TW201610152A - 微ｒｎａ１４６－ａ及其於診斷、治療及預防小核醣核酸病毒感染之用途及微ｒｎａ１４６－ａ拮抗劑 - Google Patents

微ｒｎａ１４６－ａ及其於診斷、治療及預防小核醣核酸病毒感染之用途及微ｒｎａ１４６－ａ拮抗劑 Download PDF

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Abstract

本發明發現宿主miRNA可能經由抑制I型IFN誘發而涉及小核醣核酸病毒發病機制，且可作為用於研發抗病毒療法之候選物。因此，本發明提出腸病毒誘發之miR-146a藉由抑制IFN產生而促成病毒發病機制，且提供一條研發用於腸病毒感染之預防性及治療性策略的線索。

Description

微RNA146-A及其於診斷、治療及預防小核醣核酸病毒感染之用途及微RNA146-A拮抗劑
本發明係關於微RNA(miRNA)領域，尤其miR-146a及其用於小核醣核酸病毒感染之診斷、預防及/或療法之拮抗劑。
小核醣核酸病毒為一組含有經二十面體蛋白質外鞘(protein shell)包覆之正股RNA的無包膜小病毒。其在人類與動物中引起廣泛疾病，例如無菌性腦膜炎、腦炎、普通感冒、手足口病、結膜炎、疱疹性咽峽炎及肝炎。目前沒有可用於治療小核醣核酸病毒感染之藥物。小核醣核酸病毒包括(但不限於)腸病毒(例如人類腸病毒A、B、C或D、脊髓灰白質炎病毒及柯薩奇病毒(coxsackievirus))；鼻病毒(例如人類鼻病毒A、B或C)；肝病毒(亦稱為嗜肝RNA病毒屬(Heparnavirus)，諸如A型肝炎病毒)；心病毒屬(例如腦心肌炎病毒)；口蹄疫病毒屬(例如足口病病毒)。
腸病毒屬於小核醣核酸病毒科。其包括約70種人類血清型，例如脊髓灰白質炎病毒、柯薩奇病毒A(COX A1-24)、柯薩奇病毒B(COX B1-6)、埃可病毒1-31(echoviruses 1-31)、腸病毒(EV68-71)及腸病毒72(A型肝炎)。各種腸病毒中之基因組序列相當保守。腸病毒 之病毒粒子由簡單病毒衣殼及單股RNA組成。腸病毒主要經由消化道進入身體。其在經由血液循環擴散至整個身體之前在消化道之襯裡細胞(cell lining)中複製。腸病毒感染之臨床症狀一般為溫和的。有時，腸病毒引起嚴重疾病，諸如麻痹性脊髓灰白質炎、腦膜炎或心肌炎。
腸病毒71(EV71)為小核醣核酸病毒科(Picornaviridae family)腸病毒屬之一員，其為囊封於非包膜二十面體病毒粒子中之正股RNA基因組。EV71具有可感染中樞神經元系統、心臟、肺、骨骼肌及腸之廣泛組織向性，且其感染引起典型的手足口病、無菌性腦膜炎、腦脊髓炎、肺部水腫、心臟衰竭、脊髓灰白質炎樣麻痹或甚至神經及精神影響。EV71首先於1969年在加利福尼亞經鑑別。於1975年保加利亞、1978年匈牙利、1997年馬來西亞、2000年臺灣及2010年與2011年中國出現若干次爆發，且導致許多人死亡。EV71已變為一種新出現的危及生命之病原體，尤其在近期的亞太區域。不幸地，對於EV71感染無有效療法或疫苗(Solomon,T等人，Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71.The Lancet infectious diseases 10,778-790(2010))。
一般而言，病毒感染可因刺激病毒複製中出現之單股RNA、雙股RNA或低甲基化CpG-DNA而誘發干擾素(IFN)產生。病毒相關分子可經宿主模式識別受體識別，且活化內體toll樣受體(TLR)信號傳導以產生I型IFN。所得IFN及促炎性細胞激素活化宿主適應性免疫，從而完成宿主抗病毒機制。I型IFN可促進記憶T細胞增殖，誘發IFNγ分泌且活化樹突狀細胞及自然殺傷細胞。因此，經病毒感染之個體可建立抗病毒機制，能夠抑制病毒複製且清除經病毒感染之細胞。有趣的是，EV71無法在人類及動物模型中有效刺激經感染主體產生I型IFN。然而，I型IFN治療可改良且甚至治癒EV71感染(Hung,H.C.等人Synergistic inhibition of enterovirus 71 replication by interferon and rupintrivir.J Infect Dis 203,1784-1790(2011)；Yi,L.,He,Y.,Chen,Y.,Kung H.F.及He,M.L.Potent inhibition of human enterovirus 71 replication by type I interferon subtypes.Antivir Ther 16,51-58(2011))。此等線索暗示若I型IFN產生可在感染期間正常誘發，則可能緩解由EV71引起的後遺症及死亡。
US 6,815,444提供用作治療腸病毒感染之治療劑的吡唑并嘧啶化合物。US 7,482,006係關於抗病毒治療劑，尤其重組人類抗EV71單株抗體及該等抗體在EV71感染之療法、手術及診斷中之應用。US 7,718,775提供一種能夠中和EV71感染之單株抗體。US 8,313,750提供一種來自人類腸病毒71(EV71)之衣殼蛋白VP1，"MEL701-VP1，其用作針對EV71之疫苗。US 7,858,770係關於一種具有針對非脊髓灰白質炎腸病毒之抗病毒活性之siRNA(小干擾RNA)，及包含該siRNA作為用於預防及治療由非脊髓灰白質炎腸病毒感染引起的疾病之活性成分之醫藥組合物。然而，上文所提及之先前參考文獻與微RNA無關。
微RNA(miRNA)為豐富的一類短內源性RNA，其藉由與其標靶mRNA鹼基配對來充當基因表現之轉錄後調節因子。成熟miRNA藉由RNA酶III核醣核酸酶Drosha自較長髮夾轉錄物依序處理。強調且已知miRNA藉由轉錄後調節標靶基因表現來管控廣泛生物功能，包括細胞增殖、分化及細胞凋亡。長期以來感信病毒感染可改變包括miRNA之宿主基因表現型態且可造成病毒傳播及發病機制。先前研究顯示EV71感染改造基因及miRNA表現。EV71經由誘發EGR1來上調miR-141表現，從而病毒可抑制宿主真核起始因子4E，導致帽依賴性轉譯(cap-dependent translation)中斷及病毒傳播加強(Ho,B.C.等人，Enterovirus-induced miR-141 contributes to shutoff of host protein translation by targeting the translation initiation factor eIF4E.Cell host & microbe 9,58-69(2011))。因此，微RNA可充當標靶或抗病毒療 法。
本發明提供一種長度為8至25個核鹼基單元之單股寡核苷酸，其中寡核苷酸包含由自寡核苷酸之3'端計數之AGTTCTCA(SEQ ID NO：1)組成的種子核鹼基序列。在一個實施例中，本發明之寡核苷酸通常為單股。較佳地，根據本發明之單股寡核苷酸包含與miR-146a 100%互補之相鄰核鹼基序列區。本發明之單股寡核苷酸可用作miR-146a拮抗劑。在一些實施例中，單股寡核苷酸之相鄰核苷酸序列之長度在8至25個核苷酸之間，諸如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核鹼基單元，其中單股寡核苷酸之至少50%核鹼基單元包含核苷酸類似物。較佳地，單股寡核苷酸包含核苷酸類似物，諸如LNA，其形成整個相鄰核苷酸序列之一部分或可形成整個相鄰核苷酸序列。
本發明亦提供一種診斷小核醣核酸病毒感染之方法，其包含以下步驟：提供推測遭受小核醣核酸病毒感染之個體的樣品；量測miR-146a、c-jun、c-fos、IRAK1及/或TRAF6之表現或啟動子活性；其中與對照樣品相比，miR-146a含量升高以及c-jun及/或c-fos含量升高或IRAK1及/或TRAF6含量降低表示小核醣核酸病毒感染。
本發明亦提供一種篩選治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之具醫藥活性之化合物的方法，其包含以下步驟：提供經小核醣核酸病毒感染之細胞；使候選物質與該細胞接觸；及量測miR-146a、c-jun、c-fos、IRAK1及/或TRAF6在該細胞中之表現或啟動子活性； 其中與對照樣品相比，miR-146a含量降低以及c-jun及/或c-fos含量降低或IRAK1及/或TRAF6含量升高表示係具醫藥活性之化合物。
本發明亦提供一種中和小核醣核酸病毒之方法，其包括使miR-146a拮抗劑與腸病毒接觸，其中該miR-146a拮抗劑為如本文中所描述之單股寡核苷酸。亦提供一種治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之方法，其包括向個體投與有效量之miR-146a拮抗劑，其中該miR-146a拮抗劑為如本文中所描述之單股寡核苷酸。在一些實施例中，小核醣核酸病毒為腸病毒。較佳地，腸病毒為腸病毒A、腸病毒B或腸病毒C，更佳地，腸病毒為腸病毒71。
圖1展示IRAK1及TRAF6為EV71誘發之miR-146a之標靶。a，miR-146a在藉由即時RT-PCR定量之EV71感染中經誘發。MI：模擬感染；h.p.i.：感染後之小時數。b，EV71感染在蛋白質含量中抑制IRAK1及TRAF6表現，但在mRNA中不抑制。c，同源IRAK1及TRAF6 3'UTR內之預測miR-146a結合位點。兩個及三個潛在miR-146a結合位點分別位於IRAK1或TRAF6 3'UTR內(終止密碼子後之第一核苷酸表示為+1)。d，miR-146a對含有野生型或突變型3'UTR之螢光素酶報導基因載體之影響。miR-146a顯著抑制具有野生型3'UTR之載體之螢光素酶活性，但在具有突變型3'UTR之載體中消除(n=4)。e，EV71抑制具有野生型3'UTR之V5-IRAK1及V5-TRAF6的表現，但不抑制具有突變型3'UTR之V5-IRAK1及V5-TRAF6的表現。f，miR-146a對內源性IRAK1及TRAF6之影響。MT：模擬轉染；NC：陰性對照。所有資料均呈現平均值±標準差。
圖2展示miR-146a之調節及EV71誘發之miR-146a對干擾素產生之影響。a，miR-146a之示意性組織。藉由TRANSFAC、PROMO及JASPAR軟體之交叉點預測AP1(c-jun/c-fos)結合位點。b，AP1藉由 EV71感染上調。MI：模擬感染；h.p.i.：感染後之小時數。c，c-jun及c-fos活化miR-146a啟動子。在指定分析條件下測定miR146a啟動子之轉錄活性。d，c-jun及c-fos增強miR-146a表現。e，測定miR-146a啟動子內之AP1結合位點。AP1核心序列突變體於a中指示。藉由在c-jun及c-fos存在下之螢光素酶活性分析測定miR146a突變型啟動子之轉錄活性。f，EV71活化之含有天然情形(nature context)而非突變情形之miR-146a啟動子。g，AP1之沉默減少病毒誘發之miR-146a表現且使IRAK1及TRAF6恢復。h，IRAK1及TRAF6之抑制藉由拮抗miR-146a恢復。i，IFNβ啟動子活性之抑制藉由拮抗miR-146a減弱。j，拮抗miR-146a消除IFNβ表現在EV71感染中之抑制。所有資料均呈現平均值±標準差。
圖3展示miR-146a之誘發為細胞類型及腸病毒屬中之普遍現象。a，miR-146a在經EV71感染之Caco-2細胞中經誘發。MI：模擬感染；h.p.i.：感染後之小時數。b，EV71感染在Caco-2細胞中抑制IRAK1及TRAF6表現。c，AP1(c-jun/c-fos)在EV71感染中經誘發。分別藉由即時RT-PCR及西方墨點法(Western blot)測定c-jun及c-fos在經EV71感染之Caco-2細胞中之mRNA及蛋白質表現量。d，拮抗miR-146a恢復藉由西方墨點法分析之EV71誘發之TRAF6及IRAK1抑制。e，miR-146a在經PV3或CVB3感染之RD細胞中經誘發。f，IRAK1及TRAF6之蛋白質表現在RD細胞中之PV3及CVB3感染中受抑制。g，AP1(c-jun/c-fos)在RD細胞中之PV3及CVB3感染中經誘發。所有資料均呈現平均值±標準差。
圖4展示IFN產生之死亡及抑制在經mEV71感染之miR-146-/-小鼠中大大改善。a，Mus IRAK1及TRAF6 3'UTR內之預測miR-146a結合位點。三個及兩個潛在miR-146a結合位點分別位於Mus IRAK1及TRAF6 3'UTR內(終止密碼子後之第一核苷酸表示為+1)。b，miR- 146a-/-小鼠顯示顯著較高之存活機率。各組經指定mEV71 PFU感染，且每天監測死亡情況。*p值呈現1×108 PFU/miR-146a KO組與1×108 PFU/WT組之比較；**p值呈現2×108 PFU/miR-146a KO組與2×108 PFU/WT組之比較。c，經mEV71感染之小鼠中之代表性臨床徵象及組織學檢查。d，病毒傳播在miR-146a-/-小鼠中受限制。藉由空斑分析量測指定組織中之病毒負荷(n=4)。e，miR-146a表現在經mEV71感染之野生型小鼠中經誘發，但在經mEV71感染之miR-146a-/-小鼠中未誘發(n=4)。f，IRAK1及TRAF6表現在經mEV71感染之野生型小鼠中受抑制(n=4)。g，IFNβ表現在經mEV71感染之miR-146a-/-小鼠中經誘發。IFNβ表現藉由即時RT-PCR量測(n=4)。所有資料均呈現平均值±標準差。
圖5展示LNA拮抗miR-146a治療提高存活率且恢復EV71小鼠模型中之IFN產生。a，經由腹膜內途徑之LNA拮抗miR-146a治療提高存活機率。在病毒感染之前(0 d.p.i.)或在病毒感染之後(1及2 d.p.i.)注射LNA拮抗miR-146a，且每天記錄小鼠存活率。*p值呈現2×108 PFU/抗-146a 1 d.p.i.組與2×108 PFU/抗-NC組之比較；**p值呈現2×108 PFU/抗-146a 0 d.p.i.組與2×108 PFU/抗-NC組之比較。b，miR-146a表現之增加在注射有LNA拮抗miR-146a之經EV71感染之小鼠中經中和(n=4)。c，IRAK1及TRAF6之抑制藉由LNA拮抗miR-146a注射而恢復(n=4)。d，IFNβ表現藉由即時RT-PCR，在注射有LNA拮抗miR-146a之經EV71感染之野生型小鼠中經誘發。e，抗-IFNα/β抗體消除拮抗miR-146a介導之存活率提高。在病毒感染之前(0 d.p.i.)依序注射LNA拮抗miR-146a及抗-IFNα/β抗體，且每天記錄小鼠存活率。*p值呈現2×108 PFU/抗-146a組與2×108 PFU/抗-NC組之比較；**p值呈現2×108 PFU/抗-146a組與2×108 PFU/抗-146a/抗-IFN組之比較。f，miR-146a在腸病毒感染中起調節作用之模型。AP1介導之miR-146a誘發經由miR-146a 與兩個基因之3'UTR之間的不完全鹼基配對來抑制IRAK1及TRAF6表現。IRAK1及TRAF6之減少又抑制干擾素產生。EV71藉由此新病毒-宿主相互作用而逃脫免疫攻擊，且進一步引起病毒發病機制，包括體重減輕、麻痹及甚至死亡。miR-146a之中和恢復IRAK1及TRAF6表現，恢復IFN產生且顯著提高存活率。所有資料均呈現平均值±標準差。
圖6展示IRAK1及TRAF6為mus miR-146a之標靶。
圖7展示所設計之拮抗miR-146a_1及拮抗miR-146a_2在pSilencer-miR-146a之存在下對含有野生型3'UTR之螢光素酶報導基因載體之影響。
本發明發現宿主miRNA可能經由抑制I型IFN誘發而與小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)發病機制有關，且可充當用於研發抗病毒療法之候選物。因此，本發明提出腸病毒誘發之miR-146a藉由抑制IFN產生而促成病毒發病機制，且提供一條研發用於腸病毒感染之預防性及治療性策略的線索。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術術語、符號以及其他科學術語或術語集均意欲具有熟習本發明所屬技術者通常理解的含義。在一些情況下，出於清楚起見和/或方便參考，在本文中定義具有通常理解的含義之術語，且在本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與在此項技術中一般理解的實質性差異。熟習此項技術者非常理解本文中描述或參考之許多技術及程序且通常使用習知方法來使用。按需要，除非另外指出，否則涉及市售套組和試劑之使用的程序一般根據製造商所定義之方案和/或參數進行。
定義
術語「一(a及an)」係指該冠詞之一個或一個以上(亦即，至少一 個)語法賓語。
除非明確指示僅係指替代物或除非該等替代物為相互排斥的，否則如本文中所使用，申請專利範圍中之術語「或」係指「及/或」。
術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」或「治療(treating)」意謂減少患者經歷之小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)感染之症狀的頻率、程度、嚴重程度及/或持續時間。
術語「預防(prevent)」、「預防(prevention)」或「預防(preventing)」意謂抑制或防止與小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)感染相關之症狀。
如本文中所使用，術語「個體」係指使用藥劑治療、預防或診斷，或出於如本文中所描述之類似目的給出之治療、預防或診斷之任何接受者。
如本文中可互換地使用，「miR基因產物」、「微RNA」、「miR」或「miRNA」係指來自miR基因之未經加工或經加工之RNA轉錄物。由於miR基因產物不轉譯成蛋白質，因此術語「miR基因產物」不包括蛋白質。未經加工之miR基因轉錄物亦稱作「miR前驅物」，且通常包含長度約70-100個核苷酸之RNA轉錄物。miR前驅物可藉由用RNA酶(例如Dicer酶、Argonaut酶、RNA酶III(例如大腸桿菌RNA酶III))消化而加工成活性21-23個核苷酸之RNA分子。此活性21-23個核苷酸之RNA分子亦稱作「經加工」miR基因轉錄物或「成熟」miRNA。
術語「miR拮抗劑」意謂與miR146a互補之單股寡核苷酸或其前驅物或經修飾之寡核苷酸。「經修飾之寡核苷酸」意謂相對於天然存在之末端、糖、核鹼基及/或核苷間鍵具有一或多種修飾之寡核苷酸。舉例而言，「miR-146a拮抗劑」意謂與miR146a互補之單股寡核苷酸或具有與miR-146a互補之核鹼基的經修飾之寡核苷酸。
術語「LNA」係指雙環核苷酸類似物，稱為「鎖核酸」。其可指 LNA單體，或當用於「LNA寡核苷酸」之情形中時，係指含有一或多種此類雙環核苷酸類似物之寡核苷酸。
術語「有效量」意謂有效抑制及/或治療及/或預防由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染的miRNA量。舉例而言，有效量之miRNA可抑制由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染及/或在一定程度上減輕與由感染引起之病症相關的一或多種症狀。
本發明之經分離之單股寡核苷酸
在一個態樣中，本發明提供一種長度為8至25個核鹼基單元之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其中寡核苷酸包含由自寡核苷酸之3'端計數之AGTTCTCA(SEQ ID NO：1)組成的種子核鹼基序列。
本發明之寡核苷酸通常為單股。因此，將瞭解在本發明之上下文中，術語寡核苷酸可與術語單股寡核苷酸互換使用。另外，在上下文中，術語「單股寡核苷酸」可與術語「寡聚物」互換使用。
在一些實施例中，單股寡核苷酸之相鄰核苷酸序列之長度在8至25個核苷酸之間，諸如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核鹼基單元。在一些實施例中，至少約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%單股寡核苷酸之核鹼基單元與miR-146a序列或其區域互補。
在一些實施例中，自單股寡核苷酸之3'核鹼基計數之種子區與miR-146a種子區之5'核苷酸互補，且單股寡核苷酸包含與miR-146a種子序列完全互補之相鄰核苷酸序列及視情況存在之1至17個其他核苷酸，較佳4至17個其他核苷酸，諸如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個。
在一個實施例中，根據本發明之單股寡核苷酸包含與miR-146a 100%互補之相鄰核鹼基序列區域。
根據本發明，miR-146a具有以下序列：UUGGGUACCUUAAGUCAAGAGU(SEQ ID NO：2)
根據本發明，本發明之單股寡核苷酸可用作miR-146a拮抗劑。單股寡核苷酸宜與miR-146a序列或其區域互補(抗miR)，不過認為單股寡核苷酸可能包含與相應微RNA序列或其反向互補序列有一個、二個或幾個錯配。
在一些實施例中，單股寡核苷酸為抗miR實施例。在一些實施例中，單股寡核苷酸可為線性分子或合成為線性分子。在一些實施例中，單股寡核苷酸較佳不包含與同一單股寡核苷酸內之同等區域互補(亦即，雙螺旋體)的例如至少3、4或5個相鄰核苷酸之短區域。在一些實施例中，單股寡核苷酸可完全由相鄰核苷酸區組成。因此，在一些實施例中，單股寡核苷酸實質上不自我互補。
當用於本文中時，術語「核苷酸類似物」係指非天然存在之核苷酸，其中例如在一個較佳實施例中，核醣單元不同於2-去氧核醣，及/或含氮鹼基不同於A、C、T及G，及/或核苷間磷酸鍵基不同。用於本發明之寡核苷酸之合適核苷酸類似物獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA單體、2'-胺基-DNA單體、2'-氟-DNA單體、LNA單體、阿糖核酸(ANA)單體、2'-氟-ANA單體、HNA單體、INA單體。
2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氟-DNA單體及LNA為較佳，且因此本發明之寡核苷酸可包含獨立地選自此三種類型之類似物的核苷酸類似物，或可僅包含選自該三種類型之一種類型。在一最佳實施例中，寡核苷酸僅包含LNA核苷酸類似物及核苷酸(RNA或DNA，最佳為DNA核苷酸)。
較佳地，單股寡核苷酸包含核苷酸類似物，諸如LNA，其形成整個相鄰核苷酸序列之一部分或可形成整個相鄰核苷酸序列。
在單股寡核苷酸之一個實施例中，至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或所有相鄰核苷酸序列之核鹼基單元為LNA核鹼基單元。在一個實施例中，單股寡核苷酸相鄰核苷酸序列之所有核鹼基單元均為LNA核鹼基單元。在單股寡核苷酸之一個實施例中，相鄰核苷酸序列包含4-17個較佳相鄰的核苷酸類似物單元(諸如LNA核鹼基單元)或由其組成。較佳地，單股寡核苷酸係選自由以下組成之群：
1. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3'(SEQ ID NO：3)
經設計之抗miR-146a序列(完全匹配)
5'-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：4)
2. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAV(U至A,C,G)GGGUU-3'(SEQ ID NO：5)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'-AACCC B (T,G,C)TGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：6)
3. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUH(G至A,T,C)GGUU-3'(SEQ ID NO：7)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'-AACCD(T,A,G)ATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：8)
4. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGG H (G至A,T,C)UU-3'(SEQ ID NO：9)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'-AAD(T,A,G)CCATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：10)
5. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGG V (U至A,C,G)U-3'(SEQ ID NO：11)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'-A B (T,G,C)CCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：12)
6. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU V (U至A,C,G)-3'(SEQ ID NO：13)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'- B (T,G,C)ACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：13)
7. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU N (額外A,T,C,G)-3'(SEQ ID NO：14)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'- N (額外A,T,C,G)AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：15)
8. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU NN (額外A,T,C,G)-3'(SEQ ID NO：16)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'- NN (額外A,T,C,G)AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：17)
9. 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU NNN (額外A,T,C,G)-3'(SEQ ID NO：18)
經設計之特異性抗miR-146a序列
5'- NNN (額外A,T,C,G)AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'(SEQ ID NO：19)
10. 5'-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA -3'(SEQ IDNO：20)
(22個核苷酸；下劃線表示「種子區」)
11. 5'-ATGGAATTCAGTTCTCA -3'(SEQ IDNO：21)
(17個核苷酸)
12. 5-ATTCAGTTCTCA -3'(SEQIDNO：22)
(12個核苷酸)
雖然設想其他核苷酸類似物(諸如2'-MOE RNA或2'-氟核苷酸)可 用於根據本發明之抗miR寡聚物中，但在一些實施例中，寡聚物具有高比例(諸如至少50%)之LNA核苷酸。在一個實施例中，至少75%，諸如80%或85%或90%或95%或所有存在於相鄰核苷酸序列之核鹼基單元之間的核苷間鍵為硫代磷酸核苷間鍵。在一個實施例中，該寡聚物與一或多種非核鹼基化合物結合。在一個實施例中，寡聚物構成前藥。
在一個態樣中，本發明提供一種包含本發明之單股寡核苷酸之醫藥組合物。較佳地，醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
診斷小核醣核酸病毒感染之方法及篩選治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之具醫藥活性之化合物的方法
在一個態樣中，本發明提供一種診斷小核醣核酸病毒感染之方法，其包含以下步驟：(a)提供推測遭受小核醣核酸病毒感染之個體的樣品；(b)量測miR-146a、c-jun、c-fos、IRAK1及/或TRAF6之表現或啟動子活性；其中與對照樣品相比，miR-146a含量升高以及c-jun及/或c-fos含量升高或IRAK1及/或TRAF6含量降低表示小核醣核酸病毒感染。
在另一態樣中，本發明係關於一種篩選治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之具醫藥活性之化合物的方法，其包含以下步驟：(a)提供經小核醣核酸病毒感染之細胞；(b)使候選物質與該細胞接觸；及(c)量測miR-146a、c-jun、c-fos、IRAK1及/或TRAF6在該細胞中之表現或啟動子活性；其中與對照樣品相比，miR-146a含量降低以及c-jun及/或c-fos含量降低或IRAK1及/或TRAF6含量升高表示係具醫藥活性之化合物。
本文中發現，小核醣核酸病毒誘發之miR-146a在小核醣核酸病毒感染中發揮重要作用。本發明出人意料地發現由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染誘發靶向IRAK1及TRAF6(與IFN產生路徑有關的兩種重要蛋白質)且抑制其表現之miR-146a。由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染上調靶向IRAK1及TRAF6之miR-146a表現，該IRAK1及TRAF6與TLR信號傳導及I型干擾素產生有關。
IRAK1及TRAF6在本文中經鑑別為miR-146a之結合標靶。增加由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染中之miR-146a表現抑制IRAK1及TRAF6之表現，且進一步減少IFN產生。AP1為促成小核醣核酸病毒誘發之miR-146a上調(較佳地，腸病毒誘發之miR-146a上調，且更佳地，EV71誘發之miR-146a上調)的最重要轉錄因子。發現病毒誘發之AP1可上調miR-146a，導致IRAK1及TRAF6抑制，且AP1內之c-jun及c-fos為結合位點，因為c-jun與c-fos在由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染中顯著增加。
因此，miR-146、c-jun、c-fos、IRAK1及TRAF6之表現可用作診斷由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染且篩選用於治療及/或預防由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染的具醫藥活性之化合物的標記物。
中和小核醣核酸病毒之方法及治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之方法
在另一態樣中，本發明提供一種中和小核醣核酸病毒之方法，其包括使miR-146a拮抗劑與腸病毒接觸，其中該miR-146a拮抗劑為如本文中所描述之單股寡核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供一種治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之方法，其包括向個體投與有效量之miR-146a拮抗劑，其中該 miR-146a拮抗劑為如本文中所描述之單股寡核苷酸。
本發明發現小核醣核酸病毒誘發之miR-146a之中和經由複製I型干擾素來拯救遭受小核醣核酸病毒感染之個體免於死亡。出人意料地，miR-146a之基因剔除或藉由特異性拮抗miR(一類抗miR)中和病毒誘發之miR-146a使IRAK1及TRAF6之表現恢復，加強IFNβ產生，抑制病毒傳播且提高小鼠模型中之存活率。本發明提出腸病毒誘發之miR-146a藉由抑制IFN產生而促成病毒發病機制，且提供一條研發用於腸病毒感染之預防性及治療性策略的線索。本發明之實施例係關於作為miR-146a拮抗劑之核酸，其在引入細胞中時執行抑制內源性miRNA-146a之活性。
小核醣核酸病毒包括(但不限於)腸病毒(例如人類腸病毒A、B、C或D、脊髓灰白質炎病毒及柯薩奇病毒)；鼻病毒(例如人類鼻病毒A、B或C)；肝病毒(亦稱為嗜肝RNA病毒屬，諸如A型肝炎病毒)；心病毒屬(例如腦心肌炎病毒)；口蹄疫病毒屬(例如足口病病毒)。較佳小核醣核酸病毒為腸病毒。
腸病毒為與若干人類及哺乳動物疾病相關的正義單股RNA病毒屬。腸病毒屬列舉於下表中。
較佳地，腸病毒為腸病毒A、腸病毒B或腸病毒C。更佳地，腸病毒為腸病毒71。
在某些實施例中，需要中和小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)及/或治療及/或預防由小核醣核酸病毒(較佳腸病毒，且更佳EV71)引起之感染。自然地，投與途徑將隨著待靶向之位點的位置及性質而變化，且包括例如皮內、皮下、局部、非經腸、靜脈內、肌肉內、鼻內、全身及經口投與及調配。
在一些實施例中，用於遞送miRNA或編碼該miRNA或其組合之表現構築體之方法係經由全身投與。然而，本文中所揭示之醫藥組合物亦可經口、局部、非經腸、皮下、直接、氣管內、靜脈內、皮內、肌肉內或甚至腹膜內投與。
本文中亦涵蓋非經腸投與，一般特徵在於皮下、肌肉內或靜脈內注射。若靜脈內投與，則適合的載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)，及含有增稠劑及增溶劑之溶液，諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物。用於非經腸製劑之醫藥學上可接受之載劑 包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑及分散劑、乳化劑、鉗合劑或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸林格氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物來源之不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。必須將抑制細菌或抑制真菌濃度之抗微生物劑添加至封裝於多劑量容器中之非經腸製劑中，該等抗微生物劑包括苯酚或甲酚、汞劑、苄醇、氯丁醇、甲基對羥基苯甲酸酯及丙基對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、苯紮氯銨及苄索氯銨。等張劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)。懸浮劑及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80(TWEEN.RTM.80)。金屬離子之鉗合劑或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括作為與水互溶之媒劑之乙醇、聚乙二醇及丙二醇，及用於pH調節之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。核酸之注射可藉由注射器或用於注射溶液之任何其他方法遞送，只要核酸及任何相關組分可穿過注射所需之特定規格針即可。亦描述用於基因療法之注射器系統，該注射器系統准許以任何深度準確地多次注射預定數量之溶液。可注射劑可呈習知形式，以液體溶液或懸浮液形式，以適用於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式或以乳液形式製備。適合賦形劑為例如水、生理鹽水、右旋糖、丙三醇、甘露醇、1,3-丁二醇、林格氏溶液、等張氯化鈉溶液或乙醇。
在某些實施例中，口服醫藥劑型為固體、凝膠或液體。固體劑型為錠劑、膠囊、顆粒及塊狀散劑。口服錠劑之類型包括經壓縮之咀嚼口含錠及可包覆腸溶包衣、包覆糖衣或包覆膜衣之錠劑。膠囊可為硬明膠膠囊或軟明膠膠囊，而顆粒及散劑可以與熟習此項技術者已知 之其他成分組合之非發泡或發泡形式提供。
在某些實施例中，調配物為固體劑型，較佳為膠囊或錠劑。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可含有以下成分中之任一者或具有類似性質之化合物：黏合劑；稀釋劑；崩解劑；潤滑劑；滑動劑；甜味劑；及調味劑。
在某些實施例中，製備醫藥組合物以用於口腔投與。某些此類醫藥組合物為以習知方式調配之錠劑或口含錠。
用於本文中所提供之組合物之黏合劑的實例包括微晶纖維素、黃蓍膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠、明膠溶液、蔗糖及澱粉糊。潤滑劑包括滑石、澱粉、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、石鬆粉及硬脂酸。稀釋劑包括例如乳糖、蔗糖、澱粉、高嶺土、鹽、甘露醇及磷酸二鈣。滑動劑包括(但不限於)膠態二氧化矽。崩解劑包括交聯羧甲基纖維素鈉、羥基乙酸澱粉鈉、褐藻酸、褐藻酸鈉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、膨潤土、甲基纖維素、瓊脂及羧甲基纖維素。著色劑包括例如任一經審核認證之水溶性FD及C染料、其混合物；及懸浮於氧化鋁水合物之不可溶於水之FD及C染料。甜味劑包括蔗糖、乳糖、甘露醇及人工甜味劑(諸如糖精)及許多噴霧乾燥調味劑。調味劑包括提取自植物(諸如水果)之天然調味劑，及產生令人愉快感覺之化合物的合成摻合物，諸如(但不限於)胡椒薄荷及水楊酸甲酯。潤濕劑包括丙二醇單硬脂酸酯、去水山梨醇單油酸酯、二乙二醇單月桂酸酯及聚氧乙烯十二烷基醚。腸溶包衣包括脂肪酸、脂肪、蠟、蟲膠、氨化蟲膠及鄰苯二甲酸乙酸纖維素。膜衣包括羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇4000及鄰苯二甲酸乙酸纖維素。
實例 實例1 病毒誘發之miR-146a之標靶
miR-146a(EV71誘發之一種微RNA)由於在TLR信號傳導及IFN產 生中之調節活性而被選擇用於此研究中之進一步研究(圖1a)。為了確定IRAK1及TRAF6是否受EV71感染影響，首先偵測不同感染後時間點之IRAK1及TRAF6表現。兩種蛋白質表現均受抑制，但mRNA表現未受抑制(圖1b)。結合在一起，此結果顯示miR-146a可由EV71感染誘發且靶向IRAK1及TRAF6。然而，尚未充分證實IRAK1及TRAF6之準確miR-146a結合位點，且實際上未評估個別結合位點之抑制活性。因此，進一步使用PicTar(http：//pictar.org/)及RNA22(http：//cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)預測IRAK1及TRAF6之3'UTR內的潛在miR-146a結合位點(圖1c)。隨後，將在預測之miR-146a結合位點中存在或不存在4鹼基突變之IRAK1及TRAF6之3'UTR構築於miRNA報導基因載體中。報導基因分析證實miR-146a抑制含有野生型3'UTR之載體之螢光素酶活性，在具有單突變結合位點之載體中不太抑制，且對具有組合之突變結合位點之載體幾乎喪失其抑制活性(圖1d)。進一步闡明EV71感染中之IRAK1及TRAF6抑制是否特別為miR-146a依賴性的，建立V5-IRAK1-3'UTR-WT、V5-IRAK1-3'UTR-Mut(組合之所有突變結合位點)、V5-TRAF6-3'UTR-WT及V5-TRAF6-3'UTR-Mut穩定表現細胞且經EV71感染，且藉由西方墨點法在指定時間點量測V5-IRAK1及V5-TRAF6之蛋白質表現。具有野生型3'UTR之V5-IRAK1及V5-TRAF6之表現均顯著受抑制。然而，具有突變型3'UTR之V5-IRAK1及V5-TRAF6之表現未受明顯抑制(圖1e)。圖1f展示miR-146a之異位表現可直接抑制內源性IRAK1及TRAF6。證實EV71感染誘發靶向IRAK1及TRAF6(與IFN產生路徑有關的兩種重要蛋白質)且抑制其表現之miR-146a。然而，仍不清楚miR-146a在EV71感染中上調之根本機制，且需要探索以深入瞭解EV71發病機制。
實例2 AP1上調miR-146a表現
為了確定哪個轉錄因子負責調節病毒誘發之miR-146a，將藉由 微陣列分析之經EV71更改之轉錄因子與miR-146a啟動子區內之潛在轉錄因子結合位點交叉。AP1(c-jun/c-fos)為該交叉中鑑別出之唯一候選物。在miR-146a啟動子區內預測到四個潛在AP1結合位點(圖2a)。藉由即時RT-PCR及西方墨點法量測AP1(c-jun/c-fos)之表現，且結果展示c-jun與c-fos在EV71感染中顯著增加(圖2b)。將miR-146a啟動子區構築於螢光素酶報導基因載體內，且在外源表現之c-jun及c-fos存在下分析。c-jun、c-fos或兩個轉錄因子之強制表現均可增強miR-146a啟動子之轉錄活性以及內源性miR-146a表現(圖2c及圖2d)。
為進一步驗證AP1對miR-146a表現之直接活化活性，吾等針對miR-146a啟動子區內之各潛在AP1結合位點(BS)產生不同突變構築體(圖2a)，且藉由報導基因分析來測定各經預測之AP1 BS的重要性。第三個潛在AP1 BS之突變比在AP1過度表現下之其他三個潛在AP1 BS更嚴重地減弱轉錄活性。然而，所有四個BS均促進miR-146a上調，因為具有四個突變AP1 BS的載體之螢光素酶活性最受抑制(圖2e)。另外，將野生型及組合之四個AP1 BS突變miR-146a啟動子構築體轉染於宿主細胞中，之後經過病毒感染，以評估AP1對miR-146a啟動子活性之影響。EV71感染可誘發野生型miR-146a啟動子之轉錄活性，但略微影響突變miR-146a啟動子(圖2f)。此資料顯示AP1為促成EV71誘發之miR-146a上調之最重要轉錄因子。吾等提出病毒誘發之AP1可上調miR-146a，導致抑制IRAK1及TRAF6。為解決此問題，將c-jun及c-fos siRNA引入宿主細胞中，之後經過病毒感染，且分別藉由西方墨點法及即時RT-PCR分析兩種標靶蛋白質IRAK1及TRAF6與miR-146a。miR-146a表現受抑制，且IRAK1及TRAF6在宿主細胞中在c-jun及c-fos siRNA存在下恢復(圖2g)。JNK抑制劑(SP600125，充當可逆ATP競爭抑制劑)可抑制JNK路徑之活化，且進一步減少c-jun及c-fos表現。在病毒感染之前，用JNK抑制劑(20μM)處理宿主細胞，且在感 染後之指定小時(h.p.i.)內分析c-jun、c-fos、miR-146a、IRAK1及TRAF6之表現量。如所預期，AP1表現受JNK抑制劑抑制，伴有miR-146a之抑制及IRAK1及TRAF6之恢復。IRAK1及TRAF6為I型IFN產生之信號傳導路徑中之兩種關鍵組分。為探索受病毒感染抑制之IRAK1及TRAF6之復原是否可恢復IFN產生，使用拮抗miR-146a來中和病毒誘發之miR-146a。將拮抗miR-146a轉染於宿主細胞中，之後經過病毒感染，且IRAK1及TRAF6明顯復原(圖2h)。在此分析條件下，與陰性對照或模擬轉染相比，IFNβ啟動子活性自4 h.p.i.後恢復(圖2i)。在藉由即時RT-PCR分析之拮抗miR-146a轉染物中，IFNβ mRNA表現大大增加(圖2j)。miR-146a之中和拯救IRAK1及TRAF6之表現，且又恢復經EV71感染之細胞中的IFN產生。另外，探索此miR-146a信號級聯是否亦存在於另一重要EV71主要標靶器官腸中。用Caco-2細胞(一類結腸腺癌細胞)替代RD細胞以研究AP1介導之miR-146a上調及EV71感染後之IRAK1及TRAF6抑制。以10感染倍率用EV71感染Caco-2細胞，且在指定h.p.i.下分析c-jun、c-fos、miR-146a、IRAK1及TRAF6之表現。如先前在RD細胞中所發現，EV71感染誘發miR-146a表現，且引起IRAK1及TRAF6抑制(圖3a及圖3b)。在12 h.p.i.開始，AP1在mRNA及蛋白質含量中上調(圖3c)。與陰性對照相比，IRAK1及TRAF6之抑制亦可在拮抗miR-146a存在下恢復(圖3d)。此等證據暗示AP1介導之miR-146a誘發及IRAK1及TRAF6抑制為出現於不同經EV71感染之細胞類型中的普遍法則。隨後，研究miR-146a之上調是否為腸病毒感染中之常見特徵，在經兩種其他腸病毒(脊髓灰白質炎病毒3(PV3)及柯薩奇病毒B3(CVB3))感染之RD細胞中量測miR-146a之表現。如圖3e至圖3g中所展示，CVB3及PV3感染誘發miR-146a增加及AP1上調，以及IRAK1及TRAF6抑制。已證實miR-146a在活體外I型IFN產生中之重要作用，且因此進一步評估miR-146a在活體內病毒感染中之作用，尤 其集中於IFN產生及發病機制。
實例3 miR-146a對於活體內EV71發病機制為重要的
由於Mus miR-146a序列與同源miR-146a序列一致，因此推測Mus miR-146a可能結合至Mus IRAK1及TRAF6 3'UTR且抑制其表現。Mus IRAK1 3'UTR內存在三個潛在結合位點，而Mus TRAF6 3'UTR內存在兩個(圖4a)。為表徵miR-146a在活體內EV71感染中之作用，首先由於小鼠中人類EV71具有低感染性或非感染性，所以產生適應小鼠之EV71(此後稱為mEV71)以用於建立EV71感染小鼠模型1。使用不同mEV71空斑形成單位(PFU)來滴定將用於以下活體內mEV71感染分析中之最佳mEV71劑量。經由天然經口途徑，經mEV71之1×108及2×108 PFU感染之小鼠的10天存活率分別為60%及20%，且經選擇以用於進一步實驗。藉由即時RT-PCR量測miR-146a剔除小鼠主要器官中之miR-146a表現。雖然所分析之器官之miR-146a表現在野生型小鼠中有所不同，但其無法在miR-146a-/-小鼠中偵測到。
向野生型小鼠與miR-146a-/-小鼠餵食如所指定之兩種劑量mEV71，且每天記錄臨床症狀。經2×108及1×108 PFU感染之野生型小鼠的10天存活率分別為27%及54%。出人意料地，在感染後10天(d.p.i.)，經2×108及1×108 PFU感染之miR-146a-/-小鼠的存活率顯著提高至92%及93%(p分別為0.0013及0.0212)(圖4b)。其暗示miR-146a之剔除可提高EV71感染中之存活率。隨後，發現經mEV71感染之小鼠顯示後胺麻痹，但模擬感染小鼠未顯示(圖4c，上圖)。藉由蘇木精及伊紅染色分析，經病毒感染之小鼠的肌肉組織與模擬感染小鼠相比呈現嚴重壞死性肌炎(圖4c，中圖)。先前，Wang及其同事已報導EV71感染可誘發壞死性肌炎。因此，進一步說明壞死性肌炎是否與病毒感染相關，且使用抗-EV71特異性抗體執行免疫組織化學染色。顯然，在壞死性肌炎肌肉中偵測到EV71(圖4c，下圖)。先前研究證實高組 織病毒負荷伴隨有嚴重疾病徵象及較高死亡率。由於野生型小鼠與miR-146a-/-小鼠之間的顯著死亡率差異，所以在1 h.p.i.及3 d.p.i.藉由空斑分析來量測所有主要器官中之EV71效價。在1 h.p.i.，在野生型小鼠與miR-146a-/-小鼠之胃腸道(胃、腸及直腸)中偵測到較高EV71效價為合理的，因為EV71感染經由經口投與。三天之後，與miR-146a-/-小鼠相比，野生型小鼠之主要EV71敏感器官(腸、肌肉、大腦、脊髓及肺)中具有更高病毒負荷(圖4d)。
另外，在3 d.p.i.，EV71存在於野生型小鼠之血液中而不存在於miR-146a-/-小鼠之血液中顯示病毒血症僅出現於野生型小鼠中，且miR-146a表現阻斷限制EV71擴散。此等資料暗示全身EV71感染出現於野生型小鼠中，但不出現於miR-146a-/-小鼠中。結合在一起，此等發現推理出miR-146a-/-小鼠對EV71感染更具抵抗性，且高病毒負荷可引起高死亡率之原因。
為進一步驗證miR-146a介導之信號轉導，藉由即時RT-PCR或西方墨點法分析miR-146a、IRAK1、TRAF6及IFNβ之表現量。在EV71感染後，miR-146a表現在野生型小鼠之心臟、肺、腸及肌肉中大量增加，但在大腦、脊髓及血液中較少增加(圖4e)。在miR-146a表現與其標靶基因表現(IRAK1及TRAF6)之間發現一種互反相關性，亦即野生型小鼠中較高miR-146a表現與IRAK1及TRAF6之較低表現相關(圖4f)。另外，IFNβ產生亦與miR-146a表現(尤其心臟、肺、腸及肌肉中)互反相關(圖4g)。在miR-146a-/-小鼠之情況下，在所有分析器官中均無法偵測到miR-146a表現之任何增加。一致地，與模擬對照組相比，不存在明顯減少的IRAK1及TRAF6表現或IFNβ抑制(圖4f至圖4g)。此外，與經EV71感染之miR-146a-/-小鼠組或模擬組相比，經2×108 PFU感染之野生型小鼠的體重大大下降。此等資料清晰顯示miR-146a管控EV71發病機制，包括病毒傳播、IFN阻斷、臨床疾病乃至死亡。
實例4 LNA拮抗miR-146a提供針對腸病毒之潛在療法
用於實例之LNA拮抗miR-146a的序列為5'-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA -3'(SEQ ID NO：20)。儘管已藉由使用miR-146a-/-小鼠模型清晰闡明miR-146a在EV71發病機制中之重要性，然而，應在EV71感染小鼠模型中實際上評估miR-146a沉默之治療潛能。首先將LNA拮抗miR-146a(經設計之鎖核酸)腹膜內注入以評估由LNA拮抗miR引起之潛在不良事件。自肝臟、腎臟及血清獲得之HE染色及血液化學報告展示在LNA拮抗miR-NC或LNA拮抗miR-146a感染之後無顯著病理變化。在確定LNA拮抗miR之安全性之後，隨後在如所指示之病毒感染之前或之後將LNA拮抗miR-146a引入野生型小鼠中，且每天監測小鼠之臨床症狀。在病毒感染前1小時(表示為0 d.p.i.)、1 d.p.i.及2 d.p.i.注射LNA拮抗miR-146a展示與PBS或LNA拮抗miR陰性對照組相比(分別為22%及25%)存活率明顯提高(分別為80%、70%及56%)(圖5a)。然而，3 d.p.i.之LNA拮抗miR-146a注射未提高小鼠存活率，且此等資料暗示LNA拮抗miR-146a可用作預防劑以及mEV71感染早期之治療劑。分別藉由即時RT-PCR及西方墨點法量測miR-146a及兩種miR-146a標靶IRAK1及TRAF6之表現。與模擬感染相比，miR-146a在經LNA拮抗miR陰性對照治療之經mEV71感染小鼠中上調。病毒誘發之miR-146a藉由0及1 d.p.i.時之LNA拮抗miR-146a處理而大大受抑制，尤其在高度敏感器官中，包括腸、肌肉及肺(圖5b)。為驗證藉由LNA拮抗miR-146a使病毒誘發之miR-146a削弱是否可恢復miR-146a標靶之表現，藉由西方墨點法量測分析器官中之IRAK1及TRAF6。圖5c展示IRAK1及TRAF6藉由LNA拮抗miR-146a恢復，尤其在心臟、肺及肌肉中，且結果展示與miR-146a抑制之互反相關性(圖5b至圖5c)。與miR-146a-/-小鼠研究中之發現一致，與模擬感染及LNA拮抗miR陰性對照組相比，在0及1 d.p.i.時經LNA拮抗miR- 146a處理之經EV71感染野生型小鼠中發現IFNβ產生之恢復(圖5d)。
為確定IFN是否實際上在拮抗miR-146a介導之提高存活率中發揮重要作用，在病毒感染之前(0 d.p.i.)用LNA拮抗miR-146a及抗IFNα/β抗體依序注射小鼠，且每天記錄小鼠存活率。圖5e展示抗IFNα/β抗體消除拮抗miR-146a介導之提高存活率，且意謂LNA拮抗miR-146a經由IFN之恢復來提高小鼠存活率。因此，0及1 d.p.i.組中觀察到的提高存活率歸因於病毒誘發之miR-146a之削弱、IRAK1及TRAF6之恢復及IFNβ表現之恢復。
實例5 經設計之拮抗miR-146a1及拮抗miR-146a2之作用
拮抗miR-146a1及拮抗miR-146a2之序列分別為5'-ATGGAATTCAGTTCTCA -3'(SEQ ID NO：21)及5'-ATTCAGTTCTCA -3'(SEQ ID NO：22)。
細胞培養及病毒感染.在具有1mM L-麩醯胺酸、100單位/毫升青黴素及100μg/ml鏈黴素之MEM培養基(Life Technologies)中培養人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD)及結腸腺癌細胞株(Caco-2)。分別用10%及20%胎牛血清(Life Technologies)補充用於RD及Caco-2細胞之培養基。在具有5mM L-麩醯胺酸、100單位/毫升青黴素、100μg/ml鏈黴素及10%胎牛血清之RPMI-1640培養基中培養THP-1細胞，一類來源於急性單核細胞性白血病患者之人類單核細胞。用PMA(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯)處理THP-1細胞，且使其分化成單核源性巨噬細胞。RD細胞用於脊髓灰白質炎病毒3型(PV3，Sabin菌株)、柯薩奇病毒B3(CVB3)及腸病毒71(EV71)之傳播及空斑滴定。病毒感染在無血清條件下執行。病毒儲備液之等分試樣儲存於-80℃下。所有細胞株均自ATCC源獲得。
RNA提取及miRNA型態分析.藉由Trizol試劑(Life Technologies)，自經病毒感染或模擬感染之RD細胞提取RNA。使用 TaqMan微RNA分析(Life Technologies)量測250個人類miRNA之表現量。
個別即時RT-PCR.根據製造商之說明書，使用TaqMan微RNA個別分析或TaqMan基因表現分析(000468、001093、001973、Mm00439546_sl及Mm00607939_sl；Life Technologies)執行miR-146a、同源RNU6B、mus U6 snRNA、mus IFNβ及mus β-肌動蛋白之定量。簡言之，在Applied Biosystems 7900HT系統上使用標準方案執行即時RT-PCR。10μl PCR混合物包括2μl RT產物、5μl 2x TaqMan通用PCR母體混合物、0.5μl 20x TaqMan探針及引子，及2.5μl H2O。將反應物在96孔盤中在95℃下培育10分鐘，之後為95℃下15秒及60℃下1分鐘之40次循環。所有反應均一式三份地執行。臨限循環值(CT)定義為螢光經過固定臨限值時的分數循環次數(fractional cycle number)。藉由SYBR基於綠色之即時PCR執行c-jun、c-fos及TBP之定量(表1)。
西方墨點法.在RIPA溶解緩衝液[50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、1%曲拉通X-100(Triton X-100)、0.1% SDS、1%去氧膽酸鈉、1mM PMSF及蛋白酶抑制劑混合物]中收穫細胞或組織，且藉由BCA蛋白質分析(BioRad)量測蛋白質濃度。藉由10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳將蛋白質解析，轉移至PVDF膜，用含5%脫脂乳之Tris緩衝生理鹽水(TBS)[20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl及0.5% Tween-20]阻斷，且與β肌動蛋白(1：5000；Sigma)、同源TRAF6(1：200；Santa Cruz)、同源IRAK1(1：200；Santa Cruz)、c-jun(1：200；Santa Cruz)、c-fos(1：200；Santa Cruz)、RelA(1：500；Biolegend)、組蛋白H3(1：3000；Cell Signaling)、mus TRAF6(1：200；Santa Cruz)、mus IRAK1(1：200；Santa Cruz)及V5標籤(1：5000；Life Technologies)之初級抗體反應。β-肌動蛋白充當內部對照。
螢光素酶分析.所有轉染均在96孔盤中一式三份地進行。在轉染前24小時，接種RD細胞(每孔1×104個)。以5：1 DNA比率，在如所指示之pSilencermiRNA表示載體(Life Technologies)存在下，將螢光素酶報導基因構築體以及對照質體(pRL-TK載體；Promega)用脂染胺LTX試劑(Life Technologies)共轉染於細胞中。在培育48小時之後，將Dual-Glo螢光素酶受質(Promega)添加至各孔，且根據製造商之說明書，藉由Victor3多標記計數器(PerkinElmer)量測發光信號。對於IFNβ啟動子分析，在病毒感染之前將報導基因構築體用拮抗miR-NC或拮抗miR-146a共轉染於RD細胞中。在培育24小時之後，用EV71感染所有轉染物且在所指示時間點分析。海腎螢光素酶之活性用作標準化轉染效率之內部對照。
質體構築.藉由分別使用TRAF6 luc F/TRAF6 luc R及IRAK1 luc F/IRAK1 luc R，自RD細胞之互補DNA擴增全長TRAF6及IRAK1 3'UTR(表1)。成對引子(TRAF6 luc F與TRAF6 mut R1、TRAF6 mut F1與TRAF6 luc R、TRAF6 luc F與TRAF6 mut R2、TRAF6 mut F2與TRAF6 luc R、TRAF6 luc F與TRAF6 mut R3及TRAF6 mut F3與TRAF6 luc R)用於產生突變型TRAF6 3'UTR，其中將藉由基於PCR之突變誘發方法之miR-146a結合位點種子區內的四個突變核苷酸加下劃線(表)。對於突變型IRAK1 3'UTR構築體，引子表示為IRAK1 luc F、IRAK1 luc R、IRAK1 mut F1、IRAK1 mut R1、IRAK1 mut F2及IRAK1 mut R2(表1)。所有PCR片段均選殖於pMIR報導基因螢光素酶載體(Life Technologies)中。TRAF6及IRAK1片段之編碼區及3'UTR自RD細胞之cDNA擴增，且與V5標籤一起選殖於pcDNA 3.1表現載體(Life Technologies)中。miR-146a前驅物片段藉由基於PCR之接合而擴增，且構築於具有BamHI及HindIII之pSilencer載體(Life Technologies)中(表1)。分別將miR-146a前驅物及IFNβ之啟動子區構築於pGL3基礎載體。
RD細胞之穩定轉染及拮抗miR轉染.為產生穩定TRAF6表現細胞株或IRAK1表現細胞株，藉由使用脂染胺LTX試劑(Life Technologies)，將RD細胞用編碼具有野生型或突變型3'UTR之V5-TRAF6或V5-IRAK1融合蛋白質的2μg質體DNA轉染，且用G418(1mg/ml；Life Technologies)處理。對於拮抗miR轉染，根據製造商之說明書，藉由siPORT NeoFX轉染試劑(Life Technologies)，將3×105/ml胰蛋白酶化RD細胞用對照拮抗miR(5pM)或特異性拮抗miR(5pM)(Life Technologies)轉染。
空斑分析.EV71空斑分析在6孔盤中一式三份地進行。用100微升/孔經稀釋之病毒儲備液感染RD細胞。在培育1小時之後，洗滌經感染之細胞，且在0.3%瓊脂糖培養基覆疊片上培育3天。用甲醛固定細胞，且用結晶紫染色。計數空斑。
JNK抑制劑治療.將RD細胞接種至6孔盤中，且在20μM JNK抑制劑(SP600125，Sigma-Aldrich)、DMSO或僅培養基下用EV71感染。在感染之後，提取總蛋白質及RNA，且分別藉由西方墨點法或即時RT-PCR分析。
適應小鼠之EV71及LNA拮抗miR投與.C57BL/6小鼠由國立臺灣大學基因體醫學研究中心之基因剔除小鼠核心實驗室(the Knockout Mouse Core Laboratory of National Taiwan University Center of Genomic Medicine)提供，圈養於特定無病原體動物室內，且根據國立臺灣大學醫學院及公共衛生學院實驗動物照護與使用委員會(IACUC)之準則處理。參考由Wang,Y.F.於2004年出版之報告，建立適應小鼠之EV71(mEV71)。在自親本人類EV71開始之新生小鼠中之四個連續繼代之後，產生mEV71。腹膜內注射親本人類EV71，且在3 d.p.i.時自新生小鼠大腦組織分離下一代mEV71，稱作第1 mEV71。隨後，使經分離之第1 mEV71在RD細胞中繁殖。執行繼代程序四次。為測定 50%致死劑量(LD50)，用所指示PFU之mEV71餵食七日齡野生型C57BL/6小鼠。每天監測小鼠之存活率。對於野生型C57BL/6小鼠及miR-146a-/- C57BL/6小鼠接種，將圈養於同一籠子中之各組(n=9至13)用所指示PFU之mEV71經由經口途徑感染，且用培養基餵食對照組。每天監測動物，且記錄臨床徵象、重量及死亡。自具有顯著臨床疾病徵象之處死小鼠獲得所有小鼠組織，或若小鼠不具有顯著疾病徵象，則在3 d.p.i.時獲取。用即時RT-PCR、西方墨點法、空斑分析、免疫組織化學染色等進一步分析該等組織。對於LNA拮抗miR注射，用LNA拮抗miR-146a(1.2mg/kg)或LNA拮抗miR陰性對照(1.2mg/kg)經由腹膜內途徑在如所指示之病毒感染之前或之後注射野生型小鼠，且每天監測。實驗動物照護與使用委員會(IACUC)核准所有動物方案。
免疫組織化學染色.自最佳切割溫度(OCT)包埋之組織獲得用於免疫染色之模擬感染及病毒感染小鼠切片。在4℃下將樣品用初級抗體抗腸病毒71(1：200；Millipore)染色12小時。用PBS洗滌樣品兩次，在室溫下用山羊抗小鼠IgG生物素標記二級抗體(1：500；Vector Laboratories)處理1小時，且根據製造商之說明書，藉由ABC套組(Vector Laboratories)顯影。隨後，藉由顯微鏡檢查載片。
統計分析.史都登氏t檢驗(Student's test)用於比較EV71感染期間不同時間點之miRNA表現。p值<0.05視為顯著的，且雙尾檢驗用於此研究。鑑別相對於模擬感染在4及8 h.p.i.時具有大於2倍表現變化之miRNA以用於進一步研究。miR-146a與IRAK1或TRAF6及IRAK1或TRAF6與IFNβ之相關性呈現為藉由皮爾森相關性方法(Pearson correlation method)估計之相關係數(r)。正值或負值r表示兩種變數之間的正性或負性相關。
如圖6中所展示，(a)miR-146a在mEV71感染中經誘發。MEF細 胞經mEV71感染，之後使用即時RT-PCR定量miR-146a(n=3)。MI，模擬感染。*與模擬感染相比，P值<0.05。(b)EV71感染在MEF細胞中在蛋白質含量中抑制IRAK1及TRAF6表現。(c)mus IRAK1及TRAF6 3'UTRs內之預測mus miR-146a BS(終止密碼子後之第一核苷酸表示為+1)。(d)異位miR-146a對內源性IRAK1及TRAF6之影響。用miR-146a過度表現載體或陰性對照轉染MEF細胞，且分別藉由西方墨點法及即時RT-PCR分析IRAK1及TRAF6與miR-146a(n=3)。MT，模擬轉染；NC，陰性對照。(e)拮抗miR-146a在MEF細胞中恢復mEV71誘發之TRAF6及IRAK1抑制。用拮抗miR-146a或拮抗miR-NC轉染MEF細胞，之後為mEV71感染。所有資料均呈現為平均值±標準差，且藉由史都登氏t檢驗計算所有P值。
圖7展示在pSilencer-miR-146a存在下所指示濃度之經設計拮抗miR-146a轉染於RD細胞中。與拮抗miR-NC相比，pSilencer-146a對pMIR-IRAK13'UTR(A)及pMIR-TRAF6 3'UTR(B)之抑制活性藉由拮抗miR-146a引入而恢復。

Claims (20)

  1. 一種單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其長度為8至25個核鹼基單元，其中該寡核苷酸包含由自該寡核苷酸之3'端計數之AGTTCTCA(SEQ ID NO：1)組成的種子核鹼基序列。
  2. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其中該單股寡核苷酸之至少約50%該等核鹼基單元與miR-146a序列或其區域互補。
  3. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其中該單股寡核苷酸之至少約95%該等核鹼基單元與該miR-146a序列或其區域互補。
  4. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其包含與miR-146a種子區之序列完全互補之相鄰核苷酸序列。
  5. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其包含與存在於該miR-146a序列中之至少12個相鄰核苷酸完全互補之相鄰核苷酸序列。
  6. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其包含與存在於該miR-146a序列中之至少17個相鄰核苷酸完全互補之相鄰核苷酸序列。
  7. 如請求項5之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其中該寡聚物之該相鄰核苷酸序列與miR-146a之一區域之序列完全互補。
  8. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其中該寡聚物之該相鄰核苷酸序列包含與miR-146a序列完全互補之12至22個之間的核苷酸。
  9. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其包含一或多個2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氟-DNA單體或LNA單元。
  10. 如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物，其係選自由以下組成之群：5'-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'-AACCC B (T,G,C)TGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'-AACC D (T,A,G)ATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'-AA D (T,A,G)CCATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'-A B (T,G,C)CCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'- B (T,G,C)ACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'- N (額外A,T,C,G)AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'- NN (額外A,T,C,G)AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'- NNN (額外A,T,C,G)AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3'；5'-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA -3'；5-ATGGAATTCAGTTCTCA -3'：及5'-ATTCAGTTCTCA -3'。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物。
  12. 一種診斷由小核醣核酸病毒引起之感染的方法，其包含以下步驟：(a)提供推測遭受小核醣核酸病毒感染之個體的樣品；(b)量測miR-146a、c-jun、c-fos、IRAK1及/或TRAF6之表現；其中與對照樣品相比，miR-146a含量升高以及c-jun及/或c-fos含量升高或IRAK1及/或TRAF6含量降低表示小核醣核酸病毒感染。
  13. 一種篩選治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之具醫藥活性之化合物的方法，其包含以下步驟：(a)提供經小核醣核酸病毒感染之細胞； (b)使候選物質與該細胞接觸；及(c)量測miR-146a、c-jun、c-fos、IRAK1及/或TRAF6在該細胞中之表現或啟動子活性；其中與對照樣品相比，miR-146a含量降低以及c-jun及/或c-fos含量降低或IRAK1及/或TRAF6含量升高表示係具醫藥活性之化合物。
  14. 如請求項12或13之方法，其中量測miR-146a、c-jun、c-fos、IRAK1及TRAF6。
  15. 一種中和小核醣核酸病毒之方法，其包括使miR-146a拮抗劑與該小核醣核酸病毒接觸，其中該miR-146a拮抗劑為如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物。
  16. 一種治療及/或預防小核醣核酸病毒感染之方法，其包括向個體投與有效量之miR-146a拮抗劑，其中該miR-146a拮抗劑為如請求項1之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物。
  17. 如請求項15或16之方法，其中該miR-146a拮抗劑為如請求項10之單股寡核苷酸或其核苷酸類似物中之任一者。
  18. 如請求項12、13、14及15中任一項之方法，其中該小核醣核酸病毒為腸病毒。
  19. 如請求項18之方法，其中該腸病毒為腸病毒A、腸病毒B或腸病毒C。
  20. 如請求項18之方法，其中該腸病毒為腸病毒71。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114032238B (zh) * 2021-10-22 2023-10-24 山东农业大学 gga-miR-146a-5p的抑制物在制备抗J亚群禽白血病病毒感染药物中的应用
CN115120615B (zh) * 2022-06-10 2024-02-06 中国人民解放军海军军医大学 miR-146a-5p过表达工程干细胞外泌体在制备治疗芥子气致肺损伤药物中的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007109350A2 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 California Institute Of Technology Modulation of innate immunity receptors' signaling by micrornas mir-146a and mir-146b
WO2009033185A1 (en) * 2007-09-06 2009-03-12 University Of Massachusetts Virus-specific mirna signatures for diagnosis and therapeutic treatment of viral infection
WO2009079592A2 (en) * 2007-12-17 2009-06-25 California Institute Of Technology Modulating immune system development and function through microrna mir-146
CN101643730A (zh) * 2009-07-27 2010-02-10 北京大学人民医院 微小RNA-146a在类风湿关节炎治疗中的用途
CN101670117B (zh) * 2009-09-03 2011-04-20 中国人民解放军第三军医大学 miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用
US9476041B2 (en) * 2010-07-12 2016-10-25 National University Corporation Tottori University Method for producing novel hipsc by means of siRNA introduction
CN102988985B (zh) * 2011-09-15 2014-12-10 中国科学院上海生命科学研究院 miR-146a作为调节血管生长靶标的用途
NZ630591A (en) * 2012-04-25 2017-02-24 Regulus Therapeutics Inc Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity

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