TW201643199A - 用於放射性核種治療中保護腎臟之α－１－微球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明是有關分別用於診斷或治療需要放射性核種診斷法(RD)、放射性核種治療(RTN)或放射性免疫治療(RIT)的惡性病中之α1-微球蛋白(A1M)，其中A1M用作為RD、RNT或RIT的共同治療。

Description

用於放射性核種治療中保護腎臟之α-1-微球蛋白
本發明是有關在使用經放射性核種標記之小分子治療惡性病(諸如神經內分泌腫瘤)期間，α-1-微球蛋白(A1M)用以降低在放射性核種診斷法(RD)、放射性核種治療(RNT)與放射性免疫治療(RIT)中觀察到之腎臟相關副作用的用途。小分子包括受體配體(例如生長抑制素衍生物)、親和體(Affibodies)、雙功能抗體(Diabodies)及抗體片段(Fab、Fv、scFv等)。
此外，本發明是有關A1M在治療急性及/或慢性腎臟損傷中的用途。
在過去15年間，肽受體放射性核種治療(PRRT)已成功用於治療轉移性神經內分泌腫瘤[1]。使用生長抑制素(somatostatin)-類似物肽(諸如奧曲肽(ortreotide)，經治療性放射性核種標記)治療生長抑制素受體-陽性腫瘤[2]。但是，腎毒性以及慢性腎功能不全是PRRT的典型副作用。儘管採用了保護性措施(諸如輸注帶正電的胺基酸)，在經歷PRRT的患者體內還是因為近端小管再吸收和間質中的滯留而觀察到腎功能延遲損失[1]。因此，腎臟在PRRT中為劑量限制性器官。已經觀察到，經177Lu-DOTATATE治療的患者經歷肌酸酐廓清(clearance)每年損失3.8%，而經90Y-DOTATOC治療的患者 經歷肌酸酐廓清每年損失7.3%[3]。另一種使用小分子候選物之治療方法為親和體分子、雙功能抗體及抗體片段與免疫結合物(亦即Fab、scFv等)。在臨床前研究與臨床研究中均已顯示它們有高度腎臟累積同時伴隨高腎臟放射性。
腎毒性的問題未能充分獲得解決，且對於鑑別或開發增加PRRT使用安全性以及降低相關器官毒性的方法仍有需求。另外，在重複放射性核種診斷方法(放射性核種成像)期間，ALATA(低至合理可行)原則能受惠於開發出減少免於電離輻射的生物效用的方法。
肽-受體放射性核種治療(PRRT)是一種治療神經內分泌腫瘤的臨床用途。因為腎小球過濾肽、之後局部輻射並產生自由基所引起的腎毒性，是限制劑量以及方法有效性的副作用。α1-微球蛋白(A1M)是一種人類自由基清除蛋白，顯示會防止輻射誘發的活體外細胞損傷還有對周邊細胞的傷害。A1M在肝臟中合成、分泌至血液中、相對於血管外隔室平衡並且在腎臟中過濾。
發明人意欲開發以A1M為基礎的治療來對抗PRRT的腎毒性副作用，比較在注射重組型A1M以及生長抑制素類似物奧曲肽(octreotide)的小鼠體內的動力學以及生物分布來做為第一個概念驗證。兩個分子明顯局限在腎臟，其中A1M的動力學比奧曲肽更快。在i.v.注射之後，分別於10與20分鐘之時發現到，每公克腎臟組織最多有76%的注射A1M而每公克腎臟組織最多有46%的注射奧曲肽。重要的是，在注射後至少到60分鐘時，A1M分子顯示為完整且全長的。腎臟的自動放射攝影術顯示，在10-60分鐘後經標記 的A1M與奧曲肽主要局限在皮質。免疫組織化學以及螢光顯微術揭示，兩種物質主要共同局限在近端小管的隔室及上皮細胞。結果顯示，A1M與奧曲肽有非常相似的藥動學以及生物分布，因此能夠在PRRT期間使用A1M來保護腎臟組織。
依據本文報導的結果以及上文簡述，本發明是有關用於與放射性核種治療組合使用的A1M與PRRN(肽受體放射性核種)。
更具體地，本發明是有關於：α1-微球蛋白(A1M)用於治療需要放射性核種治療(RNT)或放射性免疫治療(RIT)之惡性病，其中A1M用作為RNT或RIT的共同治療；A1M與經放射性核種標記的化合物用於治療需要放射性核種治療(RNT)或放射性免疫治療(RIT)之惡性病；A1M用於治療腎臟損傷。
A1M用於減少在單成像期或多成像期之放射性核種診斷法(核子醫學成像)期間因為電離輻射所導致的不欲生物影響。A1M用來達到ALARA原則並且減少電離輻射對患者的不欲影響。
如下所說明，經放射性核種標記的化合物是選自由肽受體配體、親和體以及抗體片段組成之群。經放射性核種標記的化合物為與發射輻射偶合的放射性核種。
PRRT是一種形式的分子靶定治療，其是透過使用與發射輻射之放射性核種偶合的小肽來實施。小肽為生長抑制素類似物。這些類似物包括奧曲肽、蘭瑞肽(lanreotide)、Tyr3-奧曲肽(TOC)、Tyr3-奧曲肽(TATE)以及DOTA+-螯合物DOTADOC、DODATATE與DOTA-蘭瑞肽。其他生長抑制素類似物 包括SOM230(帕瑞肽，pasireotide)、多巴抑制素(dopastatin)以及奧曲肽LAR。生長抑制素類似物經會發射中能量及/或高能量β粒子(諸如釔-90，90Y)或鎦-177(177Lu)的放射性核種標記並且以靜脈內(i.v.)的方式投與給患者。對具有生長抑制素受體陽性腫瘤的患者進行治療。許多但非全部形式的神經內分泌腫瘤(NET)表現一或多種生長抑制素受體亞型。在投與PRRN之後，其結合至局限在腫瘤上的生長抑制素受體，且PRRN被留在腫瘤內。發射電離輻射的放射性核種衰退會在組織中積累能量，造成高吸收劑量。
在本文中，本發明不限於諸如那些上文提及的特定PRRN，但經任何能夠發射電離輻射之適當放射性核種標記的分子期望落在本發明範疇中，諸如經放射性核種標記之小分子親和體分子、雙功能抗體、Fab、Fv、scFv-片段以及其他免疫結合物(immunoconjugates)或其他受體配體。較佳的是所選PRRN以與A1M相當的動力學分布於腎臟，以便達到A1M的最佳保護效用。
如上所述的治療之一，A1M可用於治療神經內分泌腫瘤。神經內分泌腫瘤(NET)包含癌症的異質群，通常維持無症狀，直到原發性腫瘤已轉移。
其他治療是那些會造成腎臟損傷的治療。此等治療包括治療鏈球菌感染、大腸桿菌感染(eHUS)、自體免疫性(SLE)、糖尿病等。
在任一種情況下，預期A1M對腎臟組織具有保護效用。
神經內分泌腫瘤是由內分泌與神經系統的細胞產生的贅瘤。這個類型的腫瘤包括胃腸胰腫瘤(所謂DEP-NET)，例如由小腸、十二指腸、胃或胰臟，還有大腸或肺臟或許多其他組織的腫瘤。出現在腸中的神經內分泌腫瘤也稱為類癌腫瘤。
在腫瘤散布之後，治療變得困難，且外科手術切除也有困難或不可能。存在有一些治療選項來治療晚期NET，包括外科手術、生長抑制素類似物、化療等，儘管這些中的大多數選項對於完全緩解來說是次佳的。依據疾病階段以及腫瘤的大小與侵襲性來決定治療選項。
在控制進行性NET方面，PRRT似乎非常有效。雖然完全反應率相對低，但在治療之後有部分緩解以及穩定疾病的患者百分率是高的。
然而，如上文所述，PRRT治療選項受限於輻射標記之肽的腎再吸收以及滯留，造成劑量限制性腎臟放射性毒性。在數名患者中已描述過輻射腎病。為了要保護腎臟，PRRN已與帶正電胺基酸、牛-明膠溶液(佳樂施，Gelofusine)或白蛋白片段一同投與。但還沒找到最佳解決方案。
放射性核種腫瘤治療機制包括在靶定組織中的細胞死亡(壞死與細胞凋亡)，但對活細胞還有各種形式的非致死壓力，包括「氧化壓力」。氧化壓力是由溶劑與細胞組分的電離作用所引起，且繼發性氧化壓力是由電離輻射所致之細胞壞死引起。氧化壓力定義為組織氧化因為氧化化合物生成與氧化劑的去毒作用/氧化組織的修飾之間不平衡而上升[4]。氧化壓力的主要媒介因子是活性含氧物(ROS)。ROS和游離基與蛋白質、DNA及其他分子組分反應，導致人類細胞及組織的氧化，造成目標分子不欲的修飾、喪失功能及細胞死亡。壞死主要是透過中斷氧化過程的分室作用而引起氧化壓力。在放射性核種治療期間，可觀察到「旁觀者效應」，也就是其中未直接暴露於輻射的細胞遭遇間接損害的壓力反應。旁觀者效應是由直接受到輻射之細胞的壓力因子傳播所引起且表現為未受輻射之旁觀者細胞的細胞死亡、基因體不穩定與基因表現改變[4-7]。已建議氧化劑與ROS是旁觀者 效應的媒介因子[8-10]。
抗氧化劑是消除氧化劑或防止有害氧化反應的保護因子[4]。人類生物可以對氧化壓力做出反應而產生抗氧化劑。這些內源性抗氧化劑包括過氧化物降解酶過氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫降解酶催化酶與麩胱甘肽過氧化酶，以及血色素降解酶血色素加氧酶-1(HO-1)。最近顯示，通常出現的26kDa血漿與組織蛋白α1-微球蛋白參與保護，透過作為自由基清除者以及血色素還有還原酶與氧化作用抑制因子來對抗氧化組織損傷[11-15]。數篇最近的文獻證明，A1M保護細胞培養物以及器官移植物對抗氧化損傷[16-18]，在某個程度上是透過積累於粒線體中並且保護粒線體功能[19]。更確切來說，已成功採用輸注人類重組型A1M用於動物模型中在活體內治療氧化壓力相關的疾病子癎前症[20]與血紅素引起的腎小球損傷[21]。在本發明中尤其感興趣的是，A1M已顯示在經輻射細胞培養物的旁觀者細胞中會壓抑細胞死亡、細胞凋亡，並上調壓力反應基因[22,23]。
基於藥動學研究，發明人已發現到A1M以及基於PRRN的生長抑制素類似物在投與之後均能快速分布至腎臟。A1M保護作用的先決要件是蛋白質在其局限於腎臟之後不會立刻降解。如同在本文實例中所證明，在腎臟中所發現的大多數A1M在i.v.注射之後至少60分鐘仍是完整無損的。因此，A1M可以展現保護效用對抗由PRRT引起的腎臟損傷。
發明人已顯示，>30%i.v.投與經125I-標記的A1M在幾分鐘內就局限在腎臟中。根據發明人的觀察結果，還有A1M對抗輻射引起之組織損傷所顯示的保護特性，發明人提出使用A1M-輸注透過降低腎毒性作為改善PRRT的方法。此一基於A1M之方法的先決條件是治療性A1M與奧曲肽的高度共局 限化。在本文的實驗段落中，於器官以及細胞層次上研究重組型人類A1M及奧曲肽的動力學以及生物分布。
為了要評估治療性A1M的輸注能否保護對抗在歷經PRRT之患者體內觀察到的副作用，在這些腫瘤治療中研究並比較使用之A1M與生長抑制素類似物的動力學以及分布至為重要。在器官與細胞層次上，對這些分子共局限化的程度特別感到興趣且如在本文實驗段落中所報導使用數種成像技術充分地探討。
所實施的生物分布研究顯示，兩種分子在腎臟中有高專一性攝取，其中A1M及奧曲肽最高攝取分別是在注射後10及20分鐘，且在廓清期期間有重疊的動力學(圖1)。這暗示著，任何保護性A1M輸注應與奧曲肽注射同時，或不久之後施行。A1M從腎臟快速廓清也暗示著可能需要輸注數次A1M，好能充分保護腎臟。
非侵入性SPECT成像反映出生物分布結果，顯示兩種分子在腎臟中的高攝取率。相較於髓質，在腎臟皮質中觀察到更高濃度的奧曲肽與A1M，暗示著於20分鐘之後在這些區域中已有共局限化。
A1M保護性作用的先決要件當然是蛋白質在腎臟中局限化之後不會立刻被降解。因此，發明人探討在腎臟均質物中的蛋白質尺寸。如圖2中明顯可見，在腎臟中發現的大多數A1M表現全長尺寸，在注射後至少高到60分鐘。A1M在腎臟中的天然路徑類似於大部分小血漿蛋白，從血液經腎小球過濾到初生尿，然後再吸收還有在近端小管上皮的溶小體降解[29,30]。仍然可以在尿液中發現一小部分的A1M[24]。因而可推測，儘管一大部分A1M預期會在近端小管細胞中降解，但仍有相當數量的A1M會逃過小管再吸收 與降解，並在前10-60分鐘期間維持完整與功能性。
α 1 -微球蛋白-一般性背景
A1M在肝臟中以高速率合成，分泌至血流中並且運送穿過血管壁到達所有器官的血管外隔室。蛋白質也在其他組織(血球、腦、腎臟、皮膚)中合成，但是速率較低。因為游離A1M的尺寸小，它在腎臟中從血液快速過濾。
A1M是脂鈣蛋白(lipocalin)超家族的一個成員，而脂鈣蛋白是一群來自動物、植物與細菌的蛋白質，具有守恆的三維結構但功能極為分歧。每一個脂鈣蛋白是由160-190個胺基酸鏈組成，摺疊成β-筒袋，具有疏水性內部。已知至少十二種人類脂鈣蛋白基因。A1M是一種26kDa的血漿與組織蛋白，到目前為止在哺乳動物、鳥類、魚類與蛙類中鑑別過。A1M經X射線結晶學測定的三維結構顯示於圖3中。A1M在肝臟中以高速率合成，分泌至血流中並且快速(T½=2-3分)運送穿過血管壁到達所有器官的血管外隔室。發現A1M是呈游離、單體形式還有與血液和間質組織中的較大分子(IgA、白蛋白、凝血酶原)共價複合這兩種形式。因為游離A1M的尺寸小，它在腎臟中從血液快速過濾。然後大部分被再吸收，但仍有相當數量被分泌至尿液。
A1M的序列及結構特性
已知人類A1M的完整序列。該蛋白質是由具有183個胺基酸殘基的多肽組成。已經從其他哺乳動物、鳥類、兩棲類及魚類偵測、分離及/或定序許多額外A1M cDNA及/或蛋白質。在物種之間，A1M的肽鏈長度略有不同，主要是因為C端的變異。不同推演胺基酸序列的排比比較顯示，一致性百分率有所改變，從囓齒動物或原蹄動物與人類之間約75-80%，低到魚類與哺乳動物之間約45%。在位置34處的游離半胱胺酸側鏈是守恆的。已顯示這個 基團參與氧化還原反應(見下文)，與其他血漿蛋白形成複合體並且結合至黃棕色發色團。A1M的三維結構顯示，C34會暴露於溶劑並且位在鄰近脂鈣蛋白口袋開口(參見圖3)。
在本文中，術語「α1-微球蛋白」欲含括如SEQ ID NO：1(人類A1M)還有SEQ ID NO：2(人類重組型A1M)中所鑑定的α1-微球蛋白，以及其具有相似治療活性的同源物、片段或變異體。因此，如本文所用，A1M欲表示與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性(identity)的蛋白質。較佳的是，如本文所用的A1M與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少90%序列一致性。更佳的是，如本文所用的A1M與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少95%(諸如99%或100%)序列一致性。在一個較佳態樣中，α1-微球蛋白與本文鑑定之SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相符。在圖12中提供人類A1M及人類重組型A1M的胺基酸序列之序列表(分別為SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2)及對應核苷酸序列(分別為SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4)。但是，具有如下文中鑑定之蛋白質重要部分的A1M同源物、變異體及片段也含括在如本文所用術語A1M中。
如上所提及，依據本文所述也使用A1M的同源物。理論上，所有物種的A1M可用於本文所述目的，包括大部分脊椎動物，其為來自魚類(鰈)。A1M也可以呈分離形式得自於人類、紅毛猩猩、松鼠猴、大鼠、裸隱鼠、小鼠、兔、天竺鼠、牛、蛙、雞、海象、海牛與鰈。
重要的是，要注意即便A1M與比庫寧(bikunin)有相同的前驅物，它們卻有不同的胺基酸組成且有不同特性。A1M屬於所謂脂鈣蛋白家族，而比庫寧(又稱為烏斯他汀(ulinastatin))屬於蛋白酶抑制劑超家族。
考量到A1M的同源物、變異體及片段，下面已鑑定出對於蛋白質的抗氧化效用重要的部分：
Y22(酪胺酸，位置22，鹼基對64-66)
C34(半胱胺酸，位置34，鹼基對100-102)
K69(離胺酸，位置69，鹼基對205-207)
K92(離胺酸，位置92，鹼基對274-276)
K118(離胺酸，位置118，鹼基對352-354)
K130(離胺酸，位置130，鹼基對388-390)
Y132(酪胺酸，位置132，鹼基對394-396)
L180(白胺酸，位置180，鹼基對538-540)
I181(異白胺酸，位置181，鹼基對541-543)
P182(脯胺酸，位置182，鹼基對544-546)
R183(精胺酸，位置183，鹼基對547-549)
(通篇文件中的胺基酸及核苷酸編號參照SEQ ID 1與3，亦參見圖3與4；若A1M來自其他物種，則採用A1M類似物或其重組型序列，習於技藝者將會知道如何鑑別負責酶促活性之活性位點的胺基酸)。
因此，在那樣的情況下，若A1M例如與SEQ ID 1或2之一者具有80%(或90%或95%)序列一致性，則較佳上文所提及的胺基酸存在於分子中的適當位置處。
人類A1M在三個位置中經寡糖置換，兩個為唾液酸化複合型(可能是以二觸角醣類連接至N17與N96)，而一者是連接至T5的更簡單寡醣。不同物種之間的A1M蛋白質的糖含量大為不同，從非洲爪蟾(Xenopus leavis)完全沒有 醣基化到不同的醣基化型態光譜。但是，一個在人類中對應於N96的醣基化位點於哺乳動物中是守恆的，暗示著這個特定糖可能在功能上具有重要性。
當自血漿或尿液純化出來時，A1M是黃棕色的。顏色是由共價結合至不同胺基酸側基的異源性化合物所造成，而這些胺基酸側基位在口袋入口處。這些修飾代表著在活體內被A1M共價捕獲之有機氧化劑的氧化降解產物，例如血色素、犬尿胺酸以及酪胺醯基。
A1M在電荷與尺寸上也各有不同且更為棕色的A1M分子帶有更多負電荷。異質性的可能解釋原因為不同的側基經不同基團修飾到不同程度，還有修飾會改變蛋白質的淨電荷。共價連接的有色物質局限在C34和K92、K118及K130，後者的分子量介於100和300Da。由血液透析患者的尿液中發現到，色胺酸代謝物犬尿胺酸共價附接至A1M的離胺醯基殘基，而且在這個情況下似乎是蛋白質呈棕色的來源[6]。合成分子ABTS(2,2'-次偶氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸)的氧化片段結合至Y22與Y132的側鏈。
C34是A1M的反應中心。它變得非常陰電性，表示它有非常高的潛力送出電子，因為近處K69、K92、K118以及K130的帶正電側鏈，引起C34硫醇基去質子化，是硫原子氧化的先決條件。初步數據顯示，C34顯示是已知最為陰電性的基團之一。
理論上，界定出A1M的特性的胺基酸(C34、Y22、K92、K118、K130、Y132、L180、I181、P182、R183)將在下面更詳細說明，它們以類似的三維構型排列在另一個骨架上，另一個骨架為例如具有相同球型摺疊的蛋白質(另一種脂鈣蛋白)或完全人工有機或無機分子(諸如塑膠聚合物、奈米粒子或金屬聚合物)。
這些胺基酸中的一些胺基酸的三維排列(藍色橢圓，離胺酸是「+」繪示)、A1M骨架(筒)、電子流以及自由基捕獲描繪於圖4中。
因此，較佳為含有包括如上所示反應中心及其周圍環境之結構的同源物、片段或變異體。
可在本揭示內容的多肽結構中進行修飾及改變且仍會產生與該多肽具有相似特徵的分子(例如守恆性胺基酸置換)。例如，某些胺基酸可以在序列中置換成其他胺基酸而預期不會喪失活性。因為其為交互作用力以及定義多肽生物功能活性的多肽性質，某些胺基酸序列置換可以在多肽序列中進行並仍能獲得具有相似特性的多肽。
在進行改變時，可能要考量胺基酸的親水指數。在技藝普遍理解賦予多肽之交互作用生物功能的親水胺基酸指數的重要性。已知某些胺基酸可以置換成其他具有類似親水指數或計分的胺基酸並仍會產生具有類似生物活性的多肽。基於每一個胺基酸的疏水性以及電荷特徵，會被分派一個親水指數。那些指數為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/半胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺酸(-3.5)；離胺酸(-3.9)；以及精胺酸(-4.5)。
咸信胺基酸的相對親水特性會決定所生成的多肽之二級結構，而二級結構又限定多肽與其他分子(諸如酶、受質、受體、抗體、抗原及類似物)的交互作用。技藝中已知胺基酸可以被另一種具有類似親水指數的胺基酸置換並且仍能獲得在功能上相等的多肽。在這樣的改變中，親水指標在±2 內的胺基酸置換較佳，在±1內更佳，而在±0.5內又更佳。
也可以基於親水性來進行相似胺基酸置換，尤其是由此所產生的生物學功能上相同的多肽或肽意欲用於免疫學實施中。已對胺基酸殘基分派下列親水性數值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺酸(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；脯胺酸(-0.5±1)；蘇胺酸(-0.4)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；蘇胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)；色胺酸(-3.4)。理解到胺基酸可以置換成另一個具有類似親水性數值的胺基酸並仍能得到生物學上等效，尤其是免疫學上等效的多肽。在這樣的改變下，置換胺基酸的親水性數值較佳在±2內，更佳在±1內，而在±0.5內又更佳。
如上所列，胺基酸置換通常是基於胺基酸側鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小以及類似性質。考量前述特徵中的一或多者之例示性置換為習於技藝者所熟知且包括，但不限於(原有殘基：例示性置換)：(Ala：GIy、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：GIn1 His)、(Asp：GIu、Cys、Ser)、(GIn：Asn)、(GIu：Asp)、(GIy：Ala)、(His：Asn、GIn)、(Ile：Leu、VaI)、(Leu：Ile、VaI)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Trp：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)，以及(VaI：Lle、Leu)。因此，本揭示內容的具體例含括如上文所示多肽之功能性或生物學等效物。具體而言，多肽的具體例可包括與感興趣多肽具有約50%、60%、70%、80%、90%及95%序列一致性的變異體。
在本文中，兩個胺基酸序列之間或兩個核酸序列之間的同源性是以參 數「一致性」來描繪。可以使用完全史密斯-瓦特曼排比(Smith-Waterman alignment)來排比序列並且計算同源性計分，均可用於蛋白質與DNA排比。預設計分矩陣BLOSUM50以及一致性矩陣分別用於蛋白質及DNA排比。空位中第一個殘基的罰分就蛋白質為-12而DNA為-16，而空位中其他殘基的罰分就蛋白質為-2而DNA為-4。排比也可以使使用FASTA套裝軟體v20u6版來進行。
蛋白質序列的多重排比可以使用「ClustalW」來進行。DNA序列的多重排比可以使用蛋白質排比作為模板，用DNA序列的對應密碼子取代胺基酸來進行。
或者可使用不同軟體來排比胺基酸序列及DNA序列。兩個胺基酸序列的排比是例如透過使用EMBOSS套裝軟體的Needle程式2.8.0版來決定(http：//emboss.org)。Needle程式實施其中所述的整體排比演算法。所使用的置換矩陣為BLOSUM6，空位開放罰分為10，而空位延伸罰分為0.5。
胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1與不同胺基酸序列(例如SEQ ID NO：2))之間的一致性程度計算為兩個序列排比時的確切配對數目除以「SEQ ID NO：1」的長度或「SEQ ID NO：2」的長度，端看何者最短。結果表示為一致性百分率。
當兩個序列在重疊的相同位置處具有相同胺基酸殘基，便產生確切配對。
若有關的話，則兩個核苷酸序列之間的一致性程度可以透過韋柏-利曼(Wilbur-Lipman)方法，採用LASER-GENETM MEGALIGNTM軟體(DNASTAR,Inc.,Madison,Wl)與同一性表格和下列多重排比參數來決定： 空位罰分為10和空位長度罰分為10。成對排比參數為K元組=3，空位罰分=3，以及窗=20。
多肽之胺基酸序列與SEQ ID NO：1胺基酸的同一性百分率可透過下列來決定：i)使用Needle程式，以及BLOSUM62置換矩陣、空位開放罰分為10以及空位延伸罰分為0.5來排比兩個胺基酸序列；ii)計算排比中的確切配對數目；iii)將確切配對數目除以兩個胺基酸中最短那一者的長度，以及iv)將iii)的除法結果轉換成百分率。以類似方式來計算與本發明其他序列的一致性百分率。
舉例來說，多肽序列可能與參考序列一致，也就是100%一致，或其相較於參考序列可包括至多某個整數數目的胺基酸變換，使得一致性%少於100%。這樣的變換選自：至少一個胺基酸刪除、置換(包括守恆性與非守恆性置換)或插入，且其中該等變換可能發生在參考多肽序列的胺基端或羧基端位置處，或者是這些末端位置之間的任一位置，在參考序列的胺基酸中個別參雜著，或在參考序列的一或多個相鄰基團處。
守恆性胺基酸變異體也可以包含非天然胺基酸殘基。非天然胺基酸包括，但不限於反-3-甲基脯胺酸、2,4-甲醇基脯胺酸、順-4-羥基脯胺酸、反-4-羥基脯胺酸、N-甲基-甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基高半胱胺酸、硝基-麩醯胺酸、高麩醯胺酸、哌啶甲酸、四氫噻唑羧酸、去氫脯胺酸、3-與4-甲基脯胺酸、3,3-二甲基脯胺酸、第三-白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯基-丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸，以及4-氟苯丙胺酸。在技藝中已知數種用於將非天然胺基酸殘基併入蛋白質的方法。例如，可採用活體外系統，其中無意義突變使用化學胺基醯化壓抑 因子tRNA而受到壓制。用於合成胺基酸以及胺基醯化tRNA的方法為技藝中已知。在無細胞系統中進行含有無意義突變的轉錄與轉譯質體，該無細胞系統包含大腸桿菌S30萃取物以及商業上可購得之酶與其他試劑。透過層析純化蛋白質。在第二個方法中，於非洲爪蟾中藉由微注射經突變的mRNA以及以化學方式胺基醯化之壓抑因子tRNA來進行轉譯。在第三個方法中，於不存在要被取代之天然胺基酸(例如苯丙胺酸)以及存在所需非天然胺基酸的情況下培養大腸桿菌細胞，非天然胺基酸為2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸，或4-氟苯丙胺酸。非天然胺基酸被併入蛋白質中來取代其天然相對物。天然胺基酸殘基可以透過活體外化學修飾被轉換成非天然物質。化學修飾可以結合定點突變來進一步擴大置換範圍。替代性化學結構提供足以支持A1M抗氧化特性的3維結構，這可以透過其他技術(例如人工骨架、胺基酸置換及類似技術)來提供。此外，如上文所列並於圖3及4中所繪，預期模擬A1M活性位點的結構具有與A1M相同的功能。
醫藥組成物及劑量
本發明亦提供包含以下的套組： i)包含PRRN的醫藥組成物，以及 ii)包含A1M的醫藥組成物。
該套組呈含有上述兩種組成物的套裝形式。
包含PRRN的醫藥組成物通常是已在販售的組成物。
包含A1M(或如本文定義之其類似物、片段或變異體)的醫藥組成物希望用於i.v.投藥。因此，A1M可以調配成液體，例如溶液、分散液、乳液、懸浮液等。從本文實例看來，用於i.v.投藥的適當媒劑可以是由10mM Tris-HCl、pH 8.0與9.125M NaCl組成。
關於非經腸使用所適用的溶劑包括水、植物油、聚丙醇以及一般經核准用於此等用途的有機溶劑。大體上，習於技藝者可以在Gennaro等人編著的「Remington’s Pharmaceutical Science」(Mack Publishing Company)中、在Rowe等人編著的「Handbook of Pharmaceutical Excipients」(PhP Press)以及官方專著(例如Ph.Eur或USP)中找到指引，這些是有關於用於特定類型調配物的相關賦形劑以及製備特定調配物的方法。
A1M將會以一或數個劑量與放射性核種治療劑量一起投與。較佳地，每一個劑量是i.v.投與，不論是單劑量、單劑量之後在至多60分鐘的短期間內緩慢輸注，或只在至多60分鐘的短期間內緩慢輸注。第一個劑量將會在與放射性核種治療肽相同的時間投與，或在注射放射性核種劑量之前0-60分鐘到注射後0-30的期間投與。可在注射放射性核種治療劑量之後增加額外的A1M劑量，但不是必要的。每一個劑量含有某個數量的A1M，其與患者體重有關：1-15mg A1M/患者的kg。在所述研究中，於本文實例中採用的劑量為7mg/kg(小鼠模型)。
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圖式說明
圖1顯示125I-A1M(上左)及111In-奧曲肽(上右)在正常NMRI小鼠中的生物分布。下左圖顯示兩種分子在腎臟中隨著時間的攝取。數據表示為4隻動物的%IA/g±SEM。
圖2顯示在注射後10、20及60分鐘時，全長A1M於正常NMRI小鼠腎臟與血清中的存在。動物i.v.注射150μg AIM且在指定時間點收集血液與腎臟。容許血液凝集並透過離心分離血清。一個腎臟在1ml PBS中均質化且離心。1μl血清及6μl的腎臟均質物上清液被施加至SDS-PAGE，轉移至PVDF-膜且用抗-A1M點漬。每個泳道代表一隻個別小鼠。
圖3顯示A1M的三維結構。圖式是使用PyMOL[Molinspiration,M.v. (2014)]產生並且與人類A1M的晶體結構相等[Meining,W.,and Skerra,A.(2012)The crystal structure of human α1-microglobulin reveals a potential haem-binding site.Biochem J 445,175-182]。β-股及α-螺旋以綠色絲帶顯示。C34、K92、K118、K130與H123的側鏈參與A1M的功能活性，顯示為綠色棒條，其中氮原子為藍色。四個脂鈣蛋白環標示#1-#4。
圖4顯示一些胺基酸的三維排列(藍色橢圓，離胺酸是「+」繪示)、A1M骨架(筒)、電子流以及自由基捕獲。
圖5 A-D顯示A1M及奧曲肽-A647在不同注射後時間的小管局限化。A1M及奧曲肽-A647結合物經i.v.注射且在注射後20分鐘(A、C)與4小時(B、D)取動物性命。於共軛顯微影像(20x/0.8物鏡)內在皮質、髓質與集尿管的選定小管圖中測定共局限A1M(綠色)及奧曲肽-A647(紅色)的百分率。使用DAPI使細胞核顯像(藍色)。代表性概況(A、B)顯示不同程度的共局限化(黃色)，而所有研究樣品的共局限化數據呈現為代表性區域的平均±SEM(C、D)。標尺表示50μm。
圖5 E-F顯示A1M及奧曲肽-A647在不同注射後時間的細胞共局限化。A1M及奧曲肽-A647結合物經i.v.注射且在注射後20分鐘與4小時(E，左與右)取動物性命。於高解析度共軛顯微影像(63x/1.4物鏡)內在皮質的選定小管圖中測定共局限A1M(綠色)及奧曲肽-A647(紅色)的百分率。使用DAPI使細胞核顯像(藍色)。代表性概況(E)顯示不同程度的細胞內共局限化(黃色)，而所有研究樣品的共局限化數據呈現為代表性區域的平均±SEM(F)。標尺表示20μm。
圖6顯示注射5MBq 111In-奧曲肽(A與B)以及5MBq 125I-A1M(C與D)的正 常NMRI小鼠並顯像歷時40分鐘的臨床前SPECT/CT影像。A與C顯示整個動物的重建三維圖而B與D顯示穿過腎臟的平面截面。腎臟顯示有高攝取率並在腎臟皮質中可以看到兩種分子的濃度。關於125I-A1M，在甲狀腺中可以觀察到些許攝取。
圖7顯示111In-奧曲肽及125I-A1M在正常小鼠腎臟中攝取的數位自動放射攝影術影像。(A)125I-A1M，20min p.i.；(B)125I-A1M，1h p.i.；(C)111In-奧曲肽，20min p.i.；(D)111In-奧曲肽，1h p.i.。所有影像顯示兩種分子在腎臟皮質中的局限性攝取。注意到每個影像的尺度已經過調整，好能夠最佳繪示出放射性核種在每個腎臟切片中的相對分布。
圖8顯示於i.v.注射後20分鐘，A1M免疫反應性在腎臟中的分布。A1M經i.v.注射，20分鐘後取動物性命，且利用免疫組織化學以K323抗-A1M抗體偵測A1M免疫反應性。左方顯示在皮質(A)、髓質(B)還有集尿管(C)中具有A1M-免疫反應性的代表區域；這些區域的位置在A-C不同並且以盒表示在右方的概圖中。A-C中的標尺表示100μm。
圖9顯示i.v.注射後20分鐘與4小時，A1M免疫反應性及奧曲肽-A647在腎臟中的分布。以K323抗-A1M抗體，使用免疫組織化學(左欄；亮視野顯微術)或免疫螢光(中間與右欄；共軛顯微術)偵測皮質(A)、髓質(B)和集尿管(C)中的A1M免疫反應性。在注射後20分鐘(中)與4小時(右)研究A1M免疫螢光(綠色)及奧曲肽-A647(紅色)，及其小管共局限化(黃色)的分布。使用DAPI(藍色)令細胞核顯影。標尺表示50μm。
圖10顯示A1M免疫螢光及奧曲肽-A647在i.v.注射之後的細胞共局限化。A1M及奧曲肽-A647結合物經i.v.注射並且在注射後20分鐘取動物性 命。高解析度(63x/1.4物鏡)共軛顯微影像顯示，A1M免疫螢光(綠色)與奧曲肽-A647標記(紅色)的細胞內分布。細胞核染上DAPI(藍色)，且毒蠅虎蕈鹼-Texas Red(灰色)用來描繪小管輪廓。在一個細胞中強調螢光的解析(A；箭頭)是透過測量沿著就在細胞核外側之細胞質輪廓的螢光強度(B；黃線)來顯示，提供呈紅色與綠色通道中沿著輪廓的強度(C)作為強度概況(D)，其中每個通道為8位元(256強度位準)。標尺表示10μm。
圖11顯示實例2的結果。
圖12顯示序列SEQ ID 1-4。
實例1
實驗
材料與方法
重組型人類A1M
依據Kwasek等人[25]所述在大腸桿菌中表現重組型人類A1M，純化並且再摺疊，但是加上一個額外離子交換層析步驟。這是透過將A1M施加至DEAE-Sephadex A-50管柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上來實施，該管柱經20mM Tris-HCl，pH8.0平衡。使用線性鹽梯度(從20mM Tris-HCl，pH8.0至20mM Tris-HCl，0.2M NaCl)以1ml/min的流速溶離A1M。依據在280nm下的吸光度，收集並濃縮含有A1M的餾分。
A1M的 125 I-標記
用125I的A1M放射性標記是利用氯胺T法[26]來完成。簡言之，在0.5M磷酸鈉，pH 7.5中分別以1mg/ml以及10mCi/ml的最終濃度來混合AlM以及 125I(Perkin-Elmer,NEZ033005MC)。將氯胺T添加至0.4mg/ml，並容許在冰上反應歷時2分鐘，且藉由添加NaHSO3達0.8mg/ml來中止反應。透過凝膠層析在Sephadex G-25管柱(PD10,GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)上將結合蛋白質的碘與游離碘分離。獲得比活性為大約50-200kBq/μg的蛋白質。
奧曲肽
由Mallinckrodt Pharmaceuticals(http：//www.mallinckrodt.com/)購得生長抑制素類似物肽奧曲肽，並且依據製造商的說明書標記111In還有Alexa 647(HiLyte Fluor 647；AnaSpec,Seraing,Belgium)。這些化合物分別稱為111In-奧曲肽以及奧曲肽-647。
動物研究
遵循關於實驗室動物保護的本國法律以及在動物研究倫理委員會(Lund University,Sweden)核可下進行所有動物實驗。使用6-8週大的雄性與雌性NMRI正常小鼠(Taconic,Ry,Denmark)。
生物分布
進行生物分布研究，以便確定125I-A1M與111In-奧曲肽的藥動學以及生物分布。透過尾靜脈注射至NMRI小鼠來i.v.投與125I-A1M(100kBq，1μg)以及111In-奧曲肽(100kBq，10μg)(每種注射分子以及時間點n=3)。在注射後10、20、40、60分鐘(A1M以及奧曲肽均是)，注射後4與24小時(奧曲肽)取動物性命並且取樣血液和器官，秤重並且在NaI(TI)孔計數器(Wallac Wizard 1480 Wizard,Perkin Elmer)中進行測量。器官特異性攝取數值計算為每公克組織的注射活性百分率(%IA/g)或注射活性百分率(%IA)。
數位自動放射攝影術
使用Biomolex 700成像系統(Biomolex AS,Norway)來實施數位自動放射攝影術。兩組(n=2)正常小鼠i.v.注射125I-A1M(0.5MBq，5μg)以及111In-奧曲肽(0.5MBq，50μg)。使用乾冰將腎臟冷凍在包埋介質中且在恆冷器(Leica Microsystems AB,Sweden)中以50μm厚度切片進行切片，並在Biomolex系統中成像。使用內部軟體重建影像。
西方墨點
對已i.v.注射未標記A1M(100μl/動物，1.5mg/ml)的動物的腎臟以及血清進行SDS-PAGE分析。在注射後10、20及60分鐘之時取動物性命，取樣血液和腎臟，並洗滌腎臟且放在1ml PBS中。在機械組織均質化之後，以10,000xg離心組織歷時10分鐘並且將上清液轉移至一個新管中且如下用於進一步分析。以1,000xg離心歷時10分鐘從血液樣品獲得血清。在還原條件下進行SDS-PAGE並且使用Trans-Blot Turbo轉移系統(Bio-Rad,Delaware,USA)將分離的蛋白質轉移到聚二氟亞乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P,Millipore,Bedford,MA,USA)。接著將PVDF膜阻斷並如前述與兔多株抗-A1M抗血清的IgG部分(K322,5μg/ml)一起培育過夜[28]，之後與Alexa Fluor 647山羊抗-兔IgG(稀釋3000x；Molecular Probes)一起培育。使用ChemiDoc MP成像系統(BioRad)使膜顯影。
SPECT成像
在NanoSPECT/CT(Bioscan,Washington DC,USA)中進行成像期間，用2%至3%異氟烷氣體(Baxter；Deerfield,IL,USA)麻醉動物。動物經i.v.注射約5MBq的125I-A1M(約30μg)以及5MBq的111In-奧曲肽，並在注射後20分鐘使用NSP-106多針孔小鼠投影照準儀成像。關於125I，20%的成像能量窗對準35 keV光顛，而111In是175與241光顛。使用HiSPECT軟體(SciVis；Goettingen,Germany)重建SPECT數據。在每一次全身SPECT之前完成CT成像。在SPECT成像之後1小時之時，切下腎臟並包埋在Tissue-Tek® O.C.TTM化合物(Sakura Finetek；Alphen aan den Rijn,The Netherlands)中，且在乾冰上冷凍。將冷凍樣品以10μm的厚度進行冷凍切片用於在Biomolex系統上的自動放射攝影術分析。將腎臟切片染上邁爾氏蘇木素與色變素2R，Ch2R(均來自Histolab；Gothenburg,Sweden)，並使用光學顯微玻片掃描儀(Mirax Midi,Carl Zeiss；Oberkochen,Germany)掃描。
腎臟-樣品製備以及A1M的免疫標記
在同時i.v.注射150μg A1M(未結合)以及100μg Alexa 647-標記奧曲肽(奧曲肽-647)之後，在10、20、40、60分鐘與4小時後犧牲動物。評估所有時間點，但僅評估20分鐘與4小時的腎臟，以細胞層次顯示詳細分析，包括雷射共軛掃描顯微術還有量化影像分析。重要的是，對野生型以及裸鼠進行所有實驗與評估，且顯示具有相同的標記型態。但是，只納入野生型數據。
在安樂死之後，直接移除腎臟冷凍並且包埋在Tissue Tec中。在恆冷器(Microm,HM 500OM,Walldorf,GmbH)中將組織塊切片，而切片(10μm)收集在SuperFrost plus玻片(Merck,Darmstadt,Germany)上。進行連續切片，每個玻片收集3-4個切片，相鄰玻片用於色素原免疫組織化學(IHC)或免疫螢光(IF)標記。在4%聚甲醛(PFA,Sigma,St.Louis,MO,USA，溶解於PBS,0.1M,pH 7.4)中後固定切片歷時15分鐘，然後在PBS中沖洗兩次歷時5分鐘。
關於A1M的單一標記，將切片與0.03%過氧化氫(H2O2,Merck, Darmstadt,Germany)一起培育歷時五分鐘，用於色素原顯像(IHC)。關於色素原以及螢光顯像，將切片與1%牛血清白蛋白(BSA,Sigma,St.Louis,MO,USA；稀釋於PBS中)一起培育歷時30分鐘。然後在4℃下，切片與兔抗-人類A1M(K：323,IgG)(稀釋：7500(於含有1% BSA、0.02% Triton X-100的PBS(Sigma,St.Louis,MO,USA)中))一起培育歷時16小時。
關於A1M的色素原顯像，在RT下，將切片與結合辣根過氧化酶(HRP,Dako Glostrup,Denmark)的山羊抗-兔IgG一起培育歷時20分鐘。經由於室溫下在含有0.03% H2O2的二胺基聯苯胺(DAB)溶液中培育歷時10分鐘進行免疫反應。在PBS中沖洗切片(2 x 10分鐘)並使用蘇木精(Mayers,Hematoxylin Mayers Htx Histolab Products AB,Gothenburg,Sweden)進行對比染色，然後在連續梯度酒精中脫水並浸入100%二甲苯中。將切片封片並於Pertex(Histolab Products AB,Gothenburg,Sweden)中蓋上玻片。
關於A1M的IF標記，用於同時偵測奧曲肽-647，將切片與一級抗體如上文關於色素原偵測一起培育，然後是結合Alexa Fluor 488(AF488,Invitrogen,Molecular probes,USA)的二級山羊抗-兔IgG(1：150稀釋於含有1% BSA的PBS中)。在室溫下進行培育歷時45分鐘後，在室溫下於4',6-二甲脒基-苯基吲哚(DAPI，細胞核標記，Invitrogen,Molecular probes,USA)中培育歷時15分鐘。一部分切片也在室溫下與結合Texas Red(結合至F-肌動蛋白)的毒蠅虎蕈鹼一起培育歷時1小時，以便在形態上描繪小管結構。將切片浸入PBS中並封片且在抗褪色溶液(Prolong Gold,Invitrogen,Molecular probes,USA)中蓋上玻片。
A1M及奧曲肽-647在腎臟切片中的光學偵測
使經色素原單標記的AIM顯像並且以數位的方式記錄在亮視野顯微鏡(Leica DMRE)中。使用Leica數位相機(DFC 500)收集數位影像。校正繪圖用影像的顏色平衡、亮度以及對比。
關於在組織學與細胞層次下同時使經IF標記的AIM(A1M-AF488)以及奧曲肽-647顯像，使用Zeiss共軛雷射掃描顯微鏡(CLSM,LSM 510 META,Dept.Biology,Lund University)。經由掃描Alexa Fluor 488(A1M)、HiLyte Fluor 647(奧曲肽)、Texas Red(F-肌動蛋白)以及DAPI(細胞核)的發射來檢查切片。
透過皮質、髓質與集尿管的區域來收集一或數個光學切片(Z-堆疊)的光學影像數據。使用影像紀錄來計算A1M-AF488及奧曲肽-647螢光的個別存在與共存在。關於紀錄，每個切片收集3個腎臟區域作為代表性區域(x/y階段位置標記並被擷取軟體ZEN 2009儲存)。使用20x/0.8 Plan Apochromat物鏡(提供1.8μm厚度光學切片具有約400nm x/y光學解析度)，還有使用63x/1.4油浸Plan Apochromat物鏡(提供0.9μm厚度光學切片具有約250nm x/y光學解析度)進行掃描(以1024x1024框大小)。光學切片以及掃描深度的選擇是由掃描場域中大多數細胞核(DAPI標記)的中心位置來決定。進行順序掃描，通道顯示AF488、HiLyte Fluor 647、DAPI以及Texas Red螢光。關於每個通道，選出具有最高螢光強度的腎概況做為參考，自其對擷取設定(雷射功率、PMT偵測器獲得、數位偏位)進行最佳化並用於所有掃描區域。這裡呈現的影像繪示是選自於個別光學切片，含有用於量化測量的區域/結構。
奧曲肽-647與A1M在腎臟切片中的量化影像分析
奧曲肽-647螢光以及A1M-AF488 IF的CLSM影像用於量化分析。研究 在腎臟結構(從皮質、髓質與集尿管)中還有在小管上皮細胞中的詳細分布。每個CLSM影像分析三(3)個區域而每隻動物分析10至20個影像。使用ImageJ軟體(Version 1.49g,Rasband,W.S.ImageJ,NIH,USA)開發分析程序用作為宏文本。簡言之，用「堆成影像(Stack to Images)」顯示的CLSM影像呈現所有合併在一起的通道的混成(關於AF488、HL647、DAPI以及Texas Red)。從小管結構的型態來選擇樣品區域並且由細胞核及/或毒蠅虎蕈鹼標記來描繪。使用lasso功能來限定測量用的個別區域。然後使用綠色(A1M-AF488)與紅色(octreotide-647)通道作為輸入影像，並使用「共局限化」外掛程式來檢視個別綠色或紅色畫素的比率或其共局限化。使用Origin 9.0軟體(Microcal,Northampton,MA,USA)實施統計分析。圖5中的直方圖顯示從3個腎臟在每一個時間點獲得的代表性數據並且繪製為平均±SEM。
結果
生物分布
圖1顯示111In-奧曲肽在注射後10、20、40及60分鐘時的活體內生物分布，以及125I-A1M在注射後10、20、40及60分鐘還有注射後4小時與24小時的離體生物分布。也繪示兩種分子在腎臟中隨著時間的比較攝取(%IA/g)。在腎臟中觀察到111In-奧曲肽及125I-A1M均有高攝取，其中峰值分別是在注射後10與20分鐘。透過SDS-PAGE與西方墨點研究血液血漿與溶解腎臟中的注射之非標記A1M的尺寸分布。如圖2中所示，腎臟及血清中的A1M永遠以均質條帶移動，表觀分子量約25kDa，而一個較細、微弱的條帶約50kDa。強烈的條帶最有可能表示單體A1M，理論分子量為22.6kDa，而後者為二聚體形式。在10分鐘時看到最高數量，支持顯示於圖1、下方之經125I標記A1M 的動力學。這些結果顯示，在血液與腎臟中所發現的A1M是完整的且是全長，因此降解無關緊要。
SPECT/CT影像分析
針對111In-奧曲肽以及125I-A1M進行量化SPECT/CT分析，並且使腎臟中的活性分布顯像。圖6中的SPECT/CT影像證實，兩種分子在腎臟中有高攝取。相較於111In-奧曲肽(圖6A與B)，儘管在周邊腎臟結構中可看到更高濃度125I-A1M(圖6C與D)，但兩個分子似乎共局限在腎臟皮質中。在甲狀腺中也可看到有些許125I-A1M攝取。忽略111In-奧曲肽於膀胱內集中的活性，因為訊號強烈到使其難以證明在腎臟中的分布與吸收。
數位自動放射攝影術
展示於圖7中的數位自動放射顯微術結果清楚繪示出，兩種分子局限在腎臟皮質中，與SPECT/CT結果相互映對。可以觀察到，在注射後20與60分鐘時的結果相似，指明肽與蛋白質的定位是在20分鐘後就完成。在這些影像中沒有觀察到更多次隔室化；但是，在皮質中的活性分布不全然是均質的。前兩個影像(圖7A及B)與之後兩個影像(圖7C及D)之間可觀察到在對比與解析度上有明顯差異。除了其低能量變換電子(30.6keV)以外，125I也在27.5及27.2keV發射低能量x-射線光子。這些光子在影像中提供噪音，且能量接近變換電子使其難以從最後影像中被排除。
螢光顯微術
A1M免疫反應性主要分布於皮質中，其中至髓質與集尿管中的免疫反應性降低。還有，A1M免疫反應性標記的強度在皮質中最高，在髓質中較弱，而在集尿管中最弱。於注射後20分鐘，在腎臟中選定區域的A1M免疫 分布顯示於圖8與9(左方)中。強烈的標記出現在小管結構的子集合中，在形態上描繪成牽連近端小管與腎小球子集合。A1M及奧曲肽-A647的螢光雙重標記證明其共同存在於小管中，還有高度的細胞共局限性(圖5、9與10)。兩個分子在注射後20分鐘於髓質與皮質中有強烈的標記，包括高度小管共存在以及細胞共局限性(亦參見圖10)。在注射後4小時之時，兩個分子的螢光偵測有明顯降低，在皮質與髓質中相當低，而在集尿管中不存在(圖9)。在注射後20分鐘以及4小時，從CLSM影像進行兩種分子之小管局限性的量化分析，且顯示在注射後20分鐘之共局限性的對應程度(圖5)。當在細胞層次上研究小管結構中的共局限化時，如同在圖5中所顯像以及量化般，於皮質中看到類似結果。透過在指定輪廓內個別畫素強度的比對證明了A1M及奧曲肽-A647的細胞內共局限性(圖5)。
實例2
使用A1M在PPRT中的腎臟短期輻射保護
除非另有說明，否則在實例1中提到的材料以及方法也使用於實例2中。
目的：包括使用A1M治療之8-日77Lu-奧曲肽PRRT腎臟損傷小鼠模型的初步測試
放射性核種活性：150MBq 177Lu-DOTATATE(177Lu-DOTA0，Tyr3]奧曲肽)
輻射保護以及安全性：150MBq 177Lu-DOTATATE在1cm的距離處提供7mSv/h。
A1M劑量：7mg/kg(於媒劑2中：10mM Tris-HCl,pH 8.0+0.125M NaCl)
A1M-治療時間點：T=0且T=+60min。NB、177Lu-DOTATATE以及A1M在T=0時個別注射。
分析方法：
程序
取決於可用性(Lu-177-oct)，如下將各組排定優先順序：1天、8天、4天。
樣品處理：
1.血液：
將血液取樣至管中。依據說明書進行離心並且將血漿/血清轉移至新管中。冷凍於-80℃下。
2.尿液：
立刻冷凍於-80℃下。
3.腎臟：
a.PCR-將一個腎臟切成2個部分。放在2個不同管中(一個用於mRNA而一個用於蛋白質萃取)並置放在乾冰上。
b.顯微術以及自動放射攝影術
●一些腎臟在哥本哈根進行成像。
●將腎臟立刻乾燥並且冷凍於液態氮中。
4.器官活性
依據與先前研究相同的程序，使用一個腎臟用於活性分析。亦參見第6點。
5.SPECT分析：
在第8天對第4組(至少3隻動物)進行
6.其他器官：
可能的話，也處理肝臟、脾臟、心臟、小腸、大腸、腦、胰臟、肺臟與皮膚(放置在乾冰上)，並且依據先前程序分析活性。器官稍後用於蛋白質分析。
結果
在第一個實驗中，Balb/c(nu/nu)小鼠注射50MBq 177Lu-奧曲肽(DOTATATE)、150MBq 177Lu-奧曲肽(DOTATATE)+150μg A1M，或僅有緩衝液(對照)。讓小鼠放著歷時1天或8天，然後犧牲同時採樣血漿與尿液，如上所述。因此，收集6組(n=4)的樣品：
作為腎臟功能的初步估算，測量血漿中的肌酸酐，並且測量尿液樣品中的白蛋白(圖11)。血漿肌酸酐是腎小球過濾率(GFR)的一個標記，而結果暗示DOTATATE注射在1天與8天後均會造成肌酸酐位準明顯增加，亦即GFR降低。同時輸注A1M會使GFR回到對照位準，而這個效用在8天後非常明顯(P<0.01)。為了要估算蛋白尿，尿液中的白蛋白濃度因為DOTATATE注射而在1天與8天後均明顯升高，且在1天後更為明顯。同時A1M治療會使得蛋白尿在1天後，而非8天後顯著降低。
歸納來說，177Lu-奧曲肽注射導致腎臟功能不能(腎小球過率降低及蛋白尿)，而這可以在A1M的共同治療下獲得治療。
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Claims (28)

  1. 一種α1-微球蛋白(A1M)，其用於診斷或治療分別需要放射性核種診斷法(RD)、放射性核種治療(RNT)或放射性免疫治療(RIT)的惡性病，其中A1M用作為RD、RNT或RIT的共同治療。
  2. 如請求項1使用之A1M，其中A1M降低在RD、RNT或RIT中觀察到的腎臟相關副作用。
  3. 如請求項1或2使用之A1M，其中RD、RNT或RIT是藉由使用標記放射性核種的化合物來進行。
  4. 如請求項3使用之A1M，其中標記放射性核種的化合物是選自由受體配體、親和體分子(Affibody molecules)、雙功能抗體(Diabodies)、抗體片段，及/或其他小分子組成之群。
  5. 如請求項3或4使用之A1M，其中化合物被放射性核種標記。
  6. 如請求項3至5使用之A1M，其中標記放射性核種的化合物是生長抑制素類似物。
  7. 如請求項6使用之A1M，其中生長抑制素類似物是選自由奧曲肽(octreotide)、蘭瑞肽(lanreotide)、Tyr3-奧曲肽、Tyr3-多他曲肽(octrotate)、DOTADOC、DODATATE、DOTA-蘭瑞肽、帕瑞肽(pasireotide)、多巴抑制素(dopastatin)及奧曲肽LAR組成之群。
  8. 如前述請求項中任一項使用之A1M，其中惡性病為癌症。
  9. 如前述請求項中任一項使用之A1M，其中惡性病為神經內分泌腫瘤。
  10. 一種A1M與標記放射性核種的化合物，其用於診斷或治療分別需要放射性核種診斷法(RD)及放射性核種治療(RNT)或放射性免疫治療(RIT) 的惡性病。
  11. 如請求項10使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中A1M降低在RD、RNT或RIT中觀察到的腎臟相關副作用。
  12. 如請求項10或11使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中標記放射性核種的化合物是選自由受體配體、親和體分子、雙功能抗體及抗體片段組成之群。
  13. 如請求項10至12中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中標記放射性核種的化合物是與發射輻射之放射性核種偶合的肽。
  14. 如請求項10至13中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中標記放射性核種的化合物是生長抑制素類似物。
  15. 如請求項10至14中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中生長抑制素類似物是選自由奧曲肽、蘭瑞肽、Tyr3-奧曲肽、Tyr3-多他曲肽、DOTADOC、DODATATE、DOTA-蘭瑞肽、帕瑞肽、多巴抑制素及奧曲肽LAR組成之群。
  16. 如請求項10至15中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中惡性病為癌症。
  17. 如請求項10至16中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中惡性病為神經內分泌腫瘤。
  18. 如請求項1至9中任一項使用之A1M或如請求項10至17中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中標記放射性核種的化合物在時間t=0時被投與至需要RNT或RIT的個體，而A1M在介於t=-60分鐘至約t=30分鐘之間的時間被投與至該個體。
  19. 如請求項1至9中任一項使用之A1M或如請求項10至17中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中標記放射性核種的化合物在時間t=0時被投與至需要RD、RNT或RIT的個體，而A1M在介於t=-30分鐘至約t=30分鐘之間的時間被投與至該個體。
  20. 如請求項1至9中任一項使用之A1M或如請求項10至17中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中標記放射性核種的化合物在時間t=0時被投與至需要RD、RNT或RIT的個體，而A1M在介於t=-10分鐘至約t=10分鐘之間的時間被投與至該個體。
  21. 如請求項1至9中任一項使用之A1M或如請求項10至17中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中A1M及標記放射性核種的化合物基本上同時投與。
  22. 如請求項1至9中任一項使用之A1M或如請求項10至17中任一項使用之A1M與標記放射性核種的化合物，其中A1M及標記放射性核種的化合物同時投與。
  23. 如請求項1至9中任一項使用之A1M或如請求項10至17中任一項使用之標記放射性核種的化合物，其中A1M在放射性核種注射後第一週期間以數個劑量每日投與。
  24. 一種用於治療腎臟損傷的A1M。
  25. 如請求項24使用之A1M，其中腎臟損傷是有關於RNT或RIT的影響。
  26. 如請求項24使用之A1M，其中腎臟損傷是有關於鏈球菌感染、大腸桿菌感染(eHUS)、自體免疫性(SLE)、糖尿病等的影響。
  27. 一種A1M，其用於在放射性核種診斷法(放射性核種成像)中降低不欲的 生物影響。
  28. 一種A1M，其用於在放射性核種診斷法(放射性核種治療)中達到ALARA原理。
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