BRPI0908737B1 - Anticorpo, seu uso e método de diagnóstico de carcinoma hepatocelular - Google Patents

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Abstract

MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR CARCINOMA HEPATOCELULAR (HCC), POLIPEPTÍDEO, ANTICORPO, KIT DIAGNÓSTICO PARA A DETECÇÃO DE CARCINOMA HEPATOCELULAR, BEM COMO USO DE ANTICORPO NO TRATAMENTO E DETECÇÃO DE CARCINOMA HEPATOCELULAR. A presente invenção refere-se a métodos para diagnosticar e métodos para tratar carcinoma hepatocelular em um indivíduo. A invenção refere-se também a antagonistas de proteínas PLVAP, tais como anticorpos que se ligam especificamente a proteína PLVAP, bem como composições e kits que compreendem antagonistas de proteínas PLVAP. A invenção refere-se ainda a anticorpos humanizados que se ligam especificamente à proteína PLVAP.

Description

Pedido de Patente Afim
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente provisória US no 61/069.910, depositado em 19 de março de 2008. O teor inteiro do pedido de patente acima é aqui incorporado como refe-rência.
Antecedentes da Invenção
[002] O carcinoma hepatocelular (HCC) é a malignidade primária mais frequente do fígado e é o quinto câncer mais comum em seres humanos no mundo inteiro. O HCC é também a quarta maior causa de morte relacionada a câncer (Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P., "Estimating the world cancer burden: Globocan 2000", Int. J. Cancer 2001;94:153-156). Em 1990, a Organização Mundial da Saúde estimou que houve cerca de 430.000 novos casos de câncer do fígado no mundo inteiro, e que um número similar de pacientes morreu naquele ano como resultado desta doença.
[003] A patogênese de HCC foi associada a infecções do vírus B de hepatite crônica (HBV) e ao vírus C de hepatite, bem como condições hepáticas indutoras de cirrose (Bruix J, et al. J. Hepatol. 35:421430, 2001; Bruix J, et al. Cancer Cell 5:215-219, 2004). Consequentemente, a incidência de HCC é mais alta em países do leste asiático, tais como China, Hong Kong, Taiwan, Coreia, e Japão, onde as infecções por HBV e HCV são mais prevalentes (Bruix J, et al. Cancer Cell 5:215-219, 2004; Haskell CM. Capítulo 46 "Liver: Natural History, Diagnosis and Staging" em "Cancer Treatment", 5a edição, W. B, Saunders Company, Filadélfia, editores:Haskell CM & Berek JS). Entretanto, a incidência de HCC nos países ocidentais está aumentando regularmente (Parkin DM, et al., Int. J. Cancer 94;153-156, 2001). Durante a última década nos Estados Unidos, HCC apresentou o segundo mais alto aumento em incidência, e o mais alto aumento do índice de mortalidade, entre todos os cânceres (Ann. Int. Med. 139:817-823, 2003). Assim sendo, nos Estados Unidos e no mundo inteiro, HCC é a principal causa de mortalidade e morbidade, e um ônus econômico significativo devido aos custos hospitalares e perda de trabalho por pessoas com HCC.
[004] O controle exitoso de HCC requer o diagnóstico correto da doença em um estágio precoce da progressão da doença. Entretanto, distinguir pequenos tumores de HCC de outras doenças malignas ou não malignas do fígado, incluindo tumores metastáticos, colangiocar- cinoma, hiperplasia nodular focal, nódulos displásicos do fígado e nódulos regenerantes do fígado, usando as técnicas atuais, tais como estudos de imagens, biópsia do núcleo com agulha e/ou aspiração com agulha fina, demonstrou ser desafiador (Ferrell LD, et al., Am. J. Surg. Pathol. 17:1113-1123, 1993; Horigome H, et al., Hepato- Gatroenterology 47:1659-1662, 2000; Kalar, S., et al. Arch. Pathol. Lab. Med. 131:1648-1654, 2007; Seki, S, et al. Clin. Cancer Res. 6:3460-3473, 2000). Além disso, as tentativas para tratar HCC tera- peuticamente foram largamente malsucedidas (Bruix, J., et al., J. Hepatol. 35:421-430, 2001; Bruix, J., et al. Cancer Cell 5:215-219, 2004; Haskell, C.M., capítulo 46, "Liver: Natural History, Diagnosis and Staging" em "Cancer Treatment", 5a edição, W. B. Saunders Company, Filadélfia, editores: Haskell CM & Berek JS; Szklaruk J., et al. AJR 180:441-453, 2003). Como resultado, apesar da terapia ativa, a taxa de sobrevivência em 5 anos de pacientes com HCC nos Estados Unidos é de apenas 10,5%, que é a segunda em magnitude perdendo apenas para câncer pancreático (ACS Cancer Facts & Figures (2007)). Assim sendo, há uma necessidade urgente de identificar um marcador mais confiável para diferenciar HCC e outras patologias hepáticas e facilitar a detecção precoce desta doença. Além disso, há uma necessidade urgente de desenvolver agentes terapêuticos novos e mais eficazes para o tratamento de HCC.
Sumário da Invenção
[005] A presente invenção engloba, em uma modalidade, um método para tratar carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo (por exemplo, um ser humano) que necessita deste tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um antagonista da Proteína Associada às Vesículas do Plasmalema (PLVAP) que inibe a formação, crescimento e/ou progressão de um ou mais tumores de HCC no fígado do indivíduo. Em uma modalidade, o antagonista de PLVAP é um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína PLVAP (por exemplo, uma proteína PVLAP humana). Em uma modalidade específica, o antagonista de PLVAP é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico, tal como um agente quimioterápico.
[006] Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método para tratar carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo que necessita deste tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína PLVAP e pelo menos um agente qui- mioterápico. O anticorpo que se liga especificamente a uma proteína PLVAP é administrado ao indivíduo por infusão intra-arterial (por exemplo, infusão arterial hepática, quimioembolização transarterial) e pode inibir a formação de tumores, crescimento de tumores, vascularização de tumores ou progressão de tumores no fígado do indivíduo. Em uma modalidade específica, o anticorpo é distribuído para células endoteliais de vasos sanguíneos dentro de um tumor de HCC ou que o circundam no fígado do indivíduo.
[007] Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método para diagnosticar carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo (por exemplo, um ser humano), compreendendo detectar o nível de um produto gênico de PLVAP (por exemplo, RNA de PLVAP, proteína PLVAP) em uma amostra do indivíduo e determinar que o nível do produto gênico de PLVAP na amostra está aumentado em relação a um controle. De acordo com a invenção, um nível aumentado do produto gênico de PLVAP na amostra em relação ao controle é indicativo da presença de HCC no indivíduo. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga especificamente a PLVAP é usado para detectar o nível de uma proteína PLVAP em uma amostra do indivíduo.
[008] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um método para diagnosticar um carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo, compreendendo detectar a expressão de um produto gênico de PLVAP em uma amostra de tecido do fígado do indivíduo. De acordo com a invenção, a expressão do produto gênico de PLVAP na amostra de tecido do fígado é indicativa de HCC. Em uma modalidade específica, a expressão de um produto gênico de PLVAP é detectada em células endoteliais vasculares na amostra de tecido do fígado.
[009] Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a um método in vivo para detectar HCC em um indivíduo (por exemplo, um ser humano), compreendendo administrar um anticorpo marcado com ra- dioisótopo que se liga especificamente a PLVAP, por injeção intraarterial ou intravenosa, obter uma imagem do fígado do indivíduo e detectar a acumulação do anticorpo no fígado do indivíduo. De acordo com a invenção, a detecção da acumulação do anticorpo no fígado é indicativa de HCC no indivíduo.
[010] Em outra modalidade, e invenção fornece um polipeptídeo isolado que se liga especificamente a uma proteína PVLAP de mamífero (por exemplo, ser humano). Em uma modalidade específica, o po- lipeptídeo é um anticorpo. Em outra modalidade, o anticorpo é um an- ticorpo que compete com o anticorpo monoclonal KFCC-GY4 ou KFCC-GY5 pela ligação a uma proteína PLVAP humana.
[011] Em outra modalidade, a invenção engloba uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um antagonista de PLVAP e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, o antagonista de PLVAP é um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína PLVAP (por exemplo, uma proteína PLVAP humana). Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente terapêutico, tal como um agente quimioterápico.
[012] Em uma modalidade adicional, a invenção refere-se a um kit para diagnosticar HCC em um indivíduo. Em uma modalidade, o kit inclui pelo menos uma sonda de ácido nucleico que hibridiza especificamente para um transcrito do RNA de PLVAP (por exemplo, sob condições de alta severidade). Em outra modalidade, o kit compreende um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a uma proteína PLVAP (por exemplo, uma proteína PLVAP humana).
[013] Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a um método para tratar carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo que necessita deste tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humanizado que se liga especificamente a PLVAP. Em uma modalidade específica, o anticorpo é administrado ao indivíduo por infusão intra-arterial (por exemplo, infusão arterial hepática, quimioembolização transarterial) e pode inibir a formação de tumores, crescimento de tumores, vascularização de tumores ou progressão de tumores no fígado do indivíduo.
[014] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado que compete especificamente com o anticorpo monoclonal KFCC-GY4 ou anticorpo monoclonal KFCC-GY5 pela ligação a SEQ ID N°:23.
Breve Descrição dos Desenhos
[015] A figura 1 é um fluxograma que representa um algoritmo para a identificação de genes que apresentam expressão diferencial extrema entre tumor e tecidos não-tumorosos adjacentes.
[016] A figura 2 é um gráfico que representa as intensidades da expressão de genes de PLVAP em HCC emparelhado (PHCC) e amostras (n = 18) de tecidos hepáticos não-tumorosos (PN), bem como amostras (n = 82) de HCC não emparelhadas, determinadas por execução do perfil de transcritos de mRNA, usando chips de genes Affymetrix.
[017] A figura 3A é um gráfico que representa as quantidades relativas da expressão de PLVAP em amostras emparelhadas de HCC (PHCC) e tecidos hepáticos não-tumorosos adjacentes (PN), determinadas por RT-PCR quantitativa Taqman. Os níveis do mRNA de PLVAP são significativamente mais altos em tecidos hepáticos não- tumorosos em relação a HCC.
[018] A figura 3B é um gráfico que representa as intensidades da expressão do gene de PLVAP em 18 amostras de tecidos hepáticos emparelhados de HCC (PHCC) e não-tumorosos adjacentes, determinadas por análise de microarranjos. Os níveis de transcritos de PLVAP foram mais altos em HCC do que em tecido hepático não-tumoroso adjacente de cada individual para cada um dos indivíduos testados exceto um.
[019] As figuras 4A e 4B ilustram a sequência de nucleotídeos (SEQ ID N°:1) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N°:2) da proteína de fusão recombinante das proteínas PLVAP51 - 442 humanas marcadas com His usadas para gerar antissoros policlonais anti- PLVAP do camundongo.
[020] A figura 5 é uma imagem de um Western blot que representa a detecção de proteína PVLAP recombinante antes e depois da di- gestão por trombina para remover o marcador His. As setas à esquerda da mancha indicam as localizações de His-PLVAP e PLVAP sobre a mancha. Os números à esquerda da mancha indicam as posições de padrões de peso molecular.
[021] A figura 6A é um gráfico que representa a presença de quantidades relativas significativas do mRNA de PLVAP em células endoteliais de HCC obtidas por microdissecação por captura a laser de duas amostras de tecidos de HCC (Amostra A (preta) e Amostra B (cinza)), determinada por RT-PCR quantitativa em tempo real e duas etapas. As linhas tracejadas representam sinais de RT-PCR quantitativa Taqman a partir do mRNA de beta-actina nas mesmas amostras usadas para a RT-PCR quantitativa do mRNA de PLVAP. Os resultados indicam a presença de mRNA de PLVAP facilmente mensurável nas células endoteliais dissecadas (linhas cheias).
[022] A figura 6B é um gráfico que representa a ausência de quantidades relativas significativas do mRNA de PLVAP em células obtidas por microdissecação por captura a laser de tecido hepático não-tumoroso adjacente ao tecido de HCC em duas amostras de HCC (Amostra A (preta) e Amostra B (cinza)), determinadas por RT-PCR quantitativa em tempo real e duas etapas Taqman. Os resultados indicam nenhum mRNA de PLVAP detectável (linha preta cheia) e escassamente detectável (linha cinza cheia) nas células dissecadas.
[023] A figura 6C é um gráfico que representa as quantidades relativas do mRNA de PLVAP em células de tumores HCC obtidas por microdissecação por captura a laser de duas amostras de tecido de HCC (Amostra A (preta) e Amostra B (cinza)), determinadas por RT- PCR quantitativa em tempo real e duas etapas Taqman. Os resultados indicam a presença de quantidades muito pequenas do mRNA de PLVAP (linhas cheias) nas células de HCC dissecadas devido a uma mínima contaminação inevitável a partir da parte de células endoteliais vasculares afixadas às células de HCC dissecadas.
[024] A figura 7 é um gráfico que representa a titulação do anticorpo anti-PLVAP no antissoro do camundongo gerado contra a proteína PLVAP51-442 recombinante, determinada por ELISA.
[025] As figuras 8A-8F são imagens que ilustram seções de HCC pareado fixadas em formalina (figuras 8A, 8C, 8E) e tecidos hepáticos não-tumorosos adjacentes (figuras 8B, 8D, 8F) de três pacientes com carcinoma hepatocelular que foram corados de forma imuno- histoquímica usando antissoros policlonais anti-PLVAP para detectar a localização da proteína PLVAP. Os tecidos pareados estão ilustrados nas figuras 8A, 8B; figuras 8C, 8D; e figuras 8E, 8F. A proteína PLVAP, que aparece como uma coloração marrom (setas) nas imagens de HCC, foi detectada apenas em células endoteliais capilares de carcinomas hepatocelulares (figuras 8A, 8C, 8E). Nenhum HCC de- tectável estava presente em tecido hepático não-tumoroso (figuras 8B, 8D, 8F).
[026] As figuras 9A-9F são imagens que ilustram seções de HCC fixado em formalina (figuras 9A, 9C, 9E, 9F) e tecidos hepáticos não tumorosos (figuras 9B, 9D) de três pacientes adicionais com carcinoma hepatocelular que foram corados de forma imuno-histoquímica usando antissoros policlonais anti-PLVAP para detectar a localização da proteína PLVAP. As figuras 9A, 9B e as figuras 9C, 9D ilustram amostras de tecidos de HCC pareados e tecido hepático não-tumoroso adjacente. A proteína PLVAP, que aparece como uma coloração marrom (setas) nas imagens de HCC, foi detectada apenas em células endoteliais capilares de carcinomas hepatocelulares (figuras 9A, 9C, 9E, 9F). Nenhum HCC detectável estava presente em tecido hepático não-tumoroso (figuras 9B, 9D).
[027] As figuras 10A-10F são imagens que ilustram seções de tecidos de hiperplasia nodular focal fixados em formalina de seis paci- entes diferentes que foram corados de forma imuno-histoquímica usando antissoros policlonais anti-PLVAP para detectar a localização da proteína PLVAP. A proteína PLVAP não foi detectada em células endoteliais que revestem capilares sinusoides de tecidos hepáticos não tumorosos de hiperplasia nodular focal. Alguma coloração positiva (marrom) foi notada em células epiteliais de dutos biliares (figuras 10A, 10D e 10F) e vasos dos tratos portais (figuras 10D e 10F), mas não em células endoteliais do parênquima hepático. A coloração positiva de células endoteliais de dutos biliares deveu-se à ligação de anticorpos inespecíficos no antissoro de PLVAP.
[028] As figuras 11A e 11B são imagens que ilustram seções de tecidos fixados em formalina de dois pacientes com hemangioma hepático que foram corados de forma imuno-histoquímica com antissoro policlonal anti-PLVAP. Células do revestimento endotelial de hemangioma hepático não apresentaram expressão significativa de proteína PLVAP.
[029] As figuras 12A e 12B são imagens que ilustram seções de tecido fixado em formalina de dois pacientes com hepatite B ativa crônica que foram corados de forma imuno-histoquímica com antissoro policlonal anti-PLVAP. A proteína PLVAP não foi detectada em células endoteliais que revestem os capilares sinusoides vasculares de tecidos hepáticos não tumorosos de pacientes com hepatite B crônica.
[030] As figuras 13A-13D são imagens que ilustram seções de tecido fixado em formalina de três pacientes diferentes com hepatite C ativa crônica que foram corados de forma imuno-histoquímica com an- tissoro policlonal anti-PLVAP. As seções teciduais ilustradas nas figuras 13B e 13D são do mesmo paciente. A proteína PLVAP não foi detectada em células endoteliais que revestem os capilares sinusoides vasculares de tecidos hepáticos não-tumorosos de pacientes com hepatite C crônica.
[031] As figuras 14A-14D são imagens que ilustram seções de tecido fixado em formalina de três pacientes diferentes com cânceres hepáticos metastáticos que foram corados de forma imuno- histoquímica com antissoro policlonal anti-PLVAP. As seções dos tecidos são de pacientes com adenocarcinoma colorretal metastático (figura 14A), colangiocarcinoma intra-hepático (figuras 14B e 14C) ou carcinoma ovariano metastático (figura 14D). As seções do tecido ilustradas nas figuras 14B e 14C são do mesmo paciente. A proteína PLVAP não foi detectada em células endoteliais que revestem os capilares sinusoides vasculares de tecidos de câncer metastático.
[032] A figura 15A ilustra o gene de nucleotídeo (no topo) (SEQ ID N°:3) e as sequências de aminoácidos deduzidas (no meio) (SEQ ID N°:4) do domínio VH do anticorpo monoclonal KFCC-GY4. As sequências de resíduos de aminoácidos em CDRs 1 (SEQ ID N°:5), 2 (SEQ ID N°:6) e 3 (SEQ ID N°:7) também estão indicadas (no fundo).
[033] A figura 15B ilustra o gene de nucleotídeo (no topo) (SEQ ID N°:8) e as sequências de aminoácidos deduzidas (no meio) (SEQ ID N°:9) do domínio VL do anticorpo monoclonal KFCC-GY4. As sequências de resíduos de aminoácidos em CDRs 1 (SEQ ID N°:10), 2 (SEQ ID N°: 11) e 3 (SEQ ID N°:12) também estão indicadas (no fundo).
[034] A figura 16A ilustra o gene de nucleotídeo (no topo) (SEQ ID N°:13) e as sequências de aminoácidos deduzidas (no meio) (SEQ ID N°:14) do domínio VH do anticorpo monoclonal KFCC-GY5. A sequência de resíduos de aminoácidos nas CDRs 1 (SEQ ID N°:15), 2 (SEQ ID N°:16) e 3 (SEQ ID N°:17) também estão indicadas (no fundo).
[035] A figura 16B ilustra o gene de nucleotídeo (topo) (SEQ ID N°:18) e as sequências de aminoácidos deduzidas (no meio) (SEQ ID N°:19) do domínio VL do anticorpo monoclonal KFCC-GY5. A sequência de resíduos de aminoácidos nas CDRs 1 (SEQ ID N°:20), 2 (SEQ ID N°:21) e 3 (SEQ ID N°:22) também estão indicadas (no fundo).
[036] A figura 17 é um gráfico que representa a ligação dos anticorpos monoclonais KFCC-GY4 (círculos vazados) e KFCC-GY5 (círculos cheios) à proteína PLVAP recombinante em várias concentrações dos anticorpos, determinada por ELISA.
[037] A figura 18 é um immunoblot que ilustra que os anticorpos monoclonais KFCC-GY4 e KFCC-GY5 podem detectar 5 ng da proteína PLVAP recombinante PLVAP. Fileira 1: padrão de peso molecular; Fileira 2: immunoblot com o anticorpo monoclonal KFCC-GY4; Fileira 3: immunoblot com o anticorpo monoclonal KFCC-GY5.
[038] O peso molecular da proteína PLVAP recombinante é 45 kD.
[039] As figuras 19A e 19C são géis de acrilamida SDS corados com azul de Coomassie. Fileira 1: padrão de peso molecular; Fileira 2: proteínas de membrana hidrofóbica extraídas com TX-114 de células endoteliais vasculares do cordão umbilical que foram estimuladas com VEGF (40 ng/mL) por 72 horas antes da extração.
[040] A figura 19B é um immunoblot, onde o extrato ilustrado na Fileira 2 da figura 19A foi sondado com o anticorpos monoclonais KFCC-GY4. Fileira 1: padrão de peso molecular; Fileira 2: proteínas de membrana hidrofóbica extraídas com TX-114 de células endoteliais vasculares do cordão umbilical humano que tinham sido estimuladas com VEGF (40 ng/mL) por 72 horas antes da extração.
[041] A figura 19D é um immunoblot, onde o extrato ilustrado na Fileira 2 da figura 19C foi sondado com anticorpos monoclonais KFCC- GY-5. Fileira 1: padrão de peso molecular; Fileira 2: proteínas de membrana hidrofóbica extraídas com TX-114 de células endoteliais vasculares do cordão umbilical humano que tinham sido estimuladas com VEGF (40 ng/mL) por 72 horas antes da extração.
[042] A figura 20A é uma micrografia de fluorescência que representa a coloração de imunofluorescência de células endoteliais vascu- lares humanas (HUVEC) com IgG do camundongo normal do controle. Os núcleos foram corados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Ampliação = 600x.
[043] A figura 20B é uma micrografia de fluorescência que representa a coloração de imunofluorescência de células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) com anticorpo monoclonal para o fator de von Willebrand (VWF). VWF é um marcador positivo para células en- doteliais vasculares humanas. Os núcleos foram corados com 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI). Ampliação = 600x.
[044] A figura 20C é uma micrografia de fluorescência que representa a coloração de imunofluorescência de células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) com o anticorpo monoclonal KFCC- GY4 para PLVAP. Os anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC- GY4 reagiram positivamente com células endoteliais vasculares humanas. Os núcleos foram corados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Ampliação = 600x.
[045] A figura 20D é uma micrografia de fluorescência que representa a coloração de imunofluorescência de células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) com o anticorpo monoclonal KFCC- GY5 para PLVAP. Os anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC- GY5 reagiram positivamente com as células endoteliais vasculares humanas. Os núcleos foram corados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Ampliação = 600x.
[046] A figura 21A é uma micrografia de luz de uma seção de tecido de hepatoma fixado em formalina embutida em um bloco de parafina, que foi corada com anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC-GY5. Um intenso sinal de PLVAP (coloração cinza-escuro) foi detectado em células endoteliais vasculares de hepatoma. A ampliação é 100X.
[047] A figura 21B é uma micrografia de luz de uma seção de tecido de hepatoma fixado em formalina do mesmo paciente que a amostra ilustrada na figura 21A, que foi corada com anticorpos mono- clonais anti-PLVAP KFCC-GY4. Um sinal moderado de PLVAP (coloração cinza-claro) foi detectado em células endoteliais vasculares de hepatoma. A ampliação é 100X.
[048] A figura 21C é uma micrografia de luz de uma seção de tecido de hepatoma fixado em formalina de um paciente diferente daquele das ilustradas nas figuras 21A e 21B, que foi corada com anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC-GY5. Um sinal intenso de PLVAP (coloração cinza-escuro) foi detectado em células endoteliais vasculares. A ampliação é 100X.
[049] A figura 21D é uma micrografia de luz de uma seção de tecido de hepatoma fixado em formalina do mesmo paciente que o da amostra ilustrada na figura 21C embutida em um bloco de parafina, que foi corado com anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC-GY4. Um sinal moderado de PLVAP (coloração cinza-claro) foi detectado em células endoteliais vasculares, indicando que os anticorpos mono- clonais KFCC-GY4 se ligam ao antígeno de PLVAP menos bem do que os anticorpos KFCC-GY5. A ampliação é 100X.
[050] As figuras 22A-H são micrografias de luz de seções de tecidos de hepatoma (figuras 22A, 22C, 22E, e 22G) e tecidos hepáticos não-tumorosos adjacentes (figuras 22B, 22D, 22F, e 22H) de quatro pacientes diferentes de hepatoma selecionados aleatoriamente. As seções foram coradas com anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC- GY5. O sinal de PLVAP (coloração cinza) foi detectado em células en- doteliais vasculares de tecido de hepatoma, mas não em células endo- teliais vasculares de tecido hepático não tumoroso. A ampliação é 100X. As figuras 22A e 22B, 22C e 22D, 22E e 22F, e 22G e 22H representam quatro conjuntos de tecidos hepáticos pareados de hepatoma e não tumorosos.
[051] A figura 23A é uma micrografia de fluorescência que repre- senta células endoteliais vasculares humanas (HUVECs) que foram coradas com IgG do camundongo de controle. Os núcleos foram corados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
[052] A figura 23B é uma micrografia de fluorescência que representa células endoteliais vasculares humanas (HUVECs) que foram coradas com o anticorpo monoclonal KFCC-GY4 para PLVAP. Os anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC-GY4 reagiram positivamente com as superfícies das células endoteliais vasculares humanas. Os núcleos foram corados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
[053] A figura 23C é uma micrografia de fluorescência que representa células endoteliais vasculares humanas (HUVECs) que foram coradas com o anticorpo monoclonal KFCC-GY5 para PLVAP. Os anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC-GY5 reagiram positivamente com as superfícies das células endoteliais vasculares humanas. Os núcleos foram corados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
[054] A figura 24 ilustra a sequência de aminoácidos da proteína PLVAP humana (Número de Acesso do banco de genes NP_112600; SEQ ID N°:23).
[055] As figuras 25A e 25B ilustram a sequência de nucleotídeos do cDNA de PLVAP humana de comprimento inteiro (Número de Acesso do banco de genes NM_031310; SEQ ID N°:24).
Descrição Detalhada da Invenção Definições
[056] Como aqui utilizados, os termos "Proteína Associada às Vesículas do Plasmalema", "PLVAP," e "PV-1" referem-se a uma proteína PLVAP de ocorrência natural ou endógena (por exemplo, mamífera, humana), e a proteínas que têm uma sequência de aminoácidos que é igual ou substancialmente igual àquela proteína PLVAP de ocorrência natural ou endógena (por exemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas). Consequentemente, os termos "Proteína Associ- ada às Vesículas do Plasmalema", "PLVAP", e "PV-1", que são aqui utilizados de forma intercambiável, incluem variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas de uma proteína PLVAP produzida, por exemplo, por divisão alternativa ou outros processos celulares, que ocorrem naturalmente em mamíferos (por exemplo, seres humanos). De preferência, a proteína PLVAP é uma proteína humana que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:23 (Vide Número de Acesso do banco de genes NP_112600 e figura 24).
[057] Como aqui definido, um "antagonista de PLVAP" é um agente (por exemplo, anticorpo, molécula pequena, peptídeo, pepti- domimético, ácido nucleico) que, em uma modalidade, inibe (por exemplo, reduz, impede) uma atividade de uma proteína PLVAP; ou, em outra modalidade, inibe (por exemplo, reduz, impede) a expressão de um gene e/ou produto gênico de PLVAP. As atividades de uma proteína PLVAP que podem ser inibidas por um antagonista da invenção incluem, porém sem limitações, a formação, crescimento, vascularização e/ou progressão de um tumor carcinoma hepatocelular. Em uma modalidade específica, o antagonista de PLVAP se liga especificamente a uma proteína PLVAP (por exemplo, humana) e inibe uma atividade da proteína PLVAP.
[058] Como aqui definido, "se liga especificamente" refere-se à ligação de um agente (por exemplo, um anticorpo) a um produto gêni- co de PLVAP (por exemplo, RNA, proteína) com uma afinidade (por exemplo, uma afinidade de ligação) que é pelo menos cerca de 5 vezes, de preferência pelo menos cerca de 10 vezes, maior do que a afinidade com a qual o antagonista de PLVAP se liga a uma proteína não-PLVAP.
[059] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" refere-se a um polímero de aminoácidos, e não a um comprimento específico. Assim sendo, "polipeptídeo" engloba proteínas, peptídeos, e oligopeptídeos.
[060] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a um po- lipeptídeo que tem afinidade por um alvo, antígeno, ou epitopo, e inclui anticorpos de ocorrência natural e também manipulados. O termo "anticorpo" engloba anticorpos policlonais, monoclonais, humanos, quiméricos, humanizados, "primatizados", embutidos, e de cadeia única, bem como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fv, Fc, Fd, Fab, Fab', F(ab'), scFv, scFab, dAb). (vide, por exemplo, Harlow et al., "Antibod- iesA Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
[061] O termo "região variável de anticorpo" refere-se à região de um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo (por exemplo, VH, VHH, VL), seja independentemente ou quando combinada com outras regiões variáveis do anticorpo (por exemplo, um par VH/VL).
[062] O termo "epitopo" refere-se a uma unidade de estrutura convencionalmente ligada por um par VH/VL do anticorpo. Um epitopo define o sítio de mínima ligação para um anticorpo e, assim sendo, representa o alvo de especificidade de um anticorpo.
[063] O termo "região determinante de complementaridade" ou "CDR" refere-se a uma região hipervariável de uma região variável de um anticorpo da cadeia pesada ou cadeia leve, que contém sequências de aminoácidos capazes de se ligar especificamente a um alvo antigênico (por exemplo, epitopo). Uma cadeia pesada ou leve típica deve ter três CDRs (CDR1, CDR2, CDR3), que são responsáveis pela especificidade do anticorpo por um epitopo específico.
[064] Como aqui definido, o termo "fragmento ligante de antíge- no" refere-se a uma parte de um anticorpo que contém uma ou mais CDRs e tem afinidade por um determinante antigênico por si só. Os exemplos não limitativos incluem fragmentos Fab, fragmentos F(ab)'2, dímeros de cadeias pesada/leve, e estruturas de cadeia única, tais como uma cadeia leve completa ou uma cadeia pesada completa.
[065] Como aqui utilizado, o termo "especificidade" refere-se à capacidade de um anticorpo se ligar preferencialmente a um epitopo, e não necessariamente infere alta afinidade.
[066] O termo "afinidade" refere-se a uma medida da intensidade de ligação entre um anticorpo e um determinante antigênico. A afinidade depende de inúmeros fatores, incluindo a proximidade de encaixe estereoquímico entre o anticorpo e o determinante antigênico, o tamanho da área de contato entre eles, e a distribuição de grupos eletricamente carregados e hidrofóbicos.
[067] Como aqui utilizado, o termo "constante de afinidade" ou "Kd" refere-se a uma constante de dissociação usada para medir a afinidade de um anticorpo por um antígeno. Quanto mais baixa a constante de afinidade, mais alta a afinidade da imunoglobulina pelo antí- geno ou determinante antigênico e vice-versa. Tal constante é facilmente calculada a partir das constantes de velocidades das reações de associação/dissociação, medidas por metodologia de cinética padrão para reações de anticorpos.
[068] Como aqui referido, o termo "compete" significa que a ligação de um primeiro polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) a um antíge- no-alvo é inibida pela ligação de um segundo polipeptídeo (por exemplo, anticorpo). Por exemplo, a ligação pode ser inibida estericamente, por exemplo, por bloqueio físico de um domínio de ligação ou por alteração da estrutura ou ambiente de um domínio de ligação, de tal modo que sua afinidade ou avidez por um alvo seja reduzida.
[069] Como aqui utilizado, o termo "peptídeo" refere-se a um composto que consiste em cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, onde o grupo amino de um aminoácido está ligado ao grupo carboxila de outro aminoácido por uma ligação peptídica. Tais peptídeos têm tipicamente menos do que cerca de 100 resíduos de aminoácidos de comprimento e, de preferência, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40 ou cerca de 50 resíduos.
[070] Como aqui utilizado, o termo "peptidomimético" refere-se a moléculas que não são peptídeos ou proteínas, mas que mimetizam aspectos das suas estruturas. Os antagonistas peptidomiméticos podem ser preparados por métodos químicos convencionais (vide, por exemplo, Damewood J.R. "Peptidomimetic Design with the Aid of Computational Chemistry" em "Reviews in Computational Biology", 2007, Volume 9, páginas 1-80, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1996; Kazmierski W.K., "Methods of Molecular Medicine: Peptidomime- tic Protocols" Humana Press, New Jersey, 1999).
[071] Os termos "carcinoma hepatocelular," "HCC," e "hepatoma" são aqui utilizados de forma intercambiável para se referirem a câncer que advém de hepatócitos, o principal tipo de célula do fígado.
[072] Como aqui definido, o termo "terapia" é a administração de um agente terapêutico ou profilático específico a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, um ser humano), que resulta em um benefício terapêutico ou profilático desejado para o indivíduo.
[073] Como aqui definido, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade suficiente para atingir o efeito terapêutico ou profilático desejado sob as condições de administração, tal como uma quantidade suficiente para inibir (isto é, reduzir, prevenir) a formação de tumor, crescimento de tumor (proliferação, tamanho), vascularização de tumor e/ou progressão de tumor (invasão, metástase) no fígado de um paciente com HCC. A eficácia de uma terapia (por exemplo, a redução/eliminação de um tumor e/ou prevenção do crescimento do tumor) pode ser determinada por qualquer método apropriado (por exemplo, imuno-histoquímica in situ, reprodução de imagens (ultrassom, varredura por TC, MRI, RMN), incorporação de 3H-timidina).
[074] Como aqui definido, um "esquema de tratamento" é um esquema no qual um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos são administrados a um indivíduo mamífero em uma dose específica (por exemplo, nível, medida, quantidade) e em um planejamento temporal específico ou em intervalos específicos (por exemplo, minutos, dias, semanas, meses).
[075] Como aqui utilizado, o termo "indivíduo" refere-se a um indivíduo mamífero. O termo "indivíduo mamífero" é aqui definido para incluir mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos), vacas, ovelhas, cabritos, cavalos, cães, gatos, coelhos, porquinhos-da- índia, ratos, camundongos ou outras espécies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedoras ou murinas. Os exemplos de indivíduos apropriados incluem, porém sem limitações, pacientes humanos que têm ou estão em risco de desenvolver HCC. Os exemplos de grupos de alto risco para o desenvolvimento de HCC incluem indivíduos com infecção de hepatite crônica (hepatite B, hepatite C) e indivíduos que têm cirrose do fígado ou condições hepáticas relacionadas.
[076] Os termos "prevenir" "prevenindo" ou "prevenção", como aqui utilizados, significam reduzir a probabilidade/possibilidade ou risco de formação ou progressão de tumor de HCC em um indivíduo, retardar o início de uma condição relacionada a HCC no indivíduo, minorar a gravidade de um ou mais sintomas de uma condição relacionada a HCC no indivíduo, ou qualquer combinação destas questões. Em geral, o indivíduo de um esquema preventivo mais possivelmente pode ser classificado como estando "em risco", por exemplo, o risco de o indivíduo desenvolver HCC é mais alto do que o risco de um indivíduo representado pela população regular relevante.
[077] Como aqui utilizados, os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento" significam neutralizar uma condição médica (por exemplo, uma condição relacionada a HCC) até o grau em que a condição médica é melhorada de acordo com um padrão clinicamente aceitável (por exemplo, número e/ou tamanho reduzido de tumores HCC no fígado de um indivíduo).
[078] Como aqui utilizados, os termos "baixa severidade", "média severidade", "alta severidade" ou "condições de severidade muito alta" descrevem condições para hibridização e lavagem de ácidos nuclei- cos. Uma orientação para realizar reações de hibridização pode ser encontrada em "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6, que é aqui incorporado como referência em sua totalidade. Métodos aquosos e não aquosos estão descritos nesta referência e qualquer um deles pode ser usado. As condições de hibridização específicas aqui referidas são as seguintes: (1) condições de hibridização de baixa severidade em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, e em seguida, duas lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS pelo menos a 50°C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55°C para condições de baixa severidade); (2) condições de hibridização de severidade média em 6X SSC a cerca de 45°C, e em seguida, uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 60°C; (3) condições de hibridização de alta severidade em 6X SSC a cerca de 45°C, e em seguida, uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65°C; e de preferência (4) as condições de hibridização de severidade muito alta são fosfato de sódio 0,5 M, 7% de SDS a 65°C, e em seguida, uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 1% de SDS a 65°C. As condições de severidade muito alta (4) são as condições preferidas e as que devem ser usadas, a menos que diferentemente especificado.
[079] A menos que diferentemente definidos, todos termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que aquele comumente entendido pelos versado na técnica (por exemplo, em cultura de célula, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridização e bioquímica). Técnicas usuais são usadas para métodos moleculares, genéticos e bioquímicos (vide genericamente, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e Ausubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology" (1999) 4a edição, John Wiley & Sons, Inc. que são aqui incorporados como referência) e métodos químicos.
PLVAP
[080] A proteína associada a vesículas do plasmalema (PLVAP), conhecida também como PV1, é uma glicoproteína de membrana integral do tipo II cuja expressão está restrita a certas células endoteliais vasculares (Mol. Biol. Cell 15:3615-3630 (2004)). PLVAP demonstrou ser um componente estrutural fundamental de diafragmas de janelas e estômatos endotélios fenestrados Id. Além disso, a expressão de PLVAP é necessária para a formação de diafragmas de janelas endo- teliais e pode estar envolvida na modulação de permeabilidade e transporte endotelial (Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286:H1347- 1353, 2004). A organização genômica do gene de PLVAP humana foi relatada (Stan RV, Arden KC, Palade GE, "cDNA and protein sequence, genomic organization, and analysis of cis regulatory elements of mouse and human PLVAP genes", Genomics 72;304-313, 2001).
[081] Como aqui descrito, os inventores demonstraram que a expressão do gene de PLVAP é significativamente elevada em tecidos de carcinoma hepatocelular em relação a tecidos não-tumorosos adjacentes no fígado de pacientes humanos com HCC. Além disso, os presentes inventores determinaram que a proteína PLVAP é expressada principalmente e fica localizada em células endoteliais vasculares que circundam ou estão dentro de tumores HCC, mas não é expressada ou fica localizada em células associadas a outras patologias do fígado. Consequentemente, PLVAP representa um alvo inusitado para o diagnóstico e tratamento de HCC.
Métodos de Terapia
[082] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para tratar carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo que necessita deste tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um antagonista de PLVAP, onde o antagonista de PLVAP inibe a formação, crescimento, vascularização e/ou progressão de um ou mais tumores HCC no fígado do indivíduo. Em um aspecto específico, um PLVAPD antagonista da invenção inibe a expressão ou a atividade da proteína PLVAP em células endoteliais vasculares que circundam hepatócitos no fígado de pacientes com HCC.
[083] Em um aspecto, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PLVAP é administrada a um indivíduo que necessita dela para inibir o crescimento de tumores ou exterminar células tumoro- sas. Por exemplo, os agentes que inibem diretamente o crescimento de tumores (por exemplo, agentes quimioterápicos) são administrados convencionalmente em um programa de dosagem específico e nível para atingir a terapia mais eficaz (por exemplo, exterminar melhor as células tumorosas). Genericamente, uma dose próxima da dose máxima tolerada é administrada durante um período de tratamento relativamente curto (por exemplo, um a vários dias), e em seguida, um período sem terapia. Em um exemplo específico, o quimioterápico ciclofosfami- da é administrado em uma dose máxima tolerada de 150 mg/kg a cada dois dias por três doses, com um segundo ciclo dado 21 dias depois do primeiro ciclo (Browder et al. Can. Res. 60:1878-1886, 2000).
[084] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de PLVAP (por exemplo, moléculas inibitórias pequenas, anticorpos neu- tralizadores, ácidos nucleicos inibitórios (por exemplo, siRNA, nucleo- tídeos antissense)) pode ser administrada, por exemplo, em um primeiro ciclo no qual uma dose próxima da dose máxima tolerada do antagonista é administrada em um intervalo/dose, ou em vários intervalos proximamente espaçados (minutos, horas, dias) com ou- tro/segundo ciclo administrado depois de um período sem terapia apropriado (por exemplo, uma ou mais semanas). Os programas e quantidades de dosagem apropriados para um antagonista de PLVAPD podem ser determinados facilmente por um médico experiente. A toxicidade diminuída de um antagonista de PLVAPD em comparação com agentes quimioterápicos pode permitir que o tempo entre ciclos de administração seja mais curto. Quando usada como uma terapia adjuvante para, por exemplo, cirurgia, terapia de radiação, outras terapias primárias, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PLVAP é, de preferência, administrada em um programa de dosagem que é similar àquele de outra terapia de câncer (por exemplo, quimioterápico), ou em um programa de dosagem determinado pelo médico experiente para ser mais eficaz em inibir (reduzir, prevenir) o crescimento de tumores. Um esquema de tratamento para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista de PLVAPD pode ser, por exemplo, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 300 mg/kg de peso corporal por tratamento, de preferência, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 10 mg/kg, entre cerca de 1 mg/kg e cerca de 10 mg/kg a cada 1 a 7 dias durante um período de cerca de 4 e cerca de 6 meses. Um esquema de tratamento para uma quantidade antitumoral eficaz de uma molécula pequena antagonista de PLVAP pode ser, por exemplo, entre cerca de 0,001 mg/kg e cerca de 100 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg, entre cerca de 0.01 mg/kg e cerca de 10 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 1 mg/kg, a cada 1 a 7 dias durante um período de cerca de 4 a cerca de 6 meses.
[085] Em outro aspecto, um antagonista de PLVAP pode ser administrado em um esquema de dosagem metronômico, pelo qual uma dose mais baixa é administrada mais frequentemente em relação à dosagem máxima tolerada. Inúmeros estudos pré-clínicos demonstraram eficácia antitumoral excelente, efeitos antiangiogênicos potentes, e toxicidade e efeitos colaterais reduzidos (por exemplo, mielossupressão) de esquemas metronômicos em comparação com a dose máxima tolerada (MTD) comparativa (Bocci, et al., Cancer Res., 62:6938-6943, (2002); Bocci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 100(22):12917-12922, (2003); e Ber- tolini, et al., Cancer Res., 63(15):4342-4346, (2003)). A quimioterapia metronômica parece ser eficaz em superar algumas das desvantagens associadas à quimioterapia.
[086] Um antagonista de PLVAP pode ser administrado em um esquema de dosagem metronômico para inibir (reduzir, prevenir) an- giogênese em um paciente necessitado como parte de uma terapia antiangiogênica. Tal terapia antiangiogênica pode afetar diretamente (inibir, reduzir) o crescimento de tumores bloqueando a formação de novos vasos sanguíneos que abastecem os tumores com nutrientes necessários para sustentar o crescimento dos tumores e permitir que os tumores metastizem. A inanição do tumor pela falta de abastecimento de nutrientes e sangue desta maneira pode eventualmente fazer com que as células do tumor morram por necrose e/ou apoptose. Estudos anteriores indicaram que os resultados clínicos (inibição de angiogênese tumoral mediada por células endoteliais e crescimento de tumor) de terapias de câncer que envolvem o bloqueio de fatores an- giogênicos (por exemplo, VEGF, bFGF, TGF-α, IL-8, PDGF) ou sua sinalização foram mais eficazes quando níveis de dosagem mais baixos são administrados mais frequentemente, produzindo um nível sanguíneo contínuo do agente antiangiogênico (vide Browder et al. Can. Res. 60:1878-1886, 2000; Folkman J., Sem. Can. Biol. 13:159167, 2003). Um esquema de tratamento antiangiogênico foi usado com um inibidor direcionado de angiogênese (trombospondina 1 e fator de crescimento de plaquetas-4 (TNP-470)) e o agente quimioterápico ci- clofosfamida. A cada 6 dias, TNP-470 foi administrado em uma dose mais baixa do que a dose máxima tolerada e a ciclofosfamida foi administrada em uma dose de 170 mg/kg Id. Este esquema de tratamento resultou em regressão completa dos tumores Id. De fato, os tratamentos antiangiogênicos são mais eficazes quando administrados em combinação com outros agentes terapêuticos anticâncer, por exemplo, aqueles agentes que inibem diretamente o crescimento de tumores (por exemplo, agentes quimioterápicos) Id.
[087] Os terapêuticos aqui descritos compreendem administrar um antagonista de PLVAP a um indivíduo. O antagonista de PLVAP pode ser administrado ao indivíduo necessitado como uma terapia primária (por exemplo, como o principal agente terapêutico em um esquema de terapia ou tratamento); como uma terapia adjuvante (por exemplo, como um agente terapêutico usado junto com outro agente terapêutico em um esquema de terapia ou tratamento, onde a combinação dos agentes terapêuticos proporciona o tratamento desejado; "terapia adjunta" é referida também como "terapia adjuvante"); em combinação com terapia adjunta; como uma terapia adjuvante (por exemplo, como um agente terapêutico que é dado ao indivíduo necessitado depois do agente terapêutico principal em um esquema de terapia ou tratamento foi dado); ou em combinação com uma terapia adjuvante (por exemplo, quimioterapia (por exemplo, tamoxifeno, cisplatina, mitomicina, 5-fluorouracila, doxorrubicina, sorafenib, octreotid, da- carbazina (DTIC), cisplatina, cimetidina, ciclofosfamida), terapia de radiação (por exemplo, terapia com feixe de prótons), terapia hormonal (por exemplo, terapia antiestrogênio, terapia de privação de androgê- nio (ADT), agonistas do hormônio estimulante de células intersticiais (LH-RH), inibidores de aromatase (AIs, tais como anastrozol, exemes- tano, letrozol), moduladores de receptores de estrogênio (por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, toremifeno)), ou terapia biológica). Inúmeras outras terapias também podem ser administradas durante um esque- ma de tratamento de câncer para mitigar os efeitos da doença e/ou efeitos colaterais do tratamento de câncer, incluindo terapias para controlar a dor (narcóticos, acupuntura), desconforto gástrico (antiácidos), vertigem (medicações contra tonteira), náusea (medicações contra náusea), infecção (por exemplo, medicações para aumentar as contagens de eritrócitos/leucócitos) e similares, sendo que todas elas são facilmente avaliadas pelos versados na técnica.
[088] Assim sendo, um antagonista de PLVAP pode ser administrado como uma terapia adjuvante (por exemplo, com outra terapia ou tratamento primário de câncer). Como uma terapia adjuvante, o antagonista de PLVAP pode ser administrado antes, depois ou concomitantemente com uma terapia primária tal como radiação e/ou a remoção cirúrgica de tumores. Em algumas modalidades, o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PLVAP e uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias adjuvantes, outras terapias visadas). Uma terapia adjuvante (por exemplo, um agente quimioterápico) e/ou uma ou mais outras terapias para HCC visadas e o antagonista de PLVAP podem ser coad- ministrados simultaneamente (por exemplo, concomitantemente) como formulações separadas ou como uma formulação conjunta. Alternativamente, as terapias podem ser administradas sequencialmente, como composições separadas, dentro de um espaço de tempo apropriado (por exemplo, uma sessão/intervalo de tratamento de câncer, tal como 1,5 a 5 horas), determinado pelo médico experiente (por exemplo, um tempo suficiente para permitir uma sobreposição dos efeitos farmacêuticos das terapias). A terapia adjuvante e/ou uma ou mais outras terapias para HCC visadas e o antagonista de PLVAP podem ser administrados em uma única dose ou múltiplas doses em uma ordem e em programa apropriado para atingir um efeito terapêutico desejado (por exemplo, inibição do crescimento do tumor, inibição de angiogê- nese, e/ou inibição de metástase do câncer).
[089] Um ou mais agentes que são antagonistas de PLVAP podem ser administrados em dose única ou múltiplas doses. As dosagens e esquemas de administração apropriados podem ser determinados por um médico e são dependentes do agente ou agentes escolhidos, composição farmacêutica escolhida e via de administração escolhida, vários fatores referentes ao paciente e outras considerações. Com relação à administração de um antagonista de PLVAP com uma ou mais outras terapias ou tratamentos (adjuvantes, visados, associados ao tratamento de câncer, e similares), o antagonista de PLVAP é tipicamente administrado como uma dose única (por exemplo, por injeção, infusão, via oral), e em seguida, doses repetidas em intervalos específicos (por exemplo, uma ou mais horas), caso desejado ou indicado.
[090] A quantidade do antagonista de PLVAP a ser administrada (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz) pode ser determinada por um médico usando a orientação aqui fornecida e outros métodos conhecidos na técnica, e depende de vários fatores, incluindo, por exemplo, o agente específico escolhido, a idade do indivíduo, sensibilidade, tolerância a fármacos e bem-estar global. Por exemplo, as dosagens apropriadas para uma molécula pequena podem ser entre cerca de 0,001 mg/kg e cerca de 100 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 10 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 1 mg/kg de peso corporal por tratamento. As dosagens apropriadas para anticorpos podem ser entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 300 mg/kg de peso corporal por tratamento, e de preferência, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg, entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 10 mg/kg, entre cerca de 1 mg/kg e cerca de 10 mg/kg de peso corporal por tratamento. Quando o antagonista de PLVAP é um polipeptídeo (linear, cíclico, mimético), a dosagem preferida resultará em uma concentração plas- mática do peptídeo entre cerca de 0,1 μg/mL e cerca de 200 μg/mL. A determinação da dosagem para um agente, paciente e câncer específico está dentro do conhecimento dos versados na técnica. De preferência, a dosagem não causa ou produz efeitos colaterais adversos mínimos (por exemplo, resposta imunogênica, náusea, vertigem, desarranjo gástrico, síndromes de hiperviscosidade, insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, edema pulmonar).
Métodos de Administração
[091] De acordo com os métodos da invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PLVAP (por exemplo, anticorpo, tal como um anticorpo marcado com um isótopo radioativo) é administrada a um indivíduo mamífero para tratar HCC.
[092] Várias vias de administração podem ser usadas, incluindo, por exemplo, via de administração oral, dietética, tópica, transdérmica, retal, parenteral (por exemplo, injeção intra-arterial, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica), infusão intravenosa e inalação (por exemplo, inalação intrabrônquica, intranasal ou oral, gotas intra- nasais), dependendo do agente do câncer específico a ser tratado. A administração pode ser local ou sistêmica, conforme indicado. O modo de administração preferido pode variar dependendo do agente específico escolhido; entretanto, a administração intra-arterial (por exemplo, infusão arterial hepática, quimioembolização transarterial (TACE)) é genericamente preferida para administrar agentes terapêuticos (por exemplo, anticorpos, tais como anticorpos marcados com um isótopo radiativo) da invenção para tratar carcinoma hepatocelular.
[093] Por exemplo, usando infusão arterial, agentes quimioterápi- cos (por exemplo, anticorpos para PLVAP, tais como anticorpos para PLVAP marcados com um isótopo radioativo) podem ser distribuídos diretamente para um tumor HCC através da artéria hepática, por exemplo, durante o tratamento rotineiro de HCC por TACE (Camma, et al., Radiology 224:47-54, 2002; Befeler, et al. Clinics in Liver Disease 9:287-300, 2005; Abou-Alfa, JAMA 299:1716-1718, 2008). Este procedimento é feito com a ajuda de reprodução de imagens por fluorosco- pia (tipo de raios X). Resumidamente, um cateter é inserido dentro da artéria femoral na virilha e é enfiado dentro da aorta. Da aorta, o cate- ter é avançado para dentro da artéria hepática ou suas ramificações. Depois que as ramificações da artéria hepática que alimentam o câncer de fígado são identificadas, a quimioterapia é infundida. Um radiologista de intervenções, que usualmente conduz este procedimento, pode determinar a quantidade de quimioterápico que um paciente recebe em cada sessão. Alguns pacientes podem sofrer sessões repetidas em intervalos de 6 a 12 semanas. Estudos de reprodução de ima-gens do fígado são repetidos em seis a 12 semanas para avaliar o tamanho do tumor em resposta ao tratamento.
[094] Alternativamente, quimioembolização transarterial (TACE), um procedimento similar à infusão intra-arterial, pode ser usada para administrar o antagonista de PLVAP, por exemplo, anticorpos) a um indivíduo que necessita dele. Na TACE, a infusão intra-arterial de um agente terapêutico é combinada com a etapa adicional de bloquear (isto é, efetuar a embolização) os vasos sanguíneos pequenos com compostos bloqueadores específicos, tais como espuma hemostática (Gelfoam), emulsão de óleo, ou mesmo pequenas serpentinas metálicas. Assim sendo, a TACE tem as vantagens adicionais de expor o tumor a altas concentrações do quimioterápico e confinar os agentes localmente para impedir ou reduzir seu arraste pela corrente sanguínea. Ao mesmo tempo, a TACE priva o tumor do seu suprimento de sangue necessário, o que pode resultar em dano ou morte das células tumorosas.
[095] Para administração intra-arterial de anticorpos de PLVAP, prefere-se usar anticorpos que têm altas afinidades por PLVAP (por exemplo, uma Kd menor do que 10-7 M), de tal modo que os anticorpos infundidos sejam concentrados em vasos sanguíneos de HCC. Espera-se que os anticorpos quiméricos e humanizados tenham meias- vidas circulatórias de até quatro e até 14-21 dias, respectivamente. Em uma modalidade específica, os anticorpos de alta afinidade para PLVAP (por exemplo, fragmentos ligantes de antígenos, anticorpos de cadeia única) com meias-vidas circulatórias curtas (por exemplo, cerca de 1 dia a cerca de 5 dias, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias) são administrados a um paciente para reduzir qualquer toxicidade e outros efeitos colaterais adversos resultantes da sua administração. Em outra modalidade, anticorpos de alta afinidade para PLVAP com meias-vidas circulatórias longas (por exemplo, cerca de 5 dias a cerca de 24 dias) são administrados a um paciente para tratar HCC.
[096] Em muitos casos, será preferível administrar uma dose de carga grande, e em seguida, doses de manutenção periódicas (por exemplo, semanalmente) durante o período de tratamento. Os anticorpos podem ser distribuídos também por sistemas de distribuição com liberação lenta, bombas, e outros sistemas de distribuição conhecidos para infusão contínua para dentro do HCC. Os esquemas de dosagem podem ser variados para produzir os níveis circulantes desejados de um anticorpo específico, baseado na sua farmacocinética. Assim sendo, as doses devem ser calculadas de tal modo que o nível terapêutico desejado seja mantido.
[097] A dose e o esquema de tratamento real devem ser determinados pelo médico, levando em consideração a natureza do câncer (primário ou metastático), número e tamanho dos tumores, outras terapias, e características do paciente. Em virtude da natureza fatal do carcinoma hepatocelular, grandes doses com efeitos colaterais significativos podem ser empregadas.
[098] Antagonistas de PLVAP baseados em ácidos nucleicos (por exemplo, siRNAs, oligonucleotídeos antissense, ácidos nucleicos naturais ou sintéticos, análogos de ácidos nucleicos) podem ser introduzidos em um indivíduo mamífero de interesse de inúmeras maneiras. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser expressados de forma endógena a partir de vetores de expressão de produtos de PCR em células hospedeiras ou empacotados em composições sintéticas ou manipuladas (por exemplo, lipossomas, polímeros, nanopartículas) que podem ser então introduzidas diretamente na corrente sanguínea de um indivíduo mamífero (por exemplo, por injeção, infusão). Os ácidos nucleicos anti-PLVAP ou vetores de expressão de ácidos nuclei- cos (por exemplo, vetores retrovirais, adenovirais, adeno-associados e o vetor viral do herpes simples, vetores manipulados, vetores não- virais) também podem ser introduzidos em um indivíduo mamífero diretamente, usando estratégias e protocolos de terapia gênica estabelecidos (vide, por exemplo, Tochilin, V.P., Annu. Rev. Biomed. Eng. 8:343-375, 2006; "Recombinant DNA and Gene Transfer", Office of Biotechnology Activities, National Institutes of Health Guidelines).
[099] Similarmente, quando o agente é uma proteína ou polipep- tídeo, o agente pode ser administrado por intermédio da expressão in vivo da proteína recombinante. A expressão in vivo pode ser realizada por expressão de células somáticas de acordo com métodos apropriados (vide, por exemplo, patente no US 5.399.346). Além disso, um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo também pode ser incorporado em vetores retrovirais, adenovirais ou outros vetores apropriados (de preferência, um vetor infeccioso deficiente em replicação) para distribuição, ou pode ser introduzido em uma célula hospedeira transfecta- da ou transformada capaz de expressar o polipeptídeo para distribuição. Nesta última modalidade, as células podem ser implantadas (isoladamente ou em um dispositivo de barreira), injetadas ou introduzidas de outra forma em uma quantidade eficaz para expressar o polipeptí- deo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
Métodos Diagnósticos e Prognósticos
[0100] A presente invenção engloba métodos diagnósticos e prognósticos que compreendem avaliar a expressão de PLVAP em uma amostra (por exemplo, biópsia do fígado, amostra de aspiração com agulha) de um indivíduo mamífero (por exemplo, um indivíduo mamífero que tem um tumor do fígado). Para os métodos diagnósticos da invenção, a expressão de PLVAP na amostra, ou a expressão aumentada de PLVAP na amostra em relação a um controle apropriado, indica que o indivíduo tem HCC e/ou que o indivíduo é um candidato para uma terapia contra câncer usando um antagonista de PLVAP.
[0101] Para os métodos prognósticos da invenção, a expressão de PLVAP em uma amostra de um indivíduo, ou a expressão aumentada de PLVAP na amostra em relação a um controle apropriado, indica um prognóstico ruim. O prognóstico pode ser um prognóstico para sobrevivência do paciente, um prognóstico para risco de metástases e/ou um prognóstico para risco de recidiva.
[0102] As amostras apropriadas para estes métodos incluem uma amostra de tecido, uma amostra de fluido biológico, uma amostra de células (por exemplo, uma célula de tumor), e similares. Qualquer meio de amostragem de um indivíduo, por exemplo, por retirada de sangue, punção espinhal, esfregaço ou raspagem de tecido, ou biópsia de tecido pode ser usado para obter uma amostra. Assim sendo, a amostra pode ser um espécime de biópsia (por exemplo, amostra de tumor, pólipo, massa (sólido, célula)), aspirado, esfregaço ou sangue. A amostra pode ser um tecido de um fígado que tem um tumor (por exemplo, crescimento canceroso) e/ou células tumorosas, ou é suspeita de ter um tumor e/ou células tumorosas. Por exemplo, uma biópsia de tumor pode ser obtida em uma biópsia aberta, um procedimento no qual uma massa inteira (biópsia de excisão) ou parcial (biópsia de inci- são) é removida de uma área-alvo. Alternativamente, uma amostra de tumor pode ser obtida através de uma biópsia percutânea, um procedimento realizado com um instrumento semelhante a agulha através de uma pequena incisão ou punção (com ou sem o auxílio de um dispositivo de reprodução de imagens) para obter células individuais ou agregados de células (por exemplo, uma aspiração com agulha fina (FNA)) ou um núcleo ou fragmento de tecidos (biópsia de núcleo). As amostras de biópsia podem ser examinadas de forma citológica (por exemplo, esfregaço), histológica (por exemplo, seção congelada ou em parafina) ou usando qualquer outro método apropriado (por exemplo, métodos diagnósticos moleculares). Uma amostra de tumor pode ser obtida também por colheita in vitro de células humanas cultivadas derivadas de um tecido do indivíduo. As amostras de tumores podem, caso desejado, ser estocadas antes da análise por meios de estoca- gem apropriados que preservam uma proteína e/ou ácido nucleico de uma amostra em uma condição analisável, tais como congelamento rápido, ou um esquema de congelamento controlado. Caso desejado, o congelamento pode ser realizado na presença de um crioprotetor, por exemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO), glicerina, ou propanodi- ol/sacarose. As amostras de tumor podem ser coletadas, conforme apropriado, antes ou depois da estocagem para propósitos de análise. A amostra de tumor pode ser de um paciente que tem um câncer de fígado, por exemplo, carcinoma hepatocelular.
[0103] Os ensaios apropriados que podem ser usados para avaliar a presença ou quantidade de uma PLVAPD em uma amostra (por exemplo, uma amostra biológica) são conhecidos pelos versados na técnica. Os métodos para detectar uma proteína ou peptídeo PLVAP incluem métodos imunológicos e imunoquímicos, tais como citometria de fluxo (por exemplo, análise FACS), ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA), incluindo ensaios de quimioluminescência, ra- dioimunoensaio, "immunoblot" (por exemplo, Western blot), imuno- histoquímica (IHC), e outros métodos quantitativos baseados em anticorpos (por exemplo, ensaios baseados em pérolas Luminex®). Outros métodos apropriados incluem, por exemplo, espectrometria de massas. Por exemplo, os anticorpos para PLVAP podem ser usados para determinar a presença e/ou nível de expressão de PLVAP em uma amostra diretamente ou indiretamente, usando, por exemplo, imuno-histoquímica (IHC). Por exemplo, seções em parafina podem ser retiradas de uma biópsia, fixadas sobre uma lâmina e combinadas com um ou mais anticorpos por métodos apropriados. Em uma modalidade específica, a detecção de proteína PLVAP em células endoteliais vasculares que circundam hepatócitos em uma amostra é indicativa de HCC.
[0104] Os métodos para detectar a expressão do gene de PLVAP incluem amplificação e/ou visualização de ácidos nucleicos de PLVAP. Para detectar a expressão do gene de PLVAP, um ácido nucleico pode ser isolado de um indivíduo por métodos apropriados que são rotineiros na técnica (vide, por exemplo, Sambrook et al., 1989). O ácido nu- cleico isolado pode ser então amplificado (por exemplo, por reação de polimerase em cadeia (PCR) (por exemplo, PCR direta, PCR quantitativa em tempo real, PCR - transcriptase reversa), reação de ligase em cadeia, replicação de sequências autossustentável, sistema de amplificação da transcrição, Replicase Q-Beta, ou similares) e visualizado (por exemplo, marcando o ácido nucleico durante a amplificação, expondo a compostos/corantes intercalados, sondas). O RNA de PLVAP (por exemplo, mRNA) ou sua expressão também pode ser detectado usando uma sonda de ácido nucleico, por exemplo, uma sonda de ácido marcado (por exemplo, hibridização in situ com fluorescência (FISH)) diretamente em uma amostra de tecido em parafina retirada, por exemplo, de uma biópsia de tumor, ou usando outros métodos apropriados. A sua expressão do gene de PLVAP pode ser avaliada também por Southern blot ou em solução (por exemplo, corantes, sondas). Além disso, um chip de gene, microarranjo, sonda (por exemplo, pontos de quantum) ou outro dispositivo similar (por exemplo, sensor, nanossensor/detector) pode ser usado para detectar a expressão e/ou expressão diferencial de um gene de PLVAP.
[0105] Em uma modalidade, um carcinoma hepatocelular pode ser diagnosticado detectando a expressão de um produto gênico de PLVAP (por exemplo, mRNA de PLVAP, Proteína PLVAP) em uma amostra de um paciente. Assim sendo, o método não requer que a expressão de PLVAP na amostra do paciente seja comparada com a expressão de PLVAP em um controle. A presença ou ausência de PLVAP pode ser determinada pelos métodos aqui descritos ou outros ensaios apropriados. Em outra modalidade, um aumento na expressão de PLVAP pode ser determinado por comparação da expressão de PLVAP na amostra com aquela de um controle apropriado. Os controles apropriados incluem, por exemplo, uma amostra de tecido não- neoplásico do indivíduo, células não-cancerosas, células de câncer não-metastáticas, células não-malignas (benignas) ou similares, ou um padrão referencial apropriado conhecido ou determinado. O padrão referencial pode ser uma ou faixa ou nível típico, normal ou normalizado da expressão de uma proteína PLVAP ou RNA (por exemplo, um padrão de expressão). Assim sendo, o método não requer que a expressão do gene/proteína seja avaliada em um controle apropriado.
[0106] Em outra modalidade, um carcinoma hepatocelular pode ser diagnosticado detectando o número de cópias do gene de PLVAP em uma amostra de um paciente. Por exemplo, em algumas modalidades, um número de cópias do gene de PLVAP que é maior do que dois (por exemplo, um número de cópias do gene de 3 ou 4) pode ser diagnóstico de HCC. Tipicamente, uma célula humana normal terá um número de cópias do gene de PLVAP de dois. Portanto, um método de diagnóstico baseado no número de cópias do gene de PLVAP não requer detectar o número de cópias do gene de PLVAP em uma amostra de controle do paciente, embora um controle possa ser usado. Os controles apropriados incluem, por exemplo, uma amostra de tecido não- neoplásico do indivíduo, células não-cancerosas, células de câncer não-metastáticas, células não-malignas (benignas) ou similares, ou um padrão referencial conhecido ou determinado apropriado (por exemplo, um número de cópias do gene de PLVAP de dois). O número de cópias do gene de PLVAP em uma amostra de um paciente pode ser determinado por técnicas apropriadas, tais como, por exemplo, hibridiza- ção in situ com fluorescência (FISH).
Anticorpos para PLVAP
[0107] Como aqui descrito, os anticorpos que se ligam a PLVAP têm utilidade no diagnóstico e tratamento de HCC em indivíduos humanos. Por exemplo, os anticorpos que se ligam especificamente a PLVAP podem ser usados para detectar a presença de PLVAP em células endoteliais capilares de carcinoma hepatocelular em espécimes de biópsias de núcleo do fígado ou aspirados de agulha por coloração imuno-histoquímica (IHC). Além disso, anticorpos (por exemplo, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos) para PLVAP podem ser marcados com um rastreador apropriado (por exemplo, radioisótopo) para tomografia por emissão de pósitrons (imuno-PET) (Clin. Cancer Res. 12:1958-1960, 2006; Clin. Cancer Res. 12:2133-2140, 2006) para determinar se uma lesão ou lesões que ocupam espaço no fígado de um indivíduo são carcinoma hepatocelular. Os anticorpos anti-PLVAP (por exemplo, anticorpos humanizados) podem ser marcados também com um agente citotóxico (radioativo ou não-radioativo) com propósitos terapêuticos (Weiner, L.M., Adams, G.P., Von Mehren, M, "Therapeutic monoclonal antibodies: General principles. In: Cancer: Principles & Practice of Oncology. 6a edição, editores DeVita, V.T., Hellman, S., Rosenberg, S.A., Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001:495-508; Levinson, W., Jawetz, E., "Medical Microbiology & Immunology", 4a edição, Stamford: Appleton & Lange; 1996:307-47; Scheinberg, D.A., Sgouros, G., Junghans, R.P., "Antibody-based immunotherapies for cancer" em: "Cancer Chemotherapy & Biotherapy: Principles and Practice" 3a edição, editores Chabner, B.A., Longo, D.L., Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001:850-82).
[0108] Consequentemente, em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a uma proteína PLVAP (por exemplo, uma proteína PLVAP humana (SEQ ID N°: 23)). Os anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína PLVAP podem ser anticorpos policlonais, monoclonais, humanos, quiméricos, humanizados, "primatizados", embutidos, e de cadeia única, bem como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fv, Fc, Fd, Fab, Fab', F(ab'), scFv, scFab, dAb), dentre outros (vide, por exemplo, Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Os anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína PLVAP podem ser produzidos, construídos, manipulados e/ou isolados por métodos convencionais ou outras técnicas apropriadas. Por exemplo, os anticorpos que são específicos para uma proteína PLVAP podem ser criados contra um imunógeno apropriado, tal como uma proteína PVLAP recombinante de mamífero (por exemplo, humano) (por exemplo, SEQ ID N°: 23) ou a uma parte dela (por exemplo, SEQ ID N°: 2) (incluindo moléculas sintéticas, por exemplo, peptídeos sintéticos). Vários métodos de imunização foram descritos (vide, por exemplo, Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975); e Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266:550-552 (1977); Koprowski et al., patente no US 4.172.124; Harlow, E. e D. Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); "Current Protocols In Molecular Biology", Volume 2 (Supplement 27, Summer 1994), editores Ausubel, F.M. et al.(John Wiley & Sons: New York, NY), Capítulo 11, (1991)). Os anticorpos podem ser criados também imunizando um hospedeiro apropriado (por exemplo, camundongo) com células que expressam PLVAP (por exemplo, células/linhagens de células cancerosas ou células manipuladas para expressar PLVAP (por exemplo, células trans- fectadas) (vide, por exemplo, Chuntharapai et al., J. Immunol., 152:1783-1789 (1994); Chuntharapai et al. patente no US 5.440.021).
[0109] Em um tempo apropriado depois da imunização, por exemplo, quando as titulações do anticorpo são mais altas, as células produtoras do anticorpo podem ser obtidas a partir do animal imunizado, e usadas para preparar anticorpos monoclonais por técnicas padronizadas, tais como a técnica de hibridomas descrita originalmente por Kohler e Milstein (Nature 256:495-497, 1975), a técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbor et al., Immunol. Todia 4:72, 1983), a técnica de hibridomas de EBV (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan, R. Liss, Inc., páginas 77-96, 1985) ou técnicas de "triomas". A tecnologia para produzir hibridomas é bem-conhecida (vide genericamente "Current Protocols in Immunology", Coligan et al., (editores) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1994). Resumidamente, uma linhagem de células imortais (tipicamente um mieloma) é fundida a linfócitos (tipicamente esplenócitos) de um mamífero imunizado com um imunógeno como descrito acima, e os sobrenadantes da cultura das células de hibridomas resultantes são triados para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga a um polipeptídeo aqui descrito.
[0110] Qualquer um entre os muitos protocolos conhecidos usados para fundir linfócitos e linhagens de células imortalizadas pode ser aplicado para o propósito de gerar um anticorpo monoclonal para um polipeptídeo da invenção (vide, por exemplo, "Current Protocols in Immunology", supra; Galfre et al., Nature, 266:55052, 1977; R.H. Kenneth, em "Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses", Plenum Publishing Corp., New York, New York, 1980; e Lerner, Yale J. Biol. Med. 54:387-402, 1981). Além disso, os normalmente versados na técnica devem avaliar que há muitas variações desses métodos que também seriam úteis.
[0111] Em uma alternativa para preparar hibridomas secretores de anticorpos monoclonais, um anticorpo monoclonal para uma proteína PLVAP pode ser identificado triando uma biblioteca combinatória de imunoglobulinas recombinantes (por exemplo, uma biblioteca de apresentação de fagos anticorpos) com o polipeptídeo-alvo para desta forma isolar membros da biblioteca de imunoglobulinas que se ligam ao polipeptídeo. Kits para gerar e triar bibliotecas de apresentação de fa- gos estão disponíveis no mercado (por exemplo, o "Pharmacia Recombinant Phage Antibody System", no de catálogo 27-9400-01; e o Kit de Apresentação de Fagos "Stratagene SurfZAP™", no do catálogo 240612). Adicionalmente, os exemplos de métodos e reagentes parti-cularmente suscetíveis para uso em gerar e triar bibliotecas de apresentação de anticorpos podem ser encontrados, por exemplo, na patente no US 5.223.409; publicação PCT no WO 92/18619; publicação PCT no WO 91/17271; Publicação PCT no WO 92/20791; Publicação PCT no WO 92/15679; Publicação PCT no WO 93/01288; Publicação PCT no WO 92/01047; Publicação PCT no WO 92/09690; Publicação PCT no WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372, 1991; Hay et al., Hum. Antibodies Hybridomas 3:81-85, 1992; Huse et al., Science 246:1275-1281,1989; e Griffiths et al., EMBO J. 12:725734, 1993.
[0112] Os fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos li- gantes de antígenos) podem ser produzidos por clivagem enzimática ou por técnicas recombinantes. Por exemplo, a clivagem de papaína ou pepsina pode gerar fragmentos Fab ou F(ab'), respectivamente. Outras proteases com especificidade requerida para o substrato também podem ser usadas para gerar fragmentos Fab ou F(ab')2.
[0113] Os anticorpos podem ser produzidos também em uma série de formas truncadas usando genes de anticorpos nos quais um ou mais códons de terminação foram introduzidos a montante do sítio de terminação natural. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma parte da cadeia pesada de F(ab')2 pode ser desenhado para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH1 e a região de articulação da cadeia pesada.
[0114] Anticorpos de cadeia única, humanos, quiméricos, humanizados, "primatizados" (enxertados com CDRs), ou embutidos que compreendem partes derivadas de espécies diferentes, também estão englobados pela presente invenção e pelo termo "anticorpo". As várias partes destes anticorpos podem ser unidas entre si quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam uma cadeia quimérica ou humanizada podem ser expressados para produzir uma proteína contígua (vide, por exemplo, Cabilly et al., patente no US 4.816.567; Cabilly et al., patente europeia no 0.125.023 B1; Boss et al., patente no US 4.816.397; Boss et al., patente europeia no 0.120.694 B1; Neuberger, M.S. et al., dou- cumento no WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., patente europeia no 0.194.276 B1; Winter, patente no US 5.225.539; Winter, patente europeia no 0.239.400 B1; Queen et al. , patente europeia no 0 451 216 B1; e Padlan, E.A. et al. , documento no EP 0 519 596 A1. Vide também, Newman, R. et al. , BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), quanto a anticorpos "primatizados", e Ladner et al., patente no US 4.946.778 e Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)) quanto a anticorpos de cadeia única.
[0115] Em uma modalidade específica, a invenção refere-se a anticorpos quiméricos que se ligam especificamente a PLVAP (por exemplo, uma proteína PLVAP humana que compreende SEQ ID N°: 23). Em uma modalidade, o anticorpo quimérico da invenção compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve (por exemplo, cadeia leve kappa) de IgG4 humana.
[0116] Em outra modalidade, a invenção refere-se a anticorpos humanizados que se ligam especificamente a PLVAP (por exemplo, uma proteína PLVAP humana que compreende SEQ ID N°: 23). Os anticorpos humanizados podem ser produzidos usando tecnologia de DNA sintético ou recombinante, usando métodos padronizados ou outras técnicas apropriadas. As sequências de ácidos nucleicos (por exemplo, CDNA) que codificam regiões variáveis humanizadas podem ser construídas também usando métodos de mutagênese por PCR para alterar sequências de DNA que codificam uma cadeia humana ou humanizada, tal como um modelo de DNA de uma região variável previamente humanizada (vide, por exemplo, Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17:5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research 53:851-856 (1993); Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9):2471-2476 (1991); e Lewis, A.P. e J.S. Crowe, Gene 101:297-302 (1991)). Usando estes métodos ou outros métodos apropriados, variantes também podem ser facilmente produzidas. Em uma modalidade, regiões variáveis clonadas (por exemplo, dAbs) podem ser mutadas, e as sequências que codificam as variantes com a especificidade desejada podem ser selecionadas (por exemplo, a partir de uma biblioteca de fagos; vide, por exemplo, Krebber et al., patente no US 5.514.548; Hoogenboom et al., documento no WO 93/06213, publicado em 1o de abril de 1993). Os anticorpos humanizados podem ser produzidos e/ou obtidos também a partir de fornecedores no mercado, incluindo, por exemplo, Antitope Limited (Cambridge, UK).
[0117] Outros métodos apropriados para produzir ou isolar os anticorpos com a especificidade requerida podem ser usados, incluindo, por exemplo, métodos que selecionam um anticorpo recombinante ou fragmento ligante de anticorpo (por exemplo, dAbs) a partir de uma biblioteca (por exemplo, uma biblioteca de apresentação de fagos), ou que se baseiam na imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos). Os animais transgênicos capazes de produzir uma coleção de anticorpos humanos são bem-conhecidos na técnica (por exemplo, Xenomouse® (Abgenix, Fremont, CA)) e podem ser produzidos usando métodos apropriados (vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555 (1993); Jakobovits et al. , Nature, 362:255-258 (1993); Lonberg et al., patente no US 5.545.806; Surani et al., patente no US 5.545.807; Lonberg et al., documento no WO 97/13852).
[0118] Depois de produzido, um anticorpo específico para PLVAP pode ser identificado facilmente usando métodos para triar e isolar anticorpos específicos, que são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, editora: Paul, "Fundamental Immunology", Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988; editor: Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984. Vários ensaios podem ser utilizados para detectar anticorpos que se ligam especificamente a proteínas PLVAP. Os ensaios exemplificativos estão descritos detalhadamente em "Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow & Lane (Editores), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Os exemplos representativos desses ensaios incluem: imunoeletroforese cruzada, radioimunoensaio, radioimunoprecipitação, ensaio imunoab- sorvente ligado à enzima (ELISA), ensaios dot blot ou Western blot, ensaios de inibição ou competição, e ensaios sanduíche.
[0119] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção têm uma alta afinidade de ligação por PLVAP. Tais anticorpos devem ter, de preferência, uma afinidade (por exemplo, afinidade de ligação) por PLVAP, expressa como Kd, de pelo menos cerca de 10-7 M (por exemplo, cerca de 0,4 X 10-7 M, cerca de 0,6 X 10-7 M, ou mais alta, por exemplo, pelo menos cerca de 10-8 M, pelo menos cerca de 10-9 M, ou pelo menos cerca de 10-10 M. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser determinada facilmente pelos versados na técnica, por exemplo, pela análise de Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949). A afinidade de ligação pode ser determinada também usando um instrumento biossensor disponível no mercado (BIACORE, Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.), onde a proteína é imobilizada sobre a superfície de um chip (vide Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991; e Cunningham e Boas, J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993. Este sistema permite a determinação de taxas on/off, a partir das quais a afinidade de ligação pode ser calculada, e a determinação da estequiometria da ligação.
[0120] Os anticorpos da presente invenção podem incluir um marcador, tal como, por exemplo, um marcador detectável que permite a detecção do anticorpo, e proteínas ligadas pelo anticorpo (por exemplo, PLVAP), em uma amostra biológica. Um marcador detectável é particularmente apropriado para aplicações diagnósticas. Por exemplo, um anticorpo para PLVAP pode ser marcado com um isótopo radioativo (radioisótopo), que pode ser detectado pelos versados na técnica usando um contador gamar, um contador de cintilação ou por autorra- diografia ou outros meios apropriados. Os isótopos que são úteis para o propósito da presente invenção incluem, porém sem limitações: 3H, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe e 75Se.
[0121] Os anticorpos da invenção podem ser marcados também com um composto fluorescente (por exemplo, corantes). Quando o anticorpo marcado de forma fluorescente é exposto à luz com o compri- mento de onda apropriado, sua presença pode ser então detectada em virtude da fluorescência do composto. Dentre os marcadores fluorescentes mais comumente usados estão isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluo- rescamina. Os anticorpos da invenção podem ser marcados também usando metais emissores de fluorescência tais como 152Eu, ou outros da série de lantanídeos. Estes metais podem ser afixados à molécula do anticorpo usando grupos quelantes de metais, tais como ácido dieti- lenotriaminopenta-acético (DTPA), ácido tetra-aza-ciclododecano- tetra-acético (DOTA) ou ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA).
[0122] Os anticorpos da presente invenção podem ser também acoplados a um composto quimioluminescente. Os exemplos de compostos marcadores quimioluminescentes úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio "teromático", imidazol, sal de acridínio e éster oxalato.
[0123] Similarmente, um composto bioluminescente pode ser usado para marcar o anticorpo da presente invenção. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrado em sistemas biológicos nos quais uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação qui- mioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada detectando a presença de luminescência. Os compostos bioluminescentes úteis para os propósitos de marcar anticorpos são luciferina, luciferase e aequorina.
[0124] A detecção de anticorpos marcados pode ser realizada por um contador de cintilação, por exemplo, caso o marcador detectável seja um emissor gama radioativo, ou por um fluorômetro, por exemplo, caso o marcador seja um material fluorescente. No caso de uma enzima marcadora, a detecção pode ser realizada por métodos colorimé- tricos que empregam um substrato para a enzima. A detecção pode ser realizada também por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato com padrões similarmente preparados.
[0125] Consequentemente, os anticorpos da presente invenção podem ser usados também como um corante para seções de tecidos. Por exemplo, um anticorpo marcado que se liga a PLVAP pode ser colocado em contato com uma amostra de tecido, por exemplo, uma biópsia de tecido ou aspirado com agulha fina de um paciente. Esta seção pode ser então lavada e o marcador detectado usando um meio apropriado.
[0126] Com o propósito de tratar HCC, os anticorpos para PLVAP da invenção podem incluir um radiomarcador ou outro agente terapêutico que intensifica a destruição de células que expressam PLVAP (por exemplo, células endoteliais vasculares que circundam células de HCC). Os exemplos de radioisótopos marcadores para uso em terapia de HCC incluem, porém sem limitações, 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 217Bi, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 111In e 118Re. Opcionalmente, um marcador que emite partículas α e β depois do bombardeio com radiação de nêutrons, tais como boro, pode ser usado como um marcador para anticorpos terapêuticos para PLVAP.
[0127] Os anticorpos terapêuticos podem incluir também um agente citotóxico que é capaz de exterminar seletivamente células que expressam PLVAP. Por exemplo, toxinas bacterianas tais como a toxina de difteria, ou ricina podem ser usadas. Os métodos para produzir anticorpos que compreendem o fragmento A da toxina de difteria estão enunciados na patente US no 4.675.382 (1987). A toxina de difteria contém duas cadeias de polipeptídeo. A cadeia B liga a toxina a um receptor sobre a superfície celular. A cadeia A realmente entra no citoplasma e inibe a síntese da proteína inativando o alongamento do fator 2, o fator que desloca ribossomas ao longo do mRNA concomitantemente com a hidrólise de ETP (vide Darnell, J. et al., em "Molecular Cell Biology", Scientific American Books, Inc., página 662 (1986). Alternativamente, um anticorpo que compreende ricina, uma lectina tóxi- ca, pode ser preparado. Outros agentes citotóxicos apropriados são conhecidos pelos versados na técnica.
[0128] Para detecção in vivo, os anticorpos para PLVAP da invenção podem ser conjugados a radionuclídeos diretamente ou usando um grupo funcional intermediário. Um grupo intermediário que é usado frequentemente para ligar radioisótopos, que existem como cátions metálicos, a anticorpos é o ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA) ou o ácido tetra-aza-ciclododecano-tetra-acético (DOTA). Os exemplos típicos de cátions metálicos que são ligados desta maneira são 99Tc 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, e 68Ga.
[0129] Além disso, os anticorpos da invenção podem ser marcados com um agente de reprodução de imagens por RMN, que incluem átomos paramagnéticos. O uso de um agente para reprodução de imagens por RMN permite o diagnóstico vivo da presença e do grau de HCC em um paciente, usando técnicas de RMN. Os elementos que são particularmente úteis desta maneira são 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, e 56Fe.
[0130] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo para PLVAP produzido pelo hibridoma KFCC-GY4 (número de acesso da ATCC ), tendo o hibridoma sido depositado em na American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, United States of America. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo para PLVAP produzido pelo hibridoma KFCC- GY5 (número de acesso da ATCC ), tendo o hibridoma sido depositado em na American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, Estados Unidos da América.
[0131] Em outra modalidade, a invenção refere-se ao hibridoma KFCC-GY4 (número de acesso da ATCC ). Em outra modali dade, a invenção fornece o hibridoma KFCC-GY5 (número de acesso da ATCC ).
Antagonistas de PLVAP
[0132] Um antagonista de PLVAP da invenção pode ser qualquer agente que inibe (por exemplo, reduz, impede) uma atividade de um produto gênico de PLVAP. As atividades de PLVAP incluem, porém sem limitações, formação, crescimento, vascularização ou progressão de um tumor HCC. Em uma modalidade específica, um antagonista de PLVAP inibe uma atividade de um produto gênico de PLVAP (por exemplo, RNA de PLVAP, Proteína PLVAP) ligando-se especificamente ao produto gênico de PLVAP. Os antagonistas de PLVAP englobam também agentes que inibem (reduzem, diminuem, impedem) a expressão (por exemplo, transcrição, processamento do mRNA, tradução) de um Gene ou produto gênico de PLVAP (por exemplo, RNA de PLVAP, Proteína PLVAP). Um antagonista de PLVAP pode ser um anticorpo, uma molécula pequena, um peptídeo, um peptidomimético, ou um ácido nucleico, entre outros.
Anticorpos Antagonistas
[0133] Um antagonista de PLVAP da invenção pode ser um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína PLVAP. Tais anticorpos incluem, porém sem limitações, qualquer um dos anticorpos específicos para PLVAP aqui descritos.
Moléculas Pequenas Antagonistas
[0134] Os antagonistas de PLVAP podem ser também moléculas pequenas. Os exemplos de moléculas pequenas incluem compostos orgânicos, compostos organometálicos, compostos inorgânicos, e sais de compostos orgânicos, organometálicos ou inorgânicos. Os átomos em uma molécula pequena são tipicamente ligados entre si por intermédio de ligações covalentes e/ou iônicas. O arranjo dos átomos em uma molécula orgânica pequena pode representar uma cadeia (por exemplo, uma cadeia carbono-carbono ou uma cadeia - carbono- heteroátomo), ou pode representar um anel que contém átomos de carbono, por exemplo, benzeno ou um sistema policíclico, ou uma combinação de átomos de carbono e heteroátomos, isto é, heteroci- clos tais como uma pirimidina ou quinazolina. Embora as moléculas pequenas possam ter qualquer peso molecular, elas incluem genericamente moléculas que são menores do que cerca de 5.000 dáltons. Por exemplo, essas moléculas pequenas podem ter pesos moleculares menores do que cerca de 1.000 dáltons e, de preferência, menores do que 750 dáltons ou, mais preferivelmente, menores do que cerca de 500 dáltons. As moléculas pequenas e outros antagonistas de PLVAP não peptídicos podem ser encontrados na natureza (por exemplo, identificadas, isoladas, purificadas) e/ou produzidas sinteticamente (por exemplo, por síntese orgânica tradicional, síntese bio- mediada, ou uma combinação delas) (vide, por exemplo, Ganesan, Drug Discov. Today 7(1):47-55 (janeiro de 2002); Lou, Drug Discov. Today, 6(24):1288-1294 (dezembro de 2001)). Os exemplos de moléculas orgânicas de ocorrência natural incluem, porém sem limitações, hormônios, neurotransmissores, nucleotídeos, aminoácidos, açúcares, lipídeos, e seus derivados.
Peptídeos Antagonistas
[0135] O antagonista de PLVAP da invenção pode ser também um peptídeo que se liga a uma proteína PLVAP. O peptídeo pode compreender qualquer L- e/ou D-aminoácido apropriado, por exemplo, a- aminoácidos comuns (por exemplo, alanina, glicina, valina), aminoáci- dos não-a (por exemplo, β-alanina, ácido 4-aminobutírico, ácido 6- aminocaproico, sarcosina, estatina), e aminoácidos incomuns (por exemplo, citrulina, homocitrulina, homosserina, norleucina, norvalina, ornitina). Os grupos funcionais amino, carboxila e/ou outros grupos funcionais em um peptídeo podem ser livres (por exemplo, não modificados) ou protegidos com um grupo protetor apropriado. Os grupos protetores apropriados para grupos amino e carboxila, e os métodos para adicionar ou remover grupos protetores são conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Green e Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1991. Os grupos funcionais de um peptídeo podem ser também transformados (por exemplo, alquilados) usando métodos conhecidos na técnica.
[0136] O peptídeo antagonista de PLVAP pode compreender uma ou mais modificações (por exemplo, ligantes de aminoácidos, acilação, acetilação, amidação, metilação, modificadores de terminais (por exemplo, modificações por ciclização)), caso desejado. O peptídeo pode conter também modificações químicas (por exemplo, substituição do grupo N-metil-α-amino). Além disso, o peptídeo antagonista pode ser um análogo de um peptídeo conhecido e/ou de ocorrência natural, por exemplo, um análogo de um peptídeo que tem uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos. Estas modificações podem melhorar várias propriedades do peptídeo (por exemplo, solubilidade, ligação), incluindo atividade antagonista de PLVAP.
[0137] Os antagonistas de PLVAP que são peptídeos podem ser lineares, ramificados ou cíclicos, por exemplo, um peptídeo que tem uma estrutura de anel heteroátomo, que inclui várias ligações amida. Em uma modalidade específica, o peptídeo é um peptídeo cíclico. Tais peptídeos podem ser produzidos pelos versados na técnica usando técnicas padronizadas. Por exemplo, um peptídeo pode ser obtido ou removido a partir de uma proteína nativa ou clivagem química, ou sintetizado por métodos apropriados, por exemplo, síntese de peptídeos em fase sólida (por exemplo, síntese do tipo Merrifield) (vide, por exemplo, Bodanszky et al. "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Segunda Edição, 1976). Os peptídeos que são antagonistas de PLVAP podem ser produzidos também, por exemplo, usando metodologias de DNA recombinante ou outros métodos apropriados (vide, por exemplo, Sambrook, J. e Russell, D. W., "Molecular Cloning: A Labora- tory Manual", 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).
[0138] Os peptídeos podem ser sintetizados e agrupados em bibliotecas que compreendem desde algumas até muitas espécies moleculares distintas. Tais bibliotecas podem ser preparadas usando métodos de química combinatória, e podem ser triadas usando qualquer método apropriado para determinar se a biblioteca compreende peptídeos com uma atividade biológica desejada. Tais peptídeos antagonistas podem ser então isolados usando métodos apropriados conhecidos pelos versados na técnica.
Peptidomiméticos Antagonistas
[0139] Os antagonistas de PLVAP podem ser também peptidomi- méticos. Por exemplo, podem ser preparados polissacarídeos que têm os mesmos grupos funcionais que os peptídeos. Os peptidomiméticos podem ser desenhados, por exemplo, estabelecendo a estrutura bidimensional de um agente peptídico no ambiente no qual ele está ligado ou se ligará a uma molécula-alvo. O peptidomimético compreende pelo menos dois componentes, o grupamento ou grupamentos ligantes e o esqueleto ou estrutura de sustentação.
[0140] Os grupamentos ligantes são os átomos ou grupos químicos que reagirão ou formarão um complexo (por exemplo, através de interações hidrofóbicas ou iônicas) com uma molécula-alvo, por exemplo, PLVAP humana. Por exemplo, os grupamentos ligantes em um peptidomimético podem ser iguais àqueles em um peptídeo ou proteína antagonista. Os grupamentos ligantes podem ser um átomo ou grupo químico que reage com o receptor da mesma maneira ou maneira similar que o grupamento ligante no peptídeo antagonista. Por exemplo, uma química computacional pode ser usada para desenhar miméticos de peptídeos que se ligam a proteínas PLVAP. Os exemplos de grupamentos ligantes apropriados para uso em desenhar um peptidomimético para um aminoácido básico em um peptídeo incluem grupos que contêm nitrogênio, tais como aminas, amônios, guanidinas e amidas ou fosfônios. Os exemplos de grupamentos ligantes apropriados para uso em desenhar um peptidomimético para um aminoácido ácido incluem, por exemplo, carboxila, éster de ácido carboxílico com alquila inferior, ácido sulfônico, um éster de ácido alquil-sulfônico ou ácido fosforoso ou um seu éster.
[0141] A estrutura de sustentação é uma entidade química que, quando ligada ao grupamento ou grupamentos ligantes, produz a configuração bidimensional do peptidomimético. A estrutura de sustentação pode ser orgânica ou inorgânica. Os exemplos de estruturas de sustentação orgânicas incluem polissacarídeos, polímeros ou oligôme- ros de polímeros sintéticos orgânicos (tais como poli(álcool vinílico) ou polilactídeo). Prefere-se que a estrutura de sustentação possua tamanho e dimensões substancialmente iguais àqueles do esqueleto ou estrutura de sustentação do peptídeo. Isto pode ser determinado calculando ou medindo o tamanho dos átomos e ligações do peptídeo e peptidomimético. Em uma modalidade, o nitrogênio da ligação peptídi- ca pode ser substituído por oxigênio ou enxofre, por exemplo, formando um esqueleto de poliéster. Em outra modalidade, a carbonila pode ser substituída por um grupo sulfonila ou grupo sulfinila, formando desta forma uma poliamida (por exemplo, uma polissulfonamida). Amidas inversas do peptídeo podem ser preparadas (por exemplo, substituindo um grupo NHCO por um ou mais grupos CONH). Em ainda outra modalidade, o esqueleto do peptídeo pode ser substituído por um esqueleto de polissilano.
[0142] Estes compostos podem ser fabricados por métodos conhecidos. Por exemplo, um poliéster peptidomimético pode ser preparado substituindo um grupo hidroxila pelo grupo a-amino correspondente em aminoácidos, preparando desta forma um hidroxiácido e sequencial- mente esterificando os hidroxiácidos, opcionalmente bloqueando as cadeias laterais básicas e ácidas para minimizar reações colaterais. A determinação de uma rota de síntese química apropriada pode ser facilmente identificada depois de determinar a estrutura química.
[0143] Os peptidomiméticos podem ser sintetizados e agrupados em bibliotecas que compreendem desde alguns até muitas espécies moleculares distintas. Tais bibliotecas podem ser preparadas usando métodos bem-conhecidos de química combinatória, e podem ser triadas para determinar se a biblioteca compreende um ou mais peptido- miméticos que têm a atividade desejada. Tais peptidomiméticos antagonistas podem ser então isolados por métodos apropriados.
Ácidos Nucleicos Antagonistas
[0144] Os antagonistas de PLVAP incluem também vários ácidos nucleicos, incluindo moléculas de ácidos nucleicos que inibem a expressão do gene de PLVAP (por exemplo, siRNA, oligonucleotídoes antissense, ribozimas). Por exemplo, ácidos ribonucleicos interferentes pequenos (siRNAs) e, similarmente, ácidos ribonucleicos "grampos" (hairpin) (shRNAs), que são processados para dar moléculas curtas semelhantes a siRNA em uma célula, podem impedir a expressão (tradução) da proteína PLVAP. As moléculas de siRNA podem ser po- linucleotídeos que têm genericamente um comprimento de cerca de 20 a cerca de 25 nucleotídeos desenhados para se ligarem a uma sequência de RNA específica (por exemplo, uma sequência do mRNA de PLVAP. A expressão do gene silencioso de siRNAs de uma maneira específica da sequência, ligando a um RNA-alvo RNA (por exemplo, um RNA que tem a sequência complementar) e fazendo com que o RNA seja degradado por endorribonucleases. As moléculas de siRNA capazes de inibir a expressão do produto gênico de PLVAP podem ser produzidas por métodos apropriados. Há vários algoritmos que podem ser usados para desenhar moléculas de siRNA que se ligam à se- quência de um gene de interesse (vide, por exemplo, Mateeva, O. et al., Nucleic Acids Res. 35(8):Epub, 2007; Huesken, D. et al., Nat. Bio- technol. 23:995-1001; Jagla, B. et al., RNA 11:864-872, 2005; Sha- balinea, S.A. BMC Bioinformatics 7:65, 2005; Vert, J.P. et al., BMC Bioinformatics 7:520, 2006). Vetores de expressão que podem expressar de forma estável siRNA ou shRNA estão disponíveis (vide, por exemplo, Brummelkamp, T.R., Science 296:550-553, 2002, Lee, N.S., et al., Nature Biotechnol. 20:500-505, 2002; Miyagishi, M., e Taira, K. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; Paddison, P.J., et al., Genes & Dev. 16:948-958, 2002; Paul, C.P., et al., Nature Biotechnol. 20:505508; 2002; Sui, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520, 2002; Yu, J-Y, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002; Elbashir, S.M., et al., Nature 411:494-498, 2001.). A expressão estável de moléculas de siRNA/shRNA é vantajosa no tratamento de câncer pois ela permite a expressão duradoura das moléculas, reduzindo e/ou eliminando potencialmente a necessidade de tratamentos repetidos.
[0145] Oligonucleotídeos antissense (por exemplo, DNA, ribos- sondas) também podem ser usados como antagonistas de PLVAP □ para inibir a expressão de PLVAP. Os oligonucleotídeos antissense são genericamente ácidos nucleicos curtos (~13 a ~25 nucleotídeos) de fita única que hibridizam especificamente para uma sequência de ácidos nucleicos-alvo (por exemplo, mRNA) e induzem à degradação do ácido nucleico-alvo (por exemplo, degradação do RNA através de mecanismos dependentes de RNase H) ou impedem estericamente a progressão do mecanismo de junção ou tradução (vide, por exemplo, Dias, N. e Stein, C.A., Mol. Can. Ther. 1:347-355, 2002). Há inúmeros tipos diferentes de oligonucleotídeos antissense que podem ser usados como antagonistas de PLVAP, incluindo oligonucleotídeos metil- fosfonatos, oligonucleotídeos fosforotioatos, oligonucleotídeos que têm um hidrogênio na posição 2' de ribose substituído por um grupo O- alquila (por exemplo, uma metila), ácido nucleico poliamida (PNA), oli- gômeros morfolino de fosforodiamidato (o grupamento desoxirribose é substituído por um anel morfolina), PN (substituição N3'^P5' do oxigênio na posição 3' de ribose por um grupo amina) e oligonucleotídeos quiméricos (por exemplo, 2'-O-metil/fosforotioato). Os oligonucleotí- deos antissense podem ser desenhados para serem específicos para uma □proteína, usando algoritmos preditivos (vide por exemplo, Ding, Y., e Lawrence, C. E., Nucleic Acids Res., 29:1034-1046, 2001; Scza- kiel, G., Front. Biosci., 5:D194-D201, 2000; Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res., 28:2455-2461, 2000; Patzel, V., et al., Nucleic Acids Res., 27:4328-4334,1999; Chiang, M.Y., et al., J. Biol. Chem., 266:18162-18171,1991; Stull, R. A., et al., Nucleic Acids Res., 20:3501-3508, 1992; Ding, Y., e Lawrence, C. E., Comput. Chem., 23:387-400,1999; Lloyd, B. H., et al., Nucleic Acids Res., 29:3664-3673, 2001; Mir, K. U., e Southern, E. M., Nat. Biotechnol., 17:788-792,1999; Sohail, M., et al., Nucleic Acids Res., 29:2041 -2051, 2001; Altman, R. K., et al., J. Comb. Chem., 1:493-508, 1999). Os oligonucleotídeos antissense podem ser produzidos por métodos apropriados; por exemplo, síntese de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA, PNA) usando um sintetiza- dor de ácidos nucleicos automatizado (por exemplo, da Applied Biosystems) (vide também Martin, P., Helv. Chim. Acta 78:486-504, 1995). Os oligonucleotídeos antissense podem ser também expressados de forma estável em uma célula que contém um vetor de expressão apropriado.
[0146] Os oligonucleotídeos antissense podem ser captados por células-alvo (por exemplo, células tumorosas) por intermédio do processo de endocitose adsorvente. Assim sendo, no tratamento de um indivíduo (por exemplo, mamífero), os oligonucleotídeos antissense de PLVAP podem ser distribuídos para células-alvo (por exemplo,células tumorosas), por exemplo, por injeção ou infusão. Por exemplo, oligo- nucleotídeos purificados ou siRNA/shRNA, podem ser administrados isoladamente ou em uma formulação com um veículo de distribuição de fármacos apropriado (por exemplo, lipossomas, polímeros catiôni- cos (por exemplo, dendrímeros de poli-L-lisina,PAMAM, nanopartículas de poli(cianoacrilato de alquila) e polietilenoimina) ou acoplados a um peptídeo veículo apropriado (por exemplo, fator de transcrição homeó- tico, o peptídeo Antennapedia, proteína Tat de HIV-1, peptídeo E5CA).
[0147] Ribozimas também podem ser usadas como antagonistas de PLVAP para inibir a expressão de PLVAP. As ribozimas são moléculas de RNA que possuem atividade enzimática. Uma classe de ribo- zimas é capaz de clivar repetidamente outras moléculas de RNA separadas em dois ou mais pedaços de uma maneira específica de sequências de bases de nucleotídeose (vide Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8788 (1987); Haseloff & Gerlach, Nature, 334:585 (1988); e Jefferies et al., Nucleic Acid Res, 17:1371 (1989). Tais ribozimas têm tipicamente dois domínios funcionais: um domínio catalítico e uma sequência ligante que orienta a ligação de ribozimas a um RNA-alvo através de pareamento de bases complementares. Depois que uma ribozima especificamente desenhada é ligada a um mRNA-alvo, ela cliva enzimaticamente o mRNA-alvo, tipicamente reduzindo sua estabilidade e destruindo sua capacidade de traduzir diretamente uma proteína codificada. Depois que uma ribozima clivou seu RNA-alvo, ela é liberada deste RNA-alvo, e depois disso, pode ligar e clivar outro alvo. Isto é, uma única molécula de ribozima pode ligar e clivar repetidamente novos alvos.
[0148] De acordo com a presente invenção, uma ribozima pode assestar qualquer parte do mRNA que codifica PLVAP. Os métodos para selecionar uma sequência-alvo de ribozima e desenhar e preparar ribozimas são genericamente conhecidos na técnica (vide, por exemplo, patentes US nos 4.987.071; 5.496.698; 5.525.468; 5.631.359; 5.646.020; 5.672.511; e 6.140.491, sendo cada uma delas aqui incorporada como referência em sua totalidade. Por exemplo, as ribozimas apropriadas podem ser desenhadas em várias configurações tais como modelos de "cabeça de martelo" (hammerhead), modelos de grampo (hairpin), motivos de vírus da hepatite delta, modelos de ín- trons grupo I, ou modelos do RNA de RNase P (vide, por exemplo, patentes US nos 4.987.071; 5.496.698; 5.525.468; 5.631.359; 5.646.020; 5.672.511; e 6.140.491; Rossi et al., AIDS Res Human Retroviruses 8:183 (1992); Hampel & Tritz, Biochemistry 28:4929 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res, 18:299 (1990); Perrotta & Been, Biochemistry 31:16 (1992); e Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849 (1983).
[0149] As ribozimas podem ser sintetizadas pelos mesmos métodos usados para a síntese de RNA normal. Por exemplo, os métodos apropriados estão descritos em Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845-7854 (1987) e Scaringe et al., Nucleic Acids Res, 18:54335441 (1990). As ribozimas modificadas podem ser sintetizadas pelos métodos descritos, por exemplo, na patente US no 5.652.094; publicações internacionais nos WO 91/03162; WO 92/07065 e WO 93/15187; pedido de patente europeu no 92110298.4; Perrault et al., Nature, 344:565 (1990); Pieken et al., Science, 253:314 (1991); e Usman & Cedergren, Trends Biochem Sci, 17:334 (1992).
[0150] Os antagonistas de PLVAP da invenção podem ser também moléculas de ácidos nucleicos (por exemplo, oligonucleotídeos) que se ligam e inibem a atividade de uma proteína PLVAP. Os ácidos nuclei- cos antagonistas de PVLAP apropriados incluem aptâmeros, que são capazes de se ligar a uma molécula específica de interesse (por exemplo, PLVAP humana) com alta afinidade e especificamente através de interações que não o pareamento clássico de bases de Watson-Crick (Tuerk e Gold, Science 249:505 (1990); Ellington e Szostak, Nature 346:818 (1990)).
[0151] Os aptâmeros, tais como os peptídeos gerados por apresentação de fagos ou anticorpos monoclonais (MAbs), são capazes de se ligar especificamente a alvos selecionados e, através da ligação, bloqueiam a capacidade de os alvos funcionarem. Criados por um processo de seleção in vitro a partir de coleções de oligonucleotídeos com sequências aleatórias, foram gerados aptâmeros para mais de 100 proteínas, incluindo fatores de crescimento, fatores de transcrição, enzimas, imunoglobulinas, e receptores. Um aptâmero típico tem um tamanho de 10-15 kDa (30-45 nucleotídeos), se liga a seu alvo com afinidade abaixo de nanomolar e discrimina contra alvos proximamente relacionados (por exemplo, não se ligarão tipicamente a outras proteínas da mesma família de genes). Vários estudos estruturais demons-traram que os aptâmeros são capazes de usar os mesmos tipos de interações de ligação (ligação hidrogênio, complementaridade eletrostática, contatos hidrofóbicos, exclusão estérica, etc.) que direcionam a afinidade e especificidade em complexos anticorpo-antígeno.
[0152] Um aptâmero que se liga a um alvo de interesse (por exemplo, uma proteína PLVAP humana) pode ser gerado e identificado usando um processo-padrão conhecido como "Evolução sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial" (SELEX), descrito, por exemplo, nas patentes nos US 5.475.096 e US 5.270.163. Identificação de Antagonistas de PLVAP
[0153] Os agentes que têm especificidade de ligação por produtos gênicos de PLVAP podem ser identificados em uma triagem, por exemplo, uma triagem com alto volume de produção de compostos químicos e/ou bibliotecas (por exemplo, bibliotecas de produtos químicos, peptídeos, ácidos nucleicos).
[0154] Os anticorpos que se ligam especificamente a PVLAP humana podem ser identificados, por exemplo, triando bibliotecas combi- natórias de anticorpos comercialmente disponíveis (Dyax Corp., MorphoSys AG). As bibliotecas combinatórias de anticorpos apropriadas e os métodos padronizados para triar estas bibliotecas estão descritos em Hoet et al., Nature Biotechnology 23(3):344-348 (2005); e Rau- chenberger et al., J. Biol. Chem. 278(40):38194-38205 (2003), cujos teores são aqui incorporados como referência. Tais bibliotecas ou coleções de moléculas podem ser preparadas também usando métodos químicos bem-conhecidos.
[0155] Alternativamente, anticorpos murinos que se ligam especificamente a PLVAP humana podem ser identificados, por exemplo, imunizando camundongos com proteínas PLVAP, fragmentos de proteínas ou peptídeos, junto com um adjuvante para romper a tolerância ao antígeno. Estes anticorpos podem ser triados quanto à especificidade e atividade desejada, e então humanizados usando técnicas conhecidas, para criar agentes apropriados para o tratamento de doença humana.
[0156] Os compostos ou moléculas pequenas podem ser identificados a partir de inúmeras bibliotecas disponíveis de compostos químicos, por exemplo, no Chemical Repository of the National Cancer Institute e no Molecular Libraries Small Molecules Repository (Pub- Chem), bem como bibliotecas do Institute of Chemistry and Cell Biology na Universidade Harvard e outras bibliotecas que estão disponíveis em fornecedores comerciais (por exemplo, Chembridge, Peakdale, CEREP, MayBridge, Bionet). Tais bibliotecas ou coleções de molé-culas podem ser também preparadas usando métodos químicos bem- conhecidos, tais como os métodos bem-conhecidos de química combinatória. As bibliotecas podem ser triadas para identificar compostos que se ligam a PLVAP e a inibem.
[0157] Os compostos identificados podem servir como compostos líderes para diversificação adicional usando métodos bem-conhecidos de química medicinal. Por exemplo, uma coleção de compostos que são variantes estruturais dos líderes pode ser preparada e triada quanto à ligação a PLVAP e/ou atividade inibitória de PLVAP. Isto pode resultar no desenvolvimento de uma relação estrutura/atividade que liga a estrutura de compostos à atividade biológica. Os compostos que têm ligação e atividade inibitória apropriadas podem ser desenvolvidos adicionalmente para uso in vivo.
[0158] Os agentes que se ligam a PLVAP podem ser avaliados quanto à atividade antagonista a PLVAP. Por exemplo, uma composição que compreende uma proteína PLVAP pode ser usada Dem um ensaio de triagem ou ligação para detectar e/ou identificar agentes que se ligam e antagonizam a proteína PLVAP. As composições apropriadas para uso incluem, por exemplo, células que expressam naturalmente uma proteína PLVAP (por exemplo, células endoteliais vasculares do fígado), extratos dessas células, e proteína PLVAP recombinante.
[0159] Um agente que se liga a uma proteína PLVAP pode ser identificado em um ensaio de ligação competitiva, por exemplo, no qual a capacidade de um agente em teste inibir a ligação de PLVAP a um agente referencial é avaliada. O agente referencial pode ser uma proteína PLVAP de comprimento inteiro ou uma parte dela. O agente referencial pode ser marcado com um marcador apropriado (por exemplo, radioisótopo, epitopo marcador, afinidade marcadora (por exemplo, biotina e avidina ou estrepto-avidina), marcador spin, enzima, grupo fluorescente, grupo quimioluminescente, corante, metal (por exemplo, ouro, prata), pérola magnética), e a quantidade do agente referencial marcado requerida para saturar a proteína PLVAP no ensaio pode ser determinada. A especificidade da formação do complexo entre a proteína PLVAP e o agente em teste pode ser determinada usando um controle apropriado (por exemplo, agente não marcado, marcador sozinho).
[0160] A capacidade de um agente em teste inibir a formação de um complexo entre o agente referencial e uma proteína PLVAP pode ser determinada como a concentração do agente em teste necessária para 50% de inibição (valor de CI50) da ligação específica do agente referencial marcado. A ligação específica é definida, de preferência, como a ligação total (por exemplo, marcação total no complexo) menos a ligação inespecífica. A ligação inespecífica é definida, de preferência, como a quantidade de marcador ainda detectada em comple-xos formados na presença de excesso de agente referencial não marcado. Os agentes referenciais apropriados para uso no método incluem moléculas e compostos que se ligam especificamente a PLVAP, por exemplo, um anticorpo que se liga a PLVAP.
[0161] Um agente que antagoniza uma proteína PLVAP pode ser identificado por triagem quanto a agentes que têm uma capacidade de antagonizar (reduzir, impedir, inibir) uma ou mais atividades de PLVAP, tal como, por exemplo, vascularização de tumor. Tais atividades podem ser avaliadas pelos versados na técnica, usando qualquer ensaio in vitro ou in vivo apropriado. Composições Farmacêuticas
[0162] Um antagonista de PLVAP da invenção pode ser administrado a um indivíduo mamífero como parte de uma composição farmacêutica ou fisiológica, por exemplo, como parte de uma composição farmacêutica que compreende um antagonista de PLVAP e um veículo farmaceuticamente aceitável. As formulações ou composições que compreendem um antagonista de PLVAP,(DDpor exemplo,D um anticorpo que se liga especificamente a PLVAP) ou composições que compreendem um antagonista de PLVAPD e um ou mais outros agentes terapêuticos (por exemplo, um agente quimioterápico, por exemplo, doxorrubicina, 5-fluorouracila, tamoxifeno, octreotid) variarão de acordo com a via de administração selecionada (por exemplo, solução, emulsão ou cápsula). Os veículos farmacêuticos apropriados podem conter ingredientes inertes que não interagem com o antagonista de PLVAPD. Técnicas padronizadas para formulação de produtos farmacêuticos podem ser empregadas, tais como aquelas descritas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, PA. Os veículos farmacêuticos apropriados para administração parenteral incluem, por exemplo, água esterilizada, solução salina fisiológica, solução salina bacteriostática (solução salina que contém cerca de 0,9% mg/mL de álcool benzílico), solução salina tamponada com fosfato, solução de Hank, lactato em solução de Ringer, e similares. As formulações podem incluir também pequenas quantidades de substâncias que intensificam a eficácia do ingrediente ativo (por exemplo, agentes emulsificantes, auxiliares de solubilização, para tamponar o pH, umectantes). Os métodos para encapsulação de composições (tais como em um revestimento de gelatina dura ou ciclodex- trana) são conhecidos na técnica. Para inalação, o agente pode ser solubilizado e carregado dentro de uma embalagem apropriada para administração (por exemplo, um atomizador ou nebulizador ou embalagem de aerossol pressurizada).
Kits Diagnósticos
[0163] A invenção fornece também kits diagnósticos para detectar a presença de um carcinoma hepatocelular em um indivíduo. Tais kits compreendem pelo menos um agente (por exemplo, uma sonda de ácido nucleico, um anticorpo) para detectar a expressão do gene de PLVAP em uma amostra (por exemplo, uma amostra biológica de um indivíduo mamífero). A expressão do gene de PLVAP pode ser detectada, por exemplo, detectando um produto gênico de PLVAP, tal como um mRNA de PLVAP ou uma proteína PLVAP, na amostra.
[0164] Consequentemente, em uma modalidade, o kit compreende pelo menos uma sonda de ácido nucleico (por exemplo, uma son- da de oligonucleotídeo) que hibridiza especificamente para um transcrito do RNA de PLVAP (por exemplo, mRNA, hnRNA). Tais sondas são capazes de hibridizar para RNA de PLVAP sob condições de alta severidade.
[0165] Em outra modalidade, o kit inclui um par de iniciadores de oligonucleotídeos que são capazes de hibridizar especificamente para um produto gênico de PLVAP (por exemplo, mRNA, CDNA) em uma amostra. Tais iniciadores podem ser usados em qualquer procedimento-padrão de amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, reação de polimerase em cadeia (PCR), por exemplo, RT-PCR, PCR quantitativa em tempo real) para determinar o nível do produto gênico de PLVAP na amostra.
[0166] Em outra modalidade, os kits da invenção incluem um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína PLVAP (por exemplo, uma proteína PLVAP humana). Tais anticorpos incluem qualquer um dos anticorpos para PLVAP da invenção aqui descritos. Em uma modalidade, o anticorpo compreende um domínio VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 4 e um domínio VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 9. Em outra modalidade, o anticorpo compreende um domínio VH que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID N°: 14 e um domínio VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 19.
[0167] Os agentes diagnósticos nos kits da invenção podem incluir um ou mais marcadores (por exemplo, marcadores detectáveis). Inúmeros marcadores apropriados para agentes diagnósticos são conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitações, qualquer um dos marcadores aqui descritos. Em uma modalidade específica, o agente diagnóstico (por exemplo, anticorpo) inclui um radioisótopo, de tal modo que o agente possa ser usado para tomografia por emissão de pó- sitrons (imuno-PET).
[0168] A presente invenção será agora ilustrada pelos exemplos que seguem, que não pretendem ser de forma alguma limitativos. Exemplificação Exemplo 1: Expressão de PLVAP é elevada em tecidos hepáticos de HCC em relação a tecidos hepáticos não-HCC Materiais e Métodos: Amostras de tecidos
[0169] Tecidos de HCC e tecidos hepáticos não-tumorosos adjacentes foram coletados a partir de espécimes frescos removidos cirurgicamente de pacientes humanos com propósito terapêutico. Estes espécimes foram coletados sob supervisão direta de patologistas atenden- tes. Os tecidos coletados foram imediatamente estocados em nitrogênio líquido no Tumor Bank of the Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Center (KF-SYSCC). Amostras de tecidos pareados de dezoito pacientes de HCC estavam disponíveis para o estudo. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. As características clínicas dos dezoito pacientes de HCC deste estudo estão resumidas na Tabela 1. Tabela 1: Dados clínicos de dezoito pacientes de HCC a partir dos quais amostras de tecidos hepáticos pareados de HCC e não- tumorosos adjacentes foram obtidas
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Perfil de Transcritos do mRNA
[0170] O RNA total foi isolado a partir de tecidos congelados em nitrogênio líquido usando reagentes Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). O RNA isolado foi purificado adicionalmente usando o kit RNAEasy Mini (Qiagen, Valencia, CA), e sua qualidade foi avaliada usando o ensaio RNA 6000 Nano em um Bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha). Todas as amostras de RNA usadas no estudo tinham um Número de Integridade de RNA (RIN) maior do que 5,7 (8,2 ± 1,0, média ± desvio-padrão). Alvos de hibridi- zação foram preparados a partir de 8 μg de RNA total de acordo com protocolos Affymetrix e hibridizados para um Affymetrix U133A GeneChip, que contém 22.238 conjuntos de sondas para aproximadamente 13.000 genes humanos. Imediatamente depois da hibridização, o arranjo hibridizado sofreu lavagem automatizada e coloração usando estação fluídica Affymetrix GeneChip 400 e o protocolo EukGE WS2v4. Depois disso, GeneChips U133A foram escaneados em um escaneador Affymetrix GeneArray 2500. Determinação de Denominação Presente e Ausente de Dados de Mi- croarranjos
[0171] O programa Affymetrix Microarray Analysis Suite (MAS) 5.0 foi usado para gerar denominações presentes para dados de microar- ranjos para todos 18 pares de tecidos hepáticos de HCC e não tumo- rosos adjacentes. Todos os parâmetros para determinação de chama- das presentes foram valores de omissão. Cada conjunto de sondas foi determinado como "presente", "ausente" ou "marginal" por MAS 5.0. Similarmente, os mesmos dados de microarranjos foram processados usando o programa dChip versão-2004 para determinar o estado "presente", "ausente" ou "marginal" de cada conjunto de sondas nos mi- croarranjos. Identificação de Conjuntos de Sondas com Extrema Expressão Diferencial
[0172] Para identificação de genes com extrema expressão diferencial entre tecido hepático de HCC e não tumoroso adjacente, o programa escrito usando a Linguagem de Extração Prática e Relatório (PERL) foi usado de acordo com se seguintes regras: "Genes específicos de Tumor" foram definidos como conjuntos de sondas que foram denominados "presentes" em HCC e "ausentes" ou "marginais" em tecido hepático não-tumoroso adjacente por MAS 5.0 e também dChip. "Genes específicos de tecidos hepáticos não-tumorosos" foram definidos como conjuntos de sondas denominados 'ausentes' ou 'marginais' em HCC e 'presentes' no tecido hepático pareado não tumoroso adjacente por MAS 5.0 e também dChip. Um diagrama em fluxograma que representa o algoritmo de identificação está ilustrado na figura 1. Reação de polimerase em cadeia quantitativa em tempo real com transcriptase reversa (RT-PCR)
[0173] Uma PCR quantitativa em tempo real com transcriptase reversa TaqManTM (qRT-PCR) foi usada para quantificar o mRNA. O CDNA foi sintetizado a partir de 8 μg de RNA total para cada amostra usando 1.500 ng do iniciador oligo(dT) e 600 unidades de Transcriptase Reversa SuperScript™ II da Invitrogen (Carlsbad, CA) em um volume final de 60 μL, de acordo com as instruções do fabricante. Para cada reação RT-PCR, 0,5 μL de CDNA foi usado como modelo em um volume final de 25 μL seguindo as instruções dos fabricantes (ABI e Roche). As reações PCR foram conduzidas usando o sistema Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR. As sondas e reagentes necessários para os experimentos foram obtidos na Applied Biosystems (ABI) (Foster City, CA). As sequências de iniciadores e as sondas usadas para a RT-PCR quantitativa em tempo real de PLVAP são 5'- CCTGCAGGCATCCCTGTA-3' (iniciador direto) (SEQ ID N°: 25); 5'- CGGGCCATCCCTTGGT-3' (iniciador reverso) (SEQ ID N°: 26); e 5'- CCCCATCCAGTGGCTG-3' (sonda) (SEQ ID N°: 27). O gene de expressão de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HPRT) foi usado como referência endógena para normalização. Todas as amostras foram operadas em duplicata na mesma placa de PCR para o mesmo mRNA-alvo e o mRNA de HPRT da referência endógena. As quantidades relativas de mRNA's-alvos foram calculadas pelo método Ct comparativo de acordo com as instruções do fabricante (Boletim do Usuário no 2, ABI Prism 7700 Sequence Detection System). Uma amostra não-tumorosa do fígado foi escolhida como calibrador relativo para o cálculo. Resultados:
[0174] As intensidades da expressão do gene de PLVAP em 18 pares de tecidos hepáticos de HCC e não-tumorosos adjacentes estão ilustradas na figura 2. As intensidades médias da expressão gênica foram 759,8±436,5 e 170,6±53,4 (média ± desvio-padrão) tecido hepático pareado de HCC e não-tumoroso adjacente, respectivamente. O valor de p do teste t pareado entre os dois grupos era 2,8 x 10-5. Estes resultados indicam que PLVAP é expressada em HCC e não em tecido hepático não tumoroso. Esta expressão elevada de PLVAP em HCC foi confirmada adicionalmente quando 82 amostras de HCC não pareadas apresentaram uma intensidade de expressão média de 810,4 ± 482,0 (média ± desvio-padrão), que é essencialmente igual à descoberta em 18 amostras de HCC pareadas (p = 0,62 pelo teste t) (figura 2).
[0175] Para confirmar que PLVAP é significativamente expressada em tecido hepático de HCC e não em tecido hepático não-tumoroso, uma RT-PCR quantitativa em tempo real foi realizada em amostras de RNA de 18 pares de tecidos hepáticos de HCC e não-tumorosos adjacentes. As quantidades do mRNA de PLVAP foram significativamente mais altas em tecidos de HCC em relação a tecidos hepáticos não-tumorosos (vide figura 3A e Tabela 2). Embora os resultados apresentassem alguma sobreposição entre os dois grupos, os transcritos de PLVAP eram mais altos em HCC do que em tecido hepático não-tumoroso adjacente dentro do mesmo indivíduo para todos os indivíduos testados, exceto um (figura 3B). Esta exceção estava possivelmente associada a graus desiguais de degradação do RNA durante o processo de estocagem dos tecidos. Tabela 2: Intensidades da Expressão do Gene de PLVAP para 18 pares de Tecidos Hepáticos de HCC e Não Tumorosos Adjacentes
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Exemplo 2: PLVAP é expressada especificamente por células endote- liais vasculares de HCC Materiais e Métodos: Microdissecação por Captura a Laser (LCM) de tecidos embutidos em parafina fixados com formalina
[0176] LCM de tecido fixado em formalina a partir de blocos de parafina foi conduzida usando o sistema Arcturus PixCellR IIe, CapSureTM HS LCM caps, e o sistema de reagentes ParadiseTM da Arcturus Bioscience, Inc. (Mountain View, CA). Sete seções de tecidos com espessura micro- métrica foram cortadas, retiradas da parafina, reidratadas, coradas e desidratadas para realizar LCM de acordo com as instruções do fabricante. Células-alvo foram capturadas sobre cápsulas de LCM CapSureTM HS LCM, usando tamanho de spot de laser de 7,5 μm em potência de 50 mW e duração de 1,3 ms. Aproximadamente, 5.000 a 6.000 células foram capturadas em cada cápsula. Entretanto, apenas 1.000 a. 2.000 células endoteliais vasculares de carcinoma hepatocelular foram capturadas sobre cada cápsula devido à escassez de células. Extração de RNA de Seções de Tecido por LCM para RT-PCR Quantitativa
[0177] Células capturadas sobre cápsulas de LCM CapSureTM HS, como descrito acima, foram processadas para extração de RNA, síntese de cDNA, transcrição in vitro e amplificação de RNA antissense, usando o sistema de reagentes ParadiseTM, de acordo com as instruções do fabricante. O RNA antissense sintetizado foi então usado como um modelo para RT-PCR quantitativa em duas etapas e tempo real TaqMan para quantificação de PLVAP e mRNA de beta-actina nas células capturadas por LCM. A primeira etapa (isto é, transcrição reversa) foi conduzida usando 4,5 μL de RNA antissense e Reagentes de Transcrição Reversa TaqMan (ABI) em um volume final de 10 μL seguindo o protocolo do fabricante. A segunda etapa (isto é, PCR em tempo real) foi realizada usando 2,4 μL do modelo de cDNA, a mistura de iniciadores/sonda e TaqMan universal PCR Master Mix da Applied Biosystems em um volume final de 25 μL. A PCR em tempo real foi conduzida em um Smart Cycler II (Cephid, Inc., Sunnyvale, CA). As reações foram inicialmente incubadas a 50°C por 2 minutos e depois a 95°C por 10 minutos. Depois disso, 45 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos e anelamento/extensão a 60°C por 40 segundos foram realizados. As sequências dos iniciadores e sondas estão listadas na Tabela 3. Tabela 3. Sequências de iniciadores e sondas para RT-PCR quantitativa em tempo real para níveis de PLVAP e beta-actina em amostras preparadas por microdissecação por captura a laser
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Preparação de Vetor de Expressão para a Proteína De Fusão Recom- binante PLVAP51 — 442
[0178] O plasmídeo pGEM®-T Easy -PLVAP51 - 442 foi gerado inserindo um fragmento de PCR que codifica os resíduos de aminoácidos 51 a 442 de PLVAP dentro do Vetor pGEM®-T Easy (Promega, Inc., Madison, WI). O fragmento da PCR foi amplificado a partir de um clone do cDNA de PLVAP da OriGene (Rockville, MD) usando o conjunto de iniciadores de 5'-|CÃTÃTGÃÃCGTGCÃCGTGÃGCÃCÃGÃGTCC-3' (SEQ ID N°: 34) e 5'-GGATCCTGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3' (SEQ ID N°: 35). Para a construção do plasmídeo pET-15b-PLVAP5i - 442, um fragmento de cDNA que codifica os resíduos de aminoácidos 51 a 442 de PLVAP com as sequências de reconhecimento NdeI e BamHI em cada respectiva extremidade foi excisado de pGEM®-T Easy -PLVAP51 - 442 e inserido em pET-15b (Novagen, Inc., San Diego, CA). A construção de expressão descrita acima foi verificada por se- quenciamento de DNA. Expressão e purificação da Proteína de Fusão Recombinante PLVAP51 - 442
[0179] Para a produção de uma proteína PLVAP51 - 442 recombinante marcada com His (SEQ ID N°: 2) (figura 4), Escherichia coli (Rosetta- gami2(DE3)pLysS) (Novagen) foi transformada incubando células com-petentes com o DNA do plasmídeo pET-15b-PLVAP51 - 442 sobre gelo por 5 min, e em seguida, incubação em um banho de água a 42°C por 30s e depois novamente sobre gelo por 2 min. Antes de plaquear sobre meio seletivo, os transformantes foram incubados a 37°C sob vascolejamento a 250 rpm com meio SOC (0,5% de Extrato de Levedura; 2% de Tripto- na; NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM; MgCl2 10 mM; MgSO4 10 mM; Glicose 20 mM) por 60 min. A expressão da proteína de fusão marcada com His em Escherichia coli Rosetta-gami2(DE3)pLysS foi induzida com isopropil-β- D-tiogalactopiranosídeo 1 mM por 16 horas a 30°C. Depois da indução, as células bacterianas foram individualizadas até a lise por sonicação em tampão de equilibração (fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7) suplementado com ureia 8 M e separadas em frações solúveis e insolúveis por centrifugação a 5.600 x g por 30 minutos. Para purificação adicional da proteína His-PLVAP51 - 442, a fração solúvel foi carregada sobre uma Resina de Afinidade de Metal TALON® (Clontech, Inc., Palo Alto, CA), lavada com tampão de equilibração e eluída com tampão de eluição (fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7, imidazol 250 mM). O mar- cador His da proteína de fusão purificada foi removido por clivagem com trombina (Novagen) de acordo com as instruções do fabricante (vide figura 5). A proteína PLVAP51 - 442 resultante foi recuperada por diálise extensiva contra PBS. Para verificar a identidade da proteína PLVAP recombi- nante, uma pequena quantidade de antissoro do camundongo contra a proteína de fusão GST-PLVAP331-430 foi adquirida do Biodesign Institute (Tempe, AZ). A proteína PLVAP51-442 recombinante sem o marcador His foi detectada por análise Western blot usando este anticorpo, mas não reagiu com anticorpos para o marcador His. Estes resultados confirmam a identidade da proteína PLVAP recombinante. Geração de soro de PLVAP anti-humano do camundongo
[0180] A proteína PLVAP51 - 442 recombinante purificada em PBS foi usada para imunizar camundongos Balb/cByj com 6 semanas de idade. Cada camundongo foi inicialmente imunizado com injeção subcutânea em múltiplos locais com um total de 14 μg da proteína PLVAP51-442 em adjuvante de Freund completo (Sigma, Inc., St. Louis, MO). Depois disso, a imunização foi reforçada com 7 μg da proteína PLVAP51 - 442 recombinante em adjuvante de Freund incompleto uma vez a cada duas semanas por três vezes. Uma semana depois da última imunização de reforço, os camundongos foram sangrados para preparação de antissoro. Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) Reagentes e Soluções: 1. Proteína PLVAP Recombinante 2. Conjugado IgG-fosfatase alcalina anticamundongo (No do Catálogo AP124A, CHEMICON) 3. Tampão de revestimento (cloreto de sódio 0,137 M, fosfato dibásico de sódio hepta-hidratado 0,01 Mm, fosfato monobásico de potássio 2 mM, azida de sódio a 0,002% (0,3 mM), pH 7,2-7,4) 4. Tampão de lavagem (cloreto de sódio 0,137 M, fosfato dibásico de sódio hepta-hidratado 0,01 M, fosfato monobásico de potássio 2 mM, 0,2% de Tween20 (Catálogo. P1379, SIGMA, pH 7,2-7,4) 5. Tampão de bloqueio (cloreto de sódio 0,137 M, fosfato dibásico de sódio hepta-hidratado 0,01 M, fosfato monobásico de potássio 2 mM, 2% de albumina de soro bovino (Catálogo 82-045, PENTEX), 0,05% de Tween-20 (Catálogo P1379, SIGMA), pH 7,2-7,4) 6. Tampão de carbonato (bicarbonato de sódio 0,016 M, carbonato de sódio 0,014M, cloreto de magnésio 2 mM, azida de sódio a 0,002% (0,3 mM), pH 9,6) 7. Substrato de fosfatase alcalina: um comprimido de 40 mg de substrato de fosfatase (Catálogo P5994, SIGMA) dissolvido em 40 mL de tampão de carbonato Procedimento:
[0181] As titulações de anticorpos nos soros anti-PLVAP foram determinadas usando ELISA. Primeiramente, a placa de ELISA com 96 poços foi revestida com 50 μL de proteína PLVAP dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,002% de azi- da de sódio (isto é, tampão de revestimento) em uma concentração na faixa de 2,5 μg/mL de um dia para o outro a 4°C. Depois de três lavagens com 200 μL de tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween-20), cada poço da placa revestida foi bloqueado com 150 μL de tampão de bloqueio (isto é, tampão de lavagem contendo 2% de albumina de soro bovino) à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois de três lavagens, cada poço foi incubado com 50 μL de antissoro diluído (diluição serial de duas vezes a partir de 1.000x até 128.000x) preparado em tampão de diluição por 45 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, cada poço foi incubado com conjugado de IgG- flsfatase alcalina anticamundongo em diluição de 5.000X (Chemico, Inc., Temecula, CA) por 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de três lavagens, os anticorpos ligados foram quantificados com 100 μL de substrato de fosfatase alcalina (Sigma, Inc., St Louis, MO) e a medição de absorvância foi realizada a 405 nm depois de um período de incubação de 25 a 40 min, usando leitora de placas ELISA. Detecção imuno-histoquímica (IHC) de PLVAP em tecidos fixados em formalina
[0182] Seções de seis mícrons foram cortadas de blocos de parafina com tecidos fixados em formalina. As seções foram montadas sobre lâminas de vidro para adesão SuperFrost plus (Menzel Glaser GmbH, Braunschweig, Alemanha). As seções foram processadas para imunocoloração de PLVAP em um instrumento de coloração automatizado Benchmark XT (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) usando o protocolo XT-iView-DAB-V.1 com condicionamento brando por CCI por 30 minutos, e as seções foram incubadas com soro de PVLAP anti-humano diluído 400X a 37°C por 36 minutos. O segundo anticorpo e os reagentes usados para detectar a ligação de anticorpos para PVLAP anti-humanos do camundongo eram do Kit de Detecção iViewTMDAB da Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ). Todos os reagentes e tampões foram adquiridos da Ventana Medical Systems. Resultados:
[0183] Para determinar a origem celular de PLVAP em amostras de HCC, células endoteliais vasculares de HCC, células tumorosas de carcinoma hepatocelular e hepatócitos não-tumorosos, incluindo células endoteliais sinusoides do revestimento, foram dissecadas para fora das amostras usando microdissecação por captura a laser (LCM). Devido à oposição próxima entre células de hepatoma e células endoteliais do revestimento de capilares, um esforço foi envidado para evitar a inclusão de células endoteliais do revestimento de capilares durante a dissecação. Os RNAs extraídos das células dissecadas foram usados para RT-PCR quantitativa em duas etapas e tempo real para determinar as quantidades relativas do mRNA de PLVAP. Os espécimes de dois pacientes diferentes foram estudados. Os resultados indicados na Tabela 4 e figuras 6A-C indicam que PLVAP é expressada por células endoteliais vasculares de HCC (figura 6A), enquanto que nenhum transcrito de PLVAP detectável foi detectado em tecidos hepáticos não-tumorosos adjacentes (figura 6B). Tabela 4: Determinação das quantidades relativas do mRNA de PLVAP em duas amostras de HCC por RT-PCR quantitativa em tempo real Taqman em células dissecadas por microdissecação por captura a laser
Figure img0005
[0184] Para investigar ainda mais o tecido e a especificidade pela doença da expressão de PLVAP, anticorpos policlonais para uso em estudos de imuno-histoquímica (IHC) foram gerados contra o domínio extracelular de PVLAP humana (aminoácidos 51 a 442). Como ilustrado na figura 7, o antissoro obtido a partir de camundongos Balb/c que foram imunizados com a proteína PLVAP51-442 re- combinante continha uma alta titulação de anticorpos anti-PLVAP.
[0185] O antissoro anti-PLVAP foi então usado para determinar a localização da expressão de PLVAP nas seções de tecido de pacientes com carcinoma hepatocelular (n=7) (figuras 8A-F e 9A-F), hi- perplasia nodular focal (n=4) (figuras 10A-F), hemangioma hepático (n=2) (figuras 11A e B), hepatite B ativa crônica (n=2) (figuras 12A e B) ou C (n=4) (figuras 13A-D), e câncer metastático (n=4) (isto é, colangiocarcinoma intra-hepático, adenocarcinoma colorretal metas- tático, ou carcinoma ovariano metastático) (figuras 14A-D). Os resultados indicaram que apenas células endoteliais capilares de carci- nomas hepatocelulares expressavam a proteína PLVAP (figuras 8A,C,E e 9A,C,E,F). A proteína PLVAP não foi expressada por células endoteliais que revestem os sinusoides/capilares vasculares de tecidos hepáticos não-tumorosos, incluindo fígado cirrótico, fígado de hiperplasia nodular focal (figuras 10A-F), e hepatite crônica (figuras 12A e B; figuras 13A-D). As células endoteliais do revestimento de hemangioma hepático também não apresentavam expressão significativa de PLVAP (figuras 11A e B). Estes resultados demonstram que PLVAP é um biomarcador endotelial vascular que é específico para carcinoma hepatocelular, mas não para outras doenças do fígado. Portanto, PLVAP pode ser usada como um marcador diagnóstico e alvo terapêutico para HCC. Exemplo 3: Produção e caracterização de anticorpos monoclonais do camundongo que se ligam especificamente a PLVAP Materiais e Métodos Procedimentos de Imunização
[0186] Cinco camundongos Balb/cByJ com seis semanas de idade foram imunizados inicialmente com 20 μg de proteína PLVAP recombinante purificada dissolvida em 0,125 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e emulsificada em volume igual de adjuvante de Freund completo. A mistura PLVAP-adjuvante foi injetada em volumes de 0,05 mL dentro de quatro locais subcutâneos separados no lado ventral dos camundongos perto dos nodos linfáticos axilares e inguinais, bem como um quinto local subcutâneo, que ficava localizado entre as escápulas. Todos os camundongos receberam uma imunização de reforço de 20 μg de proteína PLVAP re- combinante injetada de forma intraperitoneal três vezes a cada duas semanas. Uma semana depois da última imunização de reforço, sangramentos para teste foram retirados para medir se os camundongos estavam produzindo titulações suficientemente altas de anti- corpos anti-PLVAP (>10.000X). Um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima em fase sólida (ELISA) foi usado para este propósito. O camundongo que produzia a titulação mais alta de anticorpo para PLVAP foi selecionado par a produção de hibridomas. Desenvolvimento de Anticorpos Anti-PLVAP Monoclonais Murinos
[0187] Três dias antes do experimento de fusão programado para produzir hibridomas, o camundongo que produziu a titulação mais alta de anticorpo para PLVAP recebeu injeção intravenosa de 20 μg de PLVAP recombinante. Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais (MAbs) contra PLVAP foram produzidos de acordo com um protocolo descrito anteriormente (vide "Unit 2.5 Production of Monoclonal Antibodies", em "Current Protocols in Immunology", editores: Coligan, J.E., Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H., Shevach, E.M., e Strober, W., publicado por John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001) com mínima modificação. Especificamente, células do baço colhidas a partir do camundongo imunizado foram fundidas com células de mieloma SP2/0 em uma razão de 7,5:1 (células do baço:células de mieloma) usando polietilenoglicol 1540 a 50%. Os produtos da fusão foram semeados em placas de cultura de tecidos com fundo plano e 96 poços, e meio seletivo de hipoxantina- aminopterina-timidina (HAT) foi adicionado no dia seguinte. Sete a dez dias depois, os sobrenadantes dos poços com crescimento positivo foram triados quanto à produção de anticorpos anti-PLVAP por ELISA. Os hibridomas que produziram inicialmente MAbs anti- PLVAP foram expandidos e triados novamente. Os hibridomas que apresentaram produção continuada de anticorpos foram clonados pelo método de diluição limitativa. Isótipos de MAbs foram determinados usando uma análise ELISA. Os anticorpos monoclonais foram purificados para remover ascite ou meio de cultura por cromatografia com coluna de afinidade de Proteína G ("Unit 2.7 Purification and Fragmentation of Antibodies", em "Current Protocols in Immunology", editores: Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, e Strober W., publicado por John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001). Ensaio ELISA Ensaios ELISA foram realizados como aqui descrito (vide Exemplo 2). Determinação de afinidades de ligação
[0188] As afinidades de ligação dos anticorpos monoclonais anti- PVLAP KFCC-GY4 e KFCC-GY5 foram medidas na ANT Technology Co., Ltd. (Taipei, Taiwan) usando tecnologia de microbalança de cristal de quartzo ANTQ300 (Lin, S., et al., J. Immunol Methods 239:121-124 (2000)). Isolamento e cultura de células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC)
[0189] O isolamento de cultura de HUVEC foi conduzido de acordo com o protocolo estabelecido descrito em Baudin, B., Bru- nee, A., Bosselut, N. e Vaubourdolle, M., Nature Protocols 2:481-485 (2007). Durante a manutenção da cultura de células endoteliais, 1% de gelatina (DIFCO, Corp.) dissolvida em solução salina tamponada com fosfato foi usado para substituir solução de colágeno para revestir placas de cultura ou lamínulas. Extração de proteínas de membranas hidrofóbicas de HUVEC por tampão contendo Triton X-114 (TX-114)
[0190] Quinhentas mil HUVEC foram semeadas em uma placa de cultura de 10 cm por 24 horas. As células foram então estimuladas com VEGF humano a 40 ng/mL por mais 72 horas. As células cultivadas foram lavadas duas vezes com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram então destacadas e tiradas da placa por incubação com 1 mL de PBS contendo EDTA 2 M, colocadas dentro de um tubo de centrífuga, e coletadas por centrifugação a 300 x g por 5 minutos. Elas eram aproximadamente 2 milhões de células no pélete produzido por centrifugação. Os péle- tes de células foram recolocados em suspensão em 200 μL de tampão Tris 0,05 M gelado, contendo EDTA 5 mM e 0,5% (v/v) de Triton X-114 (TX-114), pH 7,4. A suspensão celular solubilizada foi incubada sobre gelo com turbilhonamento suave ocasional. Depois disso, a suspensão celular foi centrifugada a 10.000 x g por 10 minutos a 4oC para remover detritos celulares insolúveis. O sobrenadante foi transferido para um tubo de centrífuga limpo e incubado a 37oC por 5 minutos. Durante a incubação, TX-114 ficou separado da fase aquosa. O tubo de centrifugação foi então centrifugado a 1000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente, de tal modo que o TX-114 fosse centrifugado para o fundo do tubo. A fase aquosa no topo do tubo foi removida e o pélete de TX-114 contendo proteínas celulares hidrofóbicas foi dissolvido em tampão de amostra em gel de acrila- mida 2x SDS em um volume final de 50 μL. Quinze μL da amostra foram usados para eletroforese em gel de acrilamida SDS. Eletroforese em gel de acrilamida SDS, preparação de Western blot e immunoblotting
[0191] Os procedimentos são iguais àqueles descritos anteriormente por Kao, K.J., Scornik, J.C. e McQueen, C.F., Human Immunol. 27:285-297 (1990), com ligeira modificação. A detecção da ligação do anticorpo em Western blots foi conduzida usando substrato quimioluminescente com fosfatase alcalina e um Analisador de Imagens Luminescentes LAS-4000 (Fujifilm Corp.) Microscopia Imunofluorescente Materiais: 1) . Anticorpos primários: a). IgG do camundongo normal (Sigma Corp., número do catálogo: I-5381) dissolvida em solução salina tamponada com fos-fato (PBS) a 1mg/mL como uma solução de insumo, diluída com PBS-0,5% de BSA até uma concentração de 5 μg/mL antes do uso; b.) Fator de von Willebrand anti-humano monoclonal do camundongo (vWF) (DakoCytomation Corp., número do catálogo: M0616) diluído 50x com PBS contendo 0,5% de BSA antes do uso; c.) Anticorpos monoclonais anti-PLVAP, KFCC-GY4 e KFCC-GY5, purificados diluídos até 5 μg/mL com PBS contendo 0,5% de BSA antes do uso; 2) . Anticorpo secundário: F(ab')2 de cabra anti-IgG do camundongo conjugado com FITC (H&L) (Serotec Corp., número do catálogo: Star105F); 3) . Meio de Montagem VectaShield com DAPI (Vector Labs, Corp., no catálogo: H-1200); 4) . Metanol a 100% (Merck Corp., número do catálo- go:1.06009); e 5) . Solução Equilibrada de Sais de Hank (HBSS) (Gibco, Corp., no do catálogo: 12065-056) diluída até 1x antes do uso. Procedimento:
[0192] Para preparar células endoteliais vasculares do cordão umbilical humano para estudo imunofluorescente, cinquenta mil células foram colocadas em cada poço de uma placa de cultura com 24 poços e lamínula redonda esterilizada de 1,5 cm colocada no fundo de cada poço. Cada poço continha 0,5 mL de meio de cultura M199 que foi suplementado com 20% de soro fetal vitelínico, 1% de L-glutamina, 1% de solução de antibiótico/antimicótico, 50 μg/mL de heparina e 75 μg/mL de suplemento para crescimento de células endoteliais (Sigma, Corp., E0760). Cada lamínula foi pré-revestida com 200 μL de colágeno do couro vitelínico a 0,4 mg/mL (Sigma Corp. C9791) em ácido acético a 0,04% (v/v) de um dia para o outro. As lamínulas foram então lavadas com 1x solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), e subsequentemente secadas ao ar para uso. As células foram cultivadas durante a noite inteira e depois estimuladas com 40 ng/mL de fator de crescimento de células endote- liais (VEGF) por mais 72 horas. As células sobre as lamínulas foram usadas para o procedimento imunofluorescente.
[0193] Para corar as células para microscopia imunofluorescen- te, as células desenvolvidas sobre a lamínula de cada poço foram lavadas com 0,5 mL 1x HBSS. As células foram então fixadas e permeabilizadas em 0,5 mL de metanol gelado por 5 minutos. As células fixadas foram lavadas 3 vezes com 0,5 mL de 1x PBS por 5 minutos por lavagem. As células fixadas foram então bloqueadas com 0,5 mL de 1x PBS contendo 0,5% de BSA por uma hora à temperatura ambiente. A lamínula que continha células fixadas foi removida e colocada sobre o topo de 0,2 mL de solução de anticorpo primário diluído, que continha 5 μg/mL de IgG normal, anticorpo monoclonal anti-PLVAP KFCC-GY4 ou KFCC-GY5PLVAP, ou uma diluição de 50x de anticorpo monoclonal vWF anti-humano, com as células fixadas voltadas para baixo e em contato com a solução de anticorpo. A solução de anticorpo foi colocada sobre um pedaço de parafilme em um pequeno recipiente de plástico coberto. A umidade interna foi mantida colocando um pequeno pedaço de papel de filtro umedecido com água.
[0194] Depois da incubação a 37°C por uma hora em um recipiente umidificado, a lamínula foi removida e as células sobre a la- mínula foram lavadas 3 vezes com 0,5 mL de PBS por 5 minutos cada vez. As células fixadas foram então incubadas com 0,2 mL de anticorpo secundário F(ab')2 de cabra anti-IgG do camundongo conjugado com FITC diluído 200x por 50 minutos a 37°C como descrito para a incubação com solução de anticorpo primário. Depois disso, as células foram lavadas 3 vezes com PBS como descrito acima. As células coradas foram montadas sobre uma lâmina de vidro usando solução contra esvaecimento. O excesso de meio de montagem foi removido da borda da lamínula e a borda foi selada com esmalte de unha. As células coradas foram examinadas usando um microscópio fluorescente. Resultados
[0195] A imunização de camundongos Balb/cByJ com proteína PLVAP recombinante humana levou ao desenvolvimento de anticorpos monoclonais (mAbs) produtores de hibridomas que reconheceram a proteína PLVAP humana. Dois hibridomas foram selecionados para estudo adicional. Os anticorpos produzidos por estes hibrido- mas foram denominados KFCC-GY4 e KFCC-GY5. As sequências dos domínios VH e VL dos anticorpos monoclonais KFCC-GY4 e KFCC-GY5, e as CDRs destes domínios, estão ilustradas nas figuras 15A e B, e 16A e B, respectivamente.
[0196] Ambos anticorpos monoclonais, KFCC-GY4 e KFCC- GY5, se ligaram à proteína PLVAP recombinante em ensaios ELISA (figura 17) e immunoblot (figuras 18C e D).
[0197] Estes anticorpos também reagiram especificamente com a proteína PLVAP em extratos de células endoteliais vasculares do cordão umbilical humano em um ensaio de immunoblot (figuras 19B e 19D). Além disso, experimentos de coloração por imunofluores- cência demonstraram ligação dos anticorpos monoclonais KFCC- GY4 e KFCC-GY5 às células endoteliais vasculares humanas que expressam PLVAP (figuras 20C e D).
[0198] As afinidades de ligação (Kd) dos anticorpos monoclonais pela proteína PLVAP recombinante foram determinadas como sendo 0,41 x 10-7 M para o mAb KFCC-GY5 e 0,6 x 10-7 M para o mAb KFCC-GY4 usando microbalança de cristal de quartzo ANTQ300
[0199] Os experimentos de imuno-histoquímica realizados em seções de hepatoma do fígado de dois pacientes diferentes com hepatoma, usando os anticorpos monoclonais anti-PLVAP KFCC-GY4 ou KFCC-GY5, demonstraram que o anticorpo monoclonal KFCC- GY5 produziu um sinal mais forte em células endoteliais vasculares (figuras 21A, C) do que o anticorpo monoclonal KFCC-GY4 (figuras 21B, D).
[0200] Os experimentos de imuno-histoquímica realizados em seções de tecidos hepáticos de hepatoma e não-tumorosos adjacentes do fígado do mesmo paciente foram realizados em amostras de quatro pacientes com hepatoma selecionados aleatoriamente, usando o anticorpo anti-PLVAP monoclonal KFCC-GY4. A expresão de PLVAP foi detectada em células endoteliais vasculares de tecidos de hepatoma (figuras 22A, C, E, e G), mas não em tecidos hepáticos não-tumorosos adjacentes (figuras 22B, D, F, e H). Exemplo 4: Proteína PLVAP é expressada sobre as superfícies de células endoteliais vasculares Materiais e métodos Microscopia Imunofluorescente Reagentes:
[0201] Os reagentes usados no procedimento que se segue são como descritos no Exemplo 3, com as seguintes modificações: • o tampão de lavagem 1x HBSS continha 0,1% de azi- da de sódio, que foi usada para impedir endocitose de anticorpos ligados à superfície celular.; • os anticorpos monoclonais anti-PLVAP, KFCC-GY4 e KFCC-GY5, foram diluídos no tampão de lavagem 1x HBSS com 0,1% de azida de sódio; Procedimento:
[0202] A coloração imunofluorescente de células endoteliais vasculares do cordão umbilical humano (HUVECs)foi realizada como descrito no Exemplo 3, exceto que as células não foram fixadas e permeabilizadas com metanol. Ao invés disso, depois da incubação com anticorpos monoclonais anti-PLVAP, as células foram lavadas e fixadas com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente por 10 minutos. Depois desta incubação, as células foram lavadas 3 vezes, e depois incubadas com F(ab')2 de cabra anti-IgG do camundongo conjugado com FITC. Depois de três lavagens adicionais, as células foram processadas para microscopia imunofluorescente, como descrito no Exemplo 3. Resultados
[0203] USANDO A ABORDAGEM DESCRITA ACIMA, APENAS A PROTEÍNA PLVAP EXPRESSADA SOBRE A SUPERFÍCIE CELULAR PÔDE SER DETECTADA. OS RESULTADOS DESTES EXPERIMENTOS REVELARAM QUE OS ANTICORPOS MONOCLO- NAIS ANTI-PLVAP KFCC-GY4 E KFCC-GY5 SE LIGARAM À SUPERFÍCIE DE CÉLULAS ENDOTELIAIS VASCULARES DE HCC (FIGURAS 23B, C), INDICANDO QUE A PROTEÍNA PLVAP É EXPRESSADA SOBRE AS SUPERFÍCIES DESTAS CÉLULAS. ESTAS DESCOBERTAS SUGEREM QUE OS ANTICORPOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE A PLVAP COM ALTA AFINIDADE SERÃO CAPAZES DE SE LIGAR À SUPERFÍCIE DE CÉLULAS EN- DOTELIAIS VASCULARES DE HCC DEPOIS DE INJEÇÃO DENTRO DOS VASOS SANGUÍNEOS DE UM TUMOR CARCINOMA HEPATOCELULAR.

Claims (14)

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à SEQ ID NO: 23 com Kd de 10-7 M ou menos, conforme medido usando uma microbalança de cristal de quartzo ANTQ300, para uso em um método in vivo de detecção de carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo, compreendendo a administração do anticorpo por injeção intra-arterial ou injeção intravenosa, em que o anticorpo compreende um radioisótopo, obter uma imagem do fígado de um indivíduo e detectar o acúmulo do anticorpo no fígado de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende a) um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 5, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 6, e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 7; e um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 10, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 11, e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 12; ou b) um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 15, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 16 e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 17 e um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 21, e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 22.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1(a), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1(a) ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1(b), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1(b) ou 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
7. Método de diagnóstico de carcinoma hepatocelular em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o nível de proteína PLVAP em uma amostra do indivíduo e determinar que o nível da proteína PLVAP na amostra está aumentado em relação a um controle, em que o nível da proteína PLVAP em uma amostra do indivíduo é detectado usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 5, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 6, e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 7; e um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 10, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 11, e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 12; ou um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 15, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 16 e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 17 e um domínio variável de anticorpo que compreende uma CDR1 que consiste na SEQ ID NO: 20, uma CDR2 que consiste na SEQ ID NO: 21, e uma CDR3 que consiste na SEQ ID NO: 22.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7(a), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7(a) ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7(b), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que tem a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 14.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7(b) ou 10, ca-racterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é marcado com um isótopo radioativo.
14. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição farmacêutica para detectar carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo.
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