TW201418454A - 固定化酵素與其製法以及反應系統 - Google Patents

固定化酵素與其製法以及反應系統 Download PDF

Info

Publication number
TW201418454A
TW201418454A TW101140501A TW101140501A TW201418454A TW 201418454 A TW201418454 A TW 201418454A TW 101140501 A TW101140501 A TW 101140501A TW 101140501 A TW101140501 A TW 101140501A TW 201418454 A TW201418454 A TW 201418454A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
immobilized
enzyme
cellulase
immobilized enzyme
vermiculite
Prior art date
Application number
TW101140501A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI461528B (zh
Inventor
鄭建業
張國鍾
Original Assignee
中原大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中原大學 filed Critical 中原大學
Priority to TW101140501A priority Critical patent/TWI461528B/zh
Priority to EP12192344.5A priority patent/EP2727999B1/en
Priority to US13/689,608 priority patent/US20140120600A1/en
Publication of TW201418454A publication Critical patent/TW201418454A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI461528B publication Critical patent/TWI461528B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明揭露固定化酵素與其製造方法，以及使用該固定化酵素的反應系統。在一實施例，矽石被矽烷化後，再先後以奈米金粒子、一胺基酸、一肽鍵連接劑修飾，再利用此修飾結構，鍵結一酵素。

Description

固定化酵素與其製法以及反應系統
本發明係關於一種固定化酵素與其製造方法及應用。
由於石化燃料有限與環保意識提高，必須儘快發展可再生的綠能源，以解決能源耗盡枯竭與環保問題。許多廢棄天然材料，例如枯樹枝、稻桿、食用過的玉蜀黍梗或芯、甘蔗渣、多年生草類(perennial grass)等，均可被再利用製作成再生的能源。主要因這些材料具有豐富的木質纖維素多醣類(lignocellulosicpolysaccharide)，可被水解以生產葡萄糖，而葡萄糖可進一步發酵以製造生質酒精(bioethanol)19。目前，有兩種主要方法：熱酸水解21與酵素水解4-8,25，被用來將這些材料轉換成碳水化合物，或後續再製成生質燃料。然而，以熱酸水解法分解含木質纖維素的生物物質，通常使用較激烈的反應條件，以至於會產生副產物以及有害的反應，導致環境汙染以及反應效率不高的現象。相較之下，酵素水解法幾乎不產生副產物，而且所需的反應條件通常是溫和的。然而，昂貴且無法重複使用的酵素導致成本過高，不利工業大量化生產。
為了降低酵素水解的成本，通常可透過酵素固定化，使得酵素可以重複被使用11,20。即透過一固體基材固定酵素，將同質(homogeneous)酵素轉變成異質(heterogeneous)酵素，如此酵素可輕易地被回收14，並重新再被使用。文獻提到許多固定酵素的方法，包含溶膠凝膠包覆(sol-gelencapsulation)25,5,8、物理吸附23、交聯15,17-18、化學鍵結3,9,14等等。然而，就長期重複使用而言，以化學鍵結製作的固定化酵素的效率似乎最高。在過去數年，學者已嘗試以各種固體基材製作固定化酵素。例如，Li等揭露將纖維素酶(cellulase)固定化在微脂粒(liposome)的外薄膜上18，Wu等揭露將纖維素酶固定在poly(vinyl alcohol)26，Tebeka等使用矽晶圓作為纖維素酶的固定基材23。其他材料如聚苯乙烯19、聚氨酯泡棉(polyurethane foam) 2、幾丁質(chitin)與尼龍(nylon)24，以及矽石(silica)3, 9, 13,17亦作為纖維素酶的固定基材。但是這些固定化方法，皆未能製作出一種用於水解木質纖維素時，可長期重複使用且高效率的固定化纖維素酶，以生產葡萄糖，更進一步製造生質酒精。
參考文獻：(1) Brown, K.R., Walter, D.G., Natan,M.J., 2000. Seeding of colloidal Au nanoparticle solutions. 2. improved control of particle size and shape. Chem. Mater.12, 306-313; (2) Chakrabarti, A. C., Storey, K. B., 1988. Immobilization of cellulaseusing polyurethane foam. Appl. Biochem. Biotechnol. 19, 189-207; (3) Chang, R. H.-Y., Jang, J., Wu,K. C.-W., 2011. Cellulase immobilized mesoporous silica nanocatalystsfor efficient cellulose-to-glucose conversion. Green Chem. 13, 2844-2850; (4)Cheng, C., 1998. Cellulase activity in differentbuffering media during waste paper hydrolysis by HPLC. J. Chin. Chem. Soc. 45,679-688; (5) Cheng, C., Chang, K.-C., 2007. Sampling, dilution, and loadingdevice-coupled high-performance liquid chromatography method for successiveon-line analyses of major carbohydrate products in immobilized cellulase hydrolysate of papercellulose. Anal. Sci. 23, 305-310; (6) Cheng, C., Chang, K.-C., Chen, C.-S., Pijanowska, D. G., 2011. Biosensor with nano-goldparticle modified pencil lead carbon electrode for long-term glucose monitoringof waste tree branch hydrolysis. J. Chin. Chem. Soc. 58, 1-10; (7) Cheng, C.,Chang, K.-C., Pijanowska, D. G., 2012. On-line flowinjection analysis using gold particle modified carbon electrode amperometric detection for real-time determination ofglucose in immobilized enzyme hydrolysate of wastebamboo chopsticks. J. Electroanal. Chem. 666, 32-41;(8) Cheng, C., Chen, C.-S., Hsieh, P.-H., 2010. On-line desalting andcarbohydrate analysis for immobilized enzyme hydrolysis of waste cellulosicbiomass by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., A 1217, 2104-2110; (9) Cho, E. J., Jung, S.,Kim, H. J., Lee, Y. G., Nam, K. C., Lee, H.-J., Bae,H.-J., 2012. Co-immobilization of three cellulases onAu-doped magnetic silica nanoparticles for the degradation of cellulose. Chem. Commun. 48, 886-888; (10) Ge, Y.,Burmaa, B., Zhang, S., Wang, S., Zhou, H., Li, W.,1997. Co-immobilization of cellulase and glucose isomerase by molecular deposition technique. Biotechnol. Tech. 11, 359-361; (11) Geddes, C.C., Peterson,J.J., Roslander, C., Zacchi,G., Mullinix, M.T., Shanmugam,K.T., Ingram, L.O., 2010. Optimizing the saccharificationof sugar cane bagasse using dilute phosphoric acid followed by fungal cellulases. Bioresour. Technol.101, 1851-1857; (12) Gupta, P., Kumar, V., Paul, S., J. 2010. Silicafunctionalized sulfonic acid catalyzed one-pot synthesis of 4,5,8a-Triarylhex-ahydropyrimido[4,5-d]pyrimidine-2,7(1H,3H)-dionesunder liquid phase catalysis. Braz. Chem. Soc. 21, 349-354; (13) Hartono, S.B., Qiao, S. Z., Liu, J., Jack, K., Ladewig, B. P., Hao, Z., Lu, G.Q. M., 2010. Functionalized mesoporous silica withvery large pores for cellulase immobilization. J.Phys. Chem. C. 114, 8353-8362; (14) Hung, T.-C., Fu, C.-C., Su, C.-H., Chen,J.-Y., Wu, W.-T., Lin, Y.-S., 2011. Immobilization of cellulaseonto electrospun polyacrylonitrile(PAN) nanofibrous membranes and its application tothe reducing sugar production from microalgae. EznymeMicrob. Tech. 49, 30-37; (15) Jain, P., Wilkins,E.S., 1987. Cellulase immobilized on modified nylonfor saccharification of cellulose. Biotechnol. Bioeng. 30,1057-1062; (16) Jones, P. O., Vasudevan, P. T., 2010.Cellulose hydrolysis by immobilized Trichoderma reesei cellulase. Biotechnol. Lett. 32, 103-106;(17) Kannan, K. R., Jasra,V., 2011. Improved catalytic hydrolysis of carboxymethyl cellulose using cellulase immobilized onfunctionalized meso cellular foam. J. Porous Mat. 18,409-416; (18) Li, C., Yoshimoto, M., Fukunaga, K., Nakao, K., 2007. Characterization and immobilization ofliposome-bound cellulase for hydrolysis of insolublecellulose. Bioresour. Technol. 98, 1366-1372; (19)Nakamura, Y., Sawada, T., Inoue, E., 2001. Enhanced ethanol production fromenzymatically treated steam-exploded rice straw using extractive fermentation.J. Chem. Technol. Biotechnol. 76, 879-884;(20) Qi, B.-K., Chen, X.-R., Shen,F., Su, Y., Wan, Y.-H., 2009. Optimization of enzymatic hydrolysis of wheatstraw pretreated by alkaline peroxide using response surface methodology. Ind.Eng. Chem. Res. 48, 7346-7353; (21) Shafizadeh, F.,Bradbury, A. G. W., 1979. Thermal degradation of cellulose in air and nitrogenat low temperatures. J. Appl. Polym. Sci. 23,1431-1442; (22) Shimokawa, T., Ishida, M., Yoshida,S., Nojiri, M., 2009. Effects of growth stage onenzymatic saccharification and simultaneous saccharification and fermentation of bamboo shoots forbioethanol production. Bioresour. Technol. 100,6651-6654; (23) Tebeka, I. R. M., Silva, A. G. L.,Petri, D. F. S., 2009. Hydrolytic activity of free and immobilized cellulose.Langmuir 25, 1582-1587 ; (24) Vaillant,F., Millan, A., Millan, P.,Dornier, M., Decloux, M., Reynes,M., 2000. Co-immobilized pectinlyase and endocellulase on chitin and Nylon supports. Process Biochem. 35, 989-996; (25) Wu, C.-C., Cheng, C., 2005. Astudy of the hydrolysis of waste paper cellulose with a vertically hangingimmobilized cellulase reactor and the reuse of theimmobilized cellulose. J. Chin. Chem. Soc. 52, 85-95; (26) Wu, L., Yuan, X., Shen, J., 2005. Immobilization of cellulasein nanofibrous PVA membranes by electrospinning.J. Membr. Sci. 250, 167-173.
本發明的目的在於提供一種固定化酵素與其製造方法，以及使用該固定化酵素的反應系統，其中，固定化酵素可被重複使用。
根據上述目的，本發明實施例提供一種固定化酵素的製造方法，包含下列順序步驟：提供一矽石；以一氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH，其中n為正整數)，將該矽石矽烷化；以複數個奈米金粒子修飾該矽烷化的矽石；以一具有一胺基(aminogroup)、一羧基(carboxylgroup)、一硫醇基(thiol group)支鏈的一胺基酸(amino acid)，修飾該被該奈米金粒子修飾的該矽石；以一具有二亞胺(diimide)的肽鍵連接劑(peptide bond coupling agent)，修飾被該胺基酸修飾的該矽石；鍵結一酵素於被該肽鍵連接劑修飾的該矽石。
根據上述目的，本發明實施例提供一種固定化酵素，具有下列結構：【化1】
其中，n為正整數
根據上述目的，本發明實施例提供一種反應系統，包含：一生物反應器，裝有一包含一固定化酵素及反應受質的溶液；一反應受質槽，裝有一反應受質溶液；一第一泵，將該反應受質溶液輸送至該生物反應器，使與固定化酵素進行一反應；以及一第二泵，將進行該反應後的該溶液，自該生物反應器中輸出；其中，該固定化酵素具有下列結構：【化1】
其中，n為正整數。
圖1顯示根據本發明一實施例的固定化酵素與其製法。本較佳實施例是將纖維素酶(cellulase)，透過奈米金粒子與其他化學物的協助，鍵結於矽石(silica)上。
如圖1所示，第一步驟是將矽石(silica)矽烷化(silanization)。取10.0g的矽石(silica)，並以200 mL，濃度6 M的氯化氫(HCl)溶液，在120℃下重複洗滌1 天，以活化矽石。已活化的矽石過濾後，利用去離子蒸餾水重複洗淨，直到濾液為中性。接著，將已活化的矽石，以110℃乾燥12 h。接著，取1 g乾燥的矽石與10.0 mmol的一氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH，其中n為正整數)，例如本實施例的3-氫硫基丙基三甲氧基矽烷 ((3-mercaptopropyl) trimethoxysilane，MPS)，浸沒溶於150 mL的甲苯中，並在室溫下，回流(refluxing)一天，使矽石矽烷化(silanized)。接著，將矽烷化的矽石過濾，以熱甲苯清洗後乾燥(110℃)5 h12。
於第二步驟，以奈米金粒子修飾矽烷化的矽石。首先，以王水(鹽酸：硝酸= 3:1 (v/v))清潔用於製備奈米金粒子的裝置，再以去離子水清潔之。接著，裝置注入100 mL濃度0.2 %的HAuCl4·3H2O溶液，並使之回流沸騰。然後添加2 mL濃度38.8 mM的檸檬酸鈉於沸騰的四氯金酸(HAuCl4)溶液中，以形成奈米金粒子。將此具有奈米金粒子的溶液冷卻，並以粒徑分析儀(Brookhaven90 Plus，美國紐約)測量奈米金粒子的粒徑。接著，將矽烷化的矽石與奈米金粒子，在室溫下混合並搖晃1 h，讓兩者反應使矽石表面被金奈米粒子修飾。繼之，將被金奈米粒子修飾的矽石過濾與乾燥。
於第三步驟，以半胱胺酸修飾被奈米金粒子所修飾的矽石。在室溫下，將被奈米金粒子修飾的矽石與半胱胺酸(L-cysteine)進行反應1h，半胱胺酸(L-cysteine)上的硫醇基(-SH)會與奈米金粒子形成化學鍵結。接著，將鍵結有半胱胺酸的矽石過濾，再以去離子蒸餾水清洗，以移除矽石上被吸附的非鍵結半胱胺酸。
於第四步驟，將鍵結有半胱胺酸的矽石與N,N’-二環己基碳化二亞胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)，於氯仿(chloroform)溶劑中，反應1小時，使鍵結有半胱胺酸的矽石再被DCC修飾。
於第五步驟，將上述被金奈米粒子、半胱胺酸、DCC修飾的矽石，與一酵素，例如纖維素酶，反應24 h，使酵素與矽石鍵結，然後過濾，再以去離子蒸餾水清洗此固定化的酵素，並乾燥之。
值得注意的是，本較佳實施例是將纖維素酶(cellulase)，透過奈米金粒子與其他化學物的協助，鍵結於矽石(silica)上。於本發明其他實施例，可利用相同鍵結機構，將其他酵素，鍵結於矽石或其他材料上。另外，矽石的形狀，除了顆粒狀，可依照需求變更為其他形狀。其他具有胺基(amino group)、羧基(carboxyl group)、硫醇基(thiol group)的胺基酸(amino acid)可能取代半胱胺酸。其他具有二亞胺結構的肽鍵連接劑(peptide bond coupling agent)可能取代N,N’-二環己基碳化二亞胺。其他氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH)，可取代MPS。另外，製程溫度與各溶液濃度亦可能做適度變更。
於本較佳實施例，所得到的固定化纖維素酶的結構如下：【化2】
上述實施例的固定化纖維素酶，利用其水解廢竹筷粉末，以驗證其效能，其中水解實驗分成批次式與連續式兩種。
廢竹筷的預處理
廢竹筷浸沒於去離子水中8 h後，將廢竹筷取出，再以去離子蒸餾水洗淨。清潔後的廢竹筷，以烘箱100℃加熱8h。接著，以研磨機研磨乾燥後的廢竹筷。然後，將研磨乾燥後的廢竹筷粉末儲存於烘箱，溫度維持在50℃。
批次水解
將2.5 g的廢竹筷粉末溶於1 L的去離子蒸餾水，再倒入一3-L的生物反應器，於121℃滅菌30 min。接著，將廢竹筷粉末溶液冷卻至45℃。秤取大約1.0 g的固定化纖維素酶，並以紫外(UV)光照射30 min後，置入上述1 L的廢竹筷粉末溶液中，以進行水解，反應條件為pH 4.0，45℃，攪拌速率為150 rpm4。在反應期間，每隔一固定時間，取樣1 mL的水解溶液(hydrolysate)進行分析，以監測碳水化合物產物(例如葡萄糖)的濃度。水解反應後，將固定化纖維素酶過濾回收，回收之固定化纖維素酶以去離子蒸餾水清洗，之後以40℃乾燥12 h。回收的固定化纖維素酶，儲存於冰箱中，儲存溫度約0℃，以恢復固定化纖維素酶的活性。接著，再以上述回收並恢復活性的固定化纖維素酶，進行另一批次的水解反應。
最佳反應條件
為求得以固化定纖維素酶水解廢竹筷粉末的最佳pH值，取100 mL具有0.25 g廢竹筷粉末以及0.1g的固定化纖維素酶(40 mg 纖維素酶 (g 矽石)-1)的溶液，以九種不同pH值(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0與11.0)進行水解反應。在反應之前，以紫外光照射固定化纖維素酶約30 min，再以0.01 M的硫酸 (H2SO4) 與0.01 N 的氫氧化鈉(NaOH)溶液調整pH值。水解溫度維持在45℃，攪拌速率維持在150 rpm。水解反應進行兩天。為決定最佳的pH值，以高效液相層析儀(HPLC)檢測所產生的碳水化合物，並計算固定化纖維素酶的活性。在決定最佳pH值後，同樣以3-L生物反應器決定最佳水解溫度：以1 L具有2.5 g 廢竹筷粉末的溶液，於最佳的pH值但不同的溫度(35℃、40℃、45℃、50℃與55℃)下，進行水解反應，尋找最佳的反應溫度。
連續水解反應系統
圖2顯示根據本發明實施例的一反應系統1。含有一3-L可自動控制的生物反應器10，裝有1 L含有0.3 g L-1的廢竹筷粉末與1.0g的固定化纖維素酶的懸浮溶液(40 mg 纖維素酶 (g矽石)-1)，於最佳pH值與最佳溫度下，進行四天連續水解。在反應之前，以紫外光照射固定化纖維素酶約30 min。在反應期間，新鮮的廢竹筷粉末溶液(0.2 g L-1)，利用一微量泵11，以0.5 mLmin-1的速率，連續輸送至生物反應器10中。同時，在生物反應器10中的水解液，利用另一微量泵12，以相同0.5 mLmin-1的速率，連續輸送至一收集瓶13中。同時，可線上利用一特製的取樣與注射裝置14，從生物反應器中取1mL的水解液樣品，再線上注入高效液相層析儀，以進行碳水化合物產物分析。而在收集瓶13內的水解液，也可進行取樣，並以高效液相層析儀分析。
於本實施例，生物反應器10是購自Bio Top(BTF-A，台灣台中)，其具有控制器，以控制反應器的攪拌速率、溫度、pH值等特性。此外，本實施例利用兩個微量泵11/12 (peristaltic pump，LongerpumpTM BT50-1J，中國大陸河北)，施行連續進料以及連續將水解液輸送至生物反應器外。一加熱攪拌器16(Corning，PC-420，美國加州)用於保持受質槽17於反應所需的溫度。利用購自Mettler (InPro 30301225，瑞士格瑞芬斯)的玻璃pH電極，偵測水解反應的pH值。水解產物使用高效液相層析儀15(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)系統分析，其中該系統包含一移動相傳輸泵(Jasco PU-1580，日本東京)，一具有20 μL取樣圈(Rheodyne 7125，Cotati，美國加州)的注射閥，一管柱加熱箱(column oven，Shimadzu CTO 6A，日本京都)，一氫離子交換分析管柱(Rezex ROA organic acid，300 × 7.8mm 內徑， Phenomenex，Torrance，美國加州)，其外具有一保護管柱(Rezex 4 × 3 mm 內徑，Phenomenex，Torrance，美國加州)，一折射率偵測器(Shimadzu RID-6A，日本京都)，以及一電腦，其具有層析資料分析軟體(SISC，台灣台北)。HPLC系統15可透過一特別設計的針筒裝置145與三向閥18與生物反應器10連結，用以執行碳水化合物的線上分析。
值得注意的是，本領域技藝人士，可根據需要，增加、變更或減少系統1的元件。此外，反應系統1各元件的規格、尺寸，可根據需求放大。反應的參數與流量，可做適當調整。
在連續水解反應中，纖維素的產率(yield)，是根據下列公式計算：【數1】(1)
其中Wglucose in reactor (g)是生物反應器10中的葡萄糖量，Wglucose in flask (g)是收集瓶13內的葡萄糖量，Winitial chopsticks powder (g)是生物反應器10中的起始竹塊粉末的量，Wadded chopsticks powder (g)是之後於反應期(四天)中，所添加於生物反應器10中的竹筷粉末的總量，其可利用下列公式計算：【數2】(2)
其中Cchopsticks powder (g L–1)是新鮮廢竹筷粉末溶液的廢竹筷粉末濃度，Vflow rate (mL min–1)是微量泵11輸送新鮮廢竹筷粉末溶液的流速，t (h)為水解反應進行的時間。
水解後，過濾回收固定化纖維素酶，再以去離子蒸餾水清洗，並以40℃乾燥12 h，秤量回收之固定化纖維素酶的重量，然後將之儲存於冰箱(0℃)中，以回復其活性。之後，可以此回收的固定化纖維素酶，進行另一次廢竹筷粉末水解。固定化纖維素酶的總活性(overall activity)以下列公式計算：【數3】(3)
其中Wglucose in reactor (g)是生物反應器10中，於總反應周期(例如四天)的葡萄糖總量，t為總反應時間(h)，Wcellulase (g)是水解反應所用的纖維素酶量，其可利用下列公式計算：【數4】(4)
其中0.04為理論上固定於矽石的纖維素酶的量，Wrecovered immobilized cellulose (g)是回收的固定化纖維素酶的重量，Winitial immobilized cellulose (g)是起始的固定化纖維素酶的重量。
高效液相層析儀分析
自生物反應器10取1 mL的背景溶液(未添加固定化纖維素酶的廢竹筷粉末溶液)樣品。接著，加入固定化纖維素酶後約5 min，取樣1 mL。之後，前8 h水解反應的取樣時間為每隔4h，水解反應第8 h以後至第48 h的取樣時間為每隔8 h，反應最後2 天的取樣時間為每隔12 h。以特製針筒14線上取樣1 mL，再線上注入HPLC15分析。同時，於相同的取樣時間，由收集瓶內以移液管取樣1 mL，再以離線(off-line)方式注入HPLC15分析。固定化纖維素酶水解液的碳水化合物產物的定量分析，可利用線上外部校正法5決定。因為HPLC15用於分析碳水化合物的移動相為純水，故分析過程不會產生二次污染，且有利於碳水化合物的回收。
在本發明的較佳實施例，將纖維素酶(cellulase)，透過奈米金粒子的協助，鍵結於矽石(silica)上。奈米金粒子以還原合成法24製成，其平均粒徑約為7.3 nm，此表示有大的表面積可供酵素固定化。於固定化程序中的所有材料，除了MPS外，其餘所有材料均具生物相容性(biocompatible)。此外，固定化的製程簡易，且大多數的步驟，可在大氣壓力與室溫條件下進行。
表一顯示以未固定化的纖維素酶，以及本發明較佳實施例固定化纖維素酶，分別水解廢竹筷粉末的活性。在相同反應條件pH 4.0及45℃5, 8, 25下，未固定化的纖維素酶的活性，明顯大於固定化纖維素酶的活性。此可能表示未固定化的纖維素酶，其質量傳遞(mass transfer)及與反應受質接觸(substrate contacting)或對接(docking)，比固定化纖維素酶來得好。然而，也有可能是pH 4.0及45℃，對於固定化纖維素酶的水解而言，並非是最佳的反應條件。另外，表一的結果亦顯示，固定化的纖維素酶可被重複使用至少數次，而活性僅略微降低。另一方面，纖維素酶的活性於初期降低後，後續的重複使用，即維持在一水平，未再造成活性持續減少，此表示習知技術中，回收酵素因活性大幅降低，無法重複使用的困難，已獲得突破。【表一a】
a於pH 4.0 與45°C 條件下，每次水解均使用2.5g廢竹筷粉末，40 mg的未固定化纖維素酶或40mg纖維素酶(g矽石)-1的酵素量，反應兩天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產量做計算。
固定化酵素的最佳反應條件
由於纖維素酶的3D立體結構，會因為固定在矽石上而改變；因此，固定化纖維素酶的活性於水解廢竹筷粉末的最佳反應條件，也跟著改變。因此，有必要重新檢視固定化纖維素酶，水解廢竹筷粉末的最佳反應條件，以便用於連續的水解反應中。
最佳pH值
最佳pH值的找尋，是以固定化纖維素酶，於恆溫震盪箱-燒瓶(shaker-flask)式水解廢竹筷粉末，其中水解溫度維持在45℃，並改變pH值從pH 3.0至pH 11.0。表二顯示在不同pH值下，水解反應獲得的葡萄糖量，以及固定化纖維素酶的活性。當pH值為4.0、7.0、8.0、10.0時，所製造的葡萄糖量、產率，以及固定化纖維素酶的活性大致相同；然而，反應於pH 8.0時，所產生的葡萄糖量，略大於其他pH值的產量。因此，pH 8.0為最佳pH值，且作為連續水解廢竹筷粉末的pH值。【表二a】
a每次水解均以2.5 g廢竹筷粉末，40 mg纖維素酶(g矽石)-1的酵素量，反應兩天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產量做計算。
最佳溫度
探討最佳溫度，是利用3-L生物反應器，以批次水解反應於pH8.0下實驗決定。使用35℃、40℃、45℃、50℃以及55℃五種不同溫度，分別進行批次水解反應。表三顯示不同溫度下的葡萄糖產量，以及纖維素酶的活性。顯然，在50℃時的產率以及纖維素酶的活性均最大。因此，以50℃作為之後連續水解的反應溫度。【表三a】
a每次水解均以2.5 g 廢竹筷粉末，40 mg纖維素酶(g矽石)-1的酵素量，反應兩天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產量做計算。
廢竹筷粉末的起始濃度
表四顯示以2.5 g L-1起始濃度的廢竹筷粉末，於批次反應下，葡萄糖的產量為186.6 mg，其產率相當低僅為7.5%。然而，當把起始濃度降低至0.3 g L-1，再進行批次水解反應，則葡萄糖總產量為137.8 g，相當於45.9%的產率。這些結果顯示，當使用之酵素量為40 mg (g矽石)-1時，廢竹筷粉末的起始濃度不能太高。為尋求於相同酵素使用量，連續水解廢竹筷粉末的最佳起始濃度，發明人進行了一系列的水解實驗，其中每次反應均變更受質(廢竹筷粉末)的起始濃度與連續進料濃度，並維持進料速率與出料速率為定值。表四顯示，當廢竹筷粉末的起始濃度降低至0.5g L-1，且廢竹筷粉末的連續進料濃度為0.2 g L-1時，連續廢竹筷水解的葡萄糖產量最高(683.1 mg)，但產率僅有63.5%，此表示有大量的廢竹筷粉末未被水解。相對之下，當廢竹筷粉末的起始濃度為0.2 g L-1，且廢竹筷粉末的連續進料濃度為0.2 g L-1時，連續廢竹筷水解的產率最高(82.6%)，但其葡萄糖總產量(641.1mg)並非最高，此表示固定化纖維素酶的活性小。因此，為了降低反應受質浪費率，並提高固定化纖維素酶的活性或葡萄糖的產率，後續的連續水解實驗，均以0.3 g L-1作為廢竹筷粉末的起始濃度，如此可獲得較高的固定化纖維素酶活性，較高的葡萄糖產量(649.1 mg)與產率(74.1 %)。此外，於表四中，由兩個具有高廢竹筷粉末起始濃度(1.0與2.5 g L-1)的實驗可發現葡葡糖產率均相當低，故本發明實施例之固定化纖維素酶進行水解反應，應該存在有受質抑制(substrate inhibition)效應。【表四a】
a於pH 8.0 與50°C 條件下，每次水解均以40 mg纖維素酶(g矽石)-1 的酵素量，反應四天。
b以HPLC分析，每個樣本分析四次(n = 4)。
c產率僅以葡萄糖產生的量做計算，定義如先前所述。
固定化纖維素酶的重複使用性
以前述的方法分別製作三批固定化纖維素酶，並標示為固定化纖維素酶I、II與III，並以前述的最佳反應條件與參數，連續水解廢竹筷粉末，且此三批固定化纖維素酶均被重複使用。固定化纖維素酶連續水解廢竹筷粉末之重覆使用性，由實驗確認，其結果如圖3A至3F所示。
圖3A、3B與3C顯示以三批分別製作的固定化纖維素酶，於生物反應器中連續水解廢竹筷粉末，產生葡萄糖的結果，其中，固定化纖維素酶I、II與III分別被重複使用5次、3次、3次。通常，在連續水解反應進行第8小時至第24小時期間，可達到一穩定態(steady state)與一最大葡萄糖濃度。對於四天的反應期間，最大葡萄糖濃度介於167.8-182.7mg L-1。圖3D、3E與3F分別顯示此三批固定化纖維素酶，其連續水解廢竹筷粉末所產生的葡萄糖總量，亦即，於生物反應器內的葡萄糖量加上收集瓶內的葡萄糖量。當水解反應達到穩定態，葡萄糖總量的累積速率為定值。在4天反應期，此三批固定化纖維素酶的總葡萄糖累積總產量介於637.5至671.2 mg，相當於產率72.8-76.6%。然而，其中有少數葡萄糖是於反應條件pH 8.0與50℃下的背景水解(blankhydrolysis，未使用固定化纖維素酶的水解)所產生。由於以固定化纖維素酶水解產生葡萄糖，其速率大於背景水解的速率約15至20倍，因此，所得到的葡萄糖中，絕大部分是來自纖維素酶水解作用。
圖4A顯示三批分別製作的固定化纖維素酶的產率變異，以及重複使用的水解產率變異。固定化纖維素酶I被重複使用5次，然而，回收再使用的固定化纖維素酶，其水解產生葡萄糖的產率並不會大幅降低，甚至在第二次使用時，產率增加。固定化纖維素酶II與III也具有相同情形，雖然它們僅被使用三次。圖4B顯示固定化纖維素酶每次水解的活性，顯然其可用來解釋產率的變異。固定化纖維素酶的活性增加，可能是因為回收的固定化纖維素酶，具有先前水解反應所殘留的廢竹筷粉末，誘導一較大的起始活性，導致受質抑制作用降低。這些結果顯示本發明實施例的固定化纖維素酶，可被永久使用，其活性不會消退，甚至增加；此外，前述的固定化酵素製作方法具有再現性(reproducibility)。此兩特性，為文獻1-2,10-13,16,18,22-26未曾發現的。此表示本發明實施例的酵素固定化的方法，使得纖維素水解產生葡萄糖的工業利用性大增。
本發明實施例揭露透過奈米金粒子的協助，將酵素，例如纖維素酶，固定在矽石上。接著，由連續水解廢竹筷粉末，檢視固定化纖維素酶的再使用性。實驗結果發現，固定化纖維素酶可利用簡單的過濾方法回收，且至少被重複使用五次以上，同時在最佳溫度50℃與最佳pH值8.0重複反應時，其活性與前次反應的活性相當，甚至更高。在四天的水解反應期間，連續五次水解反應的產率介於72.8%至76.6%，比批次水解反應高很多。此外，由於水解反應與液相層析分析碳水化合物的介質均為水，整個連續水解製程符合綠色化學(green chemistry)原則。由於可利用液相層析法有效率地回收葡萄糖，使重複使用固定化纖維素酶連續生產葡萄糖，更有利於後續生質酒精(bioethanol)製造。總之，本發明實施例的固定化酵素，具有長期重覆使用性，且回收再使用時，其活性不會降低，如此可大幅降低由木質纖維素製造葡萄糖的成本，並在工業應用上具有競爭力。
以上所述僅為本發明之較佳實施例而已，並非用以限定本發明之申請專利範圍；凡其他未脫離發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請專利範圍內。
1．．．反應系統
10．．．生物反應器
10a．．．控制器
11．．．微量泵
12．．．微量泵
13．．．收集瓶
14．．．取樣與注射裝置
15．．．HPLC
16．．．加熱攪拌器
17．．．受質槽
18．．．三向閥
圖1顯示根據本發明一實施例的固定化酵素與其製造方法。圖2顯示根據本發明實施例的一反應系統。圖3A至3F顯示以本發明實施例的三批固定化纖維素酶，連續水解廢竹筷粉末的重覆使用性。圖4A顯示以本發明實施例的三批固定化纖維素酶，連續水解廢竹筷粉末的產率變異，以及重複使用的水解產率變異。圖4B顯示以本發明實施例的三批固定化纖維素酶，連續水解廢竹筷粉末的活性。
無。

Claims (13)

  1. 一種固定化酵素的製造方法，包含下列順序步驟： 提供一矽石； 以一氫硫基三甲氧基矽烷((mercapto)trimethoxysilane，(CH3O)3Si-(CH2)n-SH，其中n為正整數)，將該矽石矽烷化； 以複數個奈米金粒子修飾該矽烷化的矽石； 以一具有一胺基(amino group)、一羧基(carboxyl group)、一硫醇基(thiol group)支鏈的一胺基酸(amino acid)，修飾該被該奈米金粒子修飾的該矽石； 以一具有二亞胺(diimide)的肽鍵連接劑(peptide bond couplingagent)，修飾被該胺基酸修飾的該矽石；以及 鍵結一酵素於被該肽鍵連接劑修飾的該矽石。
  2. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該氫硫基三甲氧基矽烷係3-氫硫基丙基三甲氧基矽烷 ((3-mercaptopropyl) trimethoxysilane，MPS)。
  3. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該胺基酸係半胱胺酸(L-cysteine)。
  4. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該肽鍵連接劑係N,N’-二環己基碳化二亞胺 (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide)。
  5. 如申請專利範圍第1項的製造方法，其中該酵素係纖維素酶(cellulase)。
  6. 如﹝請求項1﹞的製造方法，其中該固定化酵素可與一受質進行一反應，且經過濾、清洗、乾燥、冷藏後，該固定化酵素可重複使用。
  7. 一種固定化酵素，具有下列結構：其中，n為正整數。
  8. 如﹝請求項7﹞的固定化酵素，其中n等於3。
  9. 如﹝請求項7﹞的固定化酵素，其中該酵素係纖維素酶(cellulase)。
  10. 如﹝請求項7﹞的固定化酵素，其中該固定化酵素可與一受質進行一反應，且經過濾、清洗、乾燥、冷藏後，該固定化酵素可重複使用。
  11. 一種反應系統，包含： 一生物反應器，裝有一包含一固定化酵素的溶液； 一受質槽，裝有一受質溶液； 一第一泵，將該受質溶液輸送至該生物反應器，使與該溶液進行一反應；以及 一第二泵，將進行該反應後的該溶液，自該生物反應器中輸出；其中，該固定化酵素具有下列結構：其中，n為正整數。
  12. 如﹝請求項11﹞的反應系統，其中該酵素為纖維素酶。
  13. 如﹝請求項11﹞的反應系統，其中該固定化酵素可回收，經一程序處理後，可重新再使用。
TW101140501A 2012-11-01 2012-11-01 固定化酵素與其製法以及反應系統 TWI461528B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW101140501A TWI461528B (zh) 2012-11-01 2012-11-01 固定化酵素與其製法以及反應系統
EP12192344.5A EP2727999B1 (en) 2012-11-01 2012-11-13 Immobilized enzyme and its fabrication method and reaction system
US13/689,608 US20140120600A1 (en) 2012-11-01 2012-11-29 Immobilized enzyme and its fabrication method and reaction system

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW101140501A TWI461528B (zh) 2012-11-01 2012-11-01 固定化酵素與其製法以及反應系統

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201418454A true TW201418454A (zh) 2014-05-16
TWI461528B TWI461528B (zh) 2014-11-21

Family

ID=47148657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101140501A TWI461528B (zh) 2012-11-01 2012-11-01 固定化酵素與其製法以及反應系統

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20140120600A1 (zh)
EP (1) EP2727999B1 (zh)
TW (1) TWI461528B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112526003B (zh) * 2020-11-30 2022-06-07 合肥工业大学 一种超声波探头耦合剂自动灌注回收装置及其方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065928A2 (en) * 2003-01-22 2004-08-05 Bionanophotonics A/S Light induced immobilisation
TWI408371B (zh) * 2010-08-20 2013-09-11 私立中原大學 酵素電極與其製造方法
KR101347205B1 (ko) * 2011-10-27 2014-01-03 전남대학교산학협력단 맞춤형 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법

Also Published As

Publication number Publication date
EP2727999B1 (en) 2017-03-29
TWI461528B (zh) 2014-11-21
US20140120600A1 (en) 2014-05-01
EP2727999A1 (en) 2014-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hosseini et al. Covalent immobilization of cellulase using magnetic poly (ionic liquid) support: improvement of the enzyme activity and stability
Sillu et al. Cellulase immobilization onto magnetic halloysite nanotubes: enhanced enzyme activity and stability with high cellulose saccharification
Xu et al. Combined cross-linked enzyme aggregates as biocatalysts
Wang et al. Recyclable β-glucosidase by one-pot encapsulation with Cu-MOFs for enhanced hydrolysis of cellulose to glucose
Wang et al. Immobilization of cellulase on polyamidoamine dendrimer-grafted silica
Han et al. Construction of a multienzymatic cascade reaction system of coimmobilized hybrid nanoflowers for efficient conversion of starch into gluconic acid
Califano et al. Wrinkled silica nanoparticles: Efficient matrix for β-glucosidase immobilization
Hyeon et al. Design of nanoscale enzyme complexes based on various scaffolding materials for biomass conversion and immobilization
CN104195042A (zh) 一种纳米材料整体柱固载酶生物微反应器的制备及其应用
Cheng et al. Development of immobilized cellulase through functionalized gold nano-particles for glucose production by continuous hydrolysis of waste bamboo chopsticks
JP6458498B2 (ja) 糖液の製造方法
CN110468120A (zh) 一种含漆酶的铜纳米花及其制备方法
Bilal et al. Graphene-based nanoarchitectures as ideal supporting materials to develop multifunctional nanobiocatalytic systems for strengthening the biotechnology industry
CN112458140A (zh) 一种连续酶解制备碎米荠硒多肽的方法和碎米荠硒多肽
Cai et al. Chloroplast-inspired artificial photosynthetic capsules for efficient and sustainable enzymatic hydrogenation
WO2014129489A1 (ja) 糖液の製造方法
Li et al. Site-specific and high-loading immobilization of proteins by using cohesin–dockerin and CBM–cellulose interactions
Sulman et al. Cellulase immobilization on nanostructured supports for biomass waste processing
CN105542761A (zh) 一种以米糠为碳源制备荧光碳点的方法
TWI461528B (zh) 固定化酵素與其製法以及反應系統
CN103113425A (zh) 一种海藻糖和葡萄糖的分离方法
Yang et al. Improved catalytic performance of porcine pancreas lipase immobilized onto nanoporous gold via covalent coupling
Fatima Use of nanomaterials for the immobilization of industrially important enzymes
CN105866208A (zh) CeO2 @CNT核壳纳米线阵列及其制备方法和用途
Ahmad et al. Methods of enzyme immobilization on various supports