TW201446244A - Ｌｐａｒ３途逕之抑制劑或激活劑用於調節血小板生成之醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關LPAR3途逕之抑制劑或激活劑用於製a備治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的藥劑之用途。

Description

LPAR 3 途逕之抑制劑或激活劑用於調節血小板生成之醫藥用途/
本發明係有關LPAR3途逕之抑制劑或激活劑用於製備治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的藥劑之用途。本發明亦有關調節血小板生成之方法及組合物。具體而言，本發明係有關調節血小板生成及/或血小板異常增生(megakaryopoiesis)之方法及組合物，其係以化合物調控溶血磷脂酸第三型受體(lysophosphatidic acid receptor subtype 3，LPAR3)途徑之活性。
溶血磷脂酸(LPA)為小型甘油磷脂，其藉由自體毒素(autotoxin)催化作用自細胞膜磷脂衍生。LPA已知為許多生理過程的重要調節因子，係經由結合至各種跨膜LPA受體(LPARs)而作用。目前，已發現六種LPARs。藉由結合至不同受體，LPA發揮各種生理及病理功能。在小鼠及人類多能幹細胞中(如造血幹細胞)發現LPA受體表現，其可分化成所有的血液族系。先前報告，LPA可誘發胚胎幹細胞(embryonic stem cells，ESCs)增生及分化，其影響c-Myc表現及Ca2+訊息傳遞。
美國專利申請號13/419,405(公開號20120270780，於2012年10月25日公開)之發明人亦報告，在無血清培養基內加入紅血球生成素， LPA可誘發臍帶血衍生性人類CD34+造血幹細胞(hHSCs)之紅血球分化，且LPA藉由結合至LPAR3而改進紅血球生成並活化下游β-連環蛋白/TCF途徑以增進CD71及GlyA表現，其為紅血球之二表面標記物。然而，LPA對於另一族系的作用，例如血小板異常增生，仍不清楚。
本發明意外發現，可經由抑制或增進LPAR3途徑之活性而調節造血幹細胞的血小板生成/血小板異常增生過程。因此，其可提供新穎療法，用於治療與血小板(即凝血細胞)之異常量相關之疾病或病況(例如，血小板減少症或血小板增多症)，及其相關之疾病或病況。
據此，在一方面，本發明提供調節個體血小板生成之方法，包含投予治療有效量之調控LPA第三型受體(LPAR3)途徑活性之化合物至個體。另一方面，本發明提供調節血小板生成之醫藥組合物，包含治療有效量之調控LPAR3途徑活性之化合物以，並伴隨醫藥上可接受之載體。此外，本發明提供調控LPAR3途徑活性之化合物用於製備調節血小板生成之藥劑之用途。
另一方面，本發明提供調節個體血小板異常增生之方法，包含投予治療有效量之調控LPAR3途徑活性之化合物至個體。另一方面，本發明提供調節血小板異常增生之醫藥組合物，包含治療有效量之調控LPAR3途徑活性之化合物以，並伴隨醫藥上可接受之載體。同時，本發明提供調控LPAR3途徑活性之化合物在製備調節血小板異常增生的藥劑之用途，。
又一方面，本發明提供個體治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的方法，包含投予治療有效量之調控LPAR3途徑活性之化合 物至個體。另一方面，本發明亦提供治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的醫藥組合物，包含治療有效量之調控LPAR3途徑活性之化合物以，並伴隨醫藥上可接受之載體。此外，本發明提供調控LPAR3途徑活性之化合物在製備治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的藥劑之用途。
再一方面，本發明提供治療或預防個體與血小板之異常低量 相關之疾病或病況的方法，包含投予治療有效量之可抑制LPAR3途徑活性之化合物至個體。另一方面，本發明亦提供治療或預防與血小板之異常低量相關之疾病或病況的醫藥組合物，包含治療有效量之抑制LPAR3途徑活性之化合物以，並伴隨醫藥上可接受之載體。此外，本發明提供抑制LPAR3途徑活性之化合物於製備治療或預防與血小板之異常低量相關之疾病或病況的藥劑之用途。
又再一方面，本發明提供治療或預防個體與血小板之異常高 量相關之疾病或病況的方法，包含投予治療有效量之增進LPAR3途徑活性之化合物至個體。另一方面，本發明亦提供治療或預防與血小板之異常高量相關之疾病或病況的醫藥組合物，包含治療有效量之增進LPAR3途徑活性之化合物以，並伴隨醫藥上可接受之載體。此外，本發明提供增進LPAR3途徑活性之化合物於製備治療或預防與血小板之異常高量相關之疾病或病況的藥劑之用途。
此外，本發明提供自造血幹細胞誘發增生及/或分化成巨核 細胞/血小板之方法，包含以有效量之抑制LPAR3途徑活性之化合物接觸造血幹細胞。
本發明亦提供個體自造血幹細胞誘發增生及/或分化成血小板之方法，包含投予治療有效量之抑制LPAR3途徑活性之化合物至個體以。另一方面，本發明提供自造血幹細胞誘發增生及/或分化成血小板之醫藥組合物，包含有效量之抑制LPAR3途徑活性之化合物，並伴隨醫藥上可接受之載體。
此外，本發明提供減少自造血幹細胞增生及/或分化成巨核細胞/血小板之方法，包含以有效量之增進LPAR3途徑活性之化合物接觸造血幹細胞。另外，本發明亦提供在個體中減少自造血幹細胞增生及/或分化成血小板之方法，包含投予治療有效量之增進LPAR3途徑活性之化合物至個體。另一方面，本發明提供抑制自造血幹細胞(hHSCs)增生及/或分化成巨核細胞之醫藥組合物，包含有效量之增進LPAR3活性之化合物，並伴隨醫藥上可接受之載體。
在本發明之部分實例中，調控LPAR3途徑活性之化合物係選自於由LPAR3促效劑及拮抗劑及其他具足夠LPA結構類似性而可誘發或抑制LPAR3活性之藥劑所組成之群組。
具體而言，調控LPAR3途徑活性之化合物係選自於由溶血磷脂醯膽鹼(lysophosphatidyl choline，LPC)、神經胺醇磷酸膽鹼、1-油醯基-2-O-甲基-外消旋-硫磺酸甘油磷酸酯(OMPT)、(3S)-1-氟-3-羥基-4-丁基-1-膦酸酯(XY-17)、T13、T10、VPC12086、VPC31143、LPA之單氟化類似物、3-[({4-[4-({[1-(2-氯-4-甲基苯基)乙氧基]羰基}胺基)-3-甲基-1,2-口咢唑-5-基]苯基}甲基)磺醯基]丙酸(Ki16425)、二酸甘油焦磷酸酯(DGPP)、VPC12249、二辛基-PA、1-O-醯基-α-氟亞甲基膦酸酯、及α-羥 基亞甲基膦酸酯LPA、其類似物及其醫藥上可接受之鹽類組成之群組。
前述發明內容，以及後面的本發明詳盡說明，將因配合附圖而有更好的理解。為了說明本發明，圖式具體實施例之顯示為較佳之呈現。然而，應理解到，本發明未侷限於該具體實施例。
在圖式中：圖1A係提供經qPCR的LPAR3 MO變體注射之斑馬魚胚胎的CD41基因表現定量；圖1B係顯示經Ki16425處理增進CD41表現；圖1C係顯示經OMPT處理減少CD41表現；且圖1D係顯示LPAR1減量變體注射之斑馬魚胚胎CD41表現不受影響。
圖2A至圖2C係顯示人類幹細胞TPO/SCF誘發期間LPA受體概況；其中在細胞介素誘發下LPAR1 mRNA表現無明顯變化(圖2A)，及另一方面，MK分化期間LPAR2增加(圖2B)，而LPAR3 mRNA表現下降(圖2C)。
圖3係顯示MDP對於MK分化之影響，其提供流式細胞儀結果的量化數據，顯示MDP、LPAR2促效劑對於血小板異常增生不具顯著影響。
圖4係顯示OMPT對於MK分化之影響，其提供流式細胞儀結果的定量數據，顯示OMPT、LPAR3促效劑抑制MK。
圖5係顯示在LPAR3變體注射之斑馬魚胚胎，CD41-GFP胚胎之GFP陽性細胞數目增加。
除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本發明領域之技術人員所能普遍理解的意義。
在本發明中，以反義zLPAR3-啉寡核苷酸(MO)進行斑 馬魚LPAR3減量，以作為模型並觀察注射之斑馬魚胚胎的造血作用。發明人首次發現，經LPAR3促效劑如OMPT及LPAR3拮抗劑如Ki16425處理，會影響斑馬魚胚胎的血小板分化過程，其中以OMPT處理會減少血小板生成/血小板異常增生，但是Ki16425會增加血小板生成/血小板異常增生。因此證實，LPAR3為造血幹細胞血小板生成/巨核細胞形成過程的重要調節因子。總之，LPAR3拮抗劑誘發血小板生成/血小板異常增生，但是LPAR3促效劑抑制血小板生成/血小板異常增生。此外，本發明提出，LPAR3介導之訊息路徑會影響血小板生成/血小板異常增生過程，顯示調控存在於LPAR3介導之訊息路徑之成員在具有該訊息路徑的個體中的活性及/或量將導致該個體血小板生成/血小板異常增生的改變。LPAR3介導之訊息路徑成員包含涉及LPAR3配體生物合成及生物分解之生物分子及因而合成之配體，例如LPA及用於LPA合成或分解之酵素及中間物或位於LPAR3之訊息傳導級聯反應，諸如LPAR3本身及其下游效應物。成員之實例包括Hama K.and Aoki J.,LPAR3,a unique G protein-coupled receptor for lysophosphatidic acid.Progress in Lipid Research 49：335-342(2010)；及Aoki J.,Inoue A.and Okudaira S.,Two pathways for lysophosphatidic acid production.Biochim.Biophys.Acta,1781：513-518(2008)所述。本領域之一般技術人員應理解到，訊息路徑成員之任一者，無論是本領域所習知或待確定者，皆在本發明之範疇內，只要其有助於增進、刺激或抑制血小板生成/血小板異常增生過程。因此，可藉由使LPAR3訊息路徑成員與調控該涉及LPAR3途徑(如LPAR3途徑之抑制劑或激活劑)成員活性之化合物接觸，以達到調節個體血小板生成/血小板異常 增生之目的。
據此，本發明提供調節個體血小板生成/血小板異常增生的 新穎方法。本方法包含投予治療有效量之調控LPAR3途徑活性之化合物至個體，以。另一方面，本發明提供調節個體血小板生成/血小板異常增生之方法，包含以LPAR3途徑成員之抑制劑或激活劑接觸該成員。
另一方面，其亦提供調節血小板生成/血小板異常增生之醫 藥組合物，包含治療有效量之化合物以調控LPAR3途徑之活性，並伴隨醫藥上可接受之載體；以及調控LPAR3途徑活性之化合物於製造調節血小板生成/血小板異常增生之藥劑的用途。換言之，提供LPAR3途徑之抑制劑或激活劑於製造治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的藥劑的用途。
本文所使用的「血小板」乙詞是指缺乏主要胞器之細胞，其 於血液凝結、凝血酶凝集時扮演重要角色；具體而言，哺乳類動物血小板為無核細胞，即稱之。
本文所使用的「血小板生成」乙詞是指造血幹細胞(HSCs) 及/或造血祖源細胞之增生及分化過程，導致產生血小板。依據本發明，本文所使用的「調節血小板生成」是指增進、刺激或抑制血小板生成過程的作用。更特定而言，「調節血小板生成」的作用是指以組合物或方法改變欲增生或分化成血小板之造血祖源細胞的量，因此血液中功能性血小板的量會回復到健康個體正常止血所需的正常量。
本文所使用的「巨核細胞」乙詞是指負責生產血小板的骨髓 細胞。因此，巨核細胞的量與血小板的產生有關。本文所使用的「巨核細胞形成」乙詞是指骨髓祖源細胞發育為成熟巨核細胞的過程，其順次產生 正常止血所需的血小板。依據本發明，本文所使用的「調節巨核細胞形成」是指增進、刺激或抑制巨核細胞形成過程的作用。更特定而言，「調節巨核細胞形成」的作用是指以組合物或方法改變欲增生或分化成巨核細胞之骨髓祖源細胞的量，因此功能性巨核細胞的量會回復到健康個體正常止血所需的正常量。
本文所使用的「溶血磷脂酸」、或其縮寫「LPA」等詞是指 IUPAC命名的(2-羥基-3-膦醯氧基丙基)(Z)-十八-9-烯酸酯的化合物，其習知能結合並活化G蛋白偶聯受體，包括LPAR1、LPAR2及LPAR3(亦稱作EDG2、EDG4、及EDG7)、及LPAR4(p2y9/GPR23)及LPAR5(GPR92)。
本文所使用的「LPA第三型受體」、或其縮寫「LPAR3」等 詞是指細胞受體，其經發現與LPA及其他溶血磷脂交互作用以顯現LPA之生理或病理生理功效(Bandoh et al.,Molecular cloning and characterization of a novel human G-protein-coupled receptor,EDG7,for lysophosphatidic acid.J.Biol.Chem.274(39)：27776-85,September,1999)。人類LPAR3之核苷酸序列登錄於GenBank數據庫，其登錄號NM-012152。
本文所使用的「調控LPAR3途徑活性之化合物」乙詞是指能 改變LPAR3訊息路徑成員活性之化合物，以最終導致血小板生成/巨核細胞形成過程的增進、刺激或抑制。舉例而言，調控LPAR3途徑活性之化合物可為LPAR3途徑之抑制劑或激活劑。在一較佳之具體實施例中，化合物為能介導LPAR3受體活性者。
本文中可互換使用的語詞「能介導LPAR3活性之化合物」及 「LPAR3介導化合物」是指結合至LPAR3之化合物，其誘發體內及體外受體 活性呈可檢測的增加或減少(例如，受體活性增加或減少至少10%)。化合物包括但不限於，LPAR3促效劑及拮抗劑、及其他試劑，其為本領域習知或待開發，係具足夠LPA結構類似性以誘發或抑制LPAR3媒介之生物途徑。適用於本發明目的之一些LPAR3促效劑/拮抗劑係揭示於如US7,169,818；US6,949,529；US6,380,177；US6,004,579；US5,565,439；US7,217,704；US2003/0027800、US2006/0009507及US2008/0051372，其各自在此併入本案以作為參考資料。應理解到，變體類似物、模擬物、促效劑、拮抗劑或其衍生物的活性可比LPA更差或更佳。其中，LPAR3促效劑及LPAR3拮抗劑可便利地用於本發明。LPAR3促效劑之實例包括但不限於，溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、神經胺醇磷酸膽鹼、1-油醯基-2-O-甲基-外消旋-硫磺酸甘油磷酸酯(OMPT)、(3S)-1-氟-3-羥基-4-丁基-1-膦酸酯(XY-17)、T13及T10(請見如Tamaruya Y. et al.,Angew.Chem.(Int.Ed.Engl.)43：2834(2004))、VPC12086及VPC31143(請見如Heise C.E.et al.,Mol.Pharmacol.60：1173,(2001))、LPA之單氟化類似物(Xu Y.et al.,J.Med.Chem.48：3319-3327(2005))。LPAR3拮抗劑之實例包括但不限於，3-[({4-[4-({[1-(2-氯-4-甲基苯基)乙氧基]羰基}胺基)-3-甲基-1,2-口咢唑-5-基]苯基}甲基)磺醯基]丙酸(Ki16425)、二酸甘油焦磷酸酯(diacylglycerol pyrophosphate，DGPP)、VPC12249(請見Heise C.E.et al.，如前述)、二辛基-PA及其醫藥上可接受之鹽類。這些及其他LPAR3促效劑/拮抗劑，及其化學結構，一般皆描述於如Kano K.,et al.,LPA and its analogs-attractive tools for elucidation of LPA biology and drug development.Curr.Med.Chem.15：2122-2131(2008)；Noguchi K.,et al.,Lysophosphate acid(LPA)and its receptors.Curr.Opin. Pharmacol.9：15-23(2009)；以及Hama K.and Aoki J.,Progress in Lipid Research 49：335-342(2010)。
在一些具體實施例中，所使用的LPAR3媒介化合物具有LPAR3選擇性，亦即LPAR3之結合親和力及專一性高於其他LPA受體亞型。在一較佳之具體實施例中，LPAR3選擇性化合物包括LPA衍生物，其具有膦酸鹽或硫代磷酸鹽基團以取代磷酸鹽基團，例如OMPT、1-O-醯基-α-氟亞甲基膦酸酯、α-羥基亞甲基膦酸酯LPA類似物、及XY-17、T13及T10。醫藥上可接受鹽類之實例包括但不限於，無機鹼之鹽類如鈉、鉀、鎂及鈣及銨鹽、及有機鹼之鹽類如離胺酸、N,N-二芐基乙二胺及白芷酸。這些化合物之多者可購自如Avanti Polar Lipids Inc(Alabaster,AL)。
自體毒素(Autotoxin，ATX)負責將溶血磷脂轉變成LPA，其功能係作為溶血磷脂酶D。在使用能調控ATX酵素活性之化合物的情況中，較佳為具有ATX抑制活性之化合物，如ccPA、L-組胺酸、VPC8a202、達士多(Darmstoff)類似物及硫代磷酸O-十八-9-烯基酯，或具有ATX增進活性之化合物。這些化合物及其化學結構一般描述於Kano K.,et al.，如前述。
或者，本發明可使用調控β-連環蛋白核易位之化合物。一實例為抑制β-連環蛋白易位之化合物，如槲皮素、沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)、薑黃素或白藜蘆醇，或者引發易位之化合物。
本文所使用的「個體」乙詞是指血液中具有正常止血所需之血小板的任何生物體。「個體」乙詞包含人類或非人類哺乳類或動物。非人類哺乳類包括家畜動物、伴侶動物、實驗室動物、及非人類靈長類動物。非人類個體亦包括，馬、牛、豬、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、天竺鼠、 沙鼠、倉鼠、貂、兔及魚。應理解到，較佳之個體為人類。
在一些具體實施例中，「個體」乙詞是指本文所定義之生物 樣本，其包括但不限於，自具有正常止血所需之血小板的生物體分離的細胞、組織、或器官。據此，本文所揭示之方法、用途及組合物係旨在應用於體內及體外。
在一具體實施例中，本發明提供個體治療或預防與血小板之 異常量相關之疾病或病況的方法，包含投予化合物至個體以調控LPAR3途徑之活性。在另一具體實施例中，本發明提供調控LPAR3途徑之活性之化合物於製造治療或預防個體與血小板之異常量相關之疾病或病況的藥劑之用途。在又另一具體實施例中，本發明提供個體治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的醫藥組合物，包含調控LPAR3途徑之活性的化合物。 化合物如前面所定義。
具體而言，本發明提供個體治療或預防與血小板之異常低量 相關之疾病或病況的方法，包含投予治療有效量之化合物至個體以抑制LPAR3途徑之活性。另一方面，本發明提供個體治療或預防與血小板之異常高量相關之疾病或病況的方法，包含投予治療有效量之化合物至個體以增進LPAR3途徑之活性。
依據本發明，「投予至個體」乙詞包括藉由任何適用之途徑 將醫藥配方之調控LPAR3途徑活性之化合物分配、運送或塗敷至個體，以使化合物運送至個體之所欲部位，並使化合物接觸LPAR3途徑之標的成員。「預防」乙詞係關於減少發展為盛行疾病之風險，而「治療」乙詞係關於改善盛行疾病病況之症狀、縮短疾病過程。
本發明所使用的「個體與血小板之異常量相關之疾病或病 況」乙詞包括相對於正常量，與血液中血小板數目或功能減少或增加相關者，如血小板減少症。
與血小板之異常量相關之疾病或病況稱作血小板數目不正 常病(thrombocytopathy)，其可為血小板之異常低量如血小板減少症、血小板功能之疾病如血小板功能不足(thrombasthenia)、或血小板之異常高量如血小板增多症。與血小板之異常低量相關之疾病或病況可為血小板減少症，係指血液中血小板相對減少，且定義為每毫升之血小板數目低於50,000。與血小板之異常低量相關之疾病或病況的實例亦包括但不限於，肝素誘發性血小板減少症(heparin-induced thrombocytopenia，HIT)或血栓形成性血小板減少性紫瘢病(thrombotic thrombocytopenic purpura；TTP)，其典型上導致血栓形成(thromboses)、或血塊，而非出血。
如下列實施例所示，LPAR3為造血幹細胞之血小板生成/巨 核細胞過程的重要調節因子。因此，本發明提供自造血幹細胞誘發增生及/或分化成巨核細胞/血小板之方法，包含以有效量之化合物接觸造血幹細胞，以抑制LPAR3途徑之活性。
另一方面，減少自造血幹細胞增生及/或分化成巨核細胞/血 小板之方法，包含以有效量之化合物接觸造血幹細胞，以增進LPAR3途徑之活性。
在一具體實施例中，本發明提供個體減少自造血幹細胞增生 及/或分化成血小板之方法，包含投予治療有效量之化合物至個體，以增進LPAR3途徑之活性。其亦提供減少/誘發自造血幹細胞(hHSCs)增生及/或 分化成血小板/巨核細胞之醫藥組合物，包含有效量之化合物以增進/抑制LPAR3途徑之活性，並伴隨醫藥上可接受之載體。
在本發明中，調控LPAR3途徑之活性的化合物可與增進/減少血小板/巨核細胞數目或功能的藥劑一起配製。
依據本發明，使用有效量之調控LPAR3途徑之活性的化合物連同生理上可接受之載體、稀釋劑、佐劑及/或賦形劑，以產生醫藥組合物。化合物可藉由常規的醫藥技術便利地配製成單位劑量形式。此類技術包括將化合物與生理上可接受之載體、稀釋劑、佐劑及/或賦形劑結合的步驟。一般而言，藉由均勻地且緊密地將將化合物與液體載體或細碎之固體載體或兩者結合以製備配方，隨後視需要將產品成型。在使用調控LPAR3途徑活性之化合物(如LPAR3媒介化合物)的情況中，其劑量可依據投予途徑、欲治療個體之年齡與體重、欲治療疾病之性質與嚴重程度及類似因素而變。當投予至個體(如細胞或人類個體)時，該劑量足以產生所選之功效。舉例而言，欲投予之LPAR3媒介化合物的量，為導致生理上有意義之增加或減少LPAR3受體活性的量。正常而言，每日劑量範圍為介於每公斤體重0.1至500mg之間，較佳為每公斤體重0.1至100mg之間，更佳為每公斤體重0.1至10mg之間，且最佳為每公斤體重0.1至1.0mg之間，其可配製成單一劑量以每日給藥一次，或細分成二或多個每日劑量。
適用之投予形式包括但不限於，局部、口服、直腸、腹腔或非口服(如靜脈、皮下或肌內)製備物。較佳為口服及非口服製備物。亦可使用常規的蓋崙製劑形式，如錠劑、膜衣錠、膠囊、可分散粉末、顆粒劑、水溶液、含醇水溶液、水性或油性懸浮液、糖漿、果汁或滴液。
固體藥劑形式可包含惰性成分及載體物質，如碳酸鈣、磷酸 鈣、磷酸鈉、乳糖、澱粉、甘露醇、藻酸鹽、明膠、瓜爾膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、甲基纖維素、滑石、高度分散之矽酸、矽油、高分子量脂肪酸(如硬脂酸)、明膠、瓊脂、或植物或動物脂肪與油、或固體高分子量聚合物(如聚乙二醇)；適合口服投予的製備物可視需要包含額外的調味劑及/或增甜劑。
液體藥劑形式可除菌及/或，於適當情況下，包含輔助物質， 如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、滲透劑、乳化劑、分散劑、增溶劑、鹽類、用於調節滲透壓或用於緩衝之糖類或糖醇類、及/或黏度調節劑。
此類添加劑之實例為酒石酸鹽及檸檬酸鹽緩衝液、乙醇及螯 合劑(如乙二胺四乙酸及其無毒鹽類)。高分子量聚合物，如液態聚乙烯氧化物、微晶纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、葡聚醣或明膠，適用於調節黏度。固體載體物質之實例為澱粉、乳糖、甘露糖醇、甲基纖維素、滑石、高度分散之矽酸、高分子量脂肪酸(如硬脂酸)、明膠、瓊脂、磷酸鈣、硬脂酸鎂、動物及植物脂肪、及固體高分子量聚合物，如聚乙二醇。
用於非口服投予之製備物可呈單獨的劑量單位形式，如安瓿 或小瓶。其用途較佳為製成活性化合物溶液形式，較佳為水溶液，且具體而言，等張溶液及懸浮液。這些注射形式可製成現成可用製劑或僅於使用前直接製備，藉由與活性化合物(如凍乾物)混合，其中適當地包含其他固體載體物質，並具有所欲之溶劑或懸浮劑。
如前面所示，調控LPAR3途徑活性之化合物，如LPAR3媒介 化合物，可結合其他活性藥劑投予以作為合併治療，適用於血小板減少症及相關之疾病及病況的治療。這些活性藥劑的適用劑量為本領域之技術人員習知。
在合併治療方面，活性成分可配製成含有數個活性成分的單一劑量形式組合物及/或含有個別活性成分的單獨劑量形式套組。用於合併治療之活性成分可共同投予或個別投予。
下列實施例之提供，目的僅在於說明而非旨在侷限本發明之範疇。
實施例：材料及方法：
1. 斑馬魚養護及胚胎收集
野生型斑馬魚(Danio rerio)取自Zebrafish Information Research Center(Eugene,OR,USA)，並於27~28℃進行近親交配。從自然產的卵中收集胚胎、清洗、及培養在28℃的0.3x Danieau緩衝液待用。以魚形態學確定各階段之胚胎。在受精後12小時(hpf)，以溶於0.3x Danieau緩衝液之0.2mM 1-苯基-2-硫脲(PTU)(Sigma,St.Louis,MO,USA)處理胚胎，以抑制黑化作用。以0.01g/ml蛋白酶(Sigma)進行胚胎的去胚胎絨毛膜(dechorionation)。
2. 啉反義寡核苷酸
根據發明人提申之美國專利申請號13/419,405揭示之方法，以水平拉拔器(P-97，Sutter Instrument,Navato,CA,USA)拉動玻璃毛細管。
3. 以Ki16425處理
以二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)將Ki16425(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI,USA)粉末稀釋成濃度40mM以作為儲液。以Ki16425處理HSCs，最終濃度變為20μM。
4. mRNA表現
以Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分離總RNA萃取物。利用CD41、LPAR1、LPAR2及LPAR3引子，以反轉錄聚合酶鏈反應(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)自1μg之總RNA合成互補DNA(c DNA)。
於iCycler iQ即時檢測系統(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)進行即時PCR反應，其中使用混合試劑SYBR-Green I(Thermo Scientific,San Diego,CA,USA)。由熔化曲線的單一尖峰確認引子專一性。由即時閾值週期評估各標的之mRNA量，並與內部對照組GADPH的量進行比較。
5. 流式細胞測量
將HSC培養物收集、清洗、及以抗CD41a-PE及抗CD61-FITC抗體染色30分鐘(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA,USA)。將染色之細胞清洗並重新懸浮於PBS。製備無染色及單一染色之樣本以進行螢光補償。針對所有實驗，以FACSCalibur儀器(BD Biosciences)及FCS Express軟體(De Novo,Los Angeles,CA,USA)進行細胞分析。
6. CD41：GFP轉基因斑馬魚之血小板定量
以zlpa3 啉或對照組啉注射Tg(CD41：GFP)斑馬魚胚胎。以DMIL落射螢光顯微鏡(Leica,Wetzlar,Germany)檢查96 hpf胚胎之血小板。以EOS Utility程式取得影像(未顯示影像)並定量及分析螢光血小 板量。
7. 統計分析
以Excel電腦軟體進行實驗評估。以非參數變異數分析(a nonparametric analysis of variance，ANOVA)評估各組別間之差異。p值<0.05視為具顯著性(*表示p<0.05；***表示p<0.001)。
實施例1：LPAR 3 MO變體之CD41基因表現
欲探討LPAR3於斑馬魚血小板生成之角色，觀察以qPCR定量之LPAR3 MO變體之CD41基因表現，其結果顯示於圖1A。此外，經Ki16425處理之後CD41表現增加(如圖1B所示)，而以OMPT處理則減少(如圖1C所示)。另一方面，圖1D顯示LPAR1減量變體之CD41表現不受影響。
實施例2：LPA受體分析
在此實施例中，探討TPO/SCF誘發期間的LPA受體概況。如圖2A所示，在細胞介素誘發下，LPAR1的mRNA表現不具顯著變化，且如圖2B及圖2C所示，在MK分化期間LPAR2增加(圖2B)，而LPAR3 mRNA表現則下降(圖2C)。
實施例3：MDP對於MK分化之影響
探討MDP對於MK分化之影響。如圖3所示，MDP、LPAR2促效劑對於血小板異常增生不具顯著影響。
實施例4：OMPT對於MK分化之影響
探討OMPT對於MK分化之影響。如圖4所示，OMPT、LPAR3促效劑抑制MK。
實施例5：zlpa 3 變體之CD41-GFP胚胎之GFP表現增加
轉基因胚胎之CD41-GFP表現呈現於尾部(未顯示影像)。相較於對照組，在4 dpf時，斑馬魚以zlpa3 tMO1注射之後CD41-GFP細胞數目增加(請見圖5)。
雖然本發明參考前述之較佳具體實施例而說明，應理解到，較佳具體實施例之提供，目的僅在於說明而非旨在侷限本發明之範疇，而本相關領域之技術人員可在不違背本發明之精神及範疇之情況下進行各種修改及變更。

Claims (7)

  1. 一種LPAR3途徑之抑制劑或激活劑於製備治療或預防與血小板之異常量相關之疾病或病況的藥劑之用途。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中LPAR3途徑之抑制劑係用於製造治療或預防與血小板之異常低量相關之疾病或病況的藥劑。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中LPAR3途徑之激活劑係用於製造治療或預防與血小板之異常高量相關之疾病或病況的藥劑。
  4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該抑制劑為LPAR3拮抗劑。
  5. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該激活劑為LPAR3促效劑。
  6. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該LPAR3拮抗劑係選自於由3-[({4-[4-({[1-(2-氯-4-甲基苯基)乙氧基]羰基}胺基)-3-甲基-1,2-噁唑-5-基]苯基}甲基)磺醯基]丙酸(Ki16425)、二酸甘油焦磷酸酯(DGPP)、VPC12249及二辛基-PA及其醫藥上可接受之鹽類組成之群組。
  7. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該LPAR3促效劑係選自於由溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、神經胺醇磷酸膽鹼、1-油醯基-2-O-甲基-外消旋-硫磺酸甘油磷酸酯(OMPT)、(3S)-1-氟-3-羥基-4-丁基-1-膦酸酯(XY-17)、T13及T10及其醫藥上可接受之鹽類組成之群組。
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