CN107108719A - 巨噬细胞发炎蛋白‑1β（MIP‑1β）抑制剂用于促进血管新生以改善组织缺血及糖尿病血管病变的用途 - Google Patents

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Abstract

巨噬细胞发炎蛋白‑1β(MIP‑1β)抑制剂用于促进糖尿病患者血管新生，以改善受损部位组织缺血，及防止并发糖尿病血管病变的用途。

Description

巨噬细胞发炎蛋白-1β(MIP-1β)抑制剂用于促进血管新生以改善组织缺血及糖尿病血管病变的用途
本申请要求于2014年10月24日提交美国专利商标局、申请编号为No.62/068,475的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明是关于利用抑制巨噬细胞发炎蛋白-1β(MIP-1β)的活性以改善组织缺血及血管病变的用途。更特别地，本发明是关于包含巨噬细胞发炎蛋白-1β(MIP-1β)抑制剂的组合物用于促进糖尿病患者血管新生的用途。
背景技术
心血管疾病是第一型及第二型糖尿病人(尤其是第二型糖尿病人)的主要死因。糖尿病人因周边血管病变而截肢的情况亦时有所见。糖尿病的血管病变除与动脉硬化之一般危险因子如血压、血脂、血糖等相关外，其特色为明显且全身性的血管发炎反应(Vascular inflammation)。然而目前糖尿病的血管病变治疗效果较一般动脉硬化心血管疾病治疗效果为差。其中一个主要原因乃是:目前并无有效的治疗策略针对糖尿病血管病变的发炎反应加以控制。
现有的防治血管病变的药物，其治疗主要是针对动脉硬化的一般危险因子，如血压、血脂、血糖等加以调控，但只能延缓糖尿病相关的血管病发病，或是在糖尿病相关的血管病变发生后再加以控制，并未能够针对糖尿病的血管发炎反应(Vascular inflammation)加以控制。因此，有需要寻求一种可直接调控糖尿病的血管发炎反应，保护血管、加强血管新生及改善组织缺血，以防治糖尿病血管病变的新治疗方式。
许多研究发现，受损的内皮细胞层可以藉由血液中的内皮前驱 干细胞(endothelial progenitor cell，EPC细胞)来进行修复，藉以维持血管内皮细胞层的功能性与完整性，而内皮前驱干细胞在发生缺氧的组织中，亦被证实具有促进血管新生的作用，新生血管能提供缺氧组织所需要的血液循环，以减少组织因缺氧所造成的器官伤害(Asahara,T.等人，EMBO J 18，3964-3972，1999；Gallagher,K.A.等人,J Clin Invest 117，1249-1259，2007)。因此，如何藉由提升内皮前驱干细胞来改善血管动脉硬化与增加缺氧组织的血管新生，亦是目前研究的重要课题。
已知，SDF-1受体CXCR4可介导EPC细胞从骨髓移出的作用，且阻断循环性EPC细胞上的CXCR4作用，会阻止EPC再补充至绝血部位(Ceradini,D.J.等人，Nat Med 10，858-864，2004)。而在糖尿病鼠，受损组织中的VEGF及SDF-1表现、周边血液的EPC细胞数量以及EPC细胞上的CXCR4表现量都有减少的现象(Ceradini,D.J.等人，Journal of Biological Chemistry 283，10930-10938，2008)。
巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β最先是于由脂多糖所活化的巨噬细胞培养液中所发现，它的分子量为7.8千道尔顿，其蛋白质结构为92个氨基酸前驱物所组成。根据文献指出，血中的巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β数值与糖尿病及心血管疾病皆有正相关性。在活体外实验中，MIP-1β能够促进THP-1细胞的活性氧产生，并诱导THP-1细胞透过经由PI3k–Rac1级联所介导的氧化压力，附着至人类脐静脉内皮细胞上(Tatara Y等人，J Mol Cell Cardiol 47:104-111，2009)。此外，于高浓度糖存在下，巨噬细胞分泌的MIP-1β蛋白能够促使内皮细胞表现黏附分子，例如内皮细胞选择素(E-selectin)(Chen TC等人，J Biol Chem 286:25564-25573，2011)。
在心肌梗塞动物模式中，诱导梗塞心脏产生细胞因子，会促使具有特殊性质的白血球族群再补充到缺血部位，而在梗塞小鼠的心 肌中，MIP-1β及其受体CCR5会明显受到诱导产生(Dobaczewski M等人，Am J Pathol 176:2177-2187，2010)。但是至目前为止，MIP-1β是否直接与血管保护及心肌损伤修护有关，则仍缺乏相关的活体实验证据。
因此，吾等尝试藉由调控巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β的作用，来增加糖尿病患者的内皮前驱干细胞增生、促进血管修复新生、改善组织缺血，以及进一步防治糖尿病并发的血管病变及心血管疾病。
发明内容
本发明基于以上的目的发现，在活体内，透过直接抑制体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β的作用(例如施予抗-巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β单株抗体(mAb)或拮抗剂等方法)，可有效加强糖尿病动物的血管保护。
于是，本发明之一方面是关于，一种巨噬细胞发炎蛋白-1β抑制剂用于制备促进糖尿病患者血管新生的医药组成物的用途。于本发明的一些具体实施态样，所述的医药组成物是用于改善糖尿病患者组织缺血。于本发明的其他具体实施态样，所述的医药组成物是用于防止糖尿病患者血管病变。
于本发明的一些具体实施态样，所述的巨噬细胞发炎蛋白-1β抑制剂为能够减低或抑制巨噬细胞发炎蛋白-1β的生物活性的化合物。于本发明的一项具体实施态样，所述的巨噬细胞发炎蛋白-1β抑制剂为对于巨噬细胞发炎蛋白-1β具有结合特异性的配体化合物，例如抗-巨噬细胞发炎蛋白-1β抗体或拮抗剂。
于本发明的一些具体实施态样，所述的抗-巨噬细胞发炎蛋白-1β抗体为单株抗体或多株抗体。于本发明的一项具体实施态样，所述的抗-巨噬细胞发炎蛋白-1β抗体为单株抗体，或其与巨噬细胞发炎蛋白-1β的至少肽类片段结合的抗体片段。于本发明的其他具 体实施态样，所述的巨噬细胞发炎蛋白-1β的肽类片段包含氨基酸序列46SFVMDYYET54(SEQ ID NO:1)，或62AVVFLTKRGRQIC74(SEQ ID NO:2)。
附图说明
图1是显示MIP-1β-抑制剂对于糖尿病患者，影响其体内EPC细胞的CXCR4表现(图1A；n＝6)，以及回复EPC细胞的移动(图1B，1C；n＝5)与增生(图1D，1E；n＝3)，及促进血管新生能力细胞因子表现(图1F；n＝3)的作用。图1D及1E所表示的EPC细胞增生结果，是分别以MTT(D)与BrdU细胞增生分析(E)测定分离自糖尿病患者的EPC细胞增生而得。图1F所示糖尿病患者血浆中细胞因子VEGF及SDF-1α的表现量，是以西方转渍法进行分析，并与对照组的数值进行统计分析。#P<0.05,##P<0.01是相较于未经抗体处理的基础对照组。*P<0.05,**P<0.01是相较于单独以MIP-1β 1000ng/ml处理的对照组。
图2是显示MIP-1β蛋白对于正常小鼠的血管修复新生具有抑制作用，会减低下肢血流的恢复，加重组织缺血。图2A中红色影像是指示有血液流通，图2B为血流速率统计图(n＝6～8)。
图3是显示MIP-1β-抑制剂对于第一型糖尿病小鼠血管的保护功效，以单株抗体(mAb)抑制体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β的活性，可于有下肢血管阻断(OP)的糖尿病小鼠有效促进血管修复新生。图3A为血流影像图，其中红色影像是指示有血液流通，图3B为血流速率统计图(n＝6～8；2C)。图3C为注射单株抗体(mAb)2周后，测定糖尿病小鼠体内循环性EPC细胞数量(n＝6)。
图4A为以双重免疫组织染色分析(Immunohistochemical analysis)检测糖尿病小鼠eGFP(绿色荧光)-CD31(红色荧光)阳性细胞于绝血组织肌肉中的数量及分布(n＝6～8)；图4B为eGFP-CD31阳性细胞/肌纤维荧光强度比的数值统计图，eGFP(绿色荧光)代表 EPC细胞(由骨髓衍生)，CD31(红色荧光)代表微血管，绿红荧光重叠部分表示该细胞有能力到缺血位置进行血管修复。图4C及4D是显示以西方转渍法(Western blot)与统计分析，检测糖尿病小鼠有或无注射中和抗体2周后，其血浆中VEGF(C)及SDF-1α(D)的含量(n＝3)。图4E及4F是显示于周边血液单核细胞(E)及骨髓单核细胞(F)上的CXCR4表现量(n＝6～10)。#P<0.05,##P<0.01是相较于未经抗体处理的DM小鼠。
图5是显示MIP-1β-抑制剂对于第二型糖尿病小鼠血管的保护功效。图5A、5B显示，以单株抗体(mAb)抑制体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β的活性，有效促进经下肢血管阻断(OP)的糖尿病小鼠的血管修复新生，图5A中红色影像是指示有血液流通，图5B为血流速率统计图(n＝6～8)。图5C、5D是显示以MIP-1β单株抗体抑制MIP-1β活性相较于未处理组可增加缺血肌肉的微血管密度(C)，及CD31阳性细胞/肌纤维比(D)。图5E、5F是显示以MIP-1β单株抗体处理的糖尿病小鼠，在下肢缺血手术后的循环EPC细胞数(E)及骨髓单核细胞上的CXCR4表现量(F)相对于位处理小鼠的增加情形。#P<0.05,##P<0.01是相较于未经抗体处理的DM小鼠。
图6是显示MIP-1β-抑制剂对于肥胖型糖尿病小鼠血管的保护功效，有效促进血管修复新生。图5A、5B分别为以单株抗体(mAb)处理经下肢血管阻断(OP)的糖尿病小鼠的血流影像，及血流速率统计图(n＝6)。图5C、5D是显示以MIP-1β单株抗体处理的糖尿病小鼠，在下肢缺血手术后的循环EPC细胞数(C)及骨髓单核细胞上的CXCR4表现量(D)相对于位处理小鼠的增加情形。#P<0.05,##P<0.01是相较于未经抗体处理的DM小鼠。
具体实施方式
于本说明书中所称的“巨噬细胞发炎蛋白-1β-抑制剂(MIP-1β-抑制剂)”意指，一种可减少MIP-1β蛋白含量及/或降低MIP-1β蛋 白的至少一种活性的化合物。于本发明的一项具体实施态样，所述的MIP-1β-抑制剂化合物可使MIP-1β蛋白的至少一种生物活性降低至少约10％、25％、50％、75％或以上。
于本发明的某些具体实施态样，所述的MIP-1β-抑制剂化合物是藉由减低MIP-1β蛋白表现量，来保护胰脏及防止血糖升高。例如可使用靶定MIP-1β的siRNA、反义核酸或核酶，抑制细胞内MIP-1β基因表现。亦可藉由调节编码MIP-1β蛋白的基因转录，或使所对应的mRNA不安定，而减少MIP-1β蛋白的表现量。
于本发明的其他具体实施态样，所述的MIP-1β-抑制剂化合物是藉由与MIP-1β蛋白结合，直接或间接降低或抑制MIP-1β蛋白的生物活性，来保护胰脏及防止血糖升高。例如，根据本发明的某些实施例，可使用对抗MIP-1β的抗体与MIP-1β蛋白竞争结合至细胞表面上的受体，而抑制体内MIP-1β蛋白的生物活性。所述的抗体可包括全长单株抗体、多株抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段。
于本说明书中所称的“抗体”意指一种与特定抗原特异结合的能力的免疫球蛋白分子或其片段。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，较佳是抗体的抗原-结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)3、Fv(代表性地为抗体其中一单臂的VL及VH功能域)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(代表性地为VH与CH1功能域)及dAb片段(代表性地为VH功能域)；VH、VL及VhH功能域；迷你抗体(minibodies)、二体(diabodies)、三体(triabodies)、四体(tetrabodies)及kappa抗体(参见，Ill等人,Protein Eng 10:949-57,1997)；骆驼IgG；以及由抗体片段一或多个单离的CDRs或一个功能性互补位(paratope)形成的多特异性抗体片段，其中单离的或抗原结合残基或多肽可相互结合或键联，而形成功能性抗体片段。
于本发明的某些具体实施态样，所述的MIP-1β-抑制剂为与MIP-1β蛋白特异性结合的单株抗体。于本发明的一具体实施态样，所述的抗-MIP-1β单株抗体是与MIP-1β蛋白结构上的主要功能作用部位结合。根据本发明的某些实施例，所述的MIP-1β-抑制剂(例如，抗-MIP-1β单株抗体)可与一包含MIP-1β蛋白的氨基酸序列46SFVMDYYET54(SEQ ID NO:1)，或62AVVFLTKRGRQIC74(SEQ ID NO:2)的抗原决定基结合。
根据本发明的某些实施例，所述的抗体可为人源化或全人源单株抗体。
根据本发明的医药组成物，可包含至少一种MIP-1β-抑制剂及一或多种生理上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。可依据所选择的投药途径，而调配得适当的医药组成物形式，包括(但不限定于)口服制剂如片剂、胶囊、粉末等，非经肠道制剂如皮下、肌肉或腹膜内注射液，及于投药前与生理缓冲溶液组合的冻干粉末等。
本发明的其他特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明，而该实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。
实施例一、MIP-1β-抑制剂增加CXCR4表现及促进EPC细胞的增生与功能
本实例首先评估MIP-1β蛋白及MIP-1β-抑制剂对于EPC细胞的作用。将取自第二型糖尿病患者的EPC细胞(5×104颗细胞)以MIP-1β 1000ng/ml单独或与抗-MIP-1β 30μg/ml中和抗体共同处理30分钟。由图1A的结果显示，单独以MIP-1β蛋白处理并不会影响CXCR4表现，而与抗-MIP-1β抗体共培养，则会显著增加EPC细胞上的CXCR4表现量。
于是，进一步以舱室分析(chamber assay)测试，将EPC细胞暴露至MIP-1β是否会抑制其朝向SDF-1α的移动能力。由图1B及 1C的结果显示，以MIP-1β处理的EPC细胞(M1000组)，其细胞移动及活体外血管形成能力皆受到明显抑制；而经由MIP-1β-抑制剂(抗-MIP-1β中和抗体)处理的EPC细胞(M1000+NEU及NEU组)，相较于DM组及MIP-1β处理组(M1000组)，则呈现恢复的细胞移动与活体外血管形成能力。
而且，分别藉由MTT及BrdU细胞增生分析的测试结果显示，在抗-MIP-1β中和抗体(NEU)处理的EPC细胞组，其细胞增生也明显增加(图1D、1E)；此外，经由MIP-1β-抑制剂(抗-MIP-1β中和抗体，NEU)处理亦可增加VEGF及SDF-1α的产生(图1F)。
实施例二、MIP-1β-抑制剂对于第一型糖尿病动物(链佐霉素(STZ)-诱导的糖尿病小鼠模型)的血管保护
在正常无糖尿病动物，注射巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β，可抑制下肢缺血(OP)后的血管修复新生、减低下肢血流的恢复，加重组织缺血。此作用会依MIP-1β剂量增加(M0.1μg,1.0μg,10.0μg)而加重(图2)。
本实例以第一型糖尿病动物(链佐霉素(STZ)-诱导的糖尿病小鼠模型)进行活体实验，证明MIP-1β-抑制剂可促进糖尿病小鼠的血管新生，改善组织缺血。将小鼠先施予骨髓细胞移植，并注射链佐霉素(STZ)-诱导高血糖的糖尿病发生，接着进行下肢血管结扎手术。
由图3A的结果显示，每组小鼠经过下肢血管结扎手术的下肢相较于另一未经血管结扎手术的下肢，血流都以相同程度地减少。经过2及4周后，正常(非-糖尿病)小鼠的绝血情况已慢慢恢复血流，但是糖尿病小鼠则无法自行恢复。而糖尿病小鼠在经过施打MIP-1β-抑制剂(抗-MIP-1βmAb)处理后，其绝血情况已明显获得改善，而呈现与正常小鼠相似的血流恢复(图3B)。
无糖尿病的正常动物于接受下肢血管结扎手术(OP)造成下肢 缺血时，周边血中血管内皮干细胞(Sca-1+/Flk-1+双阳性细胞)会大量升高，以促进下肢血管新生。而血糖值高的第一型糖尿病动物周边血中血管内皮干细胞则于下肢缺血时不会升高。注射抗-MIP-1β单株抗体(mAb)对抗体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β，可有效升高第一型糖尿病动物其手术(OP)后周边血中血管内皮干细胞数量，以帮助血管修复新生、改善组织缺血(图3C)。
实施例三、MIP-1β-抑制剂藉由增加EPC细胞复位(homing)及增量调节VEGF与SDF-1产生而促进糖尿病动物的血管新生
由免疫组织切片染色的结果显示(图4A)，在糖尿病小鼠的绝血下肢，其微血管密度及EPC细胞(由骨髓衍生)复位数量，相较于非糖尿病小鼠皆明显减少；而注射对抗体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β的抗-MIP-1β单株抗体(mAb)的小鼠，其缺血肌肉中所含的双阳性细胞数量明显较未经抗体处理的糖尿病小鼠缺血肌肉多，表示抑制活体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β，可有效增加EPC细胞(由骨髓衍生)复位数量，并改善糖尿病小鼠因组织缺血所产生微血管减少的情形。eGFP+(绿色荧光)代表EPC细胞(由骨髓衍生)，CD31+(红色荧光)代表微血管，DAPI染色(蓝色荧光)代表细胞核，绿、红荧光重叠部分表示该细胞有能力到缺血位置进行血管修复。为标准化定量，将所得的绿、红荧光重叠数量与肌纤维数量以比值呈现(图4B)。
以西方转自分析测定血浆的血管生成细胞因子VEGF与SDF-1α的含量，结果显示以MIP-1β-抑制剂处理可增加糖尿病小鼠血浆中的血管生成细胞因子VEGF与SDF-1α含量(图4C、4D)，同时亦可逆转因糖尿病所造成，在周边血液单核细胞及骨髓单核细胞表面上CXCR4表现量减低的情况(图4E、4F)。
综合以上的研究结果证明，于第一型糖尿病小鼠模式，MIP-1β-抑制剂可透过增加类EPC-细胞的复位，增加血管生成细胞因子 VEGF及SDF-1α的血浆浓度，以及回复周边血液单核细胞及骨髓单核细胞上的CXCR4表现量，来促进糖尿病组织绝血部位的血管新生，协助恢复正常血流而防止受损组织坏死。
实施例四、MIP-1β-抑制剂对于第二型糖尿病动物(Leprdb/db小鼠模型)的血管保护及促进血管新生
本实例是以第二型糖尿病动物(Leprdb/db小鼠模型)进行活体实验证明，MIP-1β-抑制剂对于第二型糖尿病亦具有促进血管新生及恢复绝血下肢血流的功能。由图5显示，在血糖值高的第二型糖尿病动物，注射单株抗体(mAb)对抗体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β，可有效帮助下肢缺血(OP)后的血管修复新生、增加下肢血流的恢复，改善组织缺血(图5A、5B)。
同样，于第二型糖尿病小鼠模式，MIP-1β-抑制剂可有效升手术(op)后糖尿病动物的周边血中血管内皮干细胞数量(图5C)，增加微血管密度(图5D、5E)，循环性EPC细胞(由骨髓衍生)复位数量(图5F)，及回复骨髓单核细胞上的CXCR4表现量(图5G)。
实施例五、MIP-1β-抑制剂对于高脂肪饮食所诱发的糖尿病小鼠模型的血管保护及促进血管新生
本实例是以高脂肪饮食所诱发的糖尿病小鼠模型)进行活体实验证明，MIP-1β-抑制剂对于肥胖型糖尿病亦具有促进血管新生及恢复绝血下肢血流的功能。由图6显示，在血糖值高的第二型糖尿病动物，注射单株抗体(mAb)对抗体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β，可有效帮助下肢缺血(OP)后的血管修复新生、增加下肢血流的恢复，改善组织缺血(图6A、6B)。
于肥胖型糖尿病小鼠模式，MIP-1β-抑制剂可有效升缺血手术(OP)后糖尿病动物的周边血液血管内皮干细胞(Sca-1/Flk-1双阳性细胞)的数量(图6C)，以及回复骨髓单核细胞上的CXCR4表现量(图6D)。
根据本发明已证实，在活体内，巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β会抑制血管修复新生，及减低下肢缺血后的血流恢复，加重组织缺血。而以单株抗体(mAb)直接对抗体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1β，可有效加强糖尿病动物的血管保护，藉由促进血管内皮干细胞增生及复位，帮助血管修复新生及改善组织缺血。因此，透过直接抑制体内巨噬细胞发炎蛋白(MIP)-1的活性及作用(例如，藉由投药单株抗体或拮抗剂等方法)，对糖尿病的血管病变防治有直接且重大的效益。
符号说明
无

Claims (11)

  1. 一种巨噬细胞发炎蛋白-1β抑制剂用于制备促进糖尿病患者血管新生的医药组成物的用途。
  2. 如权利要求1所述的用途，其中该医药组成物是用于改善糖尿病患者的组织缺血。
  3. 如权利要求1所述的用途，其中该医药组成物是用于防止糖尿病患者血管病变。
  4. 如权利要求1或2所述的用途，其中该医药组成物是用于增加内皮前驱干细胞，修复糖尿病患者的血管损伤，及促进缺血后的血流恢复。
  5. 如权利要求1所述的用途，其中该巨噬细胞发炎蛋白-1β抑制剂为能够减低或抑制巨噬细胞发炎蛋白-1β的生物活性的化合物。
  6. 如权利要求1或5所述的用途，其中该巨噬细胞发炎蛋白-1β抑制剂为对于巨噬细胞发炎蛋白-1β具有结合特异性的配体化合物。
  7. 如权利要求6所述的用途，其中该巨噬细胞发炎蛋白-1β抑制剂为抗-巨噬细胞发炎蛋白-1β抗体。
  8. 如权利要求7所述的用途，其中该MIP-1β-抑制剂为与MIP-1β蛋白或其片段特异性结合的抗-MIP-1β单株抗体。
  9. 如权利要求8所述的用途，其中该抗-MIP-1β单株抗体是与MIP-1β蛋白结构上的主要功能作用部位结合。
  10. 如权利要求8或9所述的用途，其中该抗-MIP-1β单株抗体是与一包含MIP-1β蛋白的氨基酸序列位置46～54：SFVMDYYET(SEQ ID NO：1)的肽类片段结合。
  11. 如权利要求8或9所述的用途，其中该抗-MIP-1β单株抗体是与一包含MIP-1β蛋白的氨基酸序列位置62～74：AVVFLTKRGRQIC(SEQ ID NO：2)的肽类片段结合。
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