TW201626997A - 羽扇豆醇醋酸及薑黃素之協同組合用於治療或預防蝕骨細胞前驅物活化相關疾病 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於以羽扇豆醇醋酸及薑黃素之協同組合物，用於治療或預防蝕骨細胞前驅物活化相關疾病，包括類風濕關節炎及骨質疏鬆症。

Description

羽扇豆醇醋酸及薑黃素之協同組合用於治療或預防蝕骨細 胞前驅物活化相關疾病
本發明係關於羽扇豆醇醋酸及薑黃素之協同組合物，及其用於治療及預防蝕骨細胞前驅物活化相關疾病的用途。更特別地，本發明係關於以低劑量羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate,LA)結合薑黃素之組合物，用於調節免疫功能、抑制類風濕性關節炎以及蝕骨細胞生成相關疾病。
類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)屬於一種慢性發炎的疾病，在疾病發生時免疫細胞會分泌許多促發炎的細胞激素(proinflammatory cytokines)與趨化因子聚集在發炎處。發炎處被活化的巨噬細胞會分泌更多促發炎的細胞激素，導致一連串的發炎反應，以及在關節炎中導致骨頭損傷、軟骨崩解等蝕骨細胞生成所造成的傷害。
目前臨床用於治療類風濕性關節炎的藥物，大多為類固醇類(steroid)，非類固醇的抗發炎藥物(non-steroid anti-inflammation drugs)和一些針對細胞激素的生物製劑，例如抗TNF-α、抗IL-1β、抗IL-6等抗體，來治療(Breedveld FC.Arthritis Res 2002,4(2)：27；de la Torre I等人Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res 2013,13(3)：407-414)。但是這類的治療藥物不僅價格昂貴，也有一定程度的副作用。
羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate,LA)，屬於三帖類(triterpene)化合物，是由乳油木果中萃取的成分之一。羽扇豆醇醋酸結構類似固醇，在Siddique HR & Saleem M之論文(Life Sci 2011,88(7-8)：285-293)中，已談及羽扇豆醇醋酸具有抗發炎、抗氧化、抑制血管新生、癌細胞增生以及免疫調節…等 特性。雖然目前曾有專利(例如美國專利申請案US 20120177754)揭露，羽扇豆醇醋酸具有抑制發炎以及對類風濕性關節炎之療效，然而依據動物模式實驗顯示，即使以高純度天然萃取的羽扇豆醇醋酸(95%)治療小鼠關節炎，仍需要長期使用較高劑量(100mg/kg，連續12天)，才有顯著治療效果。這對於製藥界而言，價格昂貴的高純度羽扇豆醇醋酸(95%)其製藥成本過高，在臨床使用上無法嘉惠所有病人。
薑黃素(curcumin,Cur)為薑黃(Turmeric)的主要萃取組成分，是咖哩粉中常見的香料成分。薑黃是一種地下根莖植物，薑黃屬(curcuma)之longa種，即俗稱之鬱金(Turmeric)，其價格低廉，已被許多研究證實可藉由調節多種標的分子而具有免疫調節及抗腫瘤的特性，在許多動物實驗中也得到證實具有抗氧化、抗發炎、抗動脈粥樣硬化等功效，亦已知能抑制發炎與小鼠關節炎的產生，但由於其生物吸收(bioavailability)效果不佳，因此在臨床應用上仍存在著許多限制。
本發明首先嘗試將羽扇豆醇醋酸與薑黃素組合，尋求此兩種藥物的結合比例，以期一方面能顯著降低藥物的製藥成本，另一方面對於蝕骨細胞前驅物活化相關疾病，包括類風濕性關節炎及骨質疏鬆症等，能產生最佳的治療或預防功效，在將來臨床應用時能夠嘉惠所有患者。
本發明基於以上之目的發現，合併羽扇豆醇醋酸與薑黃素這兩種藥物，可明顯降低巨噬細胞的活化以及蝕骨細胞的生成，以低濃度羽扇豆醇醋酸結合薑黃素使用後，不僅可產生協同作用有效降低羽扇豆醇醋酸的使用量，亦能改善薑黃素在體內的生物吸收，以及減少骨頭流失。
於是，本發明之一方面係關於，一種用於治療或 預防蝕骨細胞生成相關疾病之醫藥組成物，包含羽扇豆醇醋酸與薑黃素，以一定之組成含量或比例組合。
於本發明之較佳具體實施態樣，所述之組成物包含25至50mg/kg羽扇豆醇醋酸與40-50mg/kg薑黃素，及醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。於本發明之一些具體實施態樣，所述之羽扇豆醇醋酸與薑黃素係以0.5：1至1：2，較佳地1：1至1：2之比例組合。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之蝕骨細胞生成相關疾病為類風濕性關節炎(RA)。於本發明之其他具體實施態樣，所述之蝕骨細胞生成相關疾病為骨質疏鬆症。
圖1為結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)治療類風濕關節炎及骨質疏鬆的機制。圖中，向上藍色箭頭表示增強作用，向下紅色箭頭則表示抑制作用。
圖2係評估RAW 264.7經(A)薑黃素(curcumin)(B)羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)與(C)結合兩種藥物處理後之細胞存活。
圖3為羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)結合薑黃素(curcumin)抑制LPS刺激巨噬細胞釋放發炎相關激素及共同刺激分子(co-stimulator)的表現結果。
圖4係顯示結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)可以抑制細胞遷移(migration)及發炎相關蛋白的表現。
圖5係顯示結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)可以抑制RANKL誘發蝕骨細胞形成。**p<0.01、***p<0.001與RANKL組比較；##p<0.01、 ###p<0.001與(40μM LA+10μM curcumin比較。
圖6為結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)對於CIA動物模式之療效評估。a1：p<0.05為25mg/kg LA與(25mg/kg羽扇豆醇醋酸+50mg/kg薑黃素)組]比較；b1：p<0.05為50mg/kg薑黃素與(25mg/kg羽扇豆醇醋酸+50mg/kg薑黃素組)比較。
圖7係顯示結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)對於抑制類風濕性關節炎小鼠的發炎比較及骨質密度追蹤。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001與CIA組比較。
圖8係顯示結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)可減少NF-κB與類風濕性關節炎相關蛋白的表現。取出小鼠的腳，使用組織研磨的方式萃取細胞質蛋白，與核蛋白進行西方墨點法(Western blotting)和電泳移動性移位分析(electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001係與CIA組比較，#p<0.05、##p<0.01為與(25mg/kg羽扇豆醇醋酸+50mg/kg薑黃素組)比較。
圖9係顯示結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)增加類風溼性關節炎小鼠之Treg的表現。在動物實驗進行至第32天時，將小鼠犧牲。取出脾臟(A)和鼠蹊部淋巴結(B)，利用流式細胞儀進行Treg分析。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001與CIA組比較，#p<0.05、##p<0.01為與(25mg/kg羽扇豆醇醋酸+50mg/kg薑黃素組)比較。
圖10為結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)相對於Celecoxb(Celebrex®(希樂葆膠囊)為COX-2 inhibitor)之CIA動物模式之療效評估。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001與CIA組比較，#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001為組間比較。
於本說明書中所稱的“蝕骨細胞前驅物活化相關疾病”係指因蝕骨細胞前驅物過度活化所導致的失調症，而蝕骨細胞前驅物一般係指巨噬細胞。如圖1所示，巨噬細胞的過度活化會引發一連串免疫反應，誘發TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、COX-2、MCP-1及VEGF等促發炎的激素產生，導致一連串的發炎反應及類風濕性關節炎等自體免疫疾病。另外，巨噬細胞的活化會分泌TNF-α和IL-1β，使成骨細胞(Osteoblast)或巨噬細胞接受器RANK(receptor activator of nuclear factor kappa-B)與配體(ligand,RANKL)結合，調控蝕骨細胞生成機制而分化成蝕骨細胞，進而造成骨頭侵蝕及骨質疏鬆症。於本發明之特別具體實施態樣，蝕骨細胞前驅物活化相關疾病係指類風濕性關節炎或骨質疏鬆症。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
薑黃素(curcumin)與羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)組合物對RAW 264.7細胞株之細胞毒性分析
使用含有羽扇豆醇醋酸(10、20、40、80M)、薑黃素(2.5,5,7.5,10M)及羽扇豆醇醋酸與薑黃素之組合物(LA10+Cur10,LA20+Cur10,LA40+Cur10,LA80+Cur10M)處理RAW 264.7細胞24小時，然後以MTT法分析存活率，並將結果與控制組比較。
在96孔的培養盤，每個孔分別種入4x105個RAW264.7細胞，待24小時細胞貼盤後，分別以不同濃度的羽扇豆醇醋酸，薑黃素及(羽扇豆醇醋酸+羽扇豆醇醋酸)處理24小時。移除培養液後，加入100μl，5mg/ml的MTT溶液，置於37℃培養箱作用四小時後(活細胞內的粒線體酵素琥珀酸脫氫酸(succinate dehydrogenase，SDH)會與MTT溶液作用 形成藍紫色的結晶)，移除MTT溶液後，加入100μl DMSO溶解藍紫色結晶。最後，再以ELISA計讀儀(Power Wave X340,Bio-Tek Instrument Inc.,Winooski,VT,USA)量測波長570nm的O.D.(optical density)值。由圖2之結果顯示，薑黃素(curcumin)、羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)、以及合併羽扇豆醇醋酸與薑黃素之組合物，隨著濃度增加並不會對細胞有毒殺作用。
羽扇豆醇醋酸結合薑黃素之組合抑制促發炎細胞激素的產生
本實例係藉由抑制LPS刺激巨噬細胞釋放發炎相關激素及共同刺激分子(co-stimulator)的表現，評估羽扇豆醇醋酸結合薑黃素之較佳組合比例。TNF-α、IL-6及IL-1β為已知的促發炎細胞激素。首先使用不同濃度的羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)處理一小時後，再加入1μg/ml的LPS進行刺激，繼續培養24小時後，收集細胞以及上清液分析TNF-α、IL-6及IL-1β的表現及分泌。由圖3A之結果發現，在結合不同濃度羽扇豆醇醋酸(LA 20μM和40μM)及薑黃素(Cur 5μM和10μM)作用下，(40μM LA+10μM Cur)與80μM LA相比較，抑制TNF-α釋放的效果相當，由圖3B和3C也顯示40μM LA+10μM Cur抑制IL-6及IL-1β釋放的效果也與80μM LA相當。因此後續實驗以此二藥物的合併濃度(40μM LA+10μM Cur)做為依據。
圖3D及3E分別是以流式細胞儀分析巨噬細胞的CD80/CD86共同刺激分子(co-stimulator)之表現與量化的結果。此二表現於巨噬細胞表面上的共同刺激因子(co-stimulation factor)，在經過羽扇豆醇醋酸結合薑黃素之組合處理後有明顯減少。
結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)抑制細胞遷移(migration)及發炎相關蛋白的表現
首先觀察羽扇豆醇醋酸結合薑黃素之組合對於 巨噬細胞經LPS刺激之細胞遷移的影響。transwell的上層細胞分別以40μM LA、80μM LA、(40μM LA+10μM Cur)及10μM curcumin培養，一小時後再於下層培養液加入1μg/ml LPS，觀察細胞移動的情形。圖4A顯示，未經過藥物處理的細胞受到1μg/ml LPS刺激下，有明顯移動的情形；而以(40μM LA+10μM Cur)處理，能顯著抑制巨噬細胞的移動能力。
由於巨噬細胞受LPS刺激下造成細胞遷移的原因可能是藉由COX-2和CCL-2(MCP-1)所調控，於是本實例亦利用西方墨點法(Western blotting)探討COX-2和CCL-2(MCP-1)的表現量在給予羽扇豆醇醋酸結合薑黃素處理後是否下降。將RAW264.7細胞以40μM LA、80μM LA、(40μM LA+10μM薑黃素)及10μM薑黃素前處理一小時，之後再將1μg/ml LPS加入培養液中培養24小時後收取細胞，使用西方墨點法分析COX-2與MCP-1的表現。
參見圖4B之結果，經由藥物處理過的組別其COX-2與MCP-1都有下降的情形，其中(40μM LA+10μM薑黃素)組可以達到與80μM LA組相同的抑制療效，顯示羽扇豆醇醋酸結合薑黃素之組合可有效降低羽扇豆醇醋酸之使用量。由以上的實驗證實，羽扇豆醇醋酸結合薑黃素之組合抑制細胞遷移的功效，是透過COX-2與MCP-1調控，且羽扇豆醇醋酸結合薑黃素之組合已達到協同效果。
結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)抑制RANKL誘發蝕骨細胞形成
骨頭的生成與代謝是處於一個動態平衡的狀態，一旦這個平衡受到破壞就會造成骨頭的損傷。而在類風濕性關節炎中，就是有過多的蝕骨細胞生成，導致骨頭被過度的侵蝕。於是，本實例首先利用抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色的方式，確定巨噬細胞受RANKL刺激分化成為蝕骨細胞的情形。抗酒石酸鹽 酸性磷酸酶染色主要是用來檢測血液、骨髓或組織中的白血球之內部酸性磷酸酶的活性。而蝕骨細胞內含有酸性磷酸酶所以可以利用此染色法確定蝕骨細胞的形成。
將1x104 RAW 264.7細胞培養在含有100ng/ml RANKL之α-MEM培養基，並同時給予藥物處理(40μM LA、80μM LA、(40μM LA+10μM curcumin)及10μM curcumin)下進行培養。五天後，以TRAP染色來確定蝕骨細胞的分化，方法如下述。移除細胞上清液後，用PBS清洗兩次，使用3.7%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定細胞一小時，細胞固定後再使用PBS清洗。染色方式使用酸性磷酸酶白血球細胞分析套組(Acid Phophatase Leukocyte kit,TRAP stain,Cat.387-A,Sigma-Aldrich,USA)，細胞染色前，確定染色時用來配置佐劑的二次水溫度為37℃。將Fast Garnet GBC鹼和亞硝酸鈉溶液以等體積均勻混合30秒，放置室溫作用至少兩分鐘。接著依照操作程序說明上的指示，調配染劑：37℃二次水45ml加入混合好的1ml Fast Garent GBC、0.5ml Naphthol AS-BI磷酸鹽溶液、2ml醋酸鹽溶液及1ml酒石酸鹽溶液。將染劑均勻混合後，每個孔洞加入100μl的染劑，再將96孔盤放置在37℃的培養箱避光反應一小時。反應後，使用二次水潤濕孔盤，最後用kit內附的蘇木素(Hematoxylin)溶液染色十分鐘，再使用自來水小心沖洗96孔盤後，自然風乾。最後使用顯微鏡觀察蝕骨細胞分化情況，每個細胞內必須有大於三個核以上才計算為蝕骨細胞。
由圖5A顯示，在有RANKL的刺激下，能夠使巨噬細胞分化成蝕骨細胞；而有施予藥物處理的組別，都有減少蝕骨細胞分化的情形。
接著使用RT-PCR來觀察，在RANKL刺激下與藥物處理後蝕骨細胞增生的主要因子NFATc1(經活化T-細胞之核因子，cytoplasmic 1)的改變情形。圖5B之結果顯示，在RANKL刺激下蝕骨細胞中的轉錄因子NFATc1表現量有上 昇，而在藥物處理組中則能夠顯著減少NFATc1的表現。
結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)對於CIA動物模式之療效評估
目前研究類風濕性關節的動物模式主要是利用膠原蛋白誘發關節炎，此動物模式與人類類風濕性關節炎的發病進展相似。本實施例係以牛第二型膠原蛋白加上完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)誘發DBA/1J小鼠患有類風濕性關節炎，即CIA動物模式。其中，第二型膠原蛋白是形成軟骨的主要成分，而使用異種(牛)的膠原蛋白會使小鼠體內產生抗-CII的抗體，引起自體免疫反應，攻擊自身的關節軟骨，一開始會活化補體系統吸引嗜中性白血球和巨噬細胞，並且刺激活化其釋放發炎的細胞激素，這些發炎物質會進一步驅使T細胞、B細胞和更多的巨噬細胞產生更劇烈的發炎反應，並且攻擊自身的關節形成類風濕性關節炎。
使用八週齡的DBA/1J老鼠(購自美國Jackson Lab)，於尾巴基部注射0.1mL關節炎誘發佐劑(包含bovine collagen type II(CII,Cat.20022,Chondrex,USA)以等比例方式用均質機溶於弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA,Cat.7023,Chondrex,USA)內含5mg/ml熱處理的肺結核M.Tuberculosis H-37 RA)。於注射21天後，以相同成分和方式再注射第二劑0.05mL關節炎誘發佐劑。在注射完第二劑誘發佐劑後，開始每天以口餵方式，給予小鼠25mg/kg LA、50mg/kg LA、50mg/kg薑黃素和25mg/kg LA+50mg/kg薑黃素共四組進行治療，實驗持續進行到第43天。關節炎的判讀使用臨床關節炎積分表，並以小動物正子斷層造影([18F]FDG/micro-PET)、及以micro-CT測量骨質密度等評估療效。
小鼠腳掌腫脹的評估分別以0，1，2，3，4五個階段表示，打完第二劑關節炎誘發佐劑後，每週觀察小鼠前、後腳各三次；0=正常關節；1=一處關節紅腫；2=超過一處關 節有紅腫現象；3=整隻腳掌有紅腫現象；4=腳掌至腳踝有非常嚴重的腫脹。注射完第二劑關節誘發佐劑後，每週三次使用游標尺量測每隻腳的腳掌中央厚度並加以記錄。每隻受測試小鼠的最高總和評分為16。
圖6A為使用數位相機拍攝各組別小鼠之發病情形，箭頭為趾頭及腳踝腫大發炎處。圖6B和6D為各組別小鼠關節炎積分的評估(每隻腳為4分、每隻老鼠最高分為16分)。結果顯示，羽扇豆醇醋酸及薑黃素治療組的小鼠，關節炎積分都小於CIA組。圖6C和6E為各組別小鼠關節炎發病率，顯示合併羽扇豆醇醋酸及薑黃素治療組的小鼠，可以有效降低關節炎的發病情形。值得注意的是，合併(25mg/kg羽扇豆醇醋酸+50mg/kg薑黃素治療組)小鼠的療效，優於目前已知臨床治療關節炎藥物10mg/kg Celecoxb塞來昔布(Celebrex®，希樂葆膠囊，一種Cox-2抑制劑)組。過程中，亦同時追蹤各組別小鼠體重變化情形。由圖6F顯示，給予羽扇豆醇醋酸與薑黃素組合物治療的小鼠，其體重變化不大，說明羽扇豆醇醋酸以及薑黃素之合併治療，並沒有對小鼠造成一般的毒性。
在評估小鼠關節炎的治療方面，亦利用[18F]FDG/micro-PET分子影像技術追蹤治療效果，並以micro-CT影像追蹤小鼠股骨的骨質密度，評估藥物減緩類風濕關節炎小鼠骨質流失程度的效果。分別在藥物治療實驗的第20、25、32、39和43天，以尾靜脈注射18.5MBq/100μl(0.5mCi/100μl)18F-FDG後，使用microPET掃描(Tri-Modality FLEX TriumphTM Pre-Clinical Imaging System,Gamma MedicaIdeas；Northridge,CA,USA)進行活體影像分析，並以Amide software對個別擷取的ROIs分析18F-FDG之累積量。
結果如圖7所示，在1st免疫之第32天後，以[(25mg/kg羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)+50mg/kg薑黃素(curcumin)]合併治療的小鼠，其關節累積FDG的情形與以50 mg/kg羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)之處理組相當，皆遠低於其他組小鼠(圖7A)。Micro-CT影像係使用Tri-Modality FLEX TriumphTM Pre-Clinical Imaging System(Gamma MedicaIdeas；Northridge,CA,USA)獲得。由圖7B以micro-CT追蹤小鼠骨頭流失程度的結果顯示，藥物治療組的骨頭流失情形皆有獲得顯著改善。綜合以上的研究結果顯示，將羽扇豆醇醋酸及薑黃素以黃金比例組合，確實可治療小鼠類風濕關節炎及其發生率，並可改善其關節的骨質密度。
羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)之組合抑制類風溼性關節炎相關蛋白表現並且降低NF-κB的活性
動物實驗進行第32天，將小鼠以頸椎脫臼法犧牲，取下小鼠的整隻腿，加入適量的溶解緩衝液(組織蛋白粹取試劑，T-PERTM)將組織磨碎，離心15000轉20分鐘，取上清液即為各組別的樣本，萃取細胞質蛋白與核蛋白進行西方墨點法(Western blotting)分析。
由圖8A之結果顯示，經過羽扇豆醇醋酸與薑黃素組合治療，確實有降低血管新生(VEGF)、細胞遷移(MCP-1)和骨頭侵蝕(granzyme B和MMP-9)相關分子，以及蝕骨細胞生成因子(RANKL)的表現。而免疫抑制蛋白IL-10與TGF-β的表現，在羽扇豆醇醋酸與薑黃素治療組都比未經藥物處理的CIA小鼠組明顯上升。相反的，OPG(抑制蝕骨細胞生成的因子)的表現則上升。
使用LightShift的化學發光EMSA試劑盒(Pierce,Rockford,IL,USA)進行電泳移動性移位分析(EMSA)。在室溫下與生物素標記的DNA探針的核萃取物作用20分鐘。分離的DNA/蛋白質複合物來自，自由的寡核苷酸的10%聚丙烯酰胺凝膠上，經轉移到尼龍(nylon)膜上，將該尼龍膜浸泡在ECL(Pierce,Rockford,IL,USA)，反應使其發出冷光，再曝光於底片上，以觀察NF-κB的活性表現。利用IMAGE J軟體(National Institutes of Health,USA)，將獲得的影像進行黑化度的定量，將欲觀察的蛋白質黑化度除以對照組所獲得的數值，即可比較各組間核蛋白質的表現量差異。圖8B之EMSA結果顯示，給予羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)之組合治療後，細胞內NF-κB的表現有明顯下降。
圖8C-E係在第一次免疫後的第20、32和43天，分別取小鼠臉頰血，收集血清進行IL-17、TNF-α、IL-6和BAFF的濃度測定。結果顯示，所有治療組別皆顯著降低這些發炎相關激素的含量。
羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)之組合增加類風溼性關節炎小鼠Treg的表現
Treg是一種免疫抑制相關的T細胞，在作用機制上會阻擋IL-17激活巨噬細胞分泌TNF-α，通常在自體免疫疾病中是分化較少的。有文獻指出，將Treg注射回小鼠體內可以有效減緩類風濕性關節炎的發病，所以我們預期給予羽扇豆醇醋酸和薑黃素之組合治療後，能夠增加Treg數量來減少類風濕性關節炎的發生。我們選擇發病的高峰期，即實驗的第32天將小鼠犧牲，取出脾臟(圖9A)與鼠蹊部淋巴結(圖9B)利用流式細胞儀進行Treg細胞分析，實驗的結果顯示，脾臟和鼠蹊部淋巴結的Treg，在給予結合羽扇豆醇醋酸與薑黃素治療的組別和CIA組別有最大顯著性差異，並與單獨50mg/kg羽扇豆醇醋酸治療組相當。此結果與前述羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)之組合可有效減低IL-17及TNF-α分泌量之結果相符。
結合羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate)和薑黃素(curcumin)相對於Celecoxb塞來昔布(Celebrex ®希樂葆膠囊)之CIA動物模式之療效評估
Celecoxb塞來昔布(希樂葆膠囊)是一種已知的COX-2抑制劑，屬於非固醇類抗發炎止痛劑(簡稱NSAIDs)，目前用於臨床治療經痛或由風濕性關節炎、退化性關節炎所 引起的慢性疼痛。本實例係比較羽扇豆醇醋酸和薑黃素及其組合物相對於塞來昔布，在抑制細胞遷移(migration)和骨頭侵蝕(bone erosion)相關分子，以及蝕骨細生成因子RANKL的表現上的功效。並使用免疫組織染色觀察該等藥物抑制關節發炎的表現情形。
在動物實驗進行至第一次免疫後第32天，將小鼠犧牲。取出小鼠的腳，使用組織研磨的方式萃取細胞質蛋白進行Western blot分析。由圖10A之結果顯示，以(25mg/kg羽扇豆醇醋酸結合10mg/kg薑黃素)治療，比以10mg/kg塞來昔布(COX-2抑制劑)組，更能有效抑制細胞遷移(migration)，以及骨頭侵蝕(bone erosion)相關分子和蝕骨細生成因子RANKL的表現。而免疫抑制蛋白TGF-β與抑制蝕骨細胞生成因子OPG的表現在羽扇豆醇醋酸結合薑黃素治療組均比給予Celecoxb(塞來昔布，Celebrex®，希樂葆膠囊)之組別及CIA組還明顯上升。
在實驗第21、32、43天取小鼠臉頰血，收集血清進行分析體內IL-6含量。由圖10B之結果，治療組別對於降低IL-6含量皆有顯著的效果，而且(羽扇豆醇醋酸結合薑黃素)之組合物的降低功效，還比Celecoxb(塞來昔布，Celebrex®，希樂葆膠囊)治療組明顯。
在免疫組織染色觀察實驗，係於動物實驗進行第43天時，將小鼠以頸椎脫臼法犧牲，取下小鼠的腳，進行石蠟切片，使用H&E染色的方式觀察小鼠腳踝關節的型態。圖10C之結果顯示，未經藥物處理之CIA組，有免疫細胞的浸潤以及骨頭嚴重損傷的情形，而羽扇豆醇醋酸與薑黃素組合物之處理組，相對於其他組別，更能有效降低骨頭的損傷。
綜合以上的實驗結果，羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate,LA)結合薑黃素(curcumin)在不毒殺正常巨噬細胞下，能有效抑制LPS誘導的發炎反應以及RANKL誘導的蝕骨細胞的生成，且本發明結合減半劑量的羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate, LA)與薑黃素(curcumin)之組合物，可經由抑制活化巨噬細胞釋放出的cytokines如：COX-2、MCP-1、TNFα等促發炎因子來減緩發炎反應，並且藉由調控NFATc1來減少蝕骨細胞相關蛋白質之表現。此外，在Collagen II誘導的關節炎小鼠之活體動物實驗顯示，劑量減半的羽扇豆醇醋酸(lupeol acetate,LA)結合薑黃素(curcumin)能多方面有效的減緩小鼠關節發炎、腫脹、骨頭侵蝕、骨頭流失等關節炎症狀的發生，達到良好治療關節炎及骨質疏鬆症的相關疾病。因此，本發明已達到在臨床治療關節炎的藥物選擇、改善關節炎病人骨頭侵蝕及關節發炎腫脹的程度及減緩骨頭流失上之重大突破，極具進步性與產業利用價值。

Claims (7)

  1. 一種用於治療或預防蝕骨細胞生成相關失調症之組成物，其特徵在於包含25至50mg/kg羽扇豆醇醋酸與40-50mg/kg薑黃素。
  2. 如請求項1所述之組成物，其進一步包含一醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
  3. 如請求項1所述之組成物，其中該羽扇豆醇醋酸與薑黃素之組成比例為0.5：1至1：2。
  4. 如請求項3所述之組成物，其中該羽扇豆醇醋酸與薑黃素之組成比例為1：1至1：2之比例組合。
  5. 如請求項1所述之組成物，其係藉由抑制巨噬細胞過度活化及蝕骨細胞生成。
  6. 如請求項1所述之組成物，其中該蝕骨細胞生成相關失調症為類風濕性關節炎(RA)。
  7. 如請求項1所述之組成物，其中該蝕骨細胞生成相關失調症為骨質疏鬆症。
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