TW201909912A - 巨噬細胞發炎蛋白－１β（ＭＩＰ－１β）抑制劑用以治療及控管動脈粥狀硬化之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於巨噬細胞發炎蛋白-1β(MIP-1β)抑制劑用以調控血 管內發炎反應、減少斑塊面積及增厚斑塊纖維帽的厚度，以治療及控管動脈粥狀硬化之用途。

Description

巨噬細胞發炎蛋白-1β(MIP-1β)抑制劑用以治療及控管動脈粥狀硬 化之用途

本發明係關於巨噬細胞發炎蛋白-1β(MIP-1β)抑制劑用以調控血管內發炎反應、減少斑塊面積及增厚斑塊纖維帽的厚度，以治療及控管動脈粥狀硬化之用途。

動脈粥狀硬化(atherosclerosis)是一種血管慢性發炎性疾病，同時也是全球心血管疾病中發生率及死亡率較高之疾病；低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)在動脈粥狀硬化形成的過程中為重要的因子，低密度脂蛋白極容易受到氧化傷害並因而形成氧化型低密度脂蛋白(oxidative LDL,oxLDL)，當氧化型低密度脂蛋白存在血管時，將促使單核球(monocyte)從血液遷移至血管內膜(intima)，並分化成巨噬細胞(macrophage)，進而吞噬大量的氧化型低密度脂蛋白而轉化為脂泡細胞(foam cell)，而當脂泡細胞死亡時即釋出其所包含的脂質進而形成脂質核心(Lipid core)，為了癒合脂質核心對於血管內膜所造成的損傷，將形成由彈力蛋白(Elastin)及膠原蛋白(collagen)組成的纖維帽(fibrous cap)於脂質核心的周圍，進而形成動脈粥狀硬化斑塊(plaque)，此即為動脈粥狀硬化的開端；此外，氧化型低密度脂蛋白除了抑制單核球離開血管內膜外，其同時改變血管壁的通透性，而更促使白血球(leukocyte)遷移到血管內膜，並反覆 地誘發血管中的發炎反應，導致血管內皮功能失調，進而更促進動脈粥狀硬化斑塊的發展，更甚者，將導致複雜的血管病變；由上述內容可以得知，發炎反應與引發血管粥狀硬化及症狀惡化息息相關。

目前臨床治療上，當動脈因脂肪或斑塊堆積造成動脈狹窄的程度達到約60%時，係採取藥物治療加以控制，而當動脈狹窄的程度大於60%時，則需透過手術治療來克服；此外，研究指出，動脈粥狀栓塞引發心臟病的機率高達30%，而引發中風的機率則為25%，另一方面，引發周邊動脈疾病，例如：冠狀動脈心臟病(Coronary Heart Disease)、頸動脈阻塞症(Carotid artery disease)及腦中風(brain stroke)等的機率約為20%，其餘25%則為併發兩種以上相關疾病之族群；此些資訊再再顯示心血管相關疾病之預防及治療的重要性。

另外，研究指出，在動脈粥狀硬化斑塊中發現巨噬細胞發炎蛋白-1β(MIP-1β)的表現，並且動脈粥狀硬化病患血液中也同樣發現較高濃度的巨噬細胞發炎蛋白-1β，而此些體內含有較高濃度巨噬細胞發炎蛋白-1β的病患，其罹患中風及其他心血管疾病之風險也相對較高，其暗示著巨噬細胞發炎蛋白-1β可能為預防及治療心血管相關疾病之標的。

基於上述之緣由，本發明嘗試藉由調控體內巨噬細胞發炎蛋白-1β的作用，以降低血管組織的發炎反應，並促使動脈粥狀硬化的病變斑塊減小，進而能控管動脈粥狀硬化病變；此外，亦希望藉由調控體內巨噬細胞發炎蛋白-1β的作用以調控血脂肪，進而輔助心血管疾病的治療與病情的控制。

本發明基於以上之目的發現，利用載脂蛋白E基因剔除(apolipoprotein E-knockout,apoE-KO)的方式建立自發性動脈粥狀硬化病變動 物模型，並透過單株抗體等方式抑制動物體內巨噬細胞發炎蛋白-1β的作用，藉以達到抑制血管中發炎反應的功效，因而可以預防形成動脈粥狀硬化斑塊，亦可於動脈粥狀硬化斑塊形成後避免因反覆地發炎反應導致動脈粥狀硬化斑塊持續成長。

另一方面，本發明透過抑制動物體內巨噬細胞發炎蛋白-1β，可直接地減少血管中動脈粥狀硬化斑塊的面積以達到治療的效果，亦可增厚動脈粥狀硬化斑塊周圍的纖維帽，以減少動脈粥狀硬化斑塊破裂而達到穩定斑塊的功效。

於是，本發明之一方面係關於，一種巨噬細胞發炎蛋白-1β抑制劑用於製備治療及控管動脈粥狀硬化之醫藥組成物的用途，其中所述治療及控管動脈粥狀硬化係包含減少動脈粥狀硬化病變斑塊面積、穩定動脈粥狀硬化病變斑塊、減緩發炎反應及降低血脂肪。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之巨噬細胞發炎蛋白-1β抑制劑為能夠減低或抑制巨噬細胞發炎蛋白-1β之生物活性的化合物。於本發明之一項具體實施態樣，所述之巨噬細胞發炎蛋白-1β抑制劑為對於巨噬細胞發炎蛋白-1β具有結合特異性的配體化合物，例如抗-巨噬細胞發炎蛋白-1β抗體或拮抗劑。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之抗-巨噬細胞發炎蛋白-1β抗體為單株抗體或多株抗體。於本發明之一項具體實施態樣，所述之抗-巨噬細胞發炎蛋白-1β抗體為單株抗體，或其與巨噬細胞發炎蛋白-1β之至少肽類片段結合的抗體片段。於本發明之其他具體實施態樣，所述之巨噬細胞發炎蛋白-1β之肽類片段包含胺基酸序列 ⁴⁶SFVMDYYET⁵⁴(SEQ ID NO：1)，或⁶²AVVFLTKRGRQIC⁷⁴(SEQ ID NO：2)。

圖1A-1B係顯示MIP-1β-抑制劑調控自發性動脈粥狀硬化病變動物之血管組織的發炎反應(n=6)；其係取得小鼠血液檢體後分析IL-6及TNF-α含量。 ^# P<0.05係相較於未經抗體處理之自發性動脈粥狀硬化病變小鼠。

圖2A-2B係顯示MIP-1β-抑制劑減少自發性動脈粥狀硬化病變動物之斑塊面積(n=6)；其係取得小鼠主動脈後進行組織切片染色(HE stain)，並於量化後呈現結果。 ^# P<0.05係相較於未經抗體處理之自發性動脈粥狀硬化病變小鼠。以回歸統計(y=0.25ln_(x)-0.0056,R²=0.9914)分析斑塊面積減少比例。

圖3A-3B係顯示MIP-1β-抑制劑增加自發性動脈粥狀硬化病變動物之斑塊纖維帽厚度以及減少斑塊中壞死面積(n=6)；其係取得小鼠主動脈後進行膠原纖維染色(Elastica van Gieson)，並於量化後呈現結果。 ^# P<0.05係相較於未經抗體處理之自發性動脈粥狀硬化病變小鼠。

圖4A-4C係顯示MIP-1β-抑制劑降低血脂肪之功效(n=6)；其係取得小鼠血液檢體後分析血液中總膽固醇、三酸甘油及非高密度脂蛋白膽固醇的含量。 ^# P<0.05係相較於未經抗體處理之自發性動脈粥狀硬化病變小鼠。

於本說明書中所稱的“巨噬細胞發炎蛋白-1β-抑制劑(Macrophage Intlammatory protein-1β-inhibitor,MIP-1β-inhibitor)”意指，一種可減少MIP-1β蛋白含量及/或降低MIP-1β蛋白之至少一種活性的化合物。於本發明之一項具體實施態樣，所述之MIP-1β-抑制劑化合物可使MIP-1β蛋白之至少一種生物活性降低至少約10%、25%、50%、75%或以上。

於本發明之某些具體實施態樣，所述之MIP-1β-抑制劑化合物係藉由減低MIP-1β蛋白表現量，來保護胰臟及防止血糖升高。例如可使用靶定MIP-1β之siRNA、反義核酸或核酶，抑制細胞內MIP-1β基因表現。亦可藉由調節編碼MIP-1β蛋白之基因轉錄，或使所對應的mRNA不安定，而減少MIP-1β蛋白之表現量。

於本發明之其他具體實施態樣，所述之MIP-1β-抑制劑化合物係藉由與MIP-1β蛋白結合，直接或間接降低或抑制MIP-1β蛋白之生物活性，來保護胰臟及防止血糖升高。例如，根據本發明之某些實施例，可使用對抗MIP-1β之抗體與MIP-1β蛋白競爭結合至細胞表面上的受體，而抑制體內MIP-1β蛋白之生物活性。所述之抗體可包括全長單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段。

於本說明書中所稱的“抗體”意指一種與特定抗原特異結合之能力的免疫球蛋白分子或其片段。“抗體片段”包含全長抗體之一部分，較佳是抗體的抗原-結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(代表性地為抗體其中一單臂之VL及VH功能域)、單鏈Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(代表性地為VH與CH1功能域)及dAb片段(代表性地為VH功能域)；VH、VL及VhH功能域；迷你抗體(minibodies)、二體(diabodies)、三體(triabodies)、四體(tetrabodies)及kappa抗體(參見，Ill等人，Protein Eng 10：949-57, 1997)；駱駝IgG；以及由抗體片段一或多個單離的CDRs或一個功能性互補位(paratope)形成之多特異性抗體片段，其中單離的或抗原結合殘基或多肽可相互結合或鍵聯，而形成功能性抗體片段。

於本發明之某些具體實施態樣，所述之MIP-1β-抑制劑為與MIP-1β蛋白特異性結合之單株抗體。於本發明之一具體實施態樣，所述之抗-MIP-1β單株抗體係與MIP-1β蛋白結構上之主要功能作用部位結合。根據本發明之某些實施例，所述之MIP-1β-抑制劑(例如，抗-MIP-1β單株抗體)可與一包含MIP-1β蛋白之胺基酸序列位置46~54：SFVMDYYET(SEQ ID NO：1)，或MIP-1β蛋白之胺基酸序列位置62~74：AVVFLTKRGRQIC(SEQ ID NO：2)之抗原決定基結合。

根據本發明之某些實施例，所述之抗體可為人源化或全人源單株抗體。

根據本發明之醫藥組成物，可包含至少一種MIP-1β-抑制劑及一或多種生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。可依據所選擇之投藥途徑，而調配得適當的醫藥組成物形式，包括(但不限定於)口服製劑如片劑、膠囊、粉末等，非經腸道製劑如皮下、肌肉或腹膜內注射液，及於投藥前與生理緩衝溶液組合之凍乾粉末等。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

有鑑於血管中的發炎反應為形成動脈粥狀硬化斑塊的開端，且血管中的反覆地發炎反應亦將造成動脈粥狀硬化斑塊持續成長，故本發明從MIP-1β-抑制劑對於血管內發炎反應的影響開始探討，後續進一步確認MIP-1β- 抑制劑對於已形成的動脈粥狀硬化斑塊的影響，最後再進一步確認MIP-1β-抑制劑是否能夠調節血管中脂肪的含量。

實施例一、MIP-1β-抑制劑可調控自發性動脈粥狀硬化病變動物(載脂蛋白E基因剔除之自發性動脈粥狀硬化病變小鼠模型(apolipoprotein E-knockout,ApoE-KO))之血管組織的發炎反應

在取得5週齡雄性apolopoprotein E-knockout(ApoE-KO)小鼠後，分為控制組(免疫球蛋白控制組；IgG2a control)、低劑量治療組(1μg之抗MIP-1β單株抗體；anti-MIP-1β mAb)及高劑量治療組(10μg之抗MIP-1β單株抗體；anti-MIP-1β mAb)，於連續7週餵養高脂飼料(AIN-76A)後開始給予MIP-1β-抑制劑(anti-MIP-1β mAb)之注射，每週注射三次並連續注射四週，另取得5週齡雄性C57BL/6(B6)小鼠作為對照組(B6 control)，並以正常飼料餵養B6小鼠；各組小鼠於MIP-1β-抑制劑治療前以及治療後的第2週及第4週禁食5小時，接著分別採集小鼠之血液檢體，分析發炎反應指標介白素-6(Interleukin 6；IL-6)及腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α；TNF-α)。

由圖1A及圖1B之IL-6及TNF-α量化結果顯示，ApoE-KO誘發自發性動脈粥狀硬化病變小鼠之組別中，以MIP-1β-抑制劑治療之小鼠與控制組(IgG control)相較之下，無論是IL-6或TNF-α，於MIP-1β-抑制劑治療前後在血液中分泌量均呈現穩定而沒有增加的趨勢，同時MIP-1β-抑制劑治療後之ApoE-KO小鼠，其血液中IL-6及TNF-α分泌量與對照組(B6 control)(未圖示)相較之下亦無差異；據此，藉由抑制巨噬細胞發炎蛋白-1β的作用，可以抑制自發性動脈粥狀硬化病變小鼠之血管組織的發炎反應。

實施例二、MIP-1β-抑制劑可減少自發性動脈粥狀硬化病變動物之斑塊面積

在取得5週齡雄性apolopoprotein E-knockout(ApoE-KO)小鼠後，分為控制組(IgG control)、低劑量治療組(1μg anti-MIP-1β mAb)及高劑量治療組(10μg anti-MIP-1β mAb)；於連續7週餵養高脂飼料(AIN-76A)後開始給予MIP-1β-抑制劑(anti-MIP-1β mAb)之注射，每週注射三次並連續注射四週，注射MIP-1β-抑制劑之治療結束後，自小鼠之主動脈首端至腹主動脈末端分離取得主動脈，再以組織切片染色(HE stain)搭配影像分析軟體(Motic Images Plus 2.0)分析動脈粥狀硬化斑塊面積。

由圖2A斑塊面積量化結果顯示，ApoE-KO誘發自發性動脈粥狀硬化病變小鼠以MIP-1β-抑制劑治療過後，其斑塊面積相較於控制組(IgG control)呈現下降的趨勢；另由圖2B斑塊面積變化百分比結果顯示，高劑量治療組相較於控制組有顯著地減少斑塊面積(約28%)的效果，且斑塊面積減少的比例與MIP-1β-抑制劑治療劑量呈現正相關性。

實施例三、MIP-1β-抑制劑可增加自發性動脈粥狀硬化病變動物之斑塊纖維帽厚度以及減少斑塊壞死面積

以實施例二所述之實驗方法取得ApoE-KO誘發自發性動脈粥狀硬化病變小鼠之主動脈組織後，以膠原纖維染色(Elastica van Gieson)搭配影像分析軟體(Image J)分析主動脈的纖維帽厚度以及動脈粥狀硬化斑塊中壞死區域。

由圖3A纖維帽厚度量化結果顯示，以MIP-1β-抑制劑治療ApoE-KO誘發自發性動脈粥狀硬化病變小鼠之後，其主動脈之纖維帽厚度呈現增加的趨勢，並且隨著注射MIP-1β-抑制劑之劑量增加而提高； 又如圖3B動脈粥狀硬化斑塊中壞死區域量化結果顯示，高劑量治療組相較於控制組(IgG control)，斑塊中的壞死區域有顯著性地減少。由上述結果可以得知，藉由抑制巨噬細胞發炎蛋白-1β的作用，可增加圍繞位於斑塊周圍的纖維帽的厚度，因而減少斑塊破裂的風險，亦同時減少動脈粥狀硬化斑塊中壞死區域，對血管壁上病變斑塊達到穩定的效果。

實施例四、MIP-1β-抑制劑可降低血脂肪

由前述實施例一之實驗方法取得小鼠之血液檢體，分析血脂肪含量指標：血中總膽固醇(T-CHO)、三酸甘油脂(TG)以及非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)。

由圖4A-4C膽固醇、三酸甘油脂及非高密度脂蛋白膽固醇量化結果顯示，ApoE-KO誘發自發性動脈粥狀硬化病變小鼠以MIP-1β-抑制劑治療過後，與控制組(IgG control)相較之下，小鼠血液中總膽固醇、三酸甘油及非高密度脂蛋白膽固醇的含量均有下降的趨勢，且隨著MIP-1β-抑制劑處理劑量越高，血脂肪下降的趨勢則越顯著；由此可知，藉由抑制巨噬細胞發炎蛋白-1β的作用，可以調降自發性動脈粥狀硬化病變小鼠之血脂肪。

綜合上述實施例之結果可以得知，透過抑制劑或拮抗劑等策略抑制體內巨噬細胞發炎蛋白-1β之作用，可以避免動脈血管內誘發產生發炎反應，如此除可降低動脈粥狀硬化生成的風險，當動脈粥狀硬化斑塊形成後，尚可使動脈粥狀硬化斑塊免於因反覆地發炎反應而持續成長，同時，更可減少動脈粥狀硬化斑塊面積，以及增厚動脈粥狀硬化病變斑塊周圍的纖維帽以穩定斑塊而不易破裂，最後，抑制體內巨噬細胞發炎蛋白-1β亦可調降血脂肪；總括而言，基於上述實施例的探討，透過抑制體內巨噬細胞發炎蛋白-1β的作用，可以達到 預防動脈粥狀硬化生成、治療動脈粥狀硬化並減緩動脈粥狀硬化病患持續惡化的效果。

<110> 國立陽明大學臺北榮民總醫院

<120> 巨噬細胞發炎蛋白-1 β(MIP-1 β)抑制劑用以治療及控管動脈粥狀硬化之用途

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<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

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<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Claims (10)

1. 一種巨噬細胞發炎蛋白-1β抑制劑用於製備治療及控管動脈粥狀硬化之醫藥組成物的用途。
2. 如請求項1所述之用途，其中該醫藥組成物係用於減少動脈粥狀硬化病患之病變斑塊。
3. 如請求項1所述之用途，其中該醫藥組成物係用於增加動脈粥狀硬化病患之斑塊中纖維帽的厚度。
4. 如請求項1所述之用途，其中該巨噬細胞發炎蛋白-1β抑制劑為能夠減低或抑制巨噬細胞發炎蛋白-1β之生物活性的化合物。
5. 如請求項1或4所述之用途，其中該巨噬細胞發炎蛋白-1β抑制劑為對於巨噬細胞發炎蛋白-1β具有結合特異性的配體化合物。
6. 如請求項5所述之用途，其中該巨噬細胞發炎蛋白-1β抑制劑為抗-巨噬細胞發炎蛋白-1β抗體。
7. 如請求項6所述之用途，其中該MIP-1β-抑制劑為與MIP-1β蛋白或其片段特異性結合之抗-MIP-1β單株抗體。
8. 如請求項7所述之用途，其中該抗-MIP-1β單株抗體係與MIP-1β蛋白結構上之主要功能作用部位結合。
9. 如請求項7或8所述之用途，其中該抗-MIP-1β單株抗體係與一包含MIP-1β蛋白之胺基酸序列位置46~54：SFVMDYYET(SEQ ID NO：1)之肽類片段結合。
10. 如請求項7或8所述之用途，其中該抗-MIP-1β單株抗體係與一包含MIP-1β蛋白之胺基酸序列位置62~74：AVVFLTKRGRQIC(SEQ ID NO：2)之肽類片段結合。