TW201439116A - 抗－顆粒溶解素抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種能夠與顆粒溶解素(granulysin)之位於R64至R113的抗原決定區結合，且能夠中和顆粒溶解素活性之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段。所述之抗體可含有選自SEQ ID NO:82至SEQ ID NO:195之序列，或者該抗體可含有選自SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:76之序列。所述之抗體可為一種單株抗體。本發明亦關於一種治療或預防不希望之免疫反應病症的方法，包括將有一效量之能夠中和顆粒溶解素活性的抗-顆粒溶解素抗體投藥予有需要之患者。所述不希望之免疫反應病症可為SJS、TEN或GVHD。

Description

抗-顆粒溶解素抗體及其應用
本發明係關於抗-顆粒溶解素(granulysin)抗體。尤其，本發明係關於此類抗-顆粒溶解素抗體之應用。
哺乳動物免疫系統於調控活體內微生物感染方面執行關鍵作用。而T細胞在此類免疫反應上扮演著重要角色。有一類T細胞(細胞溶解性T細胞，CTL)其功能係將外來及受病毒感染之細胞溶解。CTL-介導之細胞溶解的主要作用機制涉及方向性釋出細胞質之顆粒內容物，而藉此使CTL及NK細胞開始將標靶細胞溶解。
細胞質之顆粒內容物包括：一種孔-形成蛋白(穿孔蛋白，perforin)、一類絲胺酸蛋白酶家族(顆粒酶)及一種晚期T細胞活化標記蛋白(顆粒溶解素)。顆粒溶解素對微生物及腫瘤具有細胞分解活性。當顆粒溶解素附著於受感染之細胞上時，會在標靶細胞膜內產生孔洞，而導致該細胞毀壞。此外，顆粒溶解素可誘發標靶細胞凋亡，且亦具有抗微生物作用。(Janeway,Charles(2005)，免疫生物學：死亡與疾病之免疫系統(第6版)。紐約：Garland科學)
顆粒溶解素係從三種獨特之轉錄產物衍生，而表現呈具有兩種分子量(9kDa及15kDa)之蛋白質(參見圖1)。顆粒溶解素為一種類-皂素脂質結合蛋白。其結晶構造(Anderson等人(2003)J Mol Biol.325(2)：355-65)顯示一種具有分布於環繞該分子之環內的正電荷，及一個不具淨正電荷之平面的五-螺旋束(參見圖2)。此外，顆粒溶解素係藉由兩個具高度保守性之分子內雙硫鍵使結構安定。
雖然免疫反應在防禦感染方面相當重要，但不希望的免疫反應卻可能導致病症。與不希望之免疫反應相關的 病症例子包括不良藥物反應(ADRs)、移植物對抗宿主疾病(GVHD)、發炎性疾病、自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病及T-細胞衍生之癌症。
美國專利U.S.7,718,378(Chen人)揭示，顆粒溶解素涉及與不希望之免疫反應關聯之疾病，或細胞毒性T-細胞介導之病症，例如SJS(史提芬-強森徵候群)、TEN(毒性表皮壞死)及GVHD的致病原因。
SJS/TEN之致病原因尚未完全明瞭。然而，有害藥物反應是此等病況的主要成因。於2007年，FDA提出要求醫師在施予卡巴氮平治療之前，先對患者篩檢人類白細胞抗原(HLA)等位基因HLA-B*1502，因為危險或甚至致死的皮膚反應(SJS及TEN)可能係由於此等患者接受的治療所致。此等嚴重威脅生命的有害藥物反應表現形式，據相信係由免疫作用所介導，因為以相同藥物進行再刺激會代表性地縮短反應期，而導致更嚴重的表現形式(Roujeau等人，Toxicology,2005 Apr.15；209(2)：123-9)。
此外，於SJS/TEN進行之臨床、組織病理學、免疫細胞學及功能研究結果支持，SJS/TEN為一種由細胞毒性淋巴細胞引發之特別藥物敏感性反應的概念。先前之活體外研究暗示，該藥物展示為第I類MHC限制型，其中包含CD8+ CTLs純株擴充，且此等細胞會誘發效應細胞之細胞毒性反應。藥物或其代謝物對於T-細胞活化之MHC限制型展示作用，係進一步由最近發現在等位基因與對特定藥物之反應間有強烈的遺傳關聯性所支持。(Chung等人Nature,2004 Apr.1；428(6982)：486)。
細胞毒性T細胞據觀察會滲入SJS/TEN患者之皮膚病灶中(Nassif等人，Allergy Clin.Immunol.2004 November；114(5)：1209-15)。水泡液及表皮層中的淋巴細胞顯示係以CD8+表現型占優勢(Nassif等人，J.Invest.Dermatol.2002 April；118(4)：728-33)。此等觀察指出在SJS/TEN之致病過程中，有 抗原-引發且具細胞毒性T細胞之添補至皮膚。
顆粒溶解素經發現為負責SJS/TEN之獨特臨床表現形式的關鍵分子。採自SJS/TEN患者皮膚病灶之水泡液，顯示具有對抗B-細胞及角質細胞之細胞溶解活性，且含有顆粒溶解素作為最主要的細胞毒性蛋白。而且，將顆粒溶解素注射入小鼠表皮，會誘發整片皮膚細胞死亡，彷彿在人類之SJS/TEN病理變化。因此，顆粒溶解素為負責散布角質細胞凋亡的關鍵分子，且係構成SJS/TEN之致病機制脫節現象的主要成因。
圖3顯示一用以說明顆粒溶解素涉及有害藥物反應(例如，卡巴氮平有害反應)之可能機制的示意圖。根據此推論的機制，該藥物分子(抗原)與位於抗原展示細胞(例如角質細胞)上之MHC I結合，會致使CD8+細胞毒性T細胞活化。所述之藥物-MHC I相互作用，在該等位基因係HLA-B*1502，且該藥物係卡巴氮平時最為顯著。T細胞之活化作用尤其促使顆粒溶解素產生。接著，顆粒溶解素會引發角質細胞凋亡(及細胞溶解)。
於急性GVHD，顆粒溶解素在血清中顯著增加，且顆粒溶解素之血清中含量與GVHD之嚴重程度呈正關聯。此外，已顯示協同特異性T細胞於活體外會以協同-特異性釋放出顆粒溶解素，而該顆粒溶解素釋放與協同-特異性細胞毒性活性呈正關聯。此等結果表示，顆粒溶解素在GVHD中扮演重要角色。(Nagasawa等人2006,Am.J.Hematol.81(5)：340-8)。
以上所述之觀察暗示，顆粒溶解素在此等不希望的免疫反應病症中具有重要性。因此，顆粒溶解素可做為診斷及治療此類不希望的免疫反應病症之標的物。
本發明之具體實施態樣係關於，一種能夠中和顆 粒溶解素之細胞毒性及抗微生物活性的抗體。所述之抗體可為多株抗體或單株抗體。
於一方面，本發明係關於能夠中和顆粒溶解素活性之抗-顆粒溶解素抗體。本發明之抗體能與位於顆粒溶解素(granulysin)之胺基酸R64至R113的抗原決定區(SEQ ID NO：81)結合。
根據本發明之具體實施態樣，所述之抗體可包含選自SEQ ID NO：82至SEQ ID NO：195之序列，或可包含選自SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：76之序列。
根據本發明之一些具體實施態樣，所述之抗體可包含下列序列：SEQ ID NO：82直到SEQ ID NO：87，或SEQ ID NO：88直到SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：94直到SEQ ID NO：99，或SEQ ID NO：100直到SEQ ID NO：105，或SEQ ID NO：106直到SEQ ID NO：111，或SEQ ID NO：112直到SEQ ID NO：117，或SEQ ID NO：118直到SEQ ID NO：123，或SEQ ID NO：124直到SEQ ID NO：129，或SEQ ID NO：130直到SEQ ID NO：135，或SEQ ID NO：136直到SEQ ID NO：141，或SEQ ID NO：142直到SEQ ID NO：147，或SEQ ID NO：148直到SEQ ID NO：153，或SEQ ID NO：154直到SEQ ID NO：159，或SEQ ID NO：160直到SEQ ID NO：165，或SEQ ID NO：166直到SEQ ID NO：171，或SEQ ID NO：172直到SEQ ID NO：177，或SEQ ID NO：178直到SEQ ID NO：183，或SEQ ID NO：184直到SEQ ID NO：189，或SEQ ID NO：190直到SEQ ID NO：195。
根據本發明之一些具體實施態樣，所述之抗體可包含下列序列：SEQ ID NO：39與SEQ ID NO：40，或SEQ ID NO：41與SEQ ID NO：42，或SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：44，或SEQ ID NO：45與SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：47與SEQ ID NO：48，或SEQ ID NO：49與SEQ ID NO：50，或SEQ ID NO：51與SEQ ID NO：52，或SEQ ID NO：53與SEQ ID NO：54，或SEQ ID NO：55與SEQ ID NO：56，或SEQ ID NO：57與SEQ ID NO：58， 或SEQ ID NO：59與SEQ ID NO：60，或SEQ ID NO：61與SEQ ID NO：62，或SEQ ID NO：63與SEQ ID NO：64，或SEQ ID NO：65與SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：67與SEQ ID NO：68，或SEQ ID NO：69與SEQ ID NO：70，或SEQ ID NO：71與SEQ ID NO：72，或SEQ ID NO：73與SEQ ID NO：74，或SEQ ID NO：75與SEQ ID NO：76。
根據本發明之一項具體實施態樣，所述之抗體可為單株抗體。根據本發明之任一具體實施態樣，所述之抗體可為人源化抗體或人類抗體。根據本發明之具體實施態樣，抗體可防止顆粒溶解素之細胞毒性。
於另一方面，本發明係關於一種治療不希望之免疫反應病症的方法，其係將前述任一抗-顆粒溶解素抗體投藥予有需要之患者。根據本發明之任一具體實施態樣，所述不希望之免疫反應病症為SJS、TEN或GVHD。
本發明之其他層面及優點，將由下列說明及所附之申請專利範圍彰顯出來。
圖1係顯示顆粒溶解素之結構圖，包括9kDa顆粒溶解素及15kDa顆粒溶解素。
圖2係顯示顆粒溶解素之三維立體結構圖，說明顆粒溶解素之五-螺旋束構造。
圖3為用以說明涉及顆粒溶解素-所介導之細胞毒性的可能機制之示意圖。
圖4係說明用於產生根據本發明具體態樣之抗-顆粒溶解素抗體的流程圖。
圖5係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體減低顆粒溶解素毒性之能力。
圖6為用以說明使用噬菌體展示方法鑑定出抗-顆粒溶解 素抗體之示意圖。
圖7係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體之CDR序列。
圖8為用以分析各種抗-顆粒溶解素抗體減低顆粒溶解素之抗微生物活性的流程示意圖。
圖9係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體減低顆粒溶解素之抗微生物活性的分析結果。圖10係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體減低顆粒溶解素之抗微生物活性的分析結果。
圖11係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體與顆粒溶解素之結合動力學分析結果。
圖12為用以製造顆粒溶解素突變體之流程示意圖。圖13A-13O係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體與顆粒溶解素及突變型顆粒溶解素之結合分析結果。
圖14A-14J係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體與具有不同定點突變(單一胺基酸丙胺酸掃描)之顆粒溶解素的結合分析結果。
圖15為說明於顆粒溶解素作用中，精胺酸正電荷參與和帶負電荷之磷脂質層的交互作用之示意圖。
圖16係顯示顆粒溶解素之三維立體結構圖，說明位於一表面上之帶電荷殘基。
圖17係顯示位於顆粒溶解素蛋白上各種對應不同單株抗體之抗原決定基。
圖18係顯示各種抗-顆粒溶解素抗體與顆粒溶解素突變體之結合分析結果，說明其逆轉顆粒溶解素之抗微生物活性的能力及其CDR序列。
圖19為列示一種用於分析抗體與根據本發明之變性顆粒溶解素結合的方法之流程圖。
於本說明書中，術語“抗體”意指一種免疫球蛋 白分子或其具有免疫學活性的部分，亦即抗原結合部分或其片段。因此，抗體包含至少一(較佳兩)段重(H)鏈可變區(VH)，及至少一(較佳兩)段輕(L)鏈可變區(VL)。VH及VL區可進一步細分成高可變區(即“互補決定區”(“CDR”)”)，其間穿插較保守性的區域(即“骨架區”(“FR”))。每一段VH及VL係各由三段CDR's與四段FR's所組成，從胺基末端到羧基末端依序排列為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。(參見，Kabat等人(1991)免疫學相關蛋白質之序列，第5版，美國健康及人類服務部門，NIH公開號No.91-3242；及Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-917，以參考文獻之方式併入本說明書)。
抗體可包括一或多段來自重鏈或輕鏈恆定區之恆定區。重鏈恆定區包含三個功能域，即CH1、CH2及CH3，而輕鏈恆定區包含一個功能域CL。重鏈及/或輕鏈可變區含有可與抗原相互作用之結合功能域，而抗體之恆定區代表性地係介導抗體與宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)，及傳統補體系統之第一組成(Clq)間的結合。
於本說明書中，術語”免疫球蛋白”意指一種由一或多種實質上由免疫球蛋白基因所編碼之多肽類組成的蛋白質。人類免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1與IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε及μ恆定區基因，以及萬(104)免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25KDa或214胺基酸)係由位於NH2-端(約110胺基酸)之可變區基因，及位於COOH-端之κ或λ恆定區基因所編碼。全長免疫球蛋白“重鏈”(約50KDa或446胺基酸)類似地係由可變區基因(編碼約116胺基酸)，及前述之恆定區基因，例如γ恆定區基因(編碼約330胺基酸)所編碼。
術語抗體之“抗原-結合片段”(或“抗體部分”，或“片段”)意指全長抗體中一或多段保有可與抗原特異性結合之能力的片段。抗體之“抗原-結合片段”實例包括 (但不限定於)：(i)Fab片段，為一種由VL、VH、CL與CH1功能域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，為一種由兩段藉由位於絞鏈區之雙硫鍵連接的Fab片段組成之雙價片段；(iii)Fd片段，由VH與CH1功能域組成；(iv)Fv片段，由抗體其中一單臂之VL與VH功能域組成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，由VH功能域組成；及(vi)單離之互補決定區(CDR)。
再者，雖然Fv片段之兩功能域(VL與VH)係由分別的基因所編碼，彼等可使用重組方法經由合成之連接肽相接合，而使其能夠成為單一蛋白質鏈，其中該等VL與VH區配對而形成一單價分子(已知稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體亦可包含於術語抗體之”抗原-結合片段”之定義中。此等抗體片段可使用熟悉該等技術領域者已知的習知技術製得，且經篩選出可用於和完整抗體一樣的用途。
本發明之實施態樣係關於抗-顆粒溶解素抗體，及此等抗體之使用方法。所述之用途可包括治療、預防或診斷與顆粒溶解素相關聯之疾病，例如STS/TEN。本發明之抗體可包括任一種適合之抗體，例如多株抗體、全類型之單株抗體、人類抗體及藉由遺傳工程製得之人源化抗體。
根據本發明之具體實施態樣，抗-顆粒溶解素抗體可使用融合瘤或噬菌體展示技術製造。使用融合瘤製造單株抗體已為該項技術領域所熟知(參見，Schwaber,J.；Cohen,E.P.(1973)”人類x小鼠體細胞雜合選植株用於篩選兼具兩親源型之免疫球蛋白”，Nature 244(5416)：444-447)。同樣，用於產生抗體之噬菌體展示及組合方法亦為該項技術領域所熟知(參見，Ladner等人U.S.Pat.No.5,223,409；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992),Hum.Antibody Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989),Science 246：1275-1281)。
圖4列示用於製造抗-顆粒溶解素抗體之一般策略(融合瘤及噬菌體展示)。使用融合瘤製程，係將小鼠以一抗原(例如，顆粒溶解素或其片段或衍生物)進行免疫。然後，將取自經免疫動物之脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合。可使用乙二醇使相鄰之細胞膜融合。融合效率低，並使用只有已融合細胞能在其中生長之選擇培養基挑選融合瘤細胞。接著篩選出可產生所希望抗體之融合瘤細胞，並單離得到陽性純株。所得之陽性純株可用於小規模生產，及用於進一步純化與次選殖。最後，分離出可製造有用抗體之單一純株。
使用噬菌體展示製程，係代表性地製得Fab或scFv，而非完整的抗體。首先，可構築含有源自經免疫小鼠之CDR區(藉由RT-PCR及PCR擴增)之DNA片段與噬菌體外套蛋白融合而成的DNA庫。具有所希望CDR序列之噬菌體會與標靶抗原結合，且能經由將標靶抗原(例如顆粒溶解素)塗覆於平板上，並使噬菌體與該抗原結合之親和性汰選(bio-panning)或ELISA技術將其數量擴大。接著，將未結合之噬菌體洗掉。再收集並擴增呈陽性之純株。該篩選/擴大程序可重複進行數次，而純化得陽性純株。然後可將得自此等陽性純株之序列之序列(亦即，CDR序列)構築於抗體骨架中，而產生全長構體。可從此等全長構體製造抗體，並將其純化而用於分析。
本發明將於下列實施範例中進一步描述融合瘤製程及噬菌體展示製程。
實施例1：免疫程序
使用重組人類顆粒溶解素(15kDa，表現於大腸桿菌)作為抗原。根據適合的程序，將此抗原係與弗氏完全佐劑(FCA)或弗氏不完全佐劑(FIA)組合用於免疫小鼠。例如，表1說明一種例舉性免疫程序。
表1. 免疫程序
實施例2：以ELISA測試血清力價
將ELISA平盤(例如96-孔平盤)塗覆以重組人類顆粒溶解素(15kDa，表現於大腸桿菌)。將測試樣本加入平盤，並令其與所塗覆之蛋白質結合。待清洗去除未結合之抗體後，以次級抗體(例如與山辣根過氧化酶(HRP)偶合之山羊抗-小鼠IgG)分析以結合的抗體。可使用HRP的適當受質評估已結合之次級抗體量。例如，可使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)或次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)作為HRP之呈色受質。表2列示一項實施例之結果。
實施例3：產生融合瘤
待進行小鼠免疫並以ELISA分析確認抗體製造後，將小鼠犧牲。將取自該免疫小鼠之脾臟細胞藉由PEG1500之輔助，與NS-1骨髓瘤細胞進行融合。
接著使用ELISA分析以與前述相似之方法，篩選出可產生抗-顆粒溶解素抗體之融合瘤細胞。亦即，使用於大腸桿菌或NS0細胞表現製得之重組人類顆粒溶解素(15kDa)進行篩選，並使用次級抗體-HRP共軛物(山羊抗-小鼠IgG-HRP)鑑定得呈陽性之純株。NS0細胞為親本NS1細胞系之選殖衍生細胞株，且生長於懸浮培養物中。
於本實施例，使用大腸桿菌所表現之重組人類顆粒溶解素(15kDa)分析結果顯示，有112純株呈現OD讀值>1.8，及22純株呈現OD讀值>1.5。同樣，使用NS0細胞所表現之重組人類顆粒溶解素(15kDa)分析結果顯示，有111純株呈現OD讀值>1.8，1純株呈現OD讀值=1.648，及22純株呈現OD讀值>0.4。空白組之OD讀值為0.097。
實施例4：細胞毒性分析
將得自上述實施例之陽性純株單離出，用於製造供進行細胞毒性分析的抗-顆粒溶解素抗體。使用蛋白質G珠粒將抗-顆粒溶解素抗體從多株融合瘤培養物上清液純化出。分析此等抗體之減低或防止由顆粒溶解素-誘導之細胞毒性的能力。
使用WST-1分析由顆粒溶解素-誘導之細胞毒性，方法如下述：第0天：培養適當細胞(例如角質細胞)並以1/10體積之0.05%胰蛋白酶EDTA溶液進行胰蛋白酶分解5分鐘。計數取出之細胞以測定細胞數目。然後，於600rpm下離心5分鐘收集細胞。將細胞濃度調整至1×105細胞/ml，並接種於96-孔平盤之各孔內(200μl/孔；2×104細胞/孔)。培養細胞24 小時。
第1天：將顆粒溶解素及抗-顆粒溶解素抗體加至各孔中。例如，於各孔中添加20μl抗體(1：10及1：1莫耳比)及顆粒溶解素20μl(4μg/ml至62.5μg/ml)。
第2天：將20μl WST-1溶液加至各孔中，並於37℃下靜置反應24小時。可自許多市售來源購得WST-1細胞增殖分析套組(例如，G-Biosciences，聖路易市，St.Louis,MO；Cayman化學公司，Ann Arbor，MI)。該項分析係基於，四唑鎓鹽WST-1可由存在活細胞中之細胞粒腺體脫氫酶酵素裂解成甲臢。該產物(甲臢)可藉由OD 450-655nm定量，進而推定出存活的細胞數目。
如上所述，顆粒溶解素會導致標靶細胞的細胞溶解及凋亡。若有任何中和性抗體存在，就會減低或防止顆粒溶解素之細胞溶解活性。因此，存活細胞數目便會增加。
此等使用角質細胞進行之分析所得的結果列示於圖5。由此等分析結果發現，諸如14-22、16-7、34-22、37-6、106-17及41-1等純株具有可減低顆粒溶解素之細胞溶解活性的功效。可進一步確定此等純株的可能用途。例如，下表列示三種代表性純株之CDR功能域序列分析結果。
此等中和性抗-顆粒溶解素抗體可用做為，用於治療及預防由顆粒溶解素-介導之病症，例如SJS、TEN及GVHD的治療劑。
可進一步利用次選殖(subcloning)方法，進一步純化得可製造中和性抗體之陽性選殖株。可藉由將細胞以1細 胞/孔，接種於20% FBS-5% Briclone-DMEM培養基中而進行次選殖。最後，可(例如)使用小鼠抗體亞型鑑別ELISA套組(例如SBA ClonotypingTM System，購自Southern Biotech,Birmingham,AL)針對所得之陽性選殖株進行特性分析。
噬菌體展示製程
實施例5：構築噬菌體庫
根據本發明之實施態樣，亦可使用噬菌體汰選方法產生抗體。如圖6所示，可從經免疫之小鼠構築一cDNA庫。可將小鼠(例如)使用於NS0細胞表現製得之重組人類顆粒溶解素進行免疫。將小鼠犧牲，並取出脾臟萃取得到總體RNA。然後使用RT-PCR獲得抗體片段(例如，VH、VL、重鏈(Fd)或輕鏈)。此等片段可用於構築Fab片段庫。此外，將此等片段使用PCR組合而產生scFv之抗體片段，然後將其用於構築scFv片段庫。於一項具體實施例，該Fab片段庫含有6.6×108個衍生物，而該scFv片段庫含有1.4×109個衍生物。
實施例6：製備用於篩選之噬菌體
將上述(scFv或Fab)儲備庫接種於含有苄青黴素及2%葡萄糖之2xYT培養基(2YTAG)中，並搖晃培養於37℃下直到OD(600nm)值達到0.5。然後將M13KO7輔助噬菌體(helper phage)以1：20之比例，添加於此培養物中進行感染。將所成之培養物於37℃水浴中靜置30分鐘。
接著，將培養物於4000rpm下離心15分鐘，收集已感染之細胞。將細胞溫和地再懸浮於含有苄青黴素與卡那黴素之2xYT培養基(2YTAK)中，並搖晃培養於37℃下過夜。
將過夜之培養物於10,000rpm下離心20分鐘，收集細胞。將PEG/NaCl(20% PEG 8000,2.5M NaCl；1/5體積)加入上清夜中。將溶液混合並於4℃下靜置1小時。然後於10,000rpm下離心20分鐘，將上清液抽除。
將細胞沉澱再懸浮於40ml無菌水中，並於12,000rpm下離心10分鐘，以去除大部分殘留的細菌碎片。再次將 1/5體積之PEG/NaCl加入上清液。充分混合後，於4℃下靜置1小時。
接著再於10,000rpm下離心20分鐘，並將上清液抽除。然後再懸浮於PBS中，並於12,000rpm下離心10分鐘，以去除殘留的細菌碎片。
以上所述為用於製備噬菌體之其中一實施例。此實施例僅供例舉說明，而非用以限制本發明之範圍。習於該項技術者應明瞭可能進行各種修改及變異。
實施例7：使用ELISA平盤進行篩選
將ELISA平盤(Nunc)之每孔塗覆1μg/100μl抗原(例如重組人類顆粒溶解素)。該抗原塗覆步驟係於4℃下、於PBS(pH 7.4)中進行。然後，將各孔以PBS清洗三次，並以每孔300μl PBS-5%脫脂牛奶，於37℃下進行封阻1.5小時。隨後以PBS清洗三次。
接著，將100μl存在5% MPBS中之1011至1012噬菌體或5% MPBS加入，隨後添加1-7 10×His標誌。將溶液置於37℃下反應90分鐘，將測試溶液丟棄，再以PBS-0.05% Tween20(PBST)清洗三次。
每孔加入100ul PBS。置於37℃下反應60分鐘，再以PBST清洗三次，及以PBS清洗一次。將過量的PBS從平盤晃出，並將100μl 100mM三乙胺(TEA)加入已稀釋之噬菌體，於37℃下持續旋轉30分鐘。將Tris緩衝液(50μl,1M,pH 7.4)加入已稀釋之100μl噬菌體中，進行快速中和反應。
取10ml對數生長期之TG1培養物，並加入150μl已稀釋之噬菌體。亦將100μl之TG1培養物加入免疫平盤中。將該兩組培養物於37℃下靜置培養30分鐘進行感染。將上述10ml及100μl已感染之TG1細菌匯集，並於4000rpm下離心15分鐘。將離心下來的細菌再懸浮於2xTY中，並平佈於大2YTAG平板上。令細菌於30℃下生長過夜。
實施例8：使用Dynabeads®平盤進行篩選
將Dynabeads®以1ml PBS預洗三次，並再懸浮於2% MPBS中。將噬菌體與0.5ml 2% PBSM、及上述已清洗之Dynabeads®混合。將所成之懸浮液製於旋轉器上進行預-培養30分鐘。
取出Dynabeads®並加入顆粒溶解素。將所成之混合物於旋轉器上進行混合90分鐘。將Dynabeads®以1ml PBS預洗三次，並再懸浮於2% MPBS中。然後將此混合物於旋轉器上進行反應90分鐘。
將噬菌體-顆粒溶解素混合物加至已平衡之Dynabeads®，於旋轉器上再反應30分鐘。接著將Dynabeads®以1ml 0.05% PBST、0.2% PBSM及PBS進行清洗。然後將已結合之噬菌體以1ml之100mM TEA稀釋。於反應期間，預先備妥含有0.5ml 1M Tris,pH 7.4之試管，以便加入已稀釋之噬菌體中進行快速中和。
取6ml對數生長期之TG1培養物，並加入經TEA稀釋之噬菌體。亦將4ml之TG1培養物加入上述珠粒中。將該兩組培養物於37℃(水浴)下靜置培養30分鐘。
將上述已感染之TG1細菌匯集，並於4000rpm下離心15分鐘。將離心下來的細菌再懸浮於2xTY中，並平佈於大2YTAG平板上。令細菌於30℃下生長過夜。
實施例9：製備次一回合之噬菌體
將5-6ml之2xYT、15%甘油加至上述已經生長過夜之細菌平板，並使用玻璃推棒使菌落鬆脫。將50-100μl刮下的細菌加至100ml 2xYTAG中。將細菌於37℃下伴隨搖晃生長直到600nm下之OD值達到0.5。將10ml此培養物加入比例為1：20之M13KO7輔助噬菌體進行感染。將已感染之培養物於37℃(水浴)中靜置培養30分鐘。
將已感染之細胞於4000rpm下離心15分鐘收集細菌。將離心下來的細菌溫和地再懸浮於50ml 2xYTAK中，並將該培養物於30℃下伴隨搖晃進行培養過夜。
取40ml上述隔夜培養物並於10,000rpm下離心20分鐘，收集上清液。將1/5體積(8ml)之PEG/NaCl加入該上清液中。充分混合並將其於4℃下靜置1小時或以上。於10,000rpm下離心20分鐘，然後將上清液抽除。將離心下來的細菌再懸浮於2ml PBS中，並於12,000rpm下離心10分鐘，以去除大部分殘留的細菌碎片。
實施例10：以ELISA篩檢陽性噬菌體
從上述平板挑出個別菌落接種於200μl 2xYTAG 96-孔平盤中，並於37℃下伴隨搖晃進行培養過夜。使用96-孔轉移裝置將接種物從此平盤移入第二個每孔含有200μl 2xTYAG之96-平盤中。使其於37℃下，伴隨搖晃生長2小時。將50μl含有109pfu之M13KO7輔助噬菌體之2xYTAG加入上述第二平盤之各孔中。於37℃下靜置30分鐘，然後於37℃下搖晃1小時。
於4000rpm下離心30分鐘，然後將上清液抽除。將離心下來的細菌再懸浮於300μl 2xYTAK中。於30℃下搖晃生長過夜。於4000rpm下離心30分鐘，並將100μl該培養物上清液用於噬菌體ELISA。
將ELISA平盤以1μg/100μl每孔之蛋白抗原進行塗覆。將各孔以PBS清洗三次，並以每孔300μl 2%MPBS於37℃下進行封阻2小時。將各孔以PBS清洗三次。將100μl上述之噬菌體培養物上清液加入。於37℃下反應90分鐘。將測試溶液丟棄，並以PBST清洗三次。將適當稀釋於2% MPBS之HRP-抗-M13抗體加入。於37℃下反應90分鐘，再以PBST清洗三次。
以受質溶液(TMB)呈色。添加50μl 1M硫酸以終止反應。顏色應轉變成黃色。於650nm及450nm下讀取OD值。將OD 450值減去OD 650值。
從Dynabeads®及ELISA平盤方法所得之親和性汰選結果，列示於圖7。由圖7所示之序列(括號中係表示其 相對應的SEQ ID NO編號)顯示，就各別的重鏈或輕鏈CDR而言，其序列具有高度保守性。習於該項技術者應明瞭，含有一或多種此等CDR序列或同源序列之抗體(或其片段)可預期能與該抗原(例如顆粒溶解素)結合。因此，根據本發明之具體實施態樣，抗-顆粒溶解素抗體可包含一或多種此等CDR序列或同源序列。根據本發明之具體實施態樣，同源序列相對於該標靶序列，可包含50%、60%、70%、80%、90%或更高的序列同一性。
根據本發明之具體實施態樣，已例舉性鑑定得19株特別純系。下表列示代表此等19純株之重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變區的DNA與蛋白質序列之SEQ ID編號。其特定序列請參見說明書之序列表。
上述實施例係例舉說明，抗-顆粒溶解素抗體之選殖和篩檢，以及各別可變區(與重鏈或輕鏈CDRs)之特性分析。習於該項技術者應了解，重鏈及/或輕鏈序列與CDRs可用於製造全長抗體或抗體片段(例如，scFv、Fab、F(ab)2等)。此外，習於該項技術者應了解，本說明書所揭露之特定序列僅供說明，在不偏離本發明範圍之前提下，可能從此等序列產生各種變異。例如，習於該項技術者應了解，CDR區為與抗體結合之重要區域，而骨架區為結構支架。因此，習於該項技術者可針對骨架區及不影響抗體結合之某些殘基進行修飾。
實施例11：顆粒溶解素對於細菌之細胞毒性
可利用任何感受性細胞或細菌，進行顆粒溶解素細胞毒性測試。例如，可使用綠膿桿菌進行該項分析。
於一項例舉性分析方法，係將綠膿桿菌培養過夜，並藉由於5000rpm下離心5分鐘收集細菌。將細胞以10mM磷酸鹽緩衝液清洗，並以10mM磷酸鹽緩衝液稀釋300倍。將45μl該細菌溶液加入各含有5μl顆粒溶解素(例如，起始濃度為0.748μg/5μl)及1μl抗體(例如，從原始濃度開始，進行5×稀釋)之測試混合物中。顆粒溶解素可為由大腸桿菌表現製得者，且分子量可為9kDa或15kDa(參見圖1)。
將混合物37℃下伴隨旋轉反應3小時。然後將細菌平鋪於LB平板上，若需要則加以稀釋(例如進行1×、10×及100×稀釋)，並培養過夜。分析方法以流程圖方式列於圖8。
簡述之，將三組平盤培養過夜：一為僅含有細菌之對照組，一為含有顆粒溶解素(0.5μg)與相同數量細菌之溶解組，及一含有相同數量細菌、顆粒溶解素(0.5μg)與測試抗體(可增加多組平盤而以不同濃度(例如0.4μg及2.0μg)進行測試)之抗體組。如圖8之流程圖所示，顆粒溶解素預期可將細菌溶解，而產生少許菌落。在添加能夠抗衡顆粒溶解素作用之抗體後，可預期細菌會受到保護，而使菌落數回復到與 對照組相似的數量。
分析結果列示於圖9及圖10。如圖9所示，所有測試抗體皆顯示在保護細菌不被15kDa顆粒溶解素(0.5μg)溶解上具有非常好的功效。甚至以0.4μg抗體劑量，所有抗體皆有效。隨著劑量增加(2.0μg抗體)，大部分抗體可完全抑制由顆粒溶解素造成的溶解作用。
圖10顯示使用9kDa顆粒溶解素取代15kDa顆粒溶解素進行類似測試之結果。於圖10所示之結果大部分係與圖9的結果相似，惟有四種抗體(#3123、#422F、#422M及RF-10)未顯示具有可感受的保護活性。此四種抗體在以15kDa顆粒溶解素進行測試時，顯示在對抗顆粒溶解素-誘導的溶解作用上具有良好活性。活性上的差異極有可能是因為，N-端片段係存在於15kDa顆粒溶解素，而非9kDa顆粒溶解素中(參見圖1)。因此，此等測試顯示此四種抗體對應的抗原決定基是位於，不存在於9kDa顆粒溶解素之N-端片段內。同樣推論，其他八種抗體(#4209、#3131、#4256、#4279、# 3141、#2292、#4227及#3319)對應的抗原決定基是位於，共同存在於9kDa與15kDa顆粒溶解素之區域內。
基於顆粒溶解素之抗微生物(溶解)活性進行之溶解分析所得的結果與上述使用角質細胞進行分析所得之結果(圖5)一致，可確認此等抗體能夠中和顆粒溶解素之溶解活性。此等結果表示，此等抗體可用於預防由顆粒溶解素-介導之病症，例如SJS、TEN及GVHD。
實施例12：親和力測量及動力學分析
對於使用做為治療劑，抗體應較佳地對於標的分子(例如顆粒溶解素)具有良好的親和力。可使用任何適當儀器(例如，於BIAcore T100進行之SPR-為基礎的分析)，來分析各種抗體與顆粒溶解素結合之親和力及動力學。例如，藉由使用相關連軟體進行之多-循環動力學(MCK)方法，來測量及分析結合動力學。
於本發明之一實施例，係將顆粒溶解素固定於晶片上，其密度係可使Rmax達到50-150反應單位(RU)之範圍內。
於此實施例，動力學分析參數如下：數據收集速率1Hz；雙偵測模式；溫度：25℃；濃度單位：nM；及緩衝液A HBS-EP。以五重複組進行測量。各種儀器設定如下所示。
分析物樣本參數如下：類型：多-循環動力學，接觸時間：420s，流速：10μL/min，流動路徑：雙向，安定化時間：90s。
再生參數如下：再生溶液：25mM甘胺酸pH 1.5，接觸時間：90s，流速：30μL/min，流動路徑：雙向。
啟動周期參數如下：類型：低樣本耗損，接觸時間：420s，解離時間：600s，流速：30μL/min，流動路徑：雙向。
將抗-顆粒溶解素抗體以電泳緩衝液進行系列稀釋。所得之系列濃度為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.125nM(重複組)。
以BIAcoreT100分析軟體評估結果。將結合反應數據減去空白流動槽所得之數據，以校正來自緩衝液的影響。使用1：1朗繆爾曲線擬合模式估算ka或kon(結合速率或開啟速率)，及kd或koff(解離速率或關閉速率)。或者，可從穩態結合形式濃度(亦即，圖11所示曲線中之平線區)，做為以類似於酵素動力學Michaelis-Menton方程式之平衡動力學為基礎的抗體濃度函數，估算出解離常數(Kd值)，並可從圖11之彎曲部分，將其與一階反應動力學進行曲線擬合，而估算得開啟速率(kon)。(該反應因其試劑維持在恆定濃度故為一階反應)。接著，可從Kd及kon衍算得到koff速率。
如圖11所示，結合親合力(測量值以解離常數Kd表示)非常好。對於圖11所示之所有抗體，值Kd皆為sub nM(範圍從低10-10M至小於10-11M)。此等數據顯示，這些抗體可為有效的治療劑。
實施例13：抗原決定基分析
為闡明涉及抗體與顆粒溶解素結合之胺基酸殘基，遂進行抗原表位定位實驗。特別，使用丙胺酸-掃描方法來鑑定，顆粒溶解素中對於抗體結合為重要的胺基酸殘基。以如前一實施例所述相同的方法，分析此等顆粒溶解素突變體之動力學及親和力。該等分析可使用各種不同突變體與各種抗體(由其是中和抗體)結合進行。此等結合研究所得的結果不僅可用於鑑定出位於顆粒溶解素的必要結合殘基，也可定出位於CDR中的重要殘基。
顆粒溶解素可以9kD或15kD形式存在。此等形式之DNA及蛋白質序列如下所示：
SEQ ID NO 77：(顆粒溶解素9kD)
SEQ ID NO 78：(顆粒溶解素9kD)
SEQ ID NO 79：(顆粒溶解素15kD)
SEQ ID NO 80：(顆粒溶解素15kD)
如上所示，顆粒溶解素形成一種五-螺旋束，其中精胺酸位於該分子的一側(參見圖2)。圖16顯示顆粒溶解素之晶體結構。從此結構可知，七個精胺酸殘基(64、97、100、102、104、108與113)係位於該分子的一側。此等帶正電荷之胺基酸推測為顆粒溶解素活性所必需。因此，可針對此等位置進行突變，以評估該等位於顆粒溶解素上之殘基的重要性。
例如，圖12說明一種用於製造進行上述研究之顆粒溶解素突變體的流程圖。於本實施例，例如藉由將位於64、102及113之精胺酸以丙胺酸取代產生一些突變體，而其他突變係在位於97、100、104及108之精胺酸進行取代。除了此二種實施例之外，亦產生數種單一突變及/或位於非-精胺酸位置之突變。而且，為有助於純化及偵測所表現之蛋白質，可將一或多個標誌序列(例如His標誌)附加於該蛋白之N-端或C-端。
如圖12所示，可使用任何該項技術中已知的方法，例如使用脂質體轉染試劑lipofectamine 2000暫時轉感染入293T細胞，將突變體於適當細胞中進行表現。將已轉感染之細胞培養一段適當時間(例如48小時)，使轉感染之細胞產生突變型顆粒溶解素。將所製得之突變型顆粒溶解素從培養物上清液收集，並用於進行其與抗-顆粒溶解素抗體之結合分析。
抗-顆粒溶解素抗體與野生型及突變型顆粒溶解素之結合分析
可以如上述使用Dynabeads®或ELISA平盤之類似方法進行結合分析。
以使用ELISA平盤為例，可將各孔使用適當濃度 (例如5μg/ml)溶於適合緩衝液(例如50mM磷酸鹽緩衝液，pH 9.6)之抗-顆粒溶解素抗體，於4℃下進行塗覆過夜。
將200μl經系列稀釋之樣本(野生型或突變型顆粒溶解素)加至該等經抗體塗覆之平盤的各孔中。然後將溶液置於37℃下反應2小時。
經沖洗去除未結合之蛋白質後，可使用適當稀釋度(例如1：2000)之與HRP偶合之抗-His抗體(例如Sigma,A7058)，偵測帶有His-標誌(或任何其他標誌或融合蛋白)之已結合蛋白質。將溶液於37℃下反應2小時(或使用任意適合的時間及溫度)，使次級抗體與已結合之蛋白質結合。
完成反應後，將過量的次級抗體洗掉，並使用100μl TMB定量以結合之次級抗體。添加100μl of H2SO4終止酵素反應。將反應產物以OD 450-655nm進行定量。
圖13A-13O係顯示各種顆粒溶解素突變體與各種抗-顆粒溶解素抗體之例舉性動力學分析結果。如圖13A-13O所示，大多數抗體對於含有丙胺酸取代精胺酸之顆粒溶解素突變體(例如，RRR64/102/113AAA及RRRR97/100/104/108AAAA)喪失全部或大部分結合力，表示此等抗體的確會結合(或接近)至天然顆粒溶解素分子的帶正電荷表面。圖13I、13J、13M、13N及13O顯示有些許例外。
如圖13I所示，抗體BGF33-19確實與突變型顆粒溶解素更緊密結合(相較於野生型顆粒溶解素)，證據在於結合曲線向左位移。該較緊密結合係在RR64/67AA突變體及RRR64/102/113AAA突變體二者皆觀察到。該較緊密結合可能導因於突變型蛋白中的構型改變，因為產生較佳的相互作用(丙胺酸較精胺酸更具厭水性)，或由於存在野生型分子中的不利作用消失(例如，R64正電荷可能干擾抗體結合)所致。
然而，對於RRRRR94/97/100/102/104AAAAA突變體及RRRR97/100/104/108AAAA突變體，BGF33-19抗體與該等突變型蛋白間的結合喪失。此結果表示，位於如圖13所示 分子之表面下半部的正電荷，可能對於抗原-抗體結合很重要。
參照圖13J，抗體BGF31-71與RRR64/102/113突變體之結合增強，而與RRRR97/100/104/108AAA突變體之結合明顯減弱。此等結果亦暗示，位於如圖16所示表面下半部的正電荷可能對於抗體結合很重要，而位於如圖16所示表面上半部的正電荷可能會干擾抗體結合。此等結果與如圖13I所示在抗體BGF33-19所觀察到的結果相符。
參照圖13M，抗體GP31-31與RRR64/102/113突變體及RRRR97/100/104/108AAA突變體之結合並未改變。此等結果表示，此抗體可能係與位於顆粒溶解素分子上的其他表面結合。
參照圖13N，抗體BGF31-41與RRR64/102/113突變體及RRRR97/100/104/108AAA突變體之結合皆被增強。此等結果表示，此抗體可能係與顆粒溶解素分子上的另一部分結合，而且去除精胺酸正電荷會產生更多有利的結合(可能是由於構型改變所致)。
參照圖13O，抗體BGF2A2-92與RRR64/102/113突變體之結合增強，而與RRRR97/100/104/108AAA突變體之結合則完全喪失。此等結果亦表示，此抗體可能係與位於如圖16所示表面的下半部結合，且位於該區域中之正電荷對於該結合而言具有重要性。
綜合上述，圖13A-13O之結果顯示許多抗體可能係與位於如圖16所示表面的下半部結合，而且位於此區域之正電荷確實有助於與此等抗體結合。換言之，此區域或許較顆粒溶解素分子之其他部分更具抗原性(或含有較多抗原決定基)。
為使能與含有帶正電荷之精胺酸殘基的抗原決定基結合，抗體結合部位(亦即CDRs)可能含有帶負電荷之殘基。的確，CDR序列皆含有一或多個帶負電荷之殘基(例如，天冬胺酸或麩胺酸；圖7)。尤其，CDRH2及CDRH3皆含有多 數個負電荷殘基。
雖已進行如圖13A-13O所示精胺酸之丙胺酸掃描分析，亦可對顆粒溶解素蛋白之其他部位進行丙胺酸掃描。例如，圖14A-14J顯示某些其中位於顆粒溶解素之各種不同殘基已被丙胺酸取代的實例。列示此等突變型顆粒溶解素與不同抗體間之各種結合曲線。使用此等單一丙胺酸掃描，可精確標點出對於抗體結合具重要性之殘基。此項分析能定位顆粒溶解素蛋白上對於任何特定抗體之抗原決定基。
本發明之大多數中和抗體會與精胺酸富含區域結合之事實暗示，精胺酸參與其結合功能。圖15係以示意圖說明，顆粒溶解素分子(經由其帶正電荷之側面)與帶負電荷之磷脂質層間的交互作用模式。
除了精胺酸之外，顆粒溶解素之”結合面”亦含有其他可能參與抗體結合之殘基(參見圖16)。此類殘基可包括S101、V106、D108及N109。圖17係列出一些位於顆粒溶解素上對應數種抗體之抗原決定基實例。從此等結果，可推論顆粒溶解素上之抗原決定基係位於從殘基R64至R113的序列(SEQ ID NO：81)中。
SEQ ID NO：81(顆粒溶解素抗原表位區域)
圖18係綜合各種抗體之分析結果，顯示彼等與9kDa及15kDa顆粒溶解素之親合力(以解離常數KD表示)，其中和顆粒溶解素之抗微生物活性的能力，以及彼等是否可與變性顆粒溶解素結合。從此等序列及其結合常數之分析結果可闡明位於各種中的重要殘基，亦即推演出共有序列(如上所示)。
再者，藉由比較與天然及變性顆粒溶解素之結合，可推論該等抗體是否與具構型之抗原決定基結合。例如，圖19列示一項用於分析抗體與變性顆粒溶解素結合之例舉方 法。簡述之，可將顆粒溶解素暫時表現呈具有一段10 His標誌，以助於進行純化。所述之暫時表現可根據該項技術已知之方法(例如，使用脂質體轉染試劑lipofectamine 2000與293T細胞)完成。經一段適合培養期(例如48小時)後，可收集培養物上清液進行分析。可使用任意已知之方法，例如使用ELISA定量表現量。
可將所表現之顆粒溶解素於變性SDS-PAGE上進行電泳分析，然後以測試抗體探測。可使用次級抗體(含有報導基團，例如抗-人類-HRP)偵測該測試抗體是否與變性顆粒溶解素結合。基於此項分析，該等抗體與變性顆粒溶解素結合之能力列示於圖18。
如圖18所示，抗體GP42-10、GP31-52、GP42-58、GP42-27、BGF33-19、BGF31-71、GP42-09、GP31-31、BGF2A2-92、34.22Chi、16.7Chi及106.17Chi(為分別具有、或之可變區與人類IgG1之恆定區融合之嵌合抗體)並不與變性顆粒溶解素結合，表示此等抗體可能辨識具構型的抗原表位。
各種抗體之核苷酸及胺基酸序列係列於本說明書之序列表中。
人類抗體及人源化抗體
根據本發明之某些具體實施例，抗體可為全長人類抗體(例如，於經遺傳工程處理而用以製造源自人類免疫球蛋白序列之抗體的小鼠所製得的抗體)。人類單株抗體可利用攜帶該等人類免疫球蛋白基因，而非小鼠基因之轉殖基因小鼠來產生。可將得自此等經所興趣抗原(例如，顆粒溶解素)免疫之轉殖基因小鼠的脾臟細胞，用於製造可分泌對於源自人類蛋白之抗原表位具有特定親和性的人類mAb之融合瘤(參見，例如，Wood等人WO 91/00906；Kucherlapati等人WO 91/10741；Lonberg等人WO92/03918；Kay等人92/03917；Lonberg,N等人，1994 Nature 368：856-859；Green,L.L.等人1994 Nature Genet.7：13-21；Morrison等人1994 Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等人1993 Immunol 7：33-40；Tuaillon等人1993 PNAS 90：3720-3724；Bruggeman等人1991 Eur J Immunol 21：1323-1326)。
此外，可於非-人類生物(例如大鼠或小鼠)產生抗體，然後(例如)於可變區框架或恆定區進行修改，以減低在人類體內的抗原性。此類抗體可稱作“人源化抗體”。人源化抗體技術為該項技術已知(參見下述)。
作為一種人源化抗體之變異型，可藉由該項技術已知之重組DNA技術製造嵌合型抗體。例如，可將編碼小鼠(或其他物種)單株抗體之Fc恆定區的基因以限制酶分解，而去除編碼小鼠Fc之區域，並將其以編碼人類Fc恆定區之基因的相等部分取代(參見Akira等人EP申請案184,187；Cabilly等人U.S.Pat.No.4,816,567；Better等人(1988 Science 240：1041-1043)；Liu等人(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等人，1987,J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等人，1987,Canc.Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；及Shaw等人，1988,J.Natl Cancer Inst.80：1553-1559)。
人源化或移植CDR之抗體，其至少一或二(但通常全部三段)受者CDR(位於重鏈及/或輕鏈)會被供者CDR置換。該抗體可被至少一部分非人類CDR置換，或可僅於該等CDR的某些部分以非人類CDR的置換。僅需要置換供該人源化抗體或其片段結合所需之CDR數量。較佳地，供者可為齧齒類抗體，例如大鼠或小鼠抗體，而受者為人類框架或人類共有框架。共有框架可具有與人類框架約85%或更高，較佳地90%、95%、99%或更高同一性的序列。
用於本文，術語“共有序列”意指由在一相關序列家族中最常出現之胺基酸(或)核苷酸所形成的序列(參見，例如，Winnaker，從基因到純株(Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國1987))。於一蛋白質家族中，所述共有序列之各部分係由 位於該家族之該位置中最常出現的胺基酸所佔據。若有兩個胺基酸常出現機率相同，可將其任一者包括於共有序列。“共有框架”意指位於共有免疫球蛋白序列中之框架區。
可藉由該項技術已知之方法將抗體人源化。可藉由將Fv可變區之序列(其未直接參與抗原結合)置換以，源自人類Fv可變區之同等序列而產生人源化抗體。用於產生人源化抗體之一般方法可參見Morrison,S.L.,1985,Science 229：1202-1207；Oi等人，1986,BioTechniques 4：214；以及Queen等人U.S.Pat.No.5,585,089、U.S.Pat.No.5,693,761與U.S.Pat.No.5,693,762，其內文以參考文獻之方式併入本文。該等方法包括，將可編碼來自重鏈或輕鏈至少一者之所有或部分免疫球蛋白Fv可變區的核酸序列進行分離、擴增及表現。此類核酸之來源為習於該項技術者所熟知，例如可得自用於製造可對抗所興趣多肽或其片段之抗體的融合瘤。然後，可將編碼該人源化抗體(或其片段)之重組DNA，轉殖入適當的表現載體中。
此外，可將人源化抗體(其中特定胺基酸已被取代、刪除或加入)與一骨架融合。較佳的人源化抗體在框架區中具有取代，例如用以增進與抗原之結合。舉例而言，人源化抗體可具有與供者框架殘基，或與受者框架殘基以外之其他胺基酸相同的框架殘基。為產生此類抗體，可將人源化免疫球蛋白鏈中所選擇、少數的受者框架殘基，以相對應之供者胺基酸供者進行置換。較佳之取代位置包括與CDR相鄰，或能夠與CDR相互作用之胺基酸殘基。從該供者選擇出胺基酸的條件係描述於U.S.Pat.No.5,585,089，其內文以參考文獻之方式併入本文。其他製造人源化抗體之技術係描述於Padlan等人EP519596 A1。
治療方法
本發明亦關於使用抗-顆粒溶解素抗體治療或預防一或多種上述病症，例如SJS、TEN或GVHD之方法。根據 本發明之具體實施例，所述之抗體可為單株抗體。此類抗體可為人源化抗體或人類抗體。根據本發明之具體實施例，係將有效量之所述抗體給予有需要此項治療或預防的個體。
可經由對於此類病症之標準診斷技術鑑定出欲受治療的個體。或者，可針對個體之顆粒溶解素基因表現或活性程度進行檢測。若個體樣本中之基因表現或活性程度高於採自正常人的樣本，則該個體為需要以有效量顆粒溶解素抑制劑進行治療之候選者。
“治療”意指基於治癒、減輕、緩和、補救、防止或改善所述病症、該病症之症狀、由於該病症而繼發之疾病狀態、或演變成該病症的素因之目的，將一抗體或其組成物投藥予個體。“預防”意指消除或減低上述病症之發生。如該項技術所了解，“預防”不需要完全(100%)避免此類病症之發生。反而，可減低所述病症之可能性或程度，即被認為成功的預防。
“有效量”意指能夠於受治療個體內產生醫療上所希望結果之量。所述之治療方法可單獨進行，或與其他藥物或療法結合。對於皮膚病症(例如SJS及TEN)之治療，治療劑可以局部或內部(例如藉由注射)之方式遞送。
所需劑量視所選擇之投藥途徑；調配物之特性；患者之疾病特性；個體大小、體重、表面基、年齡與性別；其他正進行施藥之藥物；及臨床醫師的判斷而有所不同。適宜之劑量範圍介於0.01-100mg/kg。此等劑量程度之差異可使用該項技術中已熟知用於最適化之標準實驗例常工作進行調整。將治療劑包封於適當遞藥載體(例如，聚合型微顆粒或可植入裝置)中可增加遞送效率。
上述實施例係證明本發明具體實施態樣之各種層面及實用性。雖然本發明已描述有限數量之實施例，習於該項技術者基於本發明揭示之幫助，可了解在不偏離本說明書所述反為之下能衍生出其他實施例。因此，本發明之範圍 應僅受限於本案之申請專利範圍。
<110> 生物技術發展中心
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Claims (18)

  1. 一種抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體具有中和顆粒溶解素活性之能力。
  2. 根據申請專利範圍第1項之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體係與具有SEQ ID NO：81之序列的顆粒溶解素之抗原決定基結合。
  3. 根據申請專利範圍第1項之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體係包含選自SEQ ID NO：82至SEQ ID NO：195之序列。
  4. 根據申請專利範圍第1項之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體係包含下列序列：SEQ ID NO：82直到SEQ ID NO：87，或SEQ ID NO：88直到SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：94直到SEQ ID NO：99，或SEQ ID NO：100直到SEQ ID NO：105，或SEQ ID NO：106直到SEQ ID NO：111，或SEQ ID NO：112直到SEQ ID NO：117，或SEQ ID NO：118直到SEQ ID NO：123，或SEQ ID NO：124直到SEQ ID NO：129，或SEQ ID NO：130直到SEQ ID NO：135，或SEQ ID NO：136直到SEQ ID NO：141，或SEQ ID NO：142直到SEQ ID NO：147，或SEQ ID NO：148直到SEQ ID NO：153，或SEQ ID NO：154直到SEQ ID NO：159，或 SEQ ID NO：160直到SEQ ID NO：165，或SEQ ID NO：166直到SEQ ID NO：171，或SEQ ID NO：172直到SEQ ID NO：177，或SEQ ID NO：178直到SEQ ID NO：183，或SEQ ID NO：184直到SEQ ID NO：189，或SEQ ID NO：190直到SEQ ID NO：195。
  5. 根據申請專利範圍第1項之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體係包含選自SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：76之序列。
  6. 根據申請專利範圍第1項之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體係包含下列序列：SEQ ID NO：39與SEQ ID NO：40，或SEQ ID NO：41與SEQ ID NO：42，或SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：44，或SEQ ID NO：45與SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：47與SEQ ID NO：48，或SEQ ID NO：49與SEQ ID NO：50，或SEQ ID NO：51與SEQ ID NO：52，或SEQ ID NO：53與SEQ ID NO：54，或SEQ ID NO：55與SEQ ID NO：56，或SEQ ID NO：57與SEQ ID NO：58，或SEQ ID NO：59與SEQ ID NO：60，或SEQ ID NO：61與SEQ ID NO：62，或SEQ ID NO：63與SEQ ID NO：64，或 SEQ ID NO：65與SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：67與SEQ ID NO：68，或SEQ ID NO：69與SEQ ID NO：70，或SEQ ID NO：71與SEQ ID NO：72，或SEQ ID NO：73與SEQ ID NO：74，或SEQ ID NO：75與SEQ ID NO：76。
  7. 根據申請專利範圍第1項之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體為單株抗體。
  8. 根據申請專利範圍第7項之抗-顆粒溶解素抗體，或其scFv或Fab片段，其中該抗體為人源化抗體或人類抗體。
  9. 一種用於治療或預防不希望之免疫反應病症的方法，其係包含將根據申請專利範圍第1項之抗體或其scFv或Fab片段投藥予有需要之患者。
  10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該抗體係與具有SEQ ID NO：81之序列的顆粒溶解素之抗原決定基結合。
  11. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該抗體係包含選自SEQ ID NO：82至SEQ ID NO：195之序列。
  12. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該抗體係包含下列序列：SEQ ID NO：82直到SEQ ID NO：87，或SEQ ID NO：88直到SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：94直到SEQ ID NO：99，或SEQ ID NO：100直到SEQ ID NO：105，或 SEQ ID NO：106直到SEQ ID NO：111，或SEQ ID NO：112直到SEQ ID NO：117，或SEQ ID NO：118直到SEQ ID NO：123，或SEQ ID NO：124直到SEQ ID NO：129，或SEQ ID NO：130直到SEQ ID NO：135，或SEQ ID NO：136直到SEQ ID NO：141，或SEQ ID NO：142直到SEQ ID NO：147，或SEQ ID NO：148直到SEQ ID NO：153，或SEQ ID NO：154直到SEQ ID NO：159，或SEQ ID NO：160直到SEQ ID NO：165，或SEQ ID NO：166直到SEQ ID NO：171，或SEQ ID NO：172直到SEQ ID NO：177，或SEQ ID NO：178直到SEQ ID NO：183，或SEQ ID NO：184直到SEQ ID NO：189，或SEQ ID NO：190直到SEQ ID NO：195。
  13. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該抗體係包含選自SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：76之序列。
  14. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該抗體係包含下列序列：SEQ ID NO：39與SEQ ID NO：40，或SEQ ID NO：41與SEQ ID NO：42，或SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：44，或SEQ ID NO：45與SEQ ID NO：46，或SEQ ID NO：47與SEQ ID NO：48，或 SEQ ID NO：49與SEQ ID NO：50，或SEQ ID NO：51與SEQ ID NO：52，或SEQ ID NO：53與SEQ ID NO：54，或SEQ ID NO：55與SEQ ID NO：56，或SEQ ID NO：57與SEQ ID NO：58，或SEQ ID NO：59與SEQ ID NO：60，或SEQ ID NO：61與SEQ ID NO：62，或SEQ ID NO：63與SEQ ID NO：64，或SEQ ID NO：65與SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：67與SEQ ID NO：68，或SEQ ID NO：69與SEQ ID NO：70，或SEQ ID NO：71與SEQ ID NO：72，或SEQ ID NO：73與SEQ ID NO：74，或SEQ ID NO：75與SEQ ID NO：76。
  15. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該不希望之免疫反應病症為SJS、TEN或GVHD。
  16. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該不希望之免疫反應病症為GVHD。
  17. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該抗體為單株抗體。
  18. 根據申請專利範圍第17項之方法，其中該抗體為人源化抗體或人類抗體。
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