TW201912031A - 提高水耕植物生長之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種新穎髮根農桿菌Agrobacterium rhizogenes A8196菌株，其可以在諸如冰花之水耕植物中獲得較高生長效率。本發明之新穎農桿菌菌株可應用於植物生物科技產業，藉以提高水耕植物生長的速率及生長量。

Description

提高水耕植物生長之方法

本發明係關於髮根農桿菌Agrobacterium rhizogenes A8196菌株提高水耕植物生長的效率之方法，該方法可應用於植物生物科技產業，以增加水耕植物生長的速率及生長量。

傳統農業耕作中多使用土壤栽培，土壤栽培時對於土壤介質的灌溉、施肥、噴藥皆需要人力與機器的持續管理。土壤結構及水分條件、保水力等，也易經常不足或不穩定而影響植物生長。植株的栽植密度也取決於當地栽培環境的光照量、土壤肥力等多項因素。土壤栽培植株時也須定時除草，施肥時也不易均勻，容易過度施肥。土壤介質內易含有各式病原菌、線蟲、昆蟲等使得土壤介質不易連作。

為因應及改善上述土壤介質栽培的缺點，近年來各式水耕栽培逐漸推廣及建立。水耕栽培的優點包括(1)：不受土地限制，在貧脊土壤或缺乏耕地的都市地區可進行。(2)：節省整地、除草等所需的人力及時間。(3)：節省養分的浪費，肥料有效地應用，介質內pH值可有效控制以利植株生長。(4)：水分供給量充足，不易造成水資源浪費。(5)：栽培環境清潔衛生，根部病蟲害減少。(6)：可連續性耕種，並且可提高植株栽種密度提高作物產量。(7)：營養充足可以大幅提升作物品質及產量，植株若根部生長狀態優良時，生長速率快速。(8)：可調節農作物產期及產量提高經濟收益。

近年來在全球溫室效應及氣溫變遷日益嚴重的情況下，使得農民在田間種植遇到種種的困難，像是病蟲害、颱風災 害等種種問題，使得水耕栽培搭配自動化控制的設施栽培環境日趨重要。植物工廠的概念因運而生，植物工廠的優勢包括(1)：生產量穩定，不受外在環境的天候與環境影響，較無地點設置的限制。(2)：可全年生產。(3)：因是室內環境控制，可不需噴灑農藥，產出無毒無病蟲害的農作物。(4)可以在最小單位面積達到最高的產能，提高作物產量。(5)安全舒適的工作環境，改善農民工作現況，增加農民收入。植物工廠中可種植高經濟價值的葉菜類，如：蘿蔓生菜、葉萵苣、水菜、荷蘭生菜、冰花等，提供無毒無重金屬汙染的生鮮蔬菜。也可種植具有醫藥或保健功效的植物，藉此作為科學中藥的主成分，或提供用於萃取二次代謝物的植物材料。

本發明的實施例中使用冰花為主要材料，冰花全名為非洲翠玉冰花，在植物分類學上為石竹目、番杏科、日中花屬，原生地位於非洲南非納米比亞沙漠，南歐等乾燥地區。冰花在幼苗期與幼年期其光合作用型態為C3(Carbon fixation)型，在進入成熟期後其光合作用型態會由C3型轉變成CAM(景天酸代謝)型，此光合作用型態的轉變可受鹽分、乾旱、淹水等非生物性逆境誘導，所以冰花是高度耐鹽的植物。冰花也因植物細胞中富含許多肌醇、松醇，是一種糖醇和維他命B群，可促進細胞生長。且有助於改善動物細胞內脂質的流動並防止脂肪堆積，並對於高血脂症、憂鬱症、脫髮症禿頭等可幫助改善症狀。而且肌醇可做為一種細胞內胰島素訊號的訊息傳遞物質，可調整胰島素的作用，而松醇則可以幫助控制血糖。冰花也含有胡蘿蔔素可幫助動物細胞抵抗氧化逆境，並有助於預防老化和舒緩疲勞。冰花內有各式礦物質等各類對人類有不同功效之成分，所以近年來以水耕方式大量種植。水耕栽培時植物根部環境維持健康，對水耕植物產量影響甚深。本發明的實施例中利用髮根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)A8196菌株感染水耕冰花植物後，使植物生長出毛狀根。

農桿菌為一種生活在土壤中的革蘭氏陰性菌，農桿菌歸 類為真細菌界(Eubacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、α-變型菌綱(α a-proteobacterium)、根瘤菌目(Rhizobiales)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)及農桿菌屬(Agrobacterium)。又可依致病能力、感染部位、腫瘤型態及生理生化特性將農桿菌屬(Agrobacterium)再細分為幾個種類。當植物受到農桿菌感染時，通常會在感染的部位產生腫瘤狀的病徵或是有不定根及根毛的產生，可以根據感染的植物寄主種類、部位及腫瘤型態來做分類：Agrobacterium tumefaciens(根瘤農桿菌)會在根莖交界處的傷口，造成冠癭狀腫瘤(crown gall)。Agrobacterium rhizogenes(髮根農桿菌)則會造成的傷口部位，有不定根或是根部有根毛的產生(hairy root)。Agrobacterium rubi(懸鉤子農桿菌)會在懸鉤子屬植物的莖桿上產生腫瘤(cane gall)。而Agrobacterium vitis則專一地感染葡萄的枝條，使其在枝條上產生腫瘤的病徵。還有一種感染植物後不會產生病徵的(avirulent)農桿菌Agrobacterium radiobacter。

髮根農桿菌會造成毛狀根病徵是因為菌體內含有一毛狀根誘生質體(Root inducing plasmid、Ri plasmid)，這一特別的質體上含有一段可在原核生物與真核生物間轉移的DNA片段，稱為轉移DNA(transfer-DNA，T-DNA)。野生種菌株的T-DNA因含有植物荷爾蒙的生合成基因，所以當農桿菌感染植物後，T-DNA可插入宿主的染色體中，而引起植物宿主細胞不正常的產生植物生長素，造成植物產生次生的轉殖根。這些轉殖根可因T-DNA轉移而表現外來基因，而植株地上部不具其他病徵維持植株原生狀態，形成混和植物(composite plant)。這些轉殖根可作為外來蛋白質的生物反應器，並且不須經由產生新一代的完整的轉殖植株的過程，所以在植物生技產業中，可用此技術在植物細胞中產生目標蛋白質的技術。

經由以上所述可知，在農業生技產業或植物工廠中，常以水耕栽培做為主要產生作物的方法，若將水耕植物的根系發展強化或提升時，可使植物生長更為快速且健康。因此，本發明之 目的係在於提供一種直接提高水耕植物生長效率的方法，其可應用於植物生技產業或設施栽培中以水耕植物為主的產業，以減短其獲得健康高品質、高產量之作物的時間。

為達上述目的，本發明係關於一種提高植物生長效率之方法，其包含將髮根農桿菌菌株A8196(Agrobacterium rhizogenes A8196)感染欲水耕栽培之植物。於本發明之具體實施態樣，所述之植物為一種番杏科植物。於本發明之較佳具體實施態樣，該番杏科植物可為冰花。

於一項具體實施例，係將雙偶型載體pCAMBIA1303以電擊方式導入髮根農桿菌菌株A8196(寄存編號：BCRC910795)。

圖1為一柱狀圖表，顯示髮根農桿菌A4感染水耕冰花植物後，約有25%的植株有新生的轉殖根。而利用髮根農桿菌A8196感染水耕冰花植物後，約有36%的植株有新生的轉殖根。

圖2為一西方墨點分析結果圖，上方圖代表經由考馬斯藍染劑染色的根部組織蛋白質膠圖結果，樣本由左至右依序為，未受髮根農桿菌感染的水耕冰花植物根部蛋白質、經髮根農桿菌A4感染的水耕冰花植物根部蛋白質累積(有二組植株)、經髮根農桿菌A8196感染的水耕冰花植物根部蛋白質累積(有二組植株)。下方圖代表上述5組冰花根部組織中GUS蛋白質的西方墨點分析之結果。

圖3為一曲線圖，顯示野生冰花植物及受髮根農桿菌A4或A8196感染後，於水耕栽培液生長1到8周根部的長度。圖中的黑色菱形標誌的曲線圖代表未受感染的野生株根部，於水耕 栽培液生長1到8周的根部長度；灰色三角形標誌的曲線圖代表受髮根農桿菌A8196感染後，水耕冰花植物於水耕栽培液生長1到8周的根部長度；灰色方形標誌的曲線圖代表受髮根農桿菌A4感染後，水耕冰花植物於水耕栽培液生長1到8周的根部長度。

圖4為一柱狀圖，顯示野生冰花植物及受髮根農桿菌A4或A8196感染後，於水耕栽培液生長8周後，根部與地上部的鮮重。圖中的黑色柱狀圖代表未受感染的野生株根部與地上部，於水耕栽培液生長8周後的鮮重；灰色柱狀圖代表受髮根農桿菌A4感染後，在水耕栽培液生長8周後，根部與地上部的鮮重；白色柱狀圖代表受髮根農桿菌A8196感染後，在水耕栽培液生長8周後，根部與地上部的鮮重。

圖5顯示野生冰花植物及受髮根農桿菌A4或A8196感染後，於水耕栽培液生長8周後，植株的根部與地上部。左圖代表植物根部，右圖代表植物的地上部，由左至右依序為未受髮根農桿菌感染的水耕冰花植物地上部、經髮根農桿菌A4感染的水耕冰花植物地上部、經髮根農桿菌A8196感染的水耕冰花植物地上部。

本發明將以下述實施例配合參考圖示，進一步說明本發明之技術內容，然而所列之實施例僅作說明之用，而無意於限定本發明之所屬範圍。熟習該項技藝者，皆可根據本發明及實施例所述，在不背離本發明精神及範圍下，做修飾及變更，惟仍應涵蓋於本發明之範圍內。

實施例1：水耕冰花轉殖根的培養與製備

本發明係使用屬於番杏科(Aizoaceae)的冰花(Mesembryanthemum crystallinum L.)。將冰花種子平均播種於3吋盆中，依照泥炭土：蛭石：珍珠石=3：1：2之比例混合栽培介 質。盆栽先裝8分滿的土，先將土澆濕再播種，再覆土薄薄一層即可，之後再進行表面噴灑。放置於23℃、光照10小時黑暗14小時之生長室，每天澆水，約5-7天發芽。植株發芽後2週以花寶施肥，每日用灑水器澆水早晚各一次。植株生長約6週後，可進行農桿菌穿刺感染，穿刺1週後，移至水耕介質中繼續培養。冰花水耕栽培液內含3mM KNO₃、2mM Ca(NO₃)₂．4H₂O、0.5mM NH₄H₂PO₄、0.5mM(NH₄)₂HPO₄、0.5mM MgSO₄．7H₂O，12.5μM H₃BO₃、1μM MnSO₄．H₂O、1μM ZnSO₄．7H₂O、0.25μM CuSO₄．5H₂O、0.25μM H₂MoO₄．H₂O)，10μM Fe-EDTA和20mM NaCl。

將髮根農桿菌菌株A8196和已知的野生種髮根農桿菌A4以電擊方式，分別導入質體pCAMBIA1303，其T-DNA區域內含有一glucuronidase報導基因(reporter gene)，可使農桿菌感染植物後，藉由於植物根部細胞內檢測GUS蛋白質的表現量，而反映出T-DNA的表現效率。將含有pCAMBIA1303質體之髮根農桿菌以三區劃線法培養於含適當抗生素的523固態培養基上，倒置培養於28℃培養箱中。培養2天後，以無菌竹籤挑選單一菌落，接種於含有適當抗生素的523液態培養基中，並置於28℃培養箱中震盪培養16-18小時。待菌液生長濃度至OD600為0.8-1.0時，將菌液以6,000rpm於25℃，離心10分鐘，去除上清液後，先以少量0.9%氯化鈉溶液加至離心管中，緩緩地清洗菌塊，使菌塊回溶。再加入等量之氯化鈉溶液清洗震盪使菌塊懸浮，以6,000rpm於25℃，離心10分鐘，重複上述步驟兩次。清洗完畢後，以0.9%氯化鈉溶液回溶菌塊，使菌體OD₆₀₀值約為1，利用1毫升針筒進行穿刺感染，穿刺位置為冰花的莖基部，每株穿刺約100-200微升的菌液，穿刺後移至24℃生長室培養，感染一週後，植株移植到水耕系統內。隔週剪取少量根部進行檢測，將所剪取的根部取放入離心管中，加入GUS染色溶液，使根部完全浸泡於染劑中，避光並移至37℃培養箱中作用16-24小時，利用光學顯微鏡觀察植株染色情形，並計算植株含有轉殖根的比率。

水耕介質先以12.5%濃度的水耕介質，讓冰花有充足時間適應水耕的環境。一週後，再換到25%濃度的水耕液中。兩週後，換到50%濃度的水耕液中，三週後，換到原濃度的水耕液中。四週後，冰花成熟須利用逆境轉成景天酸代謝的植物，所以水耕介質需多加200mM粗鹽，冰花才能繼續生長。

由圖1柱狀圖結果顯示，已知的髮根農桿菌A4感染水耕冰花植物後，約有25%的植株有被轉植成功，進而產生新生的轉殖根。而利用髮根農桿菌A8196感染水耕冰花植物後，約有36%的植株有被轉殖成功，產生新生的轉殖根。圖1係顯示，利用髮根農桿菌A8196感染水耕冰花植物後，比已知的髮根農桿菌A4感染植物後產生轉殖根的比例增加了1.4倍。

實施例2：水耕冰花植物中根部的GUS蛋白質累積量之分析

抽取水耕冰花植物的蛋白質，秤取1公克的冰花組織，將組織放置於已滅菌處理的研缽中，倒入適量的液態氮，使組織急速冷凍，並以研缽棒磨成粉末狀。將植物粉末移置高速離心管中，加入500微升的萃取溶液(100mM Tris-HCl pH：7.6、5mM MgCl₂、1mM EDTA、100mM NaCl)、50微升的Leupeptin、5微升的PMSF，置於4℃的multi shaker上持續搖晃10~15分鐘，待植物粉末完全溶解於溶液中。再以12,000rpm，4℃離心10分鐘，吸取上清液至新的離心管中，再次以12,000rpm，4℃離心10-20分鐘，將剩餘雜質沉澱至底部，吸取上清液至新的離心管中，即獲得冰花蛋白質萃取液，定量蛋白質濃度後，可進行蛋白質電泳與西方墨點法分析。

本實施例使用電泳系統為Mini-PROTEIN 3 Cell，首先將鑄膠用的spacer玻璃(厚度1.5mm)和短玻璃擦拭乾淨後，組裝好鑄膠台，再將適量的separating gel(12.5%Acrylamide、0.375M Tris-HCl[pH 8.8]、0.1%SDS、0.05%ammonium persulfate、0.1%TEMED[tetramethylethylenediamine])，快速注入二片玻璃縫隙 中。並用95%酒精去除氣泡並使separating gel液面平整，靜置15-30分鐘。待膠體凝固後，以水沖洗掉酒精並將多餘的水份吸乾。再加入適量的stacking gel(5%Acrylamide、0.125M Tris-HCl(pH 6.8)、0.1%SDS、0.05%ammonium persulfate、0.1%TEMED)，插入comb，放置15-30分鐘後，待膠體凝固，即可使用。製備完成的膠體裝置於電泳槽中，於upper tank加滿1倍的running buffer(0.025M Tris-HCl[pH 8.3]、0.2M glycine、0.1%SDS)作為電泳液。檢查buffer有無外漏後即可拔出comb，再於lower tank加入適量1倍的running buffer至膠架門板處，將製備好的50-150微克的植物蛋白質(內含100mM dithiothreitol、1.5%SDS、5%glycerol、0.002%的bromophenol blue sodium salt與0.06M Tris-HCl[pH6.8])，混合均勻後，緩慢地加入stacking gel的孔洞中，設定電泳條件，定電壓50伏特40分鐘後，再用定電流65毫安培、50-60分鐘之條件，進行電泳分析。將膠體拆下以考馬斯藍(coomassie blue)染色或進行西方墨點法分析。Coomassie blue染色是將膠體以stain buffer(0.2%coomassie blue R250、50%methanol、10%acetic acid)覆蓋，移至混合式震盪器上，震盪16小時以上，再以destain solution(36%methanol、7%acetic acid)進行退染，直至背景透明。

本實施例使用的膠體轉漬系統為Mini-Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell，Protran Nitrocellulose作為轉漬膜，將裁切好的濾紙、轉漬膜與吸水綿浸泡在transfer buffer(25mM Tris-HCl[pH8.3]、192mM glycine、20%v/v methanol)中。之後進行組裝，首先將mini gel holder cassette的黑色面朝下，依序放吸水綿、濾紙、膠體、nitrocellulose膜、濾紙、吸水綿，且每放置一片均須去除氣泡，最後將其壓緊扣上，放入轉漬槽內。並倒入適量的transfer buffer，設定轉印條件，定電壓100伏特，電流350毫安培，於低溫下轉漬90分鐘。轉印完成後，取出nitrocellulose膜，先將轉漬膜以ponceau S溶液染色(0.1%ponceau S溶於5%acetic acid)，稍微用清水清洗至背景乾淨後， 確認轉印成功。

將轉漬膜上的ponceau S溶液以清水洗淨後，再浸泡含5%脫脂奶粉溶於1倍的TBST溶液(20mM Tris、137mM NaCl、2.6mM KCl、0.05%Tween-20)中，放置於混合式震盪器，室溫下，30分鐘。30分鐘後用1倍的TBST溶液清洗2次，每次5分鐘。之後將轉漬膜置入包含一次抗體的3%脫脂奶粉的TBST溶液中，使用的一次抗體來自兔子的anti-GUS抗體(稀釋倍數為1：1，000)，於4℃下作用16小時以上或室溫下作用一小時。再用1倍的TBST溶液清洗3次，每次5分鐘。放入包含二次抗體的3%脫脂奶粉TBST溶液中，二次抗體分別為Goat anti rabbit IgG-HRP conjugated antibody(稀釋倍數為1：20,000)，於室溫下作用30分鐘。以1倍的TBST溶液清洗15分鐘後，再以1倍的TBST溶液清洗4次，每次5分鐘。最後加入適量的冷光偵測試劑(Western Lighting Reagent，美國[Oxidizing Reagent、Luminol Reagent，1：1混合避光])，再於暗房中利用X光片(Super RX)進行壓片訊號偵測，最後利用顯影劑與定影劑顯影呈現，並將圖檔掃描保存。

由圖2結果顯示，未受髮根農桿菌感染的水耕冰花植物根部沒有GUS蛋白質累積。在經髮根農桿菌A4及A8196感染的水耕冰花植物根部則有GUS蛋白質累積。經由考馬斯藍染劑染色的蛋白質膠圖結果顯示，上述5組根部組織的蛋白質樣本的使用量皆相同。

實施例5：冰花植物根部經髮根農桿菌A4及A8196感染後，冰花植物在水耕環境下生長速率及鮮重提高

利用實施例1中所述的方法獲得經髮根農桿菌A4及A8196感染的冰花植物，及未受感染的冰花植物以水耕環境進行生長檢測。一週後移至水耕培養液中持續培養，培養液濃度為12.5%濃度的水耕介質，此為第一週。第二週後換到培養液25%濃度的水耕液中。第三週換到培養液50%濃度的水耕液中。第四週換到原濃度的水耕培養液中，將需進行耐鹽測試的冰花 於培養液額外添加氯化鈉，使其最終濃度為20mM。第五週至第七週將剩餘的冰花植株於培養液額外添加氯化鈉，使其最終濃度20mM。而加鹽處理的冰花則是用原濃度的水耕培養液中額外添加氯化鈉，使其最終濃度為20mM氯化鈉。培養八週後測量植株地上部與地下部鮮重，並於每周測量冰花的根長。

由圖3的黑色菱形標誌的曲線圖顯示，當未受發根農桿菌感染的野生冰花植株於水耕栽培液持續生長時，根部的長度在感染後第一周為9.6公分，生長到第8周時增長到約19公分。而圖3的灰色三角形標誌的曲線圖顯示，當水耕冰花植物受髮根農桿菌A8196感染後，在水耕栽培液持續生長1到8周時，根部持續增長，由感染後第一周根長為13.4公分，生長到第8周時已增長到23公分。圖3的灰色方形標誌的曲線圖顯示，當水耕冰花植物受髮根農桿菌A4感染後，在水耕栽培液持續生長1到8周時，根部持續增長，由感染後第一周根長為8.6公分，生長到第8周時已增長到20.5公分。由此結果可知當冰花植物被髮根農桿菌感染後，水耕冰花植物的根長增加，其中以被髮根農桿菌A8196感染的冰花植物的根長最長。

由圖4的黑色柱狀圖顯示，當未受感染的野生株於水耕栽培液持續生長8周後，根部鮮重為1.2公克，地上部為30.7公克。而圖4的灰色柱狀圖顯示當水耕冰花植物受髮根農桿菌A4感染後，在水耕栽培液持續生長8周後，根部鮮重為1.9公克，地上部為42.8公克。圖4的白色柱狀圖顯示當水耕冰花植物受髮根農桿菌A8196感染後，在水耕栽培液持續生長8周後，根部鮮重為2.8公克，地上部為50.3公克。由此結果可知當冰花植物被髮根農桿菌A8196感染後比野生株植物的根重增加約2.3倍，地上部則增加約1.6倍。而且根重及地上部鮮重也比受髮根農桿菌A4感染後為多，顯示受髮根農桿菌A8196感染後冰花水耕植物生長狀態，比受髮根農桿菌A4感染後的生長狀態為佳。

圖5的左圖顯示當水耕冰花植物在水耕栽培液持續生長8周後，地下部根部的生長結果，由左至右依序為未受髮根農 桿菌感染的水耕冰花植物根部、經髮根農桿菌A4感染的水耕冰花植物根部、經髮根農桿菌A8196感染的水耕冰花植物根部。圖5的右圖顯示當水耕冰花植物在水耕栽培液持續生長8周後，地上部根部的生長結果，由左至右依序為未受髮根農桿菌感染的水耕冰花植物地上部、經髮根農桿菌A4感染的水耕冰花植物地上部、經髮根農桿菌A8196感染的水耕冰花植物地上部。此結果顯示當冰花植物受髮根農桿菌A8196感染後根部及地上部，皆比未受感染的冰花植物生長狀態為佳。此結果顯示當冰花植物受髮根農桿菌A8196感染後，當有轉殖根時，可顯著地增加冰花植物在水耕環境下植物生長速率。

由所舉較佳的實施例可得知，依據本發明所獲得之髮根農桿菌A8196，的確具有提高冰花植物在水耕環境下生長效率之功能。本發明能夠普遍應用於植物生物科技產業，藉此可提高提高水耕植物生長效率的方法，極具有產業利用價值。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

寄存機構：財團法人食品工業發展研究所

寄存日期：106年8月15日

寄存號碼：BCRC910795

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

Claims (4)

1. 一種用於增加水耕植物生長效率之髮根農桿菌 Agrobacterium rhizogenes A8196菌株，其中該菌株之寄存編號為BCRC910795。
2. 一種增加水耕植物生長效率之方法，其包含將如申請專利範圍第1項所述之髮根農桿菌 Agrobacterium rhizogenes A8196菌株感染一水耕植物，並於水耕栽培液生長促進該水耕植物的轉殖根產生。

   2.如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該水耕植物係選自單子葉植物及雙子葉植物。
3. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該水耕植物係選自一種番杏科植物。
4. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該水耕植物為冰花( Mesembryanthemum crystallinum L.)。