TW201519906A - 用於診斷和治療肝細胞癌的方法和劑 - Google Patents

用於診斷和治療肝細胞癌的方法和劑 Download PDF

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Abstract

本發明係關於個體肝細胞癌之診斷方法及治療方法。本發明亦係關於PLVAP蛋白之拮抗劑，諸如特異性結合PLVAP蛋白之抗體，以及包含PLVAP蛋白之拮抗劑的組合物及套組。本發明進一步係關於特異性結合PLVAP蛋白之人化抗體。

Description

用於診斷和治療肝細胞癌的方法和劑
本發明係關於診斷及治療個體肝細胞癌之方法，PLVAP蛋白之拮抗劑，包含PLVAP蛋白之拮抗劑的組合物及套組，及特異性結合PLVAP蛋白之人化抗體。
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為最頻發的肝臟原發性惡性疾病且為全世界範圍內第5位最常見的癌症。HCC亦為第4位癌症相關死亡之主要原因(Parkin DM,Bray F,Ferlay J,Pisani P.Estimating the world cancer burden：Globocan 2000.Int J Cancer 2001；94：153-156)。1990年，世界衛生組織(World Health Organization)估計全世界範圍內約有430,000例新發肝癌病例且當年有類似人數的患者因此疾病而死亡。
HCC之發病機制與慢性B型肝炎病毒(HBV)及C型肝炎病毒(HCV)感染，以及肝硬化誘導病狀有關(Bruix J.等人，J Hepatol 35：421-430,2001；Bruix J.等人，Cancer Cell 5：215-219,2004)。因此，HCC的發病率在諸如中國、香港、臺灣、韓國及日本之東亞國家最高，在這些國家HBV及HCV感染最為流行(Bruix J.等人，Cancer Cell 5：215-219,2004；Haskell CM.第46章Liver：Natural History,Diagnosis and Staging，於「Cancer Treatment」第5版，W. B,Saunders Company,Philadelphia，編者：Haskell CM及Berek JS中)。然而，西方國家的HCC發病率在正在穩步遞增(Parkin DM.等人，Int J Cancer 94；153-156,2001)。過去10年中，在美國，HCC呈現出在所有癌症中發病率增加第二高且死亡率增加最高(Ann Int Med 139：817-823,2003)。因此，在美國及全世界範圍內，HCC為死亡率及發病率之主要原因，且由於住院費用及患有HCC的人們失去工作而成為顯著的經濟負擔。
成功控制HCC需要在疾病進展早期正確診斷該疾病。然而，已證明使用目前的技術(諸如成像研究、核心針穿刺活檢(needle core biopsy)及/或細針抽吸)來區分小HCC腫瘤與其他惡性或非惡性肝病(包括轉移性腫瘤、膽管癌、局灶結節性增生(focal nodular hyperplasia)、發育不良及再生肝結節)具有挑戰性(Ferrell LD.等人，Am.J Surg Pathol 17：1113-1123,1993；Horigome H.等人，Hepato-Gatroenterology 47：1659-1662,2000；Kalar S.等人，Arch Pathol Lab Med 131：1648-1654,2007；Seki S.等人，Clin Cancer Res 6：3460-3473,2000)。此外，治療性治療HCC之嘗試大部分未能成功(Bruix J.等人，J Hepatol 35：421-430,2001；Bruix J.等人，Cancer Cell 5：215-219,2004；Haskell CM.第46章Liver：Natural History,Diagnosis and Staging，於「Cancer Treatment」第5版，W.B,Saunders Company,Philadelphia，編者：Haskell CM及Berek JS中；Szklaruk J.等人，AJR 180：441-453,2003)。因此，儘管存在現行療法，但在美國患HCC患者之5年存活率僅為10.5%，其數值僅次於胰腺癌位居第二(ACS Cancer Facts & Figures(2007))。因此，急迫地需要鑑別更可靠的標記物來區分HCC與其他肝病理學且促進此疾病之早期偵測。另外，急迫地需要研發新的且更有效之治療劑來治療HCC。
在一具體態樣中，本發明涵蓋一種治療有需要之個體(例如，人類)之肝細胞癌(HCC)之方法，其包含向該個體投予治療有效量之至少一種抑制個體肝臟中HCC腫瘤之形成、生長及/或進展之一或多者的質膜小泡相關蛋白(Plasmalemma Vesicle-Associated Protein，PLVAP)拮抗劑。在一具體態樣中，PLVAP拮抗劑為特異性結合PLVAP蛋白(例如，人類PLVAP蛋白)之抗體。在一特定具體態樣中，PLVAP拮抗劑係與第二治療劑(諸如化學治療劑)組合投予。
在另一具體態樣中，本發明係關於一種治療有需要之個體之肝細胞癌(HCC)之方法，其包含向該個體投予治療有效量之特異性結合PLVAP蛋白之抗體及至少一種化學治療劑。特異性結合PLVAP蛋白之抗體係藉由動脈內輸注(例如，肝動脈輸注、經動脈化學栓塞(transarterial chemoembolization))來投予個體且可抑制個體肝臟中之腫瘤形成、腫瘤生長、腫瘤血管形成或腫瘤進展。在一特定具體態樣中，將抗體傳遞至個體肝臟中之HCC腫瘤內或周圍之血管的內皮細胞。
在另一具體態樣中，本發明係關於一種診斷個體(例如，人類)之肝細胞癌(HCC)之方法，其包含偵測來自個體之樣本中PLVAP基因產物(例如，PLVAP RNA、PLVAP蛋白)之含量且判定樣本中PLVAP基因產物之含量相對於對照增加。根據本發明，樣本中PLVAP基因產物之含量相對於對照增加表明個體中存在HCC。在一特定具體態樣中，使用特異性結合PLVAP之抗體來偵測來自個體之樣本中PLVAP蛋白之含量。
在另一具體態樣中，本發明提供一種診斷個體之肝細胞癌(HCC)之 方法，其包含偵測來自個體之肝組織樣本中PLVAP基因產物之表現。根據本發明，肝組織樣本中PLVAP基因產物之表現表明HCC。在一特定具體態樣中，偵測肝組織樣本中血管內皮細胞中PLVAP基因產物之表現。
在另一具體態樣中，本發明係關於一種偵測個體(例如，人類)之HCC之活體內方法，其包含藉由動脈內注射或靜脈內注射投予經放射性同位素標記之特異性結合PLVAP之抗體，獲得個體肝臟之影像並偵測個體肝臟中抗體之累積。根據本發明，偵測到肝臟中抗體之累積表明個體之HCC。
在另一具體態樣中，本發明提供一種特異性結合哺乳動物(例如，人類)PLVAP蛋白之經分離多肽。在一特定具體態樣中，該多肽為抗體。在另一具體態樣中，該抗體為與單株抗體KFCC-GY4或KFCC-GY5競爭結合人類PLVAP蛋白之抗體。
在另一具體態樣中，本發明涵蓋一種醫藥組合物，其包含至少一種PLVAP拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑。在一具體態樣中，PLVAP拮抗劑為特異性結合PLVAP蛋白(例如，人類PLVAP蛋白)之抗體。在另一具體態樣中，該醫藥組合物進一步包含第二治療劑，諸如化學治療劑。
在另一具體態樣中，本發明係關於一種用於診斷個體之HCC之套組。在一具體態樣中，套組包括至少一種與PLVAP RNA轉錄物特異性雜交(例如，在高嚴格度條件下)之核酸探針。在另一具體態樣中，套組包含特異性結合PLVAP蛋白(例如，人類PLVAP蛋白)之多肽(例如，抗體)。
在另一具體態樣中，本發明係關於一種治療有需要之個體之肝細胞癌(HCC)之方法，其包含向該個體投予治療有效量之特異性結合PLVAP之人化抗體。在一特定具體態樣中，該抗體係藉由動脈內輸注(例如，肝動 脈輸注、經動脈化學栓塞)來投予個體且可抑制個體肝臟中之腫瘤形成、腫瘤生長、腫瘤血管形成或腫瘤進展。
在另一具體態樣中，本發明提供一種人化抗體，其與單株抗體KFCC-GY4或單株抗體KFCC-GY5特異性競爭結合SEQ ID NO：23。
圖1為描繪鑑別在腫瘤與相鄰非腫瘤組織之間展示極端差異性表現之基因之算法的流程圖。
圖2為描繪如使用Affymetrix基因晶片藉由mRNA轉錄物側寫所測定的配對之HCC(PHCC)與相鄰非腫瘤肝組織(PN)樣本(n=18)以及未經配對之HCC樣本(n=82)中之PLVAP基因表現強度的圖表。
圖3A為描繪如藉由Taqman定量性RT-PCR所測定的配對之HCC(PHCC)與相鄰非腫瘤肝組織(PN)樣本中之相對PLVAP表現量的圖表。相對於非腫瘤肝組織，HCC中之PLVAP mRNA含量顯著較高。
圖3B為描繪如藉由微陣列分析所測定的18對HCC(PHCC)與相鄰非腫瘤肝組織(PN)樣本中之PLVAP基因表現強度的圖表。除一人外，對於所有經測試個體，來自每一個體的HCC中之PLVAP轉錄物含量比相鄰非腫瘤肝組織中高。
圖4A及4B展示用於產生小鼠抗PLVAP多株抗血清之經His標記人類PLVAP51-442蛋白重組融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及推導胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。
圖5為描繪凝血酶消化以移除His標籤之前及之後對重組PLVAP蛋白之偵測的西方墨漬影像。墨漬左側之箭頭指示墨漬上His-PLVAP及PLVAP 之位置。墨漬左側之數字指示分子量標準之位置。
圖6A為描繪如藉由兩步即時定量性RT-PCR所測定在自兩個HCC組織樣本(樣本A(黑色)及樣本B(灰色))藉由雷射捕捉顯微解剖獲得之HCC內皮細胞中存在相對大量之PLVAP mRNA的圖表。虛線表示來自用於PLVAP mRNA之定量性RT-PCR之相同樣本中的β-肌動蛋白mRNA之Taqman定量性RT-PCR信號。結果表明在所解剖內皮細胞中存在易測得之PLVAP mRNA(實線)。
圖6B為描繪如藉由兩步Taqman即時定量性RT-PCR所測定在自兩個HCC樣本(樣本A(黑色)及樣本B(灰色))中鄰近於HCC組織之非腫瘤肝組織藉由雷射捕捉顯微解剖獲得之細胞中不存在相對大量之PLVAP mRNA的圖表。結果表明在所解剖細胞中無可偵測(黑色實線)及幾乎無可偵測(灰色實線)PLVAP mRNA。
圖6C為描繪如藉由兩步Taqman即時定量性RT-PCR所測定的自兩個HCC組織樣本(樣本A(黑色)及樣本B(灰色))藉由雷射捕捉顯微解剖獲得之HCC腫瘤細胞中之PLVAP mRNA相對量的圖表。結果表明由於不可避免的來自附著於所解剖HCC細胞之血管內皮細胞部分的輕微污染，在所解剖HCC細胞中存在極少量PLVAP mRNA(實線)。
圖7為描繪如藉由ELISA所測定的對抗重組PLVAP51-442蛋白所產生之小鼠抗血清中之抗PLVAP抗體效價的圖表。
圖8A-8F為展示來自3名患有肝細胞癌之患者的經福馬林固定之配對HCC(圖8A、8C、8E)與相鄰非腫瘤肝組織(圖8B、8D、8F)之切片的影像，該等切片使用抗PLVAP多株抗血清經免疫組織化學方法染色以偵測 PLVAP蛋白之定位。圖8A、8B；圖8C、8D及圖8E、8F中展示配對組織。僅在肝細胞癌之毛細管內皮細胞中偵測到PLVAP蛋白，其在HCC影像中顯現為褐色染色(箭頭)(圖8A、8C、8E)。在非腫瘤肝組織中不存在可偵測之HCC(圖8B、8D、8F)。
圖9A-9F為展示來自另外3名患有肝細胞癌之患者的經福馬林固定之HCC(圖9A、9C、9E、9F)及非腫瘤肝組織(圖9B、9D)之切片的影像，該等切片使用抗PLVAP多株抗血清經免疫組織化學方法染色以偵測PLVAP蛋白之定位。圖9A、9B及圖9C、9D展示HCC與相鄰非腫瘤肝組織之配對組織樣本。僅在肝細胞癌之毛細管內皮細胞中偵測到PLVAP蛋白，其在HCC影像中顯現為褐色染色(箭頭)(圖9A、9C、9E、9F)。在非腫瘤肝組織中不存在可偵測之HCC(圖9B、9D)。
圖10A-10F為展示來自6名不同患者的經福馬林固定之局灶結節性增生組織之切片的影像，該等切片使用抗PLVAP多株抗血清經免疫組織化學方法染色以偵測PLVAP蛋白之定位。在局灶結節性增生之非腫瘤肝組織之內襯血管竇/毛細管之內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。在膽管(圖10A、10D及10F)及門脈周邊血管(圖10D及10F)之內皮細胞中注意到一些陽性染色(褐色)，而在肝實質之內皮細胞中並無陽性染色。膽管內皮細胞之陽性染色係由於PLVAP抗血清中之非特異性抗體之結合。
圖11A及11B為展示來自兩名患有肝血管瘤之患者的經福馬林固定之組織切片的影像，該等切片經抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。肝血管瘤之內皮內襯細胞未展示顯著的PLVAP蛋白表現。
圖12A及12B為展示來自兩名患有慢性活性B型肝炎之患者的經福馬 林固定之組織切片的影像，該等切片經抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。在來自慢性B型肝炎患者之非腫瘤肝組織之內襯血管竇/毛細管之內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。
圖13A-13D為展示來自3名患有慢性活性C型肝炎之不同患者的經福馬林固定之組織切片的影像，該等切片經抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。圖13B及13D中所示之組織切片係來自同一患者。在來自慢性C型肝炎患者之非腫瘤肝組織之內襯血管竇/毛細管之內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。
圖14A-14D為展示來自3名患有轉移性肝癌之不同患者的經福馬林固定之組織切片的影像，該等切片經抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。該等組織切片係來自患有轉移性結腸直腸腺癌(圖14A)、肝內膽管癌(圖14B及14C)或轉移性卵巢癌(圖14D)之患者。圖14B及14C中所示之組織切片係來自同一患者。在轉移癌組織之內襯血管竇/毛細管之內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。
圖15A展示單株抗體KFCC-GY4之VH域的核苷酸基因(上)(SEQ ID NO：3)及推導胺基酸(中)(SEQ ID NO：4)序列。亦指出CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：6)及CDR3(SEQ ID NO：7)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖15B展示單株抗體KFCC-GY4之VL域的核苷酸基因(上)(SEQ ID NO：8)及推導胺基酸(中)(SEQ ID NO：9)序列。亦指出CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)及CDR3(SEQ ID NO：12)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖16A展示單株抗體KFCC-GY5之VH域的核苷酸基因(上)(SEQ ID NO：13)及推導胺基酸(中)(SEQ ID NO：14)序列。亦指出CDR1(SEQ ID NO：15)、CDR2(SEQ ID NO：16)及CDR3(SEQ ID NO：17)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖16B展示單株抗體KFCC-GY5之VL域的核苷酸基因(上)(SEQ ID NO：18)及推導胺基酸(中)(SEQ ID NO：19)序列。亦指出CDR1(SEQ ID NO：20)、CDR2(SEQ ID NO：21)及CDR3(SEQ ID NO：22)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖17為描繪如藉由ELISA所測定的在各種抗體濃度下KFCC-GY4(空心圓圈)及KFCC-GY5(實心圓圈)單株抗體與重組PLVAP蛋白之結合的圖。
圖18為展示KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體可偵測5ng重組PLVAP蛋白之免疫墨漬。泳道1：分子量標準；泳道2：含KFCC-GY4單株抗體之免疫墨漬；泳道3：含KFCC-GY5單株抗體之免疫墨漬。
重組PLVAP蛋白之分子量為45kD。
圖19A及19C為經庫馬斯藍(Coomassie blue)染色之SDS丙烯醯胺凝膠。泳道1：分子量標準；泳道2：使用TX-114自人類臍帶血管內皮細胞提取之疏水性膜蛋白，該等內皮細胞在提取前已經VEGF(40ng/ml)刺激72小時。
圖19B為免疫墨漬，其中用KFCC-GY4單株抗體探測圖19A之泳道2中所示之提取物。泳道1：分子量標準；泳道2：使用TX-114自人類臍帶血管內皮細胞提取之疏水性膜蛋白，該等內皮細胞在提取前已經VEGF(40ng/ml)刺激72小時。
圖19D為免疫墨漬，其中用KFCC-GY-5單株抗體探測圖19C之泳道2中所示之提取物。泳道1：分子量標準；泳道2：使用TX-114自人類臍帶血管內皮細胞提取之疏水性膜蛋白，該等內皮細胞在提取前已經VEGF(40ng/ml)刺激72小時。
圖20A為描繪人類血管內皮細胞(HUVEC)經對照正常小鼠IgG免疫螢光染色之螢光顯微照片。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行染色。放大率=600倍。
圖20B為描繪人類血管內皮細胞(HUVEC)經針對von Willebrand因子(VWF)之單株抗體免疫螢光染色之螢光顯微照片。VWF為人類血管內皮細胞之陽性標記物。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行染色。放大率=600倍。
圖20C為描繪人類血管內皮細胞(HUVEC)經針對PLVAP之KFCC-GY4單株抗體免疫螢光染色之螢光顯微照片。KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行染色。放大率=600倍。
圖20D為描繪人類血管內皮細胞(HUVEC)經針對PLVAP之KFCC-GY5單株抗體免疫螢光染色之螢光顯微照片。KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行染色。放大率=600倍。
圖21A為包埋於石蠟塊中之經福馬林固定之肝細胞瘤組織切片之光學顯微照片，該切片經KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體染色。在肝細胞瘤之血管內皮細胞中偵測到強PLVAP信號(深灰色染色)。放大率為100倍。
圖21B為來自與圖21A中所示之樣本相同之患者的經福馬林固定之肝細胞瘤組織切片之光學顯微照片，該切片經KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體染色。在肝細胞瘤之血管內皮細胞中偵測到中等PLVAP信號(淺灰色染色)。放大率為100倍。
圖21C為來自與圖21A及21B中所示之樣本不同之患者的經福馬林固定之肝細胞瘤組織切片之光學顯微照片，該切片經KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體染色。在血管內皮細胞中偵測到強PLVAP信號(深灰色染色)。放大率為100倍。
圖21D為包埋於石蠟塊中的來自與圖21C中所示之樣本相同之患者的經福馬林固定之肝細胞瘤組織切片之光學顯微照片，該切片經KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體染色。在血管內皮細胞中偵測到中等PLVAP信號(淺灰色染色)，從而表明KFCC-GY4單株抗體與PLVAP抗原之結合比KFCC-GY5抗體弱。放大率為100倍。
圖22A-22H為來自4名不同的經隨機選擇之肝細胞瘤患者之肝細胞瘤組織(圖22A、22C、22E及22G)及相鄰非腫瘤肝組織(圖22B、22D、22F及22H)之切片的光學顯微照片。該等切片經KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體染色。在肝細胞瘤組織之血管內皮細胞中偵測到PLVAP信號(灰色染色)，而在非腫瘤肝組織之血管內皮細胞中未偵測到信號。放大率為100倍。圖22A與22B、22C與22D、22E與22F及22G與22H代表四組配對之肝細胞瘤與非腫瘤肝組織。
圖23A為描繪經對照小鼠IgG染色之人類血管內皮細胞(HUVEC)之螢光顯微照片。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行染色。
圖23B為描繪經針對PLVAP之KFCC-GY4單株抗體染色之人類血管內皮細胞(HUVEC)之螢光顯微照片。KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞之表面陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行染色。
圖23C為描繪經針對PLVAP之KFCC-GY5單株抗體染色之人類血管內皮細胞(HUVEC)之螢光顯微照片。KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞之表面陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行染色。
圖24展示人類PLVAP蛋白之胺基酸序列(Genbank編號NP_112600；SEQ ID NO：23)。
圖25A及25B展示全長人類PLVAP cDNA之核苷酸序列(Genbank編號NM_031310；SEQ ID NO：24)。
定義
如本文中所用，術語「質膜小泡相關蛋白(Plasmalemma Vesicle-Associated Protein)」、「PLVAP」及「PV-1」係指天然存在或內源性PLVAP(例如，哺乳動物、人類)蛋白，及具有與天然存在或內源性PLVAP蛋白相同或大體上相同之胺基酸序列的蛋白質(例如，重組蛋白、合成蛋白)。因此，在本文中可互換使用之術語「質膜小泡相關蛋白」、「PLVAP」及「PV-1」包括(例如)藉由天然存在於哺乳動物(例如，人類)體內之替代性拼接或其他細胞過程產生的PLVAP蛋白之多態或對偶基因變異體及其他同功異型物。較佳地，PLVAP蛋白為具有SEQ ID NO：23(參見Genbank編號NP_112600 及圖24)之胺基酸序列之人類蛋白質。
如本文中所定義，「PLVAP拮抗劑(PLVAP antagonist)」為在一具體態樣中抑制(例如，降低、阻止)PLVAP蛋白之活性；或在另一具體態樣中抑制(例如，降低、阻止)PLVAP基因及/或基因產物之表現的藥劑(例如，抗體、小分子、肽、肽模擬物、核酸)。可由本發明之拮抗劑抑制之PLVAP蛋白之活性包括(但不限於)肝細胞癌腫瘤之形成、生長、血管形成及/或進展。在一特定具體態樣中，PLVAP拮抗劑特異性結合哺乳動物(例如，人類)PLVAP蛋白且抑制該PLVAP蛋白之活性。
如本文中所用，「特異性結合(specifically binds)」係指藥劑(例如，抗體)與PLVAP基因產物(例如，RNA、蛋白質)以比PLVAP拮抗劑結合非PLVAP蛋白質之親和力大至少約5倍，較佳至少約10倍之親和力(例如，結合親和力)結合。
如本文中所用，術語「多肽(polypeptide)」係指胺基酸之聚合物，且不限長度。因此，「多肽」涵蓋蛋白質、肽及寡肽。
如本文中所用，術語「抗體(antibody)」係指對標靶、抗原或抗原決定基具有親和力之多肽，且包括天然存在及經工程化之抗體。術語「抗體」涵蓋多株、單株、人類、嵌合、人化、靈長類化、鑲飾(veneered)及單鏈抗體，以及抗體片段(例如，Fv、Fc、Fd、Fab、Fab'、F(ab')、scFv、scFab、dAb)。(例如參見Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
術語「抗體可變區(antibody variable region)」係指獨立地或在與其他抗體可變區組合時(例如，VH/VL對)，特異性結合抗原決定基之抗體區域(例 如，VH、VHH、VL)。
術語「抗原決定基(epitope)」係指習知由抗體VH/VL對結合之結構單位。抗原決定基定義抗體之最小結合位點且因此代表抗體特異性之標靶。
術語「互補決定區(complementarity determining region)」或「CDR」係指來自重鏈或輕鏈之抗體可變區之高變區，其含有能夠特異性結合抗原標靶(例如，抗原決定基)之胺基酸序列。典型重鏈或輕鏈會具有三個CDR(CDR1、CDR2、CDR3)，其負責抗體對特定抗原決定基之特異性。
如本文中所定義，術語「抗原結合片段(antigen binding fragment)」係指含有一或多個CDR且本身對抗原決定子具有親和力之抗體部分。非限制性實例包括Fab片段、F(ab)'2片段、重鏈-輕鏈二聚體及單鏈結構，諸如完整輕鏈或完整重鏈。
如本文中所用，術語「特異性(specificity)」係指抗體優先結合抗原決定基之能力，且未必意味高親和力。
術語「親和力(affinity)」係指抗體與抗原決定子之間的結合強度之量度。親和力取決於多種因素，包括抗體與抗原決定子之間立體化學配合之緊密度，其間接觸區域之大小，及帶電及疏水性基團之分布。
如本文中所用，術語「親和力常數(affinity constant)」或「Kd」係指用於量測抗體對抗原之親和力的解離常數。親和力常數愈低，免疫球蛋白對抗原或抗原決定子之親和力愈高，且反之亦然。該常數容易由如藉由用於抗體反應之標準動力學方法所量測之結合-解離反應之速率常數算得。
如本文中所提及，術語「競爭(competes)」意謂第一多肽(例如，抗體)與標靶抗原之結合受到第二多肽(例如，抗體)結合之抑制。舉例而 言，結合可因(例如)結合域之物理阻斷或結合域之結構或環境改變使得其對標靶之親和力或結合性降低而受到空間抑制。
如本文中所用，術語「肽(peptide)」係指由約2個至約100個胺基酸殘基組成之化合物，其中一個胺基酸之胺基經由肽鍵連接至另一胺基酸之羧基。該等肽之長度典型地小於約100個胺基酸殘基且較佳為約10個、約20個、約30個、約40個或約50個殘基。
如本文中所用，術語「肽模擬物(peptidomimetic)」係指不為肽或蛋白質，但模擬其結構之外表的分子。肽模擬物拮抗劑可藉由習知化學方法來製備(例如，參見Damewood J.R.「Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry」於Reviews in Computational Biology,2007，第9卷，第1-80頁，John Wiley and Sons,Inc.,New York,1996中；Kazmierski W.K.,「Methods of Molecular Medicine：Peptidomimetic Protocols,」Humana Press,New Jersey,1999)。
術語「肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)」、「HCC」及「肝細胞瘤(hepatoma)」在本文中可互換使用，用以指自肝細胞(肝臟的主要細胞類型)產生之癌症。
如本文中所定義，「療法(therapy)」為向個體(例如，哺乳動物、人類)投予特定治療劑或預防劑，其對個體產生所需治療或預防效益。
如本文中所定義，「治療有效量(therapeutically effective amount)」為在投藥條件下足以達成所需治療或預防作用之量，諸如足以抑制(亦即，降低、預防)患HCC之患者肝臟中之腫瘤形成、腫瘤生長(增殖、尺寸)、腫瘤血管形成及/或腫瘤進展(侵襲、轉移)之量。療法之有效性(例如， 縮小/消除腫瘤及/或預防腫瘤生長)可藉由任何合適方法(例如，原位免疫組織化學、成像(超音波、CT掃描、MRI、NMR)、3H-胸苷併入)來測定。
如本文中所定義，「治療攝生法(treatment regimen)」為以特定劑量(例如，含量、量、數量)且按特定時程或以特定時間間隔(例如，數分鐘、數天、數週、數月)向哺乳動物個體投予一或多種治療劑或預防劑之攝生法。
如本文中所用，「個體(subject)」係指哺乳動物個體。術語「哺乳動物個體(mammalian subject)」在本文中定義為包括諸如以下動物之哺乳動物：靈長類動物(例如，人類)、母牛、綿羊、山羊、馬、犬、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、馬科、犬科、貓科、齧齒動物或鼠類物種。合適個體之實例包括(但不限於)患者HCC或有發展HCC風險之人類患者。發展HCC之高風險群組之實例包括患有慢性肝炎感染(B型肝炎、C型肝炎)之個體及患有肝硬化或相關肝病狀之個體。
如本文中所用之術語「預防(prevent、preventing或prevention)」意謂降低個體之HCC腫瘤形成或進展之機率/可能性或風險，延遲個體體內與HCC相關之病狀的發病，減輕個體體內HCC相關病狀的一或多種症狀之嚴重性，或其任何組合。一般而言，預防性攝生法之個體最可能被歸類為「處於風險中(at-risk)」，例如該個體發展HCC之風險高於由相關基線人群所代表之個體的風險。
如本文中所用，術語「治療(treat、treating或treatment)」意謂抵抗醫學病狀(例如，與HCC相關之病狀)至根據臨床可接受之標準使該醫學病狀得以改良之程度(例如，個體肝臟中HCC腫瘤之數目及/或尺寸降低)。
如本文中所用，術語「低嚴格度(low stringency)」、「中嚴格度(medium stringency)」、「高嚴格度(high stringency)」或「極高嚴格度條件(very high stringency conditions)」描述核酸雜交及洗滌之條件。執行雜交反應之指南可見於Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中，其全文以引用的方式併入本文中。該參考文獻中描述水性及非水性方法且均可使用。本文中所提及之特異性雜交條件如下：(1)低嚴格度雜交條件為在約45℃下於6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，隨後在50℃下(對於低嚴格度條件可將洗滌溫度升至55℃)在0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌兩次；(2)中嚴格度雜交條件為在約45℃下於6X SSC中，隨後在60℃下在0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一或多次；(3)高嚴格度雜交條件為在約45℃下於6X SSC中，隨後在65℃下在0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一或多次；及較佳(4)極高嚴格度雜交條件為在65℃下於0.5M磷酸鈉、7% SDS中，隨後在65℃下在0.2X SSC、1% SDS中洗滌一或多次。極高嚴格度條件(4)為較佳條件，且除非另有規定，否則應使用該等條件。
除非另有規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與一般技術者(例如，細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術及生物化學)通常所瞭解相同之含義。使用分子、遺傳及生物化學方法(一般參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.及Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley & Sons,Inc.，其以引用的方式併入本文中)及化學方法之標準技術。
PLVAP
質膜小泡相關蛋白(PLVAP)，亦稱為PV1，為一種II型整合膜醣蛋白，其表現限於特定血管內皮細胞(Mol Biol Cell 15：3615-3630(2004))。已證明PLVAP為有孔內皮之小孔及氣孔隔膜之關鍵結構組份(同上)。另外，PLVAP表現為形成內皮小孔隔膜所必需且可能參與調節內皮滲透性及轉運(Am J Physiol Heart Circ Physiol 286：H1347-1353,2004)。人類PLVAP基因之基因組結構已有報導(Stan RV,Arden KC,Palade GE.cDNA and protein sequence,genomic organization,and analysis of cis regulatory elements of mouse and human PLVAP genes.Genomics 72；304-313,2001)。
如本文中所述，本發明者已證明在人類HCC患者之肝臟中肝細胞癌組織中之PLVAP基因表現相對於相鄰非腫瘤組織顯著升高。另外，本發明者已判定PLVAP蛋白主要表現且定位於HCC腫瘤周圍或HCC腫瘤內之血管內皮細胞，而不表現或定位於與其他肝病理學相關之細胞。因此，PLVAP代表一種用於診斷及治療HCC之新穎標靶。
治療方法
在一方面中，本發明係關於一種治療有需要之個體之肝細胞癌(HCC)之方法，其包含向該個體投予治療有效量之至少一種PLVAP拮抗劑，其中該PLVAP拮抗劑抑制個體肝臟中HCC腫瘤之形成、生長、血管形成及/或進展之一或多者。在一特定方面中，本發明之PLVAP拮抗劑抑制HCC患者之肝臟中肝細胞周圍之血管內皮細胞中的PLVAP蛋白之表現或活性。
在一方面中，向有需要之個體投予治療有效量之PLVAP拮抗劑以抑制腫瘤生長或殺死腫瘤細胞。舉例而言，直接抑制腫瘤生長之藥劑(例如，化學治療劑)習知地以特定給藥時程及含量投予以達成最有效之療法(例 如，最佳殺死腫瘤細胞)。一般而言，在相對較短的治療期(例如，一至數天)內投予約最大耐受劑量，隨後為治療中斷期(off-therapy period)。在一特定實例中，每隔一天以最大耐受劑量150mg/kg投予化學治療劑環磷醯胺(cyclophosphamide)持續3劑，在第一週期後21天給與第二週期(Browder等人，Can Res 60：1878-1886,2000)。
舉例而言，可在第一週期中投予治療有效量之PLVAP拮抗劑(例如，抑制性小分子、中和抗體、抑制性核酸(例如，siRNA、反義核苷酸))，其中以一次時間間隔/給藥，或以數次間距相近之時間間隔(數分鐘、數小時、數天)投予約最大耐受劑量之拮抗劑，在合適的治療中斷期(例如，一或多週)後投予另一/第二週期。PLVAP拮抗劑之合適給藥時程及量可易於由具有一般技術之臨床醫師判定。如與化學治療劑相比特定PLVAP拮抗劑之毒性較低可允許投藥週期之間的時間較短。當用作(例如，手術、放射療法、其他基本療法之)輔助療法時，治療有效量之PLVAP拮抗劑較佳係按與其他癌症療法(例如，化學療法)類似之給藥時程，或按由熟習此項技術之臨床醫師判定為更/最有效抑制(降低、預防)腫瘤生長之給藥時程來投予。治療有效量之抗體PLVAP拮抗劑之治療攝生法可為(例如)每次治療每公斤體重約0.01mg至約300mg，且較佳為約0.01mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg，每1至7天一次歷時約4至約6個月之時期。抗腫瘤有效量之小分子PLVAP拮抗劑之治療攝生法可為(例如)約0.001mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.01mg/kg至約1mg/kg，每1至7天一次歷時約4至約6個月之時期。
在另一方面中，PLVAP拮抗劑可以節律性給藥攝生法投予，藉此相對於最大耐受給藥更頻繁地投予較低劑量。多種臨床前研究已證明節律性攝生法與最大耐受劑量(MTD)對應攝生法相比具有上佳抗腫瘤功效、有效抗血管生成作用及降低的毒性及副作用(例如，骨髓抑制)(Bocci等人，Cancer Res,62：6938-6943,(2002)；Bocci等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,100(22)：12917-12922,(2003)；及Bertolini等人，Cancer Res,63(15)：4342-4346,(2003))。節律性化學療法似乎可有效克服與化學療法相關之一些缺點。
PLVAP拮抗劑可作為抗血管生成療法之部分以節律性給藥攝生法投予以抑制(降低、阻止)有需要患者之血管生成。該抗血管生成療法可藉由阻斷向腫瘤供給維持腫瘤生長所需之養分且使腫瘤能夠轉移之新血管的形成來間接影響(抑制、降低)腫瘤生長。以此方式斷絕腫瘤之養分及血液供應可最終使腫瘤細胞因壞死及/或細胞調亡而死亡。先前的工作已表明當更頻繁地投予較低劑量含量而提供抗血管生成劑之持續血液含量時，涉及阻斷血管生成因子(例如，VEGF、bFGF、TGF-α、IL-8、PDGF)或其他信號傳輸之癌症療法的臨床結果(抑制內皮細胞介導之腫瘤血管生成及腫瘤生長)更為有效(參見Browder等人，Can.Res.60：1878-1886,2000；Folkman J.,Sem.Can.Biol.13：159-167,2003)。抗血管生成治療攝生法已用於血管生成之靶向抑制劑(凝血栓蛋白-1及血小板生長因子-4(TNP-470))與化學治療劑環磷醯胺。每隔6天，以低於最大耐受劑量之劑量投予TNP-470且以170mg/kg之劑量投予環磷醯胺(同上)。此治療攝生法使得腫瘤完全消退(同上)。事實上，抗血管生成治療在與其他抗癌治療劑，例如直接抑制腫瘤生長之彼等藥劑(例如，化學治療劑)協同投予時最為有效(同上)。
本文中所述之治療方法包含將PLVAP拮抗劑投予個體。可將PLVAP拮抗劑以如下方式投予有需要之個體：作為基本療法(例如，作為療法或治療攝生法中之主要治療劑)；作為輔佐療法(例如，作為在療法或治療攝生法中與另一治療劑一起使用之治療劑，其中治療劑之組合提供所需治療；「輔佐療法」亦稱為「附屬療法」)；與輔佐療法組合；作為輔助療法(例如，作為在已給與療法或治療攝生法中之主要治療劑後給與有需要之個體的治療劑)；或與輔助療法(例如，化學療法(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、順鉑(cisplatin)、絲裂黴素(mitomycin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿黴素(doxorubicin)、索拉非尼(sorafenib)、奧曲肽(octreotide)、達卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)、順鉑(Cis-platinum)、西眯替丁(cimetidine)、環磷醯胺)、放射療法(例如，質子束療法)、激素療法(例如，抗雌激素療法、雄激素去除療法(androgen deprivation therapy，ADT)、促黃體素釋放激素(LH-RH)促效劑、芳香酶抑制劑(AI，諸如安美達錠(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、雷曲唑(letrozole))、雌激素受體調節劑(例如，他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)))或生物療法)組合。在癌症治療攝生法期間亦可投予多種其他療法以減輕疾病作用及/或癌症治療之副作用，其包括管理以下症狀之療法：疼痛(麻醉藥、針灸)、胃不適(抗酸劑)、頭昏(抗眩暈藥物)、噁心(抗噁心藥物)、感染(例如，增加紅/白血球計數之藥物)及其類似症狀，所有該等療法均可易於由熟習此項技術者來識別。
因此，PLVAP拮抗劑可作為輔助療法(例如，與另一基本癌症療法或治療一起)投予。作為輔助療法，PLVAP拮抗劑可在如放射及/或手術移除 腫瘤之基本療法之前、之後或並行投予。在一些具體態樣中，方法包含投予治療有效量之PLVAP拮抗劑及一或多種其他療法(例如，輔助療法、其他靶向療法)。輔助療法(例如，化學治療劑)及/或一或多種其他靶向HCC療法與PLVAP拮抗劑可以獨立調配物之形式或以聯合調配物之形式同時(例如，並行地)共投予。或者，該等療法可以獨立組合物之形式在如由熟習此項技術之臨床醫師所判定(例如，足以允許該等療法之醫藥作用重疊之時間)之適當時間範圍(例如，諸如1.5至5小時之癌症治療時段/時間間隔)內相繼投予。輔助療法及/或一或多種其他靶向HCC療法與PLVAP拮抗劑可以適於達成所需治療作用(例如，抑制腫瘤生長、抑制血管生成及/或抑制癌症轉移)之順序及時程以單劑或分多劑投予。
可以單劑或分多劑投予一或多種為PLVAP拮抗劑之藥劑。合適的給藥及投藥攝生法可由臨床醫師判定且取決於所選藥劑、醫藥調配物及投藥途徑、各種患者因素及其他考慮因素。關於PLVAP拮抗劑與一或多種其他療法或治療(輔助、靶向、癌症治療相關及其類似療法)一起之投藥，典型地以單劑形式(例如，藉由注射、輸注、經口)投予PLVAP拮抗劑，隨後必要時或視病情以特定時間間隔(例如，一或多個小時)重複給藥。
PLVAP拮抗劑之投藥量(例如，治療有效量)可由臨床醫師使用本文中所提供之指南及此項技術中已知之其他方法來判定且取決於數種因素，包括(例如)所選特定藥劑、患者之年齡、敏感性、藥物耐受性及整體健康狀況。舉例而言，小分子之合適劑量可為每次治療每公斤體重約0.001mg至約100mg、約0.01mg至約100mg、約0.01mg至約10mg、約0.01mg至約1mg。抗體之合適劑量可為每次治療每公斤體重約0.01mg至約300mg， 且較佳為每次治療每公斤體重約0.01mg至約100mg、約0.01mg至約10mg、約1mg至約10mg。在PLVAP拮抗劑為多肽(線性、環狀、模擬物)之情況下，較佳劑量會產生約0.1μg/mL至約200μg/mL之肽血漿濃度。判定用於特定藥劑、患者及癌症之劑量完全在一般技術者之能力範圍內。較佳地，劑量不引起或產生最小不良副作用(例如，免疫原性反應、噁心、頭昏、嘈雜(gastric upset)、高血黏度症候群、充血性心臟衰竭、中風、肺水腫)。
投藥方法
根據本發明之方法，向哺乳動物個體投予治療有效量之PLVAP拮抗劑(例如，抗體，諸如經放射性同位素標記之抗體)以治療HCC。
視藥劑及所欲治療之特定癌症而定，可使用多種投藥途徑，包括(例如)經口、膳食、局部、經皮、直腸、非經腸(例如，動脈內、靜脈內、肌肉內、皮下注射、皮內注射)、靜脈內輸注及吸入(例如，支氣管內、鼻內或經口吸入、鼻內滴劑)投藥途徑。投藥可視病情為局部或全身性投藥。較佳投藥模式可視所選特定藥劑而變化；然而，對於投予本發明之治療劑(例如，抗體，諸如經放射性同位素標記之抗體)以治療肝細胞癌而言，動脈內投藥(例如，肝動脈輸注、經動脈化學栓塞(TACE))通常較佳。
舉例而言，(例如)在HCC之常規TACE治療期間，可使用肝動脈輸注將化學治療劑(例如，PLVAP抗體，諸如經放射性同位素標記之PLVAP抗體)經由肝動脈直接傳遞至HCC腫瘤(Camma等人，Radiology 224：47-54,2002；Befeler等人，Clinics in Liver Disease 9：287-300,2005；Abou-Alfa JAMA 299：1716-1718,2008)。此程序係藉助於螢光透視(x射線類型)成像來進行。 簡言之，將導管插入腹股溝中之股動脈中且穿入大動脈。自大動脈，使導管前進至肝動脈或其分枝。當鑑別出供給肝癌之肝動脈分枝後，即可經輸注實施化學療法。經常進行此程序之介入放射醫師可判定每一治療期患者接受之化學療法之量。一些患者可經歷6至12週時間間隔之重複治療期。在6至12週內重複肝臟之成像研究以評估腫瘤尺寸對治療之反應。
或者，可使用經動脈化學栓塞(一種類似於動脈內輸注之程序)將PLVAP拮抗劑(例如，抗體)投予有需要之個體。在TACE中，將治療劑之動脈內輸注與用特定阻斷化合物(諸如凝膠發泡體、油乳液或甚至小金屬線圈)阻斷(亦即，栓塞)小血管之額外步驟組合。因此，TACE具有使腫瘤暴露於高濃度化學療法且局部限制藥劑以防止或減少其被血流帶走之潛在優點。同時，TACE剝奪腫瘤所需之血液供應，此可使得腫瘤細胞損傷或死亡。
對於PLVAP抗體之動脈內投藥而言，較佳使用對PLVAP具有高親和力之抗體(例如，Kd小於10-7M)以便使所輸注之抗體會集中於HCC之血管中。預期嵌合及人化抗體分別具有至多4天及至多14-21天之循環半衰期。在一特定具體態樣中，將具有短循環半衰期(例如，約1天至約5天，例如約1、2、3、4或5天)之高親和力PLVAP抗體(例如，抗原結合片段、單鏈抗體)投予患者以降低由其投藥所產生之任何毒性及其他不良副作用。在另一具體態樣中，將具有長循環半衰期(例如，約5天至約24天)之高親和力PLVAP抗體投予患者以治療HCC。
在許多情況下，較佳在治療期內先投予大負荷劑量，隨後為定期(例如，每週)維持劑量。亦可藉由緩釋傳遞系統、泵及用於向HCC連續輸注 之其他已知傳遞系統來傳遞抗體。給藥攝生法可基於特定抗體之藥物動力學而改變以提供其所需循環含量。因此，會計算劑量以使所需治療含量得以維持。
實際劑量及治療攝生法會由醫師考慮癌症性質(原發或轉移)、腫瘤數量及尺寸、其他療法及患者特徵來判定。鑒於肝細胞癌危及生命之性質，可使用具有顯著副作用之大劑量。
可將基於核酸之PLVAP拮抗劑(例如，siRNA、反義寡核苷酸、天然或合成核酸、核酸類似物)以多種方式引入所關注之哺乳動物個體體內。舉例而言，可使核酸在宿主細胞中自表現載體或PCR產物內源性表現或將其封裝於合成或經工程化組合物(例如，脂質體、聚合物、奈米顆粒)中，接著可將該等組合物(例如，藉由注射、輸注)直接引入哺乳動物個體之血流中。亦可將抗PLVAP核酸或核酸表現載體(例如，逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關及單純疱疹病毒載體、經工程化載體、非病毒介導之載體)使用既定基因療法策略及方案直接引入哺乳動物個體體內(例如，參見Tochilin V.P.Annu Rev Biomed Eng 8：343-375,2006；Recombinant DNA and Gene Transfer,Office of Biotechnology Activities,National Institutes of Health Guidelines)。
類似地，在藥劑為蛋白質或多肽之情況下，可將藥劑經由重組蛋白之活體內表現來投予。活體內表現可根據合適方法藉由體細胞表現來實現(例如，參見美國專利第5,399,346號)。此外，亦可將編碼多肽之核酸併入逆轉錄病毒、腺病毒或其他合適載體(較佳為複製缺陷型感染性載體)中以供傳遞，或可將其引入能夠表現該多肽之經轉染或經轉型宿主細胞中以供傳遞。在後一具體態樣中，可將細胞以有效表現治療有效量之多肽的量植入 (單獨或於障壁裝置中)、注入或以其他方式引入。
診斷及預測方法
本發明涵蓋診斷及預測方法，其包含評估來自哺乳動物個體(例如，患有肝腫瘤之哺乳動物個體)之樣本(例如，肝活檢、細針抽吸樣本)中PLVAP之表現。對於本發明之診斷方法而言，樣本中PLVAP之表現，或相對於合適對照樣本中PLVAP之表現增加，表明個體患有HCC，及/或個體為使用PLVAP拮抗劑之抗癌療法之候選者。
對於本發明之預測方法而言，來自個體之樣本中PLVAP之表現，或相對於合適對照樣本中PLVAP之表現增加表明不良預後。預後可為患者存活之預後、轉移風險之預後及/或復發風險之預後。
用於此等方法之合適樣本包括組織樣本、生物流體樣本、細胞(例如，腫瘤細胞)樣本及其類似物。可使用任何自個體採樣之方法來獲得樣本，例如藉由抽血、脊髓穿刺、組織塗片或刮片，或組織活檢。因此，樣本可為活檢標本(例如，腫瘤、息肉、腫塊(實體、細胞))、抽吸物、塗片或血液樣本。樣本可為來自具有腫瘤(例如，癌性生長)及/或腫瘤細胞，或疑似具有腫瘤及/或腫瘤細胞之肝臟的組織。舉例而言，可在開放式活檢中獲得腫瘤活檢物，開放式活檢為一種自標靶區域移除全部(切除活檢)或部分(切口活檢)腫塊之程序。或者，可經由經皮活檢獲得腫瘤樣本，經皮活檢為一種使用針樣儀器經小切口或穿刺(藉助於或不藉助於成像裝置)來執行以獲得個別細胞或細胞簇(例如，細針抽吸(FNA))或組織核心或片段(穿刺活檢)之程序。可以細胞學方法(例如，塗片)、組織學方法(例如，冷凍或石蠟切片)或使用任何其他合適方法(例如，分子診斷方法) 來檢查活檢樣本。腫瘤樣本亦可藉由試管內採集來源於個體組織之經培養人類細胞來獲得。必要時，可在分析前將腫瘤樣本藉由在可分析條件下保存樣本之蛋白質及/或核酸之合適儲存方法，諸如快速冷凍或受控冷凍攝生法來儲存。必要時，冷凍可在防凍劑(例如，二甲亞碸(DMSO)、甘油或丙二醇-蔗糖)存在下執行。適當時，出於分析之目的可在儲存之前或之後彙集腫瘤樣本。腫瘤樣本可來自患有肝癌(例如，肝細胞癌)之患者。
可用於評估樣本(例如，生物樣本)中PLVAP之存在或量之合適檢定為熟習此項技術者所已知。偵測PLVAP蛋白或肽之方法包括免疫及免疫化學方法，如流式細胞術(例如，FACS分析)、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)，包括化學發光檢定、放射免疫檢定、免疫墨漬法(immunoblot)(例如，西方墨漬法(Western blot))、免疫組織化學(IHC)及其他基於抗體之定量方法(例如，基於Luminex®珠粒之檢定)。其他合適方法包括(例如)質譜分析。舉例而言，可使用針對PLVAP之抗體使用(例如)免疫組織化學(IHC)來直接地或間接地測定樣本中PLVAP之存在及/或表現量。舉例而言，可藉由合適方法自活檢物獲取石蠟切片，將其固定至載片且與一或多種抗體組合。在一特定具體態樣中，在樣本中肝細胞周圍之血管內皮細胞中偵測到PLVAP蛋白表明HCC。
偵測PLVAP基因表現之方法包括PLVAP核酸擴增及/或可視化。為偵測PLVAP基因表現，可藉由此項技術中常規之合適方法(例如，參見Sambrook等人，1989)自個體分離核酸。接著可將經分離核酸擴增(例如，藉由聚合酶連鎖反應(PCR)(例如，直接PCR、定量即時PCR、逆轉錄酶PCR)、連接酶鏈反應、自主序列複製、轉錄擴增系統、Q-β複製酶或其類 似方法)且可視化(例如，藉由在擴增期間標記核酸、暴露於插入化合物/染料、探針)。亦可使用核酸探針，例如經標記核酸探針(例如，螢光原位雜交(FISH))直接在取自(例如)腫瘤活檢物之組織樣本之石蠟切片中，或使用其他合適方法來偵測PLVAP RNA(例如，mRNA)或其表現。亦可藉由南方墨漬法(Southern blot)或在溶液中(例如，染料、探針)來評估其PLVAP基因表現。此外，可使用基因晶片、微陣列、探針(例如，量子點)或其他此類裝置(例如，感測器、奈米感測器/偵測器)來偵測PLVAP基因之表現及/或差異性表現。
在一具體態樣中，可藉由偵測來自患者之樣本中PLVAP基因產物(例如，PLVAP mRNA、PLVAP蛋白)之表現來診斷肝細胞癌。因此，該方法不需要將來自患者之樣本中之PLVAP表現與對照中之PLVAP表現作比較。存在或不存在PLVAP可藉由本文中所述之方法或其他合適檢定來確定。在另一具體態樣中，可藉由將樣本中之PLVAP表現與合適對照之PLVAP表現作比較來判定PLVAP表現之增加。合適對照包括(例如)來自個體之非瘤組織樣本、非癌細胞、非轉移癌細胞、非惡性(良性)細胞或其類似物，或合適之已知或經確定參考標準。參考標準可為PLVAP蛋白或RNA之表現的典型、正常或經標準化範圍或量(例如，表現標準)。因此，該方法不需要評估合適對照中之基因/蛋白質表現。
在另一具體態樣中，可藉由偵測來自患者之樣本中之PLVAP基因複本數來診斷肝細胞癌。舉例而言，在一些具體態樣中，大於2之PLVAP基因複本數(例如，基因複本數為3或4)可診斷為患HCC。典型地，正常人類細胞之PLVAP基因複本數會是2。因此，基於PLVAP基因複本數之診斷方 法不需要偵測來自患者之對照樣本中之PLVAP基因複本數，但可使用對照。合適對照包括(例如)來自個體之非瘤組織樣本、非癌細胞、非轉移癌細胞、非惡性(良性)細胞或其類似物，或合適之已知或經確定參考標準(例如，PLVAP基因複本數2)。可藉由合適技術(諸如螢光原位雜交(FISH))來確定來自患者之樣本中之PLVAP基因複本數。
PLVAP抗體
如本文中所述，結合PLVAP之抗體具有診斷及治療人類個體之HCC之效用。舉例而言，可使用特異性結合PLVAP之抗體藉由免疫組織化學染色(IHC)來偵測肝穿刺活檢物或針抽吸物標本中肝細胞癌之毛細管內皮細胞上PLVAP之存在。另外，針對PLVAP之抗體(例如，人化抗體、嵌合抗體)可經用於免疫正電子發射斷層攝影術(免疫PET)(Clin Cancer Res 12：1958-1960,2006；Clin Cancer Res 12：2133-2140,2006)之適當示蹤劑(例如，放射性同位素)標記以判定個體肝臟中之占位病變(space occupying lesion)是否為肝細胞癌。抗PLVAP抗體(例如，人化抗體)亦可經用於治療目的之細胞毒性劑(放射性或非放射性)標記(Weiner LM,Adams GP,Von Mehren M.Therapeutic monoclonal antibodies：General principles.於Cancer：Principles & Practice of Oncology.第6版DeVita VT,Hellman S,Rosenberg SA編，Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins；2001：495-508中；Levinson W,Jawetz E.Medical Microbiology & Immunology.第4版Stamford：Appleton & Lange；1996：307-47；Scheinberg DA,Sgouros G,Junghans RP.Antibody-based immunotherapies for cancer.於Cancer Chemotherapy & Biotherapy：Principles and Practice.第3版Chabner BA,Longo DL編，Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins；2001：850-82中)。
因此，在一具體態樣中，本發明提供一種結合(例如，特異性結合)PLVAP蛋白(例如，人類PLVAP蛋白(SEQ ID NO：23))之抗體。特異性結合PLVAP蛋白之抗體尤其可為多株、單株、人類、嵌合、人化、靈長類化、鑲飾及單鏈抗體，以及抗體片段(例如，Fv、Fc、Fd、Fab、Fab'、F(ab')、scFv、scFab、dAb)。(例如參見Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。特異性結合PLVAP蛋白之抗體可藉由習知方法或其他合適技術來產生、建構、工程化及/或分離。舉例而言，可對抗適當免疫原，諸如重組哺乳動物(例如，人類)PLVAP蛋白(例如，SEQ ID NO：23)或其部分(例如，SEQ ID NO：2)(包括合成分子，例如合成肽)產生對PLVAP蛋白具特異性之抗體。已描述多種此類免疫方法(例如，參見Kohler等人，Nature,256：495-497(1975)及Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein等人，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski等人，美國專利第4,172,124號；Harlow,E.及D.Lane,1988,Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor,NY)；Current Protocols In Molecular Biology，第2卷(第27號增刊，94年夏季)，Ausubel,F.M.等人編，(John Wiley & Sons：New York,NY)，第11章，(1991))。亦可藉由用表現PLVAP之細胞(例如，癌細胞/細胞株)或經工程化以表現PLVAP之細胞(例如，經轉染細胞)免疫合適宿主(例如，小鼠)來產生抗體。(例如參見Chuntharapai等人，J.Immunol.,152：1783-1789(1994)；Chuntharapai等人，美國專利第5,440,021號)。
在免疫後之適當時間，例如當抗體效價最高時，可自經免疫動物獲得 產生抗體之細胞且用以藉由標準技術來製備單株抗體，該等技術諸如最初由Kohler及Milstein描述之融合瘤技術(Nature 256：495-497,1975)、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人，Immunol.Today 4：72,1983)、EBV-融合瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁，1985)或三體瘤(trioma)技術。產生融合瘤之技術為熟知的(一般參見Current Protocols in Immunology,Coligan等人，(編)John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,1994)。簡言之，使永生細胞株(典型地為骨髓瘤)與來自經如上文所述之免疫原免疫之哺乳動物的淋巴細胞(典型地為脾細胞)融合，且篩選所得融合瘤細胞之培養物上清液以鑑別產生結合本文中所述之多肽的單株抗體之融合瘤。
許多用於融合淋巴細胞與永生化細胞株之熟知方案中之任一者均可用於產生針對本發明多肽之單株抗體之目的(例如，參見Current Protocols in Immunology，前述；Galfre等人，Nature,266：55052,1977；R.H.Kenneth,Monoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses,Plenum Publishing Corp.,New York,New York,1980；及Lerner,YaleJ.Biol.Med.54：387-402,1981)。此外，一般技術者應應瞭解存在許多亦適用之該等方法之變體。
在製備分泌單株抗體之融合瘤之一替代方法中，可藉由用標靶多肽篩選重組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體呈現文庫)以藉此分離結合該多肽之免疫球蛋白文庫成員來鑑別及分離針對PLVAP蛋白之單株抗體。用於產生及篩選噬菌體呈現文庫之套組可購得(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌體呈現套組， 目錄號240612)。另外，特別適用於產生及篩選抗體呈現文庫之方法及試劑之實例可見於(例如)美國專利第5,223,409號、PCT公開案第WO 92/18619號、PCT公開案第WO 91/17271號、PCT公開案第WO 92/20791號、PCT公開案第WO 92/15679號、PCT公開案第WO 93/01288號、PCT公開案第WO 92/01047號、PCT公開案第WO 92/09690號、PCT公開案第WO 90/02809號；Fuchs等人，Bio/Technology 9：1370-1372,1991；Hay等人，Hum.Antibodies Hybridomas 3：81-85,1992；Huse等人，Science 246：1275-1281,1989；及Griffiths等人，EMBO J.12：725-734,1993中。
抗體片段(例如，抗原結合片段)可藉由酶促裂解或藉由重組技術來產生。舉例而言，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解分別可產生Fab或F(ab')2片段。亦可使用其他具有必需受質特異性之蛋白酶來產生Fab或F(ab')2片段。
亦可使用已在天然終止位點上游引入一或多個終止密碼子之抗體基因產生多種截短形式之抗體。舉例而言，編碼F(ab')2重鏈部分之嵌合基因可經設計而包括編碼重鏈之CH1域及鉸鏈區的DNA序列。
本發明及術語「抗體」亦涵蓋包含來源於不同物種之部分的單鏈、人類、嵌合、人化、靈長類化(CDR接枝)或鑲飾抗體。此等抗體之各種部分可藉由習知技術以化學方式接合在一起，或可使用遺傳工程化技術以相接蛋白(contiguous protein)之形式製備。舉例而言，編碼嵌合或人化鏈之核酸可經表現而產生相接蛋白。例如參見Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Cabilly等人，歐洲專利第0,125,023 B1號；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Boss等人，歐洲專利第0,120,694 B1號；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，歐洲專利第0,194,276 B1號；Winter，美國 專利第5,225,539號；Winter，歐洲專利第0,239,400 B1號；Queen等人，歐洲專利第0 451 216 B1號；及Padlan,E.A.等人，EP 0 519 596 A1。關於靈長類化抗體，亦參見Newman,R.等人，BioTechnology,10：1455-1460(1992)，且關於單鏈抗體亦參見Ladner等人，美國專利第4,946,778號及Bird,R.E.等人，Science,242：423-426(1988)。
在一特定具體態樣中，本發明係關於特異性結合PLVAP(例如，包含SEQ ID NO：23之人類PLVAP蛋白)之嵌合抗體。在一具體態樣中，本發明之嵌合抗體包含人類IgG4之至少一條重鏈及至少一條輕鏈(例如，κ輕鏈)。
在另一具體態樣中，本發明係關於特異性結合PLVAP(例如，包含SEQ ID NO：23之人類PLVAP蛋白)之人化抗體。人化抗體可使用合成或重組DNA技術使用標準方法或其他合適技術來產生。亦可使用PCR突變誘發方法改變編碼人類或人化鏈之DNA序列(諸如來自預先經人化可變區之DNA模板)來建構編碼人化可變區之核酸(例如，cDNA)序列(例如，參見Kamman,M.等人，Nucl.Acids Res.,17：5404(1989)；Sato,K.等人，Cancer Research,53：851-856(1993)；Daugherty,B.L.等人，Nucleic Acids Res.,19(9)：2471-2476(1991)；及Lewis,A.P.及J.S.Crowe,Gene,101：297-302(1991))。亦可簡便地使用此等或其他合適方法產生變異體。在一具體態樣中，可使經選殖可變區(例如，dAb)突變，且可(例如，自噬菌體文庫)選擇編碼具有所需特異性之變異體之序列(例如，參見Krebber等人，U.S.5,514,548；Hoogenboom等人，WO 93/06213，公開於1993年4月1日)。人化抗體亦可由商業來源(例如，包括Antitope Limited(Cambridge,UK))產生及/或自其獲得。
可使用產生或分離具有必需特異性之抗體的其他合適方法，包括(例 如)自文庫(例如，噬菌體呈現文庫)選擇重組抗體或抗體結合片段(例如，dAb)之方法或依賴於轉殖基因動物(例如，小鼠)免疫之方法。能夠產生人類抗體譜之轉殖基因動物為此項技術中所熟知(例如，Xenomouse®(Abgenix,Fremont,CA))且可使用合適方法產生(例如，參見Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551-2555(1993)；Jakobovits等人，Nature,362：255-258(1993)；Lonberg等人，美國專利第5,545,806號；Surani等人，美國專利第5,545,807號；Lonberg等人，WO 97/13852)。
抗體產生後，即可容易地使用此項技術中熟知之篩選及分離特異性抗體之方法來鑑別對PLVAP具特異性之抗體。例如參見Paul(編)，Fundamental Immunology,Raven Press,1993；Getzoff等人，Adv.in Immunol.43：1-98,1988；Goding(編)，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press Ltd.,1996；Benjamin等人，Ann.Rev.Immunol.2：67-101,1984。可使用多種檢定來偵測特異性結合PLVAP蛋白之抗體。例示性檢定詳細描述於Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988中。該等檢定之代表性實例包括：並行免疫電泳、放射免疫檢定、放射免疫沈澱、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、點漬墨漬或西方墨漬檢定、抑制或競爭檢定及夾心檢定。
在某些具體態樣中，本發明之抗體對PLVAP具有高結合親和力。該等抗體較佳會對PLVAP具有以Kd表示至少約10-7M(例如，約0.4×10-7M、約0.6×10-7M或更高，例如至少約10-8M、至少約10-9M或至少約10-10M)之親和力(例如，結合親和力)。抗體之結合親和力可易於由一般技術者(例如)藉由斯卡查德分析(Scatchard analysis)(Scatchard,G.,Ann.NY Acad.Sci. 51：660-672,1949)來測定。結合親和力亦可使用可購得之生物感測儀器(BIACORE,Pharmacia Biosensor,Piscataway,N.J.)來測定，其中將蛋白質固定於受體晶片之表面。參見Karlsson,J.Immunol.Methods 145：229-240,1991及Cunningham及Wells,J.Mol.Biol.234：554-563,1993。此系統允許測定結合及解離速率(可自其計算結合親和力)及評估結合之化學計量。
本發明之抗體可包括標記，諸如允許偵測生物樣本中之抗體及抗體所結合之蛋白質(例如，PLVAP)之可偵測標記。可偵測標記尤其適用於診斷應用。舉例而言，PLVAP抗體可經放射性同位素標記，放射性同位素可由熟習此項技術者使用γ計數器、閃爍計數器或藉由自動放射攝影術或其他合適方法來偵測。對於本發明而言適用之同位素包括(但不限於)：3H、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe及75Se。
本發明之抗體亦可經螢光化合物(例如，染料)標記。當使經螢光標記之抗體曝露於適當波長之光時，則可因化合物之螢光而偵測到其存在。最常用之螢光標記有異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、藻紅蛋白(phycoerytherin)、藻青蛋白(phycocyanin)、別藻青蛋白(allophycocyanin)、鄰苯二甲醛(o-phthaldehyde)及螢光胺(fluorescamine)。本發明之抗體亦可使用螢光發射金屬(諸如152Eu)或其他鑭系元素來標記。可將此等金屬使用諸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)、四氮雜-環十二烷-四乙酸(DOTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之金屬螯合基團連接至抗體分子。
亦可將本發明之抗體與化學發光化合物偶合。適用化學發光標記化合物之實例為發光胺(luminol)、異發光胺(isoluminol)、芳族吖錠酯、咪唑、 吖錠鹽及草酸酯。
同樣，可使用生物發光化合物來標記本發明之抗體。生物發光為一種可見於生物系統中之化學發光類型，其中催化蛋白增加該化學發光反應之效率。生物發光蛋白之存在可藉由偵測存在發光來判定。適用於標記抗體之目的之生物發光化合物為蟲螢光素(luciferin)、螢光素酶(luciferase)及水母發光蛋白(aequorin)。
偵測經標記抗體可藉由閃爍計數器(例如，若可偵測標記為放射性γ發射體)或藉由螢光計(例如，若標記為螢光材料)來完成。在酶標記之情況下，偵測可藉由使用酶受質之比色法來完成。偵測亦可藉由相對於類似製備之標準物視覺比較受質之酶促反應程度來完成。
因此，本發明之抗體亦可用作組織切片之染色劑。舉例而言，可使與PLVAP結合之經標記抗體與組織樣本(例如，來自患者之肝組織活檢物或細針抽吸物)接觸。接著可洗滌此切片且使用適當方法偵測標記。
出於治療HCC之目的，本發明之PLVAP抗體可包括增強破壞表現PLVAP之細胞(例如，HCC細胞周圍之血管內皮細胞)的放射性標記或其他治療劑。適用於HCC療法之放射性同位素標記之實例包括(但不限於)125I、131I、90Y、67Cu,217Bi、211At、212Pb、47Sc、109Pd、111In及118Re。視情況，可使用經中子輻射轟擊後發射α及β粒子之標記(諸如硼)作為治療性PLVAP抗體之標記。
治療性抗體亦可包括能夠選擇性殺死表現PLVAP之細胞的細胞毒性劑。舉例而言，可使用細菌毒素(諸如白喉毒素(diphtheria toxin))或篦麻毒素(ricin)。用於產生包含白喉毒素之片段A之抗體的方法教示於美國專 利第4,675,382號(1987)中。白喉毒素含有兩條多肽鏈。B鏈使毒素結合至細胞表面上之受體。A鏈實際進入細胞質且藉由使延長因子2(伴隨ETP水解使核糖體沿mRNA易位之因子)失活來抑制蛋白質合成。參見Darnell,J.等人，Molecular Cell Biology,Scientific American Books,Inc.，第662頁(1986)。或者，可製備包含篦麻毒素(一種毒性凝集素)之抗體。其他合適細胞毒性劑為熟習此項技術者所已知。
對於活體內偵測而言，可將本發明之PLVAP抗體直接或藉由使用中間官能基與放射性核素接合。常用於將放射性同位素(以金屬陽離子之形式存在)與抗體結合之中間基團為二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或四氮雜-環十二烷-四乙酸(DOTA)。以此方式結合之金屬陽離子之典型實例為99Tc、123I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga及68Ga。
此外，本發明之抗體可經包括順磁性原子之NMR成像劑標記。使用NMR成像劑允許使用NMR技術活體內診斷患者中HCC之存在及程度。尤其適於以此方式使用之元素為157Gd、55Mn、162Dy、52Cr及56Fe。
PLVAP拮抗劑
本發明之PLVAP拮抗劑可為抑制(例如，降低、阻止)PLVAP基因產物之活性的任何藥劑。PLVAP活性包括(但不限於)HCC腫瘤之形成、生長、血管形成或進展。在一特定具體態樣中，PLVAP拮抗劑藉由與PLVAP基因產物(例如PLVAP RNA、PLVAP蛋白)特異性結合來抑制PLVAP基因產物之活性。PLVAP拮抗劑亦涵蓋抑制(降低、減少、阻止)PLVAP基因或基因產物(例如，PLVAP RNA、PLVAP蛋白)之表現(例如，轉錄、mRNA加工、轉譯)的藥劑。PLVAP拮抗劑尤其可為抗體、小分子、肽、 肽模擬物或核酸。
抗體拮抗劑
本發明之PLVAP拮抗劑可為特異性結合PLVAP蛋白之抗體。該等抗體包括(但不限於)本文中所述之PLVAP特異性抗體中之任一者。
小分子抗體
PLVAP拮抗劑亦可為小分子。小分子之實例包括有機化合物、有機金屬化合物、無機化合物及有機、有機金屬或無機化合物之鹽。小分子中之原子典型地係經由共價鍵及/或離子鍵連接在一起。小有機分子中之原子排列可表現為鏈(例如，碳-碳鏈或碳-雜原子鏈)，或可表現為含有碳原子的環(例如，苯或多環系統)或含有碳與雜原子之組合的環(亦即雜環，諸如嘧啶或喹唑啉)。儘管小分子可具有任何分子量，但其通常包括小於約5,000道爾頓(dalton)之分子。舉例而言，該等小分子可小於約1000道爾頓，且較佳小於約750道爾頓，或更佳小於約500道爾頓。小分子及其他非肽PLVAP拮抗劑可存在於自然界(例如，鑑別、分離、純化)及/或合成產生(例如，藉由傳統的有機合成、生物介導之合成或其組合)。例如參見Ganesan,Drug Discov.Today 7(1)：47-55(2002年1月)；Lou,Drug Discov.Today,6(24)：1288-1294(2001年12月)。天然存在之小分子之實例包括(但不限於)激素、神經傳遞素、核苷酸、胺基酸、糖、脂質及其衍生物。
肽拮抗劑
本發明之PLVAP拮抗劑亦可為與PLVAP蛋白結合之肽。肽可包含任何適合之L-及/或D-胺基酸，例如常見α-胺基酸(例如，丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸)、非α-胺基酸(例如，β-丙胺酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、肌 胺酸、斯他胺酸(statine))及不常見胺基酸(例如，瓜胺酸、高瓜胺酸、高絲胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、鳥胺酸)。肽上之胺基、羧基及/或其他官能基可為游離的(例如，未經修飾)或經合適保護基保護。適用於胺基及羧基之保護基及適用於添加或移除保護基之方法為此項技術中所已知且揭示於(例如)Green及Wuts,「Protecting Groups in Organic Synthesis」,John Wiley and Sons,1991中。亦可使用此項技術中已知之方法將肽之官能基衍生化(例如，烷基化)。
肽PLVAP拮抗劑可視需要包含一或多個修飾(例如，胺基酸連接子、醯化、乙醯化、醯胺化、甲基化、末端修飾子(例如，環化修飾))。肽亦可含有化學修飾(例如，N-甲基-α-胺基取代)。另外，肽拮抗劑可為已知及/或天然存在之肽的類似物，例如具有保守胺基酸殘基取代之肽類似物。此等修飾可改良肽之各種特性(例如，穩定性、結合)，包括其PLVAP拮抗劑活性。
肽PLVAP拮抗劑可為線性、分枝或環狀分子，例如具有包括數個醯胺鍵之雜原子環結構的肽。在一特定具體態樣中，肽為環狀肽。該等肽可由熟習此項技術者使用標準技術製得。舉例而言，可藉由酶促裂解或化學裂解自天然蛋白質衍生或移除肽，或可藉由合適方法，例如固相肽合成(例如，梅裏菲爾德(Merrifield)型合成)(例如，參見Bodanszky等人，「Peptide Synthesis,」John Wiley & Sons，第2版，1976)來合成肽。作為PLVAP拮抗劑之肽亦可(例如)使用重組DNA方法或其他合適方法製得(例如，參見Sambrook J.及Russell D.W.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。
肽可經合成及組合為包含幾種至許多種獨立分子種類之文庫。該等文庫可使用組合化學方法製備，且可使用任何合適方法篩選以判定該文庫是否包含具有所需生物活性之肽。接著可將該等肽拮抗劑使用熟習此項技術者已知之合適方法分離。
肽模擬物拮抗劑
PLVAP拮抗劑亦可為肽模擬物。舉例而言，可製備具有與肽相同之官能基之多醣。肽模擬物可(例如)藉由確立肽藥劑在其由標靶分子結合或會與標靶分子結合之環境中的三維結構來設計。肽模擬物包含至少兩種組份、結合部分及骨架或支撐結構。
結合部分為會與標靶分子(例如，人類PLVAP)反應或形成複合物(例如，經由疏水性或離子性相互作用)之化學原子或基團。舉例而言，肽模擬物中之結合部分可與肽或蛋白質拮抗劑中之結合部分相同。結合部分可為與受體以與肽拮抗劑中之結合部分相同或類似之方式反應的原子或化學基團。舉例而言，可使用計算化學來設計結合PLVAP蛋白之肽的肽模擬物。對於肽中之鹼性胺基酸而言適用於設計肽模擬物之結合部分之實例包括含氮基團，諸如胺、銨、胍及醯胺或鏻。對於酸性胺基酸而言適用於設計肽模擬物之結合部分之實例包括(例如)羧基、低碳烷基羧酸酯、磺酸、低碳烷基磺酸酯或亞磷酸或其酯。
支撐結構為當與結合部分結合時提供肽模擬物之三維構型的化學實體。支撐結構可為有機或無機結構。有機支撐結構之實例包括多醣、聚合物或有機合成聚合物(諸如聚乙烯醇或聚交酯)之寡聚物。支撐結構較佳地具有與肽骨架或支撐結構大體上相同之大小及尺寸。此可藉由計算或量 測肽及肽模擬物之原子及鍵結之大小來測定。在一具體態樣中，肽鍵之氮可經氧或硫取代，例如形成聚酯骨架。在另一具體態樣中，羰基可經磺醯基或亞磺醯基取代，藉此形成聚醯胺(例如，聚磺醯胺)。可製備肽之逆醯胺(reverse amide)(例如，用一或多個-CONH-基團取代-NHCO-基團)。在另一具體態樣中，肽骨架可經聚矽烷骨架取代。
此等化合物可藉由已知方法製造。舉例而言，聚酯肽模擬物可藉由以下步驟來製備：用羥基取代胺基酸上之相應α-胺基，藉此製備羥基酸且繼而將羥基酸酯化，視情況阻斷鹼性及酸性側鏈以使副反應最少。判定適當化學合成途徑通常可在確定化學結構後容易地鑑別。
肽模擬物可經合成及組合為包含幾種至許多種獨立分子種類之文庫。該等文庫可使用熟知組合化學方法製備，且可經篩選以判定該文庫是否包含一或多種具有所需活性之肽模擬物。接著可將該等肽模擬物拮抗劑藉由合適方法分離。
核酸拮抗劑
PLVAP拮抗劑亦包括抑制PLVAP基因表現之各種核酸(包括核酸分子)(例如，siRNA、反義寡核苷酸、核糖核酸酶)。舉例而言，小干擾核糖核酸(siRNA)及類似地在細胞中被加工為短siRNA樣分子之短髮夾型核糖核酸(shRNA)可阻止PLVAP蛋白之表現(轉譯)。siRNA分子可為長度通常為約20至約25個核苷酸且經設計以結合特定RNA序列(例如，PLVAP mRNA序列)之聚核苷酸。siRNA以序列特異性方式使基因表現沉默，與標靶RNA(例如，具有互補序列之RNA)結合且使該RNA被核糖核酸內切酶降解。能夠抑制PLVAP基因產物之表現的siRNA分子可藉由合適方法製 得。存在數種可用於設計結合所關注基因序列之siRNA分子的算法(例如，參見Mateeva O.等人，Nucleic Acids Res.35(8)：Epub,2007；Huesken D.等人，Nat.Biotechnol.23：995-1001；Jagla B.等人，RNA 11：864-872,2005；Shabalinea S.A.BMC Bioinformatics 7：65,2005；Vert J.P.等人，BMC Bioinformatics 7：520,2006)。可獲得可穩定表現siRNA或shRNA之表現載體。(例如參見Brummelkamp,T.R.,Science 296：550-553,2002；Lee,NS等人，Nature Biotechnol.20：500-505,2002；Miyagishi,M.及Taira,K.Nature Biotechnol.20：497-500,2002；Paddison,P.J.等人，Genes & Dev.16：948-958,2002；Paul,C.P.等人，Nature Biotechnol.20：505-508；2002；Sui,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6)：5515-5520,2002；Yu,J-Y等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9)：6047-6052,2002；Elbashir,SM等人，Nature 411：494-498,2001)。siRNA/shRNA分子之穩定表現有利於治療癌症，因為其使得分子能夠長期表現，從而潛在地降低及/或消除重複治療之需要。
反義寡核苷酸(例如，DNA、核糖核酸探針(riboprobe))亦可用作抑制PLVAP表現之PLVAP拮抗劑。反義寡核苷酸通常為與標靶核酸序列(例如，mRNA)特異性雜交且誘導標靶核酸降解(例如，經由RNase H依賴性機制降解RNA)或空間阻礙拼接或轉譯機制之進程的短(約13至約25個核苷酸)單鏈核酸。(例如參見Dias N.及Stein C.A.,Mol.Can.Ther.1：347-355,2002)。存在多種不同類型的可用作PLVAP拮抗劑之反義寡核苷酸，包括甲基膦酸寡核苷酸、硫代磷酸寡核苷酸、核糖2'位處之氫經O-烷基(例如，甲基)置換之寡核苷酸、聚醯胺核酸(PNA)、磷醯二胺酸嗎啉代寡聚物(去氧核糖部分經嗎啉環置換)、PN(核糖3'位處之氧經胺基團N3'→P5'置換) 及嵌合寡核苷酸(例如，2'-O-甲基-硫代磷酸酯)。可使用預測算法設計對蛋白質具有特異性之反義寡核苷酸。(例如參見Ding,Y.及Lawrence,C.E.,Nucleic Acids Res.,29：1034-1046,2001；Sczakiel,G.,Front.Biosci.,5：D194-D201,2000；Scherr,M.等人，Nucleic Acids Res.,28：2455-2461,2000；Patzel,V.等人，Nucleic Acids Res.,27：4328-4334,1999；Chiang,M.Y.等人，J.Biol.Chem.,266：18162-18171,1991；Stull,R.A.等人，Nucleic Acids Res.,20：3501-3508,1992；Ding,Y.及Lawrence,C.E.,Comput.Chem.,23：387-400,1999；Lloyd,B.H.等人，Nucleic Acids Res.,29：3664-3673,2001；Mir,K.U.及Southern,E.M.,Nat.Biotechnol.,17：788-792,1999；Sohail,M.等人，Nucleic Acids Res.,29：2041-2051,2001；Altman,R.K.等人，J.Comb.Chem.,1：493-508,1999)。反義寡核苷酸可藉由合適方法製得，例如使用自動化核酸合成儀(例如，來自Applied Biosystems)之核酸(例如，DNA、RNA、PNA)合成(亦參見Martin,P.,Helv.Chim.Acta 78：486-504,1995)。亦可使反義寡核苷酸穩定表現於含有適當表現載體之細胞中。
反義寡核苷酸可由標靶細胞(例如，腫瘤細胞)經吸附性胞飲過程吸收。因此，在治療個體(例如，哺乳動物)時，可(例如)藉由注射或輸注將反義PLVAP寡核苷酸傳遞至標靶細胞(例如，腫瘤細胞)中。舉例而言，可將經純化之寡核苷酸或siRNA/shRNA單獨或以調配物形式使用合適藥物傳遞媒介(例如，脂質體、陽離子聚合物(例如，聚-L-離胺酸、PAMAM樹枝狀聚合物、聚烷基氰基丙烯酸酯奈米顆粒及聚乙烯亞胺))投予或與合適載體肽(例如，同源轉錄因子、觸足肽(Antennapedia peptide)、HIV-1之Tat蛋白、E5CA肽)偶合。
核糖核酸酶亦可用作抑制PLVAP表現之PLVAP拮抗劑。核糖核酸酶為具有酶促活性之RNA分子。一類核糖核酸酶能夠重複地將其他獨立RNA分子以核苷酸鹼基序列特異性方式裂解成兩個或兩個以上斷片。參見Kim等人，Proc Natl Acad Sci USA,84：8788(1987)；Haseloff及Gerlach,Nature,334：585(1988)；及Jefferies等人，Nucleic Acid Res,17：1371(1989)。該等核糖核酸酶典型地具有兩個功能域：催化域及引導核糖核酸酶與標靶RNA經由互補鹼基配對結合之結合序列。使經特定設計之核糖核酸酶與標靶mRNA結合後，其即酶促裂解標靶mRNA，典型地降低其穩定性及破壞其直接轉譯經編碼蛋白質之能力。在核糖核酸酶裂解其RNA標靶後，其自該標靶RNA釋放且隨後可結合並裂解另一標靶。亦即，單一核糖核酸酶分子可重複地結合並裂解新標靶。
根據本發明，核糖核酸酶可靶向編碼PLVAP之mRNA的任何部分。選擇核糖核酸酶標靶序列及設計並製造核糖核酸酶之方法通常為此項技術中所已知。例如參見美國專利第4,987,071號、第5,496,698號、第5,525,468號、第5,631,359號、第5,646,020號、第5,672,511號及第6,140,491號，該等專利各自之全文以引用的方式併入本文中。舉例而言，合適核糖核酸酶可以各種構型設計，諸如錘頭型基元、髮夾型基元、△型肝炎病毒基元、I型內含子基元或RNase P RNA基元。例如參見美國專利第4,987,071號、第5,496,698號、第5,525,468號、第5,631,359號、第5,646,020號、第5,672,511號及第6,140,491號；Rossi等人，AIDS Res Human Retroviruses 8：183(1992)；Hampel及Tritz,Biochemistry 28：4929(1989)；Hampel等人，Nucleic Acids Res,18：299(1990)；Perrotta及Been,Biochemistry 31：16(1992)；及Guerrier-Takada 等人，Cell,35：849(1983)。
核糖核酸酶可藉由用於常規RNA合成之相同方法來合成。舉例而言，合適方法揭示於Usman等人，J Am Chem Soc,109：7845-7854(1987)及Scaringe等人，Nucleic Acids Res,18：5433-5441(1990)中。經修飾核糖核酸酶可藉由揭示於以下文獻中之方法來合成：例如美國專利第5,652,094號；國際公開案第WO 91/03162號、第WO 92/07065號及第WO 93/15187號；歐洲專利申請案第92110298.4號；Perrault等人，Nature,344：565(1990)；Pieken等人，Science,253：314(1991)；及Usman及Cedergren,Trends Biochem Sci,17：334(1992)。
本發明之PLVAP拮抗劑亦可為與PLVAP蛋白結合且抑制其活性之核酸分子(例如，寡核苷酸)。合適核酸PLVAP拮抗劑包括能夠經由非經典沃森-克裏克(Watson-Crick)鹼基配對之相互作用以高親和力及特異性結合所關注之特定分子(例如，人類PLVAP)之適體(Tuerk及Gold,Science 249：505(1990)；Ellington及Szostak,Nature 346：818(1990))。
適體，如藉由噬菌體呈現所產生之肽或單株抗體(MAb)，能夠特異性結合所選標靶且經由結合阻斷其標靶之作用能力。適體可藉由試管內選擇方法自隨機序列寡核苷酸池產生，已對100種以上蛋白質產生適體，該等蛋白質包括生長因子、轉錄因子、酶、免疫球蛋白及受體。典型適體之大小為10-15kDa(30-45個核苷酸)，以次奈莫耳親和力結合其標靶，且排斥密切相關之標靶(例如，典型地不會結合來自相同基因家族之其他蛋白質)。一系列結構研究已展示適體能夠使用相同類型之結合相互作用(氫鍵結、靜電互補、疏水性接觸、空間排阻等)驅動抗體-抗原複合物之親和力及特異性。
與所關注標靶(例如，人類PLVAP蛋白)結合之適體可使用描述於(例如)美國專利第5,475,096號及美國專利第5,270,163號中之稱為「藉由指數富集進行配位體之系統性演化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)」(SELEX)之標準方法來產生及鑑別。
PLVAP拮抗劑之鑑別
對PLVAP基因產物具有結合特異性之藥劑可在化合物及/或文庫(例如，化學品、肽、核酸文庫)之篩選(例如，高通量篩選)中鑑別。
特異性結合人類PLVAP之抗體可(例如)藉由篩選可購得之組合抗體文庫(Dyax Corp.,MorphoSys AG)來鑑別。合適組合抗體文庫及篩選此等文庫之標準方法描述於Hoet等人，Nature Biotechnology 23(3)：344-348(2005)及Rauchenberger等人，J.Biol.Chem.278(40)：38194-38205(2003)中，該等文獻之內容以引用的方式併入本文中。該等分子文庫或集合亦可使用熟知化學方法來製備。
或者，可(例如)藉由用PLVAP蛋白、蛋白質片段或肽連同破壞對抗原之耐受性之佐劑免疫小鼠來鑑別特異性結合人類PLVAP之鼠類抗體。可根據所需特異性及活性來篩選此等抗體且接著使用已知技術將其人化以產生適用於治療人類疾病之藥劑。
化合物或小分子可自多種可獲得之化合物文庫鑑別，該等文庫例如來自美國國家癌症研究所之化學品儲存庫(Chemical Repository of the National Cancer Institute)及分子文庫小分子儲存庫(Molecular Libraries Small Molecules Repository)(PubChem)，以及哈佛大學(Harvard University)之化學與細胞生物學研究所(Institute of Chemistry and Cell Biology at Harvard University)之 文庫及可自商業來源(例如，Chembridge、Peakdale、CEREP、MayBridge、Bionet)獲得之其他文庫。該等分子文庫或集合亦可使用熟知化學方法(諸如熟知組合化學方法)來製備。可篩選文庫以鑑別結合且抑制PLVAP之化合物。
經鑑別之化合物可充當使用熟知藥物化學方法進一步分化之主導化合物。舉例而言，可製備作為主導化合物結構變異體之化合物集合且根據PLVAP結合及/或抑制活性進行篩選。此可使得發展出將化合物結構與生物活性相聯繫之結構活性關係。具有合適結合及抑制活性之化合物可經進一步研發以供活體內使用。
可進一步評價結合PLVAP之藥劑的PLVAP拮抗劑活性。舉例而言，可在篩選或結合檢定中使用包含PLVAP蛋白之組合物來偵測及/或鑑別結合且拮抗PLVAP蛋白之藥劑。適用組合物包括(例如)天然表現PLVAP蛋白之細胞(例如，肝血管內皮細胞)、該等細胞之提取物及重組PLVAP蛋白。
可在(例如)競爭結合檢定中鑑別結合PLVAP蛋白之藥劑，其中評估測試藥劑抑制PLVAP與參考藥劑結合之能力。參考藥劑可為全長PLVAP蛋白或其部分。參考藥劑可經合適標記(例如，放射性同位素、抗原決定基標記、親和標記(例如，生物素及抗生物素蛋白(avidin)或抗生蛋白鏈菌素(streptavadin))、自旋標記、酶、螢光基團、化學發光基團、染料、金屬(例如，金、銀)、磁性珠粒)標記且可測定檢定中使PLVAP蛋白飽和所需的經標記參考藥劑之量。可使用合適對照(例如，未經標記之藥劑、單獨標記)來判定PLVAP蛋白與測試藥劑之間形成複合物之特異性。
測試藥劑抑制參考藥劑與PLVAP蛋白之間的複合物形成的能力可根據50%抑制經標記參考藥劑之特異性結合所需的測試藥劑濃度(IC50值)來測定。特異性結合較佳定義為總結合(例如，複合物中之總標記量)減去非特異性結合。非特異性結合較佳定義為在過量未經標記參考藥劑存在下所形成的複合物中仍偵測到之標記的量。適用於該方法之參考藥劑包括特異性結合PLVAP之分子及化合物，例如結合PLVAP之抗體。
可藉由篩選具有拮抗(降低、阻止、抑制)PLVAP之一或多種活性(諸如腫瘤血管形成)之能力的藥劑來鑑別拮抗PLVAP蛋白之藥劑。該等活性可由熟習此項技術者使用任何適當試管內或活體內檢定來評估。
醫藥組合物
本發明之PLVAP拮抗劑可作為醫藥或生理組合物之部分，例如作為包含PLVAP拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物之部分投予哺乳動物個體。包含PLVAP拮抗劑(例如，特異性結合PLVAP之抗體)之調配物或組合物或包含PLVAP拮抗劑及一或多種其他治療劑(例如，化學治療劑，例如阿黴素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、奧曲肽)之組合物會根據所選投藥途徑而變化(例如，溶液、乳液或膠囊)。合適醫藥載劑可含有不與PLVAP拮抗劑相互作用之惰性成份。可使用標準醫藥調配技術，諸如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中所述之技術。適用於非經腸投藥之醫藥載劑包括(例如)無菌水、生理食鹽水、抑菌生理食鹽水(含有約0.9% mg/ml苯甲醇之生理食鹽水)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、漢克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏乳酸鹽溶液(Ringer’s lactate)及其類似物。調配物亦可包括少量增強活性成份之有效性之物質(例如， 乳化劑、增溶劑、pH值緩衝劑、潤濕劑)。囊封組合物(諸如於硬明膠或環糊精之包衣中)之方法為此項技術中所已知。對於吸入而言，可將藥劑溶解及裝載於適於投藥之分配器(例如，霧化器或噴霧器或加壓氣溶膠分配器)中。
診斷套組
本發明亦提供用於偵測個體中肝細胞癌之存在的診斷套組。該等套組包含至少一種用於偵測樣本(例如，來自哺乳動物個體之生物樣本)中之PLVAP基因表現之藥劑(例如，核酸探針、抗體)。PLVAP基因表現可(例如)藉由偵測樣本中之PLVAP基因產物(諸如PLVAP mRNA或PLVAP蛋白)來偵測。
因此，在一具體態樣中，該套組包含至少一種與PLVAP RNA(例如，mRNA、hnRNA)轉錄物特異性雜交之核酸探針(例如，寡核苷酸探針)。該等探針能夠在高嚴格度條件下與PLVAP RNA雜交。
在另一具體態樣中，該套組包括能夠與樣本中之PLVAP基因產物(例如，mRNA、cDNA)特異性雜交之一對寡核苷酸引子。該等引子可用於任何標準核酸擴增程序(例如，聚合酶連鎖反應(PCR)，例如RT-PCR、定量即時PCR)中以偵測樣本中PLVAP基因產物之含量。
在另一具體態樣中，本發明之套組包括特異性結合PLVAP蛋白(例如，人類PLVAP蛋白)之抗體。該等抗體包括本文中所述之本發明PLVAP抗體中之任一者。在一具體態樣中，該抗體包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的VH域及具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的VL域。在另一具體態樣中，該抗體包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VH域及具有SEQ ID NO：19 之胺基酸序列的VL域。
本發明套組中之診斷劑可包括一或多種標記(例如，可偵測標記)。此項技術中已知多種適用於診斷劑之標記且其包括(但不限於)本文中所述標記中之任一者。在一特定具體態樣中，診斷劑(例如，抗體)包括放射性同位素以使得藥劑可用於免疫正電子發射斷層攝影術(免疫PET)。
現將藉由以下實施例說明本發明，該等實施例不欲任何方式構成限制。
實施例 實施例1：HCC肝組織中之PLVAP表現相對於非HCC肝組織升高 材料及方法：組織樣本
自出於治療目的自人類患者手術移除之新鮮標本收集HCC及相鄰非腫瘤肝臟之組織。此等標本係在主治病理醫師的直接監督下收集。在辜公亮基金會和信治癌中心醫院(Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Center，KF-SYSCC)之腫瘤庫將所收集之組織立即儲存於液氮中。可獲得來自18名HCC患者之配對組織樣本用於研究。此研究獲倫理委員會(Institutional Review Board)批准且獲得所有患者之書面知情同意書。此研究中之18名HCC患者之臨床特徵總結於表1中。
mRNA轉錄物側寫
使用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)自冷凍於液氮中之組織分離總RNA。將所分離之RNA使用RNAEasy Mini套組(Qiagen,Valencia,CA)進一步純化，且在Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)中使用RNA 6000 Nano檢定評估其品質。所有用於研究之RNA樣本均具有大於5.7(8.2±1.0，平均值±SD)之RNA完整性指數。自8μg總RNA根據Affymetrix方案製備雜交標靶且使其與含有用於大約13,000種人類基因之22,238個探針組的Affymetrix U133A基因晶片雜交。在雜交後，立即使用Affymetrix基因晶片流控台400及EukGE WS2v4方案使經雜交陣列經歷自動化洗滌及染色。隨後，在Affymetrix基因陣列掃描儀2500中掃描U133A基因晶片。
微陣列資料之存在及不存呼叫之判定
使用Affymetrix微陣列分析套件(MAS)5.0軟體產生所有18對HCC與相鄰非腫瘤肝組織之微陣列資料之存在呼叫。存在呼叫判定之所有參數均為預設值。藉由MAS 5.0將各探針組判定為「存在」、「不存在」或「邊緣」。類似地，使用dChip 2004版軟體處理相同微陣列資料以判定微陣列上各探針組之「存在」、「不存在」或「邊緣」狀態。
具有極端差異性表現之探針組之鑑別
為鑑別在HCC與相鄰非腫瘤肝組織之間具有極端差異性表現之基因，根據以下規則使用用實際擷取與報導語言(Practical Extraction and Report Language,PERL)編寫之軟體：「腫瘤特異性基因(Tumor-specific gene)」係定義為藉由MAS 5.0與dChip在HCC中呼叫為「存在」而在相鄰非腫瘤肝組織中呼叫為「不存在」或「邊緣」之探針組。「非腫瘤肝組織特異性基因(Non-tumor liver tissue-specific gene)」係定義為藉由MAS 5.0與dChip在HCC中呼叫為「不存在」或「邊緣」而在配對相鄰非腫瘤肝組織中呼叫為「存在」之探針組。描繪鑑別算法之流程圖展示於圖1中。
即時定量性逆轉錄酶聚合酶連鎖反應(RT-PC)
使用TaqManTM即時定量性逆轉錄酶-PCR(qRT-PCR)來定量mRNA。自各樣本之8μg總RNA使用1500ng寡聚(dT)引子及600個單位之SuperScriptTM II逆轉錄酶(來自Invitrogen,Carlsbad,CA)以60μl之最終體積根據製造商說明合成cDNA。對於各RT-PCR反應而言，在25μl之最終體積中遵照製造商說明(ABI及Roche)使用0.5μl cDNA作為模板。使用Applied Biosystems 7900HT即時PCR系統進行PCR反應。實驗所需之探針及試劑係 自Applied Biosystems(ABI)(Foster City,CA)獲得。用於PLVAP之即時定量性RT-PCR之引子及探針的序列為5’-CCTGCAGGCATCCCTGTA-3’(正向引子)(SEQ ID NO：25)、5’-CGGGCCATCCCTTGGT-3’(反向引子)(SEQ ID NO：26)及5’-CCCCATCCAGTGGCTG-3’(探針)(SEQ ID NO：27)。使用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷醯基核糖基轉移酶(HPRT)持家基因(housekeeping gene)作為標準化之內源參考。所有樣本均雙重複操作，在同一PCR盤上操作同一標靶mRNA及內源參考HPRT mRNA。藉由比較性Ct方法根據製造商說明(User Bulletin #2,ABI Prism 7700序列偵測系統)計算標靶mRNA之相對量。選擇非腫瘤肝樣本作為計算之相對校正因子。
結果：
18對HCC與相鄰非腫瘤肝組織中之PLVAP基因表現強度展示於圖2中。配對之HCC與相鄰非腫瘤肝組織之平均基因表現強度分別為759.8±436.5及170.6±53.4(平均值±SD)。兩組之間配對t檢驗之p值為2.8×10-5。此等結果表明PLVAP表現於HCC中而不表現於非腫瘤肝組織中。當82個未經配對之HCC樣本展示出810.4±482.0(平均值±SD)之平均表現強度時，該表現強度與來自18個經配對HCC樣本之研究結果基本上相同(藉由t檢驗得出p=0.62)(圖2)，進一步證實HCC中PLVAP之此升高表現。
為證實PLVAP顯著表現於HCC肝組織中而不表現於非腫瘤肝組織中，對來自18對HCC與相鄰非腫瘤肝組織之RNA樣本執行即時定量性RT-PCR。相對於非腫瘤肝組織，HCC中之PLVAP mRNA量顯著較高(參見圖3A及表2)。儘管結果在兩組間展示出一些重疊，但除一人外對於所有經測試個體，在同一個體內HCC中之PLVAP轉錄物比相鄰非腫瘤肝組織 高(圖3B)。此例外可能與組織儲存過程中之不均勻RNA降解度有關。
實施例2：PLVAP由HCC血管內皮細胞特異性表現 材料及方法：經福馬林(formalin)固定之石蠟包埋組織之雷射捕捉顯微解剖(LCM)
使用來自Arcturus Bioscience,Inc.(Mountain View,CA)之Arcturus PixCell® IIe系統、CapSureTM HS LCM蓋片及ParadiseTM試劑系統進行來自石蠟塊之經福馬林固定之組織的LCM。切離7微米厚之組織切片，將其去石蠟化、再水合、染色及脫水以根據製造商說明進行LCM。使用7.5μm雷射光斑尺寸以50mW功率及1.3ms持續時間將標靶細胞捕捉至CapSureTM HS LCM蓋片 上。每個蓋片捕捉大約5000至6000個細胞。然而，因細胞稀少每個蓋片上僅捕捉1000至2000個肝細胞癌血管內皮細胞。
自LCM組織切片提取RNA以供進行定量性RT-PCR
使用ParadiseTM試劑系統根據製造商說明處理如上文所述捕捉於CapSureTM HS LCM蓋片上之細胞以進行RNA提取、cDNA合成、試管內轉錄及反義RNA擴增。接著使用所合成之反義RNA作為模板來進行兩步TaqMan即時定量性RT-PCR以定量藉由LCM所捕捉之細胞中之PLVAP及β-肌動蛋白mRNA。第一步(亦即，逆轉錄)係使用4.5μl反義RNA及TaqMan逆轉錄試劑(ABI)以10μl之最終體積遵循製造商方案來進行。第二步(亦即，即時PCR)係使用2.4μl cDNA模板、引子/探針混合物及來自Applied Biosystems之TaqMan通用PCR母混合物以25μl之最終體積來執行。在Smart Cycler II(Cephid,Inc.,Sunnyvale,CA)中進行即時PCR。將反應最初在50℃下培育2分鐘且接著在95℃下培育10分鐘。隨後，執行45個以下循環：95℃下變性15秒鐘及60℃下黏接/延長40秒鐘。引子及探針之序列列於表3中。
用於重組融合PLVAP51-442 蛋白之表現載體之製備
藉由將編碼PLVAP之胺基酸殘基51至442之PCR片段插入pGEM®-T Easy載體(Promega,Inc.,Madison,WI)中來產生質體pGEM®-T Easy-PLVAP51-442。PCR片段係自來自OriGene(Rockville,MD)之PLVAP之cDNA純系藉由使用5’AACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3’(SEQ ID NO：34)及5’TGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3’(SEQ ID NO：35)之引子組來擴增。為建構質體pET-15b-PLVAP51-442，自pGEM®-T Easy-PLVAP51-442切離每一各別末端具有NdeI及BamHI識別序列的編碼PLVAP之胺基酸殘基51至442之cDNA片段且將其插入pET-15b(Novagen,Inc.,San Diego,CA)中。藉由DNA定序驗證上文所述之表現構築體。
重組融合PLVAP51-442 蛋白之表現及純化
為產生重組經His標記之PLVAP51-442蛋白(SEQ ID NO：2)(圖4)，藉由將勝任細胞與pET-15b-PLVAP51-442質體DNA一起在冰上培育5分鐘，隨後在42℃水浴中培育30秒鐘且接著再於冰上培育2分鐘來轉型大腸桿菌(Escherichia coli)(Rosetta-gami2(DE3)pLysS)(Novagen)。在塗鋪於選擇性培養基上之前，將轉型體在37℃下伴隨在250rpm下之震盪用SOC培養基(0.5%酵母提取物、2%胰化蛋白、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)培育60分鐘。在30℃下使用1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導Rosetta-gami2(DE3)pLysS大腸桿菌中經His標記之融合蛋白之表現歷時16小時。在誘導之後，藉由在補充有8M尿素之平衡緩衝液(50mM磷酸鈉、300mM NaCl，pH 7)中超音波處理來使細菌細胞溶解且藉由在5,600×g下離心30分鐘將其分離為可溶部分與不溶部 分。為進一步純化His-PLVAP51-442蛋白，將可溶部分裝載於TALON®金屬親和樹脂(Clontech,Inc.,Palo Alto,CA)上，用平衡緩衝液洗滌且用溶離緩衝液(50mM磷酸鈉、300mM NaCl、250mM咪唑，pH 7)溶離。根據製造商說明藉由凝血酶裂解(Novagen)來移除經純化融合蛋白之His標籤(參見圖5)。藉由以PBS進行廣泛性透析來回收所得PLVAP51-442蛋白。為驗證重組PLVAP蛋白之特性，自Biodesign Insitute(Tempe,AZ)購得少量抗GST-PLVAP331-430融合蛋白之小鼠抗血清。使用此抗體藉由西方墨漬分析偵測到無His標籤之重組PLVAP51-442蛋白，但其不與針對His標籤之抗體反應。此等結果證實重組PLVAP蛋白之特性。
小鼠抗人類PLVAP血清之產生
使用於PBS中之經純化PLVAP51-442重組蛋白來免疫6週齡之Balb/cByj小鼠。最初用於完全弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)(Sigma,Inc.,St Louis,MO)中之總共14μg PLVAP51-442蛋白在多個部位經皮下注射免疫每隻小鼠。隨後，每兩週一次用於不完全弗氏佐劑中之7μg PLVAP51-442重組蛋白加強免疫經歷3次。最後一次加強免疫後1週，對小鼠取血以製備抗血清。
酵素結合免疫吸附分析法(ELISA) 試劑及溶液：
1.重組PLVAP蛋白
2.抗小鼠IgG-鹼性磷酸酶接合物(目錄號AP124A,CHEMICON)
3.塗佈緩衝液(0.137M氯化鈉、0.01M磷酸氫二鈉七水合物、2mM磷酸二氫鉀、0.002%(0.3mM)疊氮化鈉，pH 7.2-7.4)
4.洗滌緩衝液(0.137M氯化鈉、0.01M磷酸氫二鈉七水合物、2mM 磷酸二氫鉀、0.2%吐溫20(Tween20)(目錄號P1379,SIGMA)，pH 7.2-7.4)
5.阻斷緩衝液(0.137M氯化鈉、0.01M磷酸氫二鈉七水合物、2mM磷酸二氫鉀、2%牛血清白蛋白(目錄號82-045,PENTEX)、0.05%吐溫20(目錄號P1379,SIGMA)，pH 7.2-7.4)
6.碳酸鹽緩衝液(0.016M碳酸氫鈉、0.014M碳酸鈉、2mM氯化鎂、0.002%(0.3mM)疊氮化鈉，pH 9.6)
7.鹼性磷酸酶受質：溶解於40ml碳酸鹽緩衝液中之一片40mg磷酸酶受質錠劑(目錄號P5994,SIGMA)
程序：
使用ELISA測定抗PLVAP血清中之抗體效價。首先，在4℃下用50μl以2.5μg/ml範圍內之濃度溶解於含有0.002%疊氮化鈉之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(亦即，塗佈緩衝液)中之PLVAP蛋白塗佈96孔ELISA培養盤隔夜。在用200μl洗滌緩衝液(含有0.05%吐溫20之PBS)洗滌3次後，在室溫下將經塗佈培養盤之每一孔用150μl阻斷緩衝液(亦即，含有2%牛血清白蛋白之洗滌緩衝液)阻斷30分鐘。再洗滌3次後，在室溫下將各孔用50μl製備於稀釋緩衝液中之經稀釋抗血清(自1,000倍至128,000倍之連續兩倍稀釋)培育45分鐘。隨後，在室溫下將各孔用5,000倍稀釋度之抗小鼠IgG鹼性磷酸酶接合物(Chemico,Inc.,Temecula,CA)培育30分鐘。在3次洗滌後，用100μl鹼性磷酸酶受質(Sigma,Inc.,St Louis,MO)定量所結合之抗體且在25至40分鐘之培育期後使用ELISA培養盤讀取器在405nm下執行吸光度量測。
對經福馬林固定之組織中之PLVAP的免疫組織化學(IHC)偵測
自經福馬林固定之組織之石蠟塊切離6微米之切片。將切片封固至SuperFrost Plus黏附載玻片(Menzel Glaser GmbH,Braunschweig,Germany)上。接著處理切片以在Benchmark XT自動化染色儀(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ)中使用XT-iView-DAB-V.1方案經輕度CCI調節將PLVAP免疫染色30分鐘且在37℃下將切片用經400倍稀釋之抗人類PLVAP血清培育36分鐘。用於偵測小鼠抗人類PLVAP抗體結合之第二抗體及試劑係來自Ventana Medical Systems,Inc.(Tucson,AZ)之iViewTMDAB偵測套組。所有試劑及緩衝液均自Ventana Medical Systems購得。
結果：
為判定HCC樣本中PLVAP之細胞來源，使用雷射捕捉顯微解剖(LCM)將HCC血管內皮細胞、肝細胞癌之腫瘤細胞及非腫瘤肝細胞(包括內襯竇內皮細胞)自樣本中解剖出來。由於肝細胞瘤細胞與毛細管內襯內皮細胞之間緊密並列，在解剖期間儘力避免包含毛細管內襯內皮細胞。使用自經解剖細胞提取之RNA進行兩步即時定量性RT-PCR以測定PLVAP mRNA之相對量。研究來自兩名不同患者之標本。展示於表4及圖6A-6C中之結果表明PLVAP係由HCC血管內皮細胞表現(圖6A)，而在相鄰非腫瘤肝組織中未偵測到可偵測之PLVAP轉錄物(圖6B)。
為進一步研究PLVAP表現之組織及疾病特異性，對抗人類PLVAP之細胞外域(胺基酸51至442)產生多株抗體用於免疫組織化學(IHC)研究。如圖7中所示，自經重組PLVAP51-442蛋白免疫之Balb/c小鼠獲得之抗血清含有高效價之抗PLVAP抗體。
接著使用抗PLVAP抗血清判定來自患有腫細胞癌(n=7)(圖8A-8F及圖9A-9F)、局灶結節性增生(n=4)(圖10A-10F)、肝血管瘤(n=2)(圖11A及11B)、慢性活性B型肝炎(n=2)(圖12A及12B)或慢性活性C型肝炎(n=4)(圖13A-13D)及轉移癌(n=4)(亦即，肝內膽管癌、轉移性結腸直腸腺癌或轉移性卵巢癌)(圖14A-14D)之患者之組織切片中PLVAP表現之定位。結果展示僅肝細胞癌之毛細管內皮細胞表現PLVAP蛋白(圖8A、8C、8E及圖9A、9C、9E、9F)。非腫瘤肝組織(包括肝硬化症肝臟、局灶結節性增生(圖10A-10F)及慢性肝炎(圖12A及12B，圖13A-13D)之肝臟)之內襯血管竇/毛細管之內皮細胞不表現PLVAP蛋白。肝血管瘤之內皮內襯細胞亦未展示顯著PLVAP表現(圖11A及11B)。此等結果證明PLVAP為肝細胞癌而非其他肝病之特異性血管內皮生物標誌。因此，PLVAP可用作HCC之診斷標誌及治療標靶。
實施例3：特異性結合PLVAP之小鼠單株抗體之產生及表徵 材料及方法 免疫程序
最初用溶解於0.125mL磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中且在等體積完全弗氏佐劑中乳化之20μg經純化重組PLVAP蛋白免疫5隻6週齡雌性Balb/cByJ小鼠。將PLVAP-佐劑混合物以0.05mL體積注射至小鼠腹側接近 腋窩及腹股溝淋巴結之4個獨立皮下部位中之每一者以及位於肩胛間之第5個皮下部位。所有小鼠接受每兩週一次20μg經腹膜內注射之重組PLVAP蛋白之加強免疫3次。最後一次加強免疫後1週，進行測試取血以量測小鼠是否產生顯著高效價之抗PLVAP抗體(大於10,000倍)。使用固相酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)以達成此目的。選擇產生最高效價之PLVAP抗體的小鼠來製備融合瘤。
鼠類單株抗PLVAP抗體之產生
在產生融合瘤之預定融合實驗前3天，給產生最高效價之PLVAP抗體的小鼠靜脈內注射20μg重組PLVAP。根據先前所述之方案(參見Current Protocols in Immunology，編者：Coligan JE,Kruisbeek AM,Margulies DH,Shevach EM及Strober W.,John Wiley & Sons,Inc.,New York,2001年出版，第2.5單元Production of Monoclonal Antibodies)稍作修改製備產生抗PLVAP之單株抗體(MAb)的融合瘤。特定言之，使用50%聚乙二醇1540將自經免疫小鼠採集之脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以7.5：1(脾細胞：骨髓瘤細胞)之比率融合。將融合產物接種於96孔平底組織培養盤中，且在次日添加次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)選擇性培養基。7至10天後，藉由ELISA針對抗PLVAP抗體之產生篩選生長陽性孔之上清液。擴增最初產生抗PLVAP MAb之融合瘤且再篩選。藉由有限稀釋法選殖展示持續產生抗體之融合瘤。使用ELISA判定MAb同型。藉由蛋白G親和力管柱層析自腹水或培養基純化單株抗體(Current Protocols in Immunology，編者：Coligan JE,Kruisbeek AM,Margulies DH,Shevach EM及Strober W.,John Wiley & Sons,Inc.,New York,2001年出版，第2.7單元Purification and Fragmentation of Antibodies)。
ELISA檢定
如本文中所述來執行Elisa檢定(參見實施例2)。
結合親和力測定
在ANT Technology Co.,Ltd.(Taipei,Taiwan)使用ANTQ300石英晶體微量天平技術(Lin S.等人，J Immunol Methods 239：121-124(2000))量測KFCC-GY4及KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體之結合親和力。
人類臍血管內皮細胞(HUVEC)之分離及培養
根據Baudin B,Brunee A,Bosselut N及Vaubourdolle M.Nature Protocols 2：481-485(2007)中所述之既定方案進行HUVEC之分離及培養。在內皮細胞培養物維持期間，使用溶解於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中之1%明膠(DIFCO,Corp.)替換膠原蛋白溶液來塗佈培養盤或蓋玻片。
藉由含曲拉通(Triton)X-114(TX-114)之緩衝液提取HUVEC之疏水性膜蛋白
將500,000個HUVEC接種於10cm培養皿中歷時24小時。接著用人類VEGF以40ng/ml刺激該等細胞再歷時72小時。將經培養細胞用5ml磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌兩次。接著藉由用含有2mM EDTA之1ml PBS培育自培養皿分離且提起細胞，將其置於離心管中，且藉由在300×g下離心5分鐘來收集。藉由離心產生之離心塊中存在大約兩百萬個細胞。將細胞離心塊再懸浮於含有5mM EDTA及0.5%(v/v)曲拉通X-114(TX-114)之200μl冰冷0.05M Tris緩衝液(pH 7.4)中。將所溶解之細胞懸浮液在冰上培育，偶爾輕微渦旋。隨後，在4℃下將細胞懸浮液在10,000×g下離心10分鐘以移除不可溶細胞碎片。將上清液轉移至乾淨的Microfuge管中且在 37℃下培育5分鐘。在培育期間，TX-114自水相分離出來。接著在室溫下將Microfuge管在1000×g下離心10分鐘，以將TX-114離心至管底。移除管頂之水相且將含有疏水性細胞蛋白質之TX-114離心塊溶解於2倍SDS丙烯醯胺凝膠樣本緩衝液中，最終體積為50μl。使用15μl樣本進行SDS丙烯醯胺凝膠電泳。
SDS丙烯醯胺凝膠電泳、西方墨漬製備及免疫墨漬分析
程序與先前Kao KJ,Scornik JC及McQueen CF.Human Immunol 27：285-297(1990)所述之程序相同，稍作修改。使用鹼性磷酸酶化學發光受質及LAS-4000發光影像分析儀(Fujifilm Corp.)來進行對西方墨漬上抗體結合之偵測。
免疫螢光顯微術 材料：
1)第一抗體：a)正常小鼠IgG(Sigma Corp.，目錄號：I-5381)，以1mg/mL溶解於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中作為儲備溶液，在使用前用PBS-0.5% BSA稀釋至5μg/mL之濃度；b)單株小鼠抗人類von Willebrand因子(vWF)(DakoCytomation Corp.，目錄號：M0616)，在使用前用含有0.5% BSA之PBS稀釋50倍；c)經純化KFCC-GY4及KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體，在使用前用含有0.5% BSA之PBS稀釋至5μg/ml；2)第二抗體：FITC接合山羊F(ab')2抗小鼠IgG(重鏈及輕鏈)(Serotec,Corp.，目錄號：Star105F)； 3)含DAPI之VectaShield封固介質(Vector Labs,Corp.，目錄號：H-1200)；4)100%甲醇(Merck corp.，目錄號：1.06009)；及5)漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS)(Gibco,Corp.，目錄號：12065-056)，在使用前稀釋至1倍。
程序：
為製備用於免疫螢光研究之人類臍帶血管內皮細胞，將50,000個細胞置於24孔培養盤之每一孔中，在各孔之底部置放有1.5cm無菌圓形蓋玻片。各孔含有0.5ml補充有20%胎牛血清、1% L-麩醯胺酸、1%抗生素/抗真菌溶液、50μg/ml肝素及75μg/ml內皮細胞生長補充劑(Sigma,Corp.E0760)之M199培養基。將各蓋玻片用200μl於0.04%乙酸(v/v)中之0.4mg/ml小牛皮膠原蛋白(Sigma Corp.C9791)預塗佈隔夜。接著將蓋玻片用無菌1倍磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌，且隨後風乾以供使用。將細胞培養隔夜且接著再用40ng/ml血管內皮生長因子(VEGF)刺激72小時。使用蓋玻片上之細胞進行免疫螢光程序。
為將細胞染色以進行免疫螢光顯微術，用0.5ml 1倍HBSS洗滌生長於各孔中之蓋玻片上之細胞。接著在0.5ml冰冷甲醇中將細胞固定且增強通透性歷時5分鐘。將經固定細胞用0.5ml 1倍PBS洗滌3次，每次洗滌5分鐘。接著在室溫下將經固定細胞用含有0.5% BSA之0.5ml 1倍PBS阻斷1小時。移除含有經固定細胞之蓋玻片且將其置於0.2ml經稀釋第一抗體溶液之上，該溶液含有5μg/ml正常IgG、KFCC-GY4或KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體或抗人類vWF單株抗體之50倍稀釋液，其中經固定細胞朝下且接 觸抗體溶液。在有蓋的塑料小容器中將抗體溶液置於一片石蠟上。藉由置放一小片用水潤濕的濾紙來維持內部濕度。
在37℃下於潮濕容器中培育1小時後，移除蓋玻片且將蓋玻片上之細胞用0.5ml PBS洗滌3次，每次5分鐘。接著在37℃下如針對使用第一抗體溶液培育所述將經固定細胞用0.2ml經200倍稀釋之FITC接合山羊F(ab')2抗小鼠IgG第二抗體培育50分鐘。隨後，如上文所述將細胞用PBS洗滌3次。使用VectaShield抗褪色溶液將經染色細胞封固於載玻片上。自蓋玻片邊緣移除過量的封固介質且用指甲油密封邊緣。使用螢光顯微術檢查經染色細胞。
結果
用重組人類PLVAP蛋白免疫Balb/cByJ小鼠使得產生出產生識別人類PLVAP蛋白之單株抗體(mAb)的融合瘤。選擇兩種融合瘤作進一步研究。將由此等融合瘤產生之抗體命名為KFCC-GY4及KFCC-GY5。單株抗體KFCC-GY4及KFCC-GY5之VH及VL域及此等域之CDR之序列分別展示於圖15A及15B及圖16A及16B中。
在ELISA(圖17)及免疫墨漬(圖18C及18D)檢定中KFCC-GY4與KFCC-GY5單株抗體均結合重組PLVAP蛋白。
此等抗體亦在免疫墨漬檢定中與來自人類臍帶血管內皮細胞之提取物中之PLVAP蛋白特異性反應(圖19B及19D)。另外，免疫螢光染色實驗展示KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體與表現PLVAP之人類血管內皮細胞結合(圖20C及20D)。
使用ANTQ300石英晶體微量天平(Lin等人，J.Immunol.Methods 239：121-124,2000)測定單株抗體與重組PLVAP蛋白之結合親和力(Kd)為0.41×10-7M(KFCC-GY5 mAb)及0.6×10-7M(KFCC-GY4 mAb)。
使用KFCC-GY4或KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體對來自兩名不同肝細胞瘤患者之肝臟的肝細胞瘤切片執行之免疫組織化學實驗展示KFCC-GY5單株抗體(圖21A、21C)在血管內皮細胞中產生比KFCC-GY4單株抗體(圖21B、21D)強的信號。
使用KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體對來自4名不同的經隨機選擇之肝細胞瘤患者之樣本執行來自同一患者之肝臟的相鄰肝細胞瘤及非腫瘤肝組織切片之免疫組織化學實驗。在肝細胞瘤組織(圖22A、22C、22E及22G)之血管內皮細胞中偵測到PLVAP表現，而在相鄰非腫瘤肝組織(圖22B、22D、22F及22H)中未偵測到PLVAP表現。
實施例4：PLVAP蛋白在血管內皮細胞之表面上表現 材料及方法 免疫螢光顯微術 試劑：
用於以下程序之試劑係如實施例3中所述，修改如下：˙1倍HBSS洗滌緩衝液含有0.1%疊氮化鈉，其係用於防止結合至細胞表面之抗體的胞飲作用；˙在含0.1%疊氮化鈉之1倍HBSS洗滌緩衝液中稀釋KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體。
程序：
如實施例3中所述執行人類臍帶血管內皮細胞(HUVEC)之免疫螢光 染色，其中例外為不用甲醇將細胞固定及增強通透性。而是，在用抗PLVAP單株抗體培育後，洗滌細胞且在室溫下用4%聚甲醛固定10分鐘。在此培育後，將細胞洗滌3次，接著用FITC接合山羊F(ab')2抗小鼠IgG培育。再洗滌3次後，如實施例3中所述處理細胞以進行免疫螢光顯微術。
結果
使用上文所述之方法，僅可偵測到表現於細胞表面上之PLVAP蛋白。此等實驗之結果揭示KFCC-GY4與KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體均結合至HCC血管內皮細胞之表面(圖23B、23C)，從而表明PLVAP蛋白係表現於此等細胞之表面上。此等研究結果表明以高親和力特異性結合PLVAP之抗體在注射至肝細胞癌腫瘤之血管中後會能夠結合至HCC血管內皮細胞之表面。
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<223> 重組His-標記的人類PLVAP胺基酸殘基51-442之編碼序列
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Claims (16)

  1. 一種特異性結合SEQ ID NO：23之經分離多肽，其包含：選自由以下者組成之群的抗體可變域：1)包含以下者之抗體可變域：a)由SEQ ID NO：5組成之CDR1；b)由SEQ ID NO：6組成之CDR2；及c)由SEQ ID NO：7組成之CDR3；2)包含以下者之抗體可變域：d)由SEQ ID NO：10組成之CDR1；e)由SEQ ID NO：11組成之CDR2；及f)由SEQ ID NO：12組成之CDR3；及3)其組合。
  2. 如申請專利範圍第1項之經分離多肽，其中該多肽為抗體。
  3. 如申請專利範圍第2項之經分離多肽，其中該抗體以約0.6×10-7M之結合親和力與SEQ ID NO：23結合。
  4. 如申請專利範圍第2項之經分離多肽，其中該抗體係選自由以下者組成之群：單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人化抗體、人類抗體及抗原結合片段。
  5. 如申請專利範圍第2項之經分離多肽，其中該抗體包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的VH域。
  6. 如申請專利範圍第2項之經分離多肽，其中該抗體包含具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的VL域。
  7. 如申請專利範圍第1項之經分離多肽，其中該多肽包含標記。
  8. 如申請專利範圍第7項之經分離多肽，其中該標記係選自由放射性同位素及細胞毒性劑所組成之群。
  9. 一種特異性結合SEQ ID NO：23之經分離多肽，其包含至少一個選自由以下者組成之群的抗體可變域：1)包含以下者之抗體可變域：a)由SEQ ID NO：15組成之CDR1；b)由SEQ ID NO：16組成之CDR2；及c)由SEQ ID NO：17組成之CDR3；2)包含以下者之抗體可變域：d)由SEQ ID NO：20組成之CDR1；e)由SEQ ID NO：21組成之CDR2；及f)由SEQ ID NO：22組成之CDR3；及3)其組合。
  10. 如申請專利範圍第9項之經分離多肽，其中該多肽為抗體。
  11. 如申請專利範圍第10項之經分離多肽，其中該抗體以約0.4×10-7M之結合親和力與SEQ ID NO：23結合。
  12. 如申請專利範圍第10項之經分離多肽，其中該抗體係選自由以下者組成之群：單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人化抗體、人類抗體及抗原結合片段。
  13. 如申請專利範圍第10項之經分離多肽，其中該抗體包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VH域。
  14. 如申請專利範圍第10項之經分離多肽，其中該抗體包含具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的VL域。
  15. 如申請專利範圍第9項之經分離多肽，其中該多肽包含標記。
  16. 如申請專利範圍第15項之經分離多肽，其中該標記係選自由放射性同位素及細胞毒性劑所組成之群。
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