本發明之抗體結合TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3。在一個實施例中，本發明之抗體結合成熟TGF-β之所有三種同功異型物：成熟TGF-β 1 (SEQ ID NO:114)、成熟TGF-β 2 (SEQ ID NO:115)及成熟TGF-β 3 (SEQ ID NO:118)。在一個實施例中，本發明之抗體結合成熟TGF-β之三個同功異型物各自之均二聚體：成熟TGF-β 1之均二聚體(SEQ ID NO:114)、成熟TGF-β 2之均二聚體(SEQ ID NO:115)及成熟TGF-β 3之均二聚體(SEQ ID NO:118)。在一個實施例中，本發明之抗體不結合包含潛伏相關肽(LAP)的TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3之潛伏形式，如SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115及SEQ ID NO:117中所示。 在一個實施例中，本文所描述之抗體係拮抗性的。如本文所使用，術語『拮抗性抗體』描述能夠抑制及/或抵消TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3之生物信號傳導活性的抗體，例如藉由阻斷或實質上減少TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3與TβRI及/或TβRII之結合且由此抑制TGF-β受體複合物之形成及活化。 適合於測定抗體抑制及/或抵消TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3之生物信號傳導活性的能力的分析描述於本文之實例中，例如實例1及實例2中所述之使用重組TGF-β 1、2及/或3的HEK-Blue TGF-β報導基因分析，或實例3中所述之由BvPC3細胞產生TGF-β驅動的BxPC3與HEK-Blue TGF-β報導基因共培養分析。 在一個實施例中，本發明之抗體分子在重組TGF-β 1、TGF-β 2或TGF-β 3 HEK-Blue TGF-β報導基因分析中具有抑制活性，其中抗體以0.5 nM或更好的IC50抑制人類TGF-β 1活性、以0.05 nM或更好的IC50抑制人類TGF-β 2活性及以2 nM或更好的IC50抑制人類TGF-β 3活性。在一個實施例中，在內源性TGF-β HEK-Blue TGF-β報導基因分析中，抗體以10 nM或更好的IC50抑制TGF-β。 本發明之抗體分子適合具有高結合親和力。親和力可使用此項技術中已知的任何適合方法來量測，包括諸如表面電漿子共振之技術，例如如本文之實例中所描述之BIAcore，其使用經分離的天然或重組TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3或適合的融合蛋白/多肽。在一個實施例中，本發明之抗體分子之結合親和力的順序如下：對人類TGF-β 1最高，其次是人類TGF-β 2且對人類TGF-β 3之結合親和力最低。在一個實施例中，本發明之抗體分子對人類TGF-β 1之結合親和力比對人類TGF-β 3之結合親和力高10至30倍，諸如15至25倍。在一個實施例中，本發明之抗體分子對人類TGF-β 2之結合親和力比對人類TGF-β 3之結合親和力高2至20倍，諸如5至15倍。 本發明之抗體分子對經分離的人類TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3之結合親和力宜為約2000 pM或小於2000 pM。在一個實施例中，本發明之抗體分子對人類TGF-β 1之結合親和力為500 pM或更低，諸如200 pM或更低或100 pM或更低。在一個實施例中，本發明之抗體分子對人類TGF-β 2之結合親和力為500 pM或更低，諸如300 pM或更低或200 pM或更低。在一個實施例中，本發明之抗體分子對人類TGF-β 3之結合親和力為3000 pM或更低，諸如2500 pM或更低或2000 pM或更低。 在一個實施例中，本發明之抗體對人類TGF-β 1之結合親和力為100 pM或更低，對人類TGF-β 2之結合親和力為200 pM或更低且對人類TGF-β 3之結合親和力為2000 pM或更好。 親和力之數值愈低，抗體或片段對TGF-β同功異型物之親和力愈高。 本發明人提供新的抗TGF-β抗體，包括人類化抗體。抗體係用成熟TGF-β 1及成熟TGF-β 2對兔進行免疫而產生。 抗體可變域中之殘基習知地根據Kabat等人1987年所設計的系統編號。此系統闡述於Kabat等人，1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest，美國衛生與人群服務部(US Department of Health and Human Services), NIH, USA (下文稱「Kabat等人(同前文獻)」中。除非另有規定，否則在本說明書中使用此編號系統。 Kabat殘基名稱不總是直接與胺基酸殘基之線性編號對應。對應於基本可變域結構中結構組分(無論是框架或互補決定區(complementarity determining region；CDR))的縮短或插入，實際線性胺基酸序列含有的胺基酸可比嚴格Kabat編號少或含有其他胺基酸。對於給定抗體，可藉由比對抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源殘基來確定殘基之正確Kabat編號。 根據Kabat編號系統，重鏈可變域之CDR位於殘基31-35 (CDR-H1)、殘基50-65 (CDR-H2)及殘基95-102 (CDR-H3)。然而，根據Chothia (Chothia, C.及Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901917 (1987))，等效於CDR-H1的環自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另外規定，否則如本文所採用之『CDR-H1』旨在指殘基26至35，如Kabat編號系統與Chothia拓樸環(topological loop)定義之組合所描述。 根據Kabat編號系統，輕鏈可變域之CDR位於殘基24-34 (CDR-L1)、殘基50-56 (CDR-L2)及殘基89-97 (CDR-L3)。 用於本發明之抗體可使用此項技術中已知之任何適合方法獲得。包括融合蛋白在內的TGF-β多肽/蛋白質、(以重組方式或天然地)表現多肽的細胞可用以製造特異性識別TGF-β的抗體。如SEQ ID NO：113、115及117中所示，多肽可為TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3之『成熟』多肽，或其生物學上活性片段或衍生物。用於免疫宿主之多肽可藉由此項技術中熟知之方法，自包含表現系統之經基因工程改造之宿主細胞製備，或其可自天然生物來源回收。在本申請案中，術語「多肽」包括肽、多肽及蛋白質。除非另外規定，否則此等互換地使用。在一些情況下，TGF-β多肽可能係較大蛋白質之一部分，諸如融合至親和標記物、前導序列或其他序列的融合蛋白。 在需要對動物進行免疫的情況下，可使用熟知且常規的方案，參見例如Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (編)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986，藉由向動物、較佳非人類動物投與TGF-β多肽來獲得針對該等多肽產生的抗體。可對許多恆溫動物進行免疫，諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬。然而，小鼠、兔、豬及大鼠通常最適合。 單株抗體可藉由此項技術中已知之任何方法製備，諸如融合瘤技術(Kohler及Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源融合瘤(trioma)技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人，1983, Immunology Today, 4:72)及EBV融合瘤技術(Cole等人, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77-96頁，Alan R Liss, Inc.)。 抗體亦可使用單一淋巴細胞抗體方法藉由選殖及表現單一淋巴細胞所產生的免疫球蛋白可變區cDNA來產生，該等單一淋巴細胞係選擇用於藉由例如Babcook, J等人，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848；WO92/02551；WO04/051268及國際專利申請案第WO04/106377號中所述之方法來製造特異性抗體。 抗體篩檢可使用用於量測對人類TGF-β之結合的分析及/或用於量測阻斷配體與受體結合之能力的分析來進行。適合的分析之實例描述於本文之實例中。 如本文所採用之『特異性』旨在指僅識別特異抗原的抗體，或與結合於非特異性抗原相比對特異抗原具有顯著較高的結合親和力的抗體，例如高至少5、6、7、8、9、10倍的結合親和力。 根據本發明之某些抗體之胺基酸序列及聚核苷酸序列提供於圖1及圖2中。 在本發明之一個態樣中，抗體係包含重鏈的結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其中重鏈之可變域包含以下中之至少一者：具有SEQ ID NO:4中給出的序列的CDR用於CDR-H1、具有SEQ ID NO:5中給出的序列的CDR用於CDR-H2及具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中給出的序列的CDR用於CDR-H3。重鏈之可變域較佳包含SEQ ID NO:4中給出的序列用於CDR-H1、SEQ ID NO:5中給出的序列用於CDR-H2及SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中給出的序列用於CDR-H3。 在本發明之第二態樣中，抗體係包含輕鏈的結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其中輕鏈之可變域包含以下中之至少一者：具有SEQ ID NO:1中給出的序列的CDR用於CDR-L1、具有SEQ ID NO:2中給出的序列的CDR用於CDR-L2及具有SEQ ID NO:3中給出的序列的CDR用於CDR-L3。輕鏈之可變域較佳包含SEQ ID NO:1中給出的序列用於CDR-L1、SEQ ID NO:2中給出的序列用於CDR-L2及SEQ ID NO:3中給出的序列用於CDR-L3。 本發明之抗體分子適合分別包含互補輕鏈或互補重鏈。 在一個實施例中，本發明之抗體係包含如上文所定義之重鏈且另外包含輕鏈的結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其中輕鏈之可變域包含以下中之至少一者：具有SEQ ID NO:1中給出的序列的CDR用於CDR-L1、具有SEQ ID NO:2中給出的序列的CDR用於CDR-L2及具有SEQ ID NO:3中給出的序列的CDR用於CDR-L3。輕鏈之可變域較佳包含SEQ ID NO:1中給出的序列用於CDR-L1、SEQ ID NO:2中給出的序列用於CDR-L2及SEQ ID NO:3中給出的序列用於CDR-L3。 在一個實施例中，本發明之抗體係包含重鏈及輕鏈的結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其中重鏈之可變域包含SEQ ID NO:4中給出的序列用於CDR-H1、SEQ ID NO:5中給出的序列用於CDR-H2及SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中給出的序列用於CDR-H3；且其中輕鏈之可變域包含SEQ ID NO:1中給出的序列用於CDR-L1、SEQ ID NO:2中給出的序列用於CDR-L2及SEQ ID NO:3中給出的序列用於CDR-L3。 應瞭解，可對由本發明提供的CDR進行一或多個胺基酸取代、添加及/或缺失而不顯著改變抗體結合TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3及中和TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3活性之能力。任何胺基酸取代、添加及/或缺失之作用可由熟習此項技術者，例如藉由使用本文所描述之方法，尤其是實例中所說明之方法容易地測試，從而測定TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3結合及TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3與受體相互作用之抑制。在一個實施例中，在選自獨立地由以下組成之群的一或多個CDR中，至少一個胺基酸替換為保守取代： CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3中之任一者； 組合CDR-H1及H2、CDR-H1及H3、CDR-H1及L1、CDR-H1及L2、CDR-H1及L3、CDR-H2及H3、CDR-H2及L1、CDR-H2及L2、CDR-H2及L3、CDR-H3及L1、CDR-H3及L2、CDR-H3及L3、CDR-L1及L2、CDR-L1及L3、CDR-L2及L3中之任一者； CDR-H1、H2及H3；CDR-H1、H2及L1；CDR-H1、H2及L2；CDR-H1、H2及L3；CDR-H2、H3及L1；CDR-H2、H3及L2；CDR-H2、H3及L3；CDR-H3、L1及L2；CDR-H3、L1及L3；CDR-L1、L2、L3； 組合CDR-H1、H2、H3及L1；CDR-H1、H2、H3及L2；CDR-H1、H2、H3及L3；CDR-H2、H3、L1及L2；CDR-H2、H3、L2及L3；CDR-H3、L1、L2及L3；CDR-L1、L2、L3及H1；CDR-L1、L2、L3及H2；CDR-L1、L2、L3及H3；CDR-L2、L3、H1及H2；CDR-H1、H2、H3、L1及L2；CDR-H1、H2、H3、L1及L3；CDR-H1、H2、H3、L2及L3；CDR-L1、L2、L3、H1及H2；CDR-L1、L2、L3、H1及H3；CDR-L1、L2、L3、H2及H3中之任一者；及 組合CDR-H1、H2、H3、L1、L2及L3。 因此，本發明提供一種結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其包含選自以下的一或多個CDR：CDRH-1 (SEQ ID NO:4)、CDRH-2 (SEQ ID NO:5)、CDRH-3 (SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)、CDRL-1 (SEQ ID NO:1)、CDRL-2 (SEQ ID NO:2)及CDRL-3 (SEQ ID NO:3)，其中在一或多個CDR中的一或多個胺基酸已經另一胺基酸，例如如下文所定義之相似胺基酸取代。 在一個實施例中，本發明提供一種結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其包含CDRH-1 (SEQ ID NO:4)、CDRH-2 (SEQ ID NO:5)、CDRH-3 (SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)、CDRL-1 (SEQ ID NO:1)、CDRL-2 (SEQ ID NO:2)及CDRL-3 (SEQ ID NO:3)，例如其中在一或多個CDR中之一或多個胺基酸已經另一胺基酸，諸如如下文所定義之相似胺基酸取代。 在一個實施例中，本文所揭示之重鏈之域包括具有1、2、3或4個保守胺基酸取代的序列，例如其中取代係在框架中。 在一個實施例中，重鏈可變區之框架包含1、2、3或4個胺基酸，其經插入、缺失、取代或其組合。在一個實施例中，經取代胺基酸係來自供體抗體的相應胺基酸。 在一個實施例中，本文所揭示之輕鏈可變區包括具有1、2、3或4個保守胺基酸取代的序列，例如其中取代係在框架中。 在一個實施例中，輕鏈可變區之框架包含1、2、3或4個胺基酸，其經插入、缺失、取代或其組合。在一個實施例中，經取代胺基酸係來自供體抗體的相應胺基酸。 在本發明之一個態樣中，提供一種抗TGF-β抗體或其結合片段，其中重鏈之可變域包含三個CDR且CDR-H1之序列與SEQ ID NO:4中給出的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大之一致性或相似性，CDR-H2之序列與SEQ ID NO:5中給出的序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%之一致性或相似性，且CDR-H-3之序列與SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中給出的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大之一致性或相似性。較佳係另外包含輕鏈的抗TGF-β抗體或其結合片段，其中輕鏈之可變域包含三個CDR且CDR-L1之序列與SEQ ID NO:1中給出的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大之一致性或相似性，CDR-L2之序列與SEQ ID NO:2中給出的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大之一致性或相似性，且CDR-L3之序列與SEQ ID NO:3中給出的序列具有至少60%之一致性或相似性。 在一個實施例中，提供一種與本文所揭示之可變區序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大之一致性或相似性的可變區。 在一個實施例中，本發明提供一種結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其接觸與SEQ ID NO:114之胺基酸24-35及視情況SEQ ID NO:114之胺基酸90-95中之至少一者至少90%一致的序列。在另一實施例中，抗體接觸與SEQ ID NO:114至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一個實施例中，抗體另外接觸SEQ ID NO:114之胺基酸60、97及101中之至少一者。在另一實施例中，抗體亦接觸本文所提供之胺基酸之外的胺基酸。『接觸(contacts)』或『接觸(contacting)』意指可使用標準X射線結晶學技術在諸如5Å或4Å之適合解析度下偵測到的相互作用。 在另一實施例中，提供一種與本發明之抗體或片段之結合競爭結合TβRI及/或TβRII的抗TGF-β抗體。 在一個實施例中，提供一種交叉阻斷抗體之結合的抗TGF-β抗體，其包含由以下序列給出的6個CDR：SEQ ID NO:1用於CDR-L1、SEQ ID NO:2用於CDR-L2、SEQ ID NO:3用於CDR-L3、SEQ ID NO:4用於CDR-H1、SEQ ID NO:5用於CDR-H2及SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9用於CDR-H3，尤其其中交叉阻斷係異位的。 在一個實施例中，提供一種交叉阻斷抗體之結合的抗TGF-β抗體，其包含由以下序列給出的6個CDR：SEQ ID NO:1用於CDR-L1、SEQ ID NO:2用於CDR-L2、SEQ ID NO:3用於CDR-L3、SEQ ID NO:4用於CDR-H1、SEQ ID NO:5用於CDR-H2及SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9用於CDR-H3，尤其其中抗體藉由結合與其阻斷的抗體相同的抗原決定基來交叉阻斷結合。 在一個實施例中，抗體或結合片段係來自小鼠、大鼠、兔、駱駝或其他哺乳物種。例如，抗體或結合片段可來自兔。此類抗體之可變區之實例提供於SEQ ID NO:10-17中。 在一個實施例中，抗體或結合片段係嵌合的。通常，嵌合抗體或結合片段包含來自兩個或更多個物種的要素然而保持該等物種之某些特徵。例如，嵌合抗體或結合片段可具有來自一個物種，諸如來自小鼠、大鼠、兔或其他哺乳物種的可變區及來自另一物種，諸如人類的全部或部分恆定區。 在一個實施例中，根據本發明之抗體或結合片段係人類化的。 如本文所使用，術語『人類化抗體』係指抗體或抗體分子，其中重鏈及/或輕鏈含有來自供體抗體(例如鼠單株抗體)的移植至接受體抗體(例如人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區框架的一或多個CDR (必要時包括一或多個經修飾CDR) (參見，例如US 5,585,089；WO91/09967)。關於綜述，參見Vaughan等人，Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之任一者的決定特異性的殘基中之一或多者轉移至人類抗體框架而非轉移整個CDR (參見例如，Kashmiri等人，2005, Methods, 36:25-34)。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之一或多者的決定特異性的殘基轉移至人類抗體框架。在另一實施例中，僅將來自上文所描述之各CDR的決定特異性的殘基轉移至人類抗體框架。當移植CDR或決定特異性的殘基時，根據CDR的供體抗體的類別/類型，可使用任何適當接受體可變區框架序列，包括小鼠、靈長類及人類框架區。 根據本發明之人類化抗體宜具有包含人類接受體框架區以及本文中特定提供的CDR中之一或多者的可變域。由此，在一個實施例中提供一種結合人類TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3的人類化抗體，其中可變域包含人類接受體框架區及非人類供體CDR。 可用於本發明之人類框架之實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM (Kabat等人, 同前文獻)。舉例而言，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈且EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈二者。或者，可使用人類生殖系序列；此等可在www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase或www.imgt.org上獲得，二者皆在2016年1月07日最後一次存取。 在本發明之人類化抗體中，接受體重鏈及輕鏈不一定需要來源於同一抗體且必要時可包含具有來源於不同鏈之框架區的複合鏈。 在一個實施例中，人類框架包含1、2、3或4個胺基酸取代、添加或缺失，例如1、2、3或4個保守取代或供體殘基之取代。 在一個實施例中，用作人類框架的序列與本文所揭示之序列80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大地相似或一致。 用於本發明之人類化抗體之重鏈的適合框架區係來源於人類子群VH3序列IGHV3-21以及JH5 (SEQ ID NO:111)。 用於本發明之人類化抗體之輕鏈的適合框架區係來源於人類子群VK1序列IGKV1-5序列以及JK4 (SEQ ID NO:109)。 因此，在一個實例中提供一種人類化抗體，其包含SEQ ID NO:4中給出的序列用於CDR-H1、SEQ ID NO:5中給出的序列用於CDR-H2及SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中給出的序列用於CDR-H3，其中重鏈框架區係來源於人類亞群VH3序列IGHV3-21以及JH5 (SEQ ID NO:111)。 在一個實例中，抗體之重鏈可變域包含SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:94中給出的序列。 用於本發明之人類化抗體之輕鏈的適合框架區係來源於人類生殖系列子群VK1序列IGKV1-5序列以及JK4 (SEQ ID NO:109)。 因此，在一個實例中提供一種人類化抗體，其包含SEQ ID NO:1中給出的序列用於CDR-L1、SEQ ID NO:2中給出的序列用於CDR-L2及SEQ ID NO:3中給出的序列用於CDR-L3，其中輕鏈框架區係來源於人類亞群VK1序列IGKV1-5序列以及JK4 (SEQ ID NO:109)。 在一個實例中，抗體之輕鏈可變域包含SEQ ID NO:38中給出的序列。 在本發明之人類化抗體中，框架區無需具有與接受體抗體之序列完全相同的序列。舉例而言，可將不尋常殘基改為用於該接受體鏈類別或類型的更常出現的殘基。或者，可改變在接受體框架區中所選擇的殘基以使其對應於在供體抗體中之相同位置出現的殘基(參見Reichmann等人，1998, Nature, 332:323-324)。此類改變應保持在恢復供體抗體之親和力所必需的最小程度。用於選擇接受體框架區中之可能需要改變的殘基的方案闡述於WO91/09967中。 如本文所採用之供體殘基係指來自供給CDR的非人類抗體(例如鼠或兔抗體)的殘基。 在一個實施例中提供一種人類化抗體，其中重鏈可變域不含有任何供體殘基。 類似地，在一個實施例中提供一種『鼠類化』的抗體或結合片段。此類抗體或結合片段可具有兔供體及鼠接受體。此類抗體之實例提供於SEQ ID NO:26-33中。鼠接受體序列之實例提供於SEQ ID NO:34-37中。 在一特定實施例中，本發明提供一種結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體，其具有包含SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:94中給出的重鏈可變域序列的重鏈及包含SEQ ID NO:38中給出的輕鏈可變域序列的輕鏈。 在一個實施例中，本發明提供一種與本文所揭示之序列80%相似或一致的抗體序列，例如在相關序列之一部分或全部中，85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大地相似或一致。在一個實施例中，相關序列係SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:94。在一個實施例中，相關序列係SEQ ID NO:38。 如本文所用，「一致性」表示在所比對序列之任何特定位置，序列之間的胺基酸殘基是一致的。如本文所用，「相似性」表示在所比對序列之任何特定位置，序列之間的胺基酸殘基之類型是屬於相似性的。舉例而言，可用白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。通常可彼此間取代的其他胺基酸包括但不限於： - 苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)； - 離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)； - 天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽(具有酸性側鏈之胺基酸)； - 天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；及 - 半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。一致性及相似性之程度可輕易地計算(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編，Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編，Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data，部分1, Griffin, A.M.及Griffin, H.G.編，Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編，M Stockton Press, New York, 1991；可購自NCBI的BLAST™軟體(Altschul, S.F.等人，1990, J. Mol. Biol. 215:403-410；Gish, W.及States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272；Madden, T.L.等人，1996, Meth. Enzymol. 266:131141；Altschul, S.F.等人，1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；Zhang, J.及Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656)。 本發明之抗體分子可包含具有全長重鏈及輕鏈的完整抗體分子或其結合片段，且可係(但不限於) Fab、經修飾Fab、Fab'、經修飾Fab'、F(ab')
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、Fv、單域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二、三或四價抗體、雙scFv、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及以上中之任一者之抗原決定基結合片段(參見例如Holliger及Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136；Adair及Lawson, 2005, Drug Design Reviews - 線上2(3), 209-217)。用於產生及製造此等抗體片段之方法為此項技術中所熟知的(參見例如Verma等人，1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181)。用於本發明之其他抗體片段包括描述於國際專利申請案WO005/003169、WO05/003170及WO05/003171中的Fab及Fab'片段。多價抗體可包含多重特異性，例如雙特異性，或可為單特異性(參見例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562及WO2010/035012)。 如本文所採用之抗體之結合片段係指能夠以可將片段描述為對抗原具有特異性的親和力結合抗原的片段。 在一個實施例中，根據本發明之抗體作為TGF-β結合抗體融合蛋白提供，該融合蛋白包含免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab'片段，及直接或間接連接於其上的一個或兩個單域抗體(dAb)，例如如WO2009/040562、WO2010/035012、WO2011/030107、WO2011/061492及WO2011/086091中所述，其均以引用之方式併入本文中。 在一個實施例中，融合蛋白包含視情況藉由二硫鍵連接之兩個域抗體，例如作為可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)配對。 在一個實施例中，融合蛋白之Fab或Fab'要素具有與單域抗體相同或相似的特異性。在一個實施例中，Fab或Fab'具有與單域抗體不同的特異性，換言之，融合蛋白係多價的。在一個實施例中，根據本發明之多價融合蛋白具有白蛋白結合位點，例如其中的VH/VL對提供白蛋白結合位點。 本發明之抗體分子之恆定區結構域若存在則可根據抗體分子之建議功能及尤其是可能需要的效應功能來選擇。舉例而言，恆定區結構域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結構域。特定言之，當抗體分子意圖用於治療用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區結構域，尤其是IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意圖用於治療目的且不需要抗體效應功能時，例如僅用於阻斷TGF-β活性，可使用IgG2及IgG4同型。 應瞭解亦可使用此等恆定區結構域之序列變異體。舉例而言，如Angal等人，1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108中所述，可使用在241位置的絲胺酸已改為脯胺酸的IgG4分子。因此，在抗體係IgG4抗體的實施例中，抗體可包括突變S241P。 熟習此項技術者亦將瞭解抗體可經歷各種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常常視用於表現抗體的宿主細胞株以及培養條件而定。此類修飾可包括在糖基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬胺酸鹽異構化及天冬醯胺脫醯胺方面之變化。常見修飾為由於羧基肽酶作用而損失羧基端鹼性殘基(諸如離胺酸或精胺酸)(如Harris, RJ.
Journal of Chromatography
705:129-134, 1995中所述)。然而，在本發明之Ab4856實施例之重鏈或輕鏈上不存在C端離胺酸。 在一個實例中，本文所提供之一或多個CDR可經修飾以移除非所需殘基或位點，諸如半胱胺酸殘基或天冬胺酸(D)異構化位點或天冬醯胺(N)脫醯胺位點。 例如在CDR中之任一者中的一或多個半胱胺酸殘基可經另一胺基酸，諸如絲胺酸取代。 在一個實例中，可藉由使天冬醯胺殘基(N)及/或相鄰殘基突變為任何其他適合胺基酸以自一或多個CDR中移除天冬醯胺脫醯胺位點。在一個實例中，天冬醯胺脫醯胺位點諸如NG或NS可經突變為例如NA或NT。 在一個實例中，可藉由使天冬胺酸殘基(D)及/或相鄰殘基突變為任何其他適合胺基酸以自一或多個CDR中移除天冬胺酸異構化位點。在一個實例中，天冬胺酸異構化位點諸如DG或DS可經突變為例如EG、DA或DT。 在一個實例中，N-糖基化位點諸如NLS可藉由使天冬醯胺殘基(N)突變為任何其他適合胺基酸，例如SLS或QLS來移除。在一個實例中，N-糖基化位點諸如NLS可藉由使絲胺酸殘基(S)突變為除蘇胺酸(T)之外的任何其他殘基來移除。 在一個實施例中，抗體重鏈包含CH1域、CH2域及CH3域且抗體輕鏈包含CL域，κ或λ。 在一個實施例中，抗體重鏈包含CH1域且抗體輕鏈包含CL域，κ或λ。 在一個實施例中，本發明提供之抗體係對人類TGF-β具有特異性的拮抗性抗體，其中重鏈恆定區包含經修飾鉸鏈區。因此，本發明提供一種抗體，其中重鏈包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:101中給出的序列或由該序列組成。 本發明亦提供一種抗體，其中輕鏈包含SEQ ID NO:45中給出的序列或由該序列組成。 本發明提供之抗體具有包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:101中給出的序列的重鏈及包含SEQ ID NO:45中給出的序列的輕鏈。 亦提供一種抗TGF-β抗體或其結合片段，其中重鏈及輕鏈與包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:101中給出的序列的重鏈及包含SEQ ID NO:45中給出的序列的輕鏈至少80% (較佳85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)一致或相似。在一個實施例中，輕鏈具有SEQ ID NO:45中給出的序列或由該序列組成，且重鏈具有SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:101中給出的序列或由該序列組成。在另一實施例中，輕鏈具有SEQ ID NO:45之序列或由該序列組成，且重鏈具有SEQ ID NO:59之序列或由該序列組成。 本發明亦提供人類TGF-β 1、2或3之特異性區域或抗原決定基，其由本發明提供之抗體，尤其是包含重鏈序列gH13 (SEQ ID NO:59)及/或輕鏈序列gL3 (SEQ ID NO:45)的抗體4856結合。 人類TGF-β 1、2或3多肽之此特異性區域或抗原決定基可藉由此項技術中已知的任何適合抗原決定基定位方法組合本發明提供之抗體中之任一者來鑑別。此類方法之實例包括使用可特異性結合於含有由抗體識別的抗原決定基之序列的抗體的最小片段(例如長度在約5至20個胺基酸的區域中，較佳約7個胺基酸的肽)來篩檢來源於TGF-β的不同長度的肽對本發明抗體的結合。TGF-β肽可以合成方式或藉由蛋白分解消化TGF-β多肽產生。結合抗體的肽可藉由例如質譜分析來鑑別。在另一實例中，可用NMR光譜法或X射線結晶學鑑別本發明抗體所結合之抗原決定基。一旦鑑別，結合本發明抗體的抗原決定基片段必要時可用作免疫原以獲得結合相同抗原決定基的其他抗體。 交叉阻斷根據本發明之抗體之結合的抗體，尤其是包含重鏈序列(SEQ ID NO:59)及輕鏈序列(SEQ ID NO:45)的抗體可能類似地適用於拮抗TGF-β 1、2及3活性。因此，本發明亦提供一種對人類TGF-β 1、2及3具有特異性的拮抗性抗體，其交叉阻斷以上所述抗體中之任一者與人類TGF-β 1、2及/或3之結合，及/或經彼等抗體中之任一者交叉阻斷其結合TGF-β 1、2及/或3。在一個實施例中，此類抗體結合與上文所描述之抗體相同的抗原決定基。在另一實施例中，交叉阻斷中和抗體結合與上文所描述之抗體所結合的抗原決定基毗鄰及/或重疊的抗原決定基。在另一實施例中，本發明之此態樣之交叉阻斷中和抗體不結合與本發明之抗體相同的抗原決定基或與該抗原決定基毗鄰及/或重疊的抗原決定基。 交叉阻斷抗體可使用此項技術中之任何適合方法鑑別，例如藉由使用競爭ELISA或BIAcore分析，其中交叉阻斷抗體與人類TGF-β 1、2及/或3之結合阻止了本發明抗體之結合或反之亦然。 在一個實施例中，提供一種對人類TGF-β 1、2及3具有特異性的拮抗性抗體，其交叉阻斷重鏈包含SEQ ID NO:59中所示之序列且輕鏈包含SEQ ID NO:45中所示之序列的抗體與人類TGF-β 1、2及3之結合。在一個實施例中，本發明提供之交叉阻斷抗體抑制包含SEQ ID NO:59中所示的重鏈序列及SEQ ID NO:45中所示的輕鏈序列的抗體之結合，其抑制程度大於80%，例如大於85%，諸如大於90%，尤其大於95%、96%、97%、98%、99%或更大。 或者或此外，根據本發明之此態樣的拮抗性抗體與人類TGF-β 1、2及3之結合可經包含SEQ ID NO:59中所示的重鏈序列及SEQ ID NO:45中所示的輕鏈序列的抗體交叉阻斷。因而亦提供一種對人類TGF-β 1、2及3具有特異性的拮抗性抗體分子，其與人類TGF-β 1、2及3之結合經包含SEQ ID NO:59中所示的重鏈序列及SEQ ID NO:45中所示的輕鏈序列的抗體交叉阻斷。在一個實施例中，本發明之此態樣提供之拮抗性抗體與人類TGF-β 1、2及3之結合經包含SEQ ID NO:59中所示的重鏈序列及SEQ ID NO:45中所示的輕鏈序列的抗體抑制，抑制程度大於80%，例如大於85%，諸如大於90%，尤其大於95%、96%、97%、98%、99%或更大。 在一個實施例中，本發明提供之交叉阻斷抗體係完全人類的。在一個實施例中，本發明提供之交叉阻斷抗體係人類化的。在一個實施例中，本發明之抗體適合於吸入傳遞，例如藉由霧化。在一個實例中，霧化並不實質上改變本發明抗體之物理特性，例如結合親和力及效能。在一個實例中，本發明之抗體高度穩定。抗體穩定性之一個量度係熔融溫度(Tm)。熔融溫度可藉由此項技術中已知的任何適合方法測定，例如使用熱螢光(Thermofluor) (Ericsson等人，Analytical Biochemistry 357 (2006) 289-298)或差示掃描熱量測定(differential scanning calorimetry；DSC)。本發明提供之抗體較佳具有高熔融溫度(Tm)，通常至少75℃。在一個實例中，本發明之抗體具有至少75℃之Tm。在一個實例中，本發明之抗體具有至少77℃之Tm。在一個實例中，本發明之抗體具有至少79℃之Tm。 生物分子，諸如抗體或片段，含有酸性及/或鹼性官能基，由此給予分子淨正或負電荷。總體上「觀測到」的電荷之量將視實體之絕對胺基酸序列、3D結構中帶電基團之局部環境及分子之環境條件而定。等電點(pI)係特定分子或其溶劑可進入表面不攜帶淨電荷時的pH。在一個實例中，本發明之TGF-β抗體及片段可經改造而具有合適等電點。此可能產生具有更穩固特性，尤其是適合溶解性及/或穩定性概況及/或改善的純化特徵的抗體及/或片段。 由此在本發明之一個態樣中，提供一種經改造以具有與原先鑑別的抗體之等電點不同的等電點的人類化TGF-β抗體。抗體可能例如藉由替代胺基酸殘基進行改造，諸如用一或多個鹼性胺基酸殘基替代酸性胺基酸殘基。或者，可引入鹼性胺基酸殘基或可移除酸性胺基酸殘基。或者，若分子具有不可接受地高的pI值，則可視需要引入酸性殘基以降低pI。當調控pI時必須注意保持抗體或片段之所期望的活性係重要的。由此在一個實施例中，經改造抗體或片段具有與「未經修飾的」抗體或片段相同或實質上相同的活性。 諸如** ExPASY www.expasy.ch/tools/pi_tool.html (2015年12月21日存取)之程式可用於預測抗體或片段之等電點。 在一個實施例中，交叉阻斷抗體之等電點係至少7，例如至少8，諸如8.5、8.6、8.7、8.8或8.9，或至少9，諸如9.0、9.1、9.2、9.3或9.4。 應瞭解本發明提供之抗體之親和力可使用此項技術中已知之任何適合方法改變。本發明因此亦關於本發明之抗體分子之變異體，其對TGF-β具有提高的親和力。此類變異體可藉由多種親和力成熟方案獲得，包括使CDR發生突變(Yang等人,1995, J. Mol. Biol., 254:392-403)、鏈改組(Marks等人, 1992, Bio/Technology, 10:779-783)、使用大腸桿菌(
E. coli
)突變菌株(Low等人, 1996, J. Mol. Biol., 250:359-368)、DNA改組(Patten等人, 1997, Curr. Opin. Biotechnol.,
8
:724-733)、噬菌體展示(Thompson等人, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996)及有性PCR (Crameri等人, 1998, Nature, 391:288-291)。Vaughan等人(同前文獻)論述此等親和力成熟方法。 必要時用於本發明之抗體可結合於一或多個效應分子。應瞭解效應分子可包含單個效應分子或兩個或更多個連接成用於形成可連接至本發明抗體之單一部分的分子。在需要獲得連接至效應分子之抗體片段的情況下，此可藉由其中抗體片段直接或經由偶合劑連接至效應分子的標準化學或重組DNA程序來製備。使此類效應分子與抗體結合的技術為此項技術中所熟知的(參見Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編，1987, 第623-53頁；Thorpe等人，1982, Immunol. Rev., 62:119-58及Dubowchik等人，1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123)。特定化學程序包括例如描述於WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476及WO03/031581中的彼等。或者，在效應分子為蛋白質或多肽的情況下，連接可使用重組DNA程序來達成，例如如WO86/01533及EP0392745中所述。 如本文所使用之術語效應分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物學活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、合成的或天然存在之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其是放射性碘)、放射性同位素、螯合金屬、奈米顆粒及報導基團，諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜法偵測的化合物。 效應分子之實例可包括細胞毒素或細胞毒性劑，包括任何對細胞有害的(例如殺死)試劑。實例包括康普瑞汀(combrestatins)、海兔毒素(dolastatins)、埃博黴素(epothilones)、星形孢菌素(staurosporin)、類美登素(maytansinoids)、海綿素(spongistatins)、根瘤菌素(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrins)、桿孢菌素(roridins)、海米斯林(hemiasterlins)、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾比星(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。 效應分子亦包括但不限於：抗代謝物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷基化劑(例如甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、蒽環黴素(anthracyclines)(例如道諾比星(以前為道諾黴素(daunomycin))及小紅莓)、抗生素(例如放線菌素d (以前為放射菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素、安麯黴素(anthramycin，AMC)、卡奇黴素(calicheamicins)或倍癌黴素(duocarmycins))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。 其他效應分子可包括螯合放射性核素，諸如
111
In及
90
Y、Lu
177
、鉍
213
、鉲
252
、銥
192
及鎢
188
/錸
188
；或藥物，諸如但不限於烷基磷酸膽鹼、拓樸異構酶I抑制劑、類紫杉醇及蘇拉明(suramin)。 其他效應分子包括蛋白質、肽及酶。相關酶包括但不限於蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。相關蛋白質、多肽及肽包括但不限於：免疫球蛋白；毒素，諸如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素A (ricin A)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)；蛋白質，諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α干擾素、β干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子；血栓形成劑(thrombotic agent)或抗血管生成劑，例如血管抑制素或內皮抑制素；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素、介白素-1 (interleukin-1；IL-1)、介白素-2 (IL-2)、神經生長因子(nerve growth factor；NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白。 其他效應分子可包括適用於例如診斷的可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性核素、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影法)及非放射性順磁性金屬離子。關於用於診斷學的可與抗體結合的金屬離子，通常參見美國專利第4,741,900號。適合酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白及生物素；適合螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適合發光物質包括魯米諾(luminol)；適合生物發光物質包括螢光素酶、螢光素及水母素(aequorin)；且適合放射性核素包括
125
I、
131
I、
111
In及
99
Tc。 在另一實例中，效應分子可延長抗體的活體內半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增強抗體跨越上皮屏障至免疫系統之傳遞。此類型的適合效應分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如WO05/117984中描述的彼等化合物。 在一個實施例中，獨立於TGF-β的效應分子提供的半衰期係有利的。 在效應分子為聚合物的情況下，其一般可為合成的或天然存在的聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚環氧烷聚合物或分支鏈或非分支鏈多醣，例如同元多醣或異元多醣。 可存在於上述合成聚合物上的視情況存在之特定取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。 合成聚合物之特定實例包括視情況取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是視情況取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。 特定天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。 在一個實施例中，聚合物為白蛋白或其片段，諸如人類血清白蛋白或其片段。 如本文所使用之「衍生物」意欲包括反應性衍生物，例如巰基選擇性反應性基團，諸如順丁烯二醯亞胺及類似者。反應性基團可直接或經由連接子區段連接於聚合物。應瞭解此類基團之殘基在一些情況下將作為抗體片段與聚合物之間的連接基團形成產物之一部分。 聚合物之大小可根據需要改變，但平均分子量通常在500 Da至50000 Da範圍內，例如5000 Da至40000 Da，諸如20000 Da至40000 Da。聚合物大小可尤其根據產物之既定用途，例如定位於某些組織(諸如腫瘤)或延長循環半衰期之能力而選擇(綜述參見Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545)。因此，舉例而言，在意欲使產物離開循環且滲透組織，例如用於治療腫瘤之情況下，宜使用例如分子量為大約5000 Da的小分子量聚合物。對於產物留存在循環中的應用，宜使用例如分子量在20000 Da至40000 Da範圍內的較高分子量聚合物。 適合聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其是分子量在約15000 Da至約40000 Da範圍內的。 在一個實例中，用於本發明之抗體連接於聚(乙二醇)(poly(ethyleneglycol)；PEG)部分。在一個特定實例中，抗體為抗體片段且PEG分子可經由位於抗體片段中的任何可用的胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基，例如任何游離胺基、亞胺基、巰基、羥基或羧基連接。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經改造至片段中(參見例如US 5,219,996、US 5,667,425、WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之抗體分子係經修飾Fab片段，其中該修飾係一或多個胺基酸添加至其重鏈之C端末端以允許效應分子之連接。適合地，附加的胺基酸形成含有效應分子可連接的一或多個半胱胺酸殘基的經修飾鉸鏈區。可使用多個位點連接兩個或更多個PEG分子。 PEG分子宜經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之巰基共價連接。連接至經修飾抗體片段的各聚合物分子可共價連接於位於片段中的半胱胺酸殘基之硫原子。共價鍵一般為二硫鍵或尤其是硫-碳鍵。在巰基用作連接點的情況下，可使用適當活化的效應分子，例如巰基選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。在如上所述之經聚合物修飾的抗體片段之製備中，可使用活化聚合物作為起始物質。活化聚合物可為含有巰基反應性基團的任何聚合物，諸如α-鹵基羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺(例如順丁烯二醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物。此類起始物質可商購(例如購自Nektar，以前為Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA)或可使用習知化學程序由可商購的起始物質製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，以前為Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)及M-PEG-SPA (可獲自Nektar，以前為Shearwater)。 在一個實施例中，抗體係聚乙二醇化的經修飾Fab片段、Fab'片段或二Fab (diFab)，亦即有PEG (聚(乙二醇))共價連接於其上，例如根據揭示於EP0948544或EP1090037中之方法[亦參見「Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications」, 1992, J. Milton Harris (編), Plenum Press, New York, 「Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications」, 1997, J. Milton Harris及S. Zalipsky (編), American Chemical Society, Washington DC及「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」, 1998, M. Aslam及A. Dent, Grove Publishers, New York；Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]。在一個實例中，PEG連接於鉸鏈區中之半胱胺酸。在一個實例中，經PEG修飾的Fab片段具有共價連接於經修飾鉸鏈區中之單一巰基的順丁烯二醯亞胺基。離胺酸殘基可共價連接於順丁烯二醯亞胺基且離胺酸殘基上之各胺基可連接分子量為大約20,000 Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此連接於Fab片段的PEG之總分子量為大約40,000 Da。 特定PEG分子包括經N,N'-雙(甲氧基聚(乙二醇) MW 20,000)修飾的離胺酸之2-[3-(N-順丁烯二醯亞胺基)丙醯胺基]乙基醯胺，亦稱為PEG2MAL40K (可獲自Nektar，以前為Shearwater)。 PEG連接基團之替代來源包括NOF，其供應GL2-400MA3 (其中以下結構中之m為5)及GL2-400MA (其中m為2)且n大約為450：
。 換言之，各PEG為約20,000Da。 因此在一個實施例中，PEG為2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-順丁烯二醯亞胺基-1-側氧基己基)胺基]丙基氧基}己烷(2臂分支鏈PEG，-CH
2
)
3
NHCO(CH
2
)
5
-MAL，Mw 40,000，稱為SUNBRIGHT GL2-400MA3。 其他替代性PEG效應分子具有以下類型：
在一個實施例中提供一種抗體，諸如全長抗體，其經聚乙二醇化(例如使用本文所描述之PEG)，藉由在鏈中之胺基酸226處或約胺基酸226處(例如重鏈之胺基酸226 (按序列編號))的半胱胺酸胺基酸殘基連接。在一個實施例中，PEG連接於SEQ ID NO:101之Cys 226。 在一個實施例中，本發明提供一種Fab-PEG分子，其包含一或多個PEG聚合物，例如1或2個聚合物，諸如40kDa聚合物。 根據本發明之Fab-PEG分子尤其有利，因為其具有獨立於Fc片段的半衰期。 在一個實施例中，提供與諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子的聚合物結合的scFv。 在一個實施例中，抗體或片段結合於澱粉分子，例如以增加半衰期。將澱粉與蛋白質結合之方法如US 8,017,739中所述，其以引用的方式併入本文中。 如本文所採用之報導分子係能夠被偵測到的分子，例如螢光染料、放射性標記或其他可偵測實體。 本發明亦提供一種經分離的DNA序列，其編碼本發明之抗體分子的重鏈及/或輕鏈。適合地，DNA序列編碼本發明之抗體分子之重鏈或輕鏈。本發明之DNA序列可包含合成DNA (例如藉由化學處理產生的)、cDNA、基因體DNA或其任何組合。 編碼本發明之抗體分子的DNA序列可藉由熟習此項技術者所熟知的方法獲得。舉例而言，編碼抗體重鏈及輕鏈之一部分或全部的DNA序列可按需要自確定的DNA序列或根據相應胺基酸序列來合成。 編碼接受體框架序列的DNA對熟習此項技術者而言廣泛可獲得且可容易地根據其已知胺基酸序列合成。 可使用分子生物學之標準技術製備編碼本發明之抗體分子的DNA序列。所期望的DNA序列可使用寡核苷酸合成技術完全或部分合成。適當時可使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction；PCR)技術。 適合DNA序列之實例提供於圖1中。 本發明亦關於一種選殖或表現載體，其包含本發明之一或多個DNA序列。因此，提供一種選殖或表現載體，其包含編碼本發明之抗體的一或多個DNA序列。在一個實施例中，載體包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47中給出的輕鏈DNA序列及/或SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103中給出的重鏈DNA序列。適合地，選殖或表現載體包含兩個DNA序列，該等序列分別編碼本發明之抗體分子之輕鏈及重鏈，較佳SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:61，以及適合信號序列。在一個實例中，載體包含重鏈與輕鏈之間的基因間序列(參見WO03/048208)。 可構築載體之一般方法、轉染方法及培養方法為熟習此項技術者所熟知。就此而言，參考「Current Protocols in Molecular Biology」, 1999, F. M. Ausubel (編), Wiley Interscience, New York及由Cold Spring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。 亦提供一種宿主細胞，其包含一或多個選殖或表現載體，該一或多個選殖或表現載體包含編碼本發明之抗體的一或多個DNA序列。可使用任何適合宿主細胞/載體系統來表現編碼本發明之抗體分子的DNA序列。可使用細菌，例如大腸桿菌及其他微生物系統，或亦可使用真核(例如哺乳動物的)宿主細胞表現系統。適合哺乳動物宿主細胞包括HEK、CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。 本發明亦提供一種用於製造根據本發明之抗體分子的方法，其包含在適合於自編碼本發明之抗體分子的DNA表現蛋白質的條件下培養含有本發明之載體的宿主細胞，且分離抗體分子。 抗體分子可僅包含重鏈或輕鏈多肽，在此情況下轉染宿主細胞僅需要使用重鏈或輕鏈多肽編碼序列。為產生包含重鏈與輕鏈之產物，細胞株可經兩種載體轉染：編碼輕鏈多肽的第一載體及編碼重鏈多肽的第二載體。或者，可使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽的序列。 根據本發明之抗體及片段由宿主細胞以優良水準表現。由此抗體及/或結合片段之特性適合於以商用規模表現。 由此提供一種用於培養宿主細胞且表現抗體或其片段、分離抗體或其片段且視情況將其純化以得到經分離的抗體或片段的方法。在一個實施例中，該方法進一步包含使效應分子與經分離之抗體或片段結合，例如與尤其如本文所述之PEG聚合物結合的步驟。 在一個實施例中，提供一種用於純化抗體(尤其是根據本發明之抗體或片段)之方法，其包含以非結合模式進行陰離子交換層析，使得雜質保留在管柱上且抗體得以溶離。 在一個實施例中，純化採用在TGF-β管柱上之親和捕捉。 在一個實施例中，純化採用汽巴藍(cibacron blue)或類似者來純化白蛋白融合物或結合物分子。 用於該方法的適合離子交換樹脂包括Q.FF樹脂(由GE-Healthcare供應)。步驟可例如在pH約8下進行。 方法可進一步包含採用陽離子交換層析的最初捕捉步驟，例如在約4至5 (諸如4.5)之pH下進行。陽離子交換層析可例如採用諸如CaptoS樹脂或SP瓊脂糖凝膠FF (由GE-Healthcare供應)的樹脂。隨後抗體或片段可自樹脂溶離，採用諸如氯化鈉的離子鹽溶液，例如濃度為200 mM。 因此適當時層析步驟可包括一或多個洗滌步驟。 純化方法亦可包含一或多個過濾步驟，諸如透濾步驟。 由此，在一個實施例中，提供一種經純化之抗TGF-β抗體或片段，例如人類化抗體或片段，尤其是根據本發明之抗體或片段，採用實質上經純化之形式，尤其不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA。 如前述使用的經純化形式意圖指至少90%純度，諸如91、92、93、94、95、96、97、98、99% w/w或更純。 實質上不含內毒素一般意指每毫克抗體產物內毒素含量為1 EU或更低，諸如每毫克產物0.5或0.1 EU。 實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA一般意指每毫克抗體產物宿主細胞蛋白質及/或DNA含量為400 µg或更低，諸如100 µg/mg或更低，尤其適當時20 µg/mg。 本發明亦提供根據本發明的結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體(或包含其之醫藥組合物)用作藥劑。本發明亦提供根據本發明的結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體(或包含其之醫藥組合物)用於治療或預防由TGF-β 1、2及/或3介導的或與TGF-β 1、2及/或3之增加含量相關的病理性病症。 本發明亦提供根據本發明的結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體之用途，其用於製造用於治療或預防由TGF-β 1、2及/或3介導或與TGF-β 1、2及/或3之增加含量相關的病理性病症的藥劑。 本發明亦提供用於治療患有由TGF-β1、2及/或3介導或與TGF-β1、2或3之增加含量相關的病理性病症或處於患該病風險下的人類個體的方法，該方法包含向個體投與有效量之根據本發明之抗體。在本申請案中，由TGF-β 1、2及/或3介導或與TGF-β 1、2及/或3之增加含量相關的病理性病症可為任何適合病症。在一個實施例中，病理性病症係選自由以下組成之群：肺纖維化，諸如特發性肺纖維化；肺高血壓，諸如肺動脈高血壓。 根據本發明之抗體可使用於治療肺病，包括肺動脈高血壓。 根據本發明之抗體可用於治療患有特發性肺纖維化及肺動脈高血壓的患者。 本發明亦提供一種結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體Fab或Fab'片段，其用於藉由吸入投與來治療或預防由TGF-β 1、2或3介導及/或與TGF-β 1、2及/或3之增加含量相關的病理性病症。 本發明亦提供結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體Fab或Fab'片段，其用於製造藉由吸入投與來治療或預防由TGF-β 1、2及/或3介導或與TGF-β 1、2及/或3之增加含量相關的病理性病症的藥劑。 本發明亦提供一種用於治療患有由TGF-β 1、2及/或3介導或與TGF-β 1、2及/或3之增加含量相關的病理性病症或處於患該病風險下的人類個體的方法，該方法包含藉由吸入投與向個體投與有效量之結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的拮抗性抗體Fab或Fab'片段。 適合於藉由吸入投與來治療的病理性病症可為任何由TGF-β 1、2及/或3介導或與TGF-β 1、2及/或3之增加含量相關的肺病，例如選自由以下組成之群的疾病：肺纖維化，諸如特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis；IPF)，例如輕度、中度及/或重度IPF，及囊腫性纖維化及肺高血壓，諸如肺動脈高血壓(pulmonary arterial hypertension；PAH)。在另一實施例中，抗體可用於治療輕度IPF，諸如與肺高血壓、尤其是PAH或不相稱肺高血壓相關的輕度IPF。在一個實施例中，抗體可用於治療患有IPF及肺高血壓，諸如IPF及PAH的患者。在另一實施例中，抗體可用於治療全身性硬化症。在另一實施例中，抗體可用於治療與以下各者中之至少一者相關的全身性硬化症：肺纖維化(SSc-ILD)；肺高血壓，例如結締組織疾病相關的肺高血壓；或IPF及肺高血壓二者。 吸入使用結合人類TGF-β 1、人類TGF-β 2及人類TGF-β 3的抗體與全身性投與抗體相比可藉由局部投與至肺而降低副作用風險。 根據本發明之抗體及片段可用於治療或預防。 本發明之抗體分子亦可用於診斷，例如涉及TGF-β的活體內診斷及疾病狀態成像。 由於本發明之抗體適用於治療及/或預防病理性病況，所以本發明亦提供一種醫藥或診斷組合物，其包含本發明之抗體分子以及醫藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者。因此，提供本發明之抗體在藥劑製造中之用途。組合物通常將作為通常包括醫藥學上可接受之載劑的無菌醫藥組合物之一部分供應。本發明之醫藥組合物可能另外包含醫藥學上可接受的佐劑。 本發明亦提供一種用於製備醫藥或診斷組合物之方法，其包含添加本發明之抗體分子且將其與醫藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者混合在一起。 抗體分子可為醫藥或診斷組合物中之唯一活性成分。或者，抗體可與一或多種其他治療活性成分組合投與，例如同時、依序或分別投與。因此，醫藥或診斷組合物中之抗體分子可伴有其他活性成分，包括其他抗體成分，例如表皮生長因子受體家族(epidermal growth factor receptor；EGFR，HER-2)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptors；VEGFR)、血小板衍生生長因子受體(platelet derived growth factor receptor；PDGFR)抗體，或非抗體成分，諸如伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)、尼歐替尼(nioltinib)、巴蘇替尼(basutinib)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、坦羅莫司(temsirolimus)、範得他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)、克卓替尼(crizotinib)、伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛(romidepsin)、硼替佐米(bortezomib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、帕佐泮尼(pazopanib)、瑞戈非尼(regorafenib)、卡博替尼(cabozantinib)、吡非尼酮(perfenidone)、尼達尼布(nintedanib)、類固醇或其他藥物分子，尤其是半衰期獨立於TGF-β結合的藥物分子。在一特定實施例中，抗體與尼達尼布一起投與(例如)用於治療IPF。 如本文所採用之活性成分係指在相關劑量下具有藥理學作用(諸如治療作用)的成分。 醫藥組合物宜包含治療有效量之本發明抗體。如本文所使用之術語「治療有效量」係指治療、改善或預防靶向疾病或病況或展現可偵測的治療、藥理學或預防效果所需要的治療劑之量。以任何抗體而言，治療有效量最初可在細胞培養分析中或在動物模型中，通常在嚙齒動物、兔、狗、豬或靈長類中估算。動物模型亦可用於確定適當的投藥濃度範圍及途徑。此類資訊隨後可用來確定用於在人類中投藥的適用劑量及途徑。 人類個體之精確治療有效量視疾病狀態之嚴重程度、個體之整體健康、個體之年齡、體重及性別、飲食、投藥之時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之耐受性/反應而定。此量可藉由常規實驗確定且在臨床醫師之判斷力之內。通常，治療有效量為0.01 mg/kg至500 mg/kg，例如0.1 mg/kg至200 mg/kg，諸如100 mg/kg。特定言之，治療有效量介於0.001至100 mg/kg之間。 醫藥組合物可方便地以每劑量含有預定量之本發明活性劑的單位劑型呈現。 根據本發明之抗體之治療劑量在活體內不會顯示明顯毒理學作用或顯示有限的毒理學作用。 組合物可單獨地投與患者或可與其他藥劑、藥物或激素組合投與(例如同時、依序或分別)。 待用於治療各種發炎疾病的抗體可單獨使用或與各種其他抗炎劑組合。 待用於治療各種纖維化疾病的抗體可單獨使用或與各種其他抗纖維化藥劑組合。此類藥劑之實例係吡非尼酮及/或尼達尼布。 本發明抗體分子之投與劑量視待治療的病況之特性、呈現的病況之嚴重程度及視該抗體分子係預防性地使用或用於治療既存病況而定。 給藥頻率應視抗體分子之半衰期及其作用之持續時間而定。若抗體分子具有短半衰期(例如2至10小時)，則可能需要每日給予一或多個劑量。或者，若抗體分子具有長半衰期(例如2至15日)及/或持久的藥效學(pharmacodynamics；PD)概況，則可能僅需要每日一次、每週一次或甚至每1或2個月一次地給藥。 如本文所採用之半衰期意欲指分子在循環中，例如在血清/血漿中之持續時間。 如本文所採用之藥效學係指根據本發明之分子之生物作用的概況且尤其是持續時間。 醫藥學上可接受的載劑自身不應誘導產生對接受組合物的個體有害的抗體且不應有毒。適合載劑可為大的緩慢代謝的巨分子，諸如蛋白質、多肽、脂質體、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物及無活性病毒顆粒。 可使用醫藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽，或有機酸之鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽及苯甲酸鹽。 治療組合物中之醫藥學上可接受的載劑可另外含有液體，諸如水、生理鹽水、丙三醇及乙醇。另外，諸如濕潤劑或乳化劑或pH緩衝物質之輔助物質可存在於此類組合物中。此類載劑使得醫藥組合物能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液，以便患者攝入。 適合的投藥形式包括適合於非經腸投與的形式，例如藉由注射或輸注，例如藉由快速注射或連續輸注。在產品用於注射或輸注的情況下，其可採用於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式且其可含有調配試劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，抗體分子可呈乾燥形式，用於在使用之前用適當無菌液體復原。 本發明之組合物一經調配即可向個體直接投與。待治療之個體可為動物。然而，在一或多個實施例中，組合物經調適用於投與人類個體。 在根據本發明之調配物中，最終調配物之pH不宜與抗體或片段之等電點值相似，例如若調配物之pH為7，則8-9或更高的pI可能係適當的。然而不希望受理論束縛，認為此最終可提供具有提高的穩定性的最終調配物，例如抗體或片段保留在溶液中。 在一個實例中，pH在4.0至7.0範圍內的醫藥調配物包含：1至200 mg/mL根據本發明之抗體、1至100 mM緩衝劑、0.001至1%界面活性劑、a) 10至500 mM穩定劑，b) 10至500 mM穩定劑及5至500 mM張力劑，或c) 5至500 mM張力劑。 本發明之醫藥組合物可藉由多種途徑投與，包括但不限於：經口、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、透皮、經皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、經腸、局部、舌下、陰道內或經直腸途徑。亦可使用無針注射器(hypospray)來投與本發明之醫藥組合物。通常，治療組合物可製備成呈液體溶液或懸浮液形式之可注射劑。亦可製備適合於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。本發明之抗體分子較佳藉由吸入或局部地皮下投與。例如，抗體可鼻內投與或經口投與，諸如藉由吸入。 組合物之直接傳遞一般將藉由皮下、腹膜內、靜脈內或肌內注射達成，或傳遞至組織之間質間隙。組合物亦可投與至病變中。劑量治療可為單劑量時程或多劑量時程。 應瞭解組合物中之活性成分將為抗體分子。因而，其將容易在胃腸道中降解。因此，若組合物藉由使用胃腸道之途徑投與，則組合物將需要含有保護抗體免於降解而一旦自胃腸道吸收則釋放抗體的試劑。 醫藥學上可接受的載劑之充分論述可獲自Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)。 在一個實施例中，調配物作為用於包括吸入在內的局部投與的調配物來提供。 適合的可吸入製劑包括可吸入粉末、含有推進劑氣體的計量氣霧劑或不含推進劑氣體的可吸入溶液(諸如可霧化溶液或懸浮液)。根據本發明之含有活性物質的可吸入粉末可僅由上述活性物質組成或由上述活性物質與生理學上可接受的賦形劑之混合物組成。 此等可吸入粉末可包括單醣(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、雙醣(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖)、寡醣及多醣(例如聚葡萄糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、鹽(例如氯化鈉、碳酸鈣)或此等物質彼此之混合物。適合地使用單醣或雙醣，使用乳糖或葡萄糖，尤其但非排他地採用其水合物形式。 用於在肺中沈積的顆粒要求粒度小於10微米，諸如1-9微米，例如0.1至5 μm，尤其是1至5 μm。活性成分(諸如抗體或片段)之粒度係最重要的，因為認為其與適合於用本發明之抗體或結合片段治療的肺區域中之沈積相關。例如，10 μm或更小、諸如0.1至5 μm、尤其1至5 μm的顆粒更可能沈積在肺之肺泡結構中。 可用於製備可吸入氣霧劑的推進劑氣體為此項技術中已知的。適合的推進劑氣體係選自烴類，諸如正丙烷、正丁烷或異丁烷；及鹵烴類，諸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、環丙烷或環丁烷之氯化及/或氟化衍生物。上述推進劑氣體可獨立地或以其混合物使用。 尤其適合的推進劑氣體係選自TG 11、TG 12、TG 134a及TG 227的鹵化烷衍生物。在上述鹵化烴類中，TG 134a (1,1,1,2-四氟乙烷)及TG 227 (1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物尤其適合。 含有推進劑氣體的可吸入氣霧劑亦可含有其他成分，諸如共溶劑、穩定劑、界面活性劑(surface-active agents；surfactants)、抗氧化劑、潤滑劑及用於調節pH的手段。所有此等成分均為此項技術中已知的。 根據本發明之含有推進劑氣體的可吸入氣霧劑可含有至多5重量%之活性物質。根據本發明之氣霧劑含有例如0.002至5重量%、0.01至3重量%、0.015至2重量%、0.1至2重量%、0.5至2重量%或0.5至1重量%之活性成分。 或者可亦為藉由投與液體溶液或懸浮液調配物向肺部局部投藥，例如採用諸如噴霧器的裝置，例如連接於壓縮機的噴霧器。 在一個實施例中，調配物按用於藉由霧化傳遞的含有單位劑量的離散安瓿提供。 在一個實施例中，抗體以凍乾形式供應，用於復原或替代地作為懸浮液調配物。 本發明之抗體可分散於溶劑中傳遞，例如以溶液或懸浮液之形式。其可懸浮於適合生理溶液，例如生理鹽水或其他藥理學上可接受的溶劑或緩衝溶液中。此項技術中已知的緩衝溶液可每1 ml水含有0.05 mg至0.15 mg乙二胺四乙酸二鈉、8.0 mg至9.0 mg NaCl、0.15 mg至0.25 mg聚山梨醇酯、0.25 mg至0.30 mg無水檸檬酸及0.45 mg至0.55 mg檸檬酸鈉以達成約4.0至5.0之pH。懸浮液可採用例如經凍乾抗體。 治療懸浮液或溶液調配物亦可含有一或多種賦形劑。賦形劑為此項技術中所熟知，且包括緩衝劑(例如，檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑及碳酸氫鹽緩衝劑)、胺基酸、脲、醇、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化鈉、脂質體、甘露醇、山梨醇及甘油。溶液或懸浮液可囊封於脂質體或生物可降解微球體中。調配物通常將採用無菌製造方法以實質上無菌形式提供。 此可包括藉由過濾用於調配物的緩衝溶劑/溶液、將抗體無菌懸浮於無菌緩衝溶劑/溶液中及藉由一般熟習此項技術者所熟悉的方法將調配物分配至無菌容器中來製備及滅菌。 根據本發明之可霧化調配物可例如作為封裝在箔封套中的單次劑量單位(例如密封塑膠容器或小瓶)提供。各小瓶含有在例如2 mL體積之溶劑/溶液緩衝劑中的單位劑量。 認為本文所揭示之抗體適合於經由霧化傳遞。 亦設想本發明之抗體可藉由使用基因療法投與。為達成此目的，將在適合DNA組分之控制下編碼抗體分子之重鏈及輕鏈的DNA序列引入患者中以使得抗體鏈自DNA序列表現且原位組裝。 在一個實施例中，本發明包含抗體或其片段作為用於診斷之試劑的用途，例如結合於報導分子。由此提供經標記的根據本發明之抗體或片段。在一個態樣中提供一種包含根據本發明之抗體或片段的管柱。 由此，提供一種抗TGF-β抗體或片段，其係用作用於如下用途的試劑： 1) TGF-β蛋白質(或其結合片段)之純化 - 與基質結合且用作親和管柱或(作為抗TGF-β之修飾形式)作為沈澱劑(例如作為經過由另一分子識別的結構域修飾的形式，該另一分子可經修飾)，其視情況藉由抗Fc試劑沈澱。 2)細胞上或細胞中之TGF-β之偵測及/或定量，該等細胞係活的或經固定的(活體外細胞或在組織或細胞切片中的細胞)。用於此的用途可包括作為生物標誌物的TGF-β之定量以跟蹤抗TGF-β治療之效果。出於此等目的，候選物可以經修飾形式使用(例如藉由添加另一部分作為基因融合蛋白或化學結合物，諸如添加報導分子，例如用於偵測目的螢光標記物)。 3)由與藉由例示於(1)及(2)中的方式修飾的候選物之結合標記的攜帶TGF-β的細胞之純化或分選。 在本發明之上下文中，包含意謂『包括』。 在技術上合適的情況下，可組合本發明之實施例。 本文中將實施例描述為包含某些特徵/要素。本發明亦擴展至由或主要由該等特徵/要素組成之獨立實施例。 諸如專利及申請案之技術參考文獻以引用之方式併入本文中。 本文中專門及明確引述之任何實施例可單獨或與一或多個其他實施例組合形成免責聲明的基礎。 在以下實例中僅以說明之方式進一步描述本發明： 實例 在以下實例中，分別如圖3b、圖3d及圖3f中所示，使用術語TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3指TGF-β 1、TGF-β 2及TGF-β 3之成熟序列。
實例 1-
B細胞培養上清液之免疫及一級及二級篩檢 藉由在等量弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant；CFA)中劇烈混合乳化，用注射器用混合有250 μg人類TGF-β 2蛋白(圖3d)的250 μg人類TGF-β 1 (圖3b)蛋白對4隻雌性半折耳兔(＞2 kg)進行皮下免疫，給予每隻兔子500 μg之總劑量。使用弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant；IFA)，以21日時間間隔給予兔子加強注射，免疫後第14日自耳朵取血。在投與最終劑量(500 μg)的僅人類TGF-β 2蛋白之前，投與3個劑量的同功異型物1/2混合物。在用經製備且於10% DMSO/FCS中冷凍在‑80℃下的脾、骨髓及末梢血液單核細胞之單細胞懸浮液最終加打14日後終止。 產生的免疫反應藉由ELISA測定。用2 μg/ml於PBS中之人類TGF-β 1蛋白(Peprotech；#100-21C)、0.5 μg/ml於PBS中之人類TGF-β 2蛋白(R&D systems；302-B2-010/CF)或人類TGF-β-3蛋白(R&D systems；243-B3-010/CF)塗佈Nunc-Immuno™ 1 Maxisorp™ 96孔微量滴定盤且在4℃下培育隔夜。在各層之後洗滌培養盤(自動，用PBS+0.05% Tween以4×200ml洗滌)。用在PBS中之1% (w/v)酪蛋白(VWR Chemicals；440203H)在室溫(RT)下培育1小時來阻斷孔。添加在1%酪蛋白中以1/100對數稀釋的血清且在室溫下培育1 ½小時。將在1% (w/v)酪蛋白/PBS中以1/3000稀釋的100 μl山羊抗兔IgG Fc特異性辣根過氧化酶抗體(Jackson；111-036-046)添加至各孔中且在室溫下培育1小時。添加受質，即100 μl TMB (可溶性3,3',5,5' 四甲基聯苯胺)，且用50 μl於dH
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O中之2.5%氟化鈉溶液停止反應。使用ELISA讀取器測定610 nm下的光學密度(Optical densities；OD)。 使用類似於Zubler等人(1985)所述的方法製備B細胞培養物。簡言之，來自經免疫之兔的末梢血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)衍生的B細胞以每孔約5000個細胞的密度在帶條形碼(bar-coded)96孔組織培養盤中、在37℃下在5% CO
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氛圍中培養七日，該等組織培養盤具有200微升/孔的RPMI 1640培養基(Gibco BRL)，該等培養基補充有10% FCS (Sigma Aldrich)、2% HEPES (Sigma Aldrich)、2% L-麩醯胺酸(Gibco BRL)、1%青黴素/鏈黴素溶液(Gibco BRL)、0.1% β-巰基乙醇(Gibco BRL)、0.2% Normocin (Invivogen)、1%活化的人類末梢血液單核細胞(PBMC)上清液及γ輻射突變型EL4鼠類胸腺瘤細胞(5×10
4
個/孔)。用於TGF-β 1結合之一級篩檢： 使用基於螢光的均質結合分析，使用塗有經生物素標記的TGF-β 1 (Peprotech)的Superavidin™珠粒(Bangs Laboratories)，測定B細胞培養上清液中之TGF-β 1蛋白特異性抗體之存在。使用Lightning-Link®生物素標記套組(Innova Biosciences)根據製造商之說明書對TGF-β 1蛋白進行生物素標記。 使用Bravo自動液體處置器(Agilent)，自帶條形碼的96孔組織培養盤轉移10 μl B細胞培養上清液至帶條形碼的384孔黑壁分析盤中，該等384孔分析盤含有固定於珠粒上的TGF-β 1 (10微升/孔)。結合由山羊抗兔IgG Fcg特異性FITC結合物(Jackson ImmunoResearch)顯示。在TTP Labtech mirrorball®偵測系統上讀取培養盤。 在一級篩檢之後，使用Beckman命中揀取機器人(hit-picking robot)將TGF-β 1結合陽性的上清液固結在帶條形碼的96孔母盤(master plate)上且將細胞培養盤中之B細胞冷凍在-80℃下。 用於與TGF-β 1、2及3之結合的二級篩檢： 為測定抗體結合TGF-β之不同同功異型物之能力，在TGF-β之3種不同同功異型物之ELISA分析中篩檢在此等母盤中之B細胞上清液。ELISA分析涉及將PBS中之不同TGF-β同功異型物1、2、3 (Peprotech)以2 μg/ml塗佈至384孔Maxisorp™培養盤(ThermoScientific/Nunc)上。用PBS中之1% BSA阻斷培養盤且隨後與10微升/孔B細胞培養上清液一起培育。向培養盤中添加二級HRP結合的山羊抗兔IgG fc抗體(Jackson ImmunoResearch)，隨後觀測與TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，來自EMD Millipore；10微升/孔)之結合。使用BioTek Synergy 2微定量盤式讀取器，在630 nM下量測光學密度。 一級篩檢及二級篩檢之結果 用僅人類TGF-β 1 (SEQ ID NO:114；圖3b)免疫79隻小鼠、大鼠及兔且針對TGF-β 1與不同含量之陽性TGF-β 1結合子之結合進行篩檢。自此等79隻不同的經免疫大鼠、小鼠及兔動物鑑別到2656個抗人類TGF-β 1結合子。然而，在二級篩檢中此等孔中僅831個顯示與所有三種同功異型物結合。 如上文所描述，4隻兔經人類TGF-β 1及人類TGF-β 2二者免疫。在一級篩檢中分析所有來自此4隻兔的血清且顯示1367個TGF-β1結合陽性孔，且隨後在二級篩檢中篩檢與所有三種TGF-β同功異型物1、2及3的結合，其結果為1026個孔結合TGF-β之所有三種同功異型物。 在一級及二級篩檢之後，展現結合於所有三種同功異型物的B細胞孔隨後進行阻斷活性分析。 使用重組TGF-β 1的HEK-Blue TGF-β報導基因分析 使用HEK-Blue TGF-β細胞(HEK-Blue TGF-β細胞株；Invivogen)進行報導基因分析。HEK-Blue TGF-β細胞株藉由SEAP之表現響應於TGF-β之存在，該SEAP表現由比色偵測試劑偵測。能夠中和TGF-β的抗體將導致報導細胞株中產生的信號減弱。評估測試藥劑中和TGF-β1之能力。 抗體進行3倍滴定或以單一濃度添加且在測試培養基(DMEM，4.5 g/l葡萄糖、10% (v/v)胎牛血清、50 U/ml青黴素、50 μg/ml鏈黴素、100 μg/ml Normoci、2 mM L-麩醯胺酸)中與人類TGF-β同功異型物1、2或3 (50 pg/ml TGF-β同功異型物)一起培育30分鐘，然後添加50,000個HEK-Blue TGF-β細胞，且在37℃下培育16小時。細胞響應於TGF-β之活化產生的SEAP藉由在37℃下添加Quanti Blue (Invivogen)試劑1小時且偵測630 nm下之吸光度來偵測。自含有HEK-Blue TGF-β細胞及TGF-β的孔產生最大信號且使用過量中和TGF-β的抗體產生最小信號。 在單點TGF-β 1報導基因分析中分析含有BSN.4856的B細胞培養上清液(母盤3142，來自孔D012)。抗體顯現80%之TGF-β 1抑制。基於分析盤中之最大及最小信號計算來自濃度響應分析的抑制百分比。
實例 2-
來自B細胞的可變區基因之選殖及表現及在活體外分析中重組Fab活性之表徵 來自實例1中之結合ELISA及阻斷報導基因分析的資料允許選擇用於可變區回收的孔。因為存在異質B細胞群體，所以為了自所關注的孔回收抗體可變區基因，必須進行解迴旋步驟以使得能鑑別指定孔中之抗原特異性B細胞。此係使用螢光灶法(fluorescent foci method)達成(Clargo等人，mAbs第6卷，第1期，2014)。簡言之，將來自陽性孔的分泌免疫球蛋白的B細胞與塗佈有經生物素標記的TGF-β 1的抗生蛋白鏈菌素珠粒(New England Biolabs)及山羊抗兔Fcγ片段特異性FITC結合物(Jackson ImmunoResearch)之1:1200最終稀釋物混合。在37℃下靜態培育1小時之後，由於在該B細胞周圍存在螢光光環，所以可鑑別出抗原特異性B細胞。使用Olympus顯微鏡鑑別到的此等個別B細胞隨後用Eppendorf微操作器挑選且沈積至PCR管中。 使用重鏈及輕鏈可變區特異性引子，藉由逆轉錄(reverse transcription；RT)-PCR自單細胞中回收抗體可變區基因。進行兩輪PCR，且嵌套式2°PCR合併3'及5'端之限制位點，允許可變區選殖至兔Fab無鉸鏈(VH)或兔κ (VL)哺乳動物表現載體中。使用ExpiFectamine™ 293 (Invitrogen)將重鏈及輕鏈構築體共轉染至Expi-293細胞中且重組抗體在1 ml體積之48深孔塊中或在30 mL規模的錐形燒瓶中表現。在表現7日之後，採集未純化的瞬時上清液且再次如實例1中所述藉由ELISA測試結合且在報導基因分析中測試阻斷。在ELISA中確認重組4856兔Fab結合全部3種同功異型物。序列提供於圖1B中。 使用基於小規模真空的純化系統藉由親和捕捉純化所表現的4856兔Fab分子。簡言之，將來自30 ml細胞培養物的上清液進行0.22 μm無菌過濾，之後添加1 ml GammaBind Plus™珠粒(GE Healthcare)。隨後將上清液/珠粒混合物滾拌一小時，之後藉由施加真空移除上清液。用PBS洗滌珠粒，之後用0.1M甘胺酸在pH 2.7下溶離。將經溶離的部分中和且緩衝劑改為PBS，之後進行0.22 μm無菌過濾。最終分析由以下組成：藉由A280測定濃度；藉由SEC-UPLC (BEH200管柱，Waters)測定純度；及藉由PTS-Endosafe™濾筒系統(Charles River)測定內毒素。
實例 3
-在活體外分析中表徵重組兔Fab活性 使用重組TGF-β 1、2及3進行HEK-SEAP-SBE報導基因分析： 隨後在如實例1中所描述的TGF-β報導基因分析中，針對TGF-β1、2及3的10點劑量反應測試(n=2)經純化的兔Fab。以50 pg/ml添加TGF-β同功異型物1、2及3且評估抗體中和TGF-β1、2及3的能力。 使用4參數邏輯擬合法對資料進行擬合(圖4a、圖4b及圖4c)。基於曲線之拐折點計算IC50 (表1)。
表1.經純化之4856兔Fab在HEK-Blue TGF-β (Invivogen)報導基因分析中的IC50值。 經純化之兔Fab 4856分別以0.04、0.01及0.54 nM之IC50抑制TGF-β 1-、TGF-β2-及TGF-β3-驅動的HEK-Blue TGF-β報導基因分析。 內源性TGF-βBxPC3與HEK-Blue TGF-β報導基因共培養分析： 開發一種由Bx-PC3細胞(ATCC)與HEK-Blue TGF-β細胞株(Invivogen)組成的共培養系統。BXPC-3細胞組成性地產生且活化TGF-β。HEK-Blue TGF-β細胞株藉由SEAP之表現響應於活性TGF-β之存在，該SEAP表現由比色偵測試劑偵測。能夠中和TGF-β的抗體將導致報導細胞株中產生的信號減弱。 在含有10% FCS的DMEM中以100000個細胞/孔鋪上HEK-Blue TGF-β細胞且在37℃下培育90分鐘。在含有0.2% (w/v) BSA的無血清DMEM中對測試試劑進行3倍滴定且添加至HEK-Blue TGF-β細胞中。在含有0.2% (w/v) BSA的無血清DMEM中以50000個細胞/孔添加BxPC3細胞且在37℃下培育18小時。自含有BX-PC3及HEK-Blue TGF-β細胞的孔產生最大信號且使用過量中和TGF-β的抗體產生最小信號。藉由在37℃下添加QuantiBlue試劑1小時且量測在630 nm下之吸光度來偵測SEAP。 在BxPC3-HEK-Blue TGF-β報導基因共培養分析中分析經純化的4856兔Fab (n=3)。基於分析中之最大及最小信號計算來自濃度響應分析的抑制百分比且使用4參數邏輯擬合法擬合資料(圖5)。基於曲線之拐折點計算IC50 (表2)。 表2.4856兔Fab在BxPC3-HEK-Blue TGF-β報導基因共培養分析中之效能結果。4856兔Fab之五個不同樣品各自在三個獨立實驗中測試。
BSN.4856.rbFab以3.7 nM之IC50抑制BxPC3-HEK-Blue TGF-β報導基因共培養分析。 4856兔Fab之親和力 使用Biacore™ T200 (GE Healthcare)藉由表面電漿子共振測定4856兔Fab對TGF-β同功異型物1、2及3之親和力。 (分別)經由在流槽2、3及4上的胺偶聯化學將TGF-β同功異型物1、2及3 (Peprotech)固定在CM5 Series S晶片上至約150RU之程度。使用HBS-EP緩衝液(pH 7.4的10 mM HEPES、0.15M NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20；GE Healthcare)作為操作緩衝液。在呈各種濃度(200 nM至12.5 nM)的所有三種同功異型物上以30 μL/min之流動速率滴定4856兔Fab。表面經2×10 μL 10 mM HCl之注射液以10 μL/min之流動速率再生。 在標準程序之後使用Biacore™ T200評估軟體(1.0版)分析背景扣除結合曲線。使用RI=0的『異質配體擬合(heterogeneous ligand fitting)』算法測定4856兔Fab之動力參數。動力參數概括於表3中。 認為TGFβ之各同功異型物經由離胺酸殘基固定於Biacore™感測器晶片上已遮擋抗體對一個結合域之結合且產生二級弱相互作用(KD1)。已擬合資料至異質模型以考量兩個獨立結合事件。認為較高的親和力分量(KD2)代表非遮擋相互作用且因此係測試抗體之最具代表性的親和力量測。
表 3.
使用Biacore親和力分析測定的4856兔Fab之親和力，各組n=5。
實例 4- 抗體 4856 之嵌合及人類化移植物之產生
基於抗體Fab 4856在HEK-Blue™-SBE報導基因分析及BxPC3-HEK-Blue™-SBE報導基因共培養分析二者中之極佳抑制活性以及其以高親和力結合TGF-β之所有三種同功異型物之能力，選擇抗體Fab 4856用於進一步最佳化。 嵌合抗體4856 將抗體4856之可變區選殖至單獨的重鏈及輕鏈表現載體中且表現為人類Fab (無鉸鏈)片段。 將VH基因(SEQ ID NO:17)選殖至載體pMhFab-HIS
6
中，其含有編碼人類γ-1 CH1恆定區(G1m17異型(allotype))的DNA，具有截短鉸鏈及六個組胺酸殘基之C端標記物 將VL基因(κ)(SEQ ID NO:13)選殖至載體pMhCK中，其含有編碼人類κ恆定區(K1m3異型)的DNA。 抗體藉由重鏈及輕鏈載體短暫性共轉染至Expi293F™細胞中得以表現。 人類化抗體4856 藉由將來自兔抗體V區的CDR移植至人類生殖系抗體V區框架上以使抗體4856人類化。 為恢復抗體活性，來自兔V區之多個框架殘基亦保留在人類化序列中。使用Adair等人(1991)(Humanised antibodies. WO91/09967)概述之方案選擇此等殘基。兔抗體(供體)V區序列與人類生殖系(接受體)V區序列的比對以及所設計的人類化序列顯示於圖2a及圖2b中。 除了使用Chothia/Kabat組合定義的CDRH1 (參見Adair等人，同前文獻)之外，自供體序列移植至接受體序列的CDR如由Kabat等人(同前文獻)所定義。 藉由DNA 2.0 Inc.之自動化合成方法，設計且構築編碼多個變異體重鏈及輕鏈V區序列的基因。重鏈及輕鏈V區之其他變異體藉由寡核苷酸引導的突變誘發修飾VH及VK基因來形成，在一些情況下包括CDR內用於改變潛在天冬胺酸異構化位點的突變。 將此等基因選殖至多個載體中以使得能在大腸桿菌及哺乳動物細胞中表現人類化4856 Fab抗體。評估變異體鏈及其組合相對於親本抗體之效能、其生物物理學特性及對後續加工的適合性，促成gL3輕鏈移植物及gH13重鏈移植物之選擇。 選擇人類V區IGKV1-5加JK4 J區(圖1I，亦可獲自IMGT®，www.imgt.org，2016年1月05日最後存取)作為用於抗體4856輕鏈CDR之接受體。移植物gL3中之輕鏈框架殘基全部來自人類生殖系基因，但殘基1、2、3及71 (Kabat編號)除外，其中分別保留了供體殘基丙胺酸(A1)、酪胺酸(Y2)、天冬胺酸(D3)及酪胺酸(Y71)。殘基A1、Y2、D3及Y71之保留係人類化抗體之完全效能所必需的。 選擇人類V區IGHV3-21加JH5 J區(圖1I，亦可獲自IMGT®，www.imgt.org，2016年1月05日最後存取)作為用於抗體4856之重鏈CDR之接受體。與許多兔抗體相同，抗體4856之VH基因比所選人類接受體短。與人類接受體序列比對時，抗體4856之VH區的框架1缺乏人類化抗體中所保留的N端殘基(圖2b)。4856兔VH區中之框架3亦缺乏位於β片股D與E之間之環中的兩個殘基(75及76)：在移植物gH13中，間隙填充有來自所選人類接受體序列的相應殘基(離胺酸75，K75；天冬醯胺76，N76) (圖2b)。移植物gH13、gH23及gH29中的重鏈框架殘基皆來自人類生殖系基因，但殘基48、49、73及78 (Kabat編號)除外，其中分別保留了供體殘基異白胺酸(I48)、甘胺酸(G49)、絲胺酸(S73)及纈胺酸(V78)。殘基E1、V2、Q3、I48、G49、S73及V78之保留係人類化抗體之完全效能所必需的。 移植物gH20中之框架殘基皆來自人類生殖系基因，但殘基48、69、71、73及78 (Kabat編號)除外，其中分別保留了供體殘基異白胺酸(I48)、甲硫胺酸(M69)、離胺酸(K71)、絲胺酸(S73)及纈胺酸(V78)。 移植物gH13、gH20、gH23及gH29之CDRH3中的殘基98由甘胺酸(G98)突變成丙胺酸(A98)殘基，由此自gH13、gH20、gH23及gH29序列中移除了潛在天冬胺酸異構化位點。 在殘基N100e及G100f處之潛在天冬醯胺脫醯胺位點在gH23移植物中藉由使G100f突變成A100f來移除且在gH29移植物中藉由使N100e突變成D100e來移除(圖2b)。 人類化4856 Fab之表現 構築初始4856 Fab片段且作為哺乳動物表現載體進行測試。為達成最高產率，改變移植物之密碼子用法以適合大腸桿菌周質表現。將移植物與歷來給予持續高產率的先前人類化Fab比對且改變相應密碼子以匹配框架序列。 關於人類化4856 Fab在大腸桿菌中之表現，將人類化重鏈V區基因(SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:96)及輕鏈V區基因(SEQ ID NO:40)選殖至UCB表現載體pTTOD中，該表現載體pTTOD含有編碼人類C-κ恆定區(K1m3異型)及人類γ-1 CH1區(G1m17異型)的DNA。因為發現此等伴隨蛋白之共表現可提高在分批饋入醱酵(batch-fed fermentation)期間人類化Fab在大腸桿菌菌株MXE016中之產率，所以亦將大腸桿菌fkpA及dsbC基因引入表現質體中，使用IPTG誘導Fab表現。4856 Fab輕鏈及重鏈及FkpA及DsbC多肽皆在IPTG誘導性tac啟動子之控制下自單個多順反子表現。 使用5ml自動誘導方法測試Fab在產大腸桿菌菌株MXE016中之表現。FkpA及DsbC伴隨蛋白之組合實質上增加了所獲得的Fab之產率。 關於人類化4856 Fab在哺乳動物細胞中之表現，連接人類化輕鏈V區基因與編碼人類C-κ恆定區(K1m3異型)的DNA序列，產生相鄰輕鏈基因(SEQ ID NO:41)。連接人類化重鏈V區基因與編碼人類γ-1 CH1區(G1m17異型)的DNA序列，產生相鄰重鏈基因(SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:97)。將重鏈及輕鏈基因選殖至哺乳動物表現載體pMXE692 Cellca載體DGV 4856 gL3 gH13 VL VH中。 大腸桿菌衍生的4856 Fab gL3gH13之Biacore親和力測定 對根據以上所述的方法在大腸桿菌中產生的抗體4856 gL3gH13進行對TGF-β同功異型物1、2及3之親和力測試，其使用Biacore T200 (GE Healthcare)藉由表面電漿子共振測定。(分別)經由在流槽2、3及4上的胺偶聯化學將人類TGF-β同功異型物1、2及3 (Peprotech)固定在CM5 Series S晶片上至約20RU之程度。使用HBS-EP緩衝液(pH 7.4的10 mM HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20；GE Healthcare)作為操作緩衝液。在呈各種濃度(200 nM至1.56 nM)之所有三種同功異型物上以30 μL/min之流動速率滴定抗體4856 gL3gH13Fab。表面經2×10 μL 10 mM HCl之注射液以10 μL/min之流動速率再生。 在標準程序之後使用T200評估軟體(1.0版；GE Healthcare)分析背景扣除結合曲線。如實例3中所描述，使用RI=0的異質擬合算法測定動力參數，且值提供於表4中。正如前文在表3中的兔版Fab一樣，認為表4之KD2代表抗體4856 gL3gH13Fab之非遮擋結合值。
表 4
：使用Biacore親和力分析測定的4856人類化Fab之親和力，各組n=4。
進行分析型凝膠過濾以確定抗體移植物4856 gL3gH13是否結合包括潛伏相關肽在內的TGF-β 1之全長序列。資料顯示抗體4856 gL3gH13不結合包括潛伏相關肽在內的全長TGF-β 1 (資料未示出)。
實例 5- 人類化移植物之活體外抑制活性
在使用重組TGF-β 1、2及3的HEK-Blue TGF-β報導基因分析中之抑制活性： 如實例1中所描述，在HEK-Blue TGF-β報導基因分析中，使用重組TGF-β 1、2及3，針對TGF-β 1、2及3的10點劑量反應，分析4856人類化移植物gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29之抑制活性。以50 pg/ml添加TGF-β同功異型物1、2及3且評估抗體中和TGF-β 1、2及3之能力。使用4參數邏輯擬合法擬合資料。基於曲線之拐折點計算IC50 (表5)。自表5可看出，人類化移植物，尤其是gL3gH13及gL3gH20，在中和TGF-β 1、2及3活性方面係有效的。
表 5 ：
外源性TGF-β同功異型物1、2及3之抑制。
在內源性TGF-β BxPC3與HEK-Blue TGF-β報導基因共培養分析中之抑制活性： 如實例3中所描述，在BxPC3與HEK-Blue TGF-β報導基因共培養分析中分析4856人類化移植物gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29之抑制活性。基於分析中之最大及最小信號計算來自濃度響應分析的抑制百分比且使用4參數邏輯擬合法擬合資料。基於曲線之拐折點計算IC50且結果展示於表6中。自表6可看出，在此分析中，人類化移植物，尤其是gL3gH13、gL3gH20及gL3gH29，在中和由細胞表現及活化之TGF-β方面係有效的。
表 6 ：
在與HEK-Blue TGF-β細胞之共培養分析中由BxPC3細胞表現的TGF-β之抑制。
實例 6- 在阿德力黴素誘導的腎臟纖維化活體外模型中人類化 4856 移植物之抑制活性
阿德力黴素誘導的腎病變係經過良好表徵的嚙齒動物之後天性腎臟纖維化模型，其具有與人類腎小球硬化及小管間質性纖維化相似的病理性特徵。腎小球系膜細胞係響應於阿德力黴素的纖維化表型中所涉及的主要細胞類型之一。已建立纖維化響應於阿德力黴素處理的人類活體外模型且評估此系統中抗體4856 Fab之中和TGF-β的移植物gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29調節胞外基質(extracellular matrix；ECM)組分之沈積的能力。 在10 nM阿德力黴素及測試4856 Fab移植物gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29及對照Fab (在0.2至6000 nM範圍內的3倍連續稀釋液)存在下，以1.6×10
4
個細胞/平方公分塗鋪初級人類腎小球系膜細胞(human renal mesangial cells；HRMC，Innoprot)。在37℃下於5% CO
2
中培育細胞6日，隨後在0.25M NH
4
OH/25 mM Tris中裂解(在37℃下30 min)且將經沈積的ECM固定在冰冷甲醇中(在-20℃下30 min)。在對纖維結合蛋白(結合AlexaFluor488的Ebioscience 53-9869-82)、膠原蛋白I及III (Millipore兔多株抗體AB745及AB747)及膠原蛋白IV型(結合Efluor660的Ebioscience 50-9871-80)免疫染色之後，藉由高內涵成像(high content imaging)偵測個別ECM組分之沈積。獲得影像且藉由Cellomics Arrayscan偵測螢光強度。自含有在不存在Fab的情況下經阿德力黴素處理的細胞的孔產生最大信號且自細胞未曝露於阿德力黴素的孔獲得最小信號。 基於分析中之最大及最小螢光強度計算來自濃度響應分析的抑制百分比且使用4參數邏輯擬合法擬合資料。所示影像及曲線圖代表三個複製實驗。 圖6顯示HRMC響應於10 nM阿德力黴素且在指定濃度之中和TGF-β的4856 Fab移植物gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29或對照Fab之存在下的ECM沈積的代表性影像。 圖7顯示在阿德力黴素活體外分析中4856 Fab移植物gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29之代表性濃度響應曲線。 四個所測試的中和TGF-β的Fab移植物均抑制阿德力黴素誘導的HRMC之ECM沈積(表7)。
表 7 ：
在阿德力黴素誘導的腎臟纖維化模型中4856 Fab移植物gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29對ECM沈積之抑制(來自3個複製實驗的幾何平均值)。
注意，一些曲線之上部及下部漸近線固定在最小值或最大值。
實例 7- 在人類肺間質性纖維化之活體外模型中人類化 4856 移植物之抑制活性
上皮損傷及纖維母細胞活化係在纖維化過程期間引起ECM積聚的關鍵事件。為建立肺間質性纖維化之活體外模型，使用自IPF患者分離的初級人類小呼吸道上皮細胞(SAEpC；ATCC)及肺纖維母細胞(ATCC)進行分析。此兩個細胞類型在上皮細胞培養基中之共培養即使不存在額外刺激都可引發顯著ECM沈積，使抗纖維化藥劑之研究得以進行。 每平方公分塗鋪1.8×10
4
個初級人類小呼吸道上皮細胞(SAEpC)及相等數目之IPF肺纖維母細胞(總共3.6×10
4
個細胞/平方公分)且在37℃下於5% CO
2
中共培養7日。在0.03至1000 nM範圍內3倍滴定4856 Fab移植物gL3gH13及對照Fab。在7日共培養之後，使用Presto Blue評估細胞存活率，隨後將細胞在0.25M NH
4
OH/25 mM Tris中裂解(在37℃下，30 min)且將沈積的ECM固定在冰冷甲醇中(在-20℃下30 min)。在對纖維結合蛋白及膠原蛋白I、III、IV及V型進行免疫染色之後，藉由高內涵成像偵測個別ECM組分之沈積。獲得影像且藉由Cellomics Arrayscan偵測螢光強度。未經處理的共培養產生最大信號且使用過量Fab產生最小信號。 基於分析中之最大及最小信號計算來自濃度響應分析的抑制百分比且使用4參數邏輯擬合法擬合資料。基於曲線之拐折點計算IC50。所示影像及曲線圖代表三個複製實驗。 圖8顯示在指定濃度之4856 Fab移植物gL3gH13及對照Fab存在下藉由SAEpC與IPF纖維母細胞共培養的ECM沈積的影像。 圖9顯示在人類肺共培養分析中4856 Fab移植物gL3gH13及對照Fab之濃度響應曲線。
表 7
顯示在肺共培養分析中藉由4856 Fab移植物gL3gH13抑制ECM沈積的效能結果(來自3個複製實驗的幾何平均值)。
在SAEpC與IPF纖維母細胞之共培養中藉由4856 Fab移植物gL3gH13抑制ECM沈積。
實例 8 - 在人類腎臟纖維化之活體外模型中人類化 4856 移植物之抑制活性
使用胞外基質(ECM)積聚分析，基於經TGF-β 1、2或3刺激的人類腎近端小管上皮細胞(RPTEC)單培養及人類腎近端小管上皮細胞(RPTEC)與人類腎纖維母細胞(HRF)之共培養(無刺激)，評估4856 Fab gL3gH13抑制人類初級腎臟細胞中之纖維結合蛋白及膠原蛋白沈積的能力。 在384孔黑色透明底培養盤(Corning)上，在最終體積50 μL的腎上皮細胞基底培養基+0.5% Fcs及補充劑(ATCC)中，在0.1至100 μg/mL (0.2-2000 nM)抗TGF-β抗體(gL3gH13 Fab)或對照Fab及用於RPTEC之單培養的10 ng/ml TGF-β1 (Peprotech)、TGF-β2(R&D)或TGF-β3 (R&D)或無用於RPTEC與HRF之共培養的外源性TGF-β(無刺激)之存在下，以2,000個細胞/孔接種人類腎近端小管上皮細胞(RPTEC，Innoprot)及人類腎纖維母細胞(HRF，InnoProt)(共培養比率1:1)。 在37℃下於5% CO
2
中培育7日之後，將細胞在PBS中洗滌且用20 μl 0.25 M NH
4
OH/25 mM Tris在37℃下裂解15 min。將基質在PBS中洗滌3次，在-20℃下在40 μl 100%甲醇中固定30 min且在PBS中洗滌3次，之後使用抗纖維結合蛋白(eBiosciences)、抗膠原蛋白I (Millipore)、抗膠原蛋白III (Millipore)、抗膠原蛋白IV (eBiosciences)及抗膠原蛋白V (Abcam)抗體進行染色。在Cellomics Arrayscan HC讀取器上使用3通道協定在「Cellomics CellHealth」概況分析生物應用程式(profiling bioapplication)及10倍物鏡(新X1相機)下以2×2格化儲存(1104×1104像素/視野)掃描培養盤。 儘管膠原蛋白IV讀出產生了資料，但是由於不可接受的分析視窗及可變性，結果已被排除。 結果展示於表9及圖10a、圖10b、圖10c及圖10d以及圖11a及圖11b中，其顯示gL3gH13 Fab能夠抑制RPTEC單培養系統中TGF-β 1、2及3誘導的纖維結合蛋白及膠原蛋白I、III及V之積聚及RPTEC與HRF共培養系統中由內源性地產生的TGF-β誘導的積聚。
表 9
：gL3gH13之IC50及幾何平均IC50 (nM)(N=3)：
實例 9- 鼠肺纖維化之活體內模型
i)7日攻擊 急性博萊黴素誘導的肺損傷模型涉及向小鼠之肺直接局部投與糖肽博萊黴素。此誘導與纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1；PAI-1)之增加相關的發炎反應且最終引起肺纖維化。PAI-1係由TGF-β轉錄調節且可充當誘導發炎性細胞之募集及胞外基質(ECM)之沈積的強效纖維發生介體(Ghosh及Vaughan, 2012, J Cell Physiol, 227: 493-507)。 對測試抗TGF-β Fab限制纖維發生的任何作用(諸如PAI-1抑制)提供了直接傳遞至肺的泛特異性抗TGF-β阻斷Fab係用於人類之肺纖維化的可行治療的支持證據。 將4856 Fab移植物(人類化)經由鼻內(i.n)途徑直接局部投與至小鼠之肺。在博萊黴素攻擊(o.p；每小鼠0.05U)前1小時及6小時後，將4856gL3gH13或4856gL3gH29投與C57/BL6小鼠(i.n；每小鼠200 μg)。小鼠隨後每12小時接受4856gL3gH13或4856gL3gH29 (i.n；每小鼠200μg)直至其在第7日被處死。緊接在處死之後收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveloar lavage fluid；BAL)且藉由ELISA測定總PAI-1濃度。藉由單因子變異數分析(one-way ANOVA)對比經博萊黴素處理的對照組進行統計分析。 兩個4856Fab (4856gL3gH13及4856gL3gH29)之此投與結果展示於圖12中。圖12說明，與經生理鹽水攻擊的對照小鼠相比，經博萊黴素攻擊的小鼠之BAL中之PAI-1含量極大地提高，且當直接傳遞至肺時，人類化Fab 4856gL3gH13及4856gL3gH29對博萊黴素誘導的PAI-1之抑制能夠分別達49%及64%。 在第二研究中，在博萊黴素攻擊(o.p；每小鼠0.05U)前1小時及6小時後，向C57/BL6小鼠投與人類化4856gL3gH13 (i.n；每小鼠20、60、200 μg)。小鼠隨後每12小時接受4856gL3gH13直至其在第7日被處死。緊接在處死之後收集BAL且藉由ELISA測定總PAI-1濃度。藉由單因子變異數分析對比經博萊黴素處理的對照組進行統計分析。*p≤0.05，** p≤0.005，***p≤0.0005，****p≤0.00005。 為顯示4856gL3gH13在此系統中之優良功效，圖13繪示不同劑量的4856gL3gH13對博萊黴素誘導的PAI-1的影響。如先前所顯示，博萊黴素誘導BAL PAI-1含量增加，其可使用每小鼠200 μg (i.n) 4856gL3gH13顯著抑制至多76%且使用每小鼠60 μg i.n 4856gL3gH13顯著抑制至多45%。 此說明局部傳遞(i.n)的4856gL3gH13顯著抑制急性博萊黴素誘導的PAI-1，且可能局部抑制肺中之TGF-β，潛在地避免不想要的全身性事件。 ii)28日攻擊 博萊黴素攻擊之較久的長期作用引起肺纖維化，且因而在小鼠中進行28日的相似研究：用鼠類化4856gL3gH13(下文稱作4856)自第1日起預防性給藥以及自博萊黴素攻擊第13日起給藥。4856之此較晚投與使得在治療開始之前肺中之纖維化變得更充分確立。 藉由肺中之ECM沈積及肌纖維母細胞分化之減弱來評估4856對博萊黴素誘導的肺纖維化之影響。在石蠟包埋的肺組織中藉由使用天狼星紅(Picro Sirius Red；PSR)對膠原蛋白染色來組織學測定ECM沈積。此得到經消化肺組織中之羥脯胺酸含量之較定量分析的支持。羥脯胺酸係膠原蛋白之主要組分且可用於估計組織中之膠原蛋白之量。此外，對α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin；α-SMA)使用免疫組織化學(immunohistochemical；IHC)染色來測定肌纖維母細胞的數目，即被視為引起肺中膠原蛋白沈積的主要細胞類型。此外，亦藉由IHC測定磷酸化母親DPP同源物2及3 (phosphorylated-Mothers against decapentaplegic homolog 2 and 3；p-Smad2/3)之抑制以說明4856對TGFβ信號傳導路徑之特異性抑制。全部統計資料係使用針對指定博萊黴素攻擊的對照組的非成對t檢定測定。*p=0.05；**p=0.01；***p=0.001；****p=0.0001。 a)4856改善肺中博萊黴素誘導的膠原蛋白沈積
4856 治療第 1 - 28 日
小鼠(雄性c57BL/6；每組n=8)經生理鹽水(i.t，50 μL)或博萊黴素(i.t，50 μL；0.5 mg/mL)處理28日。此外，自第1-28日每日兩次用媒劑(i.n，25 μL)或4856 (i.n，25 μL；每小鼠400 μg)處理小鼠。
4856 治療第 13 - 28 日
小鼠(雄性c57BL/6；每組n=8)經生理鹽水(i.t，50 μL)或博萊黴素(i.t，50 μL；0.5 mg/mL)處理12日或28日。此外，自第13-28日每日兩次用媒劑(i.n，25 μL)或4856 (i.n，25 μL；每小鼠400 μg)處理小鼠。
分析
將整個左葉固定在4%福馬林(formalin)中6 h且包埋於石蠟中。切割出5 μm切片且用PSR染色。使用Nikon Eclipse 80i顯微鏡(Nikon，Badhoevedorp，Netherlands)擷取影像且使用ImageJ (V. 1.42q，National Institutes of Health，USA)以每小鼠最少四個視野分析纖維化區域。經由羥脯胺酸分析測定右肺之三個下葉(奇葉(azygous lobe)、心葉及膈葉)中膠原蛋白的量。在120℃下在6 M HCl中消化三小時後，用6 M NaOH調節樣品之pH至6。之後，將0.06 M氯胺T添加至各樣品中且在室溫下培育20 min。接下來，添加3.15 M過氯酸及20%對二甲基胺基苯甲醛且將樣品在60℃下再培育20 min。用Spectra MAX 190微定量盤式分光光度計在557 nm下測定吸光度。
結果
與i.t滴入生理鹽水(0.9% NaCl，博萊黴素之溶劑)處理的對照小鼠相比，使用微噴霧器氣管內(i.t)滴入博萊黴素(50μL；0.5mg/mL)可誘導顯著肺纖維化。此由增強的PSR染色及肺中提高的羥脯胺酸含量說明(圖14及圖15)。此外，此等纖維化改變在28日後比在12日後明顯(圖15)，表明纖維化之嚴重程度隨時間進展。 第1-28日用4856處理(25 μL i.n；每小鼠400 μg；每日兩次)引起PSR顯著減少(圖14A)及肺中之羥脯胺酸含量顯著減少(圖14B)。此表明4856可防止博萊黴素誘導的肺纖維化。此外，當與經媒劑處理的小鼠相比時，在第28日觀測到，第13-28日向經博萊黴素攻擊的小鼠投與4856顯著限制PSR (圖15A)及羥脯胺酸(圖15B)之進展性增加。 此表明當纖維化已明顯之後給予4856能夠限制疾病之進展。 b)4856改善肺中博萊黴素誘導的肌纖維母細胞分化 小鼠(雄性c57BL/6；每組n=8)經生理鹽水(i.t，50 μL)或博萊黴素(i.t，50 μL；0.5 mg/mL)處理12日或28日。此外，第1-28日或第13-28日每日兩次用媒劑(i.n，25 μL)或4856 (i.n，25 μL；每小鼠400 μg)處理小鼠。由α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)之表現表徵肌纖維母細胞。藉由與單株抗αSMA抗體(純系1A4，Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)一起培育來偵測α-SMA陽性的纖維母細胞。該表現使用辣根過氧化酶標記的二級抗體及3,3-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride；DAB)(Sigma-Aldrich)顯現。單株小鼠IgG抗體(Calbiochem，San Diego，CA，USA)用於同型對照。每小鼠評估四個不同視野。 投與博萊黴素亦誘導肺中肌纖維母細胞分化增加，其藉由IHC由α-SMA之表現表徵(圖16)。圖16A展示肺中博萊黴素誘導的肌纖維母細胞分化藉由在第1-28日i.n投與4856而受到抑制。另外，儘管第12日與第28日之博萊黴素處理之間α-SMA表現不顯著增加，但是在第13-28日投與4856亦引起肌纖維母細胞分化之顯著減弱。此外，此降低至低於單獨博萊黴素處理12日之後觀測到的α-SMA表現量，表明此時纖維化過程可能逆轉(圖16B)。 c)4856抑制肺中博萊黴素誘導的TGF-β信號傳導。 小鼠(雄性c57BL/6；每組n=8)經生理鹽水(i.t，50 μL)或博萊黴素(i.t，50 μL；0.5 mg/mL)處理12日或28日。此外，第1-28日或第13-28日每日兩次用媒劑(i.n，25 μL)或4856 (i.n，25 μL；每小鼠400 μg)處理小鼠。用山羊抗pSmad2/3抗體(Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany)及I型膠原蛋白抗體(Abcam，Cambridge，UK)對肺切片染色。使用結合HRP的抗體或Alexa Fluor抗體(Life Technologies，Darmstadt，Germany)作為二級抗體。不相關同型匹配抗體充當對照。使用DAPI (Santa Cruz Biotechnology)對細胞核染色。使用Nikon Eclipse 80i顯微鏡(Nikon，Badhoevedorp，Netherlands)觀測染色。每小鼠在三個不同視野中評估pSmad2/3在1型膠原蛋白陽性細胞中之表現。 與經生理鹽水處理之對照相比，博萊黴素誘導的肺纖維化與pSmad2/3在1型膠原蛋白陽性細胞中之表現在第12日增加且在第28日更大程度地增加有關(圖17B)。第1-28日(圖17A)及第13-28日(圖17B)用4856處理顯著抑制pSmad2/3表現至低於經生理鹽水處理的對照小鼠之pSmad2/3表現，表明TGFβ依賴性Smad2/3磷酸化完全由4856阻斷。此外，第13-28日給予之4856可逆轉在博萊黴素加媒劑攻擊12日後觀測到的博萊黴素誘導的pSmad2/3表現之增加，其與在肌纖維母細胞分化方面看到的作用相關。 d)總結 在鼠之博萊黴素誘導的肺纖維化模型中4856發揮強效抗纖維化作用且改善在膠原蛋白沈積(PSR染色)、膠原蛋白積聚(羥脯胺酸分析)、肌纖維母細胞分化(α-SMA表現)及典型TGF-β信號傳導之活化(pSmad2/3表現)方面的組織學改變。此外，在第1-28日預防性給予或在第13-28日在纖維化改變已明顯之後作為干預給予時，4856皆證明有效。此支持以下假定：可能局部抑制肺中之TGFβ，潛在地避免不想要的全身性事件。
實例 10- 人類化 4856 Fab 移植物之生物物理學分析
對抗體4856之人類化移植物：gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23、gL3gH29進行一系列生物化學及生物物理學分析以為發展及投藥穩定性篩檢且選擇最穩固的分子。分析包括特徵對比，諸如T
m
(在展開中點時的熔融溫度)；實驗pI及在氣-液界面之聚集穩定性(模擬製造時的剪應力及噴霧穩定性)；及脫醯胺傾向。 熱穩定性量測(T
m
) 進行基於螢光的熱偏移分析(亦稱作熱螢光分析)以獲得T
m
(在展開中點時的溫度)，從而評估經純化分子之熱穩定性。反應混合物含有5 μl自5000×儲備溶液經PBS稀釋的30× SYPRO®橙色染料(Invitrogen)及45 μl 0.12 mgml
- 1
樣品(於PBS中，pH 7.4)。將10 μ1混合物一式四份分配於384 PCR光學孔盤中且在7900HT快速即時PCR系統(Applied Biosystems)上運作。PCR系統加熱裝置設定在20℃至99℃，升溫速率為1.1℃ min
-1
。電荷耦合裝置監測孔中之螢光改變。繪製強度增加曲線，斜率之拐折點用於產生T
m
。 藉由熱螢光分析測定T
m
(在展開中點時的溫度)。在此方法中，使用SYPRO橙色(螢光染料)藉由與隨逐漸升溫而曝露的疏水區之結合來監測展開過程。較高的T
m
值相當於針對發展性及霧化應力較大的分子穩定性及穩固性。 如所預期，所有分子均觀測到一個等效於Fab展開域的展開域。結果概括在表10中。 有可能基於分子之熔融溫度對分子評級：顯示gL3gH13具有最高熔融溫度，在HC CDR3(gL3gH29)中N109G經D109G取代引起熔融溫度降低2℃且gL3gH23及gL3gH20二者之熔融溫度均顯示進一步降低2℃。gL3gH13具有最高熔融溫度79℃，使其成為用於經由霧化局部傳遞至肺的極佳候選物，其中在霧化之後Fab必須保持足夠的生物活性。
表 10 ：
T
m
分析：熱螢光分析：gL3gH13＞gL3gH29＞gL3gH20=gL3gH23
實驗pI及電荷變量之分析 使用全毛細管成像的cIEF ICE3系統(ProteinSimple)分析經純化樣品。藉由混合以下來製備樣品：30 μl樣品(來自HPLC級水中之1 mg/ml儲備液)、35 μl 1%甲基纖維素溶液(Protein Simple)、4μl pH3-10兩性電解質(Pharmalyte)、0.5 μl 4.65合成pI標誌物及0.5μl 9.77合成pI標誌物(ProteinSimple)、12.5 μl 8M脲溶液(Sigma-Aldrich)。使用HPLC級水將最終體積補足至100 μl。將混合物簡單渦旋以確保完全混合且在分析前以10,000 rpm離心3分鐘以移除氣泡。將樣品在1.5 kV下聚焦1 min，隨後在3 kV下5 min，且使用ProteinSimple軟體獲取毛細管之A
280
影像。所得電泳圖首先使用iCE3軟體分析且給pI值賦值(p
I
標誌物之間的線性關係)。經校準的電泳圖隨後使用Empower軟體(Waters)整合。 所有主要候選物之pI均係高的(參見表11)，因此在預期調配物pH下分子不大可能具有約零之總分子電荷(其中存在增高的聚集風險)。發現所有分子之實驗pI相似且因此無法將其區分。
表 11 ：
實驗pI
在氣-液界面之聚集傾向 將在PBS pH 7.4中1mg ml
- 1
的經純化樣品(3×250 μl等分試樣)在25℃下在1.5 ml離心管(eppendorf)中使用Eppendorf Mixmate以1400 rpm渦旋。在渦旋後之各個時間點藉由使用分光光度計(Varian)獲得在595 nm處之吸收來分析樣品之濁度產生。繪製資料相對於時間的曲線。 所有主要候選物藉由渦旋經受應力以提供關於在氣-液界面處之聚集穩定性的資訊。此用於模擬在製造期間的剪切以及在霧化期間的潛在穩定性。藉由長達144小時的在595 nm下之濁度量測來監測聚集穩定性。觀測到移植物之間的聚集速率減緩(低吸光度值)且無差異。 脫醯胺狀態Asn(N)109之分析(重鏈CDR3)。 在gL3gH13、gL3gH20(均為N109G)及gL3gH23 (N109A)之重鏈CDR3中存在脫醯胺基元。在此位點的化學不穩定性可導致產物異質性及免疫原性。移植物gL3gH29在此位點具有D109G(脫醯胺產物)以測試作為候選物之適合性同時最小化脫醯胺之風險。 在純化後立即藉由以下測定在gL3gH13、gL3gH20及gL3gH23之重鏈CDR3中在N109上之基本脫醯胺百分比：(i)胰蛋白酶消化/肽定位/質譜及(ii)毛細管成像等電聚焦(capillary imaged isoelectric focussing；ICE3)。藉由使三個分子經受已知會增進脫醯胺的加速應力條件(pH 8，37℃)來測定N109位點脫醯胺(失去氨；產生酸性物種)之速率/傾向。 (i)質譜 將等分試樣(50 μg)用DTT還原，用碘乙醯胺烷基化，隨後在室溫下用胰蛋白酶(1:20w/w)消化隔夜。藉由注入經0.2%甲酸/水平衡的C18管柱(1×150 mm BEH-300)來分析分解物(約2 μg)。將所得肽用乙腈梯度以20微升/分鐘溶離至以正離子(+ve-ion)模式操作的Thermo Fusion質譜儀中。資料相關的擷取(Data dependent acquisition；DDA)由軌道阱全掃描(120000解析度)、隨後是HCD片段化及強度最大之前驅體的離子阱量測組成。MS資料使用Thermo Pepfinder來分析，將所擷取的光譜與預測的抗體序列進行匹配。 在gL3gH13及gL3gH20中在位點N109G(重鏈CDR3)處的脫醯胺(氨損失)之百分比基本程度相似(約4%)，然而，在gL3gH23之N109A未發現脫醯胺。 在加速應力(在4℃及37℃、pH 8下2週)之後，任何Fab移植物之脫醯胺程度無變化(表12)。 總之，N109G經N109A取代導致gL3gH23具有潛在較低的脫醯胺風險。然而，因為所有分子之基本程度均低且在加速應力後無增加傾向，所以所有分子均具有就治療候選物而言適合的脫醯胺程度。
表 12
：在加速應力之前及之後的脫醯胺百分比(pH8)。
(ii)毛細管成像等電聚焦(ICE3) 關於pI量測，如上文所描述進行ICE3，且結果顯示在加速應力之前及之後，在gL3gH13、gL3gH20、gL3gH23及gL3gH29移植物之間，帶電物種百分比無顯著差異(pH 8)。
實例 11- 人類化 4856 Fab 移植物 gL3gH13 之霧化研究
藉由霧化Fab 4856移植物gL3gH13 (下文稱為4856)發揮的對剪應力的聚集穩定性利用研究用PARIeFlow®噴霧器(PARI Pharma GmBh，Grafeling，Germany)測定。大腸桿菌在經稀釋至標稱濃度20 mg/mL、5 0mg/mL及80 mg/mL的pH 6.0緩衝液及經稀釋至標稱濃度20 mg/mL及50 mg/mL的pH 7.4緩衝液中以約100 mg/mL表現Fab 4856。 使用eFlow®噴霧器霧化不同濃度的4856樣品之預過濾的/無菌樣品(約1.0 mL)及緩衝液 (i)霧化對濃度之影響 使用Varian Cary 50-Bio UV/Vis分光光度計量測經稀釋樣品(在280 nm下＜1AU)。使用消光係數1.72AU (280 nm，1 mg/mL，及1 cm路徑長度)計算濃度。 觀測到霧化前與霧化後樣品之濃度(mg/mL)無差異。 (ii)尺寸排阻HPLC (SEC HPLC) 此分析監測可溶性聚集物及片段化物質之產生。 將樣品稀釋至1 mg/mL (25 μL注入體積)或5 mg/mL (20 μL注入體積)。使用連接至Agilent 1100系統的TSK G3000SW (7.7 mm I.D×30.0cm)管柱進行分析，使用0.2 M磷酸鈉pH 7在30℃下以1.0 mL/min等度(isocratically)溶離17分鐘。在280 nm處監測到峰值。 觀測到霧化前與霧化後物質中存在的高分子量物種(high molecular weight species；HMW)之百分比無差異。因此霧化不引起可溶性聚集物之產生。無任何低分子量物質之證據，因為未觀測到由霧化導致的片段化。 (iii)動態光散射(dynamic light scattering；DLS) 此分析監測大分子量物種之產生(應藉由SEC HPLC管柱基質過濾的不可溶顆粒性物質)。使用Malvern Nano ZS儀器藉由動態光散射測試在包含組胺酸及氯化鈉的pH 6.0的緩衝液中之Fab 4856。 觀測到高達50 mg/mL的4856之強度粒徑分佈曲線(size distribution profile；SDP)之主峰強度(%)在霧化前樣品與霧化後樣品中無差異。關於多分散性百分比(percent poly-dispersity；PD%)，強度分佈加大了較大分子量物質之權重(散射與分子量之平方成比例)，且當此轉化為描述所存在的多個物種之相對比例的體積分佈時，高達50 mg/mL時觀測到極小的不顯著的改變。 (iv) SDS PAGE (非還原及還原條件) 此分析監測在包含組胺酸及NaCl的pH 6.0的緩衝液中之聚集/片段化之產生。 對於非還原條件，將10 μL 1 mg/mL的樣品與10 μL Tris/甘胺酸SDS樣品緩衝液(2×，Invitrogen)及2μL 100 mM的N-乙基順丁烯二醯亞胺混合；在100℃下加熱2分鐘。 對於還原條件，將10 μL 1 mg/mL的樣品與10 μL Tris/甘胺酸SDS樣品緩衝液(2×，Invitrogen)及2μL DTT (10×，Invitrogen)混合；在100℃下加熱3分鐘。 在離心之後，將10μL (4.5 μg)各樣品裝載在Novex Tris/甘胺酸(4-20%)凝膠(Invitrogen)上且以125 mV (恆定電壓)電泳100分鐘。藉由考馬斯藍(Coomassie Blue)顯現譜帶。 觀測到在高達20 mg/mL的霧化前樣品與霧化後樣品之間無差異。 (vi)功能性活體外分析 此分析在pH 6.0的組胺酸、20、50及80 mg/mL之NaCl中進行。 如實例3中所述，使用重組TGF-β 1進行HEK-Blue TGF-β報導基因分析。 觀測到任何濃度的霧化前樣品與霧化後樣品的IC50無顯著差異。 (v)在呼吸模擬中經霧化抗體之氣霧劑表徵 此分析使用PARI eFlow®噴霧器監測濃度為50 mg/mL (pH 6.0)的Fab 4856之液滴尺寸以及所傳遞的劑量及霧化時間。簡言之，將噴霧器連接於竇泵(sinus pump)且在吸氣收集濾紙上收集含有經霧化物質的氣霧劑液滴。使用成年人呼吸模式，潮氣量500 ml，每分鐘15次呼吸，且吸入:呼出比為50:50。完成後，洗滌所收集之濾紙以提取經霧化物質，其藉由HPLC分析(表13)。
表 13.
使用兩個不同噴霧器頭之呼吸模擬實驗之資料。
藉由呼吸模擬實驗測定所傳遞的劑量(Delivered Dose；DD)。DD [%]係68% (2.9 μm MMD)及64% (3.7 μm MMD)，因為DD值極少超過70%，所以判定其為典型優良結果。殘餘物為14% (2.9 μm MMD)及21.9% (3.7 μm MMD)，其亦在典型範圍內。＜5μm (RD＜5μm)的可吸入的劑量為63% (2.9 μm MMD)對比50% (3.7 μm MMD)。粒徑影響向呼吸路徑之不同區域之傳遞，且RD＜5μm對應於肺泡傳遞。 此等資料證實4856 Fab對於藉由霧化傳遞之適合性。
實例 12- X 射線結晶 結構
將抗體4856用TGF-β 1結晶以測定抗體所接觸的胺基酸殘基。 i)樣品製備 藉由添加30 μl 2M Tris pH8，將5 mM HCl中之2 ml 2.25mg/ml的成熟TGF-β 1調節至pH7。在室溫下培育1小時之後，藉由離心移除沈澱物，留下2 ml的2.1 mg/ml。向其中添加0.46 ml 32 mg/ml的Fab4856gL3gH13 (14.7 mg)，TGF-β 1:Fab之近似莫耳比為1:1.1。將此在室溫下放置1小時，隨後裝載至在50 mM NaCl、25 mM Tris、5%甘油pH 7.5中預平衡的S200 16/160管柱上。合併複合物之溶離份且濃縮至10 mg/ml用於結晶學。 ii)結晶
使用可購自Qiagen的各種條件(約2000個條件)進行篩檢。藉由Formulatrix RockImager 1000進行培育及成像(總培育期21日)。 iii)資料收集及結構改進
圖18A及18B展示與4856gL3gH13 Fab相互作用的TGF-β 1殘基。4856gL3gH13 Fab在與受體結合區重疊的區域中結合表明藉由4856gL3gH13 Fab的受體阻斷係藉由競爭的，抗TGF-β 1因優良親和力而有效。亦測試在輕鏈(SEQ ID NO:45之位置5)中含有天冬醯胺取代蘇胺酸的4856gL3H13之變異體，且發現其不引起結構上之變化。 相似地，用TGF-β 2 (SEQ ID NO:116)結晶抗體4856之單鏈抗體形式(scFv 4856，SEQ ID NO:108)以測定抗體所接觸的胺基酸殘基。圖18C展示與scFv 4856相互作用的TGF-β 2殘基，顯示在與TGF-β 1之Fab結合所示相同的區域中的結合。
