TW201417865A

TW201417865A - 鳳梨莖部凝集素的純化方法

Info

Publication number: TW201417865A
Application number: TW101142623A
Authority: TW
Inventors: Sor-Gan Tai; Chih-Wei Lin; Hsin-Fu Wang
Original assignee: Univ Nat Formosa
Priority date: 2012-11-15
Filing date: 2012-11-15
Publication date: 2014-05-16

Abstract

一種鳳梨莖部凝集素的純化方法，首先均質化一鳳梨莖部以得到一粗萃取液，其中粗萃取液實質上包含內生性澱粉及鳳梨莖部凝集素，且鳳梨莖部凝集素具有一澱粉結合位置，而內生性澱粉結合於澱粉結合位置上而形成一第一複合物。接著離心沉降粗萃取液以得到第一複合物，並乾燥第一複合物再以一競爭回溶液回溶第一複合物。競爭回溶液具有葡萄糖，而其競爭並取代結合於第一複合物之澱粉結合位置，以獲得一第二複合物。最後，使競爭回溶液之葡萄糖自第二複合物分離，以得到一純化之鳳梨莖部凝集素。

Description

鳳梨莖部凝集素的純化方法

本發明是有關於一種凝集素之純化方法，且特別是有關於一種應用於純化鳳梨莖部凝集素之方法。

醣結合蛋白，例如凝集素，具有與醣蛋白、醣脂質之結合親和力，能使紅血球、正常或變形細胞發生凝集的特性，且與醣分子及醣基化合物作可逆性之結合。然而在生物體中，雖然凝集素能夠辨識細胞外醣蛋白，其功能與抗體類似，具有專一性結合能力，但是屬於非免疫性結合蛋白。一般在活性測試上，凝集素因為具有兩個或多個碳水化合物結合位置，所以能夠與紅血球結合之後而產生類似聚合的反應。

凝集素發現於所有種類的生物，包含植物、脊椎動物、非脊椎動物、細菌和病毒，而穀類和豆類植物的凝集素是最早發現。由於對醣分子具有結合的專一性，在生物體中扮演著重要的角色，它參與了病毒、細菌和原生動物的感染過程；在植物體中，參與了防禦與細菌的共生現象；在動物體中，參與了細胞吸收與毒殺作用、分化、器官形成、淋巴球成熟和轉移等。

在應用上，凝集素被廣泛地應用於分離、純化醣蛋白、探討生物分子中醣基化的結構、疾病診斷、血型分類、抑制病毒複製、淋巴細胞篩選、研究細胞表面醣蛋白的生合成及功能、刺激淋巴細胞增生、研究蛋白質與特異性醣類之交互作用及發展凝集素所仲介之藥物輸送等應用工具。

鳳梨酵素具有凝集素的成份，對於葡萄糖與甘露醣具有結合專一性。在過去的研究中，凝集素的純化方式主要是利用親和力管柱進行純化，雖然相對於其他純化方式較為簡單，但其純化方式不夠簡便且成本高，且其純化後之蛋白質較不易保存。

因此，本發明之一態樣是在提供一種自生物樣品中純化凝集素的方法，在純化速度、樣品處理與保存上皆比傳統的管柱方法更加快速、方便。本發明成功應用此凝集素之純化方法於鳳梨莖部萃取物，並自鳳梨莖部萃取物中成功純化出分子量15千道爾頓(kDa)之鳳梨莖部凝集素(Ananas Comosus Lectin,ACL)。

本發明方法態樣之一實施方式是在提供一種鳳梨莖部凝集素的純化方法，依序包含：(a)均質化一鳳梨莖部以得到一粗萃取液，其中粗萃取液實質上包含內生性澱粉及鳳梨莖部凝集素，且鳳梨莖部凝集素具有一澱粉結合位置，粗萃取液中鳳梨莖部凝集素能結合於澱粉結合位置上而形成一第一複合物；(b)離心沉降粗萃取液以得到第一複合物；(c)乾燥第一複合物；(d)以一競爭回溶液回溶第一複合物，其中競爭回溶液具有預設濃度之葡萄糖，競爭回溶液之葡萄糖競爭並取代第一複合物結合於澱粉結合位置，以獲得一第二複合物； (e)將一不含葡萄糖之緩衝溶液取代具有第二複合物之競爭回溶液，使競爭回溶液之葡萄糖自第二複合物分離，以得到一純化之鳳梨莖部凝集素。

根據本發明一實施方式之一實施例，前述之鳳梨莖部凝集素的純化方法，其中步驟(c)之第一複合物之乾燥過程可為冷凍乾燥。

前述之鳳梨莖部凝集素的純化方法，其中預設濃度葡萄糖可為莫耳濃度0.2至1，亦可為0.5，且步驟(d)中，第一複合物回溶於競爭回溶液之回溶比例的重量百分比可為5至20，亦可為10。而步驟(d)中，競爭回溶液之pH值為4至6。

前述之鳳梨莖部凝集素的純化方法，其中步驟(a)之均質速率至少為18000每分鐘轉數(revolution per minute；rpm)，且均質時間至少為15秒。步驟(c)之離心速率至少為10000 rpm，且離心時間至少為5分鐘。

前述之鳳梨莖部凝集素的純化方法，其中步驟(a)及步驟(b)之間更包含一過濾步驟，用以濾除鳳梨莖部之渣體。

前述之鳳梨莖部凝集素的純化方法，其中步驟(b)及步驟(c)之間更包含一清洗步驟，用以清洗第一複合物以去除雜質。

藉由本發明，使得鳳梨莖部凝集素之純化變的單純，且步驟簡單，無需再經由習知蛋白質純化實驗的繁雜流程。例如，在生物樣品均質化之後所進行的各種色層分析法，例如陽離子交換色層分析法、親和性管柱色層分析法等等，其色層分析所用到之管柱成本高昂，且有一定的壽命，往往需要較高的經費才有辦法添購得到以進行純化之實驗。本創作之鳳梨莖部凝集素之純化方法，使得鳳梨莖部凝集素之純化不需要經由色層分析之方法即可純化而得，成本低、步驟少，使無論是產業界或者學術界可以利用本發明更快速、更進一步地研究鳳梨莖部凝集素。

本發明實施方式採用鳳梨植株的莖部為原料，品種可為台農17號金鑽鳳梨(Ananas comosus)，於田間採集後保存在室內的陰暗處備用。

請參閱第1圖，其為本發明之一實施方式的鳳梨莖部凝集素之純化方法流程圖。本發明之一實施方式的鳳梨莖部凝集素的純化方法可依序包含下列步驟。

步驟100：均質化一鳳梨莖部以得到一粗萃取液，其中粗萃取液實質上包含內生性澱粉及鳳梨莖部凝集素，且鳳梨莖部凝集素具有一澱粉結合位置，粗萃取液中鳳梨莖部凝集素能結合於澱粉結合位置上而形成一第一複合物。

步驟200：濾除鳳梨莖部之渣體。

步驟300：離心沉降粗萃取液以得到第一複合物。

步驟400：清洗以去除非第一複合物之雜質。

步驟500：冷凍乾燥第一複合物。

步驟600：以具有葡萄糖之一競爭回溶液回溶第一複合物，使競爭回溶液之葡萄糖競爭並取代結合於第一複合物之澱粉結合位置，以獲得一第二複合物。

步驟700：將一不含葡萄糖之緩衝溶液取代具有第二複合物之競爭回溶液，使葡萄糖自第二複合物分離以得到一純化之鳳梨莖部凝集素。

茲以下列試驗例詳細說明本發明，然本發明不侷限於下列試驗例揭示之內容。

試驗例1 鳳梨莖部凝集素最佳純化條件測定及以最佳純化條件純化鳳梨莖部凝集素之純度測定 試驗例1.1 鳳梨莖部總蛋白質萃取

取鳳梨莖約重500克，去除葉、皮後切成丁狀，加入鳳梨莖重量五倍的緩衝液，包含20毫莫耳濃度(mM)之三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、pH 8.0，以22000每分鐘轉數(revolution per minute；rpm)之均質速率均質30秒後，將其利用濾網過濾並取得鳳梨莖部之粗萃取液。此粗萃取液包含鳳梨莖部之總蛋白質，且此時鳳梨莖部之內生性澱粉結合於鳳梨凝集素之澱粉結合位置。

試驗例1.2 鳳梨莖部萃取物製備

下列試驗例之鳳梨莖部萃取物之製備流程為：取鳳梨莖約重500克，經去除葉、皮後切成丁狀後，加入鳳梨莖重量三倍(1500毫升)的均質緩衝液〔100 mM之磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer)、pH 6.0、內含0.1莫耳濃度(M)之氯化鈉(NaCl)〕，以22000 rpm均質30秒後，利用濾網過濾並取得粗萃取液。此粗萃取液包含鳳梨莖部之總蛋白質，且此時鳳梨莖部之內生性澱粉結合於鳳梨凝集素之澱粉結合位置。將粗萃取液以13000 rpm在4℃離心10分鐘，並分離上清液與沉降物。沉降物以均質緩衝液回溶，之後以13000 rpm在4℃離心10分鐘去除上清液，此動作重複三次。之後將清洗完的鳳梨莖部萃取物利用濾紙過濾回收，冷凍乾燥後保存在4℃。

試驗例1.3 蛋白質定量

下列試驗例之蛋白質定量分析係使用布拉福德蛋白濃度測定法(Bradford protein assay)。首先配製標準品，取10 mg牛血清白蛋白(BSA)溶於1 ml均質緩衝液中，之後經連續稀釋至100 μg/ml，再分別稀釋至5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80 μg/ml；接下來配製待測樣品，確認待測樣品pH為6.0後將樣品稀釋兩倍至三倍待測。上述標準品與未知樣品皆取200 μl再加入50 μl蛋白質染劑，混合均勻後在室溫作用10分鐘。之後取200 μl樣品加到96孔盤中，並測定吸光值，其使用之波長為595 nm。此布拉福德蛋白濃度測定法為此技術領域之具有通常知識者熟知之習知技藝，因此在此不加以贅述。

試驗例1.4 蛋白質條帶密度分析

下列試驗例之電泳圖譜蛋白質條帶的量化結果，是先將電泳完後膠片經退染完成後，加入逆滲透純水使得醋酸從膠片上溶出，再利用一影像密度測定儀(Bio-Rad GS-800 Calibrated Densitometer)將膠片掃描成影像建檔，掃描程式為Quantity one(Bio-rad)，膠片掃描完成後利用程式中條帶(Band)的工具列選項中的create contour圈選目標，之後選擇contour information即可得知蛋白質條帶的強度(intensity)，並可以此比較不同條件下之蛋白質之純化效果。

試驗例1.5 萃取最佳化試驗

萃取最佳化試驗是將大約重500克鳳梨莖，經去除其葉、皮後切成丁狀後，每個實驗取50克鳳梨莖，加入150克如下表一所列的不同pH值之均質緩衝液，以22000 rpm均質30秒後得到的粗萃取液進行分析將各實驗組的粗萃取液利用濾網過濾，再以13000 rpm在4℃離心10分鐘後，取上清液與沉降物，並以甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳(glycine SDS-PAGE)分析蛋白質分佈情形。

請參照第2A圖，其為包含鳳梨莖部凝集素之鳳梨莖部粗萃取液以不同pH值萃取之蛋白質分佈電泳圖。由電泳圖譜觀之，其顯示於高pH值(pH 9、pH 10)與低pH值(pH 3、pH 4)的條件中，上清液中15 kDa的蛋白質濃度明顯較近中性的pH值(pH 6、pH 7)高，又以pH 6最低。

請同時參照第2B圖，其為電泳圖譜之蛋白質條帶密度量化結果。膠片上蛋白質條帶經染色密度掃描及量化，數據顯示以pH 6之緩衝液萃取之上清液，15kDa蛋白質含量最低，而pH 4條件中上清液存在最大量的15 kDa蛋白質。

試驗例1.6 鳳梨莖部凝集素之純化條件測定

不同濃度鳳梨莖萃取物對葡萄糖競爭回溶分析的方法係取出如前述存放在4℃的冷凍乾燥之鳳梨莖部萃取物，並置於室溫中回溫。於微量離心管中精稱每管100、200、300、400毫克(mg)的鳳梨莖部萃取物，並將其溶於1 ml緩衝液(50 mM phosphate buffer,pH 6.0、0.5 M glucose、0.1 M NaCl)，利用37℃、200 rpm之條件進行水平震盪30分鐘，以16250 xg之條件離心10分鐘後，吸取上清液，並藉由glycine SDS-PAGE分析最佳凝集素純化條件。

請參照第3A圖，其為自不同濃度鳳梨莖部萃取物純化鳳梨莖部凝集素之條件測試。由圖中觀之，鳳梨莖萃取物依不同濃度與葡萄糖競爭回溶鳳梨莖部凝集素，膠片中回溶的鳳梨莖部凝集素蛋白質條帶的深淺與添加入的萃取物重量成正比，但其電泳膠片經由量化處理，並將各濃度之鳳梨莖部凝集素的蛋白質條帶密度換算為每一公克萃取物之蛋白質條帶密度(即單位萃取物公克之鳳梨莖部凝集素蛋白質條帶密度)後判斷(第3B圖)，以濃度100 mg/ml(1：10 g/ml)之競爭回溶純化之效率為最佳(相對密度=鳳梨莖部凝集素蛋白質條帶密度/相對應之萃取物的公克數)。

試驗例1.7 鳳梨莖部萃取物在不同pH條件下溶解度測定

取出如前述存放在4℃的冷凍乾燥之鳳梨莖部萃取物，置於室溫中回溫。精稱每管100 mg於微量離心管中，加入各種pH值的緩衝液1 ml(50mM citrate,pH 4、pH 5；50 mM phosphate pH 2、pH 6、pH 7；50 mM Tris-HCl,pH 8、pH 9皆含0.1 M NaCl)，於37℃、200 rpm、作用30分鐘，之後16250 xg離心10分鐘，吸取上清液製備成glycine SDS-PAGE樣品後，以glycine SDS-PAGE分析不同pH值的緩衝液對凝集素回溶的影響。

請參照第4圖，其為鳳梨莖部萃取物在不同pH條件下之溶解度分析之甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。如第4圖所示，在pH 2條件時，存在於鳳梨莖部萃取物中的鳳梨莖部凝集素水溶性最高，在pH 6和pH 7幾乎不具水溶性，在pH 8和pH 9只有些微的水溶性，但受限於pH 2酸度與氫離子濃度過於高，恐怕對蛋白質的安定性與活性有影響，所以pH 4的緩衝液作為競爭回溶的條件為最佳。

試驗例1.8 葡萄糖競爭性回收鳳梨莖部凝集素

取出如前述之冷凍乾燥後的鳳梨莖部萃取物，置於室溫中回溫。根據前述試驗例1.6所測定純化條件最佳之鳳梨莖部萃取物：緩衝液=1：10的比例取出30克鳳梨莖部萃取物，將其回溶在300 ml的競爭回溶液(50 mM citrate buffer pH 4.0、0.5 M glucose、0.1 M NaCl)中，在4℃條件中利用磁石攪拌器作用1小時。之後以27670 xg於4℃離心10分鐘，回收上清液，沉降物再以同樣條件作用。將所得的上清液利用超過濾設備濃縮後，與不含葡萄糖之緩衝液(50 mM citrate buffer pH 4.0、0.1 M NaCl)進行溶液取代，取代至葡萄糖濃度低於0.1 mM，此時因為蛋白質長時間於低pH值環境下易造成結構之不穩定性，因此將pH值調整至6.0，並且回收溶於不含葡萄糖之緩衝液當中之鳳梨莖部凝集素。

試驗例1.9 西方點墨法(western blot)確認純化之蛋白質為鳳梨莖部凝集素

鳳梨莖部粗萃蛋白、上清液、沉降物以及glycine SDS-PAGE電泳結束後之膠片與聚二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)排列在轉漬匣上，並將轉漬匣放入轉漬槽中，轉漬槽含有轉漬液(25 mM Tris,192 mM Glycine,20% methanol)，並以0.5安培之電流轉漬60分鐘。將PVDF放入15 ml阻隔液〔含有3%凝膠(gelatin) 〕在室溫中於震盪器30分鐘，倒掉阻隔液並倒入一級抗體溶液(1% gelatin含3000倍濃縮之anti-rACL抗體)，在室溫中於震盪器作用隔夜。倒掉抗體溶液後用逆滲透純水清洗，再用含有10%曲拉通X-100(Triton X-100)之三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝液(TBS/T)清洗10 min兩次，洗完後再加入二級抗體溶液(15 ml 1% gelatin含3000倍濃縮之anti-rabbit antibody conjugate HRPase)，在室溫中於震盪器作用4 hr，之後用逆滲透純水清洗，再用TBS/T清洗10分鐘兩次。之後混合加入呈色劑A(75 ml三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝液、45 ml過氧化氫)、呈色劑B(15 ml甲醇、45 mg HRP呈色試劑)，避光並呈色。

請參照第5圖，其係繪示鳳梨莖部蛋白質與凝集素基因表現蛋白質之甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖與西方點墨膠片圖，其中(a)部分為甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖；(b)是西方點墨膠片圖。將前述純化所得到的鳳梨莖萃取物使用葡萄糖競爭後、濃縮、緩衝液取代，經過西方點墨(western blot)可確定純化的15 kDa蛋白質為鳳梨莖部凝集素。

試驗例1.10 藉由血球凝集測試純化之鳳梨莖部凝集素之純度

本實驗採用人類O型血液。利用採血針刺穿手指表皮組織，用手擠壓傷口讓血液滴進15 ml離心管中，內含1 ml 100 mM EDTA作為抗凝血劑，血液取約100 μl後加入血液緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 7.4含0.1 M NaCl)至15 ml，以600 xg離心5分鐘後，去除上清液，之後再加入15 ml血液緩衝液，輕拍回溶後，再以600 xg離心5分鐘，此清洗動作重複三次。清洗結束後，將血球回溶，利用分光光度計將血球回溶至O.D.₆₀₀值約為1.5之濃度。

以前述血球濃度進行血球凝集實驗，每個實驗總體積為200 μl。首先取出一個96-V型孔盤，第一孔加入50 μl凝集素後，經由血液緩衝液1/2連續稀釋後，可得各個濃度的凝集素溶液，之後於每個格子加入50 μl血球混合均勻後，剩餘體積加入100 μl血液緩衝液。將盤子放入具有預先浸濕衛生紙的保鮮盒中，於室溫作用3個小時，再計算出凝集素的比活性。比活性定義為：每毫克凝集素能凝集血球的最大稀釋倍數(HAU/mg)，HAU為凝集素能夠凝集紅血球的蛋白質最大稀釋倍數(titer)。舉例而言，凝集素稀釋至原本濃度的1/32還具有凝集活性，則HAU即為32。

請參閱第6圖，其為鳳梨莖部凝集素之血球凝集活性測試圖。經由本發明的純化方法所得的凝集素，純化後鳳梨莖部凝集素經連續稀釋2倍至128倍，其中稀釋8倍後之鳳梨莖部凝集素仍然具有凝集血球的效果，且其在凝集活性方面比活性更可達1.379x10³(HAU/mg)。據此，本發明的純化方法可得到高純度之鳳梨莖部凝集素。

試驗例1.11 蛋白質四級結構測定

請參照第7圖，其為鳳梨莖部凝集素分子量測定圖。此蛋白質四級結構測定方法是利用膠體過濾層析(size exclusion chromatography；SEC)原理進行測定，流速為1 ml/min，波長設定為280 mm，移動相之溶液配置為50 mM phosphate buffer pH 7.4、0.1 M NaCl、0.1 M glucose。配製 1至2 mg/ml的BSA、卵白蛋白(Ovalbumin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)溶於50 mM phosphate buffer pH 7.4、0.1 M NaCl、0.1 M glucose作為標準品，將此標準品以及樣品藉由0.45 μm過濾膜過濾。將標準品與樣品取40 μl分別注入高效液相層析(high performance liquid chromatography；HPLC)搭配膠體過濾層析(size exclusion chromatography；SEC)管柱之中。將每一個標準品的分子量(molecular weight)與其滯留時間(retention time)作回歸曲線後(y=-29.747x+276.52)，將樣品的滯留時間帶入即可得知其分子量。據此，HPLC所得到的實驗數據可推測出鳳梨莖部凝集素四級結構為四元體之完整結構。純化結果不論在電泳分析或者是SEC-HPLC的結果上，皆具有相當高的純度。

試驗例2 辨識鳳梨莖部凝集素之抗體製備 試驗例2.1 鳳梨莖部凝集素基因的選殖

取得美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)凝集素基因序列後，將此DNA序列片段設計出前後兩端具有不同的限制酶切位的引子後，利用本實驗室已構築完成之鳳梨莖部cDNA基因庫進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)基因選殖。在此PCR反應中加入具有鳳梨莖部凝集素基因殖系(clone)、10 X反應緩衝液(reaction buffer)、引子(primer)與2.5 mM去氧核糖核甘酸(Deoxyribonucleotide, dNTP)後，進行PCR增幅。以94℃使欲增幅之DNA片段變性10分鐘後，進入PCR循環：95℃(1分鐘)、55℃(30秒)、72℃(1分鐘)，此程式進行30個循環，再以72℃延伸作用10分鐘。反應結束後取5 μl的PCR產物進行電泳分析。之後符合大小的片段進行DNA回收，構築至載體後，並轉形至DH10B株之菌體宿主，菌體宿主經過抗生素篩選後，再利用PCR與限制酶切割及核酸序列分析確認。

試驗例2.2 鳳梨莖部凝集素基因的表現

將鳳梨莖部凝集素蛋白基因構築至pET-28a與pET-29a(Novagen)之表現載體上，分別送入宿主大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)株中，以抗生素進行篩選，並抽取質體(plasmid)，以限制酶切割(restriction enzyme digestion)及核酸定序方式，確認表現載體帶有鳳梨莖部凝集素基因。

將前述帶有鳳梨莖部凝集素基因的菌株加入至相對應抗生素培養液中，於37℃震盪培養隔夜。將種菌液以1：100的比例加入含抗生素之新鮮培養液中，37℃培養至O.D.₆₀₀達0.6時，利用0.3 mM異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導蛋白大量表現，於37℃繼續培養3小時，將菌液以7150 xg在4℃離心10分鐘後，去除培養基。將所得沉降物以菌體破碎緩衝液I(50 mM Tris-HCl,pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM EDTA)回溶，以超音波均質機破碎細胞，之後以7150 xg在4℃離心10分鐘後，去除上清液，所得沉降物回溶9倍體積的菌體破碎緩衝液Ⅱ(50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5%曲拉通X-100(Triton X-100))，於室溫下作用5 min，以7150 xg在4℃離心10分鐘後，去除上清液，沉降物再以二次去離子純水清洗三次後取得內涵體。

試驗例2.3 蛋白質回收與抗體製備

將前述取得的內涵體製成glycine SDS-PAGE的樣品，經電泳、染色、脫色後，將目標蛋白質條帶割下、切碎後，將膠體碎片放入蛋白質電洗脫裝置(Electro-Eluter)，以每管8-10毫安培電泳3-5小時回收蛋白質。回收後經由蛋白質定量，進行抗原注射與動物管理，並取得鳳梨莖部凝集素之專一性抗體(anti-rACL)。

由上述本發明實施方式可知，應用本發明具有下列優點。

本創作之鳳梨莖部凝集素之純化方法所純化的萃取物猶如親和力管柱中之配體，鳳梨莖粗萃取液中大量凝集素結合在內生性多醣上，經緩衝液清洗後可去除非結合專一性的蛋白質或其他雜質。經過單醣配體競爭、濃縮與緩衝液置換後即可得到純度達95%以上的鳳梨莖部凝集素，相較傳統方法純化時間縮短且方法簡便。在純化條件的選擇上，未來不論是利用E.coli或者是酵母菌蛋白質表現系統大量生產鳳梨莖部凝集素或者是純化其它物種的凝集素，採用額外添加澱粉的方式可使得蛋白質純化更加快速，保存更加方便。在本發明實施例之單醣配體競爭性純化方式下，可在短時間得到相當大量的凝集素，可將此技術用於生產大量鳳梨莖部凝集素上。

此外，在過去植物凝集素的研究上從鳳梨的種子分離出來的物質精研究發現具有抗癌之效果。所以，鳳梨莖部凝集素也可能具有調節免疫系統的功能，甚至具有抑制癌症增生的效果，因此本發明未來之應用層面甚廣。市面上所販售鳳梨酵素保健食品，主要成分是經由鳳梨莖萃取乾燥而得的產品，其中含有大量的凝集素，經由長時間的服用鳳梨酵素膠囊，並未出現一般凝集素所會出現的中毒現象-噁心、嘔吐，所以，經過純化後鳳梨莖部凝集素產品對身體影響應該很小。因為鳳梨莖部凝集素之穩定性高，且食用之安全性也高，所以未來將可應用本發明之鳳梨莖部凝集素純化方法大量的純化鳳梨莖部凝集素，並可將之應用於各種醫療之用途上貢獻社會大眾醫藥方面的更多元化。

本發明發展了一個純化鳳梨莖部凝集素的方法，主要利用：1.鳳梨莖部凝集素與內生性澱粉或額外添加之澱粉的結合，使鳳梨莖部凝集素離心沉降；2.以競爭方式使前述之澱粉脫離並回收離心上清液中之水溶性鳳梨莖部凝集素；即可快速純化鳳梨凝集素並達純度95%以上。而純化流程中鳳梨莖部凝集素可穩定保存在清洗後經離心之冷凍乾燥沉降物中，可克服鳳梨產季之限制，利於產業應用。

本創作之實施方式所述的凝集素純化方法，乃係利用屬於巨分子的澱粉經過離心之後會沉降之特性，以及凝集素結合澱粉之特性，使得凝集素與澱粉結合之後只需經過離心沉降即可獲得凝集素及澱粉之結合複合物。取得此複合物之後只需利用競爭原理使澱粉脫離凝集素即可獲得純化之凝集素。藉此，達到簡化純化方法之目的。因此本實施方式雖係以鳳梨凝集素為例，然該技術領域之具有通常知識者無須再經過過度之實驗以及測試便能輕易利用本創作所揭露之實施方式的凝集素純化方法，而將其應用在各種生物樣品之凝集素純化方法上，例如上述實施方式所使用之鳳梨莖部凝集素，或者其他不具有內生性澱粉之生物樣品藉由額外添加澱粉之方式純化其中之凝集素。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100‧‧‧步驟

200‧‧‧步驟

300‧‧‧步驟

400‧‧‧步驟

500‧‧‧步驟

600‧‧‧步驟

700‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係繪示本發明之一實施方式的鳳梨莖部凝集素之純化方法流程圖。

第2A圖為包含鳳梨莖部凝集素之鳳梨莖部粗萃取液以不同pH值萃取之蛋白質分佈甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜。

第2B圖為第2A圖甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜之蛋白質條帶密度量化結果。

第3A圖為自不同濃度鳳梨莖部萃取物純化鳳梨莖部凝集素之條件測試的甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜。

第3B圖為第3A圖甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜的15 kDa蛋白質條帶密度量化數據折線圖。

第4圖為鳳梨莖部萃取物在不同pH條件下之溶解度分析之甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。

第5圖為鳳梨莖部蛋白質與凝集素基因表現蛋白質之甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜與西方點墨膠片圖。

第6圖為鳳梨莖部凝集素之血球凝集活性測試圖。

第7圖係繪示純化之鳳梨莖部凝集素藉膠體過濾層析管柱搭配高效液相層析儀(SEC-HPLC)之分子量測定圖。