JP2019196409A

JP2019196409A - マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤の使用方法

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Publication number: JP2019196409A
Application number: JP2019152034A
Authority: JP
Inventors: 肇文 ▲陳▼; Jaw-Wen Chen; ▲てぃん▼▲てぃん▼ 張; Ting-Ting Chang
Original assignee: FARMAR LICENSING CO Ltd; National Yang Ming University NYMU
Current assignee: FARMAR LICENSING CO Ltd; National Yang Ming Chiao Tung University NYCU
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2019-11-14
Also published as: WO2016062280A1; TWI576112B; CN107206051A; JP2017537071A; JP6860480B2; EP3210616A4; CN107108719A; TW201615215A; JP2018502055A; EP3210616A1; US20180044413A1; EP3211004C0; EP3211004B1; US20180134782A1; TWI566780B; EP3211004A1; TW201615214A; EP3211004A4; WO2016062282A1

Abstract

【課題】糖尿病患者の血管生成を促進するのに用いられるマクロファージ炎症性タンパク質＿１β抑制剤の使用方法を提供する。【解決手段】マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤は、損傷された部位の組織虚血を改善し、糖尿病の血管の病理的変化を防止する。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
この出願は、２０１４年１０月２４日に米国特許商標庁に出願された米国仮特許出願第６２/０６８４７５号に基づくアメリカ仮特許申請の優先権を主張する。その全部の内容が本発明に引用されている。

本発明は、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）の活性を抑制することによって、組織虚血と血管病理的変化を改善する使用方法に関する。特に本発明は、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤を用いた医薬組成物が糖尿病患者の血管生成を促進し、組織虚血及び糖尿病の血管病理的変化の改善に用いられるものに関する。

心臓血管病は、一型糖尿病患者および二型糖尿病患者（特に二型糖尿病患者）の主要な死因である。糖尿病患者は周辺の血管病理的変化の原因で手足の切断手術をする場合が多い。糖尿病血管病理的変化は、例えば血圧、コレステロール、血糖などの動脈硬化の一般的な危険因子を除き、明らかな全身的血管炎症反応(Vascular inflammation)が特徴である。しかし、現在、糖尿病血管病理的変化の治療効果は動脈硬化心臓血管病の治療効果より悪い。その中の一つの主要な原因は糖尿病血管病理的変化の炎症反応をコントロールする効果的な治療方法がないということである。

現在、血管病理的変化を予防と治療する薬物は主に動脈硬化症の一般危険因子例えば血圧、コレステロール、血糖などをコントロールする。しかしこれは糖尿病に関する血管病の発病を遅らせるしかできない。あるいは糖尿病に関する血管病が発病してからコントロールする。糖尿病の血管炎症反応をコントロールすることができない。それゆえ、直接糖尿病の血管炎症反応(Vascular inflammation)をコントロールし、血管を保護し、血管の新生を強め、組織虚血を改善し、糖尿病血管の病理的変化を予防する新たな治療法が必要とされる。

多数の研究によって、損傷された内皮細胞層が内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell，ＥＰＣ細胞）で修復されることが可能であり、これで血管内皮細胞層の機能性と完全性を維持することができる。内皮前駆細胞が低酸素組織の中で血管生成を促進する機能があると証明された。新生の血管は低酸素組織に必要な血液循環を提供し、低酸素による器官の損傷を減少する（非特許文献１、２）。それゆえ、どうやって内皮前駆細胞を増やすことで血管動脈硬化の改善と低酸素組織血管生成の増加を実現させるかが現在の重要な課題である。

ＥＰＣ細胞が骨髄から移出するよう媒介するＳＤＦ−１受容体ＣＸＣＲ４の作用、循環性ＥＰＣ細胞を阻害するＣＸＣＲ４の作用は、ＥＰＣが再び断血部位まで補充することを阻止することはすでに知られている（非特許文献３）。糖尿病を有するマウスでは、損傷された組織の中のＶＥＧＦ及びＳＤＦ−１の発現、周辺の血液中のＥＰＣ細胞の数量、及び、ＥＰＣ細胞の上のＣＸＣＲ４発現量が減少する現象が見られる（非特許文献４）。

マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）はリポ多糖で活性化されたマクロファージの培養液で発見された。その分子量は７．８キロドルトンであり、タンパク質は９２個アミノ酸前駆物で構成される。文献によると血液の中のマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）の数値と糖尿病や心臓血管病が正の相関を持つ。生体外実験の中、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）はＴＨＰ−１細胞の活性酸素の生産を促進し、ＴＨＰ−１細胞がPI3k_Rac1を媒介とする酸化圧力を誘導し、人類の臍静脈内皮細胞に付着する（非特許文献５）。この他、高濃度糖で、マクロファージの分泌したタンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）が内皮細胞に付着分子を発現させる。例えば、内皮細胞セレクチン(E-selectin)がそれに該当する（非特許文献６）。

心筋梗塞を有する動物モデルにおいて、梗塞した心臓を誘導し細胞因子を作り、特徴のある白血球集団を虚血のところに補充させる。梗塞したマウスの心筋の中、ＭＩＰ−１βおよび受容体CCR5は明らかに誘導を受け、発生する（非特許文献７）。しかし、今までＭＩＰ−１βは、血管保護および心筋損傷の修復に直接関わるのかということについて、関係する生体実験が不足する。
それゆえ、我々は、ＭＩＰ−１βをコントロールすることで糖尿病患者の内皮前駆細胞の増殖を増加し、血管修復生成を促進し、組織虚血を改善し、さらに糖尿病併発の血管病理的変化と心臓血管病を予防することに努力し続ける。

Asahara, T.等，EMBO J 18，3964-3972，1999 Gallagher, K.A.等, J Clin Invest 117，1249-1259，2007 Ceradini, D.J.等，Nat Med 10，858-864，2004 Ceradini,D.J.等，Journal of Biological Chemistry 283，10930-10938，2008 Tatara Y等，J Mol Cell Cardiol 47:104-111，2009 Chen TC等，J Biol Chem 286:25564-25573，2011 Dobaczewski M等人，Am J Pathol 176:2177-2187，2010

本発明は、上述の目的で、生体内において、直接に体内のマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１βを抑制する作用（例えば、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１βに反応する単クローン抗体（ｍＡｂ）またはアンタゴニストを投与する）で、糖尿病動物の血管保護を有効に強化することを発現した。

よって、本発明の一態様は、糖尿病患者の血管生成を促進する医薬組成物を製造するのに用いられるマクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤の使用方法に関する。
本発明の具体的な実施の態様によると、医薬組成物は、糖尿病患者の組織虚血を改善するのに用いられる。
本発明の他の具体的な実施の態様によると、医薬組成物は、糖尿病患者の血管の病理学的変化を防止するのに用いられる。

本発明の具体的な実施の態様によると、マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βの生物活性を低減または抑制する化合物である。
本発明の具体的な実施の態様によると、マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βに対して特異的な結合性を有するリガンド化合物である。

本発明の具体的な実施の態様によると、マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βに反応する単クローンまたは多クローン抗体である。

本発明の具体的な実施の態様によると、マクロファージ炎症性タンパク質−１βに反応する抗体は、単クローン抗体、または、マクロファージ炎症性タンパク質−１βのペプチド類フラグメントと結合する抗体フラグメントである。

本発明の具体的な実施の態様によると、マクロファージ炎症性タンパク質＿１βのペプチド類フラグメントは、４６ＳＦＶＭＤＹＹＥＴ５４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、または、６２ＡＶＶＦＬＴＫＲＧＲＱＩＣ７４（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む。

糖尿病患者にとって、体内のＥＰＣ細胞に影響するＣＸＣＲ４の発現（ｎ＝６）を促進する作用を示す。図１Ａ〜図１Ｆにて、＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１は、抗体処理されていない基礎対照組と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１は、ＭＩＰ−１β １０００ｎｇ／ｍｌで処理した対照組と比較する。ＥＰＣ細胞の移動（ｎ＝５）を促進する作用を示す。ＥＰＣ細胞の移動（ｎ＝５）を促進する作用を示す。ＥＰＣ細胞の増殖（ｎ＝３）を促進する作用を示す。ＥＰＣ細胞増殖結果は、ＭＴＴで糖尿病患者から分離されたＥＰＣ細胞の増殖を測定することで得られる。ＥＰＣ細胞の増殖（ｎ＝３）を促進する作用を示す。ＥＰＣ細胞増殖結果は、ＢｒｄＵ細胞増殖分析で糖尿病患者から分離されたＥＰＣ細胞の増殖を測定することで得られる。血管の新生能力サイトカインの発現（ｎ＝３）を促進する作用を示す。糖尿病患者の血漿中のサイトカインＶＥＧＦ及びＳＤＦ−１αの発現量は、ウェスタンブロット法で分析をし、対照組の数値と統計分析を行う。ＭＩＰ−１βが正常のマウスの血管修復生成に対する抑制作用であり、ＭＩＰ−１βは足部血流の回復を減速し、組織虚血を加重する。上図の赤い映像は血液の流通を指す。下図は血流速度統計図である。図３Ａ〜図３Ｃは、ＭＩＰ−１βが一型糖尿病マウス血管に対する保護作用を示す図である。単クローン抗体（ｍＡｂ）がマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）を抑制することで、足部血管閉塞手術を行なった糖尿病マウスの血管修復と生成を促進することを示す。図３Ａは血流映像図であり、赤い映像は血液の流通を指す。血流速度統計図である（ｎ＝６〜８；２Ｃ）。単クローン抗体（ｍＡｂ）を注射して二週間後、糖尿病マウス体内循環性ＥＰＣ細胞数量である（ｎ＝６）。免疫組織学的分析(Immunohistochemical analysis)で糖尿病マウスの断血組織筋肉中のｅＧＦＰ（緑の蛍光）−ＣＤ３１（赤い蛍光）陽性細胞の量及び分布（ｎ＝６〜８）を示す。ｅＧＦＰ−ＣＤ３１陽性細胞／筋肉繊維の蛍光強度比の数値統計図である。ｅＧＦＰ（緑の蛍光）はＥＰＣ細胞を代表し（骨髄による派生）、ＣＤ３１（赤い蛍光）は細血管を代表し、緑の蛍光と赤い蛍光とが重なり合う部分は当該細胞が虚血の位置に血管修復をする能力があることを示す。ウェスタンブロット法及び統計分析で、中和抗体注射有無の糖尿病マウスの二週間後のＶＥＧＦの含量（ｎ＝３）を示す。図４Ｃと同様の試験で、ＳＤＦ−１αの含量（ｎ＝３）を示す。外周血液の単核細胞（ｎ＝６〜１０）を示す。＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１は抗体処理がされていないＤＭマウスと比較した。図４Ｅと同様の試験で、骨髄の単核細胞の上のＣＸＣＲ４の発現量（ｎ＝６〜１０）を示す。図５Ａ〜図５Ｆは、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）が二型糖尿病マウスの血管に対する保護効果を示す図である。図５Ａは、単クローン抗体（ｍＡｂ）がマクロファージ炎症性タンパク質＿１β（ＭＩＰ−１β）を抑制することで、足部血管閉塞手術を行なった糖尿病マウスの血管修復と生成を促進することを示す。赤い映像は血液の流通を示す。図５Ａと同様の試験の結果を示す血流速度統計図である（ｎ＝６〜８）。ＭＩＰ−１β単クローン抗体でＭＩＰ−１βの活性を抑制し、処理されていない組に比べ、断血筋肉組織の細血管密度を増加させることを示す。図５Ｃと同様の試験で、ＣＤ３１陽性細胞／筋肉繊維の比率を増加させることを示す。ＭＩＰ−１β単クローン抗体（ｍＡｂ）の処理の下での糖尿病マウスが足部血管閉塞手術を行なってから、循環ＥＰＣ細胞数が処理していないマウスに比べ増加する状況を示す。＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１は抗体で処理されていないＤＭマウスに対する。図５Ｅと同様の試験で、骨髄単球のＣＸＣＲ４発現量が処理していないマウスに比べ増加する状況を示す。図６Ａ〜図６Ｄは、マクロファージ炎症性タンパク質＿１β（ＭＩＰ−１β）が肥満型糖尿病マウスの血管に対する保護効果、効果的に血管の修復と生成を促進することを示す図である。図６Ａは、単クローン抗体（ｍＡｂ）の処理の下で足部血管閉塞手術を行なったマウスの血流映像である。図６Ａと同様の試験の結果を示す血流速度統計図である（ｎ＝６）。ＭＩＰ−１β単クローン抗体（ｍＡｂ）の処理の下での糖尿病マウスが足部血管閉塞手術を行なってから、循環ＥＰＣ細胞数が処理していないマウスに比べ増加する状況を示す。＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１は抗体で処理されていないＤＭマウスに対する。図６Ｃと同様の試験で、骨髄単球のＣＸＣＲ４発現量が処理していないマウスに比べ増加する状況を示す。

本明細書中の「マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤」の意味は、ＭＩＰ−１βタンパク質含量を減少させる、及び／又は、ＭＩＰ−１βタンパク質の少なくとも一つの活性を低下させる化合物をいう。本発明の実施形態では、ＭＩＰ−１β−抑制剤化合物は、ＭＩＰ−１βタンパク質の少なくとも一つの活性を１０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上低下させることができる。

本発明の実施形態によると、ＭＩＰ−１β抑制剤化合物は、ＭＩＰ−１βタンパク質の発現量を低減することで、膵臓を保護し血糖の上昇を防止する。例えば、ＭＩＰ−１βを標的とするｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイムを使用し、細胞内のＭＩＰ−１βの遺伝子発現を抑制することができる。また、ＭＩＰ−１βタンパク質をコーディングする遺伝子転写を調節すること、または、対応するｍＲＮＡを不安定となるようにすることでＭＩＰ−１βタンパク質の発現量を減少させることができる。

本発明の実施形態によると、ＭＩＰ−１β抑制剤化合物は、ＭＩＰ−１βタンパク質と結合することにより、直接または間接にＭＩＰ−１βタンパク質の生物活性を抑制し、膵臓を保護し、血糖の上昇を防止する。例えば、本発明の実施例によると、ＭＩＰ−１βに反応する抗体とＭＩＰ−１βタンパクを競争させ、細胞表面上の受容体に結合させることで、ＭＩＰ−１βタンパク質の生物活性を抑制することができる。抗体は、全長の単クローン抗体、多クローン抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、及び、抗体フラグメントを含む。

本明細書中の「抗体」の意味は、特定の抗原と特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを指す。抗体フラグメントは、抗体全長の一部を含み、好ましくは、抗体の抗原結合領域または可変領域である。
抗体フラグメントは、以下の例を含む。
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（代表的なのは抗体のシングルハンドルのＶＬ及びＶＨの機能領域である）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄフラグメント（代表的なのはＶＨ及びＣＨ１機能領域である）、及びｄＡｂフラグメント（代表的なのはＶＨ機能領域である）；
ＶＨ、ＶＬ、及びＶｈＨ機能領域；
微抗体(minibodies)、二重特異性抗体(diabodies)、三重特異性抗体(triabodies)、四重特異性抗体(tetrabodies)及びkappa抗体(参考、Ill等, Protein Eng 10: 949-57, 1997)；
駱駝ＩｇＧ；
一つまたは複数の単離されたＣＤＲｓまたは一つの機能性パラトープ(paratope)により形成される多特異性抗体フラグメント、その中で、単離された、または、抗原結合残基またはペプチドは、互いに結合またはリンキングし、機能性の抗体フラグメントを形成する。

本発明の実施形態によると、ＭＩＰ−１β抑制剤はＭＩＰ−１β−タンパクと特異的に結合する単クローン抗体である。
本発明の一つの詳細な実施形態によると、ＭＩＰ−１βに反応する単クローン抗体はＭＩＰ−１β−タンパクの構造上の主な機能性部位と結合する。
本発明の実施例によると、ＭＩＰ−１β抑制剤（例えば、ＭＩＰ−１βに反応する単クローン抗体）は、ＭＩＰ−１βタンパクのアミノ酸配列位置６〜５４：ＳＦＶＭＤＹＹＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、または、ＭＩＰ−１βタンパクのアミノ酸配列位置６２〜７４：ＡＶＶＦＬＴＫＲＧＲＱＩＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む抗原決定基と結合することができる。

本発明の実施例によると、抗体はヒト化または完全ヒト抗体である。
本発明の医薬組成物によると、少なくとも一つのＭＩＰ−１β抑制剤または一つまたは複数の生理上受けられる担体、希釈剤、または賦形剤を含む。選ばれた投薬経路によって、適切な医薬組成物の形を調合することができる。経口製剤の場合、錠剤、カプセル、粉末などを含み、消化器を経由しない製剤の場合、皮下、筋肉、または腹膜内注射液、及び投薬する前に生理緩衝溶液と組み合わせた冷凍乾燥粉末などを含む。

本発明のほかの特徴及び長所は、以下の実施例の中で例示して説明する。下記の実施例は補助説明のためであり、本発明の範囲を制限するものではない。

［実施例１、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤がＣＸＣＲ４の発現を増加し、ＥＰＣ細胞の増殖と機能を促進する。］
本実施例では、最初はＭＩＰ−１β蛋白質とＭＩＰ−１β抑制剤がＥＰＣ細胞に対する作用を評価する。二型糖尿病患者のＥＰＣ細胞（５×１０⁴個）をとり、単独のＭＩＰ−１β １０００ｎｇ／ｍｌ、または、ＭＩＰ−１βと反応する３０μｇ／ｍｌの中和抗体と共に３０分処理する。
図１Ａの結果が示すように、単独のＭＩＰ−１βで処理するとＣＸＣＲ４の発現量に影響を与えることがなく、ＭＩＰ−１βと反応する抗体と共に培養するとＥＰＣ細胞のＣＸＣＲ４の発現量が増加する。

よって、さらにチャンバーアッセイ(chamber assay)を用いて、ＥＰＣ細胞をＭＩＰ−１βに暴露する場合、それがＳＤＦ−１αに向いて移動する能力を抑制するかを測定する。
図１Ｂと１Ｃに示すように、ＭＩＰ−１βで処理したＥＰＣ細胞（Ｍ１０００セット）は、細胞移動と生体外血管形成能力が明らかに抑制された。しかしＭＩＰ−１β抑制?で処理されたＥＰＣ?胞（Ｍ１０００＋ＮＥＵとＮＥＵセット）、ＤＭセットおよびＭＩＰ−１β処理したセット（Ｍ１０００セット）に比べ、回復した細胞移動と生体外血管形成能力を有する。

ＭＴＴ及びＢｒｄＵ細胞増殖分析で測定した結果が示すように、ＭＩＰ−１βに反応する中和抗体（ＮＥＵ）で処理したＥＰＣ細胞組は、細胞増殖も明らかに増加する（図１Ｄ、１Ｅ）。
ＭＩＰ−１β−抑制剤（ＭＩＰ−１βに反応する中和抗体、ＮＥＵ）による処理は、ＶＥＧＦ及びＳＤＦ−１αの生成を増加する（図１Ｆ）。

［実施例２、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が一型糖尿病動物（ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で誘導された糖尿病マウスモデル)の血管を保護する。］
糖尿病に患わない健康な動物にマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤を注射すると、足部血管閉塞手術を行った後の血管修復と生成を抑制し、足部血流の回復を減速し、組織虚血を加重する。こういう効果はマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤の使用量の増加（Ｍ０．１μｇ，１．０μｇ，１０．０μｇ）につれて加重する（図２）。

本実施例は一型糖尿病動物（ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で誘導された糖尿病マウスモデル）を対象とし生体実験を行う。マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤は糖尿病マウスの血管生成を促進でき、組織虚血を改善できることが証明された。まずマウスの骨髄細胞移植を行い、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を注射し、高血糖の糖尿病を誘導する。これから足部血管閉塞をする。

図３から明らかにするように、足部血管閉塞をしたマウスは足部血管閉塞をしないマウスと比べ、血流は同じ程度で減少する。二週間から四週間の後、健康なマウスはだんだん血流を回復するに対し、糖尿病マウスは自ら回復できない。しかし、マクロファージ炎症性タンパク質＿１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤を注射した糖尿病マウスの虚血状況は明らかに改善され、健康なマウスのように血流を回復する。

健康な動物は足部血管閉塞を受け、足部虚血が発生する時、外周血の血管内皮細胞(Ｓｃａ−１＋／Ｆｌｋ−１＋双陽性細胞)が大量増加し、足部の血管生成を促進する。しかし血糖値の高い一型糖尿病動物は外周血の血管内皮細胞は足部虚血する時上昇しない。ＭＩＰ−１βに反応する単クローン抗体（ｍＡｂ）を注射すると、体内のマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１βに対して、効果的に一型糖尿病動物の手術を行なった後外周血の血管内皮細胞数量を増加し、それで血管修復と生成を促進し、組織虚血を改善する（図３Ｃ）。

［実施例３、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤がＥＰＣ細胞復位の増加とＶＥＧＦの増量調節とＳＤＦ−１の発生ということで糖尿病動物の血管生成を促進する。］
免疫組織化学的染色切片の結果が示すように（図４Ａ）、糖尿病マウスの虚血の足部の細血管密度とＥＰＣ細胞（骨髄による派生）復位数量は健康なマウスより明らかに減少する。しかし、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤を注射したマウスは虚血筋肉の双陽性細胞数量が処理されていない糖尿病マウスより多い。これはマクロファージ炎症性タンパク質＿１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が効果的にＥＰＣ細胞（骨髄による派生）復位数量を増加し、糖尿病マウスの組織虚血による細血管減少の状況を改善する。

ｅＧＦＰ＋（緑の蛍光）はＥＰＣ細胞（骨髄による派生）を代表する。ＣＤ３１＋（赤い蛍光）は細血管を代表する。ＤＡＰＩ染色（青い蛍光）は細胞核を代表する。緑の蛍光と赤い蛍光が重なり合う部分は当該の細胞が虚血の位置に血管修復をする能力があると表明する。標準化された定量の為に，緑の蛍光と赤い蛍光が重なり合う部分の数量と筋肉繊維の数量との比率を表す（図４Ｂ）。

ウェスタンブロット法で、血漿の中の血管生成サイトカインＶＥＧＦ及びＳＤＦ−１αの含量を測定し、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤で処理すると糖尿病マウスの血液の血管細胞因子ＶＥＧＦとＳＤＦ−１αの含有量を増加するという結果がわかる（図４Ｃ、４Ｄ）。同時に糖尿病による外周血液単球および骨髄単球表面のＣＸＣＲ４発現量減少の状況を逆転する（図４Ｅ、４Ｆ）。

上述の研究結果を踏まえ、以下の結論が明らかにした。一型糖尿病マウスのモデルについて、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤はＥＰＣ−細胞類の復位により血管生成細胞因子ＶＥＧＦとＳＤＦ−１αの血液の濃度を増加し、外周血液単球および骨髄単球表面のＣＸＣＲ４発現量を回復する。それで、糖尿病組織の虚血の部分の血管生成を促進し、正常血流の回復を協力し、損傷した組織の壊死を受け止める。

［実施例４、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が二型糖尿病動物（Ｌｅｐｒ^db/dbマウスモデル）の血管を保護し、血管生成を促進する。］
本実施例は二型糖尿病動物（Ｌｅｐｒ^db/dbマウスモデル）生体研究を行い、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が二型糖尿病の血管生成と虚血した足部の血流の回復にも効果があると証明するつもりである。図５のように、血糖値の高い二型糖尿病動物にマクロファージ炎症性タンパク質＿１β（ＭＩＰ−１β）を対抗する単クローン抗体（ｍＡｂ）を注射すると、効果的に足部血管閉塞をした後の血管修復生成と足部の血流回復を促進し、組織虚血を改善する（図５Ａ、５Ｂ）。

マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が二型糖尿病動物モデルに対して、効果的に足部血管閉塞をした動物の外周血の血管内皮細胞数量（図５Ｃ）、細血管密度（図５Ｄ、５Ｅ）、循環性ＥＰＣ細胞の復位数量（図５Ｆ）を増加し、骨髄単球細胞のＣＸＣＲ４発現量を回復する（図５Ｇ）。

［実施例５、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が高脂肪飲食による糖尿病マウスモデルの血管を保護し、血管生成を促進する。］
本実施例は、高脂肪飲食による糖尿病マウス生体研究を行い、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が高脂肪飲食による糖尿病の血管生成と虚血した足部の血流の回復にも効果があることを証明するものである。図６のように血糖値の高い二型糖尿病動物にマクロファージ炎症性タンパク質＿１β（ＭＩＰ−１β）を対抗する単クローン抗体（ｍＡｂ）を注射すると、効果的に足部血管閉塞をした後の血管修復生成と足部の血流回復とを促進し、組織虚血を改善する（図６Ａ、６Ｂ）。

肥満型糖尿病マウスモデルについて、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）抑制剤が効果的に足部血管閉塞をした動物の外周血の血管内皮細胞数量（Ｓｃａ−１／Ｆｌｋ−１双陽性細胞）を増加し（図６Ｃ）、骨髄単球細胞のＣＸＣＲ４発現量を回復する（図６Ｄ）。

生体内においてマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）は血管修復生成を抑制し、足部虚血した後血流回復を減速し、組織虚血を加重する。単クローン抗体（ｍＡｂ）で直接マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）を対抗すると、効果的に糖尿病動物の血管を保護し、血管内皮細胞増殖及び復位を促進し、血管修復生成と組織虚血とを改善する。それゆえ、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）の活性および作用を直接抑制することは、糖尿病の血管病理的変化の予防と治療に直接的で重大な利益を有する。

Claims

糖尿病患者の血管生成を促進する医薬組成物を製造するのに用いられるマクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤の使用方法。
前記医薬組成物は、糖尿病患者の組織虚血を改善するのに用いられることを特徴とする、請求項１に記載の使用方法。
前記医薬組成物は、糖尿病患者の血管の病理学的変化を防止するのに用いられることを特徴とする、請求項１に記載の使用方法。
前記医薬組成物は、内皮前駆細胞を増加させ、糖尿病患者の血管損傷を修復し、虚血後の血流回復を促進するのに用いられることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用方法。
前記マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βの生物活性を低減または抑制する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用方法。
前記マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βに対して特異的な結合性を有するリガンド化合物であることを特徴とする、請求項１または５に記載の使用方法。
前記マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βに反応する抗体であることを特徴とする、請求項６に記載の使用方法。
前記マクロファージ炎症性タンパク質−１β抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βまたはそのフラグメントに対して特異的に結合しマクロファージ炎症性タンパク質＿１βに反応する単クローン抗体であることを特徴とする、請求項７に記載の使用方法。
前記マクロファージ炎症性タンパク質−１βに反応する単クローン抗体は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βの構造のメイン機能性部位と結合することを特徴とする、請求項８に記載の使用方法。
前記マクロファージ炎症性タンパク質−１βに反応する単クローン抗体は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βの４６〜５４：ＳＦＶＭＤＹＹＥＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に位置するアミノ酸配列を含むペプチト類フラグメントと結合することを特徴とする請求項８または９に記載の使用方法。
前記マクロファージ炎症性タンパク質−１βに反応する単クローン抗体は、マクロファージ炎症性タンパク質−１βの６２〜７４：ＡＶＶＦＬＴＫＲＧＲＱＩＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）に位置するアミノ酸配列を含むペプチト類フラグメントと結合することを特徴とする請求項８または９に記載の使用方法。