JP2017527522A - 二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2A
Description
「抗体」という語は、広義で用いられ、具体的には所望の生物活性を示しさえすれば、すなわち、タンパク質及び/または他の分子の複合混合物における標的抗原を選択的に認識して、抗原に特異的に結合しさえすれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例、二重特異性抗体)、及び抗体断片を包含するものである。
したがって、本開示の第1の態様は、非標的ペグ化物質を腫瘍標的ペグ化物質に変換する二重特異性抗体(BsAb)を提供することであり、これにより癌の増殖を抑制するか、または薬剤耐性癌を含む癌の浸潤または転移を妨げる。
抗体は、IgG、IgA、IgE、IgM及びIgDを含むタンパク質の免疫グロブリンクラスに分けられる。血清に存在する最も豊富な免疫グロブリンはIgGであり、その概略構造を図1に示す。IgG構造は軽鎖2本及び重鎖2本の4本鎖を有し、各軽鎖は2つのドメイン、各重鎖は4つのドメインを有する。抗原結合部位は、軽鎖可変(VL)及び重鎖可変(VH)ドメイン、並びに軽鎖定常(CL)及び重鎖定常(CH1)ドメインを含有する抗原結合性断片(Fab)領域に位置する。重鎖のCH2及びCH3ドメイン領域は、結晶化フラグメント(Fc)領域と呼ばれる。したがって、全長抗体の重鎖は、N末端からC末端まで、VH、CH1、ヒンジ領域(HR)、CH2及びCH3からなるポリペプチドであり、VH−CH1−HR−CH2−CH3と略す。全長抗体の軽鎖は、N末端からC末端方向のVL及びCLに存在するポリペプチドであり、VL−CLと略す。CLにはκ(カッパ)またはλ(ラムダ)がある。IgGは、CLドメイン及びCH1ドメイン間と、2本の重鎖のヒンジ領域間のジスルフィド結合(−S−S−)で、共に保持された2本の重鎖を有するヘテロテトラマーとみなされる。
本開示のBsAbを調製する方法を実施例に記載する。ヒト化BsAbを調製するため、非ヒト(例えば、マウス)抗体を調製し、初期物質として用いる。関連技術を以下の項で簡単に記載する。
所望のモノクローナル抗体を作製するため、まずマウス、ラットまたはウサギなどの動物に、適当な量のmPEG誘導体化タンパク質(つまり、PEG分子が末端メトキシ基を有する)分子またはPEG誘導体化タンパク質(つまり、PEG分子が末端ヒドロキシル基を有する)で免疫を与える。一般に、mPEGまたはPEG誘導体化タンパク質で動物に免疫を与える場合、アジュバント及びmPEGまたはPEG誘導体化タンパク質溶液を共に混合する。本発明に有用なアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント(FCA)、不完全フロイントアジュバント(FIA)及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。一般に、免疫は主に抗原の静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射により行われる。免疫間隔は特に限定されない。免疫は、数日から数週間隔、好ましくは2〜3週間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回行ってよい。免疫の結果、1000倍に希釈した血清サンプル中の抗体力価が、吸光度レベルで2以上に達すれば、動物を約1か月間放置する。
非ヒト由来モノクローナル抗体の主要な懸案事項は、レシピエントに対する免疫原性であり、危険なアレルギー反応を引き起こすことがある。多くのモノクローナル抗体はマウス由来のものであり、ヒトに注射されたとき、免疫原性を有することがわかっている。本発明の抗mPEGまたは抗PEG mAbの免疫原性を低減するため、ヒト抗体の定常領域にマウス抗mPEGまたは抗PEG Abの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを接続することにより、ヒト化抗体を作製する。
BsAbを作製するため、第2.2項で上述したヒト化抗mPEGまたは抗PEG Ab(Fabまたは全長IgGのいずれかの形状)を、癌標的効果を与えるために、腫瘍抗原に結合する抗体またはscFvとさらに連結する。詳細な作製方法は実施例に記載する。
本開示の第2の態様は、転移性及び/または薬剤耐性癌を含む癌を治療または撮像するための医薬キットを提供することである。この医薬キットは、少なくとも2つの構成要素を含む。第1の構成要素は本開示のBsAbであり、第2の構成要素はペグ化物質であり、ペグ化物質内に癌治療剤(例えば、ビンカアルカロイド)またはイメージング剤(例えば、造影剤を含有する微小気泡または量子ドット)を含む。通常、各構成要素はそれぞれ別の容器に含有される。好ましくは、第1及び第2の構成要素はそれぞれ、乾燥固体状で、または生理学的に許容される水性担体の懸濁液として容器中に存在する。このキットは、注射前に乾燥構成要素を再構成するための生理食塩水など、生理学的に許容される水性担体を任意で含んでもよい。2つ構成要素を、それぞれの担体で別々に再構成した後、混合し、集合体を形成する。これを被験者に(例えば、注射により)投与する。
したがって、本開示の第3の態様は、転移性及び/または薬剤耐性癌を含む癌の標的化及び治療一段階法を提供することである。本方法は第3項に記載した医薬キットを利用しており、第2項に記載した単離したヒト化抗PEG二重特異性抗体(BsAb)をペグ化物質と混合して、集合体を形成し、被験者に投与する。あるいは、第2項に記載したヒト化BsAbをまず、被験者(例えば、ヒト)に注射し、その後ペグ化物質を注射する(データ図示せず)。
本開示の第4の態様は、生きている被験者の組織、特に癌の組織を撮像する方法を提供することである。また、本方法は、第2項に記載の単離したヒト化抗PEG二重特異性抗体(BsAb)をペグ化物質と混合して集合体を形成し被験者に投与する、第3項に記載した医薬キットを利用している。
細胞及び動物
本開示では、乳癌細胞系MCF−7、ヒトTリンパ球細胞系Jurkat、卵巣癌細胞系OVCAR−3、類表皮癌細胞系A431(EGFR+)(ATCC CRL1555)、Bリンパ球細胞系Raji(CD19+)(ATCC CCL86)、悪性黒色腫細胞系A−375、293FT細胞、Bリンパ芽球細胞系Ramos(CD19+)(ATCC CRL−1596)、SW480(EGFR+)、SW620ヒト結腸癌細胞、ヒト乳腺癌細胞系SKBR3(HER2+)、ヒト乳腺癌細胞系MDA−MB−468、BALB3T3細胞、及びGP2−293レトロウイルスパッケージング細胞を用いた。一般に、細胞を10%ウシ胎児血清(ハイクローン、ユタ州ローガン)、100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシン添加ダルベッコ改変イーグル培地(シグマ、米国ミズーリ州セントルイス)で、空気中37℃、5%CO2雰囲気で培養した。同じ補助剤を含有するが10%ウシ血清源を有するRPMI−1640で、A431、Raji及びRamos細胞を増殖した。
抗PEG Abを分泌するハイブリドーマ細胞を、上記のようにメスBALB/cマウスをmPEG由来タンパク質またはPEG由来タンパク質で免疫を与えることにより作製した(Suら、Bioconjugate Chemistry(2010)21(7)、1264〜1270)。その後、ハイブリドーマをELISAにより選別した。具体的には、96ウェルプレートを、5μL/ウェルの0.1M NaHCO3/Na2CO3中、1μg/ウェルのCH3−PEG750−NH2、NH2−PEG3000−NH2(シグマアルドリッチ)、またはCH3−PEG5000−NH2で37℃で3時間コートした後、200μL/ウェルの希釈緩衝液(PBS中2%スキムミルク)で、4℃で一晩ブロッキングした。50μLの2%スキムミルク中、段階的濃度の抗体を室温で1時間プレートに加えた。プレートをPBS−T(0.05%Tween−20含有PBS)で3回、PBSで2回洗浄した。50μL希釈緩衝液中のHRP共役ヤギ抗マウスIgMμ鎖(2μg/mL)またはHRP結合ロバ抗マウスIgG Fc(2μg/mL)を1時間加えた。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を100μL/ウェルのTMB基質溶液(バイオレジェンド、カリフォルニア州サンディエゴ)を室温で30分間加えることにより測定した。停止緩衝液(2N H2SO4、50μL/ウェル)添加後、吸光度(405nm)を読んだ。選択したハイブリドーマを、15%ウシ胎児血清(ハイクローン)添加HT培地(シグマアルドリッチ)を用いて、胸腺細胞であるフィーダー細胞を含有する96ウェルプレートにおいて、限界希釈により3回クローニングした後、E11、6−3及び15−2bの3つのハイブリドーマ細胞を作製した。E11及び6−3は抗PEG骨格Abを分泌し、一方15−2bは抗mPEG Abを分泌した。
抗PEGFabまたはIgGを基にしたBsAbを作製するため、抗PEG抗体のマウスVL及びVHドメインをE11、6−3及び15−2bハイブリドーマ細胞からそれぞれ調製したcDNAからクローニングした。抗PEG(hE11、h6−3)及び抗mPEG(h15−2b)抗体のヒト化VL及びVHドメインを、E11、h6−3及び15−25の軽重鎖可変領域遺伝子の相補性決定領域(CDR)をコードするDNA配列を、ヒトIgG VL及びVH遺伝子のフレームワーク領域に移植することにより作製し、残りのヒトIgG1定常領域遺伝子をコードするDNA配列と融合した。
ノブイントゥホールBsAbを構築するため、h15−2bまたはh6.3のVH−CH1を修飾ヒトIgG1のCH2−CH3ドメインと融合して、h15−2b−ノブまたはh6.3−ノブの重鎖をアセンブリPCRにより形成した。フーリン−2A(F2A)由来の配列、及びh15−2bまたはh6.3の軽鎖配列が次に続く重鎖配列を、NheI及びPmeI制限部位の使用により、レンチウイルスベクターのpLKOAS3W−hyg(RNAi core、台湾台北中央研究院)にクローニングした。我々は、CH1の位置及びヒンジ領域の修飾と併せて、免疫グロブリンドメイン交差手法を採用して、BU12−ホール及びα−HER2−ホールを作製した。簡単に述べると、重鎖のN末端で融合したヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)タグタンパク質を有するVH−部分CH1−Ck−部分ヒンジを、ヒトIgG1のCH2−CH3ドメインと融合して、新しい重鎖を形成する。α−HER2 AbまたはBU12のVL−CH1−部分ヒンジ配列を、F2A配列により新しい重鎖配列に連結し、レンチウイルスベクターのpLKOAS3W−pur(RNAi core、台湾台北中央研究院)に、SfiI及びPmeI制限部位を用いて、クローニングした。クローニングに用いたプライマーを表21に示した。
抗mPEG抗体のVL−Ck及びVH−CH1ドメインを15−2bハイブリドーマのcDNAからクローニングし、以前述べたように(Chuang K−Hら、J.Nucl.Med.2010(51):933〜941)ヒト化した。ヒト化抗mPEGのVL及びVH断片をアセンブリポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により合成し、それぞれ特異なBglII、SalI、SfiI、及びXhoI制限酵素部位で、レトロウイルスベクターのpLNCX−抗PEG−eB7にサブクローニングした。15−2b Fab配列をクローニングするプライマーを表22に挙げる。ヒト抗EGFR scFvを、h528Fv DNA配列を基にクローニングした(Makabeら、(2008)J.Biol.Chem、283、1156〜1166)。したがって、h528Fv DNA配列をアセンブリPCRにより作製した。抗EGFRのVH及びVLのクローニングに用いるプライマーを表23に挙げる。その後、Mfe−ahEGFR VLプライマー、ahEGFR VL−(G4S)2プライマー、(G4S)2−ahEGFR VHプライマー及びahEGFR VH−ストップ−Calプライマーを用いて、配列の前にmycタグ及び15アミノ酸(GGGGS)3可動性リンカーを含有するヒト抗EGFR scFVを作った。
PEG2xTAG72及びPEG2xDNS BsAbを安定して分泌するCHO−K1/PEG2xTAG72及びCHO−K1/PEG2xDNS細胞を、CHO−K1チャイニーズハムスター卵巣細胞のレトロウイルス形質導入により作製した。PEG2xTAG72、PEG2xEGFR、PEG2−HER2、PEGxTAG72、PEGxEGFR及びPEGxHER BsAbを、対応するプラスミドを用いた293FT細胞の一過性トランスフェクションにより作製した。h6.3FabxCD19及びh6.3FabxEGFR BsAbを安定して分泌した293FT/h6.3FabxCD19及び293FT/h6.3FabxEGFR細胞を、レンチウイルス形質導入により作製した。組換えレンチウイルス粒子を、10cm培養皿(培養密度90%)で増殖した293FT細胞において、TransIT−LT1トランスフェクション試薬(Mirus Bio、ウィスコンシン州マディソン)(45μL)を用いて、pAS3w.Ppuro−pAS3w.Ppuro−h6.3FabxCD19及びpAS3w.Ppuro−h6.3FabxEGFR(7.5μg)を、pCMVΔR8.91(6.75μg)及びpMD.G(0.75μg)と、共トランスフェクションすることによりパッケージングした。48時間後、レンチウイルス粒子を採取し、超遠心分離(ベックマンSW41Ti超遠心スイングバケットロータ、50,000g、1.5時間、4℃)により濃縮した。レンチウイルス粒子を5μg/mLポリブレン含有培養培地に懸濁し、0.45μmフィルタでろ過した。293FT細胞をウイルス感染の1日前に6ウェルプレートに播種(1x105細胞/ウェル)した。レンチウイルス含有培地を細胞に添加した後、1.5時間遠心分離した(500g、32℃)。細胞をピューロマイシン(5μg/mL)で選択して、安定細胞株を作製した。これらの抗PEG BsAbを、TALONカラムでアフィニティクロマトグラフィにより精製した。簡単に述べると、培地を7〜10日ごとに、CELLine接着性細胞用1000バイオリアクター(インテグラバイオサイエンス社、スイス)から採取した。ポリヒスチジンタグBsAbを、Co2+−TALONカラム(GEヘルスケアライフサイエンス、ニュージャージー州ピスカタウェイ)で精製した。カラムを5倍ベッド体積の結合緩衝液(0.3M NaCl/20mMリン酸塩/HCl、pH7.4)の後、10倍ベッド体積の洗浄緩衝液(0.3M NaCl/20mMリン酸塩/5mMイミダゾール/HCl、pH7.4)で洗浄した。これらのポリヒスチジンタグBsAbを溶出緩衝液(0.3M NaCl/20mMリン酸塩/150mMイミダゾール/HCl、pH7.4)で溶出した。溶出したタンパク質をセファデックスG−25で脱塩し、PBSで平衡化し、限外ろ過により濃縮した。タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質定量法(ピアス、米国イリノイ州ロックフォード)により判断した。
所望のBsAbを作製するため、BALV 3T3プロデューサー細胞を、上記本発明のプラスミドでトランスフェクションし、続いてMoFlo(登録商標)XDP(ベックマンコールター社、カリフォルニア州ブレア)で、FACSにより4℃で分類した後、1%CCS DMEMを含むCELLine(インテグラバイオサイエンス社、スイスツィツァース)で培養した。培養培地採取後、BsAbをmPEGアフィニティクロマトグラフィにより精製した。mPEGアフィニティクロマトグラフィは、36mgのo−(2−アミノエチル)−o’−メチルポリエチレングリコール750(フルカ−シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)を1gのCNBr活性化セファロース(登録商標)4B(GEヘルスケア、英国リトルチャルフォント)に結合することにより生成した。この手順をCNBr活性化セファロース(登録商標)4B(GEヘルスケア)の取扱説明書に従って行った。
BsAbを安定して発現する293FT細胞を、開始細胞数5x107で、10%低ウシIgG培地(血清をプロテインAレジンで前吸収した)を含むDMEMで、CELLine接着性細胞用1000(インテグラバイオサイエンス社、スイスツィツァース)を用いて培養した。培養上清を毎週採取した。集めた上清を800g、10分4℃で遠心分離して細胞を除去し、続いて15000rpm、25分4℃で遠心分離して細胞残屑を除去した。その後、上清をリン酸緩衝食塩水(PBS)中で、0.45μMフィルタ及びG25カラムを通過させ、最後にプロテインAセファロースを用いてBsAbをアフィニティ精製した。プロテインA精製後、CNBr活性化セファロース(登録商標)4Bの1gあたり35mgのメチル−PEG1000−NH2を結合させたCNBr活性化セファロース(登録商標)4B(シグマアルドリッチ化学社、米国ミズーリ州セントルイス)を用いたアフィニティクロマトグラフィにより、精製物をさらに精製した。続いて、精製したBsAbをピアス抗HAアガロース(サーモサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州)を用いたアフィニティクロマトグラフィによりさらに精製した。精製したBsAb画分を3回1000倍体積のPBSに対して透析し、アミコンウルトラ(30kDカットオフ)(ミリポア)を用いて濃縮した。
BsAb(PEG2xTAG72、PEG2xDNS、mPEGxEGFR、mPEGxHER2、mPEGxDNS、15−2b/BU12、h6.3/BU12、h6.3FabxEGFR及びh6.3FabxCD19のBsAbなど)5マイクログラムを、還元または非還元条件下、10%SDS−PAGEゲルで電気泳動した後、クマシーブルーで染色した。
BsAbの抗PEG結合特異性を、50μLの2%スキムミルク中、段階的濃度のPEG2xTAG72、PEG2xDNS、hCC49 scFv、h6.3FabxEGFRまたはh6.3FabxCD19を、ムチン、BSA−PEG5000、NH2−PEG3k−NH2またはBSAでコートしたプレートに室温で1時間加えることにより測定した。プレートをPBS−T(0.05%Tween−20含有PBS)で3回洗浄した。50μL希釈緩衝液中のHRP結合ヤギ抗ウサギ(2μg/mL)またはHRP結合ヤギIg抗ヒトIgG Fab(2μg/mL)(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルベニア州ウェストグローブ)を含むウサギ抗6xHis(2μg/mL)を1時間室温で加えた。プレートをPBS−T(0.05%Tween−20含有PBS)で3回、PBSで2回洗浄した。結合ペルオキシダーゼ活性を、150μL/ウェルのABTS基質溶液(バイオレジェンド、カリフォルニア州サンディエゴ)を30分間室温で加えることにより測定した。ウェルの吸光度(405nm)をマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス、カリフォルニア州メンローパーク)で測定した。
PEG2xTAG72または対照のPEG2xDNSのBsAb(10μg/mL)を、A−375(TAG72−)、MCF−7(TAG72+)、Jurkat(TAG72+)またはOVCAR−3(TAG72+)細胞と4℃で30分、続いてFITC標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンの第2抗体(2μg/mL)(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルバニア州ウェストグローブ)またはFITC標識4アームPEG(2μg/mL)と培養した。また、ペグ化化合物の腫瘍特異的標的化を、0.05%BSA含有PBS(染色緩衝液)中、10μg/mLのh6.3FabxEGFRまたはh6.3FabxCD19のBsAbでA431(EGFRhigh)及びRaji(CD19high)細胞系を4℃で30分染色することにより調べた。細胞を冷PBSで3回洗浄した。染色緩衝液中のPEG−Qdot655(8nM)(インビトロジェン、ニューヨーク州グランドアイランド)またはPEG−リポソーム化テキサスレッド(100nmサイズ、50μM、液体濃縮)(フォーミュマックスサイエンティフィック、カリフォルニア州パロアルト)を、30分間4℃で細胞に加えた。Raji細胞(CD19+)またはSKBR3細胞(HER2+)を、10μg/mlのh15−2b−ノブ/BU12−ホール、h15−2b−ノブ/抗HER2−ホール、h6−3−ノブ/BU12−ホールまたはh6−3−ノブ/抗HER2−ホールのBsAbと培養、洗浄し、0.25μg/mlのFITC標識ヤギ抗ヒトIgGまたは10nMメトキシ−PEG Qdot655と4℃で30分間培養した。冷PBSで洗浄後、104生存細胞の表面蛍光をFACScaliberフローサイトメーター(ベクトンディッキソン、米国カリフォルニア州マウンテンビュー)で測定した後、Flowjo(ツリースター社、米国カリフォルニア州サンカルロス)で分析した。
POCチャンバのカバースリップ(30mm)を、PBS中10μg/mLのポリ−L−リシンで30分間室温でコートした。カバースリップをPBSで2回洗浄した後、A431(EGFR+)腫瘍細胞を5x104細胞/チャンバでカバースリップ上に播種した。A431細胞を1μg/mLのヘキスト33342及び100nMのLysoTracker(登録商標)Red DND−99(インビトロジェンライフテクノロジー社、米国ニューヨーク)を含有する10μg/mLのh6.3FabxEGFRまたはh6.3FabxCD19のBsAbと37℃で30分間培養した。細胞を培養培地で2回洗浄した。16nMのPEG−Qdot655溶液(インビトロジェンライフテクノロジー社、米国ニューヨーク)を加えた後、細胞イメージングをAxiovert 200M共焦点顕微鏡(カールツァイス、ニューヨーク州ソーンウッド)で記録した。
A431(EGFRhigh)及びRaji(CD19high)細胞(5000細胞/ウェル)を96ウェルプレートに一晩播種した。15μg/mLのh6.3FabxEGFRまたはh6.3FabxCD19のBsAbを、これらの細胞に30分間37℃で加え、続いて段階的濃度の遊離ドキソルビシンまたはペグ化リポソーム化ドキソルビシン(ドキシソーム(商標登録)、台湾リポソーム社、台湾台北)をこれらの細胞に3連で、37℃で4時間加えた。続いて、細胞を1度洗浄し、新鮮な培養培地でさらに48時間培養した後、3H−チミジン(1μCi/ウェル)で16時間パルスした。結果を未処理細胞と比較した細胞DNAへの3Hチミジン取り込みの阻害割合として表す。
後肢領域にRamos(CD19+)及びA431(EGFR+)腫瘍(〜250mm3)を有するBALB/cヌードマウスを、h6.3FabxEGFR(50μg)及びPEG−NIR791(50μg)を用いて、静脈内注射した。ペントバルビタール麻酔したマウスを、IVISスペクトル光学イメージングシステム(励起745nm、放射840nm、パーキンエルマー社、米国マサチューセッツ州)で、注射後45分、24時間及び48時間に順次撮像した。
SW480またはSW620細胞を1mg/mlのエルビタックス、続いて1mg/mlのFITC結合ヤギ抗ヒトIgG Fc(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルバニア州ウェストグローブ)を用いて4℃で染色することにより、EGFR発現を測定した。同じ手順を用いて、1mg/mlのハーセプチン、続いて1mg/mlFITC結合ヤギ抗ヒトIgG Fcにより染色したSK−BR−3またはMDA−MB−468細胞のHER2発現を測定した。氷冷PBSを用いて充分に洗浄後、生存細胞の表面免疫蛍光をFACScanフローサイトメーター(BDバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ)で測定し、蛍光強度をCellquestプロソフトウェア(BDバイオサイエンス)で分析した。
96ウェルプレートをPBS中ポリ−L−リシン(40μg/ml)を用いて、2μg/ウェルで5分間室温でコートし、PBSで2回洗浄した後、SW480(EGFR+)またはSK−BR−3(HER2+)腫瘍細胞を用いて、2x105細胞/ウェルでコートした。PEGxEGFR、PEGxHER2及びPEGxDNS(10μg/ml)を、室温で1時間ウェルに添加した。その後、ウェルをDMEMで3回洗浄し、200ng/mlのLipo/DOX、66.7ng/mlのLipo/IR780、100ng/mlのSN38/PM、600ng/mlのFeOdot、0.5nMのAuNP及び0.5nMのQdot565nmを20分間、ウェルに加えた。DMEMで十分に洗浄後、5μg/mlの抗PEG骨格Ab(6−3ハイブリドーマ由来の6−3Ab)を1時間加え、その後3回DMEM洗浄することにより、PEG−NPの濃度を判断した。信号を増幅するため、0.4μg/mlのヤギ抗マウスIgG Fc−HRP(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社、米国ペンシルベニア州)をウェルに加えた。DMEM、続いてABTS基質でウェルを4回洗浄した後、405nmの吸光度値をマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス、米国カリフォルニア州メンローパーク)で測定した。
BSA/PBS緩衝液(1xPBS緩衝液中0.05%BSA)中のPEG−NPに、タンパク質/PEG−NP比が380〜570μgBsAb/1μmolドキソルビシン(Lipo/DOX)、550μgBsAb/1μmolFeOdot及び140ngBsAb/1pmolQdotで、BsAbを4℃で1時間添加した。PEGxEGFRまたはPEGxHER2修飾後、PEG−NPは、αEGFR−NPまたはαHER2−NPとなった。
96穴プレートをPBS中ポリ−L−リシン(40μg/ml)を用いて、2μg/ウェルで5分間室温でコートし、PBSで2回洗浄した後、SW480(EGFR+)、SW620(EGFR−)、SK−BR−3(HER2+)またはMDA−MB−468(HER2−)腫瘍細胞を用いて、2x105細胞/ウェルでコートした。SW480(EGFR+)及びSW620(EGFR−)細胞を、4μg/mlのαEGFR−Lipo/DOX、1μg/mlのαEGFR−Lipo/IR780及び4μg/mlのFeOdotと20分間培養した。DMEMを用いて充分に洗浄後、5μg/mlの抗PEG骨格Ab(6−3Ab)を1時間加え、DMEM洗浄を3回行うことにより、ペグ化NPの濃度を判断した。信号を増幅するため、0.4μg/mlのヤギ抗マウスIgG Fc−HRP(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社、米国ペンシルベニア州)をウェルに添加した。DMEMでウェルを洗浄後、ABTS基質を加え、405nmの吸光度値をマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス、米国カリフォルニア州メンローパーク)で測定した。同じ手順で、4μg/mlのαHER2−Lipo/DOX、4μg/mlのFeOdot及び2nMのαEGFR−Qdot565nmで20分間染色したSK−BR−3(HER2+)及びMDA−MB−468(HER2−)細胞を調べた。
12ウェルプレートの円形カバースリップ(18mm)を、PBS中ポリ−L−リシン(40μg/ml)を用いて、20μg/ウェルで5分間室温でコートした。カバースリップをPBSで2回洗浄した後、SW480(EGFR+)、SW620(EGFR−)、SK−BR−3(HER2+)またはMDA−MB−468(HER2−)腫瘍細胞を4x104細胞/ウェルで、カバースリップにコートした。SW480(EGFR+)及びSW620細胞(EGFR−)を、300ng/mlのαEGFR−Lipo/Rho及びαDNS−Lipo/Rhoと、37℃で1時間培養した。細胞をPBS中2%パラホルムアルデヒドで、30分4℃で固定し、DAPIを用いて、45分4℃で染色した。その後、カバースリップをPBSで4回洗浄した後、顕微鏡ガラススライド上に蛍光封入剤(ダコ、デンマークグロストルプ)で封入した。αEGFR−Lipo/Rho及びαDNS−Lipo/Rhoの蛍光信号をオリンパスFluoView(登録商標)FV1000共焦点顕微鏡(オリンパスイメージングアメリカ社、ペンシルベニア州センターバレー)で記録した。同じ手順で、それぞれ4nMのαHER2−Qdot565nm及びαDNS−Qdot565nmで染色したSK−BR−3(HER2+)及びMDA−MB−468(HER2−)細胞を撮像した。
MRイメージングを、臨床3.0T MR画像装置(シグナ、GEヘルスケア、英国リトルチャルフォント)を用いて実施した。1x107SW480(EGFR+)またはSW620(EGFR−)細胞を異なる濃度のαEGFR−FeOdotまたはαDNS−FeOdot(7μM、14μM及び28μM)と共に、4℃で30分間培養した。細胞をPBSで3回洗浄した後、BsAb−FeOdotの蓄積をT2強調高速スピンエコーシーケンス(TR/TE=2500ミリ秒/60ミリ秒)によりスキャンした。同じプロトコールを用いて、SK−BR−3(HER2+)及びMDA−MB−468(HER2−)細胞でのαHER2−FeOdot及びαDNS−FeOdotの局在を調べた。
SW480(EGFR+)及びSW620(EGFR−)細胞(3x103/ウェル)を96ウェルプレートに播種した。2μg/mlまたは4μg/mlのαEGFR−Lipo/DOX、αDNS−Lipo/DOX、及びLipo/DOXを各ウェルに加え、37℃で1時間培養した。培地を補給し、72時間細胞を培養した後、細胞の生存をATPlite(登録商標)発光測定システム(パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム)で測定した。αHER2−Lipo/DOX、αDNS−Lipo/DOXまたはLipo/DOXと37℃で3時間培養したSK−BR−3(HER2+)またはMDA−MB−468(HER2−)細胞の生存を、同じ手順に従って測定した。結果を未処理細胞と比較した発光阻害割合として、以下の式、阻害%=100x(処理発光/未処理発光)により表した。各データ点の標準偏差は、3サンプル(n=3)の平均を取った。
後肢領域にSW480(EGFR+)及びSW620(EGFR−)腫瘍(約100mm3)を有するBALB/cヌードマウスを、それぞれαEGFR−Lipo/IR780、αDNS−Lipo/IR780及びLipo/IR780(100μg/マウス)で静脈内注射した。ペントバルビタール麻酔したマウスを、IVISスペクトル光学イメージングシステム(励起745nm、放射840nm、パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム)で、注射後24、48及び72時間に順次撮像した。
BALB/cヌードマウス(n=6)を、後肢領域に4x106SW480(EGFR+)細胞及び1x106SW620(EGFR−)細胞で皮下接種した。腫瘍サイズが約20mm3に達した後、Lipo/DOX、αDNS−Lipo/DOX及びαEGFR−Lipo/DOXを5mgDOX/kgで3週間、1週間に1回、総量15mgDOX/kgで、静脈内投与した。他の処置群は生理食塩水を包含した。腫瘍測定をキャリパーを用いて1週間に3回実施し、腫瘍サイズを(長さx幅x高さ)/2の式を用いて計算した。マウスの体重を1週間に1回測定して、毒性を調べた。
平均値差の統計的有意性をノンパラメトリックマンホイットニー検定を用いて、JMP9.0ソフトウェア(SAS Institute社、ノースカロライナ州ケーリー)で推定した。細胞毒性分析及びin vivo毒性におけるP値<0.05と、in vivo処理におけるP値<0.01を、統計的に有意であるとみなした。
1.1 マウス抗mPEGまたは抗PEG Abの作製
ヒト化BsAbを作製するため、E11、15−2b及び6−3の3つのハイブリドーマ細胞を確認し、それぞれのモノクローナルAbをアフィニティクロマトグラフィーにより採取した。その後、固定化PEGに対する採取された抗体の結合特異性を判断した。ハイブリドーマ15−2bにより産生したモノクローナル抗体及びPEG間の典型的な結合特異性を図4に示す。
二重特異性を持つヒト化Abを作製するため、材料及び方法項に記載した手順に従って、実施例1.1のマウス抗mPEG mAbのDNA配列をヒト化し、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG−72)抗原(hcc49 scFv)またはダンシル(DNS)ハプテンに対するヒト化単鎖抗体断片遺伝子と融合した。
実施例1.2のヒト化hE11 BsAbの二官能活性を本実施例で調べた。
他の細胞内標的を抗PEG BsAbにより標的とできるかどうかを評価するため、実施例1.2と類似の手順により、上皮成長因子受容体(EGFR)及びHER2抗原に対する単鎖抗体断片遺伝子を、ヒト化E11抗体の重鎖CH3領域遺伝子のC末端に融合して、それぞれPEG2xEGFR及びPEG2xHER2を作製した。
2.1 一価抗PEG(E11)BsAbの作製及び特性評価
抗PEG抗体E11由来のヒト化抗体のFab断片を、腫瘍関連抗原に特異性を持つ単鎖抗体に融合することにより、一価抗PEG BsAbを作製した。具体的には、hE11Fab断片を、抗TAG72、抗EGFR(上皮成長因子受容体)または抗HER2/Neu抗体由来の単鎖抗体断片(scFv)と融合した(図9)。一価BsAbを安定して発現するCHO細胞を作製し、各発現細胞系の培養培地を採取した。
ヒト化抗PEG(h6.3)Fabを、「材料及び方法」項に記載した手順に従って、VL−Ck及びVH−CH1をF2A(フーリン−2A)ペプチドリンカーと融合し、別々に軽鎖及び重鎖を発現させることにより、単一のオープンリーディングフレームとして構築した。単鎖ジスルフィド安定化可変断片(dsFv)を、ペプチドリンカーを介して、6.3FabのCH1ドメインのC末端に連結して、h6.3−11F8(h6−3FabxEGFR)BsAb及びh6.3−hBU12(h6.3FabxCD19)BsAbを作製した(図13A)。その後、これら2個のBsAbをレンチウイルス発現ベクターに挿入して、安定293FTプロデューサー細胞株を作製した。培養培地から精製した(h6−3FabxEGFR及びh6.3FabxCD19を含む)BsAbは、10%SDS−PAGEで、予期した分子サイズを示した(図13B)。
本実施例において、材料及び方法項に記載した手順に従って、実施例1.1のマウス抗mPEG mAbのDNA配列をヒト化し、EGFRまたはHER2の単鎖可変断片(scFv)をコードする別の核酸と組み合わせた。
本実施例において、材料及び方法項に記載した手順に従って、マウス抗mPEG mAbのヒト化単鎖可変断片(scFv)を、CD19またはCD20のモノマーIgGをコードする別の核酸と組み合わせた。
3.1 ノブインホール抗PEG(h6.3またはh15.2b)抗HER2または抗CD19BsAbの作製
組換えDNA技術を用いて、抗HER2抗体(C6)または抗CD19抗体(BU12)、及びヒト化抗メトキシ−PEGモノクローナルh15−2bまたはヒト化抗PEG抗体h6.3のどちらかのVH及びVLのcDNAコーディング領域由来BsAbを、ヘテロダイマー形成及び適切な抗体の重鎖及び軽鎖集合体のため、「ノブイントゥホール」戦略及び免疫グロブリンドメイン交差手法を利用して作った。
本実施例において、実施例3.1の精製したノブインホールBsAbの二重特異性を検討した。簡潔に述べると、Ramos細胞(CD19+)及びSKBR3細胞(HER2+)を用いて、精製したBsAbがPEG化合物、及びCD19またはHER2/neu腫瘍抗原を発現する癌細胞の両方に結合することができるかどうかを確認した。簡潔に述べると、Ramos細胞(CD19+)、Raji細胞(CD19+)またはSKBR3細胞(HER2+)を、10μg/mlのh15−2b−ノブ/BU12−ホールまたはh15−2b−ノブ/抗HER2−ホールBsAbと培養、洗浄し、0.25μg/mlのFITC標識ヤギ抗ヒトIgGまたは10nMメトキシ−PEG Qdot655と4℃で30分間培養した。生存細胞の表面蛍光をFACSCaliburで測定した。結果を図25〜28に示す。
4.1 ハーセプチン/h−α−PEG及びエルビタックス/h−αPEGのAbの作製
相乗的に癌細胞を攻撃することができる試剤を作るため、機能的ヒト化抗PEG単鎖Ab(h−αPEG scFv)を、市販の標的抗体(ハーセプチン及びエルビタックスを含む)のC末端に融合して、二官能のハーセプチン/h−αPEG、及びエルビタックス/h−αPEGのAbを形成した(図29)。したがって、ハーセプチン及び/またはエルビタックス抗体の元の抗癌作用が保持されているだけでなく、新規で作製したBsAbが腫瘍部位でペグ化薬剤に活発に結合することができ相乗的な抗癌作用(つまり、二重攻撃戦略)を生じる。
本実施例において、実施例4.1のBsAbの二官能活性を検討した。簡単に述べると、HER2/c−erb−2遺伝子産物を過剰発現するSKBR3ヒト乳腺癌細胞を、96ウェルマイクロタイタープレートにコートし、その後ハーセプチン/h−αPEG抗体及び対照のハーセプチン抗体をマイクロタイタープレートに添加した。非結合の二官能抗体を洗い流した後、ドキソルビシンを含有するペグ化リポソーム(ここでは、Lipo/DOX)をウェルに添加した。ペグ化化合物の結合をELISAにより判断した。
Claims (15)
- ポリエチレングリコール(PEG)骨格及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記PEGに結合する第1の抗原結合部位と、
EGFR、HER2、TAG−72またはCD19のいずれかである前記標的リガンドに結合する第2の抗原結合部位と、を含み、
前記第1の抗原結合部位が、配列番号1または9と少なくとも90%同一である第1のVL−Ckドメイン、及び配列番号2または10と少なくとも90%同一である第1のVH−CH1ドメインを含み、
前記第2の抗原結合部位が、配列番号5、7、8、11、15または16と少なくとも90%同一である単鎖可変断片(scFv)を含む、ヒト化二重特異性抗体。 - 前記第1の抗原結合部位が、前記第1のVH−CH1ドメイン及び前記scFv間に配置された、配列番号3と少なくとも90%同一である第1のHR−CH2−CH3ドメインをさらに含む、請求項1に記載のヒト化二重特異性抗体。
- ポリエチレングリコール(PEG)骨格及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記PEGに結合する第1の抗原結合部位と、
CD19またはHER2である前記標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位と、を含み、
前記第1の抗原結合部位が、配列番号9と少なくとも90%同一である第1のVL−Ckドメイン、配列番号10と少なくとも90%同一である第1のVH−CH1ドメイン、及び配列番号22と少なくとも90%同一である第1のHR−CH2−CH3ドメインを含み、
前記第2の抗原結合部位が、配列番号23または26と少なくとも90%同一である第2のVL−CH1ドメイン、配列番号24または27と少なくとも90%同一である第2のVL−Ckドメイン、及び配列番号25と少なくとも90%同一である第2のHR−CH2−CH3ドメインを含む、ヒト化二重特異性抗体。 - ポリエチレングリコール(PEG)の末端メトキシまたはヒドロキシル基及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記PEGに結合する第1の抗原結合部位と、
HER2またはCD19である前記標的リガンドに結合する第2の抗原結合部位と、を含み、
前記第1の抗原結合部位が、配列番号12と少なくとも90%同一である第1のVL−Ckドメイン、配列番号13と少なくとも90%同一である第1のVH−CH1ドメイン、及び配列番号22と少なくとも90%同一である第1のHR−CH2−CH3ドメインを含み、
前記第2の抗原結合部位が、配列番号23または26と少なくも90%同一である第2のVL−CH1ドメイン、配列番号24または27と少なくとも90%同一である第2のVH−Ckドメイン、及び配列番号25と少なくとも90%同一である第2のHR−CH2−CH3ドメインを含む、ヒト化二重特異性抗体。 - ポリエチレングリコール(PEG)の末端メトキシまたはヒドロキシル基及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記PEGに結合する第1の抗原結合部位と、
HER2またはEGFRである前記標的リガンドに結合する第2の抗原結合部位と、を含み、
前記第1の抗原結合部位が、配列番号12と少なくとも90%同一である前記第1のVL−Ckドメイン、配列番号13と少なくとも90%同一である前記第1のVH−CH1ドメイン、及び配列番号22と少なくとも90%同一である前記第1のHR−CH2−CH3ドメインを含み、
前記第2の抗原結合部位が、配列番号15または16と少なくとも90%同一であるヒト化単鎖可変断片(scFv)を含む、ヒト化二重特異性抗体。 - ポリエチレングリコール(PEG)の末端メトキシまたはヒドロキシル基及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記PEGに結合する第1の抗原結合部位と、
CD19またはCD20である前記標的タンパク質に結合する第2の抗原結合部位と、を含み、
前記第1の抗原結合部位が、配列番号17と少なくとも90%同一であるヒト化単鎖可変断片(scFv)を含み、
前記第2の抗原結合部位が、配列番号21と少なくとも90%同一である第1のVL−Ckドメイン、及び配列番号20と少なくとも90%同一である第1のVH−CH1ドメインを含む、ヒト化二重特異性抗体。 - 請求項1〜6のいずれかに記載のヒト化二重特異性抗体、及びペグ化物質を含む医薬キットであって、前記物質がタンパク質、ペプチド、または化学療法薬もしくはイメージング剤を含有するナノ粒子のいずれかである、医薬キット。
- 前記化学療法薬が、アドリアマイシン、アミフォスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カンプトテシン、CPT−11、シトシンアラビノシド、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、エトポシド、5−フルオロウラシル(5−FU)、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、インターフェロンベータ、イリノテカン、L−アスパラギナーゼ、L−アスパラギン酸、ロムスチン、メクロレタミン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ミトタン、パクリタキセル(タキソール)、プリカマイシン、ペントスタチン、ストレプトゾシン、トポテカン、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、SN38またはその組合せのいずれかである、請求項7に記載の医薬キット。
- 前記イメージング剤が、量子ドット(QD)、マイクロバブル造影剤、蛍光色素、キレート化された放射性同位体、常磁性鉄または金ナノ粒子である、請求項7に記載の医薬キット。
- 前記タンパク質がケモカインまたはサイトカインであり、前記ペプチドがロイプロリド、ゴセレリン、オクトレオチド、ヒストレリン、アバレリクス、セトロレリクス、デガレリクス、シレンジタイド、ATN−161、またはIM862のいずれかである、請求項7に記載の医薬キット。
- 癌である被験者を治療する方法であって、
第1の量の請求項1〜6のいずれかに記載のヒト化二重特異性抗体を、第2の量のペグ化物質と混合して集合体を形成することと、
前記集合体の治療有効量を前記被験者に順次または同時に投与して、癌の増殖または転移を阻害することと、を含み、
前記ペグ化物質が治療効果があり、タンパク質、ペプチド、化学療法薬を含有するナノ粒子のいずれかである、方法。 - 前記化学療法薬が、アドリアマイシン、アミフォスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カンプトテシン、CPT−11、シトシンアラビノシド、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、エトポシド、5−フルオロウラシル(5−FU)、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、インターフェロンベータ、イリノテカン、L−アスパラギナーゼ、L−アスパラギン酸、ロムスチン、メクロレタミン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ミトタン、パクリタキセル(タキソール)、プリカマイシン、ペントスタチン、ストレプトゾシン、トポテカン、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、SN38またはその組合せのいずれかである、請求項11に記載の方法。
- 前記タンパク質がケモカインまたはサイトカインであり、前記ペプチドがロイプロリド、ゴセレリン、オクトレオチド、ヒストレリン、アバレリクス、セトロレリクス、デガレリクス、シレンジタイド、ATN−161、またはIM862のいずれかである、請求項11の方法。
- 前記癌が、乳癌、大腸癌、結腸癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、膵癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、卵巣癌、子宮頸癌、造血器悪性腫瘍、食道癌、腎細胞癌、扁平上皮癌、神経膠腫、及び白血病のいずれかである、請求項11に記載の方法。
- 被験者の組織を撮像する方法であって、
(a)第1の十分量の請求項1〜6のいずれかに記載のヒト化二重特異性抗体と、第2の十分量のペグ化イメージング剤とを混合して集合体を形成することと、
(b)工程(a)の前記集合体を前記被験者に注射することと、
(c)蛍光イメージング、電子スピン共鳴(ESR)イメージング、X線イメージング、コンピュータ断層撮影法(CT)、または核磁気共鳴画像法(MRI)により、前記被験者の前記組織を撮像することと、
を含む、方法。
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