TW201420110A

TW201420110A - 金線連（蓮）經微生物發酵之混合物及其用途

Info

Publication number: TW201420110A
Application number: TW101144806A
Authority: TW
Inventors: Chang-Chi Hsieh; Yi-Lun Huang; Yi-Chin Tsai; Chun-Chih Huang; Yu-Chi Lin; Hui-Chi Huang
Original assignee: New Bellus Entpr Co Ltd
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2014-06-01
Also published as: TWI484973B

Abstract

本發明關於一種金線連(蓮)經微生物發酵之代謝產物；本發明亦關於一種用於抑制脂肪組織生長或改善脂肪肝的醫藥組合物，包含有效劑量之本發明混合物。

Description

金線連(蓮)經微生物發酵之混合物及其用途

本發明係關於一種金線連(蓮)經微生物發酵之代謝產物所得的混合物，其可用於抑制肥胖與脂肪肝。

目前國人的飲食習慣，隨著經濟的高度成長以及飲食生活的歐美化，造成因為飲食精緻化，導致膳食纖維的攝取量偏低，而動物性脂肪攝取比例卻逐年增加，因此罹患肥胖、高脂血症、心臟病及大腸癌等生活習慣病(life-style diseases)的人口急遽上升。最近的調查報告指出，近年來肥胖問題日益嚴重，台灣目前大約就有四百萬人口的體重過重；WHO組織及美國疾病控制與預防中心公告：肥胖將是本世紀的最大健康殺手，肥胖不但會帶來心臟病、糖尿病、心血管與高血壓等疾病，並提高癌症的罹患率，加速罹患阿滋海默症、膽囊疾病與縮短壽命等疾病。

金線連(蓮)(Anoectochilus spp.)屬於蘭科(Orchidaceae)植物，藥用的包括台灣金線連(蓮)(Anoectochilus formosanus Hayata)、高雄金線連(蓮)(Anoectochilus Koshunensis Hayata，或稱恆春金線連)、福建金線連(蓮)、廣東金線連(蓮)等。其中台灣金線連(蓮)已被證實具有調節代謝疾病如降血壓、降血糖、降血脂等，另有抗骨質疏鬆、抗脂質過氧化、抗疲勞、護肝與抗過敏性氣喘的功效，為台灣珍貴的藥用資源，金線連(蓮)具備益生質作用，且民間有使用金線連(蓮)為減肥瘦身之保健產品，但其作用不明。研究指出，金線連(蓮)粗萃取有抑制3T3-L1細胞分化的趨勢，但作用劑量太高，此太高之劑量也或許為其毒性的展現。目前台灣市場上也出現許多金線連(蓮)保肝的產品，但其安全性仍為未知，許多研究認為金線連(蓮)具有一定的毒性，因此有學者研究指出，大鼠長期投與臺灣金線連(蓮)水粗萃取物，安全劑量在0.5克/公斤以下，並且有另外一份研究指出臺灣金線連(蓮)水粗抽取物在2.0克/公斤/天的劑量對母鼠、胎兒、新生兒沒有影響。初步研究顯示，金線連(蓮)粗萃液對3T3-L1細胞具有一定的毒性，IC₅₀約為28.5微克/毫升。在中草藥的利用上，使用微生物發酵有其附加價值，對於毒性成份的去除或分解，藥效的增強與可利用之二次代謝成份增加等優點。研究指出，某些真菌與乳酸菌發酵的金線連(蓮)，對正常細胞毒性有顯著性降低，並增加抑制3T3-L1細胞分化之功能，其使用劑量可降低至10~0.1微克/毫升之間。3T3-L1為前脂肪細胞，在脂肪細胞分化上為常用的細胞培養評估模式，3T3-L1細胞的分化可被類胰島素生長因子、醣皮質類固醇、脂肪酸或是可增加細胞內cAMP濃度的試劑等荷爾蒙或是脂肪酸刺激來促使細胞分化成為脂肪細胞。最常使用於促進脂肪細胞分化的方法是加入胰島素(insulin)、異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl-methyl-xanthine)、和地塞米松(dexamethasone)培養兩天後再以單一insulin培養兩天，此方法約有90%的細胞會分化為脂肪細胞。其分化的指標在分化的早期，轉錄因子蛋白C/EBPβ/δ會大量表現，藉由活化其他分化相關的基因，使得細胞的分化得以進行。在分化的中期，其他的轉錄因子蛋白例如C/EBPα、PPARγ開始表現，隨著分化程度的增加，在分化的晚期許多代謝脂肪的酵素開始表現，這些酵素例如脂肪酸合成酶(fatty acid synthase)、aP2(adipose binding protein 2)等，當細胞分化成為脂肪細胞，會在細胞質中開始累積三酸甘油脂(triglyceride)，因此也可藉由三酸甘油脂的堆積總量來作為分化的晚期指標。初步的結果顯示，金線連(蓮)以益生菌發酵之產物不僅毒性降低，對脂肪細胞分化有顯著抑制作用。因為金線連(蓮)有益生質的作用，為此將進一步分離出之益生菌依據其不同的發酵方法，評估其毒性的減低、抑制脂肪細胞分化、抑制脂質吸收等細胞體外試驗，以降低體脂肪分化及其累積、減脂與降低脂肪肝等三種動物模式來評估微生物發酵金線連(蓮)之新穎代謝產物的生物活性。

由於我國及多數開發國家之醫藥衛生日趨發達，人類平均壽命大幅提高，在進入中、高齡化社會時，所產生的一些文明病、肥胖或老化疾病，雖然可以經由西藥來進行治療，但因為擔心西藥所帶來的副作用及抗藥性，和現代人崇尚自然養生的風氣之下，由於台灣金線連(蓮)是一個獨特性的保健原料，進一步經由本計畫開發出來之發酵產程來開發更新穎的保建素材，使產品更具獨特性與功效性，不僅可降低成本、提升其經濟效益，更可開闢此具有地區產業特色之保健食品消費市場。

本發明提供一種混合物，包含經乳酸菌發酵之金線連溶液，其中乳酸菌包括LGG菌(Lactobacillus rhamnosus G.G.)或植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)。在一較佳實施例中，該金線連(蓮)為台灣金線蓮(Anoectochilus formosanus Hayata)。又在一較佳實施例中，該乳酸菌發酵之金線連溶液經過滅菌與離心。在另一較佳實施例中，該金線連(蓮)溶液發酵前金線連(蓮)之濃度為0.1-20%(重量/體積)。在另一更佳實施例中，該金線連(蓮)溶液發酵前金線連(蓮)之濃度為1-10%(重量/體積)。又在一較佳實施例中，該發酵金線連(蓮)溶液含有金線連(蓮)苷。在一更佳實施例中，該發酵混合物之金線連苷含量為50-250(毫克/毫升)。

本發明亦提供抑制脂肪組織生長之醫藥組合物，其包含一有效劑量之經乳酸菌發酵之金線連溶液之混合物，及醫藥上可接受之賦形劑或載劑。其中該經乳酸菌發酵之金線連溶液之混合物係由前述方法製備而得。

本發明又提供改善脂肪肝之醫藥組合物，其包含一有效劑量之經乳酸菌發酵之金線連溶液之混合物，及醫藥上可接受之賦形劑或載劑。其中該經乳酸菌發酵之金線連溶液之混合物係由前述方法製備而得。

本發明之醫藥組合物可與至少一種固體、液體或半液體狀之賦形劑或輔助劑一同形成適當的藥劑形式。其形式包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。藥錠一般所使用的載體(carrier)包括乳糖與玉米澱粉。一般也將潤滑劑(lubricating agent)，例如硬脂酸鎂(magnesium stearate)加至藥錠中。用於膠囊形式的稀釋劑(diluents)包括乳糖與經乾燥的玉米澱粉。當口服給藥為水性懸浮液或乳劑時，可懸浮或溶解有效成分(active ingredient)於與乳化或懸浮劑結合的油相(oily phase)。如果需要，可加入特定甜味、調味與著色劑。

用於藥學組成物的載體必須是「可接受的」，其與配方的有效成分相容(以及較佳為具有穩定有效成分之能力)並且不對病患有害。例如，助溶劑(例如環狀糊精(cyclodextrins))(其與一個或多個萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的複合物)，為了有效成分的傳送而作為藥理學上的輔藥。其他載體的例子包括膠狀二氧化矽(colloidal silicon dioxide)、硬脂酸鎂、纖維素與烷基硫酸鹽(sodium lauryl sulfate)。

在一較佳實施例中，本發明之經乳酸菌發酵之金線連溶液之混合物可降低血中三酸甘油脂或膽固醇。

本發明可能以不同的內容來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。金線連(蓮)經LGG菌發酵之產物縮寫為LrG-AF，金線連(蓮)經植物乳酸桿菌發酵之產物縮寫為Lp-AF。

實施例1：金線連(蓮)發酵萃取液

以下列菌種發酵的金線連(蓮)代謝產物做為材料

1.菌株來源

如上表所示。

2.微生物發酵金線連(蓮)模擬生產(10公升發酵槽)

在10公升醱酵槽體積中填充工作體積為7公升之最適生產培養基(克/毫升，金線連(蓮)1-10%、葡萄糖3-8%、蛋白腖1-5%、酵母粉1-5%、硫酸鎂0.1-0.5%、磷酸二氫鉀0.1-0.5%)，接種上述兩株菌之培養菌液280毫升，接菌量為4%(體積/體積)。10公升醱酵槽攪拌速率為0-100每分鐘轉數、溫度為25-42℃及醱酵液的酸鹼值控制於4.0-7.0之間，培養時間：16-24小時；再進行放大生產實驗(200公升/5噸發酵槽實驗)。

3.微生物發酵金線連(蓮)放大生產(200公升/5噸發酵槽)

在200公升醱酵槽體積中填充工作體積為170公升之最適生產培養基，接入前培養菌液4公升，接菌量為2%(體積/體積)。200公升醱酵槽攪拌速率為0-100每分鐘轉數、溫度為25-42℃，醱酵液的酸鹼值控制於4.0-7.0之間；經發酵培養16-24小時。確認菌株無污染後，將170公升菌液接入5噸發酵槽中，填充工作體積為4噸之最適生產培養基。在確認培養完成，經滅菌並離心即為金線連(蓮)發酵產品。

實施例2：生物活性分析 1.細胞分析方法

3T3-L1細胞以DMEM+10%胎牛血清培養細胞至穩定後，使用胰蛋白酵素將細胞切下以3×10⁵細胞/孔之細胞數種於24孔中培養兩天後加入細胞培養液、分化試劑及不同濃度的益生菌發酵之金線連(蓮)萃取液，細胞培養之濃度為200微克/毫升~10奈克/毫升，誘導分化第八天後時經由油紅染色法染色，觀察油滴的形成的差異。以全分化細胞為基礎值，各分化細胞以油紅染色法染色後，經萃取油紅染色法染劑，以分光光度計量測吸光度(吸光值520奈米)，經校正對照組(全分化細胞組)後得相對抑制率(圖2)。

2.油紅染色法染色

(1)倒掉DMEM培養基。

(2)加入500微升/孔10%福馬林在室溫下靜置10分鐘。

(3)倒掉福馬林後加入同體積福馬林靜置至少1小時後倒掉。

(4)以500微升/孔60%異丙醇潤洗後使其完全乾燥。

(5)加入200微升/孔油紅染色法染劑(0.1%油紅染色法染劑在60%異丙醇中)染色10分鐘。

(6)去除染劑後以蒸餾水潤洗四次。

(7)以異丙醇萃取油紅染色法染劑於96孔盤中於盤式分光光度計。

(8)於520 nm波長偵測吸光值。

3.動物試驗

以下列動物模式進行試驗，動物分組如下：

4.動物試驗分析方法

(1)血脂質-三酸甘油脂、總膽固醇濃度，實驗動物禁食12小時後，以二氧化碳麻醉，收集腹腔大動脈的血液離心後，利用酵素法及比色原理測量血中脂質濃度。

(2)肝臟脂質-三酸甘油脂濃度，於採完全血後，肝臟以生理食鹽水沖洗後，以Folch等人的方法(J.Folch,M.Lees and G.H.Sloane Stanley；A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues；August 23,1956；Journal of Biochemistry)萃取脂質後，測量肝臟三酸甘油脂濃度。

(3)血糖-實驗動物禁食12小時後，以血糖機檢測尾靜脈血糖濃度。

(4)肝功能-血中GPT(Glutamic Pyruvic Transaminase，麩氨基酸焦葡萄轉氨基酵素)活性，利用酵素法及比色原理測量血中GPT活性。

(5)體重-實驗期間定期測量老鼠體重，比較實驗開始時與實驗結束時之體重。

(6)體脂肪量-取出實驗動物腎周圍及睪丸周圍之脂肪組織後秤重。

(7)組織切片：組織切片用來評估脂肪組織與肝臟組織，組織經福馬林固定，以石蠟包埋後切片(5微米)，以蘇木紫/伊紅染色法染色，經脫水封片後，於光學顯微鏡下觀察拍照。另以4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal)免疫組織化學染色，觀察脂質過氧化所代謝的產物。

實施例3：金線連(蓮)苷分離與定性定量 1.金線連(蓮)苷定性

(1)取金線連(蓮)萃取層(金線連(蓮)苷含20%)1克溶於水3毫升，以逆相高效能液相層析管柱(Reprosil ODS，10*250毫米，5微米，RI detector)，在流動相為純水，流速為3毫升/分鐘。室溫之下金線連(蓮)苷滯留時間為9.54分鐘，將收集到金線連(蓮)苷與文獻上的核磁共振光譜、質譜之資料比對後確認無誤。

(2)金線連(蓮)苷光譜資料：分子式為C₁₀H₁₆O₈，分子量264。¹H-NMR(D₂O)4.61(d,2H,H-4a and H-4b,J=2.9 Hz),4.56(d,1H,H-10 J=7.7 Hz),3.92(dd,1H,H-6’a,J=2.2,12.5 Hz),3.73(dd,1H,H-6’b,J=5.5,12.5 Hz),3.50(dd,1H,H-3’,J=9.2,9.2 Hz),3.47(ddd,1H,H-5’,J=2.2,5.5,9.5 Hz),3.40(dd,1H,H-4’,J=9.2,9.5 Hz),3.28(dd,1H,H-2’,J=7.7,9.2 Hz),3.01(dd,1H,H-2a,J=6.2,18.3 Hz),2.73(d,1H,H-2b,J=18.3 Hz).¹³C NMR(MeOD)37.0(C3),62.7(C6’),71.4(C4’),74.8(C2’),75.3(C5),76.0(C4),77.9(C5’),78.0(C3’),103.6(C1’),179.0(C1)

2.金線連(蓮)苷定量

(1)逆相高效能液相層析管柱(Mightysil ODS，4.6*250毫米，5微米，ELSD detector)，在流動相為純水與乙腈比98.5：1.5，流速0.2毫升/分鐘，管柱溫度為室溫下分析，發現金線連(蓮)苷的滯留時間約為22.895分鐘(圖16)。

(2)分別精密量取適量金線連(蓮)苷對照品，用純水配制成標準溶液，其質量濃度範圍為100~400毫克/毫升(表3)，進樣量10微升，以化合物峰面積均值(Y)為縱座標，金線連(蓮)苷標準品進樣量(X，毫克/毫升)為橫座標，繪制標準曲線，得回歸方程式：Y=817.53X-73981，r=0.9967(圖15)。

(3)發酵前後金線連(蓮)樣品之金線連(蓮)苷含量檢測取發酵後金線連(蓮)樣品，以0.45微米濾膜過濾後分析其金線連(蓮)苷含量(圖14)，並將分析結果代入檢量線公式得到發酵後金線連(蓮)苷含量如下(表4)：

3.統計分析

數值資料以單因子變異數分析(One-way analysis of variance，One-way ANOVA)比較試驗的顯著性，經Duncan多變域分析(Duncan's New Multiple Range Test，DMRT)進行事後檢定後，分析組間差異，差異顯著性以P<0.05表示之。

實驗結果 一、以高脂飼料誘導肥胖動物試驗

金線連(蓮)發酵產物以C57BL/6小鼠進行不易形成體脂肪試驗，試驗動物經一週適應環境後以肥胖飼糧誘發肥胖，同時給予金線連(蓮)發酵物，經十二週後量測體重後計算增重，結果顯示(圖3)，對照組顯著高於正常組(P<0.05)，顯示肥胖造型成功；LrG-AF(650毫克/公斤)、Lp-AF(750毫克/公斤)與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)。以總增重的結果可以看出，LrG-AF與Lp-AF如同細胞試驗結果相符，有相對的降低高脂飼料誘導的肥胖。試驗動物經採集全血後量測血中總三酸甘油脂(serum total triglyceride)與血中總膽固醇(serum total cholesterol)含量(圖4)，結果顯示，對照組顯著高於正常組(P<0.05)，顯示肥胖造型後血脂肪顯著升高；在血中總三酸甘油脂的結果顯示LrG-AF與Lp-AF與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)；在血中總膽固醇的結果顯示LrG-AF與Lp-AF與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)。本結果顯示，LrG-AF與Lp-AF具有降低血中三酸甘油脂與總膽固醇之能力。經餵食金線連(蓮)發酵產物之試驗動物於十二週犧牲後，採集腎臟周圍脂肪組織與睪丸周圍脂肪組織稱重(圖5)，結果顯示，對照組腎臟周圍脂肪組織與睪丸周圍脂肪組織重量均顯著高於正常組(P<0.05)，顯示肥胖造型後體脂肪組織顯著增加，肥胖造型成功；在腎臟周圍脂肪組織重量的結果顯示LrG-AF、Lp-AF與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)。在睪丸周圍脂肪組織重量的結果顯示LrG-AF、Lp-AF與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)。上述脂肪組織之總重量可推斷體脂肪組織的含量(圖6)，結果顯示，對照組體組織重量均顯著高於正常組(P<0.05)，顯示肥胖造型後體脂肪組織顯著增加，肥胖造型成功；LrG-AF與Lp-AF與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)。結果顯示，LrG-AF與Lp-AF可顯著降低體重與體脂肪含量，且LrG-AF與Lp-AF具有降低血中三酸甘油脂與總膽固醇之能力。

二、以高果糖飲水(30%)誘導脂肪肝動物試驗

金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗，試驗動物經一週適應環境後以高果糖(30%)飲水誘發脂肪肝，同時給予金線連(蓮)發酵物，經八週後量測體重後計算增重，結果顯示如圖7，對照組顯著高於正常組(P<0.05)，顯示投予高果糖飲水會造成體重增加；LrG-AF-H(3.25克/公斤)、Lp-AF-L(0.75克/公斤)、Lp-AF-H(3.75克/公斤)與對照組相比有顯著降低(P<0.05)。肝臟重量方面，結果顯示如圖9，對照組顯著高於正常組(P<0.05)，顯示投予高果糖飲水會造成肝臟重量增加；LrG-AF-L及Lp-AF-H與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)。

由以上結果得知，LrG-AF、Lp-AF對脂肪肝的形成有抑制之做用，Lp-AF需使用較高劑量可達其效果。探究經高果糖誘導脂肪肝之形成過程是否影響血中總三酸甘油脂與總膽固醇的含量，經檢測後顯示，所有試驗組與對照組相比無顯著差異(圖8)。但針對肝臟中三酸甘油脂的含量確有不同的結果，對照組顯著高於正常組(P<0.05)，顯示投予高果糖飲水會增加肝臟三酸甘油脂含量(圖10)；Lp-AF與對照組相比均有顯著降低(P<0.05)。金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗，試驗動物經一週適應環境後以高果糖(30%)飲水誘發脂肪肝，同時給予金線連發酵物，經八週犧牲後採集肝臟經照相記錄後將肝臟浸泡中性福馬林，經石蠟包埋切片後蘇木精-伊紅染色法染色。從肝臟之外觀的觀察可看到，Lp-AF處理組之試驗動物肝臟顏色明顯較對照組趨近於正常(圖11)，在蘇木精-伊紅染色之組織切片中也可看出，Lp-AF之脂肪組織空泡較不明顯(圖12)，因為脂肪組織形成較少。將肝臟以冷凍包埋液包埋後切片，以4-hydroxynonenal進行組織免疫染色，分析脂質過氧化物之沉積，脂質過氧化物4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal)的產生也有明顯的降低(圖13)。

另一方面，由於以高果糖誘導脂肪肝形成的過程中，因為果糖較不易被胰島素所調控，試驗動物經長期高果糖餵食後會造成胰島素阻抗，造成葡萄糖耐受性之產生，因此進一步利用口服葡萄糖耐受性試驗評估胰島素阻抗之情況。結果發現，Lp-AF在口服投與葡萄糖後，較對照組能在60分鐘及90分鐘將血糖降低(表 5)。

先測量小鼠空腹血糖值(0分鐘)，再口服給予葡萄糖(2.0克/公斤)，並測量小鼠餵食葡萄糖後30分鐘、60分鐘、90分鐘以及120分鐘之血糖值，各試驗組於同一時間點進行統計比較，評估口服葡萄糖後對血糖的清除率，由口服葡萄糖耐受性試驗可推斷胰島素阻抗的程度。結果顯示，對照組顯著高於正常組(P<0.05)，顯示造型成功；LrGAF-L(0.65克/公斤)、LrGAF-H(3.25克/公斤)、Lp-AF-L(0.75克/公斤)、Lp-AF-H(3.75克/公斤)與對照組相比於不同時間點對血糖降低的程度以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，表中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖1、金線連(蓮)經細菌發酵產物之發酵流程。

圖2、金線連(蓮)發酵產物LrGAF與Lp-AF(10×、100×、1000×序列稀釋液)以3T3-L1細胞進行脂肪細胞分化試驗。

圖3、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高脂飼料進行不易形成體脂肪試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖4、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高脂飼料進行不易形成體脂肪試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖5、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高脂飼料進行不易形成體脂肪試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖6、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高脂飼料進行不易形成體脂肪試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖7、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖8、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖9、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖10、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗。結果以平均值±標準差表示，以單因子變異數分析後再以Duncan多變域分析進行事後檢定，圖中相異上標字母顯示組間有顯著性差異(P<0.05)。

圖11、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗，經八週犧牲後採集肝臟照相記錄。

圖12、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗，經八週犧牲後採集肝臟經照相記錄後將肝臟浸泡中性福馬林，經石蠟包埋切片後蘇木精-伊紅染色法染色。

圖13、金線連(蓮)發酵產物對C57BL/6小鼠投予高果糖(30%)飲水進行不易形成脂肪肝試驗，經八週犧牲後採集肝臟經照相記錄後將肝臟以冷凍包埋液包埋後切片，以4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal)進行組織免疫染色，分析脂質過氧化物之沉積。

圖14、金線連(蓮)發酵圖譜，依序為未發酵、金線連(蓮)經Lactobacillus rhamnosus G.G.發酵之產物(LrG-AF)、金線連(蓮)經Lactobacillus plantarum發酵之產物(Lp-AF)。

圖15、金線連(蓮)苷檢量線公式。

圖16、逆相高效能液相層析管柱，管柱溫度為室溫下分析，金線連(蓮)苷的滯留時間約為22.895 min。

Claims

一種混合物，包含經乳酸菌發酵之金線連(蓮)溶液，其中乳酸菌包括LGG菌(Lactobacillus rhamnosus G.G.)或植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)。
根據申請專利範圍第1項所述之混合物，其中該乳酸菌發酵之金線連(蓮)溶液經過滅菌與離心。
根據申請專利範圍第1項所述之混合物，其中該金線連(蓮)為台灣金線蓮(Anoectochilus formosanus Hayata)。
根據申請專利範圍第1項所述之混合物，其中該金線連(蓮)溶液發酵前金線連(蓮)之濃度為0.1-20%(重量/體積)。
根據申請專利範圍第1項所述之混合物，其中該發酵金線連(蓮)溶液含有金線連(蓮)苷。
根據申請專利範圍第5項所述之混合物，其中該發酵金線連(蓮)溶液之金線連(蓮)苷含量為50-250(毫克/毫升)。
一種用於抑制脂肪組織生長之醫藥組合物，其包含一有效劑量之申請專利範圍第1項所述之混合物，及醫藥上可接受之賦形劑或載劑。
根據申請專利範圍第7項所述之醫藥組合物，其中該經乳酸菌發酵之金線連(蓮)溶液可降低血中三酸甘油脂或膽固醇。
一種用於改善脂肪肝之醫藥組合物，其包含一有效劑量之申請專利範圍第1項所述之混合物，及醫藥上可接受之賦形劑或載劑。
根據申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其中該經乳酸菌發酵之金線連(蓮)溶液可降低血中三酸甘油脂或膽固醇。