TW201719170A - 專一性結合人類雙埃柯病毒ｖｐ０次單元之抗體的用途 - Google Patents

Abstract

一種專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係應用於檢測第4型人類雙埃柯病毒；其中，係於體外使一抗體與一檢體反應，以辨識該檢體中所含有之第4型人類雙埃柯病毒，該抗體係為以一免疫抗原所誘發形成，該免疫抗原具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。

Description

專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途

本發明係關於一種抗體的用途，特別係一種專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途。

人類雙埃柯病毒(Human Parechovirus，簡稱HPeV)之感染會引起呼吸道、腸胃道的感染疾病，甚至會誘發無菌性腦膜炎、心肌炎、腦炎、急性無力肢體麻痺症、新生兒敗血症等嚴重的併發症，目前已知有第1~16等不同的病毒型，而第4型人類雙埃柯病毒係為全球感染盛行率位居前幾的病毒種類，除了呼吸道、腸胃道的感染疾病外，第4型人類雙埃柯病毒還會造成包括發燒，TORCH症候群及淋巴結炎等症狀。習用第4型人類雙埃柯病毒之檢測方法卻僅能夠使用一廣用型腸病毒抗體(anti-pan-EV)，惟該廣用型腸病毒抗體不僅可以辨識第4型人類雙埃柯病毒，更可以同時辨識他種微小RNA科的腸道病毒，故，受限於該習用抗體專一性不足之問題，使醫者無法於第一時間獲取正確的病毒資訊，而難以提供適當的治療方針。

再者，第二種習用第4型人類雙埃柯病毒之檢測方法則係藉由PCR基因增幅及基因定序來檢測，惟此一習用第4型人類雙埃柯病毒的檢測方法不僅步驟繁雜，且花費昂貴，不利進行大規模篩檢，故仍有必要提供一種專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體，以專一性檢測第4型人類雙埃柯病毒。

本發明係提供一種專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係可以專一性檢測第4型人類雙埃柯病毒者。

本發明再提供一種專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係適用於第4型人類雙埃柯病毒之大規模篩檢者。

本發明之一種專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係應用於檢測第4型人類雙埃柯病毒；其中，係於體外使一抗體與一檢體反應，以檢測該檢體中所含有之第4型人類雙埃柯病毒，該抗體係專一性結合人類雙埃柯病毒之VP0次單元，且該抗體係為以一免疫抗原所誘發形成，該免疫抗原具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，如此可以藉由該抗體專一地檢測第4型人類雙埃柯病毒。

本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，使該抗體與該檢體反應係包含：將該檢體與一病毒增殖細胞株共培養，以獲得一複感染細胞株；及使該抗體與該複感染細胞株進行交互作用，如此可以放大病毒含量，因而可以應用於病毒含量尚少的檢體之中。

本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，該檢體係為一喉頭拭檢體、一直腸拭檢體、一糞便檢體或一血液檢體。

本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，另包含：係於使該抗體與該檢體反應後，以一二次抗體偵測該抗體及該檢體之反應物，藉由該二次抗體可以結合該抗體及該檢體之反應物，進一步放大該抗體及該檢體之反應物的訊號，以提升檢測之精準度。

本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，係以一酵素鍵結二次抗體或一螢光鍵結二次抗體偵測該抗體 及該檢體之反應物，以利用該酵素鍵結二次抗體或該螢光鍵結二次抗體而可以直接藉由偵測吸光值或螢光訊號來得知該抗體及該檢體之反應物的訊號。

本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，該二次抗體係結合一磁珠或一瓊脂小球，以利用磁力分離法或離心分離法而可以分離該抗體及該檢體之反應物。

本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係藉由該抗體可以專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元，如此可以避免該抗體辨識他種微小RNA科病毒，提升該抗體之辨識率，進而可以提供醫者正確的病毒資訊，使醫者可以於第一時間對症下藥，防止嚴重的併發症的衍生，為本發明之功效。

本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係藉由該抗體可以與人類雙埃柯病毒VP0次單元專一性結合，可以應用於各種免疫診斷法，因而適合於大規模篩檢，為本發明之功效。

第1a圖：第B0組細胞之免疫螢光染色結果。

第1b圖：第B1組細胞之免疫螢光染色結果。

第1c圖：第B2組細胞之免疫螢光染色結果。

第1d圖：第B3組細胞之免疫螢光染色結果。

第1e圖：第B4組細胞之免疫螢光染色結果。

第1f圖：第B5組細胞之免疫螢光染色結果。

第1g圖：第B6組細胞之免疫螢光染色結果。

第1h圖：第B7組細胞之免疫螢光染色結果。

第1i圖：第B8組細胞之免疫螢光染色結果。

第1j圖：第B9組細胞之免疫螢光染色結果。

第1k圖：第B10組細胞之免疫螢光染色結果。

第2圖：第C組檢體之免疫螢光染色結果。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係藉由可以專一性結合雙埃柯病毒VP0次單元之一抗體的特性，而可以於體外辨識一檢體所含有之第4型人類雙埃柯病毒，如此可以有效檢測該檢體是否受到第4型人類雙埃柯病毒之感染。

詳而言之，該抗體係為以一免疫抗原所誘發形成，該免疫抗原具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。舉例而言，該免疫抗原可以為一合成胜肽，且係經過修飾，以有效誘發該抗體之形成，於本實施例中，係合成具有如SEQ ID NO：2之胺基酸序列的合成胜肽，以藉由位於C端之半胱胺酸(cystein)的硫醇基(-SH官能基)與一卵蛋白(ovalbumin，簡稱OVA)進行共價連結(conjugation)，使該免疫抗原得以表現於該卵蛋白之表面，且由於位於C端之卵蛋白不具有抗原性，如此可以有效製備出專一性高、靈敏度高，且可以專一性辨識如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列的抗體(單專一性抗體，monospecific Ab)。

此外，該檢體可以為第4型人類雙埃柯病毒感染宿主時，於宿主體內增殖的過程中可以存在之組織，舉例而言，由於第4型人類雙埃柯病毒主要係感染人類之呼吸道，故該檢體係可以為喉頭拭檢體，而第4型人類雙埃柯病毒擴大感染時，則可能衍生腸胃炎或病毒血症，此時則可以選用直腸拭檢體、糞便檢體或血液檢體作為該檢體。

該抗體係可以於體外與該檢體進行反應，且針對病毒含量不 足之檢體，可以先將該檢體與一病毒增殖細胞株共培養，使該檢體所含有之病毒可以感染該病毒增殖細胞株，如此即可以獲得具有大量病毒之複感染細胞株，續使該抗體及該複感染細胞株進行交互作用，以檢測該複感染細胞株是否受到第4型人類雙埃柯病毒之感染，進而可以據此得知該檢體是否受到第4型人類雙埃柯病毒之感染。舉例而言，可以將該檢體浸泡於一運送培養基(transport medium)，使該檢體所含有之病毒可以釋出於該運送培養基，以獲得一病毒收集液，將該病毒收集液通過0.45μm之過濾膜，續與該病毒增殖細胞株共培養，即可以獲得該複感染細胞株。

值得注意的是，該病毒增殖細胞株係可以依據該檢體之來源而選擇不同類型的細胞株，舉例而言，於本實施例中，該檢體係為喉頭拭檢體，且該病毒增殖細胞株則選擇為人類肺癌上皮細胞株A549(購自台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，編號為BCRC 60074)，該檢體為糞便檢體時，則可以選擇犬腎細胞株MDCK(購自台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，編號為BCRC 60004)作為該病毒增殖細胞株，而該檢體為血液檢體時，另可以選擇非洲綠猴腎細胞株Vero(購自台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，編號為BCRC 60013)作為該病毒增殖細胞株。此外，該檢體與該病毒增殖細胞株共培養的條件則可以依據各種細胞株之狀態而做調整，於本實施例中，係於37℃、5%之二氧化碳的環境中培養24小時，即可以獲得該複感染細胞株。

據此，該抗體係可以於體外與該檢體進行反應，並與該檢體所含有之病毒的VP0蛋白次單元共同形成一複合物，因而藉由偵測該複合物，即可以得知該檢體是否受到第4型人類雙埃柯病毒之感染。是以，該抗體可以搭配各種免疫診斷法(immunodiagnostic method)，以辨識該檢體中所含有之第4型人類雙埃柯病毒，舉例而言，該免疫診斷法可以為酶聯 免疫吸附分析法(ELISA)、免疫螢光染色法(immunofluorescence assay)、西方墨點法(Western blot)、免疫擴散法(immunodiffusion assay)、免疫電泳法(immunoelectrophorsis assay)、磁性免疫分析法(magnetic immunoassay)、免疫沉澱法(immunoprecipitation assay)。

詳而言之，係可以藉由一二次抗體偵測該抗體及該檢體之反應物(其中包含該抗體與病毒之VP0蛋白次單元所共同形成的複合物)，該二次抗體係可以為一酵素鍵結二次抗體(enzyme-conjugated second antibody)，以藉由該酵素鍵結二次抗體與該複合物結合後即可以產生酵素活性之特性，利用偵測該酵素活性來評估該複合物的含量；該二次抗體亦可以為一螢光鍵結二次抗體(fluorescence-conjugated second antibody)，如此當該螢光鍵結二次抗體結合於該複合物後，即能夠於顯微鏡下觀測到所產生之螢光；又或者，該二次抗體另可以結合於一磁珠或一瓊脂小球，如此即可以利用磁性或離心法進一步分離結合該複合物之二次抗體；惟前述二次抗體之態樣僅為舉例而已，並不以此為限。

據此，該抗體即可以於體外專一地檢測該檢體是否受到第4型人類雙埃柯病毒之感染，且不易受到他種微小RNA科病毒的影響而產生偽陽性訊號。

為證實本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途確實可以於體外專一地檢測第4型人類雙埃柯病毒，遂進行以下試驗：

(A)抗體之製備

於本試驗中，係以具有如SEQ ID NO：2之胺基酸序列的合成胜肽作為該免疫抗原，並分別形成一初免疫疫苗及一加強疫苗後，依照第2表所示之免疫期程，以腹腔注射之方式對一紐西蘭大白兔(12周齡，購自行政院農委會，編號為10114Y)進行免疫。其中，該初免疫疫苗係將 0.5mg之免疫抗原溶於100μL之DMSO，續與100μL之完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，購自Sigma)混合後形成；該加強疫苗則係將0.5mg之免疫抗原溶於100μL之DMSO，續與100μL之不完全佐劑(Freund’s imcomplete adjuvant，購自Sigma)混合後形成。

於完成第2表所示之免疫期程後7天(即，第108天)，取20mL之血清，以胜肽親和性管柱層析法(peptide specific affinity chromatography)純化(管柱上吸附有如SEQ ID NO：1之合成胜肽)，以獲得該抗體，經測試，該抗體之免疫效價為1：1,000~27,000。

(B)抗體之專一性測試

本試驗係使如第3表所示之微小RNA病毒株(病毒感染效價MOI=1)與A549細胞分別進行共培養，於24小時後去除細胞培養液， 再以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)進行固定，利用0.5%之Triton X-100破壞細胞膜，續以0.5%之脫脂牛奶阻斷抗原背景值，並加入如前述之抗體(稀釋比例1：500)進行一次抗體的染色，最終以螢光鍵結二次抗體(Alexa fluor 488 conjugated anti-rabbit IgG，稀釋倍數1：1000)進行染色，即可以利用倒立螢光顯微鏡觀察並拍照。

請參照第1a~1k圖所示，該抗體確實可以專一性辨識第4型人類雙埃柯病毒，且無法辨識他種微小RNA科病毒。

(C)臨床檢體之測試

另取已經藉由習用第4型人類雙埃柯病毒之檢測方法(PCR基因增幅、基因定序)確認包含第4型人類雙埃柯病毒之檢體(喉頭拭檢體)，依前述方法進行染色，其結果如第2圖所示，證實該抗體確實可以有 效辨識臨床檢體中之第4型人類雙埃柯病毒。

綜合上述，本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係藉由該抗體可以專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元，如此可以避免該抗體辨識他種微小RNA科病毒，提升該抗體之辨識率，進而可以提供醫者正確的病毒資訊，使醫者可以於第一時間對症下藥，防止嚴重的併發症的衍生，為本發明之功效。

再者，本發明之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係藉由該抗體可以與人類雙埃柯病毒VP0次單元專一性結合，可以應用於各種免疫診斷法，因而適合於大規模篩檢，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 高雄榮民總醫院

<120> 專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途

<130> PK14241

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Human parechovirus 4(第4型人類雙埃柯病毒)

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用以進行OVA共價鍵結之序列

<400> 2

Claims (6)

1. 一種專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，係應用於檢測第4型人類雙埃柯病毒；其中，係於體外使一抗體與一檢體反應，以辨識該檢體中所含有之第4型人類雙埃柯病毒，該抗體係專一性結合人類雙埃柯病毒之VP0次單元，且該抗體係為以一免疫抗原所誘發形成，該免疫抗原具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，使該抗體與該檢體反應係包含：將該檢體與一病毒增殖細胞株共培養，以獲得一複感染細胞株；及使該抗體與該複感染細胞株進行交互作用。
3. 如申請專利範圍第1項所述之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，該檢體係為一喉頭拭檢體、一直腸拭檢體、一糞便檢體或一血液檢體。
4. 如申請專利範圍第1項所述之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，另包含：係於使該抗體與該檢體反應後，以一二次抗體偵測該抗體及該檢體之反應物。
5. 如申請專利範圍第4項所述之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，係以一酵素鍵結二次抗體或一螢光鍵結二次抗體偵測該抗體及該檢體之反應物。
6. 如申請專利範圍第4項所述之專一性結合人類雙埃柯病毒VP0次單元之抗體的用途，其中，該二次抗體係結合一磁珠或一瓊脂小球。