TW201822770A

TW201822770A - 含有喹啉環的ｃ－Ｍｅｔ特異性藥物的製藥用途及其製備方法

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Publication number: TW201822770A
Application number: TW105143122A
Authority: TW
Inventors: 楊寶海; 朱強; 潘必高
Original assignee: 江蘇豪森藥業集團有限公司
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2018-07-01

Abstract

本發明涉及含有喹啉環的c-Met特異性藥物的製藥用途及其製備方法。具體涉及式(I)化合物在製備用於治療由c-Met基因擴增引起的癌症的藥物中的用途。式(I)化合物對因c-Met基因擴增引起的癌症具有很強的抑制作用和選擇性。

Description

含有喹啉環的c-Met特異性藥物的製藥用途及其製備方法

本發明涉及醫藥生物領域，具體涉及9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮甲磺酸鹽作為c-Met酪氨酸激酶抑制劑的應用。

肝細胞生長因數(HGF)受體，也叫作c-Met，是一種酪氨酸激酶受體。它是單鏈蛋白前體通過而形成α和β亞基，這兩個亞基通過二硫鍵連接起來而形成的成熟的受體。

c-Met作為一種膜受體，它是胚胎發育和傷口癒合必不可少的。肝細胞生長因數(HGF)是唯一已知的c-Met受體的配體。c-Met通常是在上皮細胞中表達的，而HGF的表達則局限於間葉細胞中。經由HGF激發後，c-Met可以誘發產生一些生物反應，這些生物反應協同起作用從而導致細胞存活和增殖，細胞遷移與入侵其他組織，並且阻斷細胞凋亡。

c-Met同時是一種重要的致癌基因，參與多種腫瘤的癌變過程。c-Met的配體是HGF(Hepatocyte Growth Factor，肝細胞生長因數)，和其他大多數賴氨酸受體激酶一樣，在正常細胞中如果沒有HGF結合，c-Met沒有活性；當HGF結合c-Met後，c-Met形成雙聚體並發生三維結構變化，導致c-Met的賴氨酸激酶被啟動，在賴氨酸的位置發生磷酸化。被啟動的c-Met可以進一步啟動細胞內的信號傳導通路，例如RAS-RAF-MAPK(ERK)信號通路，PI3K-AKT信號通路，FAK/RHO/PAK信號通路，從而導致細胞存活和增殖，細胞遷移與入侵其他組織，並且阻斷細胞凋亡。

c-Met異常發現於多種類型的腫瘤，例如肝癌HCC，非小細胞肺癌NSCLC，胃癌，結腸癌，等等。c-Met異常可表現為表達量升高，基因擴增，基因突變，或者HGF表達量升高。在這些異常情況下，c-Met可處於一種被啟動的異常狀態，從而導致癌變和不良預後。由於c-Met的這些特性，c-Met是多種癌症治療的重要靶點。製藥業目前針對c-Met為靶點的藥物可分為這樣三類：c-Met特異性藥物，多靶點(包括c-Met)選擇性藥物，抗體藥物。

抑制c-Met信號通路是治療腫瘤的重要策略之一。目前已經發現了許多能夠有效阻斷HGF/c-Met信號傳導途徑的小分子化合物，如SGX Pharmaceuticals Inc的SGX-523、Johnson&Johnson的JNJ-38877605、Amgen的AMG-458、Eisai的E-7050和Pfizer的PF-04217903，但迄今還沒有此類小分子化合物的c-Met酪氨酸激酶抑制劑上市。

9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮甲磺酸鹽屬於c-Met特異性藥物。這些藥物的作用機理主要是抑制c-Met的活性，從而殺死癌細胞。

本發明的目的在於提供9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮甲磺酸鹽在製備用於治療由c-Met基因擴增引起的癌症的藥物中的用途。

9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮甲磺酸鹽，其結構式如式(I)，是一種含有喹啉環的c-Met特異性藥物，通過抑制c-Met信號通路治療腫瘤。

本發明的式(I)化合物穩定性好，且表現出了優異的生物活性，具有良好的治療癌症的作用，尤其對因c-Met基因擴增引起的癌症具有很強的抑制作用和選擇性。

式(I)化合物在治療因c-Met基因擴增引起癌症方面表現出突出的療效和較少的副作用，其中所述的癌症選自：膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌細胞)、食管癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、皮膚癌或鱗狀細胞癌；膽管癌、間充質細胞來源的腫瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤；中樞和外周神經系統的腫瘤，星細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、腦膠質瘤、神經鞘瘤；黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、著色性幹皮病、角化棘皮瘤、甲狀腺濾泡癌和卡波西肉瘤、滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤、MFH/纖維肉瘤、平滑肌肉瘤、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、成膠質細胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、腎母細胞瘤；淋巴系的造血系統腫瘤，白血病、急性淋巴細胞白血病、急性成淋巴細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤或伯基特氏淋巴瘤；骨髓細胞系的造血系統腫瘤，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生異常綜合征或早幼粒細胞性白血病。

優選地，所述的癌症選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌細胞、食管癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、皮膚癌、白血病、多發性骨髓瘤或淋巴瘤。

更優選地，所述的癌症選自肝癌、肺癌或胃癌。

最優選地，所述的肝癌為肝癌細胞系HCCLM3、MHCC97-H或MHCC97-L引起的增殖；所述的胃癌為胃癌細胞系MKN-45或SNU-5引起的增殖；所述的肺癌為肺癌細胞系NCI-H1993引起的增殖。

本發明的另一目的在於提供所述式(I)化合物的製備方法，包括如下步驟：將9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮溶於偶極非質子溶劑中，加入甲磺酸，過濾，濾液攪拌析晶。

優選地，所述偶極非質子溶劑選自丙酮、乙腈、N,N-二甲基甲醯胺或二甲亞碸；更優選N,N-二甲基甲醯胺。

優選地，9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮與甲磺酸的摩爾比為1：1至10，更優選1：3至5，最優選1：4。

優選地，9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮與偶極非質子溶劑的品質體積(g/ml)比為1：5至15，更優選1：8至10，最優選1：10。

優選地，所述攪拌溫度為0℃至50℃，更優選20℃至30℃，最優選20至25℃。

優選地，所述攪拌時間為1至24h，更優選7至10h。

作為本發明的一個優選實施方案，所述式(I)化合物的製備方法，包括如下步驟：將9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮和N,N-二甲基甲醯胺加入到反應容器中，滴加4倍當量的甲磺酸，控溫20℃至25℃，攪拌；過濾，濾液20℃至25℃下攪拌反應；過濾，濾餅用N,N-二甲基甲醯胺洗滌；真空乾燥，得式(I)化合物。

第1圖：式(I)化合物(3mg/kg)對HCCLM3移植瘤中c-Met及下游信號因數AKT、ERK1/2磷酸化的作用，以及不同時間點藥物在血漿和腫瘤的濃度。

第2圖：式(I)化合物(30mg/kg)對HCCLM3移植瘤中c-Met及下游信號因數AKT、ERK1/2磷酸化的作用，以及不同時間點藥物在血漿和腫瘤的濃度。

第3圖：式(I)化合物(30mg/kg)口服給藥後在HCCLM3腫瘤中的藥物濃度-時間曲線。

為了進一步闡明本發明，下面給出一系列實施例，這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明具體描述，不應當理解為對本發明的限制。

實施例1 式(I)化合物的製備

將9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮(450g)和N,N-二甲基甲醯胺(4.5L)加入到三口瓶中，滴加甲磺酸(373g，4當量)，控溫20℃至25℃，攪拌50至60分鐘；過濾，濾液20℃至25℃下攪拌反應7至8小時；過濾，濾餅用N,N-二甲基甲醯胺(300mL)洗滌；濾餅100至105℃真空乾燥15至16小時，得9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮甲磺酸鹽(464g)，收率85.3%，純度99.9%。。

實驗例2 式(I)化合物對c-Met酶學活性的特異性抑制作用 1、試驗材料

激酶：由睿智化學提供。

2、試驗方法

採用Mobility shift assay來檢測式(I)化合物對60種蛋白激酶的抑制活性IC₅₀。Staurosporine用作檢測的參照化合物。在384孔板加入化合物、激酶、FAM標記的多肽底物，在28℃進行特定時間的反應後加入反應停止劑終止反應，然後獲取讀值計算抑制率(Percent inhibition=(max-conversion)/(max-min)*100.“max”stands for DMSO control；“min”stands for low control.)。根據不同濃度的抑制率獲得IC₅₀值。

3、試驗結果

式(I)化合物對c-Met激酶活性抑制的IC₅₀為0.7nM，對其他59種激酶的活性抑制IC₅₀均大於2800nM，且多數大於30000nM。表明式(I)化合物對c-Met激酶的活性抑制具有很強的選擇性和特異性。

實驗例3 式(I)化合物體外抗腫瘤活性 1、試驗方法

BALB/c裸小鼠皮下接種人肝癌HCCLM3細胞(來源為複祥生物)，待腫瘤生長至100-200mm³後，將動物隨機分組並單次灌胃給藥，然後在給藥後不同時間點采血，然後處死小鼠取腫瘤組織。

取血及瘤組織時間分別為給藥後0.25h、1h、2h、4h、6h、24h。將血液離心分離血漿，檢測血漿和腫瘤組織中的藥物含量。同時應用Western blot法檢測腫瘤組織中c-Met 及其介導的下游信號ERK及AKT磷酸化水準。

2、試驗結果

人肝癌細胞系HCCLM3高表達c-Met，對式(I)化合物非常敏感。在HCCLM3裸小鼠皮下移植瘤模型中，式(I)化合物3mg/kg單次灌胃給藥1小時便能顯著抑制腫瘤組織中c-Met的磷酸化以及下游信號因子AKT、ERK1/2的磷酸化(第1圖)，而在30mg/kg單次灌胃給藥15分鐘就可抑制c-Met信號通路，且抑制活性能維持24小時(第2圖)。在血漿和腫瘤中，Tmax和AUC均呈劑量依賴性升高。在30mg/mL的給藥劑量下，腫瘤中的藥物濃度可保持在500ng/mL(>1000nM)20小時左右(第3圖)。

實驗例4 式(I)化合物體外抗腫瘤活性 1、試驗方法 Western免疫印跡(Western blot)法

將接種于六孔板處於對數生長期的細胞加入不同濃度的藥物進行處理，處理不同時間後收集細胞，在細胞裂解液中將細胞裂解，經離心等步驟獲得細胞蛋白裂解物(protein lysate)。將6x蛋白質加樣緩衝液加入細胞裂解物，在沸水浴中變性後置於-80℃保存或直接進行SDS-PAGE電泳，電泳結束後，用半幹轉系統將蛋白轉移至PVDF膜，將PVDF膜置於封閉液中室溫封閉1小時，然後I抗、II抗反應；洗膜後，用Odyssey螢光成像檢測。

CellTiter-Glo®發光法檢測細胞活力

應用CellTiter-Glo®發光法細胞活力檢測試劑盒(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay)檢測藥物對腫瘤細胞增殖生長的抑制作用。主要步驟如下：接種一定數量的對數生長期細胞于96孔培養板。貼壁生長24小時後，加入不同濃度的藥物，同時設相應濃度的溶媒對照。然後腫瘤細胞在37℃、5% CO₂條件下再培養72h。將培養板及其內容物平衡到室溫大約30分鐘，加入CellTiter-Glo®試劑，在振盪器上混合內容物2分鐘誘導細胞裂解。將培養板在室溫進一步孵育10-45分鐘，用酶標儀(BioTek SynergyH1)測定螢光信號值。

根據各濃度抑制率，採用非線性回歸方法計算半數抑制濃度IC₅₀。

2、試驗結果

式(I)化合物顯著抑制由c-Met基因拷貝數擴增導致的c-Met高表達的人腫瘤細胞株的增殖，特別是對肝癌細胞系HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L、胃癌細胞系MKN-45、SNU-5、肺癌細胞系NCI-H1993的增殖具有較強的抑制作用；而對無c-Met基因擴增的肝癌細胞系Huh-7、胃癌細胞系NCI-N87、肺癌細胞系NCI-H1975和A-549無活性。

實驗例5、式(I)化合物體內抗腫瘤作用研究 1、試驗方法

BALB/c裸小鼠皮下分別接種人肝癌HCCLM3、人胃癌MKN-45和SNU-5、人非小細胞肺癌NCI-H1993，待腫瘤生長至100-300mm³後，將動物隨機分組(D0)。每週2-3次測瘤體積，稱鼠重，記錄資料。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2axb²其中a、b分別表示長、寬。

T/C(%)=RTVT/RTVC*100其中RTVT=T/T₀，RTVC=C/C₀；T、C為試驗結束時的腫瘤體積；T₀、C₀為試驗開始時的腫瘤體積。

%抑瘤率=1-T/C(%)

PD/PK試驗分析的血樣和腫瘤樣品。

2、試驗結果

式(I)化合物可顯著抑制肝癌HCCLM3、胃癌MKN-45和SNU-5、肺癌NCI-H1993裸小鼠移植瘤的生長，並引起部分裸小鼠移植瘤的消退，表明式(I)化合物可顯著抑制c-Met及其介導的信號轉導通路，且抑制作用具有明顯的劑量依賴性。

PR：腫瘤縮小30%；PO：灌胃；QD：每天1次；對照：n=8；治療組：n=8。

Claims

式(I)所示9-((8-氟-6-(1-甲基-1 H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3- a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2 H-[1,4]噁嗪並[3,2- c]喹啉-3(4 H)-酮甲磺酸鹽在製備用於治療由c-Met基因擴增引起的癌症的藥物中的用途。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述的癌症選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌細胞)、食管癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌；膽管癌、間充質細胞來源的腫瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤；中樞和外周神經系統的腫瘤，星細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、腦膠質瘤、神經鞘瘤；黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、著色性幹皮病、角化棘皮瘤、甲狀腺濾泡癌和卡波西肉瘤、滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤、MFH/纖維肉瘤、平滑肌肉瘤、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、成膠質細胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、腎母細胞瘤；淋巴系的造血系統腫瘤，白血病、急性淋巴細胞白血病、急性成淋巴細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤或伯基特氏淋巴瘤；骨髓細胞系的造血系統腫瘤，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生異常綜合征或早幼粒細胞性白血病。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述的癌症選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌細胞、食管癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、皮膚癌、白血病、多發性骨髓瘤或淋巴瘤。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述的癌症選自肝癌、肺癌或胃癌。
如申請專利範圍第1至4項任一項所述的用途，其中所述的肝癌為肝癌細胞系HCCLM3、MHCC97-H或MHCC97-L引起的增殖；所述的胃癌為胃癌細胞系MKN-45或SNU-5引起的增殖；所述的肺癌為肺癌細胞系NCI-H1993引起的增殖。
如申請專利範圍第1項所述的式(I)化合物的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟：將9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮溶於偶極非質子溶劑中，加入甲磺酸，過濾，濾液攪拌析晶。
如申請專利範圍第6項所述的製備方法，其特徵在於，所述偶極非質子溶劑選自丙酮、乙腈、N,N-二甲基甲醯胺或二甲亞碸，優選N,N-二甲基甲醯胺。
如申請專利範圍第6項所述的製備方法，其特徵在於，所述9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c] 喹啉-3(4H)-酮與甲磺酸的摩爾比為1：1至10，優選1：3至5，更優選1：4。
如申請專利範圍第6項所述的製備方法，其特徵在於，所述式9-((8-氟-6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]三唑並[4,3-a]吡啶-3-基)-硫代)-4-甲基-2H-[1,4]噁嗪並[3,2-c]喹啉-3(4H)-酮與偶極非質子溶劑的質量體積(g/ml)比為1：5至15，優選1：8至10，更優選1：10。
如申請專利範圍第6項所述的製備方法，其特徵在於，所述攪拌溫度為0℃至50℃，優選20至30℃，更優選20至25℃。