TW201704263A - 新穎之噬菌體呈現庫、其成員及其用途 - Google Patents

新穎之噬菌體呈現庫、其成員及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明係關於其中可產生針對其目標具有較大特異性及效力之經改善之人類抗體的庫(特定言之，噬菌體呈現庫)；且係關於產生此人類抗體之方法。特定言之，本發明係關於可獲自此庫之對抗挑戰性目標之人類抗體，且該抗體具有長度為至少18個胺基酸之HCDR3。

Description

新穎之噬菌體呈現庫、其成員及其用途
本發明係關於其中可產生針對其目標具有較大特異性及效力之經改善之人類抗體之庫(特定言之，噬菌體呈現庫)；且係關於產生此人類抗體之方法。特定言之，本發明係關於針對挑戰性目標之人類抗體。
此項技術中熟知噬菌體呈現技術，且其揭示(例如)於McCafferty等人，Nature 348(1990)：552-554(以引用之方式併入本文中)及WO 1993/11236(以引用之方式併入本文中)中。然而，此項技術中亦知曉針對特定目標產生功能性人類抗體(即，以高特異性及/或效力結合之抗體)呈現某種挑戰(參見Hutchings等人(2010)MAbs 2(6)：594-606；Wilkinson等人(2015)J Biomol Screen 20(4)：454-467及Smith(2015)J Biomol Screen 20(4)：437-453；其等中之各者以引用之方式併入本文中)。據認為此挑戰性目標較習知可溶性目標及簡單受體更難針對其產生功能性抗體。挑戰性目標包括(例如)膜主體蛋白(諸如離子通道、運輸蛋白、G-蛋白偶合之受體或GPCR)及病毒蛋白(諸如病毒殼蛋白)。
針對此目標自習知庫(諸如噬菌體呈現庫)中產生功能性人類抗體可涉及篩選數萬種可能之抗體，以找出二或三種可能之具有適當功能性之抗體。此顯然呈現時間及其他資源之顯著投資。目前，在當前全 世界針對人類用途批准之抗體(大於30種)中，僅一種係針對GPCR(莫加木珠單抗(mogamulizumab)，日本批准之抗-CCR4 mAb)，僅一種(帕利珠單抗(palivizumab))係針對病毒目標且無抗體針對離子通道或運輸蛋白。
需要結合至此挑戰性目標之功能性抗體。需要經改善之庫，其等需要較少篩選來獲得此等抗體。需要產生此等抗體之經改善之方法，其等可以較低資源密集性之方式進行。
本發明藉由提供呈現人類scFv之噬菌體庫來滿足上文需求中之一或多者，其中藉由該庫呈現之至少50%之人類scFv可變重鏈CDR3(CDR H3)之長度為至少18個胺基酸。
長度為至少18個胺基酸之藉由該庫呈現之人類scFv可變重鏈CDR H3之比例可為至少60%。長度為至少18個胺基酸之藉由該庫呈現之人類scFv可變重鏈CDR H3之比例可為至少70%。長度為至少18個胺基酸之藉由該庫呈現之人類scFv可變重鏈CDR H3之比例可為至少80%。長度為至少18個胺基酸之藉由該庫呈現之人類scFv可變重鏈CDR H3之比例可為至少90%。
藉由本發明之庫呈現之較佳CDR H3可變重鏈之長度為至少18個胺基酸。該CDR H3可變重鏈之長度可為18至30個胺基酸。該CDR H3可變重鏈之長度可為20至30個胺基酸。該CDR H3可變重鏈之長度可為20至24個胺基酸。如下文陳述，藉由本發明示例之本發明之CDR H3可變重鏈之長度為20至24個胺基酸。
已知組成特定CDR之胺基酸之定義可取決於使用之方法而變化，例如，根據Kabat定義之CDR相較於根據IMGT定義之CDR可包含不同數量之胺基酸。除非另有明確指示，否則本文陳述之胺基酸長度係如藉由Kabat編號定義。
習知人類抗體具有長度平均為約12至13個胺基酸之重鏈CDR H3，且圍繞該平均值呈常態分佈。然而，此項技術中已知具有較長環圈重鏈CDR H3之人類抗體，且其等尤其揭示於Spindler等人(PLOS Pathogens(2014)，第10卷，第10期，e1004377)、Burton等人(PNAS(2005)，第102卷，第42期，14943-14948)、Corti及Lanzavecchia(Annu.Rev.Immunol(2013)31：705-742)、Whittle等人(PNAS(2011)，第108卷，第34期，14216-14221)及Collis等人(J.Mol.Biol.(2003)325,337-354)中，其等中之各者以引用之方式併入本文中。Collis等人確定人類CDR H3之(常態分佈)平均長度為10至12個胺基酸，排除當目標為病毒之外，該平均人類CDR H3之長度為約16個胺基酸。
不受任何理論之束縛，本發明者提出相較於習知抗體具有較長CDR H3之人類抗體將更可能對含有(例如)孔、疏水性袋或峽谷結構之特定目標具有高特異性及/或效力。因此，本發明者已嘗試自現存噬菌體呈現庫中獲得此等抗體，該等噬菌體呈現庫諸如彼等描述於Vaughan等人(1996)及Lloyd等人(2009)中者，但已發現此受到以下事實之限制：此等庫呈現不超過5%之具有20個胺基酸或更大之長度之人類CDR H3。因此，本發明者已產生一種新穎庫，其中由該庫所呈現之大部分人類CDR H3之長度為至少18個胺基酸。
該庫最初係產自具有長度為至少18個胺基酸之CDR H3之抗體之人類生殖細胞序列。該庫可產生自任何已知之此抗體之人類生殖細胞序列，該抗體包括上文引用之參考文獻中揭示之長CDR H3抗體。該庫可產生自含有長度為至少18個胺基酸之CDR H3之抗-FPR1抗體之人類生殖細胞序列。該人類抗-FPR1抗體可含有長度為24個胺基酸之CDR H3。該人類抗-FPR1抗體係FPR0165，如描述於Douthwaite等人(MAbs(2015)7(1)：152-166；以引用之方式併入本文中)中。
本發明者提出產生自本發明之庫之人類抗體將更可能結合至並 功能上影響困難或挑戰性的目標抗原(例如，拮抗或催動其等)。因此，本發明提供本發明之庫產生針對挑戰性目標之功能性人類抗體(即，具有高特異性及/或效力之人類抗體)之用途。本發明進一步提供產生將結合至挑戰性目標之人類抗體之方法，該方法包括自本發明之庫中離對該目標具有特異性之人類抗體之步驟。使用噬菌體呈現庫來獲得抗體係一般技術者之例行公事。下文例示一樣本協定。
此項技術中已知抗體之挑戰性目標且其等包括膜主體蛋白(諸如離子通道、運輸蛋白、GPCR)及病毒殼蛋白(其等經常於其等結構中具有疏水性峽谷)。因此，產生自本發明之庫之人類抗體對膜蛋白具有特異性。產生自本發明之庫之人類抗體對離子通道具有特異性。產生自本發明之庫之人類抗體對運輸蛋白具有特異性。產生自本發明之庫之人類抗體對GPCR具有特異性。產生自本發明之庫之人類抗體對病毒殼蛋白具有特異性。
本發明進一步提供具有長度為至少18個胺基酸之CDR H3之人類抗體。本發明之人類抗體可獲自本發明之庫。因此，該人類抗體可藉由如上文定義之本發明之用途或方法獲得。該CDR H3之長度可為18至30個胺基酸。該CDR H3之長度可為20至30個胺基酸。該CDR H3之長度可為20至24個胺基酸。本發明之人類抗體可結合至如上文定義之挑戰性目標。本發明之人類抗體不具有如揭示於以下任一者中之CDR H3序列：Spindler等人(PLOS Pathogens(2014)第10卷，第10期，e1004377)、Burton等人(PNAS(2005)第102卷，第42期，14943-14948)、Corti與Lanzavecchia(Annu.Rev.Immunol(2013)31：705-742)、Whittle等人(PNAS(2011)第108卷，第34期，14216至14221)及Collis等人(J.Mol.Biol.(2003)325,337-354)。
本發明之人類抗體可為促效劑或拮抗劑。本發明之人類抗體針對其目標具有小於50nM之效力(IC50)。本發明之人類抗體針對其目 標具有小於20nM之效力(IC50)。本發明之人類抗體針對其目標具有小於10nM之效力(IC50)。
本發明之人類抗體可為單株抗體。為避免疑義，術語「抗體」明確包括此等抗原結合片段。因此，本發明之人類抗體可為其抗原結合片段，諸如Fab、Fab’、F(ab)2、Fv或scFv。
本發明者已分析具有長度為20至24個胺基酸之CDR H3之本發明之人類抗體之胺基酸組合物。結果陳述於下表。
因此，基於該等表內提供之資訊，顯而易見本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為20個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V
位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I
位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I
位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I
位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、 A、M、F、L、V、I
位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置11：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置12：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置13：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G
位置14：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A
位置15：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V
位置16：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L
位置17：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置18：選自由下列組成之列表：P、M、F、L
位置19：D
位置20：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I
或者，基於該等表內提供之資訊，顯而易見本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為21個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V
位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I
位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I
位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I
位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I
位置10：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I
位置11：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置12：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置13：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置14：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G
位置15：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A
位置16：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V
位置17：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L
位置18：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置19：選自由下列組成之列表：P、M、F、L
位置20：D
位置21：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I
或者，基於該等表內提供之資訊，顯而易見本發明之庫或人類抗體之CDR H3長度可為22個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V
位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I
位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I
位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I
位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、 G、A、F、L、V、I
位置11：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I
位置12：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置13：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置14：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置15：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G
位置16：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A
位置17：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V
位置18：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L
位置19：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置20：選自由下列組成之列表：P、M、F、L
位置21：D
位置22：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I
或者，基於該等表內提供之資訊，顯而易見本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為23個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V
位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I
位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I
位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I
位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I
位置10：選自由下列組成之列表：R、D、Q、P、Y、W、S、T、G、A
位置11：選自由下列組成之列表：K、Q、E、H、Y、W、S、T、G、A、F、L、I
位置12：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I
位置13：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置14：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置15：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置16：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G
位置17：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A
位置18：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V
位置19：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L
位置20：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置21：選自由下列組成之列表：P、M、F、L
位置22：D
位置23：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I
或者，基於該等表內提供之資訊，顯而易見本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為24個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V
位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I
位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I
位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、 G、F、V、I
位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I
位置11：選自由下列組成之列表：R、D、Q、P、Y、W、S、T、G、A
位置12：選自由下列組成之列表：K、Q、E、H、Y、W、S、T、G、A、F、L、I
位置13：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I
位置14：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置15：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置16：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置17：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G
位置18：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A
位置19：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V
位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L
位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置22：選自由下列組成之列表：P、M、F、L
位置23：D
位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I
或者，基於該等表內提供之資訊，顯而易見本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為24個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V
位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I
位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I
位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I
位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I
位置11：C
位置12：選自由下列組成之列表：K、Q、E、H、Y、W、S、T、G、A、F、L、I
位置13：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I
位置14：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I
位置15：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I
位置16：C
位置17：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G
位置18：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A
位置19：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V
位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L
位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置22：選自由下列組成之列表：P、M、F、L
位置23：D
位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I
來自下表中之資訊可合理地概括為：因此，例如，位置1處之胺基酸係選自R、K、D、E、P、S、G、A及V，與該CDR H3之長度是否係20、21、22、23或24個胺基酸無關。因此，可合理推斷本發明之人類抗體將在位置1處具有選自R、K、D、E、P、S、G、A及V的胺基酸。同理可推斷：針對位置2(即，該等胺基酸將選自由下列組成 之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V)；位置3(即，該等胺基酸將選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V)；位置4(即，該等胺基酸將選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I)；位置5(即，該等胺基酸將選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I)；位置6(即，該等胺基酸將選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I)及位置7(即，該等胺基酸將選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I)。
如下表6至11中所陳述，本發明者已針對各胺基酸在本發明之人類抗體之特定位置處之存在指定百分比數值(準確至±1.5%內)。指定10%或更大之截止點，具有長度為20個胺基酸之CDR H3之本發明之特定人類抗體可包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L
位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I
位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M
位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V
位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V
位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、T、G、L、V
位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V
位置11：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V
位置12：選自由下列組成之列表：Y、G、V
位置13：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G
位置14：選自由下列組成之列表：Y、G
位置15：選自由下列組成之列表：Y
位置16：選自由下列組成之列表：D、Y、G
位置17：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置18：選自由下列組成之列表：M、F
位置19：D
位置20：選自由下列組成之列表：P、Y、V
或者，指定10%或更大之截止點，本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為21個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L
位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I
位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M
位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V
位置8：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V
位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置11：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V
位置12：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V
位置13：選自由下列組成之列表：Y、G、V
位置14：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G
位置15：選自由下列組成之列表：Y、G
位置16：Y
位置17：選自由下列組成之列表：D、Y、G
位置18：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置19：選自由下列組成之列表：M、F
位置20：D
位置21：選自由下列組成之列表：P、Y、V
或者，指定10%或更大之截止點，本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為22個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L
位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I
位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M
位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V
位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V
位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V
位置11：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V
位置13：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V
位置14：選自由下列組成之列表：Y、G、V
位置15：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G
位置16：選自由下列組成之列表：Y、G
位置17：Y
位置18：選自由下列組成之列表：D、Y、G
位置19：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置20：選自由下列組成之列表：M、F
位置21：D
位置22：選自由下列組成之列表：P、Y、V
或者，指定10%或更大之截止點，本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為23個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L
位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I
位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M
位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V
位置8：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V
位置10：選自由下列組成之列表：R、Y、W、S、T、G、A
位置11：選自由下列組成之列表：Y、S、G
位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置13：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V
位置14：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V
位置15：選自由下列組成之列表：Y、G、V
位置16：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G
位置17：選自由下列組成之列表：Y、G
位置18：Y
位置19：選自由下列組成之列表：D、Y、G
位置20：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置21：選自由下列組成之列表：M、F
位置22：D
位置23：選自由下列組成之列表：P、Y、V
或者，指定10%或更大之截止點，本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為24個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L
位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I
位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M
位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V
位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V
位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V
位置11：選自由下列組成之列表：R、Y、W、S、T、G、A
位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G
位置13：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置14：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V
位置15：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V
位置16：選自由下列組成之列表：Y、G、V
位置17：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G
位置18：選自由下列組成之列表：Y、G
位置19：Y
位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、G
位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置22：選自由下列組成之列表：M、F
位置23：D
位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、V
或者，指定10%或更大之截止點，本發明之庫或人類抗體之CDR H3之長度可為24個胺基酸且包含下列胺基酸序列：
位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V
位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L
位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V
位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I
位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M
位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I
位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V
位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V
位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V
位置11：C
位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G
位置13：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V
位置14：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V
位置15：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V
位置16：C
位置17：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G
位置18：選自由下列組成之列表：Y、G
位置19：Y
位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、G
位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A
位置22：選自由下列組成之列表：M、F
位置23：D
位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、V。
實例1：長VH CDR3(CDR H3)庫之設計
描述抗-FPR1抗體，其含有不尋常之長VH CDR3(藉由Kabat定義之24個胺基酸；藉由IMGT定義之26個胺基酸；Douthwaite,JA等人，2015；MAbs：7(1)：152-166；以引用之方式併入本文中)。此抗體(FPR0165)之Fab片段之X射線晶體結構顯示，長VH CDR環圈足夠穩定可供結構解析用(圖1)。FPR0165之重鏈序列最近似匹配VH3-15*07基因，其不尋常係在於VH CDR3開端處替代了半胱胺酸接著丙胺酸及然後精胺酸或者離胺酸(CAR/K)之常見序列，該基因係編碼半胱胺酸，接著編碼兩個蘇胺酸(CTT)。不受任何理論之束縛，本發明者提出處於此長VH CDR3環圈底部之此異常結構特徵可提供一些結構穩定性。因此，決定將生殖細胞系基因VH3-15*07用作具有長VH CDR3環圈之抗體庫之重鏈細目之基礎。
最初設計具有20、21、22、23及24個胺基酸長度之五個VH CDR3環圈長度(如藉由Kabat編號定義，即，將該CDR3環圈定義為起始自於VH生殖細胞系序列中緊接在CTT模體前之胺基酸(Kabat編號92至94，其中VH CDR3起始於Kabat位置95)。為在該等環圈內設計多樣性，使用已知人類抗體序列在給定環圈長度下之分析(Zemlin M等人，2003；J.Mol.Biol.334(4)：733-749)。沿著具有給定環圈長度之VH CDR3之各位置測定各胺基酸之平均使用百分率(於人類中)(表1至5)。
使用週期性酶催化單一密碼子合成法(ColibraTM，Isogenica Ltd,Little Chesterford，UK；EP 1907548、EP 2236612與US 8357638 B2及Ashraf MA等人，2013；Biochem.Soc.Trans.41：1189-1194)來合成VH庫細目。此方法論之技術局限性需要針對在特定位置處可成功合成之各胺基酸之最小%使用係5%。因此，用於該庫之VH細目係基於描述於Zemlin等人中環圈長度為20至24個胺基酸長度之胺基酸組合物之經修改版本設計(表6至10)。亦設計含有在位置11及16處之固定半 胱胺酸對之24個胺基酸之額外VH細目。若干人類抗體D基因含有於其等中經編碼之半胱胺酸胺基酸對。不受任何理論之束縛，本發明者提出兩個半胱胺酸於此等位置中之二硫化物配對可能導致VH CDR3環圈之增大結構穩定性及因此將其包括於此細目之設計中(表11)。直接處於VH CDR3下游之C端框架4區域通常係藉由人類VHJ片段編碼。在該庫設計之情況下，此受限於衍生自VHJ片段IGHJ6*01之單一序列，因為此單一序列在所用之FPR0165抗體中被用作該庫之設計基礎。因此，針對不同環圈長度中之各者合成的整個VH構築體係由以下各物組成：衍生自生殖細胞系VH3-15*07之VH框架1(FW1)-CDR1-FW2-CDR2-FW3-，接著經設計之CDR3序列(表6至11)，接著衍生自IGHJ6*01基因之單一FW4區域(起始於Kabat定義之位置103處之色胺酸)。為促進將插入物選殖至噬菌粒載體中，將限制內切酶NcoI及XhoI之限制位分別設計至構築體上游及下游中。該庫之整體設計總結於圖2中。
實例2：VH細目之選殖及EG3庫之製備
為最大化最終庫之多樣性，將該等6個VH細目選殖至含有人類抗體V λ及V κ基因之噬菌粒載體(Lloyd C等人，2009；Protein Eng Des Sel 22(3)：159-168)中。使此受體框架庫(於pCantab6載體中)生長整夜且藉由Maxiprep(Qiagen,Manchester,UK)提取DNA。使該經純化之DNA在37℃下依序藉由限制酶NcoI及XhoI(NEB,Hitchin,UK)消化，接著在80℃下進行20分鐘之熱滅活步驟。經雙重消化之載體用鎖相凝膠(Phase Lock Gel)(5Prime GmbH,Hilden,Germany)藉由酚：氯仿萃取純化且隨後經乙醇沈澱。該等DNA填充片段藉由在Chromospin+TE-1000管柱(Takara Clontech,Saint-Germain-en-Laye,France)上純化載體DNA而移除。6個VH細目插入物同時用限制酶NcoI及XhoI(NEB)在37℃下消化4hr，接著在80℃進行20分鐘之熱滅活步驟以產生相關懸垂物。
在經酚：氯仿萃取及乙醇沈澱前，使用T4連接酶套組(NEB)以不同之比率(3：1、6：1及12：1之插入物：載體)進行試驗連接。然後在於37℃下恢復前將連接經電穿孔引入至新鮮製造之電勝任(electrocompetent)TG1細胞中。將細胞接種至含有相關抗生素之瓊脂上且在30℃下培養整夜。在群落上進行群落PCR以確認載體及插入物之正確連接。一旦已選擇插入物：載體比率，即針對子庫中之各者如先前描述進行大範圍連接。如先前描述，進行連續稀釋以提供對庫尺寸之估算(Marks JD等人，(1991)J.Mol.Biol.,222：581-5971)。定序來 自各子庫之264至528個個別殖株之scFv基因以確定對HCDR3多樣性及庫品質之評估。此分析指示該庫係高度多樣化(HCDR3序列在經定序之植株間呈100%多樣性)且各子庫中~70%之植株編碼全長、框架內scFv(圖3)。
於成功選殖六個個別子庫後，使用標準技術(Sambrook J等人，(1987)Molecular Cloning-A Laboratory Approach.Cold Spring Harbor Laboratory Press)製備個別子庫之噬菌體等份。然後以當量比率組合此等。最終經組合之scFv庫具有經估算具有7.5x109個個別重組體之尺寸且稱為EG3庫之細目。
製備來自新構築之庫之DNA且藉由次世代定序法(MiSeq-Illumina,Little Chesterford,UK)提交定序以確定VHCDR3長度分佈及各子庫中之VHCDR3胺基酸使用。亦獲得對VL生殖細胞系多樣性之評估，因為該VH具有固定框架。
從每個子庫120至160萬個個別讀數中，該NGS(次世代定序法，即，如使用Illumina MiSeq®進行)指示各子庫中60至70%植株含有預期長度之VHCDR3(圖4)。此分析亦確認就各子庫中之絕大部分位置而言，最終庫中之胺基酸使用與庫設計一致(觀察之胺基酸之頻率/設計之胺基酸之頻率=0.1-2)。在胺基酸使用不落於預期範圍內的情況下，設計各情況下之胺基酸以在該位置出現<10%。例如，在各庫中，異白胺酸在Kabat位置98處稍微過度呈現(觀察值=0.12相對於設計值0.05)及酪胺酸在Kabat位置102處稍微過度呈現(觀察值=0.21相對於設計值0.1)。使用每個子庫100000個無規選擇之個別讀數來產生關於VL生殖細胞系多樣性之資訊(圖5)。三種最常用之VL生殖細胞系係IGLV1-44*01、IGV3-19*01及IGLV1-40*01，其各呈現各子庫之7至10%。最常見之κ生殖細胞系係IGKV3-20*01，其呈現各子庫之4至5%。
實例3：針對模型抗原SCF及胰島素自EG3庫分離scFv
為測試EG3庫針對典型可溶性抗原之性能，針對兩種模型抗原(人類胰島素及人類幹細胞因子(SCF))進行選擇。自EG3庫分離對SCF或胰島素具有特異性之scFv抗體並針對兩個先前描述之人類scFv抗體庫(Groves等人，J.Immunol.Methods,313：129-139(2006)；Lloyd等人，Protein Eng.Des.Sel.22(3)：159-68(2009))，藉由基本上如描述於Vaughan等人，Nat.Biotech.14,309-314(1996)及Hawkins等人(J.Mol.Biol.226,889-896(1992)中之針對生物素化重組人類SCF ECD(殘基1至214；產生於HEK293 EBNA細胞中)或生物素化牛胰島素(Sigma目錄I5500，經由使用EZ連接磺基-NHS-LC-生物素(EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin)(Thermo/Pierce,21335)之游離胺生物素化)之可溶性選擇作比較。簡言之，使109至1012個scFv-噬菌體顆粒在室溫下於MPBS(PBS+3%(w/v)Marvel脫脂奶粉)中阻斷1小時。將50μl經鏈黴親和素塗佈之順磁性珠粒(Dynabeads®,M-280)添加至經阻斷之噬菌體中，接著培養1小時。用磁鐵捕獲該等鏈黴親和素珠粒，且將生物素化SCF或胰島素添加至100nM(第1輪)或50nM(第2輪)之最終濃度。在室溫下培養1小時後，接著將結合至抗原之scFv捕獲至經鏈黴親和素塗佈之順磁性珠粒上。未經結合之噬菌體藉由用PBST(PBS+0.1%(v/v)吐溫(Tween)-20)大量清洗該等珠粒來移除。保留於該等抗原上之噬菌體顆粒藉由添加5μg/ml胰蛋白酶，接著在37℃下培養30分鐘來洗提。將該等珠粒捕獲於磁鐵上，且使用上清液來感染對數期TG1大腸桿菌，接著針對下一輪選擇救援噬菌體；以此方式進行兩輪選擇。
於兩輪上文描述之選擇後，使來自選擇輸出之96個個別殖株(包括對照組植株)於96孔盤中生長。單鏈Fv片段呈現於噬菌體顆粒上並於結合分析中測試以確定針對相關選擇抗原之特異性。噬菌體呈現之scFv上清液樣品係如下於96孔深孔盤中產生。將來自96孔母盤之各孔 中之5μl培養物轉移至含有500μl之2TYAG(2TY+100μg/ml安比西林(ampicillin)+2%葡萄糖)培養基之Greiner深孔培養盤中並在37℃、280rpm下培養5小時。然後以100μl/孔添加K07 M13輔助噬菌體(於2TYAG中稀釋至1.5 x 1011pfu/ml)且在37℃、150rpm下培養該盤以容許感染。使該盤於3200rpm下降速旋轉10分鐘並移除上清液。使細菌顆粒重懸浮於500μl/孔之2TYAK(2TY+100μg/ml安比西林+50μg/ml康黴素)中且使該盤在25℃、280rpm下培養整夜。於早晨，向各孔添加500μl於2x PBS中之6%(w/v)脫脂奶粉且使該盤在室溫下培養1小時。然後使該盤在3200rpm下離心10分鐘及將經阻斷之噬菌體呈現之scFv上清液直接用於ELISA實驗中。
將鏈黴親和素盤(Greiner,655990)用2.5μg/ml於PBS中之生物素化抗原塗佈且在4℃下培養整夜。將盤用PBS清洗3次且在室溫下用300μl/孔MPBS阻斷1小時。將盤用PBS清洗1次且在室溫下以50μl/孔添加經阻斷之噬菌體樣品1小時。將盤用PBST清洗3次且將50μl/孔以1：5000稀釋於MPBS中用於偵測噬菌體呈現之scFv之抗-M13-HRP抗體(Amersham,27-9421-01)添加至各孔中，接著在室溫下培養1小時。將盤用PBST清洗3次且以50μl/孔之TMB(Sigma,T0440)展開。在於EnVisionTM盤式分析儀(plate reader)上於450nm下讀取前，用50μl/孔之0.1M H2SO4中止該反應。就無關抗原上之相同樣品而言，若450nm下之吸光度>0.5且<0.1，則認為噬菌體呈現之scFv結合選擇抗原。進行SCF或胰島素結合植株之scFv基因之定序以評估經VHCDR3多樣性選擇之植株。於兩輪可溶性選擇後，自所有三個噬菌體庫識別用於兩種抗原之特異性黏合劑之多樣化小組。
實例4：針對使用噬菌體呈現選擇分離之離子通道之抑制抗體之識別及特性描述
為確定該EG3庫是否可良好適用於針對更具挑戰性之目標類別(諸如離子通道)識別抗體，在離子通道P2X4上進行選擇。使用如本文描述之噬菌體呈現獲得例示性P2X4抑制抗體1至4。將天然人類單鏈Fv(scFv)噬菌體呈現庫基於絲狀噬菌體M13選殖至噬菌粒載體中，將該等庫用於選擇(Lloyd(2009)Protein Eng Des Sel 22,159-168；Vaughan等人，Nature biotechnology 14,309-314,1996)。基本上如先前Vaughan等人(Vaughan等人，同上)之描述，在重組人類P2X4(hu P2X4)上使用一系列選擇循環，自EG3庫或先前描述之天然噬菌體呈現庫(共同稱為CAT2.0庫)分離抗-P2X4特異性抗體。簡言之，在4℃下將於PBS(Dulbecco’s PBS,pH7.4)中之人類P2X4固定於MaxiSorp®微量滴定盤(Nunc)之孔上整夜。用PBS清洗孔，然後用經PBS-Marvel乾燥之脫脂奶(3% w/v)阻斷1小時。將於PBS-Marvel(3% w/v)中之經純化之噬菌體添加至該等孔中並在室溫下容許結合經塗佈之抗原1小時。未經結合之噬菌體藉由一系列使用PBS之清洗循環移除。經結合之噬菌體顆粒在37℃下用胰蛋白酶洗提30分鐘，感染至大腸桿菌TG1細菌中並經援救用於下一輪選擇。
來自噬菌體呈現選擇之人類P2X4抗體之識別
使識別自(上文)描述之噬菌體呈現方法之scFv抗體於細菌中表現並篩選為於以下各物中製備之未經純化之細菌周質提取物(其等含有scFv)：0.2M HEPES緩衝液pH7.4，0.5mM EDTA及0.5M蔗糖。或者，重鏈及輕鏈可變區藉由PCR擴增並選殖至載體中以用於在HEK293F細胞中表現為人類IgG1抗體。
為篩選細菌scFv樣品，將5μl細菌提取物添加至384孔分析盤 (Corning 3655)中。如下製備分析緩衝液：將1X Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(Sigma H8264)、0.1%(v/v)BSA(PAA K05-013)、20mM HEPES(Gibco 15630)及1U/ml三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)(Sigma A6535)及5μl添加至具有細菌scFv提取物之分析盤中。在分析緩衝液中將抗-myc偵測(Serotec MCA220)及抗-小鼠DyLight649(Jackson Immuno Research Labs 115-495-071)於相同溶液中分別稀釋至15.6nM及24nM並將5μl添加至具有scFv樣品之分析盤中。在分析緩衝液中將表現人類P2X4(huP2X4)之HEK293F細胞(Q99571,ENSP00000336607)稀釋至2.6e5個細胞/ml並將15μl添加至該分析盤。同時亦針對結合至不表現huP2X4之HEK293F細胞來測試scFv樣品。
為篩選經HEK293F表現之IgG樣品，將2.5μl細胞培養物上清液添加至384孔分析盤(Corning 3655)。如上文描述製備分析緩衝液並將7.5μl添加至具有IgG樣品之分析盤。在分析緩衝液中將抗-人類AlexaFluor 647(Life Technologies A21445)稀釋至6nM並將10μl添加至具有IgG樣品之分析盤。在分析緩衝液中將表現huP2X4之HEK293F細胞(Q99571,ENSP00000336607)稀釋至4e5個細胞/ml並將10μl添加至分析盤。同時亦針對結合至不表現huP2X4之HEK293F細胞來測試IgG樣品。用Topseal盤封口機(Perkin Elmer 6005250)密封經設置以篩選兩種類型之樣品之分析盤且在於螢光微量分析技術(FMAT)上讀取前在室溫下培養至少4小時，該螢光微量分析技術係基於螢光的平臺，其偵測定位於沈降於微孔底部之珠粒或細胞之螢光(Dietz等人，Cytometry 23：177-186(1996),Miraglia等人，J.Biomol.Screening 4：193-204(1999))。使用FMAT分析軟體分析數據且基於螢光0至10,000 FL1計數閘控事件，顏色通常為0.15至0.40及尺寸10至60。在針對各孔記錄數據前，將20個事件之最小計數設定為臨限值。選擇顯示結合至HEK293F huP2X4細胞，但不結合至對照HEK293F細胞之 scFv來進一步測試該FL1計數在huP2X4細胞上是否大於1000，將顯示大於200 FL1計數之特異性huP2X4結合信號之IgG樣品識別為採樣數並經進一步表徵。
使作為未經純化樣品之對HEK293F huP2X4細胞顯示特異性結合信號之scFv或IgG樣品經受DNA定序(Vaughan等人，同上，Nature Biotechnology 14：309-314),(Osbourn 1996；Immunotechnology.2,181-196)。使獨特的scFv於細菌中表現並藉由親和層析法(如Bannister等人(2006)Biotechnology and bioengineering,94.931-937之描述)純化。測試經純化之抗體在電生理學中的功能活性。
單株抗體相對P2X4之電生理學特性描述
使用細胞消化液(accutase)以50%融匯(confluency)獲得穩定表現人類P2X4之HEK 293F細胞。然後將細胞以2-3e6個細胞/ml之密度重懸浮於10ml經補充HEPES(10mM)+三磷酸腺苷雙磷酸酶(1U/ml,ATPase/ADPase活性=1)之Freestyle 293F培養基中。使用自動化電生理學平臺QPatch 16X(Sophion)以群體碎片(population patch)組態分析P2X4功能。QPatch細胞外緩衝液(QEB)之組成(以mM計)係NaCl(140)、KCl(2)、MgCl2(1)、CaCl2(2)、HEPES(10)。複合盤細胞外緩衝液(CPEB1)之最終組成係NaCl(137.6)、KCl(2.2)、MgCl2(0.66)、CaCl2(1.3)、HEPES(6.6)、KH2PO4(0.49)、NaH2PO4(2.66)。將細胞外緩衝液之pH用NaOH(1M)調整至7.4，滲透壓用蔗糖調整至300mOsm且該等溶液經0.2μm過濾。複合盤細胞外緩衝液經補充0.1%牛血清白蛋白。該QPatch細胞內緩衝液(以mM計)含有CsF(140)、NaCl(10)、EGTA(1)、HEPES(10)。該細胞內緩衝液之pH用 CsOH(1M)調整至7.3且該溶液經0.2μm過濾。用NaOH(1M)將IgG滴定至pH 7.4。
在獲得整體細胞組態後，用採用之70%串聯電阻補償將細胞電壓夾持於-50mV。將於CPEB1中之配體促效劑5’-三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP,3μM)每5分鐘施用3秒持續20分鐘，從而產生4個對照組促效劑反應。各促效劑反應用CPEB1+三磷酸腺苷雙磷酸酶(1U/ml)洗淨。然後在測試IgG或同型對照組IgG(NIP 228)之連續存在下每5分鐘量測4個額外之促效劑反應。
發現四個IgG顯著抑制人類P2X4電流；抗體第1、2、3及4號，其中該等抗體中之兩者(1及4)分別以19.6及3.8nM之IC50完全抑制人類P2X4電流。P2X4電流之抑制在添加IgG後之第一時間點迅速發生，而同型對照組IgG NIP 228 CMC無顯著影響。相比之下，自來自CAT 2.0庫之33 000個scFv之全部篩選中僅分離出1個完全抑制人類P2X4電流之抗體(Lloyd等人，2009,Protein Engineering Design and Selection 22(3)159-168)。
抗體(Abs)結合及功能：噬菌體呈現P2X4結合抗體
來自前導小組(lead panel)之抗體於Ephys分析中之效力
現將參考下列圖式藉助於實例描述本發明，其中顯示：圖1：噬菌體呈現庫所根基之抗-FPR抗體(FPR0165)之Fab片段之X射線晶體結構，其指示長VH CDR環圈足夠穩定供結構解析用。
圖2：用於長VH CDR3庫之VH插入物設計之示意圖。合成呈現VH CDR長度20至24之六個構築體，加上在環圈位置11及16處編碼半胱胺酸之24個胺基酸長度之構築體。六個不同之CDR3插入物係憑藉如定義於表6至11中之胺基酸組合物設計。
圖3：6種VH長CDR3細目之選殖效率之分析。定序用於來自各子庫之264至528個個別殖株之scFv基因以判定對HCDR3多樣性及庫品質之評估。此分析指示該庫係高度多樣化(HCDR3序列在經定序之植株間呈100%多樣性)且各子庫中~70%之植株編碼全長、框架內scFv。
圖4：選殖至含有抗體輕鏈細目之噬菌粒載體中後之實際VH CDR3環圈長度之深度定序分析。從每個子庫的120至160萬個個別讀數，NGS(次世代定序法)指示各子庫中60至70%之植株含有預期長度之VHCDR3。此分析亦證實就各子庫中之絕大部分位置而言，最終庫中之胺基酸使用與庫設計一致(觀察之胺基酸之頻率/設計之胺基酸之頻率=0.1-2)。
圖5：選殖6個VH細目插入物後之輕鏈生殖細胞系使用之多樣性。使用每個子庫100000個無規選擇之個別讀數來產生關於VL生殖細胞系多樣性之資訊。三種最常用之VL生殖細胞系係IGLV1-44*01、IGV3-19*01及IGLV1-40*01，其各呈現各子庫之7至10%。最常見之κ生殖細胞系係IGKV3-20*01，其呈現各子庫之4至5%。
圖6：獲自本發明之噬菌體呈現庫之四種抗-P2X4抗體(抗體1至4)之VH(6a、6b)及VL(6c、6d)序列。

Claims (45)

  1. 一種呈現人類scFv之噬菌體庫，其中藉由該庫呈現之至少50%之人類scFv可變重鏈CDR3(CDR H3)之長度為至少18個胺基酸。
  2. 如請求項1之噬菌體庫，其中藉由該庫呈現之至少60%之人類scFv可變重鏈CDR3(CDR H3)之長度為至少18個胺基酸。
  3. 如請求項1之噬菌體庫，其中藉由該庫呈現之至少70%之人類scFv可變重鏈CDR3(CDR H3)之長度為至少18個胺基酸。
  4. 如請求項1之噬菌體庫，其中藉由該庫呈現之至少80%之人類scFv可變重鏈CDR3(CDR H3)之長度為至少18個胺基酸。
  5. 如請求項1之噬菌體庫，其中藉由該庫呈現之至少90%之人類scFv可變重鏈CDR3(CDR H3)之長度為至少18個胺基酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之噬菌體庫，其中該CDR H3可變重鏈之長度係介於18至30個胺基酸之間。
  7. 如請求項1至5中任一項之噬菌體庫，其中該CDR H3可變重鏈之長度係介於20至30個胺基酸之間。
  8. 如請求項1至5中任一項之噬菌體庫，其中該CDR H3可變重鏈之長度係介於20至24個胺基酸之間。
  9. 如請求項1至5中任一項之噬菌體庫，其係產生自具有長度為至少18個胺基酸之CDR H3之抗體之人類生殖細胞序列。
  10. 如請求項1至5中任一項之噬菌體庫，其係產生自具有長度為至少18個胺基酸之CDR H3之抗-FPR1抗體之人類生殖細胞序列。
  11. 如請求項10之噬菌體庫，其中該抗-FPR1抗體具有長度為24個胺基酸之CDR H3。
  12. 如請求項11之噬菌體庫，其中該抗-FPR-1抗體係FPR0165。
  13. 一種如請求項1至12中任一項之庫之用途，其用以產生針對目標 抗原之功能性人類抗體或其抗原結合片段。
  14. 一種產生針對目標抗原之功能性人類抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括自如請求項1至12中任一項之庫分離對該目標抗原具有特異性之人類抗體。
  15. 一種藉由如請求項13之用途或如請求項14之方法可獲得之人類抗體或其抗原結合片段，其中該人類抗體特異性地結合至其目標抗原且具有長度為至少18個胺基酸之CDR H3。
  16. 一種人類抗體或其抗原結合片段，其特異性地結合至其目標抗原且具有長度為至少18個胺基酸之CDR H3。
  17. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3可變重鏈之長度係介於18至30個胺基酸之間。
  18. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3可變重鏈之長度係介於20至30個胺基酸之間。
  19. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3可變重鏈之長度係介於20至24個胺基酸之間。
  20. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性地結合至膜主體蛋白。
  21. 如請求項20之人類抗體或其抗原結合片段，其中該膜主體蛋白係：(i)離子通道；(ii)運輸蛋白；或(iii)GPCR。
  22. 如請求項20之人類抗體或其抗原結合片段，其中該膜主體蛋白包含一個以上之跨膜域。
  23. 如請求項20之人類抗體或其抗原結合片段，其包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十 五或更多個跨膜域。
  24. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體特異性地結合至病毒殼蛋白。
  25. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係拮抗劑。
  26. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係促效劑。
  27. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段針對其目標抗原具有小於50nM之IC50。
  28. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段針對其目標抗原具有小於20nM之IC50。
  29. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段針對其目標抗原具有小於10nM之IC50。
  30. 如請求項15或請求項16之人類抗體或其抗原結合片段，其係單株的。
  31. 如請求項15或請求項16之抗體之抗原結合片段，其係Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、或scFv片段。
  32. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為20個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V 位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置11：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置12：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置13：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G位置14：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A位置15：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V位置16：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L位置17：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A 位置18：選自由下列組成之列表：P、M、F、L位置19：D位置20：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I。
  33. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為21個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I位置10：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I 位置11：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置12：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置13：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置14：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G位置15：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A位置16：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V位置17：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L位置18：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置19：選自由下列組成之列表：P、M、F、L位置20：D位置21：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I。
  34. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為22個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V 位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I位置11：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I位置12：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置13：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置14：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置15：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G位置16：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A 位置17：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V位置18：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L位置19：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置20：選自由下列組成之列表：P、M、F、L位置21：D位置22：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I。
  35. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為23個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I 位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I位置10：選自由下列組成之列表：R、D、Q、P、Y、W、S、T、G、A位置11：選自由下列組成之列表：K、Q、E、H、Y、W、S、T、G、A、F、L、I位置12：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I位置13：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置14：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置15：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置16：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G位置17：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A位置18：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V位置19：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L位置20：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置21：選自由下列組成之列表：P、M、F、L位置22：D位置23：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I。
  36. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體 或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為24個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I位置11：選自由下列組成之列表：R、D、Q、P、Y、W、S、T、G、A位置12：選自由下列組成之列表：K、Q、E、H、Y、W、S、T、G、A、F、L、I 位置13：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I位置14：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置15：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置16：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置17：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G位置18：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A位置19：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置22：選自由下列組成之列表：P、M、F、L位置23：D位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I。
  37. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為24個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、S、G、A、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、E、H、P、Y、S、G、F、L、V 位置3：選自由下列組成之列表：R、D、H、P、Y、S、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、K、D、H、P、Y、W、S、G、A、F、L、V、I位置5：選自由下列組成之列表：K、D、H、P、Y、S、T、G、A、M、L、V、I位置6：選自由下列組成之列表：D、P、Y、S、G、A、M、F、L、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G、F、V、I位置8：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置9：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置10：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、W、S、T、G、A、F、L、V、I位置11：C位置12：選自由下列組成之列表：K、Q、E、H、Y、W、S、T、G、A、F、L、I位置13：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、W、S、G、A、L、V、I位置14：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、T、G、A、M、F、L、V、I位置15：選自由下列組成之列表：R、D、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V、I位置16：C 位置17：選自由下列組成之列表：R、K、D、E、P、Y、S、T、G位置18：選自由下列組成之列表：R、K、E、P、Y、S、T、G、A位置19：選自由下列組成之列表：R、E、P、Y、S、T、G、A、F、L、V位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、S、T、G、F、L位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置22：選自由下列組成之列表：P、M、F、L位置23：D位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、L、V、I。
  38. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為20個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、T、G、L、V位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V位置11：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V位置12：選自由下列組成之列表：Y、G、V 位置13：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G位置14：選自由下列組成之列表：Y、G位置15：選自由下列組成之列表：Y位置16：選自由下列組成之列表：D、Y、G位置17：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置18：選自由下列組成之列表：M、F位置19：D位置20：選自由下列組成之列表：P、Y、V。
  39. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為21個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V位置8：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置11：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V位置12：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V位置13：選自由下列組成之列表：Y、G、V位置14：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G位置15：選自由下列組成之列表：Y、G 位置16：Y位置17：選自由下列組成之列表：D、Y、G位置18：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置19：選自由下列組成之列表：M、F位置20：D位置21：選自由下列組成之列表：P、Y、V。
  40. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為22個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V位置11：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V位置13：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V位置14：選自由下列組成之列表：Y、G、V位置15：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G位置16：選自由下列組成之列表：Y、G位置17：Y 位置18：選自由下列組成之列表：D、Y、G位置19：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置20：選自由下列組成之列表：M、F位置21：D位置22：選自由下列組成之列表：P、Y、V。
  41. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為23個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V位置8：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V位置10：選自由下列組成之列表：R、Y、W、S、T、G、A位置11：選自由下列組成之列表：Y、S、G位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置13：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V位置14：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V位置15：選自由下列組成之列表：Y、G、V位置16：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G位置17：選自由下列組成之列表：Y、G位置18：Y 位置19：選自由下列組成之列表：D、Y、G位置20：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置21：選自由下列組成之列表：M、F位置22：D位置23：選自由下列組成之列表：P、Y、V。
  42. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為24個胺基酸且包含下列膠基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V位置11：選自由下列組成之列表：R、Y、W、S、T、G、A位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G位置13：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置14：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V位置15：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V位置16：選自由下列組成之列表：Y、G、V位置17：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G位置18：選自由下列組成之列表：Y、G 位置19：Y位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、G位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置22：選自由下列組成之列表：M、F位置23：D位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、V。
  43. 如請求項1至5中任一項之庫，或如請求項15或請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3之長度為24個胺基酸且包含下列胺基酸序列：位置1：選自由下列組成之列表：R、D、G、V位置2：選自由下列組成之列表：R、D、P、Y、S、G、L位置3：選自由下列組成之列表：R、P、Y、T、G、A、F、V位置4：選自由下列組成之列表：R、Y、G、I位置5：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、M位置6：選自由下列組成之列表：D、Y、S、G、V、I位置7：選自由下列組成之列表：R、D、Y、S、G、V位置8：選自由下列組成之列表：D、S、G、M、V位置9：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置10：選自由下列組成之列表：Y、S、G、V位置11：C位置12：選自由下列組成之列表：Y、S、G位置13：選自由下列組成之列表：Y、S、G、L、V位置14：選自由下列組成之列表：Y、S、G、A、V位置15：選自由下列組成之列表：E、Y、S、G、V位置16：C位置17：選自由下列組成之列表：R、Y、S、G 位置18：選自由下列組成之列表：Y、G位置19：Y位置20：選自由下列組成之列表：D、Y、G位置21：選自由下列組成之列表：Y、W、G、A位置22：選自由下列組成之列表：M、F位置23：D位置24：選自由下列組成之列表：P、Y、V。
  44. 一種可獲自如請求項32至43中任一項之庫之人類抗體或其抗原結合片段，其中該CDR H3可變重鏈之長度係介於18至30、20至30，或20至24個胺基酸之間。
  45. 如請求項44之人類抗體或其抗原結合片段，其係獲自如請求項32至43中任一項之庫。
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