JP7397906B2

JP7397906B2 - 代謝疾患の調節に用いるラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコン

Info

Publication number: JP7397906B2
Application number: JP2022078392A
Authority: JP
Inventors: 陳威仁; 朱慧芳; 唐宗寅; 魏▲ウィ▼珊; 葉美良; 曾明中
Original assignee: 生展生物科技股▲分▼有限公司
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2023-12-13
Anticipated expiration: 2042-05-11
Also published as: JP2023167314A

Description

FIRDI

BCRC 911125

本発明は発酵生成物の用途に関し、特に代謝疾患の調節に用いるラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンに関する。

肥満人口は年々増加しているが、その主な原因は望ましくない飲食習慣や運動習慣にある。肥満は、体内の代謝異常を引き起こすだけでなく、糖尿病、非アルコール性脂肪肝などの他の代謝疾患を招く場合もある。現在、世界保健機関、米国、カナダなどは、肥満を慢性疾患の１つとして発表している。

ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａｌｏｎｇａ）根茎中の主な活性成分はクルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄｓ、又はクルクミン、ウコン抽出物とも呼ばれる）であり、それは天然ポリフェノール類に属する。クルクミノイドには、クルクミンやデメトキシクルクミン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビスデメトキシクルクミン（ｂｉｓ－ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）が含まれている。ウコンは既にアジア諸国で伝統的な民間薬として使用されており、抗酸化、抗炎症及び抗ガンの特性を有することが研究により発見されている。クルクミンが強い生物活性を有することは多くの研究によって指摘されてきたが、クルクミンは難水溶性で、吸収が悪い、代謝が早い、生物学的利用能が低いといった構造的な特性に起因する問題がある。クルクミンの吸収の悪さや水溶性の低さという問題を克服して生体利用率における欠点を改善するために、現在ではコーティング技術やナノテクノロジーが多く採用されているが、上述の技術であっても処理後のクルクミンに生体内でそうした機能を発揮させてしまう。

本発明の主な目的は、代謝疾患の調節に用いるラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンを提供することにあり、それは本発明が開示する特殊な発酵工程により得るものであり、水溶性クルクミノイドなどの活性成分を有し、クルクミンの生物学的利用能や吸収率を効果的に向上させることができ、これにより、生体内の脂質代謝と血糖代謝を調節して代謝性疾患を予防又は改善する効果を達成せしめるものである。

上述の目的を達成できるようにするため、本発明は、発酵ウコンを代謝疾患の調節に用いる用途を提供するが、そのうち、発酵ウコンはウコンをラクチカゼイバチルス・パラカゼイにより発酵反応させて調製して得るものであり、有効量の本発明が開示する発酵ウコン又は有効量の発酵ウコンを含有する組成物を個体に投与することにより、高脂肪の飲食によって引き起こされる代謝性疾患や症状を効果的に改善又は予防することができる、というものである。そのうち、ＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＭＣ１～４０は台湾・財団法人食品工業発展研究所に受領番号９１ｘ２－１１１０４０６Ａとして２０２２年５月２６日に寄託され。

そのうち、本発明の実施例中、発酵ウコンは水溶性クルクミノイドを含有する。

具体的に、本発明の１つの実施例は、発酵ウコンをダイエット組成物の調製に用いる用途を提供するものである。

本発明の別の実施例は、発酵ウコンを、代謝不均衡関連疾患を治療又は／及び予防する組成物の調製に用いる用途を提供するものである。

そのうち、代謝不均衡疾患は、例えば非アルコール性脂肪肝、高血糖症など、高脂肪の飲食によって引き起こされるものである。

ＨｅｐＧ２細胞を異なる条件で培養した後、細胞内の脂肪滴含有量を分析した結果である。実例２の各マウス群の試験期間中における体重変化である。実例２中の各マウス群の肝臓組織にＨ＆Ｅ染色を行った結果である。実例２中の各マウス群の肝臓組織内におけるトリグリセリド含有量の分析結果である。実例２中の各マウス群の生殖腺脂肪組織にＨ＆Ｅ染色を行った結果である。実例２中の各マウス群の肝臓組織内におけるＳｉｒＴ１発現量の分析結果である。実例２中の各マウス群の肝臓組織内におけるＰＧＣ－１α発現量の分析結果である。実例２中の各マウス群に経口ブドウ糖負荷試験を行って測定した血糖の分析結果である。図６Ａ中の各マウス群において測定した血糖曲線下面積の分析結果である。実例２中の各マウス群の肝臓組織内におけるＧｌｕＴ２発現量の分析結果である。実例２中の各マウス群の肝臓組織内におけるｐＡｋｔ／Ａｋｔ発現量の分析結果である。

本発明は、代謝疾患の調節に用いるラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンを提供するものであり、そのうち、本発明が開示するラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンは、水溶性クルクミノイドを含み、脂肪蓄積、脂肪生成の抑制能力を有する。そのため、有効量の本発明が開示するラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンか又は本発明が開示するラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンを含有する組成物を個体に投与することにより、例えば非アルコール性脂肪肝、肥満症、高血糖症、糖尿病など、高脂肪の飲食によって誘発される代謝性疾患を効果的に予防又は治療することができる。

さらに、本発明が開示するラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンは、ウコンをラクチカゼイバチルス・パラカゼイにより発酵反応させて得るものであり、ここでいうラクチカゼイバチルス・パラカゼイとは、分類学的にラクチカゼイバチルス・パラカゼイ菌種に属するか、又はラクチカゼイバチルス・パラカゼイ菌種に分類される菌株を指している。一般的に、発酵反応は、ｐＨ値が４．０～６．０、発酵温度が３５～４０℃、発酵時間が２１～３６時間という条件を含み、使用する培地は、乳酸菌の培養に用い得るか又はラクチカゼイバチルス・パラカゼイが成長可能である、当業者に周知の培地である。

本発明がいう「組成物」とは、本発明が開示するラクチカゼイバチルス・パラカゼイ発酵ウコンを０．１％～１００％含有するものを指し、それは食品、医薬品、栄養補助食品でよく、必要に応じて様々な形態に調製することができ、それには散剤、液体、錠剤、丸剤及びカプセルなどが含まれるが、これらに限定されない。

以下、本発明の技術的特徴及び効果について説明するため、幾つかの実例を図とともに挙げて説明する。

以下の実例中で使用したＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＭＣ１～４０は、台湾・財団法人食品工業発展研究所に受領番号９１ｘ２－１１１０４０６Ａとして２０２２年５月２６日に寄託され。

以下の実例で使用したＨｅｐＧ２などの細胞は、当業者が容易に取得できる生体材料であるため、寄託する必要はない。

実例１：発酵ウコンの調製

グルコース１～２％、ペプトン１～２％、硫酸マグネシウム０．０１～０．０８％などを含有する培地でＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＭＣ１～４０の種菌を培養した。培地内の乳酸菌が対数増殖期に達したとき、それを主発酵培地中に播種して主発酵を行った。主発酵培地は、グルコース２～４％、ペプトン２～６％、０．０１～０．０８％硫酸マグネシウム、ウコン粉３％などを含み、発酵ｐＨは４．０～６．０にコントロールし、発酵温度は３５～４０℃、発酵時間は２１～３６時間とした。発酵の完了後、乾燥して発酵ウコン粉を得た。

微生物発酵を経ていないウコン粉と発酵ウコンをそれぞれ水、メタノールを抽出溶媒として抽出し、ウコンメタノール抽出液、ウコン水抽出液、発酵ウコンメタノール抽出液及び発酵ウコン水抽出液を得た。ＨＰＬＣによりメタノール抽出液と水抽出液を分析した。そのうち、ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。移動相は２％酢酸溶液とアセトニトリル（６：４（ｖ／ｖ））、分析カラムはＣ１８、検出波長は４２０ｎｍ、カラム温度は３５℃、流速は２ｍＬ／ｍｉｎ、試料注入量は１０μＬとした。

ＨＰＬＣの分析結果から分かるように、ウコンメタノール抽出液中の総クルクミノイド含有量は０．５１％であり、そのうち、ＢＤＭＣ（ｂｉｓｄｅｍｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）は０．１３％、ＤＭＣ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）は０．１８％、クルクミンは０．２０％であった。発酵ウコンメタノール抽出液中のクルクミノイド含有量は０．３９％であり、そのうち、ＢＤＭＣは０．１１％、ＤＭＣは０．１６％、クルクミンは０．１２％であった。ウコン水抽出液中からクルクミノイドは検出されなかったが、発酵ウコン水抽出液中のクルクミノイド含有量は０．１２％であった。

上述の結果から、発酵工程を経ていないウコン粉中のクルクミンは、クルクミンの疎水特性ゆえに水に溶けず、水溶液ではその含有量がほとんど検出できない一方で、ウコンをＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉなどの乳酸菌により発酵させてから得た発酵ウコンの分析では水中に０．１２％のクルクミノイドを含むことが示された。言い換えると、本発明が開示する発酵ウコン及びその発酵組成物は、水溶性が低いという欠点を効果的に改善できるということである。

実例２：細胞試験

ＨｅｐＧ２細胞（６×１０^４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートで２４時間培養した。そのうち、培地は１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地であり、培養条件は３７℃、５％二酸化炭素とした。細胞が７～８割成長するまで培養した時点で、ブランク培地、ＤＭＳＯ、１６ｍＭＦＦＡ（ｆｒｅｅｆａｔｔｙａｃｉｄｓ、遊離脂肪酸。以下、オレイン酸と略称）、１６ｍＭＦＦＡとクルクミン標準品（２５μＭ、ＤＭＳＯ中に溶解）、１６ｍＭＦＦＡと未発酵ウコン水溶液（２５μＭ）、１６ｍＭＦＦＡと発酵ウコン水溶液（２５μＭ）をそれぞれ加えて、さらに２４時間培養した。そのうち、発酵ウコン水溶液は、実例１に開示する方法を参照して調製した発酵ウコンと水で調製されて成るものである。培養完了後の各ウェルの細胞にオイルレッドＯ染色（ＯｉｌＲｅｄＯｓｔａｉｎｉｎｇ）を行い、細胞内脂肪滴の染色を行って分析した。結果は図１に示す通りである。

図１の結果から分かるように、オレイン酸処理を経たＨｅｐＧ２細胞は、脂肪滴が顕著に生じていた。クルクミン標準品と未発酵ウコン水溶液の処理後では、肝臓細胞内の脂肪蓄積量を低下せしめてはいるものの、その効果は本発明が開示する発酵ウコン水溶液が肝臓細胞内の脂肪滴生成を抑制する効果には及ばなかった。発酵ウコン水溶液は明らかに未発酵ウコン水溶液やクルクミン標準品よりも優れていた。上述の結果は、本発明が開示する発酵工程により調製された発酵ウコンが確かにウコンとその内の活性成分の脂質生成を抑制する効果を効果的に向上させ得ることを示している。即ち、本発明が開示する発酵ウコンは、肝臓細胞内の脂肪生成の調節能力を有しており、これにより非アルコール性脂肪肝や脂質代謝関連疾患の発生を抑制又は軽減する効果を達成し得る、ということである。

実例３：動物試験

６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性黒マウスを４つの群に分けて、それぞれ下記条件で１７週飼育した。

第１群：通常の餌（５００１Ｍ飼料）と通常の飲料水。

第２群：５０％高脂肪飼料と通常の飲料水。

第３群：５０％高脂肪飼料、通常の飲料水、飼料重量の５％の未発酵ウコン粉及び不活化菌（ＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＭＣ１～４０）。

第４群：５０％高脂肪飼料、通常の飲料水、飼料重量の５％の発酵ウコン粉及び不活化菌（ＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＭＣ１～４０）、そのうち、発酵ウコン粉は実例１に開示する工程を参考に調製して得たものである。

試験期間中、各マウス群の体重変化を記録した。結果は図２に示す通りである。

図２の結果から、第２群マウスの体重は明らかに第１群マウスを上回っており、高脂肪飼料の投与によってマウスの体重が確実に増加していること、第３群と第４群のマウスの体重はそれぞれ第２群マウスの体重よりも下がっていることが分かる。そのうち、第４群マウスの体重上昇レベルは明らかに第３群マウスよりも緩やかであり、第４群マウスの体重は第１群マウスとほぼ同じであった。

図２の結果は、本発明が開示する発酵ウコンが高脂肪の飲食のもとで引き起こされる肥満を効果的に軽減することができ、さらにその体重上昇を抑制する効果が発酵処理を経ていないウコンよりも明らかに優れていることを示している。言い換えると、本発明が開示する発酵ウコンは確かに高脂肪の飲食が誘発する体重上昇を生体内で抑制又は軽減することができ、これによりダイエットや代謝性関連疾患を予防する効果を効果的に達成し得るということである。

実例４：組織切片

実例３の各マウス群を犠牲にして、その肝臓組織を取り、切片をパラフィン包埋してからＨ＆Ｅ染色を行って、各群の肝臓中のトリグリセリド含有量を分析した。結果は図３Ａ及び図３Ｂに示す通りである。また、各マウス群の生殖腺脂肪組織を取り、組織片の切り出しとＨ＆Ｅ染色を行った。結果は図４に示す通りである。

図３Ａの結果から分かるように、第１群はマウスの肝臓組織内の細胞配列が整然としていて病変の現象はなく、第２群はマウスの肝臓組織中に明らかな白色の脂肪空胞（図中の矢印部分）を有し、脂質蓄積の現象があり、第３群及び第４群はマウスの肝臓組織内の白色脂肪空胞が明らかに第２群マウスを下回っていた。図３Ｂの結果から分かるように、第１群マウスと比べると、第２群マウスは肝臓中のトリグリセリド含有量が顕著に上昇しているが、第４群マウスは肝臓内のトリグリセリド含有量が明らかに第２群マウスを下回っていた。図４の結果から分かるように、第２群はマウスの生殖腺脂肪組織の大きさが明らかに第１群マウスよりも大きいが、第４群はマウスの生殖腺脂肪組織の大きさが明らかに第２群及び第３群のマウスよりも小さかった。

図３及び図４の結果は、高脂肪の飲食が確かに肝臓や他の組織において脂肪蓄積を生じさせ、個体の肥満や非アルコール性脂肪肝などの脂質代謝異常関連疾患の発生を引き起こすこと、また本発明が開示する発酵ウコンを個体に投与することで、高脂肪の飲食が誘導する組織内の脂肪蓄積やトリグリセリド含有量の状態を効果的に改善できることを示している。即ち、本発明が開示する発酵ウコンは、例えば非アルコール性脂肪肝、肥満など、高脂肪の飲食によって引き起こされる脂質代謝異常疾患を予防又は治療し得るということである。

実例５：タンパク質発現

実例３中の各マウス群を犠牲にして、その肝臓組織を取り、ウェスタンブロッティング法及び市販のＥＬＩＳＡキットで各マウス群の肝臓組織内のＳｉｒＴ１及びＰＧＣ－１αの発現を分析した。結果は図５Ａ及び図５Ｂに示す通りである。

図５Ａ及び図５Ｂの結果から分かるように、第４群マウスの肝臓組織内のＳｉｒＴ１とＰＧＣ－１αの発現量は、第２群及び第３群マウスよりも上昇していた。ＳｉｒＴ１はミトコンドリア生合成の主要な調節剤であり、エネルギー代謝に関与するＰＧＣ－１αの発現を促進する。そのため、図５Ａ及び図５Ｂの結果が示すように、本発明が開示する発酵ウコンは、ＳｉｒＴ１及びＰＧＣ－１αの発現を上昇させることによる脂肪酸の酸化促進能力を有することができる。即ち、本発明が開示する発酵ウコンは、高脂肪の飲食が誘発する肥満やそれに関連する代謝疾患の発生率を効果的に低減し得るということである。

実例６：血糖調節能力の分析

実例３中、各マウス群の試験第１６週において経口ブドウ糖負荷試験（ＯｒａｌＧｌｕｃｏｓｅＴｏｌｅｒａｎｃｅＴｅｓｔ，ＯＧＴＴ）を行った。まず各マウス群の空腹時血糖値をそれぞれ測定した後に、経管給餌方式で各マウス群に２ｇ／Ｋｇ体重のブドウ糖溶液を与えて、それぞれ給餌後の３０、６０、９０、１２０及び１８０分後に血糖値を測定した。結果は図６Ａに示す通りである。また、ＯＧＴＴの曲線下面積を分析した。結果は図６Ｂに示す通りである。

また、実例２の試験終了後、各マウス群の肝臓組織を取り、ウェスタンブロッティング法及び市販のＥＬＩＳＡキットで各マウス群の肝臓組織内のＧｌｕＴ２及びｐＡｋｔ／Ａｋｔなどのタンパク質発現量を分析した。結果は図７Ａ及び図７Ｂに示す通りである。

図６Ａの結果から分かるように、０分時点では、第２群マウスの空腹時血糖値は第１群マウスよりも高く、統計的に顕著であり、ブドウ糖溶液の経管給餌後の３０分時点で、第２群マウスの血糖濃度が上昇し始め、６０、９０及び１２０分時点では、第２群マウスの血糖濃度が次第に下降してはいるものの依然として第１群マウスの血糖濃度よりも高く、９０分時点では統計的に顕著であった。第４群マウスは、ブドウ糖溶液の経管給餌後の３０分時点に測定した血糖濃度が第２群マウスよりも低く、ブドウ糖溶液の経管給餌後の６０、９０及び１２０分時点で、第３群及び第４群マウスの血糖濃度はそれぞれ第２群マウスと顕著な差があった。図６Ｂの結果から分かるように、第２群マウスは比較的高いＡＵＣを有していたが、第４群マウスのＡＵＣは明らかに第２群マウスよりも低かった。

図７Ａ及び図７Ｂの結果から分かるように、本発明が開示する発酵ウコンは、ｐＡｋｔ／Ａｋｔの値を上昇させることができ、且つグルコース輸送タンパク質Ｇｌｕｔ２の発現量を顕著に増加させる。

図６及び図７の結果を総合すると、高脂肪の飲食は経口ブドウ糖負荷試験の血糖降下速度を落とすが、本発明が開示する発酵ウコンを投与した場合、飲食から３０分以内に血糖が急激に上昇する状態を効果的に改善し得ること、また本発明が開示する発酵ウコンは、ブドウ糖の代謝及び血糖の調節において優れた能力を有しており、これにより高脂肪の飲食が誘導する血糖を安定させ、血糖代謝異常と関連する疾患の発生を防ぐ効果が達成されることを示している。

Claims

ダイエット組成物の調製における発酵ウコンの使用であって、前記発酵ウコンは、ウコンをラクチカゼイバチルス・パラカゼイにより発酵反応させて調製して得るものであり、
前記ラクチカゼイバチルス・パラカゼイは台湾・財団法人食品工業発展研究所に受託番号ＢＣＲＣ９１１１２５として寄託されている、使用。
前記発酵ウコンは、水溶性クルクミノイドを含有する、請求項１に記載の使用。
高脂肪の飲食によって誘発される疾患、非アルコール性脂肪肝若しくは高血糖症を治療又は／及び予防するための組成物の調製における発酵ウコンの使用であって、前記発酵ウコンは、ウコンをラクチカゼイバチルス・パラカゼイにより発酵反応させて調製して得るものであり、
前記ラクチカゼイバチルス・パラカゼイは台湾・財団法人食品工業発展研究所に受託番号ＢＣＲＣ９１１１２５として寄託されている、使用。
前記発酵ウコンは、水溶性クルクミノイドを含有する、請求項３に記載の使用。