TW201828933A - 用於治療眼疾的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種用於治療眼疾的方法，具體而言是一種治療糖尿病相關的眼疾的方法，該方法包含向有其需要的個體投予有效量的具有式A1結構的一組化合物，其中眼疾係選自由增生性玻璃體視網膜病變、葡萄膜炎、青光眼及老年性黃斑病變所組成的群組，且糖尿病相關的眼疾係選自由糖尿病視網膜病變及糖尿病黃斑水腫所組成的群組。

Description

用於治療眼疾的方法
本發明有關於一種用於治療眼疾的方法。
糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)及糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)是成人失明的主因，且是糖尿病最常見的併發症。(Aiello LP et al. Diabetic retinopathy. Diabetes Care 21:143-156, 1998)。其影響超過30%有糖尿病的人，最終導致許多患者的視網膜水腫、血管新生(neovascularization)及視力喪失。糖尿病視網膜病變中已廣泛記錄血管改變，包括血-視網膜屏障(BRB)的分解、毛細管基底膜的增厚、及外被細胞數量減少與非細胞毛細管數目的增加。(Yang LP et al. Baicalein reduces inflammatory process in a rodent model of diabetic retinopathy. Inv. Opthalmol. Vis. Sci 50:2319-2327, 2009)。毛細管細胞並不是在糖尿病中經歷凋亡性死亡的唯一視網膜細胞。據報告，有糖尿病的人及動物其視網膜中有大於正常頻率的新生血管細胞的TUNEL(BrdU-Red DNA片段)為陽性成為及 。雖然視網膜血管分佈是糖尿病視網膜病變發展的中心，有越來越多的證據表明神經視網膜功能在疾病期間也受波及，經常在明顯血管改變之前。(Barbe AJ et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J. Clin Invest. 102:783-791, 1998)。
例如，在診斷出糖尿病之後及在偵測到臨床上明顯的血管視網膜病變之前，已迅速地在病患身上記錄到視覺功能不足，如色覺喪失，對比敏感度及視網膜電圖異常。(Phipps JA et al. Paired-fflash identification of rod and cone dysfunction in the diabetic rat. Inv Ophthalmol Vis Sci 45:4592-4600, 2004)。早期的神經元變化在糖尿病的實驗性囓齒動物模型的視網膜中也是明顯的，包括類似於人類糖尿病中所描述的神經生理缺陷。由於神經視網膜變化發生在疾病過程的早期階段，有人已提出其可能在與糖尿病視網膜病變相關的血管病變的發生及進展中起到致病或貢獻的角色。(Ward MM et al. Glutamate uptake in retinal glial cells during diabetes. Diabetologia 48:351-360, 2005)。在過去的研究中，越來越多的證據證實了一個概念，視網膜的發炎，其特徵在於小神經膠質細胞及星形膠質細胞的活化，其參與了糖尿病視網膜病變的發病機制。糖尿病視網膜病變是一種慢性、低度發炎性的疾病。(Fan JW et al. Pharmacologic induction of heme oxygenase -1 plays a protective role in diabetic retinopathy in rats. Inv Ophthalmol Vis. Sci. 53: 6541-6556, 2012)。糖尿病症狀導致視網膜內促炎細胞激素表現的升高，其活化小神經膠質細胞。回應於活化刺激，靜止小神經膠質細胞經歷了一系列的刻板形態、表型及功能變化。活化的小神經膠質細胞因此刺激了吸收白血球的循環發炎，導致血管分解，並通過釋放細胞毒性物質直接誘導神經膠質功能障礙及神經元細胞死亡。(Steinle JJ et al. Intra-ophthalmic artery chemotherapy triggers vascular toxicity through endothelial cell inflammation and leukosasis. Inv Ophthalmol Vis Sci 53: 2439-2445, 2012)。繆勒(Müller)細胞是視網膜的主要膠質細胞。其跨越視網膜從內界膜到感光層的整個厚度，並且這些過程與大多數神經細胞接觸。(Bringmann A & Wiedemann P. Müller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica 227:1-19, 2012)。其亦在內部及外部視網膜血管床的大血管與毛細管上均形成終枝(end feet)。(Distler C and Dreher Z. Glia cells of the monkey retian-II. Müller cells. Vision Res 36:2381-2394, 2012)。繆勒神經膠質對於維持視網膜的正常神經元及血管功能至關重要。過去二十年來的一些研究已提供證據，在糖尿病過程早期繆勒神經膠質細胞受到不利影響。人類及實驗性糖尿病的繆勒神經膠質細胞均獲得反應性表型，係以細胞增生及膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)上調為特徵。(Yong, PH et al. Evidence supporting a role for N’-(d-formyl-3,4-dehydropiperidino) lysine accumulation in Müller glia dysfunction and death in diabetic retinopathy. Molecular Vision 16:2524-2538, 2010)。在糖尿病動物中，這些生物變化伴隨著幾種功能失調的反應，包括在細胞外空間中調節鉀及麩胺酸鹽的能力的改變、γ-胺基丁酸的累積、促炎細胞激素的上調、及血管生成生長因子的增加表現，如血管內皮生長因子(VEGF)。(Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. ArteriosclerThromb Vasc Biol. 29:789-791, 2009)。
然而，仍期望找到一些新方法以治療眼疾。
本發明中意外地發現，一些新化合物是有效的抗氧化劑及眼血流促進劑，其有效防止血眼屏障的破壞，其係由於糖尿病視網膜病變的糖尿病黃斑水腫及生成VGEF及GFAP所引起。意外的發現導致這些化合物作為用於治療眼疾的有效藥物，特別是老年性黃斑病變(age related macular degeneration，AMD)及與糖尿病有關的眼疾，如糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)或青光眼。
據此，在一方面，本發明的特徵在於用於治療眼疾的方法，包含向有其需要的個體投予有效量的具有式A1結構的化合物：式A1 其中 R1 為氫、烷基、烯基、C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或5員或6員雜環，或(CH2 )mR4 X為C、-O-、-N-或-S-； Y為-O-、-NH或-O-C1 -C4 烷基； n為0至10的整數； m為0至5的整數； R2 及R3 獨立地為C1 -C6 烷基； R4 為可被鹵素、-CF3 、-OR7 或-NR7 R8 取代的C5 -C6 環烷基或5員或6員不飽和碳環或雜環，其中R7 及R8 獨立地為氫或C1 -C6 烷基； R5 為OH、NH2 或C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或雜環，其中環烷基、碳環及雜環可任意地被鹵素、NH2 、NO2 、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 烷硫基、OR7” 、NR7 R8 或CF3 取代；以及 R6 為H、可被羥基或C2 -C10 烯基取代的C1 -C10 烷基，或與R1 一起為-C2 H2 -； 或醫藥上可接受的鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥或其溶劑合物。
另一方面，本發明提供具有式1A結構的化合物用於製備治療眼疾，具體而言是治療與糖尿病有關的眼疾的藥物之用途。
又一方面，本發明提供用於治療眼疾之醫藥組合物，具體而言是與糖尿病有關的眼疾，其包含具有式A1結構的化合物及醫藥上可接受的載體。
本發明的一具體實施例中，眼疾為增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、葡萄膜炎(uveitis)、青光眼(glaucoma)或老年性黃斑病變(age related macular degeneration，AMD)。
本發明的一具體實施例中，糖尿病相關眼疾為糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)或糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)。
應理解的是，前面一般性描述及下面詳細描述都是例示性及說明性，而不是對本發明的限制。
除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同含義。
如本文所使用，除非上下文另有明確規定，單數形式「一」及「該」包括複數指示。因此，例如，對「一樣本」的引用包括多個這類樣本及其對本領域技術人員已知的等同物。
根據本發明，提供一種治療眼疾的新方法。美國專利號7,994,357中公開了用於本發明的化合物，其內容藉由引用其整體併入本文。該化合物具有式A1的結構：式A1 其中 R1 為氫、烷基、烯基、C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或5員或6員雜環；(CH2 )mR4 X為C、-O-、-N-或-S-； Y為-O-、-NH或-O-C1 -C4 烷基； n為0至10的整數； m為0至5的整數； R2 及R3 獨立地為C1 -C6 烷基； R4 為可被鹵素、-CF3 、-OR7 或-NR7 R8 取代的C5 -C6 環烷基或5員或6員不飽和碳環或雜環，其中R7 及R8 獨立地為氫或C1 -C6 烷基； R5 為OH、NH2 或C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或雜環，其中環烷基、碳環及雜環可任意地被鹵素、NH2 、NO2 、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 烷硫基、OR7 、NR7 R8 或CF3 取代；以及 R6 為H、可被羥基或C2 -C10 烯基取代的C1 -C10 烷基，或與R1 一起為-C2 H2 -。
本發明的一具體實施例中，化合物為化合物I(亦稱為「BMX」)，其由蛇床子素(osthole)的半合成而獲得，並在學習及記憶方面扮演新角色，報載於Yang YC et al。(Yang YC et al. Evid. Based Complement Alternat. Med. 2013: Article ID. 514908 (18 pages), 2013)：化合物I。
如本文所用的「眼疾」乙詞是指與眼血流減少相關的疾病或病症，包括但不限於增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、葡萄膜炎、青光眼及老年性黃斑病變(AMD)。
如本文所用的「糖尿病相關的眼疾」乙詞是指一種疾病或病症，其係與糖尿病相關、由糖尿病所導致、或起因於糖尿病，包括但不限於糖尿病視網膜病變(DR)及糖尿病黃斑水腫(DME)，其可能與氧化壓力(oxidative stress)及/或缺氧引起的對眼睛損害有關，或更具體地與視網膜色素上皮細胞(RPE)有關。
如本文所用，「有效量」乙詞是指足量的通式A的化合物，以提供所需的治療效果，或誘導特定類型的回應。所需的有效量隨個體的不同而有所不同，取決於個體的疾病狀態、身體狀況、年齡、性別、人種及體重等。然而，本領域一般技術人員僅使用常規實驗即可確定適當的有效量。例如，通式A1的化合物可口服投予個體一天1-3次。對於每次口服投予，通式A1的化合物的量可為0.5至50mg，較佳2至25mg。通式A1的化合物亦可透過眼科投予而給予個體，每天1-10次。例如，一人可每次使用一滴包含通式A1的化合物的製劑，每天3次。對於局部眼科投予來說，可使用0.01-10%通式A1的化合物，較佳可使用0.1-1.0%通式A1的化合物。
本發明的醫藥組合物可藉由傳統已知的方法用一或多種醫藥上可接受的載體來製備。如本文所用的「醫藥上可接受的載體」乙詞涵蓋任何標準醫藥載體。如此載體可包括但不限於：鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、丙二醇、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)、奈米顆粒、脂質體、聚合物及其組合。
本發明的醫藥組合物可構成適合於所選投予模式的任何形式。例如，適用於口服投予的組合物包括固體劑型，如藥丸、膠囊、顆粒、藥片及藥粉，以及液體劑型，如溶液、糖漿、酏劑及懸浮液。可用於局部投予的形式包括乳劑、軟膏、凝膠、懸浮液、滴劑、乳液、皮膚貼劑。
除了標準載體之外，本發明的口服醫藥組合物可補充有一或多種賦形劑，通常用於口服製劑中，如表面活性劑、吸入劑、助溶劑、穩定劑、乳化劑、增稠劑、著色劑、甜味劑、調味劑及防腐劑。此種賦形劑為本領域技術人員所熟知的。
根據本發明，醫藥組合物可透過任何途徑投予至個體，如口服投予、腸胃外注射、眼部注射(例如，玻璃體內注射)、皮膚貼劑或眼部局部投予。用於眼睛局部投予的醫藥組合物可以眼膏、眼凝膠、眼霜或滴眼劑的形式配製。
藉由以下實施例進一步說明本發明，這些實施例是為了說明而不是限制的目的而提供。
實施例
實施例1：氧化的影響
RPE的功能障礙或細胞死亡的機制可涉及各種因素，例如氧化損傷、Bruch氏膜的退化性變化及對脈絡膜血管系統的損傷。不同類型的氧化壓力導致RPE細胞中蛋白質的氧化損傷的不同模式以及不同的存活喪失模式。
視網膜色素上皮(RPE)是位於視網膜感光器及脈絡膜血管之間的單層細胞，其在感光器的機械及代謝支持中起關鍵角色。另外，RPE細胞是一些眼疾的主要成分，如增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、葡萄膜炎及老年性黃斑病變(AMD)。AMD及其他疾病，如糖尿病視網膜病變(DR)，可能與由光或代謝反應所產生的氧自由基的影響有關。由於上皮很容易受到氧張力及氧自由基相關壓力的變化，在缺血相關疾病期間，RPE中所產生的活性含氧物(reactive oxygen species，ROS)可能對RPE細胞有害。AMD的一個重要「早期」事件是由於氧化損傷的RPE細胞損失。已認識到氧化壓力涉及幾種與年齡有關的慢性疾病的病因，如癌症、糖尿病、神經退化性及心血管疾病。
1.1 材料
溴化噻唑藍四唑(MTT，純度 ≥ 97.5%)、杜爾貝科(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)、過氧化氫(H2 O2 ，50重量%水溶液)、第三丁基氫過氧化物(t-BHP，70重量%水溶液)、碘酸鈉(NaIO3 ，純度≥99.5%)、疊氮化鈉(NaN3 ，純度≥99.5%)及杜爾貝科改良式Eagle培養基/ Ham's F12(DMEM / F12，1：1)均購自西格瑪奧瑞奇化學公司(Sigma-Aldrich Chemical Co.)(St.Louis，MO，USA)。人視網膜色素上皮(ARPE-19)細胞、人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)、胎牛血清(FBS)、血管細胞基礎培養基及內皮細胞生長套組係購自ATCC(Manassas，VA，USA)。
1.2 細胞培養
ARPE-19細胞在補充有10%FBS、100單位/ ml青黴素G及100μg/ ml硫酸鏈黴素的DMEM / F12培養基中生長。HUVECs在補充有內皮細胞生長套組的血管細胞基礎培養基中生長。細胞於37℃，在5% CO2 及95%空氣下的潮濕培養箱中培養。
1.3 BMX對ARPE-19細胞及HUVECs存活率的影響
使用MTT分析來測量ARPE-19細胞及HUVECs的存活率。2×105 個ARPE-19細胞或5×104 個HUVECs接種於96孔盤(100μl/孔)中並使其生長整夜。藉由加入100μl不含細胞的培養基來製備負對照組。然後將細胞用具有化合物I(0.03、0.1、0.3、1、3及10μg/ml)及/或氧化劑(NaIO3 、H2 O2 、t-BHP及NaN3 )的新鮮培養基處理12、24或72小時 (200μl/孔)。載體對照組用載體處理。向孔中加入20μl的MTT(5mg/ml)，並再培養4小時。培養後，丟棄培養基並加入100μl的DMSO，以藉由活細胞將由MTT所產生的甲臢(Formazan)溶解。使用微量盤式分析儀(microplate readers) (Bio-Rad Laboratories，Inc.，CA)在570 nm處測量吸光度。根據以下公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(測試樣品的吸光度 – 負對照組的吸光度)/(載體對照組的吸光度 – 負對照組的吸光度)×100%。
1.4 缺氧處理
使細胞附著整夜，然後在缺氧條件下暴露於化合物I或載體72小時。藉由使用以O2 及CO2 控制器(Proox Model 110及Pro CO2 model 120, Biospherix Ltd., Redfield, NY, USA)與N2 及CO2 氣體源的溫度及濕度控制環境C室，而保持缺氧條件(1%O2 、5%CO2 及94%N2 )。
1.5 統計分析
所有資料表示為平均值±S.E.M。統計分析使用學生t檢驗(student's t-test)進行。P ＜0.05的值被認為是統計學顯著的。
1.6 結果
1.6.1 化合物I在ARPE-19細胞及HUVECs中的細胞毒性
結果顯示，BMX不影響ARPE-19細胞及0.03μg/ml至1μg/ml的HUVECs中的細胞生長。然而，化合物I顯著抑制濃度為10μg/ ml的ARPE-19細胞及HUVECs的增生分別為36%及47%(P ＜0.01，圖1A及圖1B)。
1.6.2 化合物I對ARPE-19細胞及HUVECs中缺氧誘導損傷的影響
除了3μg/ml外，化合物I(BMX)使ARPE-19細胞的存活率提高了22%，化合物I對缺氧條件下的ARPE-19細胞從0.03μg/ml到10μg/ml沒有影響 (P ＜0.05，圖2A)。在10μg/ ml的濃度下，化合物I使 HUVECs在缺氧條件下的存活率顯著降低了98%(P ＜0.01，圖2B)。
1.6.3 化合物I對ARPE-19細胞及HUVECs中NaIO3 誘導損傷的影響
在10μg/ml的濃度下，化合物I顯著增強了ARPE-19細胞及HUVECs中NaIO3 誘導損傷的存活率(P ＜0.01，圖3A及圖3B)。然而，化合物I將在0.03μg/ml到1μg/ml的HUVECs中的300μg/ml的NaIO3 誘導損傷逆轉(P ＜0.01，圖3B)。
1.6.4 化合物I對ARPE-19細胞及HUVECs中H2 O2 誘導損傷的影響
在3μg/ml及10μg/ml的濃度下，化合物I在ARPE-19細胞中逆轉400μM及600μM的H2 O2 誘導損傷(P＜0.01，圖4A)。然而，10μg/ml化合物I使HUVECs中200μM及400μM的H2 O2 誘導損傷分別增加41%及10%(圖4B)。
1.6.5 化合物I對ARPE-19細胞及HUVECs中NaN3 誘導損傷的影響
化合物I顯著逆轉ARPE-19細胞中的NaN3 誘導損傷(圖5A)。然而，從0.03μg/ml，化合物I不影響HUVECs中NaN3 誘導損傷。10μg/ml化合物I使HUVECs中0.3、1及3mM的NaN3 誘導損傷分別增加65%、52%及72%(P ＜0.01，圖5B)。
1.6.6 化合物I對ARPE-19細胞及HUVECs中t-BHP誘導損傷的影響
從0.03μg/ml到10μg/ml，化合物I在ARPE-19細胞中逆轉200μM的t-BHP誘導損傷(圖6A)。在1μg/ml及3μg/ml的濃度下，化合物I使HUVECs中200μM t-BHP誘導損傷分別逆轉26%及28%(P＜0.01，圖6A)。然而，10μg/ml化合物I使HUVECs中50、100及200μM的t-BHP誘導損傷分別增加40%、20%及51%(P ＜0.01，圖6B)。
結論是，BMX逆轉由全部氧化劑引起的RPE細胞的氧化損傷，氧化劑包括缺氧、H2 O2 、NaN3 及除了NaIO3 以外的t-BHP，其被BMX增強。反之，高濃度(10μg/ml)的BMX增強全部誘導的氧化損傷，全部包括缺氧、H2 O2 、NaN3 及t-BHP，除了NaIO3 以外，在HUVEC上。較低濃度的BMX對於被全部氧化劑(包括在HUVEC細胞的NaIO3 )所誘導的氧化損傷顯示無效果或輕微逆轉。這些結果表明，BMX是對於除了在RPE細胞上的NaIO3 之外的全部氧化劑的有效抗氧化劑。反之，逆轉由氧化劑引起的損傷效果較差或無效，且甚至在高濃度(10μg/ ml)時對HUVECs增加氧化損傷。
總結來說，BMX對眼部RPE細胞來說，是有效抗氧化劑，但對非眼部特異性HUVEC細胞並不是有效的，表示BMX是用於治療眼睛相關疾病的優良藥劑，該疾病諸如糖尿病視網膜病變及糖尿病黃斑水腫。
實施例2：增強眼血流(OBF)
眼血流的改善在糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、青光眼及缺血性眼疾中是必要的，因為最需要的營養物質及氧氣的供應可因此維持在正常或接近正常濃度。雖然在2-8ml/min/g組織時冠脈血流量相當高，在13ml/min/g組織時脈絡膜的血流量更高。慢性眼內血流減少可能導致視野及視神經頭的惡化，而急性缺血超過45分鐘可能導致不可逆轉的失明。
眼血流與多種眼疾密切相關，包括青光眼、缺血性視網膜病變、糖尿病視網膜病變及老年性黃斑病變(AMD)。因此，正常眼睛血流的維持對於預防/治療上述眼疾是至關重要的。
2.1 材料
0.5%愛爾卡因(Alcaine)係商業上購得。在實驗室中製備20%無菌高滲壓鹽水溶液。彩色微球係購自E-Z Trac(Los Angeles，CA)。以含有0.01%(v / v)吐溫80的鹽水稀釋彩色微球，以防止微球黏在一起。在每個時間點注射0.4ml的2百萬個微球。
重量2-3.0kg的雌性紐西蘭白兔係商業上購得。接著以機構指南進行動物照護及處理。
2.2 方法
用35mg/kg氯胺酮(Ketamine)及5mg/kg 安耐寧(Balanzine) (10%賽拉嗪(xylazine))藉由肌內注射而麻醉兔子。此後每一小時給予一半的初始劑量。通過右側頸動脈插入左心室以注射彩色微球，並插入股動脈以收集血液樣本。用一滴鹽酸普派卡因眼用溶液(Bausch & Lomb, Inc., Tampa, FL, USA)治療左眼。將針頭直接插入到與40mmHg鹽水壓力計連接的左眼前房中。眼高血壓模型將眼血流減少至正常值的約三分之一。在建立眼高血壓模型後，將50μl的10g/l化合物I或載體(30%HP-β-CD溶液)局部徐徐滴注到左眼30分鐘。在用化合物I或載體治療後，在0、30、60及120分鐘藉由彩色微球而測量眼血流。在每個時間點，注射2百萬個微球作為參照，在注射微球後，從股動脈採取血液樣本剛好1分鐘。將血液樣本收集在肝素化管(heparinized tube)中並記錄體積。在最後一次血液採樣後，將兔子注射100mg/kg戊巴比妥鈉以安樂死。將左眼摘除並切成虹膜、睫狀體、視網膜及脈絡膜。所有的組織均秤重。
E-Z Trac(Los Angeles，CA，USA)提供樣本處理及微球計數的細節。簡而言之，將血液溶血試劑與血液樣本加入到微量離心管中，然後渦旋並以6000rpm離心30分鐘。除去上清液，接著加入組織/血液消化試劑I及II。將試管上蓋、渦旋並離心30分鐘。除去上清液，並加入計數試劑、渦旋並離心15分鐘。除去上清液，將微球重新懸浮在精確體積的計數試劑中。在顯微鏡下用血球計(hemocytometer)計算微球的數量。將組織/血液消化試劑I加入到具有組織樣本的微量離心管中，密封，並在95℃下加熱15分鐘。然後將試管渦旋30秒，再加熱，並再渦旋直到所有組織樣本溶解。加入組織/血液消化試劑II，同時組織樣本仍熱，然後將試管上蓋，渦旋，並離心30分鐘。此後的方案與用於處理血液樣本的方案相同，並對微球進行計數。
根據下面的公式計算在某個時間點的每個組織的血流量：Qm =(Cm×Qt)/ Cr。Qm是以μl/min/mg表示的組織的血流量，Cm是組織的微球編號，Qr是以μl/min表示的血液樣本流速，而Cr是參考血液樣本中的微球數量。
2.3 結果
藥物滴注後，在120分鐘時，所有組織中的血流均顯著增加1%化合物I(圖7)。然而，藥物滴注後，在30分鐘及60分鐘時，睫狀體及脈絡膜的血流也顯著增加(圖7)。
眼血流減少導致許多眼疾；特別是在脈絡膜、視網膜及虹膜。它們包括但不限於糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、青光眼、老年性黃斑病變、缺血性視網膜病變及其類似物。因此，眼血流增強對糖尿病視網膜病變及DME有益。本研究顯示BMX有效增強眼血流，表明其可有效使用以治療糖尿病視網膜病變或DME。
實施例3：化合物I對鏈佐黴素誘導的糖尿病黃斑水腫中的血-視網膜屏障破壞的影響
糖尿病黃斑水腫(DME)是已開發國家裡50歲以上人口視力喪失的最常見原因。糖尿病，DME病因，由於無症狀性發炎，在世界各地的發病率和盛行率不斷上升，不僅在已開發國家，而且在未開發國家也成為流行病。這種併發症發生主要是因為糖尿病視網膜病變，糖尿病的血管併發症，經常被診斷及治療晚於其應該的時間點，當損害視力的條件已經發生。糖尿病視網膜病變經由視網膜新生血管及黃斑水腫而破壞視力。DME的病理生理學涉及擴張的毛細管、視網膜微動脈瘤及周細胞的損失，最終損害血-視網膜屏障(BRB)。BRB的分解導致流體洩漏到細胞外空間，這破壞了細胞濃度上的黃斑結構及功能。
白細胞介素-1阻斷化合物在抑制IL-1誘導發炎是有效的，且在抑制眼科傷口癒合也是有效的。鑑於各種發炎介質似乎在促進DME中扮演角色，我們推測具有抗炎特性的化合物I可能發揮阻斷糖尿病誘導DME的能力。
3.1 材料及方法
禁食16小時後，秤重200-220g的史-道二氏(Sprague-Dawley)雌性大鼠，在10mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.5；Sigma-Aldrich, St. Louis, MD)中接受單次60mg/kg腹膜內注射鏈佐黴素(STZ；Sigma-Aldrich, St.Louis, MD)。對照組大鼠被禁食，並單獨接受緩衝液。在接受STZ後7天血糖濃度高於375mg/dL的大鼠被認為是糖尿病。每週檢測體重及血糖。所有的實驗均按照「實驗動物的照護及處理指南」(NIH出版物第85-23號)所指定的規則進行。對於治療，大鼠被滴注0.5%及1%化合物I滴眼劑。在糖尿病產生後，所有大鼠的雙眼均滴注1滴眼藥水，每天3次，持續6週。葡萄糖濃度測定後，大鼠用0.5%及1%化合物I或載體溶液滴眼劑一天3次以治療4週。動物照護及處理係遵循該機構指南。
在引導全身麻醉後，分別用0.28及0.58mm內徑的聚乙烯管插管右頸靜脈及右髂動脈，聚乙烯管填充有肝素化鹽水(50IU肝素/ml鹽水)。伊凡氏藍(Sigma-Aldrich, St.Louis, MD)以45mg/kg的劑量經由頸靜脈注射10秒。在伊凡氏藍注射之後，大鼠立即變成可見的藍色，確認其攝入及染劑分佈。隨後，以15分鐘的間隔，從髂動脈抽取0.1ml血液2小時，以獲得時間平均的伊凡氏藍血漿濃度。染劑已循環120分鐘後，打開胸腔，在37℃用0.05M的pH3.5檸檬酸鹽緩衝的聚甲醛(paraformaldehyde) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MD)經由左心室灌注大鼠2分鐘。使用pH 3.5以優化伊凡氏藍與白蛋白的連結，並將灌注溶液升溫至37℃以防止血管收縮。
在灌注之後，立即將雙眼摘除並在赤道處解剖。在手術顯微鏡下仔細分離視網膜，並在真空設備中徹底乾燥5小時。使用乾重來將伊凡氏藍滲漏的定量規則化。伊凡氏藍藉由將每個視網膜在150mL甲醯胺(Sigma-Aldrich, St. Louis, MD)中於70℃培養18小時而萃取。將上清液通過具有6000rpm的過濾器的離心管離心1小時，並將100μl濾液用於三重分光光度測量(SmartSpec, Bio-Rad)。每個測量發生在5秒鐘的間隔內，且所有測量組均以已知的標準進行。減去背景的吸光度係藉由在620nm及在740nm兩處測量每個樣本來確定，其中620nm是伊凡氏藍在甲醯胺中的吸光度最大值，而740nm則是吸光度最小值。
從伊凡氏藍在甲醯胺中的標準曲線計算萃取物中染劑的濃度。使用以下等式計算BRB分解，結果以BRB分解抑制(%)表示：[(載體對照組中的濃度) - (非糖尿病組或化合物I處理組中的濃度)] /(載體對照組中的濃度)×100%。
3.2 結果
非糖尿病大鼠的體重在3週期間內穩定增加，而糖尿病大鼠的體重無論藥物治療與否都逐漸下降(圖8)。至於血糖濃度，無論藥物治療與否，糖尿病大鼠穩定增加(圖9)。而非糖尿病者的血糖保持在100mg%的低濃度。
正常非糖尿病組及0.5%化合物I及1%化合物I治療組中伊凡氏藍滲漏的百分比分別為54%、68%及56%，與糖尿病載體對照組(100%)相比(圖10及圖11)。糖尿病載體對照組與所有其他組之間有顯著差異(圖10及圖11)。然而，非糖尿病對照組與1%化合物I治療組之間沒有差異(圖10及圖11)。
這些結果表示DME的伊凡氏藍滲漏可完全被1%化合物I及部分0.5%化合物I阻斷，顯示良好的劑量對應關係(圖10及圖11)。
BRB分解引起血管滲透性或血管滲漏，這是糖尿病的早期併發症及DME的主要原因。BRB有兩個組分：外屏障及內屏障。外屏障藉由視網膜色素上皮(RPE)細胞之間的緊密連接而形成，並包括閉合帶及橋粒(desmosome)。內屏障藉由視網膜血管內皮細胞與分化良好網路的神經膠質細胞(星形膠質細胞及繆勒細胞)之間的緊密連接錯合物而形成。一些臨床研究表明內屏障是導致DME的血管滲漏的主要位置。BRB分解的機制是多因性的，且次要於緊密連接的變化、外被細胞及內皮細胞損失、視網膜血管擴張及白血球停滯(leukostasis)以及玻璃體-視網膜繃緊與牽引。視網膜血管緊密連接保護血管免於滲漏，但是持續的高血糖可能損害緊密連接，血管可能變成易滲漏，使液體或血液滲入視網膜，從而導致視網膜腫脹。在糖尿病誘導後6周，藉由伊凡氏藍滲漏法分析BRB完整性。糖尿病動物的伊凡氏藍滲漏比非糖尿病動物高得多，表明糖尿病組與非糖尿病組之間的顯著差異(圖10及圖11)。在本實驗室之前進行的實驗中，蛇床子素(Osthole)顯示降低實驗誘導眼部發炎中的血管通透性及抑制大鼠眼睛中的IL-1誘導葡萄膜炎的功效。我們的研究表示，BMX顯著降低STZ誘導糖尿病動物模型中的血管通透性。此外，1%BMX將糖尿病BRB分解完全恢復至非糖尿病濃度(圖11)。
實施例4：化合物I對鏈佐黴素誘導糖尿病視網膜病變的影響
神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是已確立的視網膜壓力指標。在正常的哺乳動物視網膜中，GFAP在繆勒細胞中可以些微檢測到。在壓力下，活化的繆勒細胞表現高水平的GFAP。在本研究中，在繆勒細胞中說明增加的GFAP表現，表示繆勒細胞功能障礙係涉及STZ誘導糖尿病視網膜病變，這與以前的研究一致。繆勒細胞功能障礙導致麩胺酸鹽輸送異常，對神經元細胞有毒性。神經元功能障礙或糖尿病視網膜細胞損失可能部分是由於繆勒細胞功能障礙。
由糖尿病視網膜病變的視力喪失及失明通常是血管滲漏或缺血的結果。血管滲漏涉及出血或形成硬性滲出物。由血管損傷的缺血及局部灌注中斷導致血管生成及新血管形成。形成的新血管易碎，容易出血，其可損害視力，最終導致失明。VEGF是血管形成及功能的主要調節。其控制內皮細胞中的幾個過程，如增生、存活及遷移。視網膜VEGF表現與動物及人類中的糖尿病血液-視網膜屏障分解及缺血相關的新血管形成相關。在本研究中，繆勒細胞中的VEGF表現在糖尿病視網膜中顯著上調，表示VEGF的過度表現在STZ誘導糖尿病中的視網膜血管異常中起關鍵角色。在這項研究中，我們試圖調查由糖尿病引起的GFAP及VEGF上調是否可以被化合物I抑制。
4.1 方法
4.1.1 動物
禁食16小時後，秤重200-220g的史-道二氏(Sprague-Dawley)雌性大鼠，在10mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.5；Sigma-Aldrich, St. Louis, MD)中接受單次60mg/kg腹膜內注射鏈佐黴素(STZ；Sigma-Aldrich，St.Louis，MD)。對照組大鼠被禁食，並單獨接受緩衝液。在接受STZ後7天血糖濃度高於375mg/dL的大鼠被認為是糖尿病。糖尿病大鼠用1%化合物I、0.5%化合物I或載體滴眼劑一天3次以治療6週。
4.1.2 西方墨點轉漬分析
如上一節所述犧牲大鼠後，將眼睛摘除並切成兩半。將視網膜從眼罩上剝離，並立即用0.3ml冰冷的裂解緩衝液(STZ；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)均質化，該緩衝液包括1μl蛋白酶抑制劑混合物(STZ；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。藉由以12,000g離心20分鐘除去不溶物質。根據製造商的說明，使用蛋白質測定套組(BCA, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)確定最終的蛋白質濃度。均質物(80μg)用NuPAGE Bis-Tris Mini凝膠(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)分離，並藉由iBlot凝膠轉移裝置(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)轉移到硝化纖維膜。根據WesternBreeze®Chromogenic Kit-抗兔(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)的說明，硝化纖維膜藉由BenchPro 4100卡片加工站(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)處理。使用的初級抗體分別是抗GFAP(1:200，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(1：100)。使用抗兔IgG、AP連接的抗體作為第二抗體。為了定量評估西方墨點轉漬研究，掃描硝化纖維膜並用分析軟體(Pro-gel Analyzer software, Media Cybernetics, Rockville, MD)定量光密度。
4.1.3 定量即時PCR
如前所述犧牲大鼠後，將眼睛摘除並切成兩半，將視網膜從眼罩上剝離，並立即在RNA分離劑(RNeasy®Plus Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA)均質化。藉由使用根據製造商的方案(高容量逆轉錄套組，AB life technologies, Austin, TX)的商業套組從mRNA製備第一股cDNA。表1中列出了引子的序列。在即時檢測系統(iCycler, Bio-Rad)中，使用螢光檢測染料(SYBR® Green PCR Master Mix, AB life technologies, Austin, TX)的標準方案，在96孔盤中進行即時PCR。所有PCR反應都是由螢光染料/PCR混合物、最終濃度為0.2μM的正向及反向引子以及1ng的cDNA所組成的20μl最終體積。PCR循環參數如下：在90℃聚合酶活化15分鐘，95℃15秒、60℃30秒及72℃ 1分鐘進行40次循環。藉由在相同樣本中正規化β肌動蛋白持家基因的CT來計算mRNA的量，根據以下公式：從平均目標基因CT中減去平均β肌動蛋白CT(每個多重PCR進行三次)；結果代表ΔCT。此ΔCT是特定的，且可與校準樣本的ΔCT進行比較。從目標基因的ΔCT減去對照ΔCT被稱為ΔΔCT。目標基因表現的相對定量(與對照組相比)藉由使用2-∆∆CT 來確定。
用作引子的寡核苷酸的的序列表。
4.1.4 統計分析
所有資料均以平均值±SD表示。兩組正常分佈的資料用學生t檢驗分析。對於兩兩比較，兩組之間使用配對t檢驗。P ＜0.05的值被認為有統計學意義。
4.2 結果
4.2.1 西方墨點轉漬分析
將STZ腹腔注射7週後，糖尿病對照組的視網膜中GFAP的蛋白表現與非糖尿病組相比顯著增加(P ＜0.05)。在糖尿病大鼠灌注1%化合物I及0.5%化合物I持續6周後，與糖尿病對照組相比，GFAP蛋白在視網膜中的表現被顯著抑制(P ＜0.05，圖12及圖13)。
這些結果清楚地表示糖尿病視網膜病變可藉由化合物I以劑量依存的方式而治療(圖12及圖13)。
與對照的正常眼相比，VEGF是糖尿病視網膜病變中顯著增加的另一種生物標誌體，如可見糖尿病眼內VEGF顯著增加(圖14及圖15)。0.5%化合物I及1%化合物I顯著抑制糖尿病眼中的VEGF濃度(圖14及圖15)，表示糖尿病視網膜病變可以劑量依存的方式有效地治療(圖14及圖15)。
4.2.2 定量即時PCR
藉由定量即時PCR偵測GFAP的基因表現。結果表示非糖尿病視網膜表現低濃度的GFAP(圖16)。糖尿病發病六週後，GFAP的基因表現顯著上調。與糖尿病對照組相比，藉由用0.5%及1%化合物I治療，GFAP表現顯著下調(圖16)。
這些結果與前面章節中呈現的西方墨點轉漬所獲得的結果相似(圖12及圖13)。顯著上調的GFAP表現會被0.5%化合物I及1%化合物I以劑量依存方式顯著抑制，並且更接近對照組濃度(圖16)。
這些結果清楚地表示化合物I可以用於治療糖尿病視網膜病變。
實施例5：化合物I(BMX)在CNV小鼠模型中的體內功效
5.1 材料及方法
5.1.1 動物
在台北醫學大學(TMU)動物中心內飼養雄性C57BL/6J小鼠(BioLASCO Taiwan Co.)，並根據ARVO聲明進行CNV研究，實驗方案由TMU機構動物照護及使用委員會(LAC-2017-0130)批准。為了產生CNV，藉由注射安耐寧(Balanzine)(10%賽拉嗪(xylazine))(10mg/kg)及氯胺酮(Ketamine)(80mg/kg)麻醉小鼠。Bruch氏膜脈絡膜破裂係藉由雷射光凝(Micron III system, Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA)使用CNV雷射燒四點(持續時間0.1秒，250mW)，距離視盤大約兩個盤間直徑而達成。將小鼠隨機分為三組：(1)只接受載體治療的小鼠；(2)接受CVN雷射燒並僅用載體治療的小鼠；(3)接受CNV雷射燒並以25mg /kg/d的BMX經口服投予而全身性傳遞7或28天治療的小鼠。在第-7天、第7天及第28天，在麻醉下在對小鼠腹膜內注射螢光素鈉之後，立即進行基底攝影(FP)及基底螢光素血管攝影(FFA)，以獲得視網膜血管造影資料，如下所述。
5.1.2 基底攝影(FP)及基底螢光素血管攝影(FFA)
使用Micron III視網膜成像顯微鏡(Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA)，以監測C57BL/6小鼠基底的形態及病理變化。簡言之，藉由IP注射氯胺酮(80mg/kg)及甲苯噻嗪(xylazine)(10mg/kg)將小鼠麻醉，並用0.125%阿托品使眼睛擴張。將每隻老鼠放在顯微鏡平台的一邊上，右眼用2%美多秀(Methocel)凝膠(OmniVision, SA, Neuhausen, Switzerland)沖洗。在進行彩色FP之後，透過IP注射使用螢光素(10%；0.05mL)進行FFA檢查。然後使用SteamPix 5TM 軟體收集串列圖像。
5.1.3 光同調斷層掃瞄(OCT)成像及厚度分析
使用Micron III(Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA)視網膜成像顯微鏡的OCT模組，以從視網膜層獲得圖像。藉由將沿同一垂直軸的5個單獨b掃描加以平均及空間對齊，而獲得高解析度的視網膜橫截面(右眼)的b掃描。使用InSight XL(Phoenix Research Laboratories, San Ramon, CA, SA)將視網膜層進行分割以用於進一步分析。在本研究中包含的C57BL/6小鼠中定義及測量三個視網膜層：包含視網膜神經纖維層(RNFL)、神經節細胞層(GCL)及內叢狀層(IPL)的內層；包括內核層(INL)、外叢狀層(OPL)、外核層(ONL)及外界膜(OLM)的中間層；及包含感光器的內部及外部片段(IS/OS)及視網膜色素上皮的外層。
5.2 結果
結果顯示在圖17A至圖18B。BMX組的洩漏面積顯著減少(圖17A及圖18A)。此外，根據FP及FFA圖像，在BMX組(圖17B(第7天)及圖18B(第28天))中，由雷射損傷導致的組織增生得到改善。
本領域技術人員將會理解，可對上述具體實施例進行改變而不背離其廣泛的發明構思。因此，應理解，本發明不限於所公開的特定具體實施例，而是旨在覆蓋由所附申請專利範圍所限定的本發明的精神及範圍內的修改。
圖 1A 顯示化合物I(以下稱為「BMX」)對ARPE-19細胞增生的影響。以BMX培養ARPE-19細胞72小時。
圖 1B 顯示BMX對HUVECs增生的影響。以BMX培養HUVECs 72小時。資料表示為平均值±SEM，每組n = 6。**, P ＜ 0.01 BMX組對比載體對照組。
圖 2A 顯示BMX對ARPE-19細胞中缺氧誘導損傷的影響。以BMX培養ARPE-19細胞72小時。
圖 2B 顯示BMX對HUVECs中缺氧誘導損傷的影響。以BMX培養HUVECs 72小時。對照組在缺氧條件下(1%O2 ，5%CO2 及94%N2 )以載體處理72小時。資料表示為平均值±SEM。每組n = 6；*, P ＜0.05及**, P ＜0.01對比對照組。
圖 3A 顯示BMX對ARPE-19細胞中NaIO3 誘導損傷的影響。以BMX及NaIO3 培養ARPE-19細胞72小時。
圖 3B 顯示BMX對HUVECs中NaIO3 誘導損傷的影響。以BMX及NaIO3 培養HUVECs 72小時。資料表示為平均值±SEM。每組n = 6；*, P ＜0.05及**, P ＜0.01對比NaIO3 組。
圖 4A 顯示BMX對ARPE-19細胞中H2 O2 誘導損傷的影響。以BMX及H2 O2 培養ARPE-19細胞24小時。
圖 4B 顯示BMX對HUVECs中H2 O2 誘導損傷的影響。以BMX及H2 O2 培養HUVECs 24小時。資料表示為平均值±SEM。每組n = 6；*, P ＜0.05及**, P ＜0.01對比H2 O2 組。
圖 5A 顯示BMX對ARPE-19細胞中NaN3 誘導損傷的影響。以BMX及NaN3 培養ARPE-19細胞72小時。
圖 5B 顯示BMX對HUVECs中NaN3 誘導損傷的影響。以BMX及NaN3 培養HUVECs 72小時。資料表示為平均值±SEM。每組n = 6；*, P ＜0.05及**, P ＜0.01對比NaN3 組。
圖 6A 顯示BMX對ARPE-19細胞中t-BHP誘導損傷的影響。以BMX及t-BHP培養ARPE-19細胞12小時。
圖 6B 顯示BMX對HUVECs中t-BHP誘導損傷的影響。以BMX及t-BHP培養HUVECs 12小時。資料表示為平均值±SEM。每組n = 6；*, P ＜0.05及**, P ＜0.01對比t-BHP組。
圖 7 顯示1%BMX對患有實驗性眼高血壓的兔之眼血流的影響。資料表示為平均值±SEM。每組n = 6；*, P ＜0.05及**, P ＜0.05對比對照組。
圖 8 顯示與正常動物相比鏈佐黴素(streptozotocin)注射後體重的變化。資料表示為平均值±SEM及**, P ＜0.01與對照組比較。
圖 9 顯示與正常動物相比鏈佐黴素注射後血糖水平的變化。資料表示為平均值±SEM及**, P ＜0.01與對照組比較。
圖 10 顯示0.5%BMX對鏈佐黴素誘導糖尿病水腫的影響。0.5%BMX顯著抑制糖尿病動物的伊凡氏藍滲漏(Evans blue leakage) (100%)至68%(P ＜0.01)，較接近於正常動物的54%濃度。資料表示為平均值±SD，在0.5%BMX組n = 18，而糖尿病組n = 26，與正常組相比*, P ＜0.01，與糖尿病視網膜病變組相比**, P ＜0.01且##, P ＜ 0.01與正常組比較。
圖 11 顯示1.0%BMX對鏈佐黴素誘導糖尿病黃斑水腫的影響。BMX在劑量-反應關係中顯著抑制糖尿病動物的伊凡氏藍滲漏。1% BMX將伊凡氏藍滲漏(56%)完全抑制到正常動物濃度(56%)。資料表示為平均值±SD，在1%BMX組n = 16，而糖尿病組n = 26。與正常組相比*, P ＜0.01，**, P ＜0.01與糖尿病動物相比，且##, P＞ 0.05與正常對照動物相比。
圖 12 顯示0.5%BMX對用西方墨點轉漬法實驗的鏈佐黴素誘導糖尿病視網膜病變(DR)中GFAP濃度的影響，表示以0.5%BMX的糖尿病視網膜病變中的GFAP上調係為劑量相關模式。糖尿病視網膜病變動物中GFAP的上調(100%)被0.5% BMX顯著抑制至70%濃度，並較接近糖尿病視網膜病變動物53%的正常動物的GFAP濃度。資料表示為平均值±SD，在所有組n = 6。*, p ＜0.01與正常組相比，**, P ＜0.01與糖尿病視網膜病變組相比，且##, P ＜0.01與正常組相比。
圖 13 顯示1.0%BMX對用西方墨點轉漬法實驗的鏈佐黴素誘導糖尿病性視網膜病變(DR)中GFAP濃度的影響，表示1.0%BMX的糖尿病視網膜病變中的GFAP上調係為劑量相關模式。糖尿病視網膜病變大鼠中GFAP的上調(100%)被1.0% BMX顯著抑制至46%濃度，且與正常大鼠的41%非常接近。資料表示為平均值±SD，在所有組n = 5。*, p ＜0.01與正常組相比，**, P ＜0.01與糖尿病組相比，且##, P＞ 0.05與正常組動物相比。
圖 14 顯示0.5%BMX對用西方墨點轉漬法實驗的鏈佐黴素誘導糖尿病視網膜病變(DR)中VEGF濃度的影響，表示0.5%BMX的糖尿病視網膜病變中的VEGF上調係為劑量相關模式。糖尿病視網膜病變動物中VEGF的上調(100%)被0.5% BMX顯著抑制至77%濃度，並在50%糖尿病視網膜病變動物中更接近正常動物中的VEGF濃度。資料表示為平均值±SD，在所有組n = 6。*, p ＜0.01與正常組相比，**, P ＜0.01與糖尿病視網膜病變組相比，且##, P ＜0.01與正常組相比。
圖 15 顯示1.0%BMX對用西方墨點轉漬法實驗的鏈佐黴素誘導糖尿病視網膜病變(DR)中VEGF濃度的影響，表示1.0%BMX的糖尿病視網膜病變中的VEGF上調係為劑量相關模式。糖尿病視網膜病變大鼠中VEGF的上調(100%)被1.0% BMX顯著抑制至50%濃度，且與正常大鼠的34%非常接近。資料表示為平均值±SD，在所有組n = 3。*, p ＜0.01與正常組相比，**, P ＜0.01與糖尿病組相比，且##, P ＜0.05與正常組相比。
圖 16 顯示BMX對用PCR分析的鏈佐黴素誘導糖尿病視網膜病變(DR)中GFAP基因表現的影響。糖尿病視網膜病變動物中GFAP的mRNA表現顯著增加至正常對照濃度的3.0倍(作為100%)，其中0.5%BMX及1%BMX分別將其抑制至60%及51%。正常動物的GFAP是糖尿病視網膜病變大鼠的34%。這些結果表示，BMX可以劑量反應的方式顯著抑制糖尿病視網膜病變中GFAP的mRNA表現。資料表示為平均值±SD，正常組n = 9，糖尿病組n = 9，0.5%BMX組n = 7，1%BMX組n = 5。*, p ＜0.01與正常組相比，#, P ＜0.05及##, P ＜0.01與糖尿病視網膜病變動物相比，且**, P ＜0.01及*#, p ＜0.05與正常動物相比。
圖 17A 顯示載體組及BMX組之間洩漏面積的比較。
圖 17B 顯示第7天的鼠視網膜的光同調斷層掃瞄(OCT)圖像。箭頭：雷射損傷區域。
圖 18A 顯示第28天小鼠的基底攝影(fundus photography，FP)及基底螢光素血管攝影(fundus fluorescein angiography，FFA)圖像。
圖 18B 顯示第28天鼠視網膜的OCT圖像。箭頭：雷射損傷區域。

Claims (18)

  1. 一種用於治療眼疾的方法，包含向有需要的個體投予有效量的具有式A1結構的化合物：其中 R1 為氫、烷基、烯基、C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或5員或6員雜環；(CH2 )m R4 X為C、-O-、-N-或-S-； Y為-O-、- NH或-O-C1 -C4 烷基； n為0至10的整數； m為0至5的整數； R2 及R3 獨立地為C1 -C6 烷基； R4 為可被鹵素、-CF3 、-OR7 或-NR7 R8 取代的C5 -C6 環烷基或5員或6員不飽和碳環或雜環，其中R7 及R8 獨立地為氫或C1 -C6 烷基； R5 為OH、NH2 或C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或雜環，其中環烷基、碳環及雜環可任意地被鹵素、NH2 、NO2 、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 烷硫基、OR7 ”、NR7 R8 或CF3 取代；以及 R6 為H、可被羥基或C2 -C10 烯基取代的C1 -C10 烷基，或與R1 一起為-C2 H2 -， 或醫藥上可接受的鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥或其溶劑合物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該眼疾係選自由增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、葡萄膜炎(uveitis)、青光眼(glaucoma)及老年性黃斑病變(age related macular degeneration，AMD)所組成的群組。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該眼疾為糖尿病相關的眼疾。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該糖尿病相關的眼疾係選自由糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)及糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)所組成的群組。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該化合物係局部地投予至該個體的眼睛，或口服地投予至該個體。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該化合物係配製成眼膏、眼凝膠、眼霜或滴眼劑。
  7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該化合物係局部地投予。
  8. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該化合物係口服地投予。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該化合物為：化合物I。
  10. 一種具有如下所示式A1結構的化合物用於製備治療個體眼疾的藥物之用途：其中 R1 為氫、烷基、烯基、C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或5員或6員雜環；(CH2 )m R4 X為C、-O-、-N-或-S-； Y為-O-、- NH或-O-C1 -C4 烷基； n為0至10的整數； m為0至5的整數； R2 及R3 獨立地為C1 -C6 烷基； R4 為可被鹵素、-CF3 、-OR7 或-NR7 R8 取代的C5 -C6 環烷基或5員或6員不飽和碳環或雜環，其中R7 及R8 獨立地為氫或C1 -C6 烷基； R5 為OH、NH2 或C5 -C6 環烷基、5員或6員不飽和碳環或雜環，其中環烷基、碳環及雜環可任意地被鹵素、NH2 、NO2 、C1 -C6 烷氧基、C1 -C6 烷硫基、OR7 ”、NR7 R8 或CF3 取代；以及 R6 為H、可被羥基或C2 -C10 烯基取代的C1 -C10 烷基，或與R1 一起為-C2 H2 -。
  11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該眼疾係選自由增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、葡萄膜炎、青光眼及老年性黃斑病變(AMD)所組成的群組。
  12. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該眼疾為糖尿病相關的眼疾。
  13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該糖尿病相關的眼疾係選自由糖尿病視網膜病變(DR)及糖尿病黃斑水腫(DME)所組成的群組。
  14. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該藥物係局部地投予至該個體的眼睛，或口服地投予至該個體。
  15. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該藥物為眼膏、眼凝膠、眼霜或滴眼劑的形式。
  16. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該藥物係局部地投予。
  17. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該藥物係口服地投予。
  18. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該化合物為：化合物I。
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