TW201546091A - 雙功能抗體用於治療癌症 - Google Patents

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Abstract

本發明係一雙功能抗體(bi-specific antibody)其專一性引導一治療劑至一癌細胞透過靶向一癌細胞之腫瘤抗原，從而抑制癌細胞的生長或阻斷侵襲癌或轉移。本發明之該雙功能抗體包括一第一抗原結合位其結合至結合聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)；及一第二抗原結合位其結合至一目標配體(target ligand)，諸如一腫瘤抗原。

Description

雙功能抗體用於治療癌症
本發明係關於癌症的治療。具體而言，本發明係關於新雙功能抗體(bi-specific antibodies，BsAb)及其抑制癌症生長或轉移；並追蹤癌症發生的用途。
聚乙二醇(poly(ethylene glycol)，PEG)之共價連接(聚乙二醇化或PEG化，PEGylation)至物質，諸如蛋白質、胜肽及奈米粒子(nanopaiticles，NPs)(例如，脂質體(liposomes)，微胞(micelles)等)可增加藥物生物利用度，增強血液循環半衰期(half-life)和阻礙由網狀內皮系統(reticuloendothelial system，RES)之捕獲。
這些有利之特性，致使PEG化之廣泛使用於NPs之發展包含於臨床上使用，例如脂質體阿黴素(liposomal doxorubicin，Lipo-Dox)(Caelyx)用於對卵巢癌(ovarian)和乳腺癌(breast carcinomas)的治療和卡波濟氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)和紫杉醇添加之PEG-聚乳酸(poly lactic acid，PLA)微胞(Paclitaxel-loaded PEG-PLA micelles)(Genexol-PM®)之治療，在韓國核准用於轉移性乳腺癌，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)和卵巢癌。
聚乙二醇化奈米粒子(PEGylated nanopaiticles， PEG-NPs)係被高度視為第二代藥物遞送系統和治療劑或顯像劑之主流。
由於腫瘤中內皮細胞的異常結構引起之增加滲透和滯留(enhanced permeability and retention，EPR)可在腫瘤中堆積PEG化物質，特別是PEG-NPs。
然而，PEG-NPs常累積於腫瘤附近但不穿透進入腫瘤塊，且一些藥物不能輕易由PEG-NPs擴散至癌細胞。因此，一些研究報告指出，抗體與PEG-NPs之的化學共軛作用(chemical conjugation)增加專一性靶向和細胞內吞，從而提高治療效果和成像的靈敏度。
然而，抗體(antibody，Ab)以化學式連接PEG-NPs係難以達成。大多數的官能基(例如，胺基、羧基、硫醇基團)係大量存在於配體中，其可能導致抗體功能喪失，或導致該抗體的異質取向(heterogeneous orientation)，從而使其難以在化學共軛作用後得到可再現產物。此外，化學共軛作用也可能改變奈米載體和被包封藥物的結構。這些問題限制了靶向之NPs之臨床應用性。
鑑於上述情況，在現有之相關技術中，需要一種靶向PEG化物質(例如，PEG-NPS)的改進的方法，其可再現並且易於使用。
本發明提供了人類化雙功能抗體及其用於治療癌症或用於追蹤癌症發生之用途。
因此，本發明之第一個目的係提供一種雙功能抗體(bi-specific antibody，BsAb)，其結合到兩個不同的抗原決定位(epitope)， 其係一個PEG分子(例如，聚乙二醇之末端甲氧基(methoxy)或羥基(hydroxyl)，或PEG之主鏈)和目標配體(例如，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、TAG72、CD19或CD20)。本發明之BsAb包括一第一抗原結合位其結合至PEG且包括一第一輕鏈可變結構域及一第一重鏈可變結構域；一第二抗原結合位其結合至一目標配體(例如，一腫瘤抗原)。較佳地，本發明之該BsAb進一步包括一胜肽連接子位於該第一抗原結合位和該第二抗原結合位之間。視情況，該第一抗原結合位可進一步包括一第一鉸鏈結構域(first hinge domain)。
該目標配體可以為一蛋白質，其選自由表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor2 HER2)、HER3、腫瘤相關糖蛋白72(tumor-associated glycoprotein 72，TAG-72)、CD19和CD20所組成之群組。
在一些實施例中，該BsAb之第一抗原結合位結合至PEG之主鏈且包含一至少90%與SEQ ID NO：1相同之第一VL-Ck結構域、一至少90%與SEQ ID NO：2相同之一VH-CH1結構域及一至少90%與SEQ ID NO：3相同之第一鉸鏈結構域(hinge domain)；而BsAb之第二抗原結合位結合於TAG-72、EGFR或HER2之任一且包括一至少90%與SEQ ID NO：5、7或8相同之單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)；及一至少90%與SEQ ID NO：4相同之該胜肽連接子。
PEG具有至少90%與SEQ ID NO：9相同之該第一VL-Ck結構域，及至少90%與SEQ ID NO：10相同之該第一VH-CH1結構域；而該 第二抗原結合位結合於EGFR或CD19且包含一至少90%與SEQ ID NO：7或11相同之scFv；和至少90%與SEQ ID NO：4相同之該肽連接子係。
在其它實施例中，該第一抗原結合位結合至PEG之主鏈且包含至少90%與SEQ ID NO：9相同之一第一VL-Ck結構域、至少90%與SEQ ID NO：10相同之一第一VH-CH1結構域和至少90%與SEQ ID NO：22相同之第一HR-CH2-CH3結構域；而該第二抗原結合位結合於CD19或HER2和包括至少90%與SEQ ID NO：23或26相同之一第二VL-CH1結構域、至少90%與SEQ ID NO：24或27相同之一第二VH-Ck結構域及至少90%與SEQ ID NO：25相同之一第二HR-CH2-CH3結構域。
在另一個實施例中，該第一抗原結合位結合至該的PEG之末端甲氧基或羥基的基團，並且包括至少90%與SEQ ID NO：12相同之一第一VL-Ck結構域、至少90%與SEQ ID NO：13相同之一第一VH-CH1結構域和至少90%與SEQ ID NO：22相同之一第一HR-CH2-CH3結構域；而該第二抗原結合位結合於CD19或HER2和包括至少90%與SEQ ID NO：23或26相同之一第二VL-CH1結構域，至少90%與SEQ ID NO：24或27相同之一第二VH-Ck結構域，和至少90%與SEQ ID NO：25相同之一第二HR-CH2-CH3結構域。
在另一個實施例中，該第一抗原結合位結合於聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)之末端甲氧基或羥基的基團，並且包括至少90%與SEQ ID NO：12相同之一第一VL-CK結構域，一第一VH-CH1結構域至少90%與SEQ ID NO：13相同之一第一VH-CH1結構域和至少90%與SEQ ID NO：22相同之一第一HR-CH2-CH3結構域；而該第二抗原結合位結合HER2 或EGFR，並且包括至少90%與SEQ ID NO：15或16相同之一人類化單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)。
在進一步的實施例中，該第一抗原結合位結合於聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)之該末端甲氧基或羥基之基團，並且包括至少90%與SEQ ID NO：17相同之一人類化單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)；而該第二抗原結合位結合於CD19或CD20和包含至少90%與SEQ ID NO：21相同之一第一VL-Ck結構域、至少90%與SEQ ID NO：20相同之一第一VH-CH1結構域。
本發明之第二個目的係提供一種藥物套組用於治療或追蹤癌症發展，包括轉移性及/或抗藥性癌症。該藥物套組包括至少兩種成份，其分別係上述雙功能抗體；及聚乙二醇化物質，其係一治療劑或一顯像劑。該治療劑可以是一蛋白質、一胜肽或包含一化療藥物於其中之一奈米粒子之任一者。該顯像劑可以是量子點(quantum dot，QD)、微泡造影劑、一螢光染料、一鐵奈米顆粒、一螯合放射性同位素或一金奈米顆粒。
實務上，該雙功能抗體及該藥物套組之聚乙二醇化之物質係首先混合以形成一組件；且該組件接著給予該個體用於治療癌症或用於追蹤癌症。
本發明之第三個目的是提供一種治療一患有一癌症生長之一個體的方法。該方法包括以下步驟，給予上述之該雙功能抗體及一含有治療劑之聚乙二醇化物質，同時或依序地給予該個體一足以抑制該個體之該癌症之該生長及轉移的劑量。較佳地，該方法包括以下步驟，混合上述之該雙功能抗體及含有治療劑的聚乙二醇化的物質以形成一組件 (assembly)，並將該組件在足以抑制個體癌細胞的生長或轉移的劑量給予該個體。給予該個體的劑量為約0.1至50毫克/千克體重(mg/Kg body weight)。在某些實施例中，該劑量係給予該個體約1至40毫克/千克體重，較佳地，約為5至10毫克/千克該個體之體重。該劑量可以一單一劑量或可替代地以一個以上之小劑量施予。
此外，本發明亦提供了一種藥物組合在製備用於治療癌症之藥物之用途，其中該藥物組合包含一第一量之上述該人類化雙功能抗體及一第二量之一聚乙二醇化物質之一混合物；其中該混合物係形成一組件且該治療癌症係抑制癌的生長或轉移；且該聚乙二醇化物質係治療性且係一蛋白質、一胜肽、一含有化學治療藥物於其中之奈米顆粒之任一者。
癌症，較佳為那些顯示出EGFR、HER2、TAG72、CD19或CD20之表現量增加者，係可經由本發明的方法治療。在較佳實施例中，本發明的該方法對於治療一患有乳腺癌、頭頸癌、結腸直腸癌或卵巢癌之個體係有效。
本發明之第四個目的係提供一種在活的個體中組織成像之方法。該方法包括以下步驟，給予上述的雙功能抗體及含有治療劑之一聚乙二醇化物質，同時或依序地給予個體在其量足在個體之組織成像。較佳地，該方法包括以下步驟：(a)本發明的一第一足夠量之任一之人類化雙功能抗體之及一第二足夠量之聚乙二醇化的物質(例如，一奈米粒子其中包含成像劑如一量子點(quantum dot；PEG-QD)或一螢光染料)，以形成一個組件；(b)注入步驟(a)之該組件至該個體；及(c)透過螢光成像(fluorescence imaging)、電子自旋共振(electron spin resonance，ESR) 成像，γ相機成像，X射線成像，電腦斷層掃描(computed tomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)進行該個體之組織成像。此外，本發明亦提供了一種顯影劑(developing agent)含有一上述第一足夠量之人類化雙功能抗體及一第二足夠量之一PEG化成像劑之混合，其中，該混合物係形成一組件且該組件係製備為注射一個體並成像該個體之該組織透過螢光成像、電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)成像，X射線成像，電腦斷層掃描(computed tomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)。根據一些實施例中，該PEG-QD包含一選自CdHgTe、硒化鎘(CdSe)、硒化鎘/硫化鋅(CdSe/ZnS)、硫化鎘(CdS)、碲化鎘(CdTe)、碲化鎘/硫化鎘(CdTe/CdS)、硒化鉛(PbSe)和硫化鉛(PbS)組成的群組中之量子點奈米晶體(quantum dot nanocrystal)
本發明的一個或多個實施例之細節闡述於下面所附之描述。本發明之其它特徵和優點從該發明內容及申請專利範圍係顯而易見。
Fab‧‧‧片段抗原結合區域(fragment antigen binding)
Fc‧‧‧可結晶片段(fragment crystallizable)
HR‧‧‧鉸鏈區(鉸鏈region)
VL‧‧‧可變輕鏈(variable light)
VH‧‧‧可變重鏈(variable heavy)
CL‧‧‧恆定輕鏈(constant light)
CH1‧‧‧恆定重鏈1(constant heavy1)
CH2‧‧‧恆定重鏈2(constant heavy2)
CH3‧‧‧恆定重鏈3(constant heavy3)
300‧‧‧藥物套組
310‧‧‧人類化抗PEG BsAb(humanized抗PEG BsAb)
311‧‧‧第一抗原結合位
312‧‧‧第二抗原結合位
320‧‧‧PEG化物質
321‧‧‧癌症治療劑
322‧‧‧PEG分子
330‧‧‧組件(assembly)
340‧‧‧腫瘤抗原
360‧‧‧人
scFv‧‧‧單鏈可變片段(single chain variable fragment)
TAG-72‧‧‧腫瘤相關糖蛋白72(tumor-associated glycoprotein 72)
hcc49 scFv‧‧‧腫瘤相關糖蛋白72抗原
DNS‧‧‧丹磺醯半抗原(dansyl hapten)
F2A‧‧‧弗林蛋白酶2A(furin-2A)
M‧‧‧標記(marker)
本專利或申請文件包含至少一彩色附圖。本專利或專利申請公開之含有彩色附圖之副本將透過向官方申請並支付必要的費用而取得。
參照下面的說明所附的申請專利範圍和附圖，本發明之該些及其他特徵、樣態及優點將變得更好理解，其中：圖1係具有所示之結構域之IgG抗體之示意圖；圖2A係根據本發明之一實施例之一二聚體BsAb結構之 示意圖；圖2B係根據本發明之一實施例之一單體BsAb結構之示意圖；圖2C係根據本發明之另一個實施例之一單體BsAb結構之示意圖；圖2D係根據本發明之一實施例之一“孔中球(knob in hole)”BsAb結構之示意圖；圖2E係根據本發明之一實施例，繪示該修飾後“孔中球(knob in hole)”BsAb結構具有交叉重鏈及輕鏈之一個示意圖；圖3說明根據本發明之一實施例，該使用該人類化抗mPEG BsAbs(抗mPEG BsAbs)的一步驟靶向(one-step targeting)及治療癌症之一個示意圖，；圖4係根據本發明之一個實例，繪示由融合瘤15-2b分泌的抗mPEG抗體與固定的PEG分子之結合；圖5A係根據一本發明實施例，實例1.2為人類化抗PEG(hE11)BsAbs(抗PEG(hE11)BsAbs)DNA構築之一示意圖，；圖5B係實例1.2之該人類化抗PEG(hE11)BsAbs之結構之示意圖；圖5C說明根據本發明之一實施例，實例1.2之該人類化抗PEG(hE11)BsAbs之該SDS-PAGE分析於還原或非還原條件下；圖5D說明根據本發明之一實施例，實例1.2之該人類化抗PEG(hE11)BsAbs之西方墨點法(western blot)分析； 根據本發明之一實施例，實例1.2之PEG(hE11)BsAbs對(A)黏蛋白(mucin)、(B)BSA-PEG5,000或(C)BSA；圖7說明根據本發明之一實施例，實例1.2之該人類化抗PEG(hE11)BsAbs之癌細胞的選擇性；圖8A說明根據本發明之一實施例，實例1.4之該二聚體人類化抗PEG(hE11)BsAbs(dimeric humanized抗PEG(hE11)BsAbs)於Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)細胞之癌細胞選擇性；圖8B說明根據本發明之一實施例，實例1.4之二聚體人類化抗PEG(hE11)BsAbs與該PEG化脂質體德克薩斯紅(PEGylated liposomal Texas Red)於Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)細胞中之結合活性；根據本發明之一實施例，實例1.4之PEG(hE11)BsAbs與該PEG化的量子點(Quantum Dot)(Qdot655)於Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)細胞中；圖9為根據本發明之一實施例，實例2.1之為人類化單價抗PEG(hE11)BsAbs(humanized monovalent抗PEG(hE11)BsAbs)DNA構築及單價BsAb之結構示意圖；圖10說明根據本發明之一實施例，實例2.1之該人類化單價抗PEG(hE11)BsAbs之癌細胞於Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)細胞中的選擇性； 圖11說明根據本發明之一實施例，實例2.1之人類化單價抗PEG(hE11)BsAbs與該PEG化脂質體德克薩斯紅(PEGylated liposomal Texas Red)，於Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)細胞中之結合活性；圖12說明根據本發明之一實施例，實例2.1之人類化單價抗PEG(hE11)BsAbs與該PEG化的量子點(Quantum Dot；Qdot655)於Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)細胞中之結合活性；圖13A係根據本發明之一實施例，實例2.2為人類化單價抗PEG(h6.3)BsAbsDNA構築及該BsAb之該結構之示意圖，；圖13B說明根據本發明之一實施例，實例2.2之該人類化單價抗PEG(h6.3)BsAbs於還原或非還原條件下之該SDS-PAGE分析；圖14及圖14B分別說明根據本發明之一實施例，實例2.2之該人類化單價抗PEG(h6.3)BsAbs對(A)NH 2-PEG10,000-NH 2及(B)BSA之抗原結合活性，；圖14C說明根據本發明一實施例，實例2.2之人類化單價抗PEG(h6.3)BsAbs與PEG化量子點(Qdot655)或聚乙二醇化脂質體德克薩斯紅於Raji(CD19+)或A431(EGFR+)細胞中之結合活性；圖14D和14E分別說明根據本發明之一實施例，實例2.2之該人類化單價抗PEG(h6.3)及抗CD19 BsAbs對CH3-PEG5,000-Alexa647之結合動力學； 圖15說明根據本發明之一實施例，實例2.2之該人類化單價抗PEG(h6.3)BsAbs與該PEG化的量子點(Qdot655)於A431(EGFR+)細胞中之胞吞活性之即時影像；圖16A至16C分別說明根據本發明之一實施例，透過實例2.2之該人類化單價抗PEG(h6.3)BsAbs於(A)A431細胞(EGFR+)、(B)MDA-MB-468細胞(EGFR+)及(C)Raji細胞(CD19+)細胞中Lipo/Dox之增加體外細胞毒性之折線圖；圖17根據本發明之一實施例說明，實例2.2之該人類化單價抗PEG(h6.3)BsAbs標定PEG-NIR797針對CD19+和EGFR+腫瘤之腫瘤成像增強；圖18A係根據本發明之一實施例，用於人類化抗mPEG BsAbs之DNA構築之一示意圖；圖18B說明根據本發明之一實施例，實例2.3之該人類化BsAbs在還原或非還原條件下之該SDS-PAGE分析；圖18C和18D說明根據本發明之一實施例，實例2.3之該人類化BsAbs與該所示PEG-NPs於SW480細胞(EGFR+)(圖2C)及SK-BR-3細胞(HER2+)(圖2D)之分別的結合活性，；圖19A說明根據本發明之一實施例，以實例2.3之該人類化BsAbs對於SW480細胞(EGFR+)及SW620細胞(EGFR-)(圖2C)處理之PEG-NPs之癌細胞選擇性；圖19B說明根據本發明之一實例，以實例2.3之該PEG×EGFR或PEG×HER2對於SK-BR-3細胞(HER2+)及MDA-MB-468細胞 (HER2-)處理之PEG-NPs之該癌細胞選擇性；圖20說明根據本發明之一實施例，透過實例2.3之PEG×EGFR於(A)SW480細胞(EGFR+)、(B)SW620細胞(EGFR-)、(C)SK-BR-3細胞(HER2+)及(D)MDA-MB-468細胞(HER2-)中Lipo/DOX之增加體外細胞毒性；圖21係根據本發明之一實施例，實例2.3之PEG×EGFR靶向Lipo/IR780之活體成像；及圖22A和22B說明根據本發明之一實施例，EGFR+及EGFR-腫瘤以PEG×EGFR靶向Lipo/Dox處理之各別大小尺寸；及圖22C係一折線圖，說明在圖22A和22B中該試驗動物之體重變化；圖23A係根據本發明之一實施例，為人類化抗mPEG(h15-2b)抗CD19 BsAb及mPEG(h15-2b)抗CD02 BsAb之DNA構築之示意圖；圖23B說明根據本發明之一實施例，實例2.4之該BsAbs於Raji細胞中之癌細胞選擇性；圖23C說明根據本發明之一實施例，實例2.4之該BsAbs之該mPEG結合活性，；圖23D說明根據本發明之一實施例，實例2.4之該BsAbs之該雙結合活性，；圖24A係根據本發明之一實施例，為實例3.1之人類化孔中球(knob in hole)抗PEG(h15-2b)BsAbs之DNA構築及該BsAbs之該結構 之示意圖；圖24B係根據本發明之一實施例，為實例3.1之人類化孔中球(knob in hole)抗PEG(h6.3)BsAbs之DNA構築及BsAbs之該結構之示意圖；圖23C說明根據本發明之一實施例，實例3.1之該人類化孔中球(knob in hole)抗PEG(h15-2b或h6.3)BsAbs於非還原條件下之該SDS-PAGE分析；圖25說明根據本發明之一實施例，實例3.1之該人類化孔中球抗PEG(h15-2b)BsAbs於Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)細胞之該癌細胞的選擇性，；圖26說明根據本發明之一實施例，實例3.1之該人類化孔中球抗PEG(h15-2b)BsAbs與該PEG化的量子點(Qdot655)於Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)細胞之該雙結合活性，；圖27說明根據本發明之一實施例，實例3.1之該人類化孔中球抗PEG(h6.3)BsAbs於Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)細胞之該癌細胞的選擇性；圖28說明根據本發明之一實施例，實例3.1之該人類化孔中球抗PEG(h15-2b或h6.3)BsAbs與該PEG化的量子點(Qdot655)於Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)細胞之該雙結合活性；圖29係根據本發明之一實施例，為實例4.1之BsAbs之DNA構築的一示意圖； 圖30說明根據本發明之一實施例，透過實例4.1之BsAbs於(A)SKBR3細胞(HER2+)及(B)A431細胞(EGFR+)中之Lipo/DOX之增加體外細胞毒性；及圖31說明根據本發明之一實施例，透過實例4.1之BsAbs於(A)SKBR3細胞(HER2+)及(B)A431細胞(EGFR+)中之Lipo/DOX之協同抗癌效果；及圖32說明根據本發明之一實施例，透過實例4.1之BsAbs於(A)SKBR3細胞(HER2+)中之Lipo/DOX之協同抗癌效果。
下文提供的詳細描述與附圖連結旨在作為對本實例的描述並非代表其中本實例可被構造或利用的唯一形式。本說明書闡述該實例之功能及用於建構和操作本實例的步驟之順序。然而，相同或等價的功能與順序可由不同的實例來實現。
I. 定義
術語「抗體」係用於最廣義並明確涵蓋單株抗體、多株抗體、多專一性抗體(例如，雙功能抗體，bi-specific antibodies)以及具有足夠長度以表現所需生物活性之抗體片段，即，與抗原專一性結合，當其在蛋白質及/或其它分子之複雜混合物中優先辨識其目標抗原。
如本文所用的術語“單株抗體”指一抗體自一本質上同源均質之抗體群獲得的抗體，並且不須通過任何特定方法產生所需抗體產品。相反的多株抗體通常包括針對不同抗原決定位(epitope)的不同抗 體，每一單株抗體針對抗原上的單一決定位置(即抗原決定位)。本發明的該單株抗體可以通過融合瘤細胞方法(hybridoma method)或通過重組DNA方法來製備。該單株抗體於本文中特別包括“嵌合”或“重組”抗體，其中重鏈及/或輕鏈的一部分相同於或同源對應於自一特定物種或屬一抗體種類或亞種的抗體的序列，然而，該鏈的其餘部分則相同或同源到相應的序列中自另一物種的抗體或屬於另一抗體類別或亞類，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性。
非人(例如，鼠類)抗體之“人類化(Humanized)”形式係嵌合抗體(chimeric antibodies)其含有衍生自非人免疫球蛋白(non-human immunoglobulin)之最少序列。人類化抗體係人類免疫求蛋白其高度變異區殘基(hypervariable region residues)被非人物種，例如，小鼠、大鼠、兔子或非人靈長類其具有期望之專一性或親和性之高度變異區殘基所取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區(framework region，FR)殘基被相應的非人殘基所取代。在一般情況下，該人類化抗體將包含基本上所有的至少一個，通常兩個可變域，其中所有或基本上所有的FR區是人免疫球蛋白的序列。該人類化抗體可視情況包含一免疫球蛋白恆定區(constant region，Fc)的至少一個部分，通常是一人類免疫球蛋白。
一"分離的"抗體(isolated antibody)係一已經被鑑定並分離及/或其自然環境的一組成中回收。其自然環境的容納性(Containment components of its nature environment)係成份(materials)其會幹擾本發明的抗體的治療用途，並且可以包括酶，激素，和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。分離的抗體包括重組細胞內的抗體原位(in situ)。通常，分 離的抗體透過至少一個純化步驟來製備。
術語“雙功能抗體bi-specific antibody(bi-specific antibody，BsAb)”係指一抗體具有至少兩種不同抗原專一性。例如，BsAb可能具有一臂(arm)其具有一個特異性抗原位點(antigenic site)，如腫瘤相關抗原，而另一臂識別不同的標的(target)，例如，一半抗原(hapten)其與一致死劑(lethal agent)結合(例如，IFN-α或一含有抗癌劑如長春花生物鹼(vinca alkaloid)的脂質體(liposome))，或一成像劑(例如，含有造影劑或者量子點或螢光染料的微泡)。在較佳實施例中，本發明之BsAb具有兩個抗原結合位，其中一個是針對腫瘤抗原(例如，TAG72，CD19，EGFR或HER2)，而另一個是針對一個親水性聚合物(例如，聚乙二醇(polyethylene oxide，PEG))，即是結合到含於其中的癌症治療劑的奈米粒子(例如，Lipo/DOX)。
如本文所用的術語“價(valent)”係指在一抗體分子中結合位點存在的指定數目。因此，術語“一價(monovalent)”、“二價(divalent)”、“三價(trivalent)”和”四價(tetravalent)”係指在抗體分子分別具有1、2、3和4個結合位點的存在。本發明之BsAb係至少“二價”，並且可以是多價的，例如四價。
術語“連接子(linker)”和“胜肽連接子(peptide linker)”在本發明所公開中可互換地使用並且係指一種胜肽具有天然或合成的胺基酸殘基用於連接兩個多肽(polypeptides)。例如，該胜肽連接子可以用於連接VH和VL結構，以形成單鏈可變片段(例如，scFv)；或將該scFv連接於全長抗體，以形成本發明之一個BsAb。較佳地，該連接係一具有至 少5個胺基酸殘基長度胜肽，例如5至100個胺基酸殘基的長度的，更佳地，10至30個胺基酸殘基的長度。該連接於scFv是一至少5個胺基酸殘基長度之胜肽，較佳地為15至20個胺基酸殘基的長度的胜肽。在一個實施例中，所述連接包含(GnS)m的的序列，其中G=甘氨酸(glycine)，S=絲氨酸(serine)，n係數字1到4之間，和m為1，2或3。較佳地，該連接子包含一(G4S)3的序列；或(G3S)及(G3S2)的一序列。
如本發明所用的術語“聚乙二醇化物質(或PEG化物質，PEGylated substance)”係指一塗覆有聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)的物質，其包括但不限於，一蛋白質(例如，趨化介素(chemokine))、一胜肽(例如，柳菩林(leuprolide))和一奈米粒子(nanoparticle，NP)含於其中的一種治療劑或一種顯影劑。在本領域技術已知用於產生奈米粒子之材料包括中孔洞氧化矽(mesoporous silica)，以及具有一疏水部分及一親水部分之材料其可形成一微胞結構(micelle structure)能夠包括一種治療劑(例如，抗癌劑)或一種成像劑(例如，螢光染料(fluorescence dye)、量子點(quantum dot)、螯合的放射性同位素(chelated radioisotope)，順磁性鐵(paramagnetic iron)，金奈米粒子(gold nanoparticle)或造影劑(contrast agent))在其結構中。本發明用於形成奈米粒子之合適材料包括，但不限於，中孔洞氧化矽；磷脂質(phospholipids)如卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol，PG)、磷脂酸(phosphatidic acid PA)、磷脂酸肌醇(phosphatidylinositol，PI)、鞘磷脂(sphingomyelin，SPM)和類似物，單獨或組合；生物可降解聚合物如 聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)，聚己內酯(polycaprolactone，PCL)，聚二惡烷酮(polydioxanone，PDO)，聚酐(polyanhydrides)，聚原酸酯(polyorthoesters)，甲殼素(chitosan)等，單獨使用或以組合。較佳地，所述PEG化物質，例如聚乙二醇化的奈米粒子，進一步含有一種癌症治療劑或一種顯影劑於微胞結構中。
在本發明中，術語“癌症(cancer)”和“腫瘤(tumor)”係可替換使用，並且較佳地，係指哺乳動物於生理環境中，特別是在人類中特徵為不受控制的細胞生長。在此方面的癌症包括轉移癌(metastases cancers)及/或抗藥性的癌症(drug-resistant cancers)。癌症，較佳地表現出增加TAG72，EGFR，HER2，CD19，和CD20的表現量。因此，藉由本發明可治療之癌症或腫瘤為乳腺癌、肺癌、結腸癌、結腸、脾、腎、肝、膀胱、頭和頸、卵巢、前列腺、腦、胰、皮膚、骨、血液、胸腺、子宮、睾丸癌、宮頸癌和神經元。更具體地，所述癌症係選自乳腺癌，結腸直腸癌，頭頸部癌，結腸癌，肝癌，非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)，淋巴瘤，胰腺癌，肺癌，胃癌，前列腺癌，腦腫瘤出，視網膜母細胞瘤，卵巢癌，子宮頸癌，造血系統惡性腫瘤，食管癌，腎細胞癌，鱗狀細胞癌，神經膠質瘤，和白血病的群組中。
如本發明所用之術語“治療劑(therapeutic agent)”係指一種藥劑用於治療、對抗、改善、預防或改進疾病或狀況，如患者體內之癌症。因此，用於治療癌症之治療劑較佳地係指細胞抑制劑(cytotoxic agent)，其係周知可增進癌症治療的治療效果；相應地，細胞抑制劑使用於 本發明包括，但不限於此，放射，化學治療劑，抗體及類似物。
如本文所用的術語“抗藥性癌症(drug-resistant cancer)”係指癌症的生長沒有被運用已知細胞抑制劑，其可為一種化療劑、一種抗體、一種胜肽或一種其組合所抑制或阻滯。在一些實施例中，該藥物係化療劑。化療劑的實例包括烷化劑(alkylating agent)，例如亞硝基尿素(nitrosoureas)、順鉑(cisplatin)或達卡巴仁(dacarbazine)；抗代謝物(antimetabolites)如葉酸(folic acid)，嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)拮抗劑(antagonists)；有絲分裂抑製劑(mitotic inhibitor)如長春花生物鹼(vinca alkaloid)；細胞毒性抗生素(cytotoxic antibiotics)和喜樹鹼衍生物(camptothecin derivatives)。較佳之化療劑包括阿德力黴素(adriamycin)、阿米福汀(amifostine)、博來黴素(bleomycin)、硫酸布他卡因(busulfan)、順鉑(cisplatin)及/或其它鉑化合物，較佳地包括，卡鉑定(carboplatin)及/或奧沙利鉑(oxaliplatin)、喜樹鹼(camptothecin)、CPT-11、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、環磷醯胺((cyclophosphamide)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、達卡巴仁(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、依妥普賽(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，氟尿苷(floxuridine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基尿素(hydroxyurea)、依弗醯胺(ifosfamide)、艾達魯比辛(idarubicin)、干擾素β(interferon beta)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、L-天門冬醯胺酶(L-asparaginase)、L-天門冬胺酸(L-aspartic acid)、環己亞硝脲(lomustine)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)絲裂黴素 (mitomycin)、胺甲喋呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、美皆斯妥(megestrol)、黴法蘭(melphalan)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、米托坦(mitotane)、紫杉醇(paclitaxel，taxol)，普卡黴素(plicamycin)、噴司他丁(pentostatin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、托泊替康(topotecan)、他莫昔芬(tamoxifen)、坦尼坡賽(teniposide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)或其的組合。在其他實施例中，該藥物係一種趨化介素(例如，CC趨化介素、CXC趨化介素、C趨化介素和CX3C趨化介素)或一種細胞生長激素(例如，幹擾素(interferon)，白介素(interleukin)，淋巴因子(lymphokine)，和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor))。在進一步的實施例中，該藥物係一種胜肽，較佳地一種對於癌細胞具有細胞毒性作用的胜肽。優選地，抗癌胜肽係選自柳菩林(leuprolide)、諾雷德(goserelin)、善得定(octreotide)、組氨瑞林(histrelin)、阿巴瑞克(abarelix)、欣得泰(cetrorelix)、地加瑞克(degarelix)、西侖吉肽(cilengtide)、ATN-161、及IM862之群組。
本文所用的術語“治療有效量(therapeutically effective amount)”係指一有效的量，在劑量和必需的時間週期，以獲得對於癌症包括轉移及抗藥癌症期望的治療要求。
該詞組“藥學上可接受的(pharmaceutically acceptable)”係指分子整體及組合物是“通常認為是安全的”，例如，當給予於人，是生理上可耐受的並且通常不會產生過敏或類似的不良反應，例如胃不適，頭暈等。較佳地，如本文所用的術語“藥學上可接受的”指由聯邦管理機構或州政府或在美國藥典或其它一般公認的藥典所核准可用於動物， 並且更定而言是人。
術語“給予(administered)”、“給藥(administering)”或“施用(administration)”在本文可互換，其係指直接施用一人類化雙功能抗體或一本發明之組合物
術語“個體(subject)”或“患者(patient)”係指動物，包括人類其可以本發明之組合物及/或方法治療。術語“個體”或“患者”指男性和女性兩者，除非一種性別被特別指出。因此，術語“個體”或“患者”包括可以從治療癌症中獲益的任何哺乳動物。一“個體”或“患者”的例子包括，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥和家禽。在示範性實施例中，該患者是人。
如本文所用的術語“相同的(identical)”或“百分比同一性(percent identity)”係指兩個或兩個以上序列或子序列，比較及最大對應排比時具相同或特定的胺基酸殘基比例是相同的。為確定百分比同一性，該序列排成一列進行比對為達最佳比較目的(例如，在第一胺基酸序列中間隙可以被引入以達與第二胺基酸序列的比對最佳排比)。該胺基酸殘基對應的胺基酸位置進行比較。當在該第一序列中的一個位置被相同的胺基酸殘基與第二序列中相應位置佔據時，則該分子在該位置是相同的。兩個序列之間的該同一性百分比是序列共有的相同位置的數目的函數(即，%同一性=相同位置/位置的總數(例如，重疊位置)×100)。在某些實施例中，兩個序列長度相同。
單數形式“一”、“和”及“該”在本文中用於包括複數對象，除非上下文另有明確說明。
II. 本發明之描述
因此，本發明的第一個方面係提供雙功能抗體(BsAbs)其將一個非標靶PEG化物質轉化為腫瘤標靶PEG化物質，從而抑制癌細胞的生長或阻止侵入的或轉移癌症，包括藥物抗藥性癌症。
本發明雙功能抗體(BsAbs)之結構
抗體屬於免疫球蛋白類蛋白質其包含IgG、IgA、IgE、IgM及IgD。在血清中發現最豐富之免疫球蛋白係IgG，其結構示意圖示於圖1。該IgG的結構有四條鏈，兩條輕鏈和兩條重鏈；每個輕鏈具有兩個結構域(domain)而每個重鏈具有四個結構域。抗原結合位位於該片段抗原結合(fragment antigen binding，Fab)區域，包含可變輕鏈(variable light，VL)和可變重鏈(variable heavy，VH)鏈結構域，以及一個恆定輕鏈(constant light，CL)和恆定重鏈(constant heavy，CH1)結構域。該重鏈之CH2和CH3結構域稱為可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)區域。一個全長抗體重鏈係一多肽，包括，從N末端至C末端，一VH、一CH1、一鉸鏈區(hinge region，HR)、一CH2及一CH 3；縮寫為VH-CH1-HR-CH 2 CH 3。一全長抗體輕鏈係一多肽，一VL及一CL組成，由在N端至C端方向，簡寫為VL-CL，其中CL可以是κ(kappa)或λ(lambda)。該IgG抗體被認為是一異四聯體(heterotetramer)具有兩條重鏈透過雙硫鍵(disulfide bonds，-S-S-)結合在一起，在CL結構域和CH1結構域之間和兩個重鏈的鉸鏈區之間。
如上所述的“定義”部分中，該BsAbs係指抗體具有至少兩種不同抗原之專一性；因此，本發明的BsAbs是重組抗體加工以包含能夠結合不同抗原的序列。因此，各種重組雙功能抗體形式已經開發於本發 明中，並且這些BsAbs的概略結構示意圖示於圖2A至2E。
在一些實施例中，本發明之BsAb是一個二聚體，四價雙功能抗體，其中定向到第一抗原之全長IgG的該二重鏈分別經由胜肽連接子被融合到定向到第二抗原之單鏈可變片段(例如，scFv)(圖2A)。該scFv中，較佳地一個雙硫鍵穩定的scFv，由一個抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)，和一個連接子；縮寫為VH-接頭VL。
選擇性地，本發明的BsAb可以是單體的，二價雙功能抗體，其中VH-CH1結構域和引導到第一抗原的輕鏈VL-CL結構域通過胜肽連接子融合於雙硫鍵穩定單鏈結構域定向到第二抗原(圖2B)。
在一些實施例中，本發明之該BsAb係一單體、二價雙功能抗體，其中一雙硫穩定單鏈結構域引導該第一抗原透過胜肽連接子連接一單體體抗體引導至一第二抗原。
在其他實施例中，本發明之BsAb具有“孔中球(knobinto hole)”結構，其中在該第一重鏈的CH3結構域球係透過選擇性的胺基酸取代幾個胺基酸創造，並且在第二重鏈的CH3結構域的位置並列該位置之一孔由合適的胺基酸取代所創建。此外，半胱氨酸殘基(cysteine residues)被引入，以形成重鏈之間的雙硫鍵連接。一”孔中球”BsAb結構示意圖示如圖2D描繪。
在進一步的實施例中，如在圖2D中所描繪的該“孔中球”BsAb進一步修飾，其中一個單體抗體重鏈於轉錄期間交叉其輕鏈，並由此產生一經修飾的抗體的重鏈雜多肽(hetero-polypeptide)，一VH、一CL一鉸鏈區(hinge region，HR)、一CH2及一球-CH 3(knob-CH3)，由在 N-端至C-端的方向組成；縮寫為VH-CL-HR-CH 2-球-CH 3；和一修飾的抗體輕鏈的雜多肽，一VL及一CH1，由在N-端至C-端的方向組成；縮寫為VL-CH1。圖2E係本修飾之“孔中球”BsAb結構之示意圖，其中一個單體抗體重鏈間交叉其輕鏈，而其它單體抗體結構保持不變。
2. 抗體製備
用於製備本發明的BsAbs之方法在實例中描述。為了製備人類化雙功能抗體，一種非人(例如鼠)抗體的製備和用作起始材料；相關技術在以下部分將簡要描述。
2.1 鼠類抗mPEG抗體的生產
為產生所需的單株抗體(monoclonal antibodies)，動物如小鼠、大鼠或兔子與mPEG衍生蛋白(mPEG-derivatized proteins)分子(即該PEG分子具有末端甲氧基)或PEG衍生蛋白分子(即該PEG分子具有末端羥基)在適當劑量產生免疫反應。當該動物與mPEG-或PEG衍生蛋白質產生免疫反應時，通常，佐劑(adjuvan)與mPEG-或PEG衍生蛋白質溶液是混合在一起。佐劑用於本發明之實例中包括弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)，和氫氧化鋁佐劑。免疫反應通常進行主要透過靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射抗原。免疫間隔沒有特別的限制。免疫反應可以進行在數天至數週的間隔，較佳地為2至3週，1至10次，較佳地為2至5次。當血清樣品中的抗體力價(titers)於1000倍稀釋後達2或更多之吸光度作為免疫反應之結果，將動物放置約1個月。
然後，至少再進行一次再免疫反應。在最後一次免疫後 數日，較佳地為3至5天，脾細胞(splenic cells)和區域淋巴結(regional lymph nodes)被除去。在免疫反應之後，血液樣本被以常規方式取出並離心分離血清。所得的血清接著藉由任何適合的方法，包括但不限於，酵素免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酵素免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)或放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)測定抗體力價(antibody titers)。在一較佳實例中，抗體力價利用ELISA測定。接著，最終免疫反應使那些動物對於mPEG-或PEG-衍生蛋白質同型異構物具有高抗體力價。
抗體產生細胞從該免疫動物的脾細胞和區域淋巴結或類似的細胞或位置製備。在抗體產生細胞的製備過程中，盡可能以除去組織碎片和紅血球。市售紅血球去除劑可以被用於此目的。或以氯化銨(ammonium chloride)緩衝液及Tris可以製備和使用來替代。可替代地，緩衝氯化銨和的Tris可以製備和使用。
如此製備的產生抗體細胞，應立即融合不朽細胞(immortal cells)如骨髓瘤細胞(myeloma cells)，以產生融合瘤細胞(hybridoma cells)，其中半永遠繼續增生而產生抗體。通常可獲得細胞株(Commonly available cell strains)被使用來自一動物，例如鼠。在本發明中，一較佳細胞株被使用為高效融合、提供並要用於本發明的優選的細胞株應是那些高效融合，支持穩定高水準產生抗體，並且對HAT選擇培養基敏感，其含有六羥基嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶核苷(thymidine)和胺基喋呤(aminopterin)及當與抗體產生細胞融合生存所需。骨髓瘤細胞的種類包括，但不限於，小鼠骨髓瘤細胞株(mouse myeloma cell line；如骨 髓瘤FO細胞(myeloma FO cells))和人骨髓瘤細胞株(human myeloma cell line如卡帕斯希707H(Karpas 707H))。
細胞融合是透過將脾細胞或淋巴結細胞與市售的骨髓瘤細胞在細胞融合促進劑(cell-fusion promoter)的存在下混合，例如PEG約200至20,000道爾頓(daltons)或類似具有的平均分子量進行。可替代地，細胞融合可以在市售的細胞融合裝置來進行利用電刺激如電-融合(electro-fusion)。融合後，得到的細胞接著稀釋並在HAT培養基中培養的。
所需要的融合瘤自已融合細胞中被選出。該融合細胞在HAT培養基中存活下的細胞將形成群落(colony)。將每一培養皿中之上清液收集並檢驗是否存在對於mPEG-或PEG衍生蛋白質之抗體力價。ELISA、EIA或RIA作為確認之方法，其中CH3-PEG750-NH2或NH2-PEG3000-NH2塗覆(coated)於該盤上並用作篩選標準。一旦抗體陽性盤孔被識別，該細胞培養於一不含胺基喋呤之HT培養基。在培養一段時間之後，在培養上清液中之抗體力價再次確認。該最後被選擇之細胞接著被選殖(cloning)取得一單細胞表現出高度對mPEG-或PEG衍生的蛋白質專一性的殖株(Clones)被選擇，並且被增殖到一定程度來建立融合瘤。
根據本發明一較佳實施例，3個融合瘤，E11、15-2b及6-3被選定。該15-2B融合瘤產生之一抗mPEG單株抗體，其專一性結合到，而不是PEG的主鏈。相較之下，該E11和6-3之融合瘤，其產生抗PEG主鏈之單株抗體而不是PEG之末端甲氧基或羥基基團。
在一些實施例中，該抗mPEG單株抗體被選擇跳過該抗PEG主鏈之單株抗體，由於當抗體與聚乙二醇化的奈米顆粒接合時空間均勻 性呈現。在其他實施例中，抗PEG主鏈之單株抗體被選定為抗mPEG單株抗體。
該因此產生之抗mPEG或抗PEG單株抗體可被任何已知方法被分離或製備。例如，抗體可以從培養在低血清濃度的培養基中之融合瘤之培養上清液中製備。可替換地，融合瘤細胞可以被注入動物的腹腔和所得腹水(abdominal dropsies)被收集以製備抗體。抗體可以採用親合柱(affinity column)，凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)，離子交換層析(ion exchange chromatography)或諸如此類的方法進行純化或分離。任何這些已知的方法可適當地選擇或組合使用。
可替代地，抗mPEG或抗PEG單株抗體可經由DNA選殖(DNA cloning)產生。抗mPEG或抗PEG mAbs DNA編碼(DNA encoding)可經由使用常規方法例如使用能夠專一性結合單株抗體之重鏈和輕鏈基因編碼之寡核苷酸探針(oligonucleotide probes)輕易地分離和定序。該融合瘤細胞(例如，E11、6-3或15-2B融合瘤)作為此類DNA的較佳來源。當該DNA被分離將其置於表達載體(vectors)中，接著將其轉染到宿主細胞如大腸桿菌(Escherichia coli，E.Coli)，猿猴COS細胞(simian COS)或中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞或骨髓瘤細胞，其在重組宿主細胞中不產生免疫球蛋白以合成期望之單株抗體。
該單株抗體因此產生且該抗體DNA編碼可被用於生產嵌合抗體(chimeric antibody)(例如，雙功能抗體)，人類化抗體及/或抗體片段衍生物。
2.2 人類化抗mPEG(15-2)或抗PEG(E11或6.3)抗 體之生產
一非人來源單株抗體之該主要問題是其免疫原性(immunogenicity)對於該接受者(recipient)在某些情況下，造成的危險的過敏反應。大多數單株抗體是以鼠類為來源，並已發現當注射到人體具免疫原性。為降低本發明的抗mPEG或抗PEG單株抗體之免疫原性，人類化抗體製備藉由連接不同鼠類抗mPEG或抗PEG之該重鏈及輕鏈之結構域於人抗體的恆定區產生。
為製作人類化抗mPEG或抗PEG抗體，該抗體之DNA編碼被分離及定序根據上文第2.1節描述的方法，並接著用於製作人類化構築體(constructs)。詳細的製造方法示於實例中。
根據本發明一較佳實施例，互補決定區(complementary determining region，CDR)嫁接被應用，其中CDR區在一個人抗體的VH和VL基因被替換為相應的CDR編碼片段(如在那些對應抗mPEG或抗PEG抗體片段其胺基酸片段編碼之DNA片段)。因此所得到的抗體具有可變區，其中只有所述CDRs是從原來的小鼠抗體，而在VH和VL基因的構架區以及恆定區基因(即，C κ或CH1-H-CH 2-CH 3)係人IgG。
在較佳的實施例中，人類化抗mPEG或抗PEG抗體包含一重鏈可變結構域和一輕鏈可變結構域。一旦產生，該人類化抗mPEG或抗PEG抗體可根據本領域的標準程式進行純化，包括交叉流過濾(cross-flow filtration)，親和柱層析，凝膠過濾等進行純化。應當理解的是，該人類化抗體應當在相同或基本相似的鼠類抗mPEG的方式來執行。較佳地，人類化抗mPEG或抗PEG ABS(無論是在Fab或全長IgG的形式)運用於人體個體應 比鼠類版本更具優勢。在一些實施例中，人類化抗mPEG被運用於本發明之雙功能抗體產生。在其他實施例中，人類化抗PEG抗體被用於本發明之雙功能抗體生產。
2.3 雙功能單株抗體(bi-specific monoclonal antibodies，BsAbs)之產生
為產生BsAbs，描述於前述於2.2節中之該人類化抗mPEG或抗PEG As(無論是在Fab或全長IgG的形式)進一步與抗體或scFv其與腫瘤抗原結合，以便賦予癌症靶向效果。詳細的製造方法示於實例中。
在一般情況下，該上述人類化抗mPEG或抗PEG抗體之DNA序列包括人類化抗mPEG或抗PEG序列的重和輕鏈的DNA序列片段與所需抗體或scFv其利用一連接子(linker)結合於一腫瘤抗原，接著將嵌合序列轉殖至一表現載體用於轉染一宿主細胞，並根據在上述2.2節相似的步驟隨後純化。該製成的BsAbs接著可用於治療癌症或追蹤癌症的發展與成像系統的輔助。
因此，人類化的單體和二聚體抗體產生，其對PEG化分子及腫瘤抗原具有雙功能，其包括但不限於TAG72、EGFR、HER2、CD19、和CD20。
在一些實施例中，單體BsAbs包括PEG×EGFR(抗PEG抗EGFR)、PEG×TAG72(抗PEG抗TAG72)和PEG×HER2(抗PEG抗HER2)與衍生自hE11 Fab片段之抗PEG部份被產生。在另一個實施例中，單體h6.3Fab×EGFR(抗PEG抗EGFR)和h6.3Fab×CD19(抗PEG抗CD19)的生產，其中h6.3 Fab代替hE11Fab，被與scFv融合對應EGFR或CD19。在進 一步的實施例中，單體h15-2b Fab×EGFR scFv(抗PEG抗EGFR)，h15-2b Fab×HER2 scFv(抗PEG抗HER2)之產生，其中h15-2b Fab與scFv融合對應EGFR或HER2。在更進一步的實施例中，單體h15-2b scFv×CD19 Fab(抗PEG抗CD19)和h15-2b scFv×CD20 Fab(抗PEG抗CD20)的生產，其中h15-2b scFv與Fab融合針對CD19或CD20。
在其他實施例中，二聚BsAbs包括PEG2×EGFR(抗PEG抗EGFR)、PEG2×TAG72(抗PEG抗TAG72)及PEG2×HER2(抗PEG抗HER2)的產生。不同於該單體BsAb，每個二聚體BsAb包括全長IgG，每個重鏈被連接到能結合一腫瘤抗原的該scFV(例如，TAG72、EGFR或HER2)。此外，本發明之PEG×EGFR、PEG×HER2和PEG×TAG72的單體BsAbs不同於其他二聚體形式之對應體(即，PEG2×EGFR、PEG2×HER2及PEG2×TAG72)，因為它們不具有在其各自結構的HR-CH2-CH3結構域不同。
在又一些其他實施例中，“孔中球(knob in hole)”BsAbs的製作，其中DNA序列編碼抗體重鏈，特別是該兩條重鏈的CH3結構域，被設計為引入特異性和互補的相互作用在各個CH3結構域的界面的兩條重鏈。例如，數個胺基酸被取代成另一種胺基酸在第一個重鏈CH3結構域以創建一“球(knob)”結構，並且第二重鏈CH3結構域中的數個胺基酸被改變以創建一個“孔(hole)”，如此DNA序列所表現之該抗體重鏈不太可能形成一只為該第一對或只為該第二對組合，而是該“孔中球”重鏈對的組合。該孔中球技術是本領域技術人員的均知之技術，並且可以在形成本發明的BsAbs容易地應用。此外，該“孔中球”BsAbs可進一步藉由互換該抗體重鏈和抗體輕鏈進行修飾，並由此產生一抗體重鏈雜多肽，由N末端至C 端方向為一VH、一CL、一鉸鏈區(hinge region，HR)、一CH 2及一球-CH 3；縮寫為VH-CL-HR-CH 2-球-CH 3(VH-CL-HR-CH2-knob-CH3)；和一抗體輕鏈的雜多肽，由N末端至C端方向為一VL和一CH1；縮寫為VL-CH1。
因此，在一個具體實施例中，一個“孔中球”抗mPEG，抗CD19 BsAb產生。具體地，二點突變，S354C和T366W被引入到一h15-2b(抗mPEG)重鏈之CH3區以產生一個球結構；然而，額外四的突變點，S349C、T366S、L368A及Y407V，被引入到一BU12(抗CD19)的重鏈的CH3區，以產生一個孔的結構。除了產生在各個重鏈之該球和該孔結構中，該Bu12孔重鏈可進一步修飾透過與其輕鏈互換以產生一雜重鏈多肽及一雜輕鏈多肽，如上所述修改。因此，該Y形h15-2b球/Bu12孔BsAb(Y-shape h15-2b knob/Bu12-hole BsAb)的每個臂分別識別不同的抗原，即，一PEG化分子和CD19。在一個具體的實施例中，h15-2b球/HER-2孔BsAb(h15-2b knob/HER2-hole BsAb)被提供，其中，該Y形h15-2b球/HER-2孔BsAb之該兩個臂分別識別一個PEG化的分子和HER2。
該組成和本發明之BsAbs其各自的胺基酸序列列於表1至13。
3. 藥物套組
其係本發明之第二個方面係提供一種藥物套組用於治療或成像癌症，包括轉移性及/或抗藥性的癌症。該藥物套組，包括至少兩種成分，該第一成分係本發明之該BsAbs；及該第二組分係PEG化物質，其包括一癌症治療劑(例如，長春花生物鹼(vinca alkaloid))，或一成像劑(例 如，一微泡其中含一造影劑，或者一量子點(quantum dot))於PEG化物質內。通常情況下，各成分被包含在各自單獨的容器中。較佳地，該第一和該第二成分可以分別存在於所述容器中以一乾燥固體的形式或作為在生理上可接受的水性載體中的懸浮液。該試劑套組可視情況包括生理上可接受的水性載體，如一鹽水在注射前該乾燥成份之復水(reconstitution)。該兩種成分將分別與各自的載體進行復水，然後混合以形成一個組件，其被給予於個體(例如，通過注射)。
4. 靶向及治療癌症之一步驟方法
因此，其係本發明的第三個方面係提供靶向和治療癌症的一步驟方法，包括轉移性和/或抗藥性的癌症。該方法採用在第3節中描述的藥物套組，其中所述分離之人類化抗PEG雙功能抗體(bi-specific antibody，BsAbs)，為在第2節係一PEG化物質混合以形成一組件，在被給予於個體。可替代地，在第2節中描述之該人類化BsAbs首先被注入到個體(例如，人類)，再接著是注射PEG化物質(數據未顯示)。
圖3係一示意圖，說明藉由使用本發明的藥物套組300之一步方法靶向和治療癌症。該藥物套組300包括一人類化抗PEG BsAb310(humanized抗PEG BsAb 310)和一PEG化物質320。該人類化抗PEG BsAb310由第一抗原結合位311，其選擇性地結合到PEG化物質320，其包含在其結構內之一癌症治療劑；及一第二抗原結合位312，其選擇性地結合到靶蛋白質，例如腫瘤抗原340。在本實施例中，該PEG化物質320被描繪為一脂質體(liposome)或微胞(micelle)，並且其特徵在於在具有一癌症治療劑321之該脂質體或微胞結構內和多個PEG分子322從脂質體或微胞之該表 面延伸。在結合到該聚乙二醇化的物質320中，該BsAb310之該第一抗原結合位311允許該BsAb310來定向該第二抗原結合位312從PEG化物質320的表面向外，從而將非靶向PEG化物質320轉變為以腫瘤細胞靶向PEG化物質。
實務上，為達成一步驟靶向和治療目的，該人類化抗PEG BsAb310與PEG化物質320混合，以形成一組件330，該組件330接著立即給予(例如，注射)給個體(例如，一人360如圖3中所描繪)。
因此，其係本發明的第三個方面以提供一治療癌症的方法。該方法包括的步驟中，向個體給予時，本發明之該BsAb及PEG化物質其含有癌症治療劑在其中，其具有足以抑制個體的癌症的生長或轉移的劑量。該給予個體的劑量為約0.1至50mg/該個體體重(Kg)。在某些實施例中，該劑量給予於個體約1至40mg/Kg個體體重，如10至30mg/kg個體體重。該劑量可以施予單一劑量或給予一次以上小劑量來替代。
此外，本發明亦提供一藥物組合用於製備藥物用於治療癌症之用途，其中該藥物組合包含上述該前述人類化雙功能抗體之第一量及聚乙二醇化的物質的第二量的一混合物；其中該混合物係形成一組件及該治療癌症係抑制癌症的生長或轉移；及該PEG化物質係治療性且係含一蛋白質、一胜肽、一含有化學治療藥物的奈米顆粒於其中之任一者。
本發明之該BsAb和該PEG化物質可以給予於哺乳動物，較佳地為人類，藉由任何途徑其可有效地傳輸包含在該PEG化物質中之化療藥物至適當的或期望的位點，如口服、經鼻、經肺、經皮，如被動或離子電滲遞送，或腸胃外，例如，直腸，長效製劑，皮下，靜脈內，肌內，鼻內，小腦，眼用溶液或軟膏。應當理解的是，本發明之劑量依患者而異， 不僅用於癌症治療劑選擇，給藥途徑，和該BsAb的結合一PEG化物質的能力，以引發在所希望的反應於該患者，也用於如疾病狀態或病症的嚴重程度減輕，年齡，性別，體重的病人，對作為患者狀況，和在病理條件下，正在接受治療的嚴重程度，同時使用的藥物或特殊飲食之患者，和其他因素，本領域技術人員將認識到，用適當的劑量，最終是由主治醫生決定。給藥方案可進行調整以提供改進的治療反應。治療有效量也是其中的治療有益效果勝過癌症治療劑的任何毒性或有害作用。較佳地，本發明之該BsAb及該聚乙二醇化的物質被給予在一劑量和一時間，使得症狀的數量及/或嚴重程度降低。
5. 一靶向組織成像的方法
本發明的第四方面是提供一組織成像之方法，特別是活體個體之癌組織。該方法還需要利用在第3節中描述的藥物套組，其中如在第2部分所述該分離之人類化抗PEG雙功能性抗體(BsAbs)與PEG化物質混合，在被給予於個體之前，形成一組件。
該方法包括，(a)將本發明之一第一足夠量該人類化BsAb和一第二足夠量之PEG化的量子點(PEGylated quantum dot，PEG-QD)或一含有螢光染料的PEG化脂質體，以形成一個組件；(b)注入步驟(a)之該組件到被檢體的主體之部分；及(c)螢光光成像，電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)成像，X射線成像，電腦斷層掃描(computed tomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)被檢體之主體部份。此外，本發明亦提供一種顯影劑含有前述一第一足夠量的人類化雙功能抗體及一第二足夠量PEG化成像劑之一混合物，其 中，該混合物係形成組件且該組件準備注射給個體並成像通過螢光成像，電子自旋共振(ESR)成像，X射線成像，電腦斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)被檢體之組織。該PEG-QD包含一量子點奈米晶體係選自由一CdHgTe、硒化鎘(CdSe)、硒化鎘/硫化鋅(CdSe/ZnS)、硫化鎘(CdS)、碲化鎘(CdTe)、碲化鎘/硫化鎘(CdTe/CdS)、硒化鉛(PbSe)和硫化鉛(PbS)之群組所組成。
本發明將更具體的說明，以下面的實施例，其提供了用於示範，而不是限制的目的。
實例
材料與方法
細胞與動物
乳腺癌細胞株MCF-7、人T淋巴細胞細胞株Jurkat、卵巢癌細胞株OVCAR-3、表皮樣癌細胞株A431(EGFR+)(ATCC CRL1555)中、B淋巴細胞細胞株Raji(CD19+)(ATCC CCL86)、惡性黑色素瘤細胞株A-375、293FT細胞、B淋巴母細胞株拉莫斯(Ramos)(CD19+)(ATCC CRL-1596)、SW480(EGFR+)、SW620人結腸癌細胞、人乳腺癌細胞株SKBR3(HER2+)，人乳腺癌細胞株MDA-MB-468、BALB3T3細胞中及GP2-293逆轉錄病毒包裝細胞在本發明中使用。在一般情況下，細胞培養於Dulbecco改良的Eagle培養基(Sigma,St Louis,MO,USA)，其補充含有10%胎牛血清(fetal calf serum；HyClone,Logan,UT)，100U/mL青黴素(penicillin)和100μg/mL鏈黴素(streptomycin)，在37℃下含5%CO2。A431、Raji和Ramos細胞生長在含有相同補充劑之RPMI-1640，但有10%牛血清(bovine serum) 的來源。
雌性BALB/c裸小鼠(6-8週齡)從國家實驗動物中心，台北，台灣取得。所有的動物實驗均根據機構準則進行，並經IBMS之實驗動物設施和病理核心委員會，中央研究院同意。
產生鼠類抗PEG抗體(antibodies，Abs)
融合瘤細胞分泌抗PEG抗體係通過免疫雌性BALB/c小鼠的mPEG衍生的蛋白質或PEG衍生的蛋白質如前所述生成(Su et al.,Bioconjugate Chemistry(2010)21(7),1264-1270.)。該融合瘤接著利用ELISA篩選。具體地，96孔盤係用1μg/孔(well)CH3-PEG750-NH2、NH2-PEG3000-NH 2(Sigma-Aldrich)，或5μL/well CH3-PEG5000-NH 2在0.1M的NaHCO3/Na2CO3，於37℃下塗覆3小時，接著，利用200μL/well稀釋緩衝液(2%脫脂牛奶於PBS中)，4℃過夜進行阻斷(blocked)。含抗體之梯度濃度之50μL 2%脫脂牛奶加入到盤中在室溫下1小時。該盤以PBS-T(PBS含有0.05%妥文-20(Tween-20))洗3次並以PBS洗2次。山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)共軛山羊抗小鼠IgM μ鏈(HRP-conjugated goat anti-mouse IgM μ chain)(2μg/mL)或HRP共軛驢抗小鼠IgG Fc(HRP-conjugated donkey antimouse IgG Fc)(2μg/mL)稀釋緩衝液被加入反應1小時。該盤洗滌並且過氧化物酶活性透過加入100μL/well TMB受質溶液(BioLegend,San Diego,CA)室溫中反應30分鐘進行測量。加入終止緩衝液(2N H 2 SO 4，50μL/well)後，該吸光度(405nm)後讀取。選擇之融合瘤被以3次極限稀釋(limiting dilution)於含有胸腺飼養細胞(thymocyte feeder cells)之HT培養基(Sigma-Aldrich)，含15%胎牛血清(Hyclone)96 孔盤被選殖，並且3株融合瘤細胞，E11、6-3及15-2b被生產，其中E11和6-3分泌抗PEG主鏈抗體，而15-2b分泌抗mPEG抗體。
對於PEG2×EGFR、PEG2×TAG72、PEG2×HER2、h6.3Fab×EGFR及h6.3Fab×CD19 DNA質體之構築
為了產生該抗PEG Fab或IgG基礎之BsAbs，該抗PEG抗體之該小鼠VL和VH結構域被分別從E11、6-3及15-2B融合瘤細胞所製備之cDNA選殖。該抗PEG(hE11,h6-3)和抗mPEG(h15-2b)抗體之該人類化VL和VH結構域透過E11、h6-3和15-25之該輕鏈和重鏈可變區域之該DNA序列編譯互補決定區域(complementarity-determining regions，CDRs)嫁接進入人類IgG VL and VH基因之構架區，接著與該剩餘人IgG1恆定區基因的DNA序列進行融合。
該Cκ、CH1及部分CH1-鉸鏈-CH2-CH3(Fc)、人類IgG1恆定結構域係從萃取自人PBMC cDNA利用表14中之引子所選殖。
該人類化可變結構域(VL或VH)及人抗體恆定結構域(Cκ、CH1或鉸鏈-CH2-CH3(Hinge-CH2-CH3))透過重疊PCR接合。為了這個目的，所有該人類化的VL片段使用表15中之引子透過PCR擴增以引入部分Cκ片段於C端。
該VL-部分Cκ(VL-partial Cκ)及Cκ片段藉由重疊PCR進行再次接合，利用反向引子如上表14及表15所示之VL結構域之該正向引子及該Cκ以產生VL-Cκ片段。
同樣地，所有之該人類化VH片段透過PCR增幅以表16所示之引子，於C端引入部分CH1片段。
該VH-部分CH1(VH-partial CH1)、CH1和Fc片段透過重疊PCR接合，使用表14及表16所指之該VH結構域之該正向引子及該CH1及Fc反向引子，產生VH-CH1或VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)片段。
該hBU12 dsFv之DNA片段利用組合PCR(assembly PCR)以hBU12之VH及VL序列為基礎被合成，如美國專利號7,968,687 B2所述，該全部內容在此引入作為參考。PCR反應如下進行：95℃，3分鐘；10個循環的95℃ 30秒，63至53℃遞減每1分鐘(每個循環減少1℃)，72℃ 1分鐘；25個循環的95℃ 30秒，53℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘；72℃下進行10分鐘。該VH和VL片段連接並使用表17中所述P1和P22引子擴增。該11F8 dsFv之 DNA片段利用組合PCR(assembly PCR)以11F8之VH及VL序列為基礎被合成，如歐洲專利號EP233299O A1所述，該全部內容在此引入作為參考。PCR如上所述被執行。該VH和VL片段分別以P23到P34引子及P35到P44引子如表18所述，使用組合PCR組裝產生。該hCC49 scFv及DNS scFv之DNA片段，利用過去研究(K C Chen et al.,Bioconjugate Chemistry 22：938-948,2011)所教示之該引子進行PCR增幅。C6ML3-9 dsFv質體之該產物於歐洲專利號EP2258726A1中所描述。接下使用表19所列引子利用PCR以產生成SalI-連接子-MfeI-hBU12 scdsFv-MluI-6×His-ClaI(SalI-linker-MfeI-hBU12 scdsFv-Mlul-6×His-ClaI)；而MfeI-連接子-11F8 dsFv-MluI(MfeI-linker-11F8 dsFv-MluI)、MfeI-連接子-DNS dsFv-Mlu I(MfeI-linker-DNS dsFv-MluI)及MfeI-連接子-hCC49 dsFv-MluI(MfeI-linker-hCC49 dsFv-MluI)利用表20所述之引子透過PCR生成。
表20 用於MfeI-linker-11F8 dsFv-MluI,MfeI-linker-DNS
該pLNCX-SfiI-mAGP3 VL-Cκ-Xho I-F2A-Bgl II-mAGP3 VH-CH1-SalI-eB7-ClaI質體作為模板用於進一步之次選殖(sub-cloning)。該SfiI-VL-Cκ-XhoI或BglII-VH-CH1-SalI或BglII-VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-SalI(BglII-VH-CH1-hinge-CH2-CH3-SalI)片段被次選殖進入該敘述於上透過適當限制脢切割之模板DNA質體，以產生之pLNCX-SfiI-抗PEG VL-Cκ-XhoI-F2A-BglII-抗PEG VH-CH1-SalI-eB7-ClaI或pLNCX-SfiI-抗PEG VL-Cκ-XhoI-F2A-BglII-抗PEG VH-CH1-絞鏈-CH2-CH3-SalI-eB7-ClaI質體。此外，該單鏈可變片段(scFv或scdsFv)次選殖進入這些質體，利用 SalI和Cla I或隨後之MfeI和Cla I酶消化。
15-2B球/Bu12孔(15-2b knob/Bu12 hole)、15-2b球/抗HER2孔(15-2bknob/抗HER2 hole)、h6.3.球/Bu12孔(h6.3 knob/Bu12 hole)及h6.3球/抗HER2孔(h6.3 knob/抗HER2 hole)之DNA質體構築
為了構築該孔中球BsAbs(knob into hole BsAbs)、h15-2b之VH-CH1或h6-3與修改後之人IgG1 CH2-CH3結構域融合，藉組合PCR(assembly PCR)形成h15-2b球或h6-3球之重鏈。該重鏈序列，隨後是由衍生自弗林蛋白酶2A(furin-2A，F2A)之一序列及h15-2b或h6-3之該輕鏈序列，透過Nhe I和PmeI限制酶切位點之使用，被選殖進入慢病毒載體(lentival vector)pLKOAS3W-hyg(RNAi核心實驗室，中央研究院，台北，台灣)。採用免疫球蛋白結構域交叉的方式，單獨與該CH1及鉸鏈區的位置的修飾，產生BU12孔和α-Her-2孔。簡言之，VH-部分CH1-Cκ-部分鉸鏈(VH-partial CH1-Cκ-partial hinge)，具有一人流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)標記蛋白質融合在重鏈的N-端，與人IgG1 CH2-CH3結構域融合以形成新的重鏈。α-Her2抗體或BU12之VL-CH1部分鉸鏈序列藉由F2A序列與該新的重鏈序列連接並利用SfiI和PmeI之限制酶位點選殖進入慢病毒載體pLKOAS3W-pur(RNAi核心實驗室，中央研究院，台北，台灣)。選殖所用之引子如表21所述。
15-2b Fab×HER2 scFv、15-2b Fab×EGFR scFv、15-2b scFv×CD19 Fab及15-2b scFv×CD20 Fab DNA質體構築
該抗mPEG抗體之該VL-Cκ及VH-CH1結構域自該15-2b融合瘤之該cDNA中選殖及人類化，以如前所述(Chuang K-H et al.,J.Nucl.Med.2010(51)：933-941)。該人類化抗mPEG VL and VH片段由組裝聚合酶鏈反應(assembly polymerase chain reaction，assembly PCR)所合成並次選殖分別進入反轉錄病毒載體(retroviral vector，pLNCX-抗PEG-eB7)中之獨特之BglII、SalI、SfiI和XhoI限制酶切位。選殖15-2b Fab序列之引子於表22中。該人類抗EGFR scFv被基於該h528Fv DNA序列被選殖(Makabe et al.,(2008)J.Biol.Chem,283,1156-1166.)。因此，h528Fv DNA序列透過組裝PCR(assembly PCR)產生。用於抗EGFR VH及VL之選殖引子於表23中。接著利用Mfe-ahEGFR VL引子、ahEGFR VL-(G4S)2引子、(G4S)2-ahEGFR VH引子及ahEGFR VH-stop-Cal引子產生人抗EGFR scFv，其含有一myc標記及15個胺基酸(GGGGS)3彎曲連接子於該序列前方。
一人類抗HER2 scFv及抗DNS scFv係分別自pBub-YCMC質體(Shahied et al.,(2004)J.Biol.Chem.279,53907-53914)及pLNCX-DNS-B7質體(Chuang et al.,(2006)Bioconjugate Chemistry 17,707-714)中選殖出。用於選殖人抗HER2 scFv和抗DNS scFv之引子分別列 於表24及表25中。一myc標記及15個胺基酸(GGGGS)3彎曲連接子置於該抗mPEG Fab及scFv基因間利用SalI及CalI限制酶位點以產生pLNCX-PEG×EGFR、pLNCX-PEG×HER2及pLNCX-PEG×DNS質體。
表25 用於h15-2b scFv之選殖引子
用於選殖抗人類CD19 VH和VL之引子列於表26。該選殖之人類CD19 VH和VL序列(表13)接著與h15-2b scFv的DNA序列融合以產生DNA表現PEG×CD19的BsAbs之構築體相同地，人類抗CD20 VH和VL透過表27所列引子被選殖出，並且該選殖的人類抗CD20及抗CD22序列接著與h15-2b scFv之DNA序列融合，以分別產生PEG×CD20和PEG×CD22之表現BsAbs構建體。
重組PEG2×TAG72、PEG2×EGFR、PEG2-HER2、PEG×TAG72、PEG×EGFR和PEG×HER BsAbs之生產
CHO-K1/PEG2×TAG72及CHO-K1/PEG2×DN S細胞其 穩定分泌PEG2×TAG72及PEG2×DNS BsAbs係透過反轉錄病毒轉導作用(transduction)進入CHO-K1中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells)產生。PEG2×TAG72、PEG2×EGFR、PEG2-HER2、PEG×TAG72、PEG×EGFR和PEG×HER BsAbs透過293FT細胞之瞬時轉染(transient transfection)相應之質體產生。293FT/h6.3Fab×CD19和293FT/h6.3Fab×EGFR細胞其穩定分泌h6.3Fab×CD19及h6.3Fab×EGFR BsAbs透過慢病毒轉導產生。重組慢病毒顆粒透過pAS3w.Ppuro-pAS3w.Ppuro-h6.3Fab×CD19和pAS3w共轉染包裝。Ppuro-h6.3Fab×EGFR(7.5μg)與pCMV△R8.91(6.75μg)和pMD.G(0.75μg)利用TransLT1轉染試劑(Mirus Bio,Madison,WI)(45μL)於293FT細胞生長在10cm的培養皿(90%細胞滿度)。48小時後，慢病毒顆粒透過超高速離心(Beckman SW 41 Ti旋翼式轉子，50,000g，1.5小時，4℃)收集和濃縮。慢病毒顆粒懸浮於含5μg/mL之聚凝胺(polybrene)並以0.45μm過濾之培養基中。293FT細胞於病毒感染前一日接種於6孔盤中(1×105cells/well)。含慢病毒培養基加入細胞中接著離心1.5小時(500g,32℃)該細胞於嘌黴素(puromycin，5μg/mL)中被選擇以產生穩定細胞株(cell lines)。該抗PEG BsAbs利用一TALON管柱之親和性層析純化。簡要地說，該培養基每7-10天從CELLine貼附1000生物反應器(CELLine adhere 1000 bioreactors)(INTEGRA Biosciences AG,Switzerland)中收集。聚組氨酸標記(Poly-histidine-tagged)之BsAbs以Co2+-TALON管柱進行純化(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)。該管柱以5倍柱床體積(bed volumes)之結合緩衝(binding buffer，0.3M氯化鈉/20mM磷酸/鹽酸，pH值7.4)洗滌，並隨後以10倍床體積柱床體積之洗滌緩衝液(washing buffer， 0.3M氯化鈉/20mM磷酸鹽/5mM咪唑/鹽酸，pH值7.4)洗滌。這些聚組氨酸標記BsAbs被以洗析緩衝液(elution buffer)(0.3M NaCl的/20mM磷酸鹽/150mM的咪唑/鹽酸，pH值7.4)洗析出。該洗析之蛋白質以葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25脫鹽、PBS平衡並超濾(ultrafiltration)濃縮。蛋白質濃度以Bicinchoninic acid(BCA)蛋白分析法(Pierce,Rockford,IL,U.S.A.)測定。
PEG×EGFR、PEG×HER2和PEG×DNSBsAbs之生產
為產生所期望之BsAbs，該BALB 3T3生產細胞以上述本發明質體轉染並以MoFloTM XDP(Beckman coulter,Inc.,Brea,CA)螢光流式細胞分選儀(fluorescence-activated cell sorter，FACS)於4℃分選，接著培養於含1% CCS DMEM之CELLine生物反應器(INTEGRA Biosciences AG,Zizers,Switzerland)中。於收集該培養基後，BsAbs透過mPEG親和層析被純化，其為o-(2-aminoethyl)-o’-methylpolyethylene glycol 750(Fluka-Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)36mg交聯於活化之CNBr-SepharoseTM 4B(CNBr-activated SepharoseTM 4B,GE Healthcare,Little Chalfont,UK)。此過程根據CNBr-activated SepharoseTM 4B(GE Healthcare)產品使用說明書進行。
孔中球BsAbs之純化
穩定表現BsAbs之293FT細胞，5×107之起始細胞數之該細胞培養在DMEM含10%的低牛IgG(low bovine IgG)培養基(血清以蛋白A樹脂(protein A resin)預吸收)CellLine adhere 1000生物反應器中(Integra Biosciences AG,Zizers,Switzerland)。培養之上清液每週收集。該合併之上清液以於4℃，800g離心10分鐘以去除細胞，並隨後以4℃ 15000rpm離心25 分鐘以除去細胞碎片。之後，將該上清液通過0.45μm過濾器和G25管柱在磷酸鹽緩衝液(PBS)中的過濾，最後bsAb被利用蛋白A瓊脂糖(protein A sepharose)親和性純化。蛋白A純化後，將該純化產物利用活化CNBr SepharoseTM 4B(Sigma-Aldrich Chemical Co,St.Louis,MO,USA)親和層析進一步純化，其每克活化CNBr SepharoseTM 4B共軛接合methyl-PEG1000-NH2 35mg。隨後，該將純化之bsAb進一步利用皮爾斯抗HA瓊脂糖(Pierce抗HA agarose)(Thermo Scientific,MA,USA)親和層析進行純化。純化之bsAb分餾物(fractions)以1000倍體積之PBS透析3次並使用Amicon Ultra(30kDa截留(cutoff))(Millipore)進行濃縮。
BsAbs 5μg(如PEG2×TAG72、PEG2×DNS、mPEG×EGFR、mPEG×HER2、mPEG×DNS、15-2B/BU12、h6.3/BU12、h6.3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19 BsAbs)利用10%聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)在還原或非還原條件下進行並以考馬斯藍(Coomassie Blue)染色。
酵素免疫測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
BsAbs之該抗PEG結合專一性經由PEG2×TAG72、PEG2×DNS、hCC49 scFv、h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19於50μL 2%脫脂牛奶中以梯度濃度的方式加入由該黏蛋白(mucin)、BSA-PEG5000、NH2-PEG3k-NH2或BSA塗覆之一盤中室溫中反應1小時以進行測驗。該盤以PBS-T(PBS含有0.05%妥文-20(Tween-20))洗滌三次。兔抗6×His(Rabbit抗6×His)(2μg/mL)補充以含有HRP-共軛山羊抗兔子(HRP-conjugated goat 抗rabbit)(2μg/mL)或HRP-共軛山羊免疫球蛋白(Ig)抗人IgG Fab(HRP-conjugated goat Ig anti human IgG Fab)(2μg/mL)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)於50μL稀釋緩衝液之抗體加入室溫1小時。該盤以PBS-T(PBS含有0.05%妥文-20)洗滌三次並以PBS洗滌兩次。結合之過氧化物酶活性透過加入150μL/well ABTS受質溶液(BioLegend,San Diego,CA)，在室溫下進行30分鐘反應後測量。盤孔之該吸光度(405nm)以微盤分析儀(microplate reader)進行測量(Molecular Device,Menlo Park,CA)。
流式細胞儀分析
PEG2×TAG72或控制組PEG2×DNS BsAbs(10μg/mL)與A-375(TAG72-)、MCF-7(TAG72+)、Jurkat(TAG72+)或OVCAR-3(TAG72+)細胞於4℃下共培養30分鐘，隨後給予FITC-標記之山羊抗人免疫球蛋白第二抗體(FITC-labeled goat抗human immunoglobulin second antibody)(2μg/mL)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)或FITC-labeled 4arm-PEG(FITC-labeled 4arm-PEG)(2μg/mL)。PEG化化合物之腫瘤特異性靶向係亦利用A431(EGFRhigh)及Raji(CD19high)細胞株以10μg/mL之h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19 BsAbs於含0.05% BSA之PBS(染色緩衝液)中4℃下反應30分鐘，進行染色檢查。該細胞以冷PBS洗滌3次。PEG-Qdot655(8nM)(Invitrogen,Grand Island,NY)或PEG-化脂質體德克薩斯紅(PEG-liposomal Texas-Red)(100nm大小，50μM，脂質濃度)(FormuMax Scientific,Palo Alto,CA)於染色緩衝液中被加入細胞4℃下反應30分鐘。Raji細胞(CD19+)或SKBR3細胞(HER2+)與10μg/mL h15-2b- 球/BU12-孔(h15-2b-knob/BU12-hole)、h15-2b-球/抗Her2-孔(h15-2b-knob/抗Her2-hole)、h6-3-球/BU12-孔(h6-3-knob/BU12-hole)或h6-3-球/抗Her2-孔(h6-3-knob/抗Her2-hole)BsAbs共培養、洗滌並與0.25μg/ml FITC-labeled goat抗human IgG或10nM methoxy-PEG Qdot 655於4℃下反應30分鐘。用冷PBS洗滌後，104活細胞之表面螢光透過FACScaliber流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA,USA)進行測量，接著以FlowJo(Tree Star Inc.,San Carlos,CA,USA)進行分析。
BsAb標的奈米粒子之共焦顯微鏡攝影
於POC腔室(chambers)中之該蓋玻片(30mm)於室溫下予以溶於PBS中之10μg/mL多聚離胺酸(poly-L-lysine)塗覆反應30分鐘。該蓋玻片以PBS洗滌兩次並且將每個腔室接種5×104個A431(EGFR+)腫瘤細胞於蓋玻片上。A431細胞與10μg/mL之h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19 BsAbs在37℃的含有1μg/mL及100nM LysoTracker®紅DND-99(LysoTracker® Red DND-99，Invitrogen Life Technologies Corporation,NY,USA)培養30分鐘。該細胞以培養基洗滌2次。細胞成像在給予PEG-Qdot655溶液(Invitrogen Life Technologies Corporation,NY,USA)16nM後以Axiovert200M共聚焦顯微鏡(Carl Ziess Inc.,Thornwood,NY)成像記錄。
細胞毒性試驗
A431(EGFRhigh)及Raji(CD19high)細胞(5000cells/well)接種於96孔盤培養至隔日。h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19 BsAbs每毫升15μg加入到該細胞在37℃下，30分鐘，並隨後濃渡梯度給予游離態 阿黴素(free doxorubicin)或PEG化脂質體阿黴素(PEGylated liposomal doxorubicin)(Doxisome®,Taiwan Liposome Company Ltd.,Taipei,Taiwan)加入細胞，三重複於37℃下反應4小時。隨後將該細胞洗滌一次，並額外在新鮮培養基中再培養48小時，接著給予3H-胸腺核苷(3H-thymidine，1微居里(μCi)/well)反應16小時。結果為與未處理的細胞相比之3H-thymidine合併進入細胞之抑制作用百分比表示。
PEG-NIR797探針之活體光學成像
BALB/c裸鼠帶有Ramos(CD19+)及A431(EGFR+)腫瘤(~250mm3)於其後肢區域給予h6.3Fab×EGFR(50μg)及PEG-NIR791(50μg)靜脈注射(intravenously inject)。戊巴比妥(Pentobarbital)麻醉小鼠依次以IVIS光譜成像光學系統(激發，745nm；發射，840nm；Perkin-Elmer,Inc.,MA,USA)在45分鐘後進行成像，在注射後24小時和48小時。
檢測於結腸癌和乳腺癌細胞該腫瘤標誌物之表現程度
EGFR之表現被測量藉由染色含1mg/mL爾必得舒(Erbitux)SW480或SW620細胞，在4℃下利用，接著以1mg/ml FITC conjugated goat抗human IgG Fc(Jackson Immuno-Research Laboratories,Westgrove,PA)。相同的過程被用來測量SK-BR-3或MDA-MB-468細胞之HER2表達，其藉由賀癌平(Herceptin，1mg/mL)隨後1mg/mL FITC conjugated goat抗human IgG Fc染色。冰冷之PBS充分洗滌後，活細胞的該表面免疫螢光以FACScan流式細胞儀(BD Biosciences,San Diego,CA)測定且螢光強度以Cellquest pro軟體分析(BD Biosciences)。
PEG×EGFR和PEG×HER2的雙功能測定
96孔盤以溶於PBS之poly-L-lysine(40μg/ml)2μg/每孔於室溫下塗覆反應5分鐘，後以PBS洗滌兩次，接著以SW480(EGFR+)或SK-BR-3(HER2+)腫瘤細胞2×105cells/well接種。PEG×EGFR、PEG×HER2和PEG×DNS(10μg/mL)加入到孔中，在室溫下反應1小時。該細胞接著以DMEM洗滌三次並200ng/mL之Lipo/DOX、66.7ng/mL之Lipo/IR780、100ng/mL之SN38/PM、600ng/ml之FeOdots、0.5nM之AuNP及0.5nM之Qdot565nm被加入孔中20分鐘。在以DMEM充分洗滌後，PEG奈米顆粒(PEG-NPs)之濃度藉由抗PEG主鏈抗體(6自6-3融合瘤細胞產生之-3抗體)5μg/mlL加入反應一小時，接著DMEM洗滌三次進行測定。為了放大信號，山羊抗小鼠IgG之Fc-HRP(goat抗mouse IgG Fc-HRP)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,PA,USA)0.4μg/mL，加入到孔中。第四次用DMEM洗滌孔盤，隨後在405nm吸光度值以微盤分析儀(microplate reader)(Molecular Device,Menlo Park,CA)進行測量前，加入ABTS受質。
PEG-NPs與PEG×EGFR及PEG×HER2之非共價修飾
BsAbs加入到含PEG-NPs之BSA/PBS緩衝液(1倍PBS緩衝液含0.05% BSA)，於4℃下以反應1小時在380-570μg BsAb/μmol doxorubicin(為Lipo/DOX)、550μg BsAbs/μmol FeOdot及140ng BsAbs/pmol Qdots之protein/PEG-NP比例。經過PEG×EGFRPEG×HER2修飾後，PEG-NPs成為αEGFR-NPs或αHER2-NPs.
非靶向NPs轉變為靶向NPs之確認
96孔盤用以溶於PBS之poly-L-lysine(40μg/mL)2μg/孔(well)塗覆，於室溫下反應5分鐘，以PBS洗滌兩次並且以2×105cells/well 之SW480(EGFR+)、SW620(EGFR-)、SK-BR-3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-)腫瘤細胞接種。SW480(EGFR+)及SW620(EGFR-)細胞與4μg/mL之αEGFR-Lipo/DOX、1μg/mL之αEGFR-Lipo/IR780及4μg/mL之FeOdots反應20分鐘。以DMEM充分洗滌後，PEG化NPs之該濃度以加入抗PEG主鏈抗體(6-3抗體)5μg/mL 1小時反應後，接著以DMEM洗滌三次後進行測定。為了放大信號，山羊抗小鼠IgG之Fc-HRP(goat抗mouse IgG Fc-HRP)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,PA,USA)0.4μg/mL，加入到孔中。用DMEM洗滌孔盤，隨後在405nm吸光度值以微盤分析儀(microplate reader)(Molecular Device,Menlo Park,CA,USA)，進行測量前加入ABTS受質。相同的過程被用來研究SK-BR-3(HER2+)和MDA-MB-468(HER2-)細胞，其以4μg/mL之αHER2-Lipo/DOX、4μg/mL之FeOdots及2nM之αEGFR-Qdot565nm反應20分鐘。
BsAb-靶向NPs之共聚焦顯微鏡成像
圓形蓋玻片(18mm)於12孔盤中溶於PBS之poly-L-lysine(40μg/ml)以20μg/well塗覆於室溫下反應5分鐘。該蓋玻片以PBS洗滌兩次並且將每個腔室接種4×104個SW480(EGFR+)、SW620(EGFR-)、SK-BR-3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-)腫瘤細胞/well於該蓋玻片上。SW480(EGFR+)和SW620細胞(EGFR-)與300ng/mL之αEGFR-Lipo/Rho與αDNS-Lipo/Rho於37℃下培養1小時。該細胞以溶於PBS之2%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定在4℃ 30分鐘並以DAPI在4℃ 45分鐘染色接著，該蓋玻片以PBS洗滌4次，並隨後以螢光封固劑(fluorescent mounting medium；Dako,Glostrup,Denmark)封片於顯微鏡的玻璃載玻片上。 αEGFR-Lipo/Rho及αDNS-Lipo/Rho之螢光訊號以一Olympus FluoViewTM FV1000共軛焦顯微鏡(Olympus Imaging America Inc.,Center Valley,PA)成像記錄。相同的方法用於SK-BR-3(HER2+)及MDA-MB-468(HER2-)cells分別以4nM of αHER2-Qdot565nm及αDNS-Qdot565nm之染色成像。
BsAb靶向FeOdots之標的於磁振造影(MR imaging)
磁振造影以一臨床3.0T磁振造影儀(MR imager；Signa；GE Healthcare,Little Chalfont,UK)執行。1×107 SW480(EGFR+)或SW620(EGFR-)細胞與不同濃度之αEGFR-FeOdots或αDNS-FeOdots(7μM、14μM及28μM)在4℃下培養30分鐘。該細胞於PBS洗滌3次，接著BsAbs-FeOdots之堆積作用以T2加權快速自旋回波序列(T2-weighted fast spin-echo sequence；TR/TE=2500ms/60ms)進行掃瞄。同樣的步驟用於觀測αHER2-FeOdots和αDNS-FeOdots在SK-BR-3(HER2+)和MDA-MB-468(HER2-)細胞中之定位。
BsAb-targeted Lipo/DOX之體外毒性
SW480(EGFR+)及SW620(EGFR-)細胞(3×103/well)接種於96孔盤上。2μg/mL或4μg/mL之αEGFR-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX及Lipo/DOX加至每一盤孔並培養於37℃ 1小時。該培養基補充並且該細胞培養72小時在細胞活性以該ATPliteTM冷光分析系統(ATPliteTM Luminescence Assay System；Perkin-Elmer,Inc.,Waltham,MA)檢測之前。對SK-BR-3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-)細胞與αHER2-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX或Lipo/DOX培養在37℃ 3小時之細胞活性根據相同方法測定。相對於未處理細胞之冷光之抑制百分率以下公式呈現：抑制率(%) =100×(處理組之冷光/未處理組之冷光untreated luminescence)。每一個數據點之該標準差(standard deviation)以三個樣品(n=3)之平均。
BsAb-Lipo/IR780及Lipo/IR780活體內光學成像
BALB/c裸鼠帶有SW480(EGFR+)和SW620(EGFR-)腫瘤(約100立方毫米)在其後腿區域，分別靜脈內注射αEGFR-前列/IR780，αDNS-前列/IR780，和前列/IR780(100每隻小鼠微克)。戊巴比妥麻醉的小鼠依次在24，48和注射後72小時，用IVIS光譜成像光學系統(激發，745nm；發射840nm；Perkin-Elmer公司制，公司，馬薩諸塞州沃爾瑟姆)成像。
EGFR + 及EGFR -腫瘤以BsAb-Lipo/DOX and Lipo/DOX之治療
BALB/c裸鼠小鼠(n=6)皮下(Subcutemeous，s.c.)接種4×106 SW480(EGFR+)細胞及1×106 SW620(EGFR-)細胞在其後腿區域。腫瘤大小到達約20mm3時，Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX及αEGFR-Lipo/DOX靜脈給予(intravenous，i.v.)在每周一次5mg DOX/kg給予3週，總共給與15mg DOX/kg之劑量。其他治療組給予生理食鹽水。腫瘤測量進行每週3次用卡尺，以及使用方程式：(長×寬×高)/2，計算腫瘤大小。小鼠秤重每週一次以觀測毒性。
統計分析。
不同平均值之間之統計顯著差異被以JMP 9.0軟體(SAS Institute,Inc.,Cary,NC)以無母數曼-懷特尼檢定(nonparametric Mann-Whitney test)估算。P值在毒性分析及活體毒性<0.05及P-values在該活體處理<0.01被視為具統計上顯著。
實例1 製備和二聚體人類化雙功能特異性抗體(BsAbs)之生產與定性
1.1 鼠類抗MPEG或抗PEG抗體之產生
為了產生人類化BsAbs，三融合瘤細胞，E11、15-2b和6-3，被確定，且其各自之單株抗體分別通過親和層析收集。該收集之抗體對於固定之PEG之專一性結合接著被測定。一典型專一性結合於融合瘤所產生之單株抗體與PEG之間示於圖4。
從圖4可以明顯看出，由融合瘤15-2b所產生單株抗體與CH3-PEG750-NH2而不是NH2-PEG3000-NH2結合；其表明這種單株抗體專一性辨識該CH3-PEG分子之甲氧基末端或PEG分子之末端羥基(圖4)並因此被稱為抗mPEG抗體(抗mPEG Ab)；而該抗體產生由融合瘤6-3或E11專一性辨識該主鏈部份並非該末端甲氧機或末端羥基或該PEG分子餅因此稱為抗PEG抗體(抗PEG Ab)。
該抗mPEG或抗PEG Abs DNA編碼接著利用慣用程序(即，利用具有對於該單株抗體之重鏈或輕鏈基因編碼專一性接合之寡核苷酸探針)分離及定序。
1.2 二聚體人類化抗PEG(hE11)抗TAG72 BsAb之產生
為了產生具雙功能人類化抗體，實例1.1之鼠抗mPEG mAb之該DNA序列被人類化並與人類之單鏈抗體片段基因其對應腫瘤相關 糖蛋白72(glycoprotein 72，TAG-72)抗原(hcc49 scFv)或一丹磺醯半抗原(dansyl(DNS)hapten)融合，其遵照材料與方法部分所描述之方法製得。
圖5A係該人類化雙功能抗體之DNA構築於實例中製備之一示意圖。在一般情況下，每一個構建體依序列編碼，HA抗原決定基(epitope)標記(tag)(HA)、該hE11抗PEG輕鏈、F2A一雙順反子因子(F2A bicistronic element)、該hE11抗PEG重鏈、一絞鏈-CH2-CH3結構域(hinge-CH2-CH3 domain)、一連接子胜肽(L)、一抗腫scFv序列(例如hcc49 scFv對於PEG2×TAG72質體及抗dansyl scFv對於the control PEG2×DNS質體)及一組氨酸標記。圖5B係此一實例之二聚人類化抗PEG BsAb之一示意圖。因此，BsAbs包括PEG2×TAG72及PEG2×DNS被製備。SDS-PAGE分析說明其BsAbs由一個VH-CH1-H-CH 2-CH 3-scFv片段(72kDa)和輕鏈(35kDa的)在還原條件下(圖5C，右圖)組成；相較之下，一個230kDa之雙硫鍵連接BsAbs被觀測於非還原條件(圖5C，左圖)。該結果進一步由Western blot分析證實，在其中，該hE11抗PEG輕鏈之該N端上之HA抗源決定為及該scFv貼附於該hE11抗PEG重鏈之C端上呈現之該組胺酸抗原決定位標記被識別，證明其雙功能抗體呈現預期之結構(FIG 5D)。
1.3 實例1.2之BsAbs功能特性
實例1.2之該人類化hE11 BsAbs之雙功能活性於本實例中觀測。
該BsAbs之結合利用ELISA法檢測。微量盤首先以抗原塗覆並接著加入PEG2×TAG72、PEG2×DNS BsAbs或hCC49(抗TAG72)單鏈抗體。在該盤充分洗滌以除去未結合的抗體後，每孔中剩餘的該結合 的抗體以HRP共軛接合之二級抗體被偵測。該PEG2×TAG72 BsAb能夠同時結合黏蛋白(mucin)(TAG-72腫瘤抗原)(圖6A)及BSA-PEG(圖6B)但不結合BSA(圖6C)，證明其PEG2×TAG72顯示對於PEG及黏蛋白具雙抗原特異性。相較之下，該控制組PEG2×DNS BsAb結合BSA-PEG但不結合黏蛋白。相同的，該hcc49 scFv結合到黏蛋白，但不與BSA-PEG結合。總之，實例1.2之PEG2×TAG72抗PEG(hE11)BsAb可以結合PEG和腫瘤抗原兩者。
為確定實例1.2之該hE11 BsAbs是否能結合標的細胞，MCF-7乳癌、Jurkat T細胞和OVCAR-3卵巢癌細胞，其表現TAG-72抗原可由hCC49抗體識別，與PEG2×TAG72及PEG2×DNS BsAbs培養。A-375惡性黑色素瘤細胞，其不表達的TAG-72抗原，被作為陰性對照細胞株。於該細胞洗滌未結之BsAbs後，結合至細胞之該剩餘BsAbs以FITC-共軛結合之抗-人類免疫球蛋白抗體(FITC-conjugated抗human immunoglobulin)進行檢測。以流式細胞儀檢測表面免疫螢光反應，證明TAG-72陽性細胞結合PEG2×TAG72 BsAb而不結合該控制組PEG2×DNS BsAb(圖7，左圖)。為測試PEG2×TAG72是否可同時結合於癌細胞和PEG化分子，該細胞先與BsAbs培養、洗滌並接著與FITC標記的PEG分子反應。TAG-72陽性細胞與PEG2×TAG72 BsAb反應但不與該控制組PEG2×DNS BsAb結合PEG-FITC，證明其PEG2×TAG72作為一真正之BsAb其可同時結合腫瘤抗原和PEG分子(圖7，右圖)。
1.4 二聚體人類化抗PEG(hE11)抗EGFR或抗HER BsAbs之產生及定性
評估是否其它細胞標的可被抗PEG BsAbs所標識，單鏈 抗體片段對應上皮生長因子受器(epidermal growth factor receptor，EGFR)及該HER2抗原與該人類化E11抗體之該重鏈CH3區域基因之C端融合以分別產生PEG2×EGFR及PEG2×HER2，依照實例1.2相似步驟。
該BsAbs結合至癌細胞之能力評估揭示其PEG2×TAG72與Jurkat T細胞(TAG-72陽性)結合但不與MDA-MB-468細胞或BT-474細胞。與此相反，PEG2×EGFR BsA與MDA-MB-468細胞(EGFR陽性)結合但不與其它細胞反應，而PEG2×HER2 BsAbs與BT-474細胞(HER2陽性)專一性結合(圖8A)。因此，這些BsAbs與各自之標的細胞具一抗原依賴性(antigen-dependent manner)。
該雙功能抗體同時結合腫瘤細胞和PEG化的化合物之能力進一步透過首先將細胞與BsAbs共培養、從細胞洗滌未結合的抗體並接著加入PEG-脂質體德克薩斯紅(PEG-liposomal Texas Red)或PEG-Qdot655(PEG化量子點(PEGylated quantum dots))之研究。每一BsAb選擇性堆積PEG化脂質體(PEGylated liposomes)(圖8B)或PEG化的奈米顆粒(圖8C)於表現對應標的抗原於表面上之細胞。
總之，本實例之抗PEG BsAbs可以同時結合到目標抗原及PEG化物質以選擇性堆積PEG化化合物和奈米粒子於各自標的細胞上。
實例2 單價(monovalent)人類化BsAbs之產生與定性
2.1 單價抗PEG(E11)BsAbs之產生與定性
單價 抗PEG BsAbs透過該一衍生自該抗PEG antibody E11至單鏈抗體人類化抗體之Fab片段與專一性腫瘤相關抗原之融合產生。具體而言，該hE11 Fab片段與衍生自抗TAG72，抗表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)或抗HER2/Neu抗體之一單鏈抗體片段(single-chain antibody fragment，scFv)融合(圖9)。CHO細胞穩定表現該單價BsAbs被產生並且每一株表現細胞株之培養基被收集。
單價BsAbs與其標的蛋白之專一性結合透過BsAbs產生細胞之被收集的培養基之測量，加入該培養基至表現標的蛋白之細胞，接著透過ELISA測定其結合程度。洗滌細胞後，該已結合之BsAbs透過FITC標記之山羊抗人免疫球蛋白二級抗體(FITC-labeled goat抗human immunoglobulin second antibody)檢測。結果發現，其PEG×TAG72結合至Jurkat T細胞(TAG-72陽性)，但不結合MDA-MB-468細胞或BT-474細胞。與此相反，PEG×EGFR BsAb結合至MDA-MB-468細胞(表皮生長因子受體陽性)，但沒有與其他兩個細胞結合；而PEG×HER2 BsAb被發現專一性結合至BT-474細胞(HER2陽性)(圖10)。因此，單價抗PEG(hE11)結合至標的細胞具有一抗原-依賴性和選擇性。
該單價BsAb同時與癌細胞及PEG化化合物結合之能力透過具BsAbs之標的細胞與PEG化物質之共培養觀測。在從該細胞之未接合之抗體洗滌後，PEG-脂質體德克薩斯紅(PEG-liposomal Texas Red)或PEG-Qdot655(PEG化量子點)被接著加入。每個BsAbs選擇性地堆積PEG化脂質體(圖11)或PEG化的奈米顆粒(圖12)於其表現對應標的抗原於表面之細胞中。因此，單價抗PEG(hE11)BsAbs可以同時結合之目標抗原與PEG化物質以選擇性地積PEG化化合物和奈米顆粒於該目標細胞的表面上。
2.2 單價抗PEG(h6.3)BsAbs之產生與定性
該人類化抗PEG(h6.3)Fab被以一單一開讀框(open reading frame，ORF) 構築，透過融合VL-Cκ及有一弗林蛋白酶2A(furin-2A，F2A)胜肽連接子之VH-CH1，允許輕鏈與重鏈分別表達，根據材料與方法部分中所描述之程序進行。
該單鏈雙硫鍵穩定之可變區片段(disulfide-stabilized variable fragments，dsFv)與該6.3Fab中之該CH1結構域之C端連接，透過一胜肽連接子產生h6.3-11F8(h6-3Fab×EGFR)及h6.3-hBU12(h6.3Fab×CD19)BsAbs(圖13A)。該此二BsAbs接著插入到一慢病毒表達載體，以產生穩定之293FT生產細胞株。BsAbs(包括h6-3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19)其從該培養基中純化，預期之分子大小，顯示在一10%之SDS-PAGE(圖13B)。
此外，h6-3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19 BsAbs兩者結合之該NH2-PEG10,000-NH2，但不結合至控制組的BSA蛋白，說明其具有與PEG分子結合之專一性(圖14A和14B)。至於其結合至該目標抗原之專一性，流式細胞儀分析顯示，其係h6.3Fab×EGFR，但不為h6.3Fab×CD19，是能夠指引該PEG化物質(包括PEG-脂質體德克薩斯紅及PEG-Qdot655)至A431細胞(EGFR+)；而h6.3Fab×CD19，但非h6.3Fab×EGFR，係能夠引導PEG化物質至Raji細胞(CD19+)(圖14C)。h6-3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19 BsAbs之PEG-結合動力學通過微型熱泳(Microscale Thermophoresis，MST)進行驗證(圖14D和14E)。
為了驗證是否BsAb標的之物質可以被抗原陽性癌細胞內化(internalize)，活細胞成像透過細胞以溶酶體追蹤子(lysosome tracker)與BsAbs染色，隨後以PEG-Qdot655之加入及反應進行。結果發現，其 h6.3Fab×EGFR處理之A431細胞顯示紅色螢光於胞吞囊泡(endocytic vesicle)中，而h6.3Fab×CD19處理之A431細胞未能產生的PEG-Qdot655信號(圖15)。這一觀察結果說明，其h6.3Fab×EGFR調節EGFR內吞作用，允許PEG-物質的攝取到A431細胞中。
接著，是否h6.3Fab×CD19和h6.3Fab×EGFR BsAbs之能力可能增加該載藥奈米顆粒(drug-loaded nanoparticles，NPs)對於抗原陽性癌細胞的細胞毒性的能力進行了研究。Raji細胞(CD19+)和A431(EGFR+)細胞與h6.3Fab×CD19和h6.3Fab×EGFR進行培養，接著加入梯度濃度之Doxisome(即，PEG化脂質體化阿黴素)。當與Doxisome單獨處理相比，無論h6.3Fab×CD19和h6.3Fab×EGFR增強Doxisome之分別對Raji、MDA-MB-468和A431細胞之細胞毒性(圖16)。該結果說明，其抗PEG(h6.3)BsAbs可以賦予腫瘤選擇性和增加PEG化的奈米顆粒(例如，doxisome)與抗原陽性的癌細胞的細胞毒性。
為了確定抗PEG(h6.3)BsAbs-NPs於活體之腫瘤之標的，BALB/c裸鼠帶有Ramos(CD19，左側)和SW480(EGFR，右側)的腫瘤在其後腿區被以靜脈內注射h6.3Fab×EGFR和PEG-NIR797探針。該小鼠在注射後45分鐘、24及48小時內，以IVIS光譜成像光學系統成像。PEG-NIR797之增強信號在A431腫瘤中觀察到，但不在Ramos腫瘤(圖17)，證明其h6.3Fab×EGFR BsAbs優先遞送PEG探針至EGFR抗原陽性腫瘤的體內。
2.3 單價抗mPEG(h15.2b)BsAbs之產生及定性
在本實例中，實例1.1之鼠抗mPEG抗體的DNA序列係人 類化，結合其他核酸編譯EGFR或HER2之一單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)根據在材料和方法部分所描述的方法進行。
圖18A係在本實例中該人類化雙功能性抗體製備之該DNA構築體示意圖，且3 BsAbs包括PEG×EGFR，PEG×HER2和PEG×DNS被產生。在一般情況下，每一個構築體中編碼依序為，一信號肽(signal peptide，SP)、HA抗原決定位標記(HA)、該抗mPEG輕鏈、一F2A一雙順反子因子，該抗mPEG重鏈Fd片段，一myc抗原決定為標記，一15個胺基酸柔性連接子胜肽(L)及scFv對應抗腫瘤標記序列，如抗EGFR scFv用於PEG×EGFR質體，及抗HER2 scFv用於PEG×HER2質體和抗丹磺醯(dansyl)scFv(抗dansyl scFv)用於該控制組PEG×DNS質體。因此，3個BsAbs包括PEG×EGFR，PEG×HER2和PEG×DNS被製作。SDS-PAGE分析說明，在還原條件下，其BsAbs由一個Fd-scFv片段(56kDa)及輕鏈(35kDa)組成；相比之下，一91kDa之雙硫鍵連接BsAbs於非還原條件下被觀測(圖18B)。
該因此製成之人類化BsAbs接著進行於抗原陽性或抗原缺陷癌細胞之雙功能活性測定。簡言之，細胞具有過度表現之EGFR(即，SW480，EGFR+)或HER2(即，SK-BR-3，HER2+)係首先與本實例之人類化BsAbs進行培養，並且該未結合BsAbs以一緩衝溶液洗出，不同之PEG-NPs(即，Lipo/DOX、Lipo/IR780、SN38/PM、FeOdot、AuNP及Qdot565nm)接著加入，並且該個別之該BsAbs結合活性以具有抗mPEG抗體之ELISA法檢測。
應該注意的是PEG×EGFR，而不是該陰性對照組PEG×DNS，調控所有測試之PEG-NPs至EGFR+ SW480癌細胞之結合(圖 18C)。同樣，PEG×HER2，但不是PEG×DNS，調控PEG-NPs結合至HER2+ SK-BR-腫瘤細胞(圖18D)。總之，PEG×EGFR和PEG×HER2兩者顯示雙功能結合活性，並能調控PEG-NPs至表現該EGFR or HER2腫瘤標誌之細胞之交聯。
為評估本實例之該BsAb是否可以賦予癌細胞對於PEG-NP專一性，本實例之該BsAbs加入至各種PEG-NPs(例如，Lipo/DOX、Lipo/IR780及FeOdo以產生靶向之PEG-NPs。結合之專一性以ELISA測量。結果描述於圖19。結果發現，其PEG-NPs靶向取決於該BsAb之該抗EGFR部份，用於控制組αDNS-NPs未能結合於SW480(EGFR+)或SW620(EGFR-)腫瘤細胞(圖19A)。同樣，PEG-NPs與PEG×HER2反應，允許奈米顆粒與SK-BR-3(HER2+)腫瘤細胞結合，但不與MDA-MB-468(HER2-)腫瘤細胞反應(圖19B)。這些結果證明，其PEG×EGFR或PEG×HER2與PEG-NPs可賦予該奈米顆粒對於癌細胞上之EGFR或HER2具有專一性。
該靶向之PEG-NP於消滅抗原陽性癌細胞之能力進一步研究並且結果提供於圖20中。如描繪在圖20中，αEGFR-Lipo/DOX表現出對於SW480(EGFR+)癌細胞具有較高的細胞毒性，如與Lipo/DOX或αDNS-Lipo/DOX比較(圖20A)。相比之下，αEGFR-Lipo/DOX顯示類似細胞毒性於Lipo/DOX or αDNS-Lipo/DOX對於SW620(EGFR-)腫瘤細胞(圖20B)。同樣地，αHER2-Lipo/DOX係顯著對於SK-BR-3(HER2+)癌細胞較具毒性與Lipo/DOX或αDNS-Lipo/DOX所造成相比(圖20C)。然而，αHER2-Lipo/DOX與Lipo/DOX或αDNS-Lipo/DOX相比，對於MDA-MB-468(HER2-)具有相似毒性。因此，合理的結論係抗mPEG BsAbs可以賦予腫瘤 選擇性和增加的PEG-NP(Lipo/DOX)之對抗原陽性癌細胞之細胞毒性。
探討活體內BsAbs-NPs之腫瘤標的，BALB/c裸鼠帶有EGFR-SW620(左側)及EGFR+ SW480(右側)腫瘤在其後腿區，給予靜脈注射αEGFR-Lipo/IR780、αDNS-Lipo/IR780或Lipo/IR780。該小鼠注射後24,48和72小時以一IVIS光譜成像光學系統進行成像。該αEGFR-Lipo/IR780之螢光訊號在SW480(EGFR+)腫瘤中被增強與SW620(EGFR-)相比，於探針注射後24至72小時(圖21，底行)。αEGFR-Lipo/IR780於SW480(EGFR+)腫瘤之螢光強度相對於SW620(EGFR-)腫瘤於24，48和72小時分別為2.037，2.318和2.328倍以上(表28)。相比之下，Lipo/IR780及αDNS-Lipo/IR780於SW620腫瘤位置較強烈，應是由EPR效應。這些數據說明，其αEGFR-Lipo/IR780可能具有選擇性對於EGFR+癌症細胞，從而促進於EGFR+腫瘤之增強積累。表28. SW480(EGFR+)對SW620(EGFR-)之重點區域(region of interest，ROI)比率在所指示的時間確定
為觀測本實例之PEG×EGFR是否能增加Lipo/DOX對於EGFR+腫瘤於活體之治療功效，帶有SW480(EGFR+)及SW620(EGFR-)腫瘤於其後腿區域之BALB/c裸鼠被給予Lipo/DOX αEGFR-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX或saline。結果發現，αEGFR-Lipo/DOX抑制SW480(EGFR+)腫瘤生長顯著高於Lipo/DOX處理組(P<0.01；於8至45天)(圖22A)，且根據小鼠體重之測定，應無任何明顯的毒性(圖22C)。在該SW620(EGFR-)腫瘤模型，在給予αEGFR-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX或Lipo/DOX處理之間腫瘤大小無顯著差異。因此，可合理的結論，該實例之PEG×EGFR可確實提高Lipo/DOX於活體中對於EGFR+腫瘤之抗腫瘤效率。
2.4 單價抗mPEG(h15.2b)、抗CD19或抗CD20 BsAbs之產生及定性
在本實例中，鼠抗mPEG單株抗體之該人類化單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)與另一核酸編碼該CD19或CD20之單體IgG結合，根據在材料和方法部分描述的方法。
圖23A係於本實例中製備的人類化雙特異性抗體之該DNA構築體之示意圖。在一般情況下，每一個構築體中編碼依序，一信號肽(signal peptide，SP)，一抗CD19或抗CD20重鏈序列(VH-CH1)，一抗CD19或抗CD20的輕鏈序列(VL-CK)中，一胺基酸柔性連接子胜肽(L)和該抗mPEGscFv。因此，兩抗mPEG BsAbs分別針對CD19和CD20被生產。結合之結果證實，本實例之抗mPEG BsAbs特異性地結合至該陽性表達CD19和CD20(例如，Raji細胞)(圖23B)，以及PEG分子的末端甲氧基或 經基的(圖23C)。此外，一旦在本實例之抗mPEG BsAbs與用於治療奈米顆粒(例如，Lipo/DOX)混合，其能夠標的遞送該治療性奈米顆粒至CD19或CD-20陽性癌細胞(圖23D)
實例3 二聚體人類化孔中球(knob in hole)BsAbs之構築及定性
3.1 孔中球抗PEG(h6.3或h15.2b)、抗HER2或抗CD19 BsAbs之產生
重組DNA技術被利用來創造源自抗HER2抗體(C6)或抗CD19抗體(BU12)及人類化抗甲氧基-PEG單株抗體h15-2b或人類化抗PEG抗體h6.3之VH及VL之cDNA編碼區域，使用“孔中球(knobs-into-holes)”策略之使用及免疫球蛋白結構域交叉的方法，以異二聚體的形成及正確抗體重鏈和輕組件。
用於產生正確組裝抗體，BU12或C6抗體之該抗原結合片段(antigen binding fragment，Fab)中之該輕鏈Ck結構域與重鏈CH1結構域被交換，而該抗PEG抗體保持不變。特別是，該腫瘤抗原之抗體BU12和C6之Cκ被該部分CH1片段及部分該抗體重鏈之部分鉸鏈被取代，且抗體重鏈中之該原CH1片段位被該抗體輕鏈之該Cκ序列取代。這使得該輕鏈與其同源重鏈配對，而不是該抗PEG-球抗體之該重鏈。此外，對於重鏈異源二聚體的形成，分別將一個球結構(T366W和S354C)被引入該h15-2b和h6.3 CH3區和一個孔結構(T366S，L368A，Y407V和Y349C)被引入到C6之CH3和BU12。自該抗mPEG(h15-2b)-球(抗mPEG(h15-2b)-knob)抗體及BU12-孔(BU12-hole)或抗HER2-hole(抗HER2-hole)抗體構築BsAbs之構築 結構圖描繪於圖24A；而從該抗PEG antibody(h6.3)-球(抗PEG antibody(h6.3)-knob)及BU12-hole或抗HER2-hole抗體構築BsAbs之DNA圖顯示在圖24B上。
BsAbs之該DNA構築體接著插入到慢病毒表達載體，以產生穩定的293FT生產細胞株。BsAbs(包括h15-2b球+BU12孔(h15-2b knob+BU12-hole)，h6.3+BU12孔(h6.3+BU12-hole))其自培養基中純化，於10%的SDS-PAGE上顯示預期的分子大小(圖24C)。
3.2 實例3.1之孔中球BsAbs的定性
在此實例子，實例3.1之該純化孔中球BsAbs之該雙特異性被研究。簡言之，Ramos細胞(CD19+)和SKBR3細胞(HER2+)被用來驗證是否純化之BsAbs可結合於PEG化合物和其表達CD19或Her2/neu腫瘤抗原之癌細胞兩者。簡言之，將Ramos細胞(CD19+)，Raji細胞(CD19+)或SKBR3細胞(HER2+)培養於10μg/mL h15-2b球/BU12孔(h15-2b-knob/BU12-hole)或h15-2b球/抗Her2孔BsAbs(h15-2b-knob/抗Her2-hole BsAbs)，洗滌並與0.25μg/mL FITC-標記的山羊抗人IgG(FITC-labeled goat抗human IgG)或10nM的甲氧基聚乙二醇的Qdot655(methoxy-PEG Qdot 655)，在4℃下進行30分鐘反應。活細胞之該表面螢光測定在FACSCalibur。結果示於圖25至28。
結果發現，h15-2b-球/BU12-hole(h15-2b-knob/BU12-hole)BsAbs結合於CD19陽性Ramos細胞，但不結合於SKBR3細胞；而h15-2b-球/抗HER2-hole(h15-2b-knob/抗HER2-hole)BsAbs結合至SKBR3(Her2陽性)(圖25)。這表示其h15-2b BsAbs保留該特異性結 合到癌細胞抗原依賴性方式的能力。更重要的是，h15-2b-球/BU12-hole可以保持穩定的PEG化量子點於Ramos細胞和Raji細胞；及h15-2b-球/抗HER2-hole可以保留該量子點在SKBR3細胞中(圖26)。因此，這些試劑充當真正的雙特異性分子。h6.3-球/BU12-hole(h6.3-knob/BU12-hole)BsAbs以流式細胞儀測量，觀察到類似的結果，其可以結合到CD19表達細胞(Ramos及Raji)(圖27)。h6.3-球/BU12-hole亦有效地結合PEG修飾的量子點與Raji細胞(圖28)，這表該此BsAb可以同時結合於癌細胞上之CD19和一聚乙二醇化奈米顆粒之PEG分子。
實例4 重組完整抗癌BsAbs之構築和定性
4.1 賀癌平(Herceptin)/h-α-PEG和爾必得舒(Erbitux)/h-αPEG Abs之產生
創造試劑其可以協同攻擊癌細胞，一功能和人類化抗PEG之單鏈抗體(h-αPEG scFv)與市售標靶抗體(包括賀癌平 和爾必得舒)之C端融合，以形成雙功能的賀癌平/h-αPEG及 爾必得舒/h-αPEG Abs(圖29)。因此，不僅有該賀癌平 及/或 爾必得舒 抗體之原始抗癌作用被保留，且該新產生的BsAbs亦可以積極地結合到PEG化的藥物於腫瘤部位，以產生協同抗癌作用(即，雙攻擊策略)。
4.2 實例4.1之BsAbs該功能之定性
在本實例中，實例4.1之BsAbs的雙功能活性被研究。簡要地說，SKBR-3人乳腺癌細胞，其過量表現該HER2/c-erb-2基因產物，塗覆在96孔微量孔盤；接著賀癌平/h-αPEG抗體及控制組賀癌平抗體加入該微量孔盤中。在未結合之雙功能抗體被洗出後，其中含有doxorubicin之PEG化 脂質體(在本文中Lipo-DOX)加入到盤孔中。該PEG化化合物之結合透過ELISA來確定。
正如預期的，賀癌平/h-αPEG而不是控制組賀癌平抗體，選擇性地結合Lipo-DOX至SKBR-3細胞(圖30A)。類似的結果也觀察到的A431人上皮癌細胞，其具有過量表現EGFR。爾必得舒/h-αPEG而不是控制組爾必得舒抗體，指引PEG化的化合物堆積於A431細胞的表面(EGFR+)(圖30B)。
實例4.1靶向Lipo-Dox對癌細胞所使用之BsAbs的抗癌效果進一步於體外檢測。結果描述於圖31。
據證實，賀癌平/h-αPEG(圖31A)和爾必得舒/h-αPEG(圖31B)，但不包括控制組，當分別與Lipo-Dox合併表現出協同抗腫瘤效果，說明該雙攻擊策略有助於實現腫瘤的殺傷效果更上一層樓。
在一個類似的實驗中，HER-2陽性SKBR-3細胞與5μg/mL賀癌平/h-αPEG或賀癌平，在37℃進行預培養1小時。洗滌去除未結合之抗體後，將細胞再用梯度濃度之Lipo-Dox(9,3，及0.33μg/mL)處理三重複反應6小時。含藥培養基以新鮮培養基置換，並允許細胞繼續培養額外72小時。細胞ATP合成在經藥物處理的細胞，然後與未處理的細胞比較。
結果發現，細胞毒性程度在細胞預處理雙特異性賀癌平抗體和Lipo-Dox，比用任單一賀癌平或Lipo-Dox處理組來的高(圖32)。該發現是與圖31相符的，在其中觀察到Lipo-Dox和抗PEG BsAb之協同殺傷作用。
應該理解的是，其上實施例所描述僅透過實例及各種修 改可以由那些本領域的普通技術人員進行說明。以上說明書、實例及數據提供了對結構和使用本發明示例性實施例的完整描述。雖然本發明的各種實施例已經描述了以上帶著一定程度的特殊性或參考一個或多個個體實施例中，那些與在本領域的普通技術人員可以做出多種更改對所公開的實施例而不脫離的精神或範圍的本發明。
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<223> MluI-11F8VL反向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> MfeI-DNSVH正向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> MluI-DNSVL反向引子
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> MfeI-hCC49VH正向引子
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> MluI-hCC49VL反向引子
<400> 98
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 15-2b-球：VL-Cκ反向引子
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 15-2b-球：VH-CH1正向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 15-2b-球：VH-CH 1反向引子
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 15-2b-球：CH3反向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> h6-3-球：104 VL-Cκ正向引子
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> h6-3-球：104 VL-Cκ反向引子
<400> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> h6-3-球：104 VH-CH1正向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h6-3-球：104 VH-CH1反向引子
<400> 109
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<213> 人工序列
<220>
<223> BU12-孔：VH-Cκ-部分鉸鏈正向引子
<400> 110
<210> 111
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BU12-孔：VH-Cκ-部分鉸鏈反向引子
<400> 111
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BU12-孔：VL-部分VH-CH1-上鉸鏈正向引子
<400> 112
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BU12-孔：VL-部分VH-CH1-上鉸鏈反向引子
<400> 113
<210> 114
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BU12-孔：部分VL-hCH1引子正向
<400> 114
<210> 115
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：VH引子
<400> 115
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：VH-Cκ-部分鉸鏈正向引子
<400> 116
<210> 117
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：VH-Cκ-部分鉸鏈反向引子
<400> 117
<210> 118
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：VL-部分VH正向引子
<400> 118
<210> 119
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：VL-部分VH反向引子
<400> 119
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：VL正向引子
<400> 120
<210> 121
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：VL反向引子
<400> 121
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-Her2-孔：CH1-上鉸鏈反向引子
<400> 122
<210> 123
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b Bgl-VH-1正向引子
<400> 123
<210> 124
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-2反向引子
<400> 124
<210> 125
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-3正向引子
<400> 125
<210> 126
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-4反向引子
<400> 126
<210> 127
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-5正向引子
<400> 127
<210> 128
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-6反向引子
<400> 128
<210> 129
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-7正向引子
<400> 129
<210> 130
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-8
<400> 130
<210> 131
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-9(T93S)正向引子
<400> 131
<210> 132
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VH-10反向引子
<400> 132
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> homo 3' IgG2 CH1-SalI反向引子
<400> 133
<210> 134
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b sfi-VL-1正向引子
<400> 134
<210> 135
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-2反向引子
<400> 135
<210> 136
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-3正向引子
<400> 136
<210> 137
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-4反向引子
<400> 137
<210> 138
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-5正向引子
<400> 138
<210> 139
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-6反向引子
<400> 139
<210> 140
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-7正向引子
<400> 140
<210> 141
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-8反向引子
<400> 141
<210> 142
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-9正向引子
<400> 142
<210> 143
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2b VL-10反向引子
<400> 143
<210> 144
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> homo 3' Ck cys-XhoI反向引子
<400> 144
<210> 145
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH01正向引子
<400> 145
<210> 146
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH02反向引子
<400> 146
<210> 147
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH03正向引子
<400> 147
<210> 148
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH04反向引子
<400> 148
<210> 149
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH05正向引子
<400> 149
<210> 150
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH06反向引子
<400> 150
<210> 151
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH07正向引子
<400> 151
<210> 152
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH08反向引子
<400> 152
<210> 153
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH09正向引子
<400> 153
<210> 154
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VH10反向引子
<400> 154
<210> 155
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2-ahEGFR VH正向引子
<400> 155
<210> 156
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ahEGFR VH-stop-Cal反向引子
<400> 156
<210> 157
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL01正向引子
<400> 157
<210> 158
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL02反向引子
<400> 158
<210> 159
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL03正向引子
<400> 159
<210> 160
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL04反向引子
<400> 160
<210> 161
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL05正向引子
<400> 161
<210> 162
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL06反向引子
<400> 162
<210> 163
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL07正向引子
<400> 163
<210> 164
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL08反向引子
<400> 164
<210> 165
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL09正向引子
<400> 165
<210> 166
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h528VL10反向引子
<400> 166
<210> 167
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mfe-ahEGFR VL正向引子
<400> 167
<210> 168
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ahEGFR VL-(G4S)2反向引子
<400> 168
<210> 169
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sal-G-myc-G4S正向引子
<400> 169
<210> 170
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G2S-G4SX2-MfeI正向引子
<400> 170
<210> 171
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 scFv-stop-ClaI反向引子
<400> 171
<210> 172
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mfel-h15-2bVL正向引子
<400> 172
<210> 173
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h15-2bscFv-ClaI-Sbfl反向引子
<400> 173
<210> 174
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NaeI-X+hHB12bVL-1正向引子
<400> 174
<210> 175
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-2反向引子
<400> 175
<210> 176
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-3正向引子
<400> 176
<210> 177
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-4反向引子
<400> 177
<210> 178
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-5正向引子
<400> 178
<210> 179
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-6反向引子
<400> 179
<210> 180
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-7正向引子
<400> 180
<210> 181
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-8反向引子
<400> 181
<210> 182
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVL-9正向引子
<400> 182
<210> 183
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DraIII+hHB12bVL-10反向引子
<400> 183
<210> 184
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HpaI+hHB12bVH-1正向引子
<400> 184
<210> 185
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-2反向引子
<400> 185
<210> 186
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-3正向引子
<400> 186
<210> 187
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-4反向引子
<400> 187
<210> 188
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-5正向引子
<400> 188
<210> 189
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-6反向引子
<400> 189
<210> 190
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-7正向引子
<400> 190
<210> 191
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-8反向引子
<400> 191
<210> 192
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hHB12bVH-9正向引子
<400> 192
<210> 193
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApaI+hHB12bVH-10反向引子
<400> 193
<210> 194
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NaeI-X-aCD20VL-1正向引子
<400> 194
<210> 195
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-2反向引子
<400> 195
<210> 196
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-3正向引子
<400> 196
<210> 197
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-4反向引子
<400> 197
<210> 198
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-5正向引子
<400> 198
<210> 199
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-6反向引子
<400> 199
<210> 200
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-7正向引子
<400> 200
<210> 201
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-8反向引子
<400> 201
<210> 202
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VL-9正向引子
<400> 202
<210> 203
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DraIII-aCD20VL-10反向引子
<400> 203
<210> 204
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HpaI+aCD20VH-1正向引子
<400> 204
<210> 205
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-2反向引子
<400> 205
<210> 206
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VhH-3正向引子
<400> 206
<210> 207
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-4反向引子
<400> 207
<210> 208
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-5正向引子
<400> 208
<210> 209
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-6反向引子
<400> 209
<210> 210
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-7正向引子
<400> 210
<210> 211
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-8反向引子
<400> 211
<210> 212
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-9正向引子
<400> 212
<210> 213
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-10反向引子
<400> 213
<210> 214
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCD20VH-11正向引子
<400> 214
<210> 215
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApaI-aCD20VH-12反向引子
<400> 215
HR‧‧‧鉸鏈區(鉸鏈region)
VL‧‧‧可變輕鏈(variable light)
VH‧‧‧可變重鏈(variable heavy)
CL‧‧‧恆定輕鏈(constant light)
CH1‧‧‧恆定重鏈1(constant heavy1)
CH2‧‧‧恆定重鏈2(constant heavy2)
CH3‧‧‧恆定重鏈3(constant heavy3)

Claims (15)

  1. 一種對應聚乙二醇的主鏈及目標配位子之人類化雙功能抗體，包括：一與PEG結合之第一抗原結合位；及一與目標配位子結合之第二抗原結合位，其為任一EGFR、HER2、TAG-72或CD19；其中，該第一抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：1或9相同之第一VL-Ck結構域及一至少90%與SEQ ID NO：2或10相同之第一VH-CH1結構域；且該第二抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：5、7、8、11、15或16相同之單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之人類化雙功能抗體，其中第一抗原結合位進一步包括一至少90%與SEQ ID NO：3相同置於該第一VH-CH1結構域及該scFv之間的第一HR-CH2-CH3結構域。
  3. 一種對應聚乙二醇的主鏈及目標配位子之人類化雙功能抗體，包括：一與PEG結合之第一抗原結合位；及一與目標配位子結合之第二抗原結合位，其為CD19或HER2；其中，該第一抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：9相同之第一VL-Ck結構域、一至少90%與SEQ ID NO：10相同之第一VH-CH1結構域及一 至少90%與SEQ ID NO：22相同之第一HR-CH2-CH3結構域；該第二抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：23或26相同之第二VL-CH1結構域、一至少90%與SEQ ID NO：24或27相同之第二VL-Ck結構域及一至少90%與SEQ ID NO：25相同之第二HR-CH2-CH3結構域。
  4. 一種對應聚乙二醇的末端甲氧基或羥基及目標配位子之人類化雙功能抗體，包括：一與PEG結合之第一抗原結合位；及一與目標配位子結合之第二抗原結合位，其為CD19或HER2；其中，該第一抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：12相同之第一VL-Ck結構域、一至少90%與SEQ ID NO：13相同之第一VH-CH1結構域及一至少90%與SEQ ID NO：22相同之第一HR-CH2-CH3結構域；該第二抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：23或26相同之第二VL-CH1結構域、一至少90%與SEQ ID NO：24或27相同之第二VL-Ck結構域及一至少90%與SEQ ID NO：25相同之第二HR-CH2-CH3結構域。
  5. 一種對應聚乙二醇的末端甲氧基或羥基及目標配位子之人類化雙功能抗體，包括：一與PEG結合之第一抗原結合位；及一與目標配位子結合之第二抗原結合位，其為HER2或EGFR；其中， 該第一抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：12相同之第一VL-Ck結構域、該至少90%與SEQ ID NO：13相同之第一VH-CH1結構域及該至少90%與SEQ ID NO：22相同之第一HR-CH2-CH3結構域；且該第二抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：15或16相同之人類化單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)。
  6. 一種對應聚乙二醇的末端甲氧基或羥基及目標配位子之人類化雙功能抗體，包括：一與PEG結合之第一抗原結合位；及一與目標配位子結合之第二抗原結合位，其為CD19或CD20；其中，該第一抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：17相同之人類化單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)；且該第二抗原結合位，包括一至少90%與SEQ ID NO：21相同之第一VL-Ck結構域及一至少90%與SEQ ID NO：20相同之第一VH-CH1結構域。
  7. 一種藥物套組，包括申請專利範圍第1至6項中的任一人類化雙功能抗體；和一聚乙二醇化的物質，其中該物質係一蛋白質、一胜肽或一含化學療劑或顯影劑的奈米粒子的任一。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之藥物套組，其中化學療劑為阿德力黴素(adriamycin)、阿米福汀(amifostine)、博來黴素(bleomycin)、硫酸布 他卡因(busulfan)、順鉑(cisplatin)、卡鉑定(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、喜樹鹼(camptothecin)、CPT-11、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、達卡巴仁(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、依妥普賽(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，氟尿苷(floxuridine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基尿素(hydroxyurea)、依弗醯胺(ifosfamide)、艾達魯比辛(idarubicin)、干擾素β(interferon beta)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、L-天門冬醯胺酶(L-asparaginase)、L-天門冬胺酸(L-aspartic acid)、環己亞硝脲(lomustine)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)絲裂霉素(mitomycin)、胺甲喋呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、美皆斯妥(megestrol)、黴法蘭(melphalan)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、米托坦(mitotane)、紫杉醇(paclitaxel，taxol)，普卡黴素(plicamycin)、噴司他丁(pentostatin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、托泊替康(topotecan)、他莫昔芬(tamoxifen)、坦尼坡賽(teniposide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、SN38或其的組合。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之藥物套組，其中該顯影劑是一量子點(quantum dot，QD)、一微泡造影劑(microbubble contrast agent)、一螢光染劑、一螯合放射性同位素、一順磁鐵或一金奈米粒子。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之藥物套組，其中該蛋白質係任一趨化介素(chemokine)或一細胞生長激素(cytokine)；及該胜肽係柳菩林(leuprolide)、諾雷德(goserelin)、善得定(octreotide)、組氨瑞林(histrelin)、阿巴瑞克(abarelix)、欣得泰(cetrorelix)、地加瑞克(degarelix)、西侖吉肽(cilengtide)、ATN-161、或IM862。
  11. 一種用於製備治療癌症用途的藥物組合，其中該藥物組合包含申請專利範圍第1至6之任一人類化雙功能抗體之第一量與一聚乙二醇化的物質之第二量之混合物；其中該混合物形成一組件(assembly)及該治療癌症係抑制癌症之生長或轉移；該聚乙二醇化的物質係治療性的並為一蛋白質、一胜肽、一其他含有化療劑之奈米粒子。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中化學療劑為阿德力黴素(adriamycin)、阿米福汀(amifostine)、博來黴素(bleomycin)、硫酸布他卡因(busulfan)、順鉑(cisplatin)、卡鉑定(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、喜樹鹼(camptothecin)、CPT-11、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、環磷醯胺((cyclophosphamide)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、達卡 巴仁(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、依妥普賽(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，氟尿苷(floxuridine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基尿素(hydroxyurea)、依弗醯胺(ifosfamide)、艾達魯比辛(idarubicin)、干擾素β(interferon beta)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、L-天門冬醯胺酶(L-asparaginase)、L-天門冬胺酸(L-aspartic acid)、環己亞硝脲(lomustine)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)絲裂霉素(mitomycin)、胺甲喋呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、美皆斯妥(megestrol)、黴法蘭(melphalan)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、米托坦(mitotane)、紫杉醇(paclitaxel，taxol)，普卡黴素(plicamycin)、噴司他丁(pentostatin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、托泊替康(topotecan)、他莫昔芬(tamoxifen)、坦尼坡賽(teniposide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、SN38(SN38)或其的組合。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該蛋白質係任一趨化介素(chemokine)或一細胞生長激素(cytokine)；及該胜肽係柳菩林(leuprolide)、諾雷德(goserelin)、善得定(octreotide)、組氨瑞林(histrelin)、阿巴瑞克(abarelix)、欣得泰(cetrorelix)、地加瑞克(degarelix)、西侖吉肽(cilengtide)、ATN-161、或IM862。
  14. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該癌症係乳腺癌、大腸直腸癌、結腸癌、肝癌、結腸、非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、 淋巴瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、腦腫瘤出、視網膜母細胞瘤卵巢癌、子宮頸癌、造血系統惡性腫瘤、食道癌、腎細胞癌、鱗狀細胞癌、神經膠質瘤和白血病。
  15. 一種顯影劑，包含第一足夠量之申請專利範圍第1至6項中任一項之人類化雙功能抗體與第二足夠量之一聚乙二醇化之造影劑的混合物；其中該混合物形成一組件(assembly)及該組裝係製備用於注射一個體及透過螢光成像、電子自旋共振(ESR)成像，X射線成像，電腦斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)成像該個體之組織。
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