TW201418454A - 固定化酵素與其製法以及反應系統 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露固定化酵素與其製造方法，以及使用該固定化酵素的反應系統。在一實施例，矽石被矽烷化後，再先後以奈米金粒子、一胺基酸、一肽鍵連接劑修飾，再利用此修飾結構，鍵結一酵素。

Description

固定化酵素與其製法以及反應系統
本發明係關於一種固定化酵素與其製造方法及應用。
由於石化燃料有限與環保意識提高，必須儘快發展可再生的綠能源，以解決能源耗盡枯竭與環保問題。許多廢棄天然材料，例如枯樹枝、稻桿、食用過的玉蜀黍梗或芯、甘蔗渣、多年生草類(perennial grass)等，均可被再利用製作成再生的能源。主要因這些材料具有豐富的木質纖維素多醣類(lignocellulosicpolysaccharide)，可被水解以生產葡萄糖，而葡萄糖可進一步發酵以製造生質酒精(bioethanol)19。目前，有兩種主要方法：熱酸水解21與酵素水解4-8,25，被用來將這些材料轉換成碳水化合物，或後續再製成生質燃料。然而，以熱酸水解法分解含木質纖維素的生物物質，通常使用較激烈的反應條件，以至於會產生副產物以及有害的反應，導致環境汙染以及反應效率不高的現象。相較之下，酵素水解法幾乎不產生副產物，而且所需的反應條件通常是溫和的。然而，昂貴且無法重複使用的酵素導致成本過高，不利工業大量化生產。
為了降低酵素水解的成本，通常可透過酵素固定化，使得酵素可以重複被使用11,20。即透過一固體基材固定酵素，將同質(homogeneous)酵素轉變成異質(heterogeneous)酵素，如此酵素可輕易地被回收14，並重新再被使用。文獻提到許多固定酵素的方法，包含溶膠凝膠包覆(sol-gelencapsulation)25,5,8、物理吸附23、交聯15,17-18、化學鍵結3,9,14等等。然而，就長期重複使用而言，以化學鍵結製作的固定化酵素的效率似乎最高。在過去數年，學者已嘗試以各種固體基材製作固定化酵素。例如，Li等揭露將纖維素酶(cellulase)固定化在微脂粒(liposome)的外薄膜上18，Wu等揭露將纖維素酶固定在poly(vinyl alcohol)26，Tebeka等使用矽晶圓作為纖維素酶的固定基材23。其他材料如聚苯乙烯19、聚氨酯泡棉(polyurethane foam) 2、幾丁質(chitin)與尼龍(nylon)24，以及矽石(silica)3, 9, 13,17亦作為纖維素酶的固定基材。但是這些固定化方法，皆未能製作出一種用於水解木質纖維素時，可長期重複使用且高效率的固定化纖維素酶，以生產葡萄糖，更進一步製造生質酒精。
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本發明的目的在於提供一種固定化酵素與其製造方法，以及使用該固定化酵素的反應系統，其中，固定化酵素可被重複使用。
根據上述目的，本發明實施例提供一種固定化酵素的製造方法，包含下列順序步驟：提供一矽石；以一氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH，其中n為正整數)，將該矽石矽烷化；以複數個奈米金粒子修飾該矽烷化的矽石；以一具有一胺基(aminogroup)、一羧基(carboxylgroup)、一硫醇基(thiol group)支鏈的一胺基酸(amino acid)，修飾該被該奈米金粒子修飾的該矽石；以一具有二亞胺(diimide)的肽鍵連接劑(peptide bond coupling agent)，修飾被該胺基酸修飾的該矽石；鍵結一酵素於被該肽鍵連接劑修飾的該矽石。
根據上述目的，本發明實施例提供一種固定化酵素，具有下列結構：【化1】
其中，n為正整數
根據上述目的，本發明實施例提供一種反應系統，包含：一生物反應器，裝有一包含一固定化酵素及反應受質的溶液；一反應受質槽，裝有一反應受質溶液；一第一泵，將該反應受質溶液輸送至該生物反應器，使與固定化酵素進行一反應；以及一第二泵，將進行該反應後的該溶液，自該生物反應器中輸出；其中，該固定化酵素具有下列結構：【化1】
其中，n為正整數。
圖1顯示根據本發明一實施例的固定化酵素與其製法。本較佳實施例是將纖維素酶(cellulase)，透過奈米金粒子與其他化學物的協助，鍵結於矽石(silica)上。
如圖1所示，第一步驟是將矽石(silica)矽烷化(silanization)。取10.0g的矽石(silica)，並以200 mL，濃度6 M的氯化氫(HCl)溶液，在120℃下重複洗滌1 天，以活化矽石。已活化的矽石過濾後，利用去離子蒸餾水重複洗淨，直到濾液為中性。接著，將已活化的矽石，以110℃乾燥12 h。接著，取1 g乾燥的矽石與10.0 mmol的一氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH，其中n為正整數)，例如本實施例的3-氫硫基丙基三甲氧基矽烷 ((3-mercaptopropyl) trimethoxysilane，MPS)，浸沒溶於150 mL的甲苯中，並在室溫下，回流(refluxing)一天，使矽石矽烷化(silanized)。接著，將矽烷化的矽石過濾，以熱甲苯清洗後乾燥(110℃)5 h12。
於第二步驟，以奈米金粒子修飾矽烷化的矽石。首先，以王水(鹽酸：硝酸= 3:1 (v/v))清潔用於製備奈米金粒子的裝置，再以去離子水清潔之。接著，裝置注入100 mL濃度0.2 %的HAuCl4·3H2O溶液，並使之回流沸騰。然後添加2 mL濃度38.8 mM的檸檬酸鈉於沸騰的四氯金酸(HAuCl4)溶液中，以形成奈米金粒子。將此具有奈米金粒子的溶液冷卻，並以粒徑分析儀(Brookhaven90 Plus，美國紐約)測量奈米金粒子的粒徑。接著，將矽烷化的矽石與奈米金粒子，在室溫下混合並搖晃1 h，讓兩者反應使矽石表面被金奈米粒子修飾。繼之，將被金奈米粒子修飾的矽石過濾與乾燥。
於第三步驟，以半胱胺酸修飾被奈米金粒子所修飾的矽石。在室溫下，將被奈米金粒子修飾的矽石與半胱胺酸(L-cysteine)進行反應1h，半胱胺酸(L-cysteine)上的硫醇基(-SH)會與奈米金粒子形成化學鍵結。接著，將鍵結有半胱胺酸的矽石過濾，再以去離子蒸餾水清洗，以移除矽石上被吸附的非鍵結半胱胺酸。
於第四步驟，將鍵結有半胱胺酸的矽石與N,N’-二環己基碳化二亞胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)，於氯仿(chloroform)溶劑中，反應1小時，使鍵結有半胱胺酸的矽石再被DCC修飾。
於第五步驟，將上述被金奈米粒子、半胱胺酸、DCC修飾的矽石，與一酵素，例如纖維素酶，反應24 h，使酵素與矽石鍵結，然後過濾，再以去離子蒸餾水清洗此固定化的酵素，並乾燥之。
值得注意的是，本較佳實施例是將纖維素酶(cellulase)，透過奈米金粒子與其他化學物的協助，鍵結於矽石(silica)上。於本發明其他實施例，可利用相同鍵結機構，將其他酵素，鍵結於矽石或其他材料上。另外，矽石的形狀，除了顆粒狀，可依照需求變更為其他形狀。其他具有胺基(amino group)、羧基(carboxyl group)、硫醇基(thiol group)的胺基酸(amino acid)可能取代半胱胺酸。其他具有二亞胺結構的肽鍵連接劑(peptide bond coupling agent)可能取代N,N’-二環己基碳化二亞胺。其他氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH)，可取代MPS。另外，製程溫度與各溶液濃度亦可能做適度變更。
於本較佳實施例，所得到的固定化纖維素酶的結構如下：【化2】
上述實施例的固定化纖維素酶，利用其水解廢竹筷粉末，以驗證其效能，其中水解實驗分成批次式與連續式兩種。
廢竹筷的預處理
廢竹筷浸沒於去離子水中8 h後，將廢竹筷取出，再以去離子蒸餾水洗淨。清潔後的廢竹筷，以烘箱100℃加熱8h。接著，以研磨機研磨乾燥後的廢竹筷。然後，將研磨乾燥後的廢竹筷粉末儲存於烘箱，溫度維持在50℃。
批次水解
將2.5 g的廢竹筷粉末溶於1 L的去離子蒸餾水，再倒入一3-L的生物反應器，於121℃滅菌30 min。接著，將廢竹筷粉末溶液冷卻至45℃。秤取大約1.0 g的固定化纖維素酶，並以紫外(UV)光照射30 min後，置入上述1 L的廢竹筷粉末溶液中，以進行水解，反應條件為pH 4.0，45℃，攪拌速率為150 rpm4。在反應期間，每隔一固定時間，取樣1 mL的水解溶液(hydrolysate)進行分析，以監測碳水化合物產物(例如葡萄糖)的濃度。水解反應後，將固定化纖維素酶過濾回收，回收之固定化纖維素酶以去離子蒸餾水清洗，之後以40℃乾燥12 h。回收的固定化纖維素酶，儲存於冰箱中，儲存溫度約0℃，以恢復固定化纖維素酶的活性。接著，再以上述回收並恢復活性的固定化纖維素酶，進行另一批次的水解反應。
最佳反應條件
為求得以固化定纖維素酶水解廢竹筷粉末的最佳pH值，取100 mL具有0.25 g廢竹筷粉末以及0.1g的固定化纖維素酶(40 mg 纖維素酶 (g 矽石)-1)的溶液，以九種不同pH值(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0與11.0)進行水解反應。在反應之前，以紫外光照射固定化纖維素酶約30 min，再以0.01 M的硫酸 (H2SO4) 與0.01 N 的氫氧化鈉(NaOH)溶液調整pH值。水解溫度維持在45℃，攪拌速率維持在150 rpm。水解反應進行兩天。為決定最佳的pH值，以高效液相層析儀(HPLC)檢測所產生的碳水化合物，並計算固定化纖維素酶的活性。在決定最佳pH值後，同樣以3-L生物反應器決定最佳水解溫度：以1 L具有2.5 g 廢竹筷粉末的溶液，於最佳的pH值但不同的溫度(35℃、40℃、45℃、50℃與55℃)下，進行水解反應，尋找最佳的反應溫度。
連續水解反應系統
圖2顯示根據本發明實施例的一反應系統1。含有一3-L可自動控制的生物反應器10，裝有1 L含有0.3 g L-1的廢竹筷粉末與1.0g的固定化纖維素酶的懸浮溶液(40 mg 纖維素酶 (g矽石)-1)，於最佳pH值與最佳溫度下，進行四天連續水解。在反應之前，以紫外光照射固定化纖維素酶約30 min。在反應期間，新鮮的廢竹筷粉末溶液(0.2 g L-1)，利用一微量泵11，以0.5 mLmin-1的速率，連續輸送至生物反應器10中。同時，在生物反應器10中的水解液，利用另一微量泵12，以相同0.5 mLmin-1的速率，連續輸送至一收集瓶13中。同時，可線上利用一特製的取樣與注射裝置14，從生物反應器中取1mL的水解液樣品，再線上注入高效液相層析儀，以進行碳水化合物產物分析。而在收集瓶13內的水解液，也可進行取樣，並以高效液相層析儀分析。
於本實施例，生物反應器10是購自Bio Top(BTF-A，台灣台中)，其具有控制器，以控制反應器的攪拌速率、溫度、pH值等特性。此外，本實施例利用兩個微量泵11/12 (peristaltic pump，LongerpumpTM BT50-1J，中國大陸河北)，施行連續進料以及連續將水解液輸送至生物反應器外。一加熱攪拌器16(Corning，PC-420，美國加州)用於保持受質槽17於反應所需的溫度。利用購自Mettler (InPro 30301225，瑞士格瑞芬斯)的玻璃pH電極，偵測水解反應的pH值。水解產物使用高效液相層析儀15(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)系統分析，其中該系統包含一移動相傳輸泵(Jasco PU-1580，日本東京)，一具有20 μL取樣圈(Rheodyne 7125，Cotati，美國加州)的注射閥，一管柱加熱箱(column oven，Shimadzu CTO 6A，日本京都)，一氫離子交換分析管柱(Rezex ROA organic acid，300 × 7.8mm 內徑， Phenomenex，Torrance，美國加州)，其外具有一保護管柱(Rezex 4 × 3 mm 內徑，Phenomenex，Torrance，美國加州)，一折射率偵測器(Shimadzu RID-6A，日本京都)，以及一電腦，其具有層析資料分析軟體(SISC，台灣台北)。HPLC系統15可透過一特別設計的針筒裝置145與三向閥18與生物反應器10連結，用以執行碳水化合物的線上分析。
值得注意的是，本領域技藝人士，可根據需要，增加、變更或減少系統1的元件。此外，反應系統1各元件的規格、尺寸，可根據需求放大。反應的參數與流量，可做適當調整。
在連續水解反應中，纖維素的產率(yield)，是根據下列公式計算：【數1】(1)
其中Wglucose in reactor (g)是生物反應器10中的葡萄糖量，Wglucose in flask (g)是收集瓶13內的葡萄糖量，Winitial chopsticks powder (g)是生物反應器10中的起始竹塊粉末的量，Wadded chopsticks powder (g)是之後於反應期(四天)中，所添加於生物反應器10中的竹筷粉末的總量，其可利用下列公式計算：【數2】(2)
其中Cchopsticks powder (g L–1)是新鮮廢竹筷粉末溶液的廢竹筷粉末濃度，Vflow rate (mL min–1)是微量泵11輸送新鮮廢竹筷粉末溶液的流速，t (h)為水解反應進行的時間。
水解後，過濾回收固定化纖維素酶，再以去離子蒸餾水清洗，並以40℃乾燥12 h，秤量回收之固定化纖維素酶的重量，然後將之儲存於冰箱(0℃)中，以回復其活性。之後，可以此回收的固定化纖維素酶，進行另一次廢竹筷粉末水解。固定化纖維素酶的總活性(overall activity)以下列公式計算：【數3】(3)
其中Wglucose in reactor (g)是生物反應器10中，於總反應周期(例如四天)的葡萄糖總量，t為總反應時間(h)，Wcellulase (g)是水解反應所用的纖維素酶量，其可利用下列公式計算：【數4】(4)
其中0.04為理論上固定於矽石的纖維素酶的量，Wrecovered immobilized cellulose (g)是回收的固定化纖維素酶的重量，Winitial immobilized cellulose (g)是起始的固定化纖維素酶的重量。
高效液相層析儀分析
自生物反應器10取1 mL的背景溶液(未添加固定化纖維素酶的廢竹筷粉末溶液)樣品。接著，加入固定化纖維素酶後約5 min，取樣1 mL。之後，前8 h水解反應的取樣時間為每隔4h，水解反應第8 h以後至第48 h的取樣時間為每隔8 h，反應最後2 天的取樣時間為每隔12 h。以特製針筒14線上取樣1 mL，再線上注入HPLC15分析。同時，於相同的取樣時間，由收集瓶內以移液管取樣1 mL，再以離線(off-line)方式注入HPLC15分析。固定化纖維素酶水解液的碳水化合物產物的定量分析，可利用線上外部校正法5決定。因為HPLC15用於分析碳水化合物的移動相為純水，故分析過程不會產生二次污染，且有利於碳水化合物的回收。
在本發明的較佳實施例，將纖維素酶(cellulase)，透過奈米金粒子的協助，鍵結於矽石(silica)上。奈米金粒子以還原合成法24製成，其平均粒徑約為7.3 nm，此表示有大的表面積可供酵素固定化。於固定化程序中的所有材料，除了MPS外，其餘所有材料均具生物相容性(biocompatible)。此外，固定化的製程簡易，且大多數的步驟，可在大氣壓力與室溫條件下進行。
表一顯示以未固定化的纖維素酶，以及本發明較佳實施例固定化纖維素酶，分別水解廢竹筷粉末的活性。在相同反應條件pH 4.0及45℃5, 8, 25下，未固定化的纖維素酶的活性，明顯大於固定化纖維素酶的活性。此可能表示未固定化的纖維素酶，其質量傳遞(mass transfer)及與反應受質接觸(substrate contacting)或對接(docking)，比固定化纖維素酶來得好。然而，也有可能是pH 4.0及45℃，對於固定化纖維素酶的水解而言，並非是最佳的反應條件。另外，表一的結果亦顯示，固定化的纖維素酶可被重複使用至少數次，而活性僅略微降低。另一方面，纖維素酶的活性於初期降低後，後續的重複使用，即維持在一水平，未再造成活性持續減少，此表示習知技術中，回收酵素因活性大幅降低，無法重複使用的困難，已獲得突破。【表一a】
a於pH 4.0 與45°C 條件下，每次水解均使用2.5g廢竹筷粉末，40 mg的未固定化纖維素酶或40mg纖維素酶(g矽石)-1的酵素量，反應兩天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產量做計算。
固定化酵素的最佳反應條件
由於纖維素酶的3D立體結構，會因為固定在矽石上而改變；因此，固定化纖維素酶的活性於水解廢竹筷粉末的最佳反應條件，也跟著改變。因此，有必要重新檢視固定化纖維素酶，水解廢竹筷粉末的最佳反應條件，以便用於連續的水解反應中。
最佳pH值
最佳pH值的找尋，是以固定化纖維素酶，於恆溫震盪箱-燒瓶(shaker-flask)式水解廢竹筷粉末，其中水解溫度維持在45℃，並改變pH值從pH 3.0至pH 11.0。表二顯示在不同pH值下，水解反應獲得的葡萄糖量，以及固定化纖維素酶的活性。當pH值為4.0、7.0、8.0、10.0時，所製造的葡萄糖量、產率，以及固定化纖維素酶的活性大致相同；然而，反應於pH 8.0時，所產生的葡萄糖量，略大於其他pH值的產量。因此，pH 8.0為最佳pH值，且作為連續水解廢竹筷粉末的pH值。【表二a】
a每次水解均以2.5 g廢竹筷粉末，40 mg纖維素酶(g矽石)-1的酵素量，反應兩天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產量做計算。
最佳溫度
探討最佳溫度，是利用3-L生物反應器，以批次水解反應於pH8.0下實驗決定。使用35℃、40℃、45℃、50℃以及55℃五種不同溫度，分別進行批次水解反應。表三顯示不同溫度下的葡萄糖產量，以及纖維素酶的活性。顯然，在50℃時的產率以及纖維素酶的活性均最大。因此，以50℃作為之後連續水解的反應溫度。【表三a】
a每次水解均以2.5 g 廢竹筷粉末，40 mg纖維素酶(g矽石)-1的酵素量，反應兩天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產量做計算。
廢竹筷粉末的起始濃度
表四顯示以2.5 g L-1起始濃度的廢竹筷粉末，於批次反應下，葡萄糖的產量為186.6 mg，其產率相當低僅為7.5%。然而，當把起始濃度降低至0.3 g L-1，再進行批次水解反應，則葡萄糖總產量為137.8 g，相當於45.9%的產率。這些結果顯示，當使用之酵素量為40 mg (g矽石)-1時，廢竹筷粉末的起始濃度不能太高。為尋求於相同酵素使用量，連續水解廢竹筷粉末的最佳起始濃度，發明人進行了一系列的水解實驗，其中每次反應均變更受質(廢竹筷粉末)的起始濃度與連續進料濃度，並維持進料速率與出料速率為定值。表四顯示，當廢竹筷粉末的起始濃度降低至0.5g L-1，且廢竹筷粉末的連續進料濃度為0.2 g L-1時，連續廢竹筷水解的葡萄糖產量最高(683.1 mg)，但產率僅有63.5%，此表示有大量的廢竹筷粉末未被水解。相對之下，當廢竹筷粉末的起始濃度為0.2 g L-1，且廢竹筷粉末的連續進料濃度為0.2 g L-1時，連續廢竹筷水解的產率最高(82.6%)，但其葡萄糖總產量(641.1mg)並非最高，此表示固定化纖維素酶的活性小。因此，為了降低反應受質浪費率，並提高固定化纖維素酶的活性或葡萄糖的產率，後續的連續水解實驗，均以0.3 g L-1作為廢竹筷粉末的起始濃度，如此可獲得較高的固定化纖維素酶活性，較高的葡萄糖產量(649.1 mg)與產率(74.1 %)。此外，於表四中，由兩個具有高廢竹筷粉末起始濃度(1.0與2.5 g L-1)的實驗可發現葡葡糖產率均相當低，故本發明實施例之固定化纖維素酶進行水解反應，應該存在有受質抑制(substrate inhibition)效應。【表四a】
a於pH 8.0 與50°C 條件下，每次水解均以40 mg纖維素酶(g矽石)-1 的酵素量，反應四天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產生的量做計算，定義如先前所述。
固定化纖維素酶的重複使用性
以前述的方法分別製作三批固定化纖維素酶，並標示為固定化纖維素酶I、II與III，並以前述的最佳反應條件與參數，連續水解廢竹筷粉末，且此三批固定化纖維素酶均被重複使用。固定化纖維素酶連續水解廢竹筷粉末之重覆使用性，由實驗確認，其結果如圖3A至3F所示。
圖3A、3B與3C顯示以三批分別製作的固定化纖維素酶，於生物反應器中連續水解廢竹筷粉末，產生葡萄糖的結果，其中，固定化纖維素酶I、II與III分別被重複使用5次、3次、3次。通常，在連續水解反應進行第8小時至第24小時期間，可達到一穩定態(steady state)與一最大葡萄糖濃度。對於四天的反應期間，最大葡萄糖濃度介於167.8-182.7mg L-1。圖3D、3E與3F分別顯示此三批固定化纖維素酶，其連續水解廢竹筷粉末所產生的葡萄糖總量，亦即，於生物反應器內的葡萄糖量加上收集瓶內的葡萄糖量。當水解反應達到穩定態，葡萄糖總量的累積速率為定值。在4天反應期，此三批固定化纖維素酶的總葡萄糖累積總產量介於637.5至671.2 mg，相當於產率72.8-76.6%。然而，其中有少數葡萄糖是於反應條件pH 8.0與50℃下的背景水解(blankhydrolysis，未使用固定化纖維素酶的水解)所產生。由於以固定化纖維素酶水解產生葡萄糖，其速率大於背景水解的速率約15至20倍，因此，所得到的葡萄糖中，絕大部分是來自纖維素酶水解作用。
圖4A顯示三批分別製作的固定化纖維素酶的產率變異，以及重複使用的水解產率變異。固定化纖維素酶I被重複使用5次，然而，回收再使用的固定化纖維素酶，其水解產生葡萄糖的產率並不會大幅降低，甚至在第二次使用時，產率增加。固定化纖維素酶II與III也具有相同情形，雖然它們僅被使用三次。圖4B顯示固定化纖維素酶每次水解的活性，顯然其可用來解釋產率的變異。固定化纖維素酶的活性增加，可能是因為回收的固定化纖維素酶，具有先前水解反應所殘留的廢竹筷粉末，誘導一較大的起始活性，導致受質抑制作用降低。這些結果顯示本發明實施例的固定化纖維素酶，可被永久使用，其活性不會消退，甚至增加；此外，前述的固定化酵素製作方法具有再現性(reproducibility)。此兩特性，為文獻1-2,10-13,16,18,22-26未曾發現的。此表示本發明實施例的酵素固定化的方法，使得纖維素水解產生葡萄糖的工業利用性大增。
本發明實施例揭露透過奈米金粒子的協助，將酵素，例如纖維素酶，固定在矽石上。接著，由連續水解廢竹筷粉末，檢視固定化纖維素酶的再使用性。實驗結果發現，固定化纖維素酶可利用簡單的過濾方法回收，且至少被重複使用五次以上，同時在最佳溫度50℃與最佳pH值8.0重複反應時，其活性與前次反應的活性相當，甚至更高。在四天的水解反應期間，連續五次水解反應的產率介於72.8%至76.6%，比批次水解反應高很多。此外，由於水解反應與液相層析分析碳水化合物的介質均為水，整個連續水解製程符合綠色化學(green chemistry)原則。由於可利用液相層析法有效率地回收葡萄糖，使重複使用固定化纖維素酶連續生產葡萄糖，更有利於後續生質酒精(bioethanol)製造。總之，本發明實施例的固定化酵素，具有長期重覆使用性，且回收再使用時，其活性不會降低，如此可大幅降低由木質纖維素製造葡萄糖的成本，並在工業應用上具有競爭力。
以上所述僅為本發明之較佳實施例而已，並非用以限定本發明之申請專利範圍；凡其他未脫離發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請專利範圍內。
1．．．反應系統
10．．．生物反應器
10a．．．控制器
11．．．微量泵
12．．．微量泵
13．．．收集瓶
14．．．取樣與注射裝置
15．．．HPLC
16．．．加熱攪拌器
17．．．受質槽
18．．．三向閥
圖1顯示根據本發明一實施例的固定化酵素與其製造方法。圖2顯示根據本發明實施例的一反應系統。圖3A至3F顯示以本發明實施例的三批固定化纖維素酶，連續水解廢竹筷粉末的重覆使用性。圖4A顯示以本發明實施例的三批固定化纖維素酶，連續水解廢竹筷粉末的產率變異，以及重複使用的水解產率變異。圖4B顯示以本發明實施例的三批固定化纖維素酶，連續水解廢竹筷粉末的活性。
無。

Claims (13)

  1. 一種固定化酵素的製造方法，包含下列順序步驟： 提供一矽石； 以一氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH，其中n為正整數)，將該矽石矽烷化； 以複數個奈米金粒子修飾該矽烷化的矽石； 以一具有一胺基(amino group)、一羧基(carboxyl group)、一硫醇基(thiol group)支鏈的一胺基酸(amino acid)，修飾該被該奈米金粒子修飾的該矽石； 以一具有二亞胺(diimide)的肽鍵連接劑(peptide bond couplingagent)，修飾被該胺基酸修飾的該矽石；以及 鍵結一酵素於被該肽鍵連接劑修飾的該矽石。
  2. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該氫硫基三甲氧基矽烷係3-氫硫基丙基三甲氧基矽烷 ((3-mercaptopropyl) trimethoxysilane，MPS)。
  3. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該胺基酸係半胱胺酸(L-cysteine)。
  4. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該肽鍵連接劑係N,N’-二環己基碳化二亞胺 (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide)。
  5. 如申請專利範圍第1項的製造方法，其中該酵素係纖維素酶(cellulase)。
  6. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該固定化酵素可與一受質進行一反應，且經過濾、清洗、乾燥、冷藏後，該固定化酵素可重複使用。
  7. 一種固定化酵素，具有下列結構：其中，n為正整數。
  8. 如﹝請求項7﹞的固定化酵素，其中n等於3。
  9. 如﹝請求項7﹞的固定化酵素，其中該酵素係纖維素酶(cellulase)。
  10. 如﹝請求項7﹞的固定化酵素，其中該固定化酵素可與一受質進行一反應，且經過濾、清洗、乾燥、冷藏後，該固定化酵素可重複使用。
  11. 一種反應系統，包含： 一生物反應器，裝有一包含一固定化酵素的溶液； 一受質槽，裝有一受質溶液； 一第一泵，將該受質溶液輸送至該生物反應器，使與該溶液進行一反應；以及 一第二泵，將進行該反應後的該溶液，自該生物反應器中輸出；其中，該固定化酵素具有下列結構：其中，n為正整數。
  12. 如﹝請求項11﹞的反應系統，其中該酵素為纖維素酶。
  13. 如﹝請求項11﹞的反應系統，其中該固定化酵素可回收，經一程序處理後，可重新再使用。
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