ser

Thr

Cys

Arg

Pro

Ala

Gln

Ser

Gly

705

710

715

720

Gln

Thr

Phe

Ile

Asn

Gln

Tyr

Gly

Gln

Phe

Leu

Leu

Cys

Phe

Thr

Met

725

730

735

Val

Trp

Glu

Val

Lys

Pro

Arg

Pro

Lys

Ser

Ile

Lys

Gln

Trp

Asn

Pro

740

745

750

- 31 031278

Arg

Pro

Pro 755

Ile

Ser

Ile

Pro

Val 760

Gly Gln

Ser

Gly

Pro 765

Ala

Phe

Ile

Leu

Asp

Gln

Asp

Gly

Tyr

Tyr

Arg

Leu

Pro

Glu

His

Val

Trp

Ser

Ala

770

775

780

Arg

Glu

Arg

Ile

Arg

Ser

Lys

Arg

785

790

<210> 5 <211> 726 <212> Белок <213> Парвовирус свиней 4

<400> 5

Lys 1

His

Gly

His

Trp 5

Pro

His

Leu

Trp

Ala 10

Pro

Phe

Val

Asp

Arg 15

Gln

Met

Ser

Gln

Glu

Ile

Gln

Gln

Val

Leu

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Leu

Ser

20

25

30

Gln

Lys

Leu

Leu

Ala

Asn

Phe

Ile

Ile

Ala

Leu

Trp

Arg

Ala

Lys

Glu

35

40

45

Lys

Ile

Gly

Ala

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ile

Val

Lys

Gly

Val

Phe

Pro

Ser

50

55

60

Val

Asp

Lys

Lys

Thr

Val

Glu

Ser

Leu

Leu

Pro

His

Pro

Asp

Pro

Ile

65

70

75

80

Pro

Ala

Pro

Pro

Ser

Ser

Pro

Gln

Arg

Gly

Ser

Lys

Arg

Ala

Ser

Pro

85

90

95

Pro

Gln

Ser

Pro

Asn

Ala

His

Asp

Glu

Asp

Thr

Met

Ser

Gly

His

Lys

100

105

110

Arg

Gln

Lys

Thr

Met

Glu

Val

Glu

Ser

Glu

Cys

Asp

Lys

Ser

Leu

Leu

115

120

125

Cys

Pro

Thr

Gln

Asn

Ala

Gly

Ala

Asp

Phe

Glu

Leu

Cys

Gly

Thr

Gly

130

135

140

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Glu

Lys

Gly

Thr

Trp

Val

Gly

Gly

Thr

Gln

Phe

145

150

155

160

Thr

Asp

Thr

Ser

Ile

Arg

Thr

Phe

Gly

Thr

Arg

Arg

Cys

Val

Leu

Ser

165

170

175

- 32 031278

Ala

Phe

Pro Asp 180

Thr

Tyr

Cys

Ser

Met 185

Met

Ser

Gly

Asp

Ala 190

Ile

Pro

Ser

Ile

Ile

Phe

Asn

Thr

Pro

Trp

Tyr

Tyr

Tyr

Asp

Leu

Asn

Ile

Met

195

200

205

Ser

Cys

His

Phe

Ser

Pro

Ser

Ala

Phe

Gln

Thr

Leu

Ile

Glu

Asp

Tyr

210

215

220

Asp

Ala

Phe

Arg

Pro

Arg

Ser

Leu

Thr

Val

His

Leu

Lys

Glu

Leu

Val

225

230

235

240

Ile

Lys

Asp

Val

Cys

Gln

Gln

Gln

Gly

Leu

Gln

Ala

Glu

Gln

Val

Ser

245

250

255

Asp

Asn

Asn

Ser

Ala

Thr

Leu

Leu

Ala

Phe

Glu

Asp

Val

Asn

Tyr

Glu

260

265

270

Leu

Pro

Tyr

Val

Leu

Gly

Gly

Gly

Gln

Val

Ser

Val

Pro

Gly

His

Leu

275

280

285

Pro

Gly

Gln

Pro

Tyr

Gln

Leu

Pro

Lys

Tyr

Ser

Tyr

Arg

Thr

Val

Gly

290

295

300

Lys

Pro

Asp

Pro

Asn

Ser

Gly

Phe

Val

Pro

Gly

Arg

Asn

Thr

His

Pro

305

310

315

320

Asp

Gln

Gly

Pro

Gly

His

Pro

Lys

Ala

Ser

Lys

Thr

Ile

Trp

Tyr

Ser

325

330

335

Gln

Tyr

Leu

Glu

Thr

Gln

Asp

Thr

Glu

Phe

Tyr

Ile

Leu

Glu

Asn

His

340

345

350

Lys

Ala

Thr

Ile

Leu

His

Ser

Gly

Asn

Thr

Phe

Ser

Gln

His

Tyr

Asn

355

360

365

Phe

Pro

Asp

Leu

Pro

Phe

Glu

Gln

Leu

Thr

Gln

Tyr

Met

Trp

Asp

Ala

370

375

380

Arg

Arg

Gln

Asp

Asn

Pro

Leu

Ile

Asp

Gln

Arg

Ile

Gln

Val

Met

Ser

385

390

395

400

Arg

Met

Tyr

Asp

Asp

Gly

Pro

Gln

Lys

Thr

Phe

Ala

Ile

Lys

Val

Asn

405

410

415

Pro

Tyr

Ile

Val

Pro

Phe

Thr

Val

Lys

Ser

Thr

Ser

Arg

Pro

Ala

Met

420

425

430

- 33 031278

Phe

Leu Ala 435

Gly

Gly

Arg

Phe

Lys 440

Asp

Gly

Asp

Tyr

Ser 445

Ile

Thr

Gly

Pro

Gly

Asp

Arg

Asp

Lys

Thr

Ser

Phe

Lys

Tyr

Tyr

Asn

Asp

Pro

Pro

450

455

460

Trp

Ile

Ile

Thr

Arg

Asp

Thr

Tyr

Leu

Phe

Ser

Ser

Asp

Leu

Ala

Lys

465

470

475

480

Thr

Glu

Arg

Glu

Gln

Pro

Gly

Pro

Arg

Gln

Gly

Asp

Thr

Val

Val

Arg

485

490

495

Thr

Pro

Asp

Gly

Thr

Leu

Ile

Val

Thr

Thr

Asn

Ala

Leu

Ala

Tyr

Gly

500

505

510

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr

Leu

Lys

Asn

Ile

Pro

Leu

Leu

Ser

Ser

Lys

Tyr

515

520

525

His

Gly

Val

Glu

Asn

Phe

Arg

Leu

Ala

Val

Glu

Asn

Glu

Arg

Gly

Tyr

530

535

540

Ser

Met

Pro

Gly

His

Pro

Ser

His

Ile

Arg

Glu

Thr

Leu

Phe

Arg

Gly

545

550

555

560

Lys

Leu

Pro

Ser

Glu

Ile

Arg

Glu

Ser

Thr

Ile

Lys

Ser

Glu

Asp

Gln

565

570

575

Arg

Lys

Glu

Ile

Thr

Phe

Pro

Asp

Tyr

Met

Gly

Ser

Val

Asn

Glu

Lys

580

585

590

Thr

Thr

Ala

Asn

Leu

Glu

Ser

Gln

Ile

Trp

Ser

Gln

Ile

Pro

Asn

Thr

595

600

605

Asp

Ile

Thr

Glu

Lys

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Leu

Ser

Ile

Trp

Gly

Met

610

615

620

Lys

Asn

Pro

Pro

Pro

Met

Val

Phe

Leu

Arg

Leu

Leu

Ala

Gln

Met

Gly

625

630

635

640

Pro

Pro

Arg

Arg

Ser

Ala

Cys

Ser

Gly

Ser

Ile

Pro

Ser

Asn

Thr

Tyr

645

650

655

Leu

Asn

Gln

Tyr

Cys

Gln

Phe

Leu

Leu

Thr

Tyr

Glu

Met

Glu

Trp

Asp

660

665

670

Val

Ile

Lys

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Val

Arg

Trp

Asn

Pro

Ile

Pro

Pro

- 34 031278

675

680

685

Pro

Gln

Ile

Pro

Met

Gly

Pro

Asn

Asn

Leu

Pro

Val

Tyr

Ile

Leu

Asn

690

695

700

Lys

Glu

Gly

Gln

Tyr

Arg

Met

Pro

Thr

Glu

Val

Trp

Thr

Ala

Lys

Gln

705

710

715

720

Arg

Pro

Arg

His

Arg

Arg

725 <210> 6 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 6 aatgcgtgtg cttacgctta <210> 7 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной ский праймер последовательности:

Синтетиче<400> 7 tgggttcgaa tatgaagagg <210> 8 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной ский праймер последовательности:

Синтетиче<400> 8 tcatcaggaa ccctggagtg atctca <210> 9 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 35 031278 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 9 gtactatgaa tttccaaacg atcttccttt cg <210> 10 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 10 ttacaccaaa tctgggactc taaacaggc 29 <210> 11 <211> 495 <212> Белок <213> Парвовирус свиней 4

<400> 11

Ala Glu Ala 10

Leu

Phe

Arg

Glu

Leu 15

Gln

Leu Val 1

Ile

Ala

Val 5

Arg

Gln

Lys

Glu

Leu

Arg

Lys

Ser

Cys

Arg

Leu

Gly

Val

Asp

Pro

Gly

Ile

Phe

20

25

30

Met

Gln

Leu

Glu

Glu

Val

Asp

Ser

Lys

Gly

Gly

Leu

His

Leu

His

Trp

35

40

45

Cys

Val

Ser

Val

Ser

Ala

Gly

Thr

Pro

Arg

Asp

Val

Leu

Thr

Ile

Phe

50

55

60

Lys

Asn

Thr

Glu

Lys

Lys

Val

Ser

Gln

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Val

Glu

Gly

65

70

75

80

Leu

Ser

Phe

Phe

Val

Pro

His

Lys

Asn

Lys

His

Gly

Ala

Trp

Lys

Ser

85

90

95

Thr

Asp

Glu

Gly

Phe

Ile

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Leu

Lys

Lys

Leu

Pro

Leu

100

105

110

Lys

Glu

Cys

Leu

Tyr

Ala

Trp

Thr

Thr

Ile

Gly

Gly

Ala

Ile

Gly

Asp

115

120

125

Ala

Cys

Leu

Asn

Thr

Asp

Lys

Arg

Lys

Glu

Leu

Leu

Asp

Asn

Arg

Gln

130

135

140

- 36 031278

Asp 145

Pro

Ala Val

Ile

Glu 150

Glu

Leu

Ser

Ala

Pro 155

Met

Tyr

Lys

Cys

Ala 160

Thr

Gly

Glu

Lys

Met

Leu

Asp

Ile

Val

Gln

Trp

Leu

Val

Asp

Asn

Asn

165

170

175

Ile

Cys

Ser

Glu

Ser

Arg

Trp

Glu

Asn

Lys

Asn

Ala

Leu

Ser

Leu

Tyr

180

185

190

Ser

Phe

Leu

Ala

Thr

Gln

Ala

Gly

Gly

Tyr

Met

Ala

Lys

Gln

Cys

Leu

195

200

205

Arg

Ile

Ala

Gln

Gln

Lys

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Pro

Leu

Gly

Leu

Thr

210

215

220

Leu

Met

Asp

Phe

Lys

Gly

Met

Asn

Ala

Leu

Arg

Arg

Phe

Gln

Gln

Asp

225

230

235

240

Glu

Gly

Glu

Met

Thr

Phe

Asp

Asn

Asn

Arg

Met

His

Tyr

Ile

Phe

Ala

245

250

255

Ile

Asn

Asn

Tyr

Asp

Pro

Lys

Ile

Ala

Ser

Val

Ile

Met

Tyr

Phe

Trp

260

265

270

Ser

Met

Lys

Gln

Thr

Gly

Lys

Arg

Asn

Cys

Val

Trp

Phe

Tyr

Gly

Pro

275

280

285

Ala

Thr

Thr

Gly

Lys

Thr

Asn

Met

Ala

Gln

Ala

Ile

Cys

His

Ser

Ser

290

295

300

Ala

Asn

Tyr

Gly

Asn

Val

Asn

Trp

Asn

Asn

Ala

Asn

Phe

Pro

Phe

Gln

305

310

315

320

Asp

Ile

Val

Gly

Ala

Gln

Val

Gly

Trp

Trp

Glu

Glu

Gly

Lys

Met

Thr

325

330

335

Gly

Asp

Met

Val

Glu

Ala

Ala

Lys

Ala

Leu

Leu

Gly

Gly

Thr

Ala

Leu

340

345

350

Arg

Ile

Asp

Arg

Lys

Cys

Met

Gln

Ser

Ile

Glu

Val

Asn

Ser

Pro

Pro

355

360

365

Phe

Leu

Ile

Thr

Ser

Asn

Val

Asp

Met

Thr

Ile

Val

Gln

Glu

Gly

Ser

370

375

380

Phe

Val

Ser

Phe

Glu

His

Gln

Gln

Pro

Leu

Glu

Asp

Arg

Met

Ile

Lys

385 390 395 400

- 37 031278

Phe

Ser

Phe

Asn

Met 405

Thr

Leu

Pro

Gly

Asn 410

Phe

Gly

Leu

Ile

Thr 415

Ser

Glu

Glu

Val

Lys

Ser

Phe

Phe

Arg

Met

Gly

Ala

Lys

Leu

Ala

Ala

Gln

420

425

430

Pro

Asp

Ile

Met

Asn

Cys

Pro

Ile

Phe

Lys

Lys

Gly

Pro

Ala

Ser

Ile

435

440

445

Arg

His

Leu

Val

Pro

Val

Gly

Glu

Ile

Pro

Pro

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

450

455

460

His

Lys

Arg

Gln

Pro

Leu

Tyr

Met

Arg

Ala

Glu

Pro

Asp

Glu

Ile

Gln

465

470

475

480

Asp

Asn

Pro

Glu

Glu

Leu

Asp

His

Trp

Phe

Glu

Glu

Glu

Ala

Pro

485

490

495

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изолированный полинуклеотид, кодирующий обладающий иммуногенностью полипептид парвовируса свиней 5А (PPV5А), выбранный из группы, включающей:

   а) полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1;

   б) полинуклеотид, имеющий последовательность, которая кодирует полипептид последовательности SEQ ID NO: 2 или полипептид последовательности SEQ ID NO: 3;

   в) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1; и

   г) полинуклеотид, имеющий последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 1, которая кодирует полипептид, имеющий биологическую или иммунологически эффективную активность полипептида SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или последовательности нуклеотидов 28455547 SEQ ID NO: 1.

   2. Изолированный обладающий иммуногенностью полипептид парвовируса свиней 5А (PPV5А), выбранный из группы, включающей:

   а) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или кодируемый полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1; и

   б) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или последовательности полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1, и имеющий биологическую или иммунологически эффективную активность полипептида с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1.

   3. Изолированный парвовирус свиней 5A (PPV5А), обладающий иммуногенностью, содержащий:

   а) полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 1 или

   б) полинуклеотид с последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности SEQ ID NO: 1, которая кодирует полипептид, имеющий биологическую или иммунологически эффективную активность полипептида SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1.

   4. PPV5А по п.3, который представляет собой аттенуированную невирулентную форму PPV5А.

   5. Вакцина для лечения или предотвращения инфекции вирулентным PPV5А, включающая убитую или аттенуированную форму PPV5А по п.3.

   6. Вакцина для лечения или предотвращения инфекции вирулентным PPV5А, включающая субъединицу убитой или аттенуированной формы PPV5А по п.3.

   7. Вакцина по п.6, где указанная субъединица представляет собой капсидный белок, содержащий

   - 38 031278 полипептид, кодируемый полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1.

   8. Вакцина по п.6, где субъединица представляет собой обладающий иммуногенностью фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1.

   9. Иммуногенный препарат против парвовируса свиней 5Л (PPV5A), включающий иммунологически эффективное количество полипептида по п.2 и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

   10. Способ формирования иммунного ответа к парвовирусу свиней 5Л (PPV5A) у млекопитающего, включающий введение иммунологически эффективного количества PPV5A по п.3.

   11. Способ формирования иммунного ответа к парвовирусу свиней 5Л (PPV5A) у млекопитающего, включающий введение иммунологически эффективного количества полипептида по п.2.

   12. Способ формирования иммунного ответа к парвовирусу свиней 5Л (PPV5A) у млекопитающего, включающий введение иммунологически эффективного количества вакцины по п.5.

   13. Способ формирования иммунного ответа к парвовирусу свиней 5Л (PPV5Л) у млекопитающего, включающий введение иммунологически эффективного количества вакцины по п.6.

   14. Способ формирования иммунного ответа к парвовирусу свиней 5Л (PPV5Л) у млекопитающего, включающий введение иммунологически эффективного количества вакцины по п.7.

   15. Способ по п.10, где животное представляет собой свинью, а иммунный щитный иммунитет к заболеванию, вызванному PPV5Л инфекцией.

   16. Способ по п.11, где животное представляет собой свинью, а иммунный щитный иммунитет к заболеванию, вызванному PPV5Л инфекцией.

   17. Способ по п.12, где животное представляет собой свинью, а иммунный щитный иммунитет к заболеванию, вызванному PPV5Л инфекцией.

   18. Способ по п.13, где животное представляет собой свинью, а иммунный щитный иммунитет к заболеванию, вызванному PPV5Л инфекцией.

   19. Способ по п.14, где животное представляет собой свинью, а иммунный щитный иммунитет к заболеванию, вызванному PPV5Л инфекцией.

   20. Изолированное антитело, которое специфически связывается с полипептидом PPV5Л, кодируемым полинуклеотидом парвовируса свиней 5Л, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и где указанное антитело не ответ ответ ответ ответ ответ обеспечивает обеспечивает обеспечивает обеспечивает обеспечивает зазазазазасвязывается с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом другого парвовируса.

   21. Изолированное антитело, которое специфически связывается с полипептидом PPV5Л, кодируемым полинуклеотидом парвовируса свиней 5Л, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и где указанное антитело не связывается с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом другого парвовируса.

   22. Изолированное антитело, которое специфически связывается с полипептидом PPV5Л, кодируемым полинуклеотидом парвовируса свиней 5Л, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, где указанный полипептид имеет последовательность полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов 2845-5547 SEQ ID NO: 1, и где указанное антитело не связывается с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом другого парвовируса.

   23. Способ идентификации присутствия PPV5Л в биологическом образце, включающий:

   а) обеспечение контактирования биологического образца с антителом по любому из пп.20-22,

   б) определение образования комплекса между антителом и полинуклеотидом PPV5Л, где образование указанного комплекса свидетельствует о присутствии PPV5Л в биологическом об разце.

   24. Вектор или плазмида для экспрессии, содержащий(ая) полинуклеотид по п.1.

   25. Клетка-хозяин, которая включает вектор по п.24.

   26. Гибридома, которая экспрессирует антитело по п.20.

   27. Гибридома, которая экспрессирует антитело по п.21.

   28. Гибридома, которая экспрессирует антитело по п.22.

   29. Диагностический набор для идентификации присутствия PPV5Л в биологическом образце, включающий:

   а) антитело по любому из пп.20-22 и

   б) реагенты для определения образования комплекса между антителом и полипептидом PPV5Л.

   30. Набор для формирования иммунного ответа в отношении парвовируса свиней 5Л (PPV5Л), включающий:

   а) по крайней мере один иммуногенный пептид PPV5Л по п.2, который является эффективным для иммунизации животного против по крайней мере одного заболевания, ассоциированного с PPV5Л инфекцией;

   б) по крайней мере один адъювант или носитель;

   в) контейнер для упаковки иммуногенной композиции, состоящей из компонентов а) и б);

   - 39 031278

   г) комплект распечатанных инструкций и

   д) дозирующее устройство, способное к введению указанной иммуногенной композиции животному.

   31. Набор по п.30, который дополнительно включает по крайней мере один иммуногенный белок, который является эффективным для иммунизации указанного животного против по крайней мере одного патогенного вируса свиней или бактерии, которые вызывают заболевание, ассоциированное с инфекцией указанным вирусом или бактерией.

   Последовательность ДНК PPV5A

   PPV5A:

   ген 87..1967 /метка = Прогнозируемая репликаза ген 1975..2844 /метка=Прогнозируемый ген с неизвестной функцией / ORF3 ген 2845..5547 /метка =Прогнозируемый капсид

   Последовательность:

   TATTTGCAGGCTTTTCCCTGATATTGGGAAGATTCCTGGGGTGACTCCTGAGCGGTATATTTAT GCTGTAAACGTGAGTACCCGTAATGGGCAAAAGTGGCCGAAAGTTGGGACCGAGGGGCCATTGG CTGCAGGTGTCTTACAGGGGGAGGCCCTTTTCCGTGAGACCCTTAAAGAGGTCCGGAAGGTGTG CCGGCTGCCGCAAGACCCCCCATCTTTTCTTTCAATTGGAGAAAGTTGATTCCAAAGGGGGTCT TCACCTTCATTTTTGTATTAGTGTTGCTGCTGGCACTCCTAGAGATGTGTCTTCGATGTTTAAA GCCATTGAGCGTCGAGTTTCCTTTTACTACTTTGGTGTAGAGGGCTTGACTTTTTTTACTCCTC ATAAAAATAAGCATGGGGCTTGGAAGAGTAATGATGAGGGCTTTATTGTGAATTATCTTCTTAA AAAATTGCCTTTGTCTGAGTGTGTGTATGCGTGGACTAATATGGATGGGGTGATTGGCGATGCC TGTCTGAATGAAGATAAGCGCAGGGAATTGTTGTCTGAGCGTCAAGATCAGGGAGTCATTAAAG AGCTCACTGCTCCTACTTTTAAAGCTGCTACGGGTGATAAAATGTTGAGTGTGGTGGATTGGAT GTGTGATAATGATGTGACTACGGAGCGCCGATGGGAGGAAATATCGGCTGCGTCCCTGTACTCT TTCCTTGCTACCCCAGCTGGCACTCATTTGGCTAAACAGTGTCTTAGAGCTGCGAATCAGCGTA TTGTGAGCACTAAAACCTCTTGGTTGAGTCTCTGTAAATTTGCCAGTGAAAAGGAGCTTCGTGC TTTTCAAAATGGGGATCCTGAGTTGTCTTCAGACAACAATAGGATCTATTACTTATTTGCTATG AATAATTACTGCCCTGATATGGCCAGTATGATTTTCTTTTGGTGGTCTATGCGCCAAACGGGTA AGAGAAACAGTATTTGGCTGTTTGGACCTGCTACAACCGGTAAAACCAATTTAGCAAGTGCTAT TGCACATACTGCTGCCAGTTATGGGTGTGTTAACTGGAATAACGCAAATTTCCCGTTTCAAGAC ATTGTGAATGTGCAACTGGGTTGGTGGGAGGAAGGAAAGATGACAGAGGATGTGGTTGAATGTG CTAAGGCATTGCTAGGGGGAAGTAATGTAAGAGTTGACCGCAAATGTATGCAATCTGCGGAAGT GCAATCTCCTCCTTTTATTATCACATCCAATACGGATATGTGCCTTGTTTCTCAAGGCAGTTAC ATCAGTTTTGAGCACCAGCAGCCTCTCCAGGATAGAATGATTAAATTTGAGTTTAACCATGTTC TTCCTGGCAATTTCGGCCTCATTTCTGAAGATGAAGTTGTGGCCTTCTTCAGAAATGGTGCTTA TAATGTGTTGAAGCATGCGTACATGAGAAAGGCCCAGCTTTTTGCTCTCGGTCCAGCTTCCTTG CCATATAAGCCCCCTACGGGTGAATTAGTGTGTATAGACCAAGCTAAGTCTCCTTCTCCCTCTG CTTCTCGCCGCAGTGTGAGAAATTGGATGACGTGTCCCCCTGATCCTGTCCAGGACGATCCCGC TGAACTGGACGAGTATTTTCCTCCAGATACTCCTCCAGAGGATTGTCCTTGTCCTATTTCTCCT GTGAGGGAGTCTTGTCCCTCGCCAGGGCCTTGCCCTACCCCTCCTCGCAAAAAACAACGGAAGA GCAAGCATTGCTCCTTGTCTGTCTCTGCGGGTAAAGTTCCTGTGGTGGTTGTGGGTGATTCTGA CTCAGTCCCCCCCGAAGAAAAAGAAAAAGAGGAAGTTTCCGTGGGGGAATCCCAGGATCCACAA CTGTACTGGGACCTAACTCTCAGTCAATCCGACGTTCCTGTGCCTGAAGACGAGAGTACCCAGT TTCCTGACGACGCTGTGGACGCTTCTGATCTCATTGCTGAACAGTAGTTAAGGTATGAGCCGTT CTACTCAAAGAGATCTTTGGTCTTTGTTAAGGGAGAGACTTGAAAGGTATAAGGATCGAGTTAA ATATTATGGTATTTTGGTGCCAGAACGTCCTTCTACCTTAGCATCTTATTTTAGTAAAGACCCA CCTCCAGATCCTCCAACTGTTAAATTTGATAAACCCTATCAGGATGTAGATAGATTCTGGTTTC Фиг. 1

   Последовательность ДНК PPV5A

   CAACAGACGATTATACTGACTGGTATGTCTGGCATGGAGAGGACAGACCTCCTAGATTTACCGA GCATTCCGGTGTTCAGGGTTTTAAAACTAGGTGTGAGGGGGGGCTTCCTTTAATGCCCAGTGAT CCCAAATTTTGCCCCATACAAAATTTTTGGGATCAGTTCGCTAATTTTGATGAGGGGTCTCCGT CCACCCAGATCGGTGAGAGTGTTTCATGGAGTGATCATTTTGGAAGTCCCGATCCCTCTCATCA TCAGGAGGTGAGGGATGCTGATGAAGTTACTTCCGAGCGGCAGCAATATAAAAATAGGATTGTC ACCTTACTAAGAAAAGTTTATTGGGCTAAGCAGTGGTCTGGGAAATTACAAATTAATGTTCCTT CCCTCGAAAGCCTTTATGAGCAGATCCCCTATATGCTAGCCTATATGGACGCCGATAATTGGCG TCAGAATTTGTTAGCTGCTAAAACTCTGCGAACCACTTTGGAAGCATTTTCCTGTGTTCCAGAT CCTTCCACGTGCGATGTCACAATCTCCACACCCCTATCTGGTGAAACGGATCCCGCCTCTTTTG CAAAATACTTATGTTCCCTTGTATGCAACAGGTCTCAAGAAAAAGAACAGGCGCAGACGCCTTC TTTGTCTCCATCTAAGCAAAAAGGGCAGATGTCAAGTCCTGATTCTGCATCGATCTCCCAACCT CCCCCTGAAAGTCACAAGGATAGACTGCTTCCTAAAACTGATCCCCTTCAGGAAGCAGGGCCCC TTCCCGCTCCCCCTACAGCTCAGAAGCCTATTATCTCTAAGGGTGCAGGCGGTGGAGGGTCGTC TGGCTTCATAATCCCTCCAAAACCTCCTAGCCCCGATCATACTAAAGATCCCCCCCCTCCTCCT CCTCCCTCTCCAATTCCTCCTCCTACATCTGCGCCTGACGCAGAGGAGCACGAGCTAGAGCGTG С TAAGCAGGAGAAACAAGAGGAAGAT GAGCT CAT T GAAAGAATСAAATCAGGAGAAGGAGAAGG AGAACGAGGAGGCTTCGTCTTGCCTTCTCACCACTACACTGGTCCTAGAAATCCTGTCCCAGCT GGCAAGCCTGCTGACCCCGTTGATGAATCTTCTGCGAGACATGACATCAGGTATGGGCAACGTC TTAAACATGGAGACTGGCCATACCTGTGGGGGAAGGACTTGGATAATGCTCAGCGAGATGAGAT TATCAAAGCTCTTCATAGTCATGTCAAAGTGGGAACCCAATTGGCAGGGAATATAGTGAGGAGT ATCTGGAAGGCTAAGGAGCTCTTAACAGAACCTGTGTATGAGCTGTTAAAGTCTATTCTCCCTC CTTCAGATTTATCTAAAGTTCCTCTTCCTCATTCCCAACAGACAGACAGAACAGAAGATCCAGA AACTCCAGGGGAGACTAGAGGAACTGGATCAGACAGTCCTCGATCTCCTCGGCCTTCTGGATCA ACTGAAGACGGGGGAGGTCCTTCTTCCGAGTCCAGATTACCTGGGAGTAAAGTTCCAGTAGACC CATCTGCCACCACGTCTGAAGCAAAGAGGCAGAGGACTGAGGAGGGGATGGACATATCTTCATG CGGTCCAGGGGGGATTTCTGCTTCTGGGGCTGCTTCAAATAACTCTGGTCTTGCTTGTGGGGGT GGGGGGGGTACTAATTTAGGGACAGAATCTCTTGTATCCGGCTGTCAGTTTGGTAAAAACTCTG TGATCACTTCATCTTTTAGACGATGTCTTATTTCACCCTGGCCTGATAAATACTGTTGTTCTTC TGCTCACGATCTTATTCCCGGAGTGGTCTACGAGACCCCTTGGTGCTATTATGATCTGAACGTC ATCTCAAGCTACATTTTTTCTCCTTCTGCTTGGCAGAGGCTTTTGGAGGATTATGATGCCTTTC GACCTAAATCCCTTAAAGTTACCATCCAGTCTTTAGTTTTAAAGATGTCTGTCAAGGTGCAGAA AAAACAAACTACAGTTCAGGATTCCCAGTCAGCCACTATTGCTATCTTTGAGGATAAAGACTAT GACTACCCCTATGTGATGGGAGGGGGTCAAAAAACAGTTCCGGGTCACTTGCCCGGTCAACCTT ATAATCTTCCCAAGTATTCTTACAGAACCCTTGGTTCAGTCAAAGAAAGTAATAGGGCCAGTAT GGGCGGTTCAGGGTACACTTTCAAATCCAATCAAGATACGGAATTGTTCCTGCTTGAAACACAT GATGCCACTCTTATTCGAGGCGGGGGTACTTTTGAGCAGTACTATGAATTTCCAAACGATCTTC CTTTCGAAAATTTGACTCAGTATCCTTGGGATATCCGCCGTCAGGATAACCCCCTCTATCAGCA GAGGATCACTGTCATGTCAGGTTCTGACAGAGATACGGTAGGCATTCTAGATGGAGATTTTTAC TCTCCTTTTCGGTTCAAAGGACATGATAGACCCGCCATGTGGCTGCCAGGACAGAGGTTGATTC AGGGCAAATTCATAGATACGCACCCAATACCCAATACAGGGAGGAGTGGGGTTCATCCTAATGA TTTTCACACAAGGGGCGATGGTCATGGTGACACCCATAGAACACATGAAGAGAGGATCTACAGT CTAGATACAGGTCTTGCTGCTATGCCACGTGCCGCTCATAGACCCACCCTTCAGCCCGGACCTA Фиг. 1 (продолжение)

   - 40 031278

   GGACTCTGTCTCATGCCGTACGCAGACCCGATGGTTCCACCGTGGTCACGGCTAATGCGTGTGC

   TTACGCTTACACCCAGGAGAATCCTCATCAGGAACCCTGGAGTGATCTCAATGTCAGACATACC

   ATGTATAGGTTAGCCTATCAACGTCAAAAAGGTTTTCAGCAACCCGGGGACCCTCTTCATATTC

   GAACCCATGCTTGTTATGGGGACGGGGATGTTACCATTCCAAAAGAAGAGTCCTTATGGCCTAC

   TGTTCTGGGTAGTTGCACAGAAAAGTCCCCTGCCTGTTTAGAGTCCCAGATTTGGTGTAAAACA

   CCAAATGTGGACATGGTCTATGGAGAACACACACCCCCTCTTGCTTTATGGGGTATGCATGCTC

   CCCCACCCCATGTATTTCTCAGGATGCTTGCTCAAGAGGGTCCTCCTAATGTCAGTACTTGCAG

   ACCGGCTCAATCTGGTCAGACCTTCATCAATCAATATGGTCAGTTTCTCCTCTGTTTTACCATG

   GTATGGGAAGTTAAGCCTAGACCCAAGTCCATCAAGCAGTGGAATCCACGTCCGCCCATCAGCA

   TTCCTGTTGGTCAGTCTGGTCCTGCTTTCATTCTCGATCAAGATGGCTACTACCGTCTCCCAGA

   ACATGTCTGGTCTGCCAGGGAACGTATCCGCAGCAAACGCTAGTGCCCCCAGCAATACACTTAC

   TACAGTATTGATGTGTCAGGCATTCTGGTTGATTGTTTTATTTTGGCTCCGCCTACTGTATGGC

   CCATGTAAACGCATCTATTATGAAAATAAAATACGTCAATTGCTGATGTAATTCGTGTTGTAAT

   TCTTGTTTTGAAAAGCGCATATTTTCTTGCCGGTCTGAGTAACACCACCTATGACATCATATAA

   ATTTGATTACGTAACTTCCTCTTTTTACTTCCGTCTTTTTTTGATTACGCAATATACACAATTC TAGCAGTTAACTATTACACAATATCACAC

   Фиг. 1 (продолжение)

   Последовательность белка репликазы PPV5A

   MGKSGRKLGPRGHWLQVSYRGRPFSVRPLKRSGRCAGCRKTPHLFFQLEKVDSKGGLHLHFCIS

   VAAGTPRDVSSMFKAIERRVSFYYFGVEGLTFFTPHKNKHGAWKSNDEGFIVNYLLKKLPLSEC

   VYAWTNMDGVIGDACLNEDKRRELLSERQDQGVIKELTAPTFKAATGDKMLSVVDWMCDNDVTT

   ERRWEEISAASLYSFLATPAGTHLAKQCLRAANQRIVSTKTSWLSLCKFASEKELRAFQNGDPE

   LSSDNNRIYYLFAMNNYCPDMASMIFFWWSMRQTGKRNSIWLFGPATTGKTNLASAIAHTAASY

   GCVNWNNANFPFQDIVNVQLGWWEEGKMTEDVVECAKALLGGSNVRVDRKCMQSAEVQSPPFII

   TSNTDMCLVSQGSYISFEHQQPLQDRMIKFEFNHVLPGNFGLISEDEVVAFFRNGAYNVLKHAY

   MRKAQLFALGPASLPYKPPTGELVCIDQAKSPSPSASRRSVRNWMTCPPDPVQDDPAELDEYFP

   PDTPPEDCPCPISPVRESCPSPGPCPTPPRKKQRKSKHCSLSVSAGKVPVVVVGDSDSVPPEEK

   EKEEVSVGESQDPQLYWDLTLSQSDVPVPEDESTQFPDDAVDASDLIAEQ

   Фиг. 2

   ORF3 PPV5A

   MSRSTQRDLWSLLRERLERYKDRVKYYGILVPERPSTLASYFSKDPPPDPPTVKFDKPYQDVDR FWFPTDDYTDWYVWHGEDRPPRFTEHSGVQGFKTRCEGGLPLMPSDPKFCPIQNFWDQFANFDE GSPSTQIGESVSWSDHFGSPDPSHHQEVRDADEVTSERQQYKNRIVTLLRKVYWAKQWSGKLQI NVPSLESLYEQIPYMLAYMDADNWRQNLLAAKTLRTTLEAFSCVPDPSTCDVTISTPLSGETDP ASFAKYLCSLVCNRSQEKEQAQTPSLSPSKQKGQ

   Фиг. 3

   Последовательность белка капсида PPV5A

   MQRINSGEGEGERGGFVLPSHHYTGPRNPVPAGKPADPVDESSARHDIRYGQRLKHGDWPYLWG KDLDNAQRDEIIKALHSHVKVGTQLAGNIVRSIWKAKELLTEPVYELLKSILPPSDLSKVPLPH SQQTDRTEDPETPGETRGTGSDSPRSPRPSGSTEDGGGPSSESRLPGSKVPVDPSATTSEAKRQ RTEEGMDISSCGPGGISASGAASNNSGLACGGGGGTNLGTESLVSGCQFGKNSVITSSFRRCLI SPWPDKYCCSSAHDLIPGVVYETPWCYYDLNVISSYIFSPSAWQRLLEDYDAFRPKSLKVTIQS LVLKMSVKVQKKQTTVQDSQSATIAIFEDKDYDYPYVMGGGQKTVPGHLPGQPYNLPKYSYRTL GSVKESNRASMGGSGYTFKSNQDTELFLLETHDATLIRGGGTFEQYYEFPNDLPFENLTQYPWD IRRQDNPLYQQRITVMSGSDRDTVGILDGDFYSPFRFKGHDRPAMWLPGQRLIQGKFIDTHPIP NTGRSGVHPNDFHTRGDGHGDTHRTHEERIYSLDTGLAAMPRAAHRPTLQPGPRTLSHAVRRPD GSTVVTANACAYAYTQENPHQEPWSDLNVRHTMYRLAYQRQKGFQQPGDPLHIRTHACYGDGDV TIPKEESLWPTVLGSCTEKSPACLESQIWCKTPNVDMVYGEHTPPLALWGMHAPPPHVFLRMLA QEGPPNVSTCRPAQSGQTFINQYGQFLLCFTMVWEVKPRPKSIKQWNPRPPISIPVGQSGPAFI L DQ DGYYRL PEHVWSARERIRS KR

   Фиг. 4

   Попарное сравнение аминокислот на идентичность [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [И] [12] [13] [14] [15] [16] [ 1] Крупный рогатый скот 47.2% 52.3% 50.3% 50.5% 52.8% 52.8% 52.8% 52.6% 6.6% 22.7% 22.5% 20.7% 20.7% 21.4% 18.4% [ 2] Мелкие собачьи 43.3% 51.0% 60.2% 61.0% 50.5% 51.3% 50.5% 51.8% 7.4% 25.0% 24.7% 21.7% 21.7% 20.9% 18.1% [ 3] GboV 43.7% 49.8% 50.0% 50.3% 91.3% 83.7% 83.7% 84.2% 6.6% 23.7% 23.7% 21.7% 21.7% 23.0% 17.6% [ 4] PBoVla 42.8% 53.5% 49.1% 93.9% 51.8% 50.5% 49.7% 51.5% 7.1% 24.0% 24.0% 20.9% 20.9% 23.2% 19.9% [ 5] PBoVlb 43.3% 53.7% 49.5% 94.7% 51.8% 51.3% 49.7% 51.8% 7.9% 24.5% 24.5% 20.4% 20.4% 23.0% 20.2% [ 6] Hu Воса 44.2% 50.9% 93.3% 50.0% 50.7% 82.7% 82.7% 83.2% 6.9% 24.2% 24.2% 21.2% 21.2% 22.5% 17.9% [ 7] Hu Boca 2 47.0% 50.5% 78.4% 50.0% 50.2% 80.5% 91.8% 91.1% 7.9% 23.5% 23.2% 20.9% 20.9% 22.5% 18.4% [ 8] НиВосаЗ 44.7% 51.2% 92.6% 50.2% 50.5% 93.3% 80.0% 92.1% 8.7% 24.0% 23.7% 21.7% 21.7% 23.2% 18.6% [ 9] HuBoca4 46.5% 50.2% 77.7% 50.0% 50.5% 80.2% 96.5% 79.3% 8.2% 23.5% 23.7% 21.4% 21.4% 23.2% 19.1% [10] Densovirus 7.9% 7.0% 6.5% 7.7% 8.1% 6.5% 6.1% 6.7% 5.8% 7.7% 7.4% 8.4% 8.2% 6.9% 6.6% [11] Hokovirus a 20.5% 20.7% 20.5% 22.6% 22.3% 20.9% 20.2% 20.7% 20.5% 7.9% 99.5% 33.9% 34.2% 33.4% 17.6% [12] Hokovirus b 20.0% 20.9% 20.5% 22.6% 22.3% 20.9% 20.2% 20.7% 20.5% 8.1% 98.6% 33.9% 34.2% 33.4% 17.9% [13] PPV4a 21.4% 21.2% 22.1% 22.1% 21.6% 22.8% 21.2% 22.8% 21.4% 6.3% 29.1% 29.1% 99.5% 51.3% 17.1% [14] PPV4b 21.4% 21.2% 22.1% 22.1% 21.6% 22.8% 21.4% 22.8% 21.6% 6.3% 29.3% 29.3% 99.3% 51.3% 17.1% [15] BIVI PPV5A 22.1% 22.3% 23.3% 23.3% 23.0% 22.8% 23.0% 22.3% 23.3% 5.1% 32.6% 32.3% 60.5% 60.2% 15.8% [16] PPV1 18.6% 25.4% 23.3% 20.5% 21.2% 22.8% 26.1% 23.5% 25.1% 5.8% 16.5% 16.5% 18.4% 18.4% 19.3% Вверху = аминокислот! ная идентичность VP1/CAP Внизу = аминокислотная идентичность REP

   Фиг. 5

   - 41 031278

   Подсемейство

   Parvovirinae

   Филогенетический анализ VP1/CAP участка PPV5A

   НиВосаг NC 012042

   НиВосаЗ NC 012564

   HuBoca4 NC 012729

   GboVNC 014358

   HuBocaNC 007455

   Bocavirus

   PBoVlb HM053694

   PBoVla HM053693

   Hokavirus a GQ8G9543

   BIVI PPV5B

   PPV4a HM031135

   PPV4b GQ387499

   Фиг. 6

   IPPV5a

   Hokovirus b EU200677 PPV1NC 001718

   Результаты BLASTp сравнения капсидного белка PPV5A против общих последовательностей GenBank

   Самое близкое совпадение: парвовирус свиньи 4 PPV4 - депоз.номер GenBank: AFM73871

   Идентичность последовательности: 40% (310/774)

   Гомология последовательности: 52% (403/774)

   PPV5A

   163

   PPV4_

   KHGDWPYLWGKDLDNAQRDEIIKALHSHVKVGTQLAGNIVRSIWKAKELLTEPVYELLKS KHG WP+LW +D El + L K+ +L N + ++W+AKE + P+YE++K

   KHGHWPHLWAPFVDRQMSQEIQQVLKGSTKLSQKLLANFIIALWRAKEKIGAPIYEIVKG

   222

   PPV5A

   223

   PPV4

   ILPPSDLSKVPLPHSQQTDRTEDPETPGETRGTGSDSPRSPRPSGSTEDGGGPSSESRLP + P D V P +P RG+ SP P+ ED

   VFPSVDKKTVESLLPHPDPIPAPPSSP—QRGSKRASPPQ-SPNAHDED----------282

   108

   PPV5A

   PPV4109

   GSKVPVDPSATTSEAKRQRTEEGMDISSCGPGGISASGAASNNSGLACGGGGGTNLGTES

   T S KRQ+T E SC ++A+LCG GGG +

   ----------TMSGHKRQKTMEVE—SECDKSLLCPTQNAGADFEL-CGTGGGATNEKGT

   342

   155

   PPV5A

   343

   PPV4_

   156

   LVSGCQFGKNSVITSSFRRCLISPWPDKYCCSSAHDLIPGVVYETPWCYYDLNVISSYIF

   V G QF Ξ+ T RRC++S +PD YC + D IP +++ TPW YYDLN++S + F WVGGTQFTDTSTRTFGTRRCVLSAFPDTYCSMMSGDAIPSIIFNTPWYYYDLNIMSCH-F

   102

   21'

   PPV5A

   403

   215

   SPSAWQRLLEDYDAFRPKSLKVTIQSLVLKMSVKVQKKQT-TVQDSQSATIAIFEDKDYD SPSA+Q L+EDYDAFRP+SL V ++ LV+K + Q Q V D+ SAT+ FED +Y+ SPSAFQTLIEDYDAFRPRSLTVHLKELVIKDVCQQQGLQAEQVSDNNSATLLAFEDVNYE

   461

   274

   PPV5A

   462

   PPV4

   275

   YPYVMGGGQKTVPGHLPGQPYNLPKYSYRTLGS-------VKESNRASMGGSGY-----PYV+GGGQ +VPGHLPGQPY LPKYSYRT+G V N G G+

   LPYVLGGGQVSVPGHLPGQPYQLPKYSYRTVGKPDPNSGFVPGRNTHPDQGPGHPKASKT

   508

   33'

   PPV5A

   509

   PPV4

   335

   ----TFKSNQDTELFLLETHDATLIRGGGTFEQYYEFPNDLPFENLTQYPWDIRRQDNPL + QDTE ++LE Η ΆΤ++ G TF Q+Y FP DLPFE LTQY WD RRQDNPL IWYSQYLETQDTEFYILENHKATILHSGNTFSQHYNFP-DLPFEQLTQYMWDARRQDNPL

   564

   393

   PPV5A

   565

   PPV4_

   394

   YQQRITVMSGSDRD----TVGILDGDFYSPFRFKGHDRPAMWLPGQRLIQGKFIDTHPIP

   QRI VMS D T I + PF К RPAM+L G R G + T P IDQRIQVMSRMYDDGPOKTFAIKVNPYIVPFTVKSTSRPAMFLAGGRFKDGDYSITGPGD

   620

   153

   PPV5A

   621

   PPV4_

   154

   NTGRSGVHPND---FHTRGDGHGDTHRTHEERIYSLDTGLAAMPRAAHRPTLQPGPRTLS

   S + ND TR DT Y + LA R QPGPR

   RDKTSFKYYNDPPWIITR-----DT--------YLFSSDLAKTERE------QPGPRQGD

   677

   494

   PPV5A

   678

   PPV4_

   495

   HAVRRPDGSTVVTANACAYAYTQENPHQEPWSDLNVRHT-MYRLAYQRQKGFQQPGDPLH

   VR PDG+ +VT NA AY YT E P +RLA + ++G+ PG P H

   TVVRTPDGTLIVTTNALAYGYTTEYLKNIPLLSSKYHGVENFRLAVENERGYSMPGHPSH

   736

   554

   PPV5A '37

   PPV4_

   555

   IRTHACYGD-----GDVTIPKE----ESLWPTVLGSCTEKSPACLESQIWCKTPNVDMVY

   IR G + ΤΙ E E +P +GS EK+ A LESQIW + PN D+

   IRETLFRGKLPSEIRESTIKSEDQRKEITFPDYMGSVNEKTTANLESQIWSQIPNTDITE

   787

   61PPV5A

   GEHTPPLALWGMHAPPPHVFLRMLAQEGPPNVSTCRPAQSGQTFINQYGQFLLCFTMVWE

   847

   PPV4

   615

   PPV5A

   848

   PPV4

   675

   Фиг. 7

   QFLL + M W+

   TPPL++WGM PPP VFLR+LAQ GPP S С + T++NQY

   KCTTPPLSIWGMKNPPPMVFLRLLAQMGPPRRSACSGSIPSNTYLNQYCQFLLTYEMEWD 674

   VKPRPKSIKQWNPRPPISIPVG-QSGPAFILDQDGYYRLPEHVWSARERIRSKR V R + +WNP PP IP+G + P +IL+++G YR+P VW+A++R R +R

   VIKRTRKTVRWNPIPPPQIPMGPNNLPVYILNKEGQYRMPTEVWTAKQRPRHRR

   Фиг. 7 (продолжение)

   900

   728

   - 42 031278

   Результаты BLASTp гена репликазы PPV5A против общих последовательностей GenBank

   Самое близкое совпадение: парвовирус свиньи 4 PPV4 - депоз.номер GenBank: ADB20210

   Идентичность последовательности: 58% (292/504)

   Гомология последовательности: 73% (369/504)

   PPV5A

   PPV4

   LQVSYRGRPFSVRPLKRSGRCAGCR--KTPHLFFQLEKVDSKGGLHLHFCISVAAGTPRD L ++ R R L++ R CR P +F QLE+VDSKGGLHLH+C+SV+AGTPRD LVIAVRQAEALFRELQKELR-KSCRLGVDPGIFMQLEEVDSKGGLHLHWCVSVSAGTPRD

   PPV5A

   PPV4

   VSSMFKAIERRVSFYYFGVEGLTFFTPHKNKHGAWKSNDEGFIVNYLLKKLPLSECVYAW V + + FK E++VS YYFGVEGL+FF PHKNKHGAWKS DEGFI NYLLKKLPL EC+YAW VLTIFKNTEKKVSQYYFGVEGLSFFVPHKNKHGAWKSTDEGFIYNYLLKKLPLKECLYAW

   132

   151

   PPV5A

   133

   PPV4

   152

   TNMDGVIGDACLNEDKRRELLSERQDQGVIKELTAPTFKAATGDKMLSVVDWMCDNDVTT Т + G IGDACLN DKR+ELL RQD VI+EL+AP +K ATG+KML· +V W+ DN++ + TTIGGAIGDACLNTDKRKELLDNRQDPAVIEELSAPMYKCATGEKMLDIVQWLVDNNICS

   192

   211

   PPV5A

   193

   PPV4

   212

   ERRWEEISAASLYSFLATPAGTHLAKQCLRAANQRIVSTKTSWLSLCKFASEKELRAFQN E RWE +A SLYSFLAT AG ++AKQCLR A Q+++ К L+L F LR FQ

   ESRWENKNALSLYSFLATQAGGYMAKQCLRIAQQKLLKEKPLGLTLMDFKGMNALRRFQQ

   252

   271

   PPV5A

   253

   PPV4

   272

   GDPELSSDNNRIYYLFAMNNYCPDMASMIFFWWSMRQTGKRNSIWLFGPATTGKTNLASA + Е++ DNNR++Y+FA+NNY Р +AS+I ++WSM+QTGKRN +W +GPATTGKTN+A А DEGEMTFDNNRMHYIFAINNYDPKIASVIMYFWSMKQTGKRNCVWFYGPATTGKTNMAQA

   312

   331

   PPV5A

   313

   PPV4

   332

   IAHTAASYGCVNWNNANFPFQDIVNVQLGWWEEGKMTEDVVECAKALLGGSNVRVDRKCM I H++A+YG VNWNNANFPFQDIV Q+GWWEEGKMT D+VE AKALLGG+ +R+DRKCM ICHSSANYGNVNWNNANFPFQDIVGAQVGWWEEGKMTGDMVEAAKALLGGTALRIDRKCM

   372

   391

   PPV5A

   373

   PPV4

   392

   QSAEVQSPPFIITSNTDMCLVSQGSYISFEHQQPLQDRMIKFEFNHVLPGNFGLISEDEV QS EV SPPF+ITSN DM +V +GS++SFEHQQPL+DRMIKF FN LPGNFGLI+ +EV QSIEVNSPPFLITSNVDMTIVQEGSFVSFEHQQPLEDRMIKFSFNMTLPGNFGLITSEEV

   432

   451

   PPV5A

   433

   PPV4

   452

   VAFFRNGAYNVLKHAYMRKAQLFALGPASLPYKPPTGELVCIDQAKSPSPSASRRSVRNW +FFR GA + + +F GPAS+ + P GE+ P ++

   KS FFRMGA-KLAAQPDIMNC PIFKKGPASIRHLVPVGEI-------P PPKEMKHKRQPLY

   492

   503

   PPV5A

   493

   PPV4

   504

   MTCPPDPVQDDPAELDEYFPPDTP 516

   М PD +QD+P ELD +F + Р

   MRAEPDEIQDNPEELDHWFEEEAP 527

   Фиг. 8