TW201416448A - 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物（四） - Google Patents
穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物（四） Download PDFInfo
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Abstract
本發明係關於穿膜胜肽與有效成分之共軛物及該共軛物之使用。具體而言，揭示包括穿膜胜肽之共軛物及包含共軛物之組成物，該穿膜胜肽為包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6之任一種胺基酸序列之胜肽、SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6之任一序列之片段或具有與上述序列超過80%同源性之胜肽。
Description
本發明係關於源自人端粒酶反轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase；hTERT)之穿膜胜肽、穿膜胜肽及有效成分之共軛物及包含該共軛物之組成物。
儘管低分子量物質、核酸、蛋白質、奈米粒子等在分子水準上具有作為治療物質的極大可能性，但低分子量物質、核酸、蛋白質、奈米粒子等之使用由於無能力穿透組織及細胞膜而受限。輸送此類物質至細胞內之系統的發展已成為過去二十年來活躍的研究領域。在細胞內部運輸物質已成為分子處理方法中之話題。低分子量物質、核酸或奈米粒子係藉由若干試劑、電穿孔或熱休克在細胞內部運輸。然而，難以找到一種適當方法在不破壞蛋白質之活性及完整性的情況下在細胞內部輸送蛋白質。在20世紀80年代，在對人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus；HIV)之穿膜能力進行的研究中，已發現，由特定的11個胺基酸組成之HIV-TAT蛋白質在於細胞內部之運輸過程中起重要作用。因
此，在20世紀90年代，探索在細胞內部運輸蛋白質之恰當方法的研究成為熱點研究領域。
已知端粒是染色體末端發現之遺傳物質重複序列，端粒防止染色體損傷或合併至其他染色體上。端粒之長度係在每次細胞分裂時縮短，且在一定次數的細胞分裂之後，端粒長度極端縮短至細胞停止分裂且死亡的程度。在另一方面，已知端粒延伸延長細胞之壽命。作為實例，癌細胞分泌稱為端粒酶之酶，該酶防止端粒縮短，因此導致癌細胞增生。
[較佳實施例之詳細描述]
本發明之目標在於提供一種新穎胜肽。
本發明之另一目標在於提供編碼新穎胜肽之多核苷酸。
本發明之另一目標在於提供一種穿膜胜肽。
本發明之另一目標在於提供作為細胞內之有效成分載體的有用胜肽。
本發明之另一目標在於提供作為細胞內之有效成分載體的有用胜肽，尤其是將有效成分局部地輸送至粒線體的有用胜肽。
本發明之另一目標在於提供用於輸送有效成分至粒線體以改善、預防或治療粒線體相關之疾病或病症的有用胜肽。
本發明之另一目標在於提供有效成分及穿膜胜肽共
軛成之共軛物。
本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的組成物。
本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的醫藥組成物。
本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的功能性化妝品組成物。
本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的健康食品組成物。
本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的對比造影劑。
根據本發明之一實施例的共軛物可為穿膜乘載胜肽及有效成分之共軛物，其中乘載胜肽為包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列的胜肽、具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽或上述胜肽之片段，且其中具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及該胜肽之片段為保持SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一者之穿膜能力的胜肽。
根據本發明中之共軛物之另一實施例，片段可由三個或更多胺基酸組成。
根據本發明中之共軛物之另一實施例，乘載胜肽可由三十個或更少胺基酸組成。
根據本發明中之共軛物之另一實施例，上述乘載胜肽可為具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列的胜肽或具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽。
根據本發明之一實施例的對比造影劑可包含上述的任一種共軛物。
根據本發明之一實施例的對比造影劑可用於對比造影細胞。
根據本發明之對比造影劑之另一實施例，細胞可為幹細胞。
根據本發明之一實施例的組成物可包含上述的任一種共軛物。
根據本發明中之組成物之另一實施例，有效成分可用於治療或預防疾病，且組成物可為醫藥組成物。
根據本發明之組成物之另一實施例，有效成分可為用於功能性化妝品之有效成分，且組成物可為化妝品組成物。
根據本發明之組成物之另一實施例，有效成分可為用於功能健康食品之有效成分，且組成物可為健康食品組成物。
根據本發明之一實施例之方法可為一種輸送有效成分至細胞內的方法，其中該方法包含給需要的對象施用任一種上述共軛物之步驟，且其中乘載胜肽為執行有效成分至細胞內之輸送的穿膜胜肽，且其中具有與序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及序列之片段可為保持SEQ ID NO：2至
SEQ ID NO：178之任一種胜肽之穿膜能力的胜肽。
根據本發明之方法之另一實施例，方法可用於在細胞內部局部地輸送有效成分至粒線體內。
根據本發明之胜肽可包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列或上述胜肽之片段。
根據本發明之多核苷酸可編碼上述穿膜胜肽。
根據本發明之載體可包含上述多核苷酸。
根據本發明之轉形細胞可包含上述載體。
產業利用性
難以在細胞內部運輸之有效成分可藉由使用本發明所揭示之胜肽或胜肽及有效成分之共軛物而易於在細胞內部運輸。此意味著可增加有效成分之功效且因此可減少有效成分之劑量。因此，可最小化由於投藥造成的副作用且可增加治療之有效性。特別地，當將藥物局部地輸送至粒線體內時，可改善粒線體相關之疾病或病症，且可增加預防及治療疾病的有效性。在化妝品之情況中，利用少量有效成分可產生顯著效應。藉由使胜肽與對比造影劑共軛，可將該胜肽用作對比造影劑以監測細胞移植之過程或在細胞處理中的移植細胞。特別地，該胜肽可實際上用作用於注入軀體內之幹細胞的對比造影劑。
第1圖描繪圖示重組DNA選殖之製造方法的示意圖，作為報導基因(reporter gene)之增強型綠螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein；EGFP)係與SEQ ID NO：1
至SEQ ID NO：6之胜肽共軛。
第2圖至第7圖描繪藉由螢光活化細胞分類計(Fluorescence-activated cell sorting；FACS)分析在HeLa細胞中量測之標記有FITC之具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽的細胞攝入。僅以FITC處理之細胞充當對照物。
第8圖至第11圖描繪藉由螢光活化細胞分類計(FACS)分析在Huh7細胞(人類肝癌細胞系)中量測之標記有FITC之具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：6之胜肽的細胞攝入。僅以FITC處理之細胞充當對照物。
第12圖至第15圖描繪藉由螢光活化細胞分類計(FACS)分析在Jurkat細胞(人類T淋巴球細胞系)中量測之標記有FITC之具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：6之胜肽的細胞攝入。僅以FITC處理之細胞充當對照物。
第16圖至第21圖描繪標記有FITC之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽與培育之HeLa細胞之細胞毒性及細胞活性的結果。
第22圖至第27圖描繪經執行以決定pep(CPP)-EGFP融合蛋白質之穿膜性質之流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析的結果。
蛋白質、核酸、胜肽或病毒等具有用作治療物質之極大可能性。然而，在分子水準大小下，蛋白質、核酸、胜肽或病毒等之使用由於無能力穿透組織及細胞膜而受限。儘管分子大小很小，但該等分子由於分子之結構或特性而無法
穿透脂質雙層。因此，試圖藉由使用電穿孔或熱休克在細胞內部運輸蛋白質、核酸、胜肽或病毒；難以在既不破壞細胞膜又保持上述分子之活性及完整性的情況下轉移彼等分子。已進行的許多研究顯示源自人類免疫缺乏病毒(Human Immuno-deficiency Virus；HIV)之反式轉錄活化因子(Trans-Activating Transcriptional activator；TAT activator)蛋白質可用作穿膜胜肽，該穿膜胜肽可在細胞內部運輸極大的活性物質。具體而言，已進行了關於下列物質的研究，與在細胞內部產生毒性的TAT蛋白質不同，該等物質可在不產生任何毒性的情況下在細胞內部運輸諸如蛋白質、核酸、胜肽或病毒之極大分子。因此，本發明是因應本發明人發現，源自端粒酶之胜肽具有作為穿膜胜肽之顯著功效而無顯著毒性而完成的。
以SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6描述之胜肽係與下列表1中相同。SEQ ID NO：8列舉人類端粒酶蛋白質之全長之順序。下文表1中之「名稱」係用於區別胜肽。在本發明之不同特定實施例中，在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中之所述胜肽之一個以上胜肽包括「合成胜肽」，端粒酶之選定區域之合成胜肽。在本說明書中，術語「pep」在本文係指具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一者的胜肽、包含與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽或上述胜肽之片段。
在本發明之一實施例中，提供一種多核苷酸，該多核苷酸編碼以下的胜肽：包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一者的胜肽，具有與上述序列超過80%同源性之胜肽或上述胜肽之片段。如上所述之多核苷酸使得能夠大量地產生胜肽。舉例而言，載體在寄主細胞中之培養允許大量產生胜肽，該等載體包括編碼胜肽之多核苷酸。
本文揭示之胜肽可包括包含序列之超過80%、超過85%、超過90%、超過95%、超過96%、超過97%、超過98%、超過99%同源性之胺基酸序列的胜肽。此外，本發明中所揭示之胜肽可包括：包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任何一者的胜肽或該等胜肽之片段，及具有一個以上轉形胺基酸、兩個以上轉形胺基酸、三個以上轉形胺基酸、四個以上轉形胺基酸、五個以上轉形胺基酸、六個以上轉形胺基酸或七個以上轉形胺基酸的胜肽。
在本發明之一實施例中，胺基酸序列中之改變屬於
胜肽之物理及化學特性的修飾。舉例而言，胺基酸轉形可經執行用於改善胜肽之熱穩定性、改變基質專一性及改變最佳pH值。
術語「胺基酸」在本文不僅包括經天然整合成為胜肽之22種標準胺基酸而且包括D-異構體及轉形胺基酸。因此，在本發明之特定實施例中，本文之胜肽包括具有D-胺基酸之胜肽。在另一方面，胜肽可包括非標準胺基酸，諸如已經後轉譯修飾的彼等胺基酸。後轉譯修飾之實例包括磷酸化、糖基化、醯化(包括乙醯化、豆蔻醯化、棕櫚醯化)、烷化、羧化、羥化、醣化、生物素化、泛素化、化學性質之轉形(例如，β-移除脫醯胺、脫醯胺)及結構轉形(例如，形成雙硫鍵)。同樣，胺基酸之改變包括由於在為形成胜肽共軛物與交叉連接子之組合過程期間之化學反應而發生之胺基酸之改變，諸如在胺基酸基、羧基或側鏈中之改變。
本文揭示之胜肽可為已經識別且從天然源分離出之野生型胜肽。在另一方面，當與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一者之胜肽片段相比時，本文揭示之胜肽可為人工突變株，該等人工突變株包含經置換、刪除及/或嵌入之一或更多個胺基酸。在野生型多肽中之胺基酸變化(不僅在人工突變株中)包含不顯著影響活性之胺基酸之蛋白質折疊及/或保守置換。保守置換之實例屬於由以下各者組成之群組：鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸及組胺酸)、酸性胺基酸(麩胺酸及天門冬胺酸)、極性胺基酸(麩醯胺及天門冬醯胺)、疏水性胺基酸(亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸)、芳香
族胺基酸(苯基丙胺酸、色胺酸及酪胺酸)及小型胺基酸(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸及蘇胺酸)。通常不改變特定活性之胺基酸置換係在此技術領域已知。最常發生的變化為丙胺酸/絲胺酸、纈胺酸/異亮胺酸、天門冬胺酸/麩胺酸、蘇胺酸/絲胺酸、丙胺酸/甘胺酸、丙胺酸/蘇胺酸、絲胺酸/天門冬醯胺、丙胺酸/纈胺酸、絲胺酸/甘胺酸、酪胺酸/苯丙胺酸、丙胺酸/脯胺酸、離胺酸/精胺酸、天門冬胺酸/天門冬醯胺、亮胺酸/異亮胺酸、亮胺酸/纈胺酸、丙胺酸/麩胺酸、天門冬胺酸/甘胺酸，及相反的變化。保守置換之另一實例係顯示在下表2中。
胜肽之生物學性質之實質轉形係藉由在以下功效中選定顯著不同的置換而執行：(a)保持置換區域中的多肽主鏈之結構的功效，諸如片狀或三維螺旋結構，(b)保持靶區域中之分子之電荷或疏水性的功效，或(c)保持側鏈之整體的功效。自然殘基係藉由一般側鏈性質劃分成為如下群組：
(1)疏水性：正白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸；(2)中性親水性：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；(3)酸性：天門冬胺酸、麩胺酸；(4)鹼性：天門冬醯胺、麩醯胺、組胺酸、離胺酸、精胺酸；(5)影響鏈取向之殘基：甘胺酸、脯胺酸；及(6)芳香性：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。
非保守置換可藉由交換上述種類之成員與不同種類之成員而執行。與保持胜肽之適當三維結構無關之任何半胱胺酸殘基可通常經置換為絲胺酸，因此增加分子之氧化穩定性且防止不適當交聯。反之，穩定性之改善可藉由給胜肽添加一或更多個半胱胺酸鍵而實現。
胜肽之胺基酸變體之經改變類型為已改變抗體糖基化方式的彼等胺基酸。術語「改變」在本文係指刪除在胜肽中發現的至少一個糖殘基及/或添加在胜肽內不存在的至少一個糖基化殘基。
胜肽中之糖基化作用通常經N連接或O連接。術語「N-連接」在本文係指將糖殘基附著至天門冬醯胺殘基之側鏈。作為三肽序列，天門冬醯胺-X-絲胺酸及天門冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為用於將糖殘基酶法附著至天門冬醯胺之側鏈之辨識序列。因此，在多肽中存在該等三肽序列中之一者的情況下，創建可能的糖基化作用位點。α「O-連接糖基化作用」意味著將糖N-乙醯半
乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附著至羥基胺基酸。羥基胺基酸大部分通常為絲胺酸或蘇胺酸，但可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
對胜肽添加糖基化作用位點係藉由改變胺基酸序列為含有上述三肽序列(用於N連結之糖基化作用位點)而便利地執行。該等改變可藉由給第一抗體序列添加至少一個絲胺酸或蘇胺酸殘基或藉由以彼等殘基(用於O連結之糖基化作用位點)置換而進行。
在本發明之一實施例中，提供包含胜肽之穿膜胜肽，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列，或胜肽為上述胜肽之片段。在本發明之一實施例中，提供醫藥組成物，該醫藥組成物包含作為運輸一個以上有效成分之藥物輸送系統之胜肽，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%的同源性，或該胜肽為上述胜肽之片段。包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一胺基酸序列之胜肽、上述胜肽之片段或具有與上述序列具有超過80%同源性之胜肽是安全的且具有作為穿膜胜肽之顯著功效。因此，胜肽可與藥物共軛以在細胞內部運輸藥物。
在本發明之一實施例中，提供胜肽與待運輸之有效成分的共軛物，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段或該胜肽具有與上述胜肽具有超過80%的同源性。在本發明之一實施例
中，有效成分可為選自以下各者中之至少一者：蛋白質、核酸、胜肽、脂質、醣脂質、礦物、糖、對比造影物質、藥物及化合物。在本發明之一實施例中，有效成分可為胜肽。在本發明之一實施例中，有效成分可為細胞介素、抗體、抗體片段、治療酶、可溶受體或配位子。
本文揭示之穿膜胜肽意指可自體外及/或體內運輸貨物至細胞內部的胜肽。本文揭示之「貨物」包含可經由與穿膜胜肽之共軛作用在細胞內部運輸之所有物質，例如，想要增加穿膜功效之所有物質，具體而言，藥物、化妝品或健康食品之有效成分，更具體而言，無法經由一般途徑在細胞內部運輸的物質，更具體而言，糖、奈米粒子、生物學配方、病毒、對比造影物質或其他化合物，該等其他化合物可例如具有蛋白質、核酸、胜肽、礦物、葡萄糖，但不限於彼等物質。本文揭示之「藥物」為寬泛概念，包括待運輸用於緩和、預防、治療或診斷疾病、創傷或特定症狀的物質。
本文揭示之「乘載胜肽」為可經由與有效成分之共軛作用運輸有效成分至靶位點的胜肽。
在本發明之一實施例中，作為貨物之蛋白質或胜肽包含以下之一或更多者：激素、激素類似物、酶、酶抑製劑、訊號轉移蛋白質(或胜肽)、抗體及疫苗，但不限於彼等物質。在本發明之一實施例中，核酸為以下分子：可為自發或人工的、單股或雙股的DNA分子或RNA分子。核酸分子可為相同類型(例如，具有相同的核苷酸序列)之一或更多個核酸或不同類型之核酸。核酸分子包含以下之一或更多者：
DNA、互補DNA(cDNA)、誘餌DNA(decoy DNA)、RNA、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小髮夾式RNA(shRNA)、小時序RNA(stRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小胞核RNA(snRNA)、戊糖核酸(pentose nucleic acid；PNA)、反義寡聚物、質體及其他修飾核酸，但不限於彼等物質。在本發明之一實施例中，病毒包含全病毒或包括病毒之核酸的病毒核心。在本發明之一實施例中，化學物質為包含天然或合成物質之寬泛指示，該天然或合成物質可充當藥物。
在本發明之一實施例中，藉由穿膜胜肽在細胞內部運輸之藥物可包含一或更多個藥物運輸載體，諸如脂質體、微胞、奈米粒子、磁性粒子或量子點。
本文揭示之術語「對比造影劑」為寬泛指示，該寬泛指示包含用來在醫學影像中對比造影軀體內之結構或流體的所有物質。適當對比造影劑包含不透射線對比造影劑、順磁對比造影劑、超順磁對比造影劑、電腦斷層掃描(computed tomography；CT)及其他對比造影劑，但不限於彼等物質。舉例而言，不透射線對比造影劑(用於X射線影像)將包含無機碘化合物及有機碘化合物(例如，泛影酸鹽(diatrizoate))、不透射線金屬及該等不透射線金屬之鹽(例如，銀、金、鉑等)及其他不透射線化合物(例如，鈣鹽、諸如硫酸鋇之鋇鹽、鉭及氧化鉭)。適當的順磁對比造影劑(用於MR影像)包含釓二乙三胺五乙酸(gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid；Gd-DTPA)及Gd-DTPA之衍生物、其他釓、錳、鐵、鏑、銅、銪、鉺、鉻、鎳及鈷複合體，例如，
1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N’,N”,N'''-tetraacetic acid；DOTA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,-N’,N”-三乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,-N’,N”-triacetic acid；DO3A)、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N’,N”-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-N,N’,N”-TRIACETIC ACID；NOTA)、1,4,8,10-四氮雜環十四烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸(1,4,8,10-tetraazacyclotetradecane-N,N’,N”,N'''-tetraacetic acid；TETA)、羥基苄基乙二胺二乙酸(hydroxybenzylethylene-diamine diacetic acid；HBED)。適當的超順磁對比造影劑(用於MR影像)包含磁鐵礦、超順磁氧化鐵(super-paramagnetic iron oxide；SPIO)、超小超順磁氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide；USPIO)及單晶氧化鐵。其他適當的對比造影劑為碘化、非碘化、離子及非離子的CT對比造影劑、類似旋轉標記或診斷上有效製劑之對比造影物質。
對比造影劑之其他實例包含β-半乳糖苷酶、綠螢光蛋白、青螢光蛋白、螢光素酶(但不限於彼等物質)及編碼在表現於細胞內時可輕易偵測到之蛋白質之標識基因。可使用各種標記，諸如放射性核種、粉(flour)、酶、酶基質、酶輔因子、酶抑製劑、配位子(尤其是半抗原(heptan))。
在本發明之一實例中，對比造影劑為下文化學式2之二茂鐵羧酸。二茂鐵之結構係表示在化學式1中。
在本發明之一實例中，穿膜胜肽與對比造影劑之共軛物為下文化學式3中表示之二茂鐵羧基-pep1。
在本發明之一實施例中，胜肽或組成物可與一或更多個可偵測標記融合。標記可為可在化學反應、物理反應或酶反應中偵測到之化合物或在反應中直接或間接地產生訊號之化合物。標記及偵測隨後可根據此技術領域所熟知的方法來執行(例如，Sambrook,J.及Russel,D.W.(2001)；及Lottspeich,F.及Zorbas H.(1998)Bioanalytik，Spektrum Akademischer Verlag，海德堡/柏林，德國)。標記包含螢光
標記、酶標記、色原體標記、發光標記、輻射標記、半抗原、生物素、金屬複合體、金屬及膠態金，但不限於彼等標記。該等標記之所有形式在此工作領域是眾所周知的，該等標記之所有形式可自各種供應商購得。
在本發明之一實施例中，貨物可與胜肽直接組合。在本發明之另一實施例中，貨物可經由諸如共價鍵或非共價鍵之各種類型之鍵與胜肽組合。例如，在本發明之一實施例中，貨物可與胜肽之N端或C端組合。舉例而言，貨物可藉由二硫鍵或共價鍵鍵結至胜肽。共價鍵為可將貨物鍵結至N端麩胺酸之α-胺或C端離胺酸殘基之胺的鍵。同樣，胜肽及貨物可經由非共價鍵組合，此可使胜肽或貨物可將彼此封裝為膠囊形式。
在本發明之另一實施例中，胜肽可經由連接子與貨物組合。舉例而言，胜肽可藉由在將諸如聯肼尼克醯胺(6-肼基吡啶-3-羧酸)連接子(Hynic(6-hydrazinopyridine-3-carboxylic acid)linker)之連接子引入N端麩胺酸之α-胺或C端離胺酸殘基之胺之後將貨物結合至連接子而與貨物組合。
在本發明之另一實施例中，當貨物為DNA或RNA時，將SH基團(硫醇基)引入胜肽，且將馬來醯亞胺基引入DNA或RNA，隨後，組合胜肽之SH基團及DNA或RNA之馬來醯亞胺基，因此產生在貨物與胜肽之間的結合。
在本發明之另一實施例中，當貨物為胜肽或蛋白質時，表現貨物之DNA與表現乘載胜肽之DNA組合，且藉由
表現此DNA組合，可將貨物與胜肽組合為融合蛋白質之形式。藉由融合蛋白質組合之特定實例如下：當製造引子用於產生融合蛋白質時，編碼乘載胜肽之核苷酸經附著在表現貨物之核苷酸前面，且使用限制酶將所獲得核苷酸嵌入諸如聚乙烯對苯二甲酸酯(Polyethylene Terephthalate；pET)載體之載體，且核苷酸係以轉形到諸如BL-21(DE3)之細胞中來表現。此時，融合蛋白質將藉由以類似異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside；IPTG)之表現誘導製劑處理該融合蛋白質而有效表現。隨後，所表現的融合蛋白質係藉由His標籤淨化來淨化，且以PBS透析，且經添加至試劑盒以在2000rpm至4000rpm、5至20分鐘之此類條件下藉由離心分離作用而濃縮。
在本發明之一實施例中，乘載胜肽係與染色物質、螢光物質、具體而言螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate；FITC)或綠螢光蛋白(Green Fluorescent Protein；GFP)組合。在本發明之一實施例中，FITC係與在乘載胜肽之N端或C端之離胺酸之胺基(NH3+)組合。在其中離胺酸不存在於胜肽之端的胜肽情況中，胜肽可經由包括離胺酸之連接子與FITC組合。
本文揭示之乘載胜肽可以1：1之莫耳分數與貨物組合，但該乘載胜肽也可以不同於1：1之莫耳分數與貨物組合，該乘載胜肽為包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列之胜肽，或具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列之胜肽，或上述胜肽之片段。舉例而言，CPP與貨
物之莫耳分數可大於2：1，具體而言，大於2：1、大於3：1、大於4：1、大於5：1、大於6：1、大於7：1、大於8：1、大於9：1或大於10：1。此意味著大量乘載胜肽分子可與貨物分子組合。大量乘載胜肽分子可經串聯或並聯組合。「串聯組合」意味著乘載胜肽與貨物分子將在端胺基酸處組合。「並聯組合」意味著乘載胜肽與貨物分子將在不同於端胺基酸之位點組合。在另一方面，乘載胜肽與貨物之莫耳分數可大於1：2。此意味著乘載胜肽分子可與大量數量之貨物分子組合。舉例而言，乘載胜肽與貨物之莫耳分數可為1：2，具體而言，大於1：2、大於1：3、大於1：4、大於1：5、大於1：6、大於1：7、大於1：8、大於1：9或大於1：10。
可輕易發現與螢光異硫氰酸鹽組合之胜肽的移動途徑。因此，在本發明之一實施例中之乘載胜肽將用於細胞成像或偵測在細胞內部之藥物輸送途徑。
在本發明之一實施例中，提供用作運輸一個以上有效成分之藥物輸送載體的胜肽，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，提供在對象之細胞內部輸送藥物之方法，該方法包含施用包含藥物及胜肽之組成物之步驟；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，提供偵測藥物輸送途徑之方法，該方法包含給對象應用胜肽及對比造影物質之步驟；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，提供偵測藥物輸送途徑之方法，該方法包含給對象應用胜肽與對比造影物質之共軛物的步驟；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，提供用於藥物輸送至對象之細胞內的試劑盒，該試劑盒含有組成物及說明書，其中該組成物包含本發明之胜肽與用於輸送之藥物的共軛物，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列，其中該說明書包括以下之至少一者：給藥劑量、給藥途徑、給藥頻率及組成物之指示。
在本發明之一實施例中，提供包含有效成分及胜肽之化妝品或食品組成物；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段。在本發明之另一實施例中，提供包含胜肽與有效成分之共軛物的化妝品或食品組成物；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過
80%同源性之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段。
在本發明之一實施例中，提供具有在細胞內部運輸有效成分之顯著能力的醫藥、化妝品或食品組成物，該醫藥、化妝品或食品組成物包含胜肽與有效成分之共軛物；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一種胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段。
粒線體，作為真核細胞之能量代謝中之中心胞器，為與人類疾病有關之首先熟知的細胞內胞器(Luft R、Ikkos D、Palmieri G、Ernster L、Afzelius B：A case of severe hypermetabolism of non thyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control：a correlated clinical,biochemical,and morphological study(在保持粒線體呼吸控制中具有缺陷的非甲狀腺成因之嚴重代謝亢進之情況：相關的臨床研究、生物化學研究及形態學研究)，J Clin Invest 41：1776-804，1962年)。
因為粒線體在控制細胞之能量代謝及細胞凋亡中起重要作用，故該等粒線體充當用於各種治療藥物之主要靶。同樣，此胞器涉及控制細胞內部之鈣濃度，粒線體呼吸鏈充當在能量產生中重要的電子運輸系統，且該粒線體呼吸鏈導致產生活性氧物種。因此，異常粒線體作用與成人疾病具有密切關係，該等成人疾病諸如尿崩症、心肌症、不孕症、失明、腎/肝疾病及中風(Modica-Napolitano KS，Singh KK：四月mitochondri as targets for detection and treatment of cancer.
(作為偵測及治療癌症的靶之粒線體。)Expert Rev Mol Med 11：1-19，2002年)。同樣，正建議將粒線體遺傳突變包括在老化、變性神經元疾病及癌症等之爆發中。
在本發明之一實施例中，提供有效成分之粒線體靶向輸送系統。該輸送系統包含上述共軛物中之至少一者，且包括在共軛物中之乘載胜肽為在細胞內局部地移動至粒線體內且局部地運輸有效成分至粒線體的胜肽。具有與上述序列超過80%同源性之胜肽及作為共軛物之組分所述之胜肽之片段保持以SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之回應胜肽之至少一者之粒線體為靶的能力。
同樣，在本發明之一實施例中，提供用於調節粒線體活性之組成物。組成物包含上述共軛物中之至少一者，且包括在共軛物中之乘載胜肽為在細胞內局部地移動至粒線體內且局部地運輸有效成分至粒線體的胜肽，其中具有與上述序列超過80%同源性之胜肽及作為共軛物之組分所述之胜肽之片段保持以SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之回應胜肽之至少一者之粒線體為標靶的能力。
在用於調節粒線體活性之組成物之一實施例中，上述組成物為用於與粒線體有關之疾病或病症的治療、預防、病情抑制或症狀緩和的醫藥組成物；上述有效成分為用於與粒線體有關之疾病或病症的治療、預防、病情抑制或症狀緩和的成分。
本文揭示之「粒線體相關疾病」包含亨汀頓氏疾病、肌萎縮性脊髓側索硬化、粒線體腦肌肉病變合併乳酸血症及
類中風症候群(Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidemia and Stroke-like episodes；MELAS)；肌陣攣癲癇合併紅色襤褸肌纖維症(Myoclonus,epilepsy,and myopathy with ragged red fibers；MERRF)；神經性肌肉鬆弛、失調症、色素性視網膜炎/母體遺傳萊氏症狀(Neurogenic muscular weakness,ataxia,retinitis pigmentosa/Maternally inherited leigh syndrome；NARP/MILS)；Leber氏視神經病變(Lebers hereditary optic neuropathy；LHON)；Kearns-Sayre症候群(Kearns-Sayre Syndrome；KSS)；皮爾森骨髓胰腺症(Pearson Marrow-Pancreas Syndrome；PMPS)；慢性漸進性眼外肌麻痹(Chronic progressive external opthalnoplegia；CPEO)；瑞氏症候群；阿爾珀斯氏症候群；多個粒線體DNA缺失症狀；粒線體DNA耗乏症候群；複合體I缺陷；複合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase；SDH))缺陷；複合體Ⅲ缺陷；細胞色素c氧化酶(COX，複合體Ⅳ)缺陷；複合體V缺陷；腺嘌呤核苷酸轉運體(Adenine nucleotide translocator；ANT)缺陷；丙酮酸脫氫酶(Pyruvate dehydrogenase；PDH)缺陷；具有乳酸血症之乙基丙二酸酸性尿；具有乳酸血症之3-甲基戊烯二酸酸性尿；體現為在傳染期間之衰減的不應性癲癇；體現為在傳染期間之衰減的阿斯伯格症候群；體現為在傳染期間之衰減的自閉症；注意力不足過動症(Attention deficit hyperactivity disorder；ADHD)；體現為在傳染期間之衰減的腦性麻痹；體現為在傳染期間之衰減的失讀症；母系遺傳血小板減少症；白血病；MNGIE(粒線體肌病變、周圍及自主
神經病變、胃腸功能異常及癲癇)；MARIAHS症候群(粒線體失調症、復發傳染、失語症、低尿酸血症/髓磷脂減少症(hypomyelination)、癲癇發作及二羧酸酸性尿)；ND6肌張力不全症；體現為在傳染期間之衰減的週期性嘔吐症狀；具有乳酸血症之3-羥基異丁酸酸性尿；具有乳酸血症之尿崩症；尿苷反應性神經症狀(Uridine reactive neural syndrome；URNS)；家族雙側紋狀體壞死(Familial bilateral striatum necrosis；FBSN)；與胺基糖苷有關之聽力損失；鬆馳心肌病；脾淋巴瘤；鎢症狀；多個粒線體DNA缺失症狀；及腎小管酸血症/尿崩症/失調症症狀，但不限於彼等疾病。
在本發明之另一實施例中，提供編碼上述多肽之核酸分子。例如，核酸分子具有鹼基序列GAA GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA。核酸可根據熟習此項技術者所熟知的方法引入寄主細胞內。舉例而言，熟知方法可為藉由以下各者之轉形方法：磷酸鈣方法、脂質體、電穿孔、接觸病毒及細胞，或直接微注射至細胞內等。寄主細胞為較高等的真核細胞(例如，哺乳動物細胞)，或較低等的真核細胞(諸如酵母細胞)，或原核細胞(諸如細菌細胞)。適於轉形之原核寄主細胞可為屬於以下的物種：例如，大腸桿菌、枯草桿菌、沙門氏菌、假單胞菌、鏈黴菌及微細菌物種。
包括上述核酸分子之載體通常為重組型表現載體，且該載體包含賦能寄主細胞轉形之複製起點及可選擇標記物(例如，用於真核細胞培養之二氫葉酸還原酶，或新黴素之
容許度、四環素或安比西林在大腸桿菌中之容許度，酵母菌TRP1基因)，及用於控制蛋白質塗佈序列之轉錄的促進子。例如，可用表現載體為：熟知細菌質體，諸如SV40、pcDNA之衍生物；及熟知細菌質體，諸如colE1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等人，Gene 67：31-40(1988))；質體，諸如pMB9及pMB9之衍生物RP4；與噬菌體I之大量衍生物相同的噬菌體DNA，諸如NM989；諸如M13及絲狀單股噬菌體DNA之噬菌體DNA；酵母質體，例如，噬菌體DNA或自使用表現抑制序列之修飾質體與噬菌體DNA之組合誘導的載體。哺乳動物表現載體包含複製起點、適當促進子及增進子。同樣，該等載體可包含強制核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體部分、轉錄終止序列及5’平板式非轉錄序列。哺乳動物表現載體可包含可誘導促進子，例如，含有二氫葉酸還原酶促進子之載體，含有DHFR表現匣或DHFR/胺甲葉酸共擴增載體之任何表現載體，諸如pED(Randal J，kaufman，1991，Randal J.Kaufman，Current Protocols in Molycular Biology，16，12(1991))。或者，可使用以下載體：麩胺醯胺合成酶/甲硫胺酸磺醯亞胺共擴增載體，例如，pEE14(Celltech公司)、人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr-Virus；EBV)；或受核抗原(EBNA)控制引導附加型表現之載體，例如，pREP4(Invitrogen公司)、pCEP4(Invitrogen公司)、pMEP4(Invitrogen公司)、pREP8(Invitrogen公司)、pREP9(Invitrogen公司)及pEBVHis(Invitrogen公司)。可選擇哺乳動物表現載體為Rc/CMV(Invitrogen公司)
及pRc/RSV(Invitrogen公司)等。可用於本發明之牛痘病毒哺乳動物表現載體為pSC11、pMJ601、pTKgptF1S等。
將用於本發明之酵母表現載體系統為非融合pYES2載體(Invitrogen公司)、融合pYESHisA、B、C(Invitrogen公司)、pRS載體等。
上述載體可經引入各種細胞，諸如特別是源自人體的細胞之哺乳動物細胞或細菌、酵母、真菌、昆蟲、線蟲及植物細胞。適當細胞之實例為：VERO細胞；HeLa細胞，例如ATCC No.CCL2；CHO細胞系，例如ATCC No.CCL61；COS細胞，例如COS-7細胞及ATCC No.CRL 1650細胞；W138、BHK、HepG2、3T3，例如，ATCC No.CRL6361；A549、PC12、K562細胞；293細胞；Sf9細胞，例如ATCC No.CRL1711；及Cv1細胞，諸如ATCC No.CCL70等。
將用於本發明之其他適當細胞為原核寄主細胞菌株，例如，屬於大腸桿菌(例如，DH5-α菌株)、枯草桿菌、沙門氏菌、假單胞菌、鏈黴菌及葡萄球菌之菌株。
在本發明之一實施例中，組成物可含有0.1μg/mg至1mg/mg、具體而言1μg/mg至0.5mg/mg、更具體而言10μg/mg至0.1mg/mg的以下胜肽：包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一者之胺基酸序列的胜肽、包含與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽或上述胜肽之片段。當胜肽係含在上述範圍內時，組成物之所有安全性及穩定性可經滿足且在成本有效性方面為適當的。
在本發明之一實施例中，組成物可應用於所有動
物，包括人類、狗、雞、豬、母牛、羊、天竺鼠及猴。
在本發明之一實施例中，醫藥組成物可在骨髓、硬膜外或皮下手段中經由以下方式給藥：口服、直腸給藥、經皮給藥、靜脈給藥、肌肉給藥、腹膜內給藥。
口服給藥之形式可為但不限於片劑、藥丸、軟膠囊或硬膠囊、顆粒、粉末、溶液或水乳液。非口服給藥之形式可為但不限於注射、滴劑、洗劑、軟膏、凝膠、乳霜、懸浮液、水乳液、栓劑、貼劑或噴劑。
在本發明之一實施例中，若有必要，醫藥組成物可含有添加劑，諸如稀釋劑、賦形劑、潤滑劑、黏合劑、崩解佐劑、緩衝劑、分散劑、表面活化劑、著色劑、芳香劑或甜味劑。在本發明之一實施例中，醫藥組成物可藉由此技術領域中之習知工業方法製造。
在本發明之一實施例中，醫學組成物之有效成分可根據以下各者變化：病人的年齡、性別、體重、病理及狀態、給藥途徑或開藥者的判斷。基於該等因數之劑量係在熟習此項技術者之水準內決定，且每日劑量例如可為但不限於，0.1μg/kg/天至1g/kg/天，具體而言1μg/kg/天至10mg/kg/天，更具體而言10μg/kg/天至1mg/kg/天，更具體而言50μg/kg/天至100μg/kg/天。在本發明之一實施例中，醫藥組成物可每天一至三次給藥，但不限於此。
在本發明之一實施例中，化妝品組成物可以適於局部應用之所有形式來提供。舉例而言，該等形式可經提供為溶液、藉由油相在水中之分散獲得之水乳液、藉由水在油相
中之分散獲得之水乳液、懸浮液、固體、凝膠、粉末、糊劑、泡沫、或氣溶膠。該等形式可藉由此技術領域中之習知工業方法製造。
在本發明之一實施例中，化妝品組成物可在不會損害主效應之水準內包括可合意地增加主效應之其他成分。在本發明之一實施例中，化妝品組成物可另外包括潤膚膏、軟化劑、表面活化劑、UV吸收劑、防腐劑、殺真菌劑、抗氧化劑、pH值調節劑、有機顏料或無機顏料、芳香劑、冷卻劑或止汗劑。上述成分之配方比可在不會損害本發明之目的及效應的水準內藉由熟習此項技術者決定，且基於化妝品組成物之總重量的配方比可為以重量計0.01%至5%，具體而言以重量計0.01%至3%。
在本發明之一實施例中，食品組成物不局限於形式，但例如可為顆粒、粉末、液體及固體形式。每一形式可以由熟習此項技術者適當選取之常用於工業中的成分(除有效成分外)組成，且可增加具有其他成分之效應。
對於上述有效成分之劑量的判定係在熟習此項技術者之水準內，且每日劑量例如可為1μg/kg/天至10mg/kg/天，更具體而言10μg/kg/天至1mg/kg/天，更具體而言50μg/kg/天至100μg/kg/天，但不限於該等數量且可根據年齡、健康狀態、並發病及其他各種因數而變化。
本文使用之術語意欲用來描述實施例，而非用來限制本發明。前文數不勝數之術語不欲限制量而是表示可存在一個以上的所使用術語之事物。術語「包括」、「具有」、
「組成」及「包含」應為開放解釋(亦即，「包括但不限於」)。
使用數量之範圍之提及代替說明範圍內之分開數量，因此除非明確說明，否則每一數量可讀作本文整合之分開數量。所有範圍之端值係包括在範圍內且可經獨立組合。
除非另作說明或明顯同上下文相矛盾，否則本文提及之所有方法可按適當順序執行。除非包括在申請專利範圍內，否則任一實施例及所有實施例或示例性語言(例如，使用「類似......」之語言)之使用係用來更清楚描述本發明，而不是限制本發明之範疇。在申請專利範圍外之本文任何語言將不會解釋為本發明之必需品。除非另外界定，否則本文使用之技術術語及科學術語具有本發明所歸屬之熟習此項技術者通常理解的意義。
本發明之較佳實施例係為執行本發明之發明者所熟知的最佳模式。對熟習此項技術者而言，先於較佳實施例中之變化而讀取聲明之後，可為清楚的。本發明者希望熟習此項技術者可充分使用該等變化且以不同於本文所列舉之其他方式進行本發明。因此，如專利法所允許，本發明包括在隨附申請專利範圍中所說明之關鍵點的等效物及等效物之變化。另外，在上述組分之任何組合內的所有可能變化係包括在本發明中，除非另外明確說明或同上下文相矛盾。儘管本發明係藉由示例性實施例描述及表示，但熟習此項技術者將很好理解，在不脫離本發明之精神及範圍的情況下可存在藉由下文申請專利範圍所界定之形式及細節上的各種變化。
實例1：胜肽之合成
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽係根據固相胜肽合成之現有方法來合成。更具體而言，胜肽係藉由使用ASP48S(Peptron公司，大田市，大韓民國)經由Fmoc固相胜肽合成(solid phase peptide synthesis；SPPS)自C端偶合每一胺基酸而合成。彼等胜肽經使用如下，彼等胜肽在C端之第一胺基酸附著至樹脂：NH2-離胺酸(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂
NH2-丙胺酸-2-氯-三苯甲基樹脂
NH2-精胺酸(Pbf)-2-氯-三苯甲基樹脂
合成胜肽之所有胺基酸在N端係藉由Fmoc保護，且胺基酸殘基係藉由可溶於酸之Trt、Boc、t-Bu(t-丁酯)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯基)保護。諸如：Fmoc-丙胺酸-OH、Fmoc-精胺酸(Pbf)-OH、Fmoc-麩胺酸(OtBu)-OH、Fmoc-脯胺酸-OH、Fmoc-亮胺酸-OH、Fmoc-異亮胺酸-OH、Fmoc-苯丙胺酸-OH、Fmoc-絲胺酸(tBu)-OH、Fmoc-蘇胺酸(tBu)-OH、Fmoc-離胺酸(Boc)-OH、Fmoc-麩醯胺(Trt)-OH、Fmoc-色胺酸(Boc)-OH、Fmoc-蛋胺酸-OH、Fmoc-天門冬醯胺(Trt)-OH、Fmoc-酪胺酸(tBu)-OH、Fmoc-胺基己酸-OH、Trt-巰乙酸。
HBTU[2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-六氟磷酸四甲銨]/HOBt[N-羥基苯並三唑]/NMM[4-甲基嗎啡啉]係用作偶合試劑。使用含20%哌啶之二甲基甲醯胺(dimethyl formamide；DMF)移除Fmoc。為自殘基移除保護或使所合成胜肽與樹脂分離，使用分裂混合物[三氟乙酸(trifluoroacetic acid；TFA)/
三異丙基矽烷(triisopropylsilane；TIS)/乙二硫醇(ethanedithiol；EDT)/H2O=92.5/2.5/2.5/2.5]。
胜肽合成係藉由使用固相分子框架以下列過程之重複而執行：以胺基酸保護開始、每一胺基酸之單獨反應、以溶劑洗滌及去保護。藉由使用結合至具有胺基酸保護之開始胺基酸的固相分子框架、使相應胺基酸單獨反應、以溶劑洗滌及去保護以及重複過程合成胜肽。在自樹脂釋放後，所合成胜肽係藉由高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography；HPLC)淨化、藉由質譜分析法驗證且冷凍乾燥且藉由MS驗證合成且隨後冷凍乾燥。
特定胜肽合成過程係基於具有SEQ ID NO：7之PEP 1之合成過程描述如下。
1)偶合
將以NH2-離胺酸(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂保護之胺基酸(8當量)與熔融在DMF中之偶合劑HBTU(8當量)/HOBt(8當量)/NMM(16當量)混合在一起，且在室溫(room temperature；RT)下培育達2小時。在培養後，反應混合物經受DMF、MeOH及DMF之順序洗滌。
2)Fmoc去保護
添加含20%哌啶之DMF且在RT下培育達5分鐘2次，隨後以DMF、MeOH及DMF順序洗滌。
3)藉由反復重複反應1)及反應2)構成胜肽之鹼性框架NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf
)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂。
4)分裂：添加分裂混合物至完全合成之胜肽，且使所合成胜肽與樹脂分離。
5)將預冷卻乙醚添加至所獲得混合物內，且隨後使用離心分離作用沉澱所聚集之胜肽。
6)在藉由Prep-HPLC淨化之後，分子重量係藉由LC/MS確定且經冷凍乾燥以產生粉末形式。
實例2：CPP及FITC共軛物之製造
(1)FITC-CPP共軛物之合成
標記有FITC之具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽之共軛物經製造如下，例如，具有SEQ ID NO：7之pep1之共軛物，換言之，FITC-連接子-pep1經製造如下。
根據實例1獲得之胜肽之鹼性框架NH2-連接子-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂係與FITC反應。具體而言，將螢光素-5-異硫氰酸鹽(FITC)(8當量)與N,N-二異丙基乙基胺(N,N-Diisopropylethylamine；DIPEA)(16當量)熔融在DMF中。添加DMF溶液且在室溫下反應達2小時，隨後以DMF、MeOH及DMF順序洗滌以獲得FITC-連接子-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂。本文之連接子為6-胺基己酸(Ahx)。TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5經添加至在上述所合成樹脂上之胜肽，且共軛物係與樹脂分離。預冷卻乙醚經添加至混合物，且所得共軛物係藉由離心分離作用沉澱。在藉由
Prep-HPLC淨化之後，純度係藉由分析HPLC確定且分子重量係藉由LC/MS決定。上文所獲得之物質係藉由由LC/MS確定分子重量而識別為FITC-pep1。隨後，將共軛物冷凍乾燥。
(2)CPP-FITC共軛物之合成
胜肽之鹼性框架(NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基樹脂)係根據實例1來製造。為選擇性引入FITC至胜肽鹼性框架之C端，鹼性框架之N端係受Boc保護。隨後，將二碳酸二叔丁酯(30當量)與DIPEA(30當量)熔融在DMF中。添加DMF溶液且在室溫下反應達2小時，隨後以DMF、MeOH及DMF順序洗滌以獲得Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基樹脂。使用含2%肼之DMF來移除Dde以添加FITC至C端之殘基K，該Dde為C端殘基離胺酸之保護基。隨後，將FITC(8當量)與DIPEA(16當量)熔融在DMF中，且添加DMF溶液且在室溫下反應達2小時，隨後以DMF、MeOH、DMF順序洗滌以獲得Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(FITC)-2-氯-三苯甲基樹脂。添加TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5至胜肽-樹脂以使胜肽與樹脂分離。添加預冷卻乙醚至混合物，且執行離心分離作用以沉澱胜肽。在藉由Prep-HPLC淨化之後，純度係藉由分析HPLC確定且分子重量係藉由LC/MS確定。所獲得物質經證明是
pep1-FITC。隨後將共軛物冷凍乾燥。
實例3：pep(CPP)-EGFP融合蛋白質之製造、表現及淨化
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽與增強型綠螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein；增強型EGFP)(SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10)之融合蛋白質經製造如下。
(1)pET21a-EGFP-組胺酸-標籤重組DNA選殖之製造
首先，引子鹼基序列經產生以包含如表3中所列舉之限制酶以選殖EGFP(增強型綠螢光蛋白)至pET21a(+)載體(Novagen)，其中pEGFP-N1載體作為模板鏈。
EGFPF(正向)引子經產生以含有具有20個EGFP序列之NdeI及EcoRI之限制酶位點。EGFP-R(反向)經產生以含有具有30個EGFP序列之XhoI之限制酶位點。
對於DNA擴增，將100pmol之引子及2.5U之Taq DNA聚合酶添加至50μl之10mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH 9.0)溶液，該溶液含有50mM KCl、0.1% Triton X-100、1.5mM MgCl2及150μM之四種類型脫氧核苷三磷酸(Deoxynucleotide triphosphates；dNTP)(脫氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate；dATP)，脫氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate；dTTP)，脫氧鳥苷三磷酸(Deoxyguanosine triphosphate；dGTP)，脫氧胞苷三磷酸(Deoxycytidine triphosphate；dCTP))。在10nmg之pEGFP質體DNA作為模板鏈的情況下，使pEGFP質體DNA在聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction；PCR)分室中在95℃下變
性達5分鐘。執行具有在95℃下30秒、在46℃下30秒及在72℃下45秒之溫度改變的30次循環之PCR且擴增之PCR產物係以瓊脂糖凝膠電泳驗證。
產物係在存在於pET21a載體之多重選殖位點(multiple cloning site；MCS)中之NdeI及XhoI限制酶位點上選殖且產生pET21a-EGFP-組胺酸標籤重組DNA選殖。
(2)pET21a-pep(CPP)-EGFP-組胺酸標籤重組DNA選殖之製造
如表4中所列舉之引子鹼基序列經產生以獲得SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之pep(CPP)-EGFP-組胺酸標籤融合蛋白質。
每一F(正向)引子經產生以含有具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之pep(CPP)DNA之鹼基序列的NdeI之限制酶位點。每一R(反向)引子經產生以含有EcoRI及SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之pep(CPP)DNA之鹼基序列的限制酶位點。
將10uM之每一F-R引子添加至含有10mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH 7.5-8.0)、50mM KCl、1mM乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid；EDTA)之500μl溶液以合成寡核苷酸。使引子在PCR分室中在95℃下變性達2分鐘且引子係在25℃之低溫下反應達45分鐘且保持在4℃下。
所合成寡核苷酸產物係以NdeI及EcoRI限制酶分裂且在pET21a-EGFP-組胺酸標籤重組DNA選殖之NdeI及EcoRI限制酶位點上選殖，因此製造SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之pET21a-pep(CPP)-EGFP-組胺酸標籤重組DNA選殖(第1圖)。
(3)融合蛋白質之表現及淨化
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之PET21a-EGFP-組胺酸標籤重組DNA選殖及pET21a-pep(CPP)-EGFP-組胺酸標籤
重組DNA選殖經轉形成細菌及隔離蛋白質。具體而言，選殖係使用大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen，卡爾斯巴德，加尼福利亞州，美國)轉形，在5ml LB/安比西林培養基中生長且轉移至100ml培養基中並在100ml培養基中培養。安比西林係以50μg/ml之比率添加。轉形細胞係在37℃下在旋轉器中培養達2至3小時，且藉由量測吸收度生長約0.6至0.8。隨後，細胞係以0.1mM至1mM之異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG)處理以誘導融合蛋白質之表現，且在16℃至37℃下培養達額外的3至16小時且以5000rpm使細胞離心作用達5分鐘。
可視覺上確定所表現蛋白質之離心分離之結果，該結果顯示綠色表示之蛋白質之過度表現。所表現蛋白質係根據製造者之說明書使用Ni-TAT蛋白質分離試劑盒(Prod，#31314，Quiagen，美國)、組胺酸標籤淨化試劑盒隔離。
在分離之後，蛋白質經透析、淨化且濃縮。具體而言，蛋白質係使用無菌4℃ PBS淨化。首先，滲析管係與PBS平衡且將上述分離之蛋白質溶液用5ml注射器添加至管，且在4℃下利用攪拌透析。所透析蛋白質係藉由在BIBASPIN 20(Prod，#VS2092，Sartorius Stedin biotech，德國)中在3000rpm、4℃下之離心分離作用濃縮以增加蛋白質之濃度且移除不必要物質。
實例4：pep(CPP)-FITC共軛物之穿膜性質
(1)共軛物在HeLa細胞系中之穿膜性質
細胞培養
自ATCC之HeLa細胞(人類宮頸腺癌細胞系)係在37℃下在5% CO2培育箱中保持在含有10%胎牛血清(Invitrogen，美國)、厄爾氏鹽、非必要胺基酸、丙酮酸鈉、100μg/mL青黴素及100單元/mL鏈黴素之最低必需培養基(Minimum Essential Medium；MEM)中。
流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析
HeLa細胞係以SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽處理，該等胜肽為pep(CPP)。執行流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析以比較CPP胜肽與對照組之細胞攝入的程度。
將細胞播種在6井板上且在37℃下培養達12小時。隨後，細胞係以PBS洗滌且在無血清MEM中培育達1小時以誘導饑餓。在饑餓後，細胞係在37℃下以20uM之每一胜肽處理達1小時。隨後，細胞係以PBS洗滌3次，且在37℃下以胰蛋白-EDTA處理達10分鐘以移除結合至細胞膜或在細胞外之胜肽。細胞係在冷PBS中收穫、洗滌3次且藉由離心分離作用形成聚合體。聚合體係懸浮在含有4%多聚甲醛之5ml PBS中，且螢光訊號係藉由FACS Calibur(美國BD公司)量測。各種胜肽共軛物之細胞攝入係相對於未以任何胜肽處理過之對照物來比較，且藉由平均螢光強度(mean fluorescence intensity；MFI)量化。
將培養之細胞播種在分室孔中且在含有10%胎牛血清(Invitrogen，美國)、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之培養基中在37℃下培養達12小時。隨後，細胞係以PBS洗滌且在無血清MEM中培育達1小時以誘導饑餓。在饑
餓後，細胞係在37℃下以1.5uM之每一pep(CPP)-EGFP融合蛋白質處理達2小時。隨後，細胞係以冷PBS洗滌3次且在室溫下以2%(v/v)多聚甲醛固定達15分鐘。細胞核係在室溫下以DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，且細胞經比較且藉由共軛焦顯微鏡分析來分析。分析之結果係圖示在第2圖至第7圖中。
(2)在Huh7細胞系中之穿膜性質
細胞培養
來自美國細胞培養收藏中心(American Type Cell Culture；ATCC)之Huh7(人類肝細胞癌)細胞係在37℃下在5% CO2培育箱中保持在具有10%胎牛血清(Invitrogen，美國)、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基中。
穿膜性質藉由流式細胞儀分析之篩選
執行流式細胞儀分析以決定在以具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽處理過之Huh7細胞系中之胜肽的穿膜性質。使用如上文(1)中針對HeLa細胞所描述之分析方法。分析之結果係圖示在第8圖至第11圖中。
(3)在人類T淋巴球細胞系中之穿膜性質
細胞培養
來自ATCC之Jurkat細胞(人類T細胞白血病細胞系)係在37℃下在5% CO2培育箱中保持在具有10%胎牛血清(Invitrogen，美國)、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基中。
人類淋巴球細胞之分離係藉由在自健康對象獲得血液樣本(50ml)之後使用Biocoll分離溶液(Biochrom AG，柏林，德國)收集周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells；PBMC)及淋巴球細胞而執行。
穿膜性質之流式細胞儀分析
執行流式細胞儀分析以決定在以具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽處理過之人類T淋巴球細胞系中之胜肽的穿膜性質。使用如上文(1)中針對HeLa細胞所描述之分析方法。分析之結果係圖示在第12圖至第15圖中。
(4)細胞活性及細胞毒性之分析
將HeLa細胞鍍至96井板上且在開始實驗之前培養達12小時。隨後，細胞係以PBS洗滌且在無血清MEM(最低必需培養基)中培育用於饑餓。20μM之每一胜肽經添加至細胞且在37℃下在5% CO2培育箱中培育達24小時。隨後，細胞活性及毒性係藉由MTT測定分析。分析之結果係圖示在第16圖至第21圖中。
實例5：pep(CPP)-EGFP融合蛋白質之細胞穿膜性質
細胞培養
來自ATCC之HeLa細胞(人類宮頸腺癌細胞系)係在37℃下在5% CO2培育箱中保持在含有10%胎牛血清(Invitrogen，美國)、厄爾氏鹽、非必要胺基酸、丙酮酸鈉、100μg/mL青黴素及100單元/mL鏈黴素之MEM(最低必需培養基)中。
流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析
上述細胞係以藉由組合本文SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之胜肽與作為報告基因之EGFP(增強型綠螢光蛋白)製造之融合蛋白質來處理。執行流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析以比較pep(CPP)-EGFP融合蛋白質處理組與對照組之細胞的攝入程度。對照組係未以pep(CPP)-EGFP融合蛋白質處理之群組及僅以EGFP處理之群組。
將細胞播種在12孔培養板上且在37下培養達12小時。隨後，細胞係以PBS洗滌且在無血清MEM中培育達1小時以誘導饑餓。在饑餓後，細胞係在37℃下以3uM之每一胜肽處理達1小時。隨後，細胞係以冷PBS洗滌3次，且在37℃下以胰蛋白-EDTA處理達10分鐘以移除結合至細胞膜或在細胞外之胜肽。細胞係在冷PBS中收穫、洗滌3次且藉由離心分離作用形成聚合體。聚合體係懸浮在含有4%多聚甲醛之0.5ml PBS中，且螢光訊號係藉由FACS Calibur(美國BD公司)量測。相對於對照組比較各種胜肽共軛物之細胞攝入，且各種胜肽共軛物之細胞攝入係藉由平均螢光強度(mean fluorescence intensity；MFI)量化，該等對照組係未以pep(CPP)-EGFP融合蛋白質處理之群組及僅以EGFP處理之群組。
將培養之細胞播種在分室孔中且在含有10%胎牛血清(Invitrogen，美國)、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之培養基中在37℃下培養達12小時。隨後，細胞係以PBS洗滌且在無血清MEM中培育達1小時以誘導饑餓。在饑
餓後，細胞係在37℃下以1.5uM之每一pep(CPP)-EGFP融合蛋白質處理達2小時。隨後，細胞係以冷PBS洗滌3次且在室溫下以2%(v/v)多聚甲醛固定達15分鐘。細胞核係在室溫下以DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，且細胞經比較且藉由共軛焦顯微鏡分析來分析。分析之結果係圖示在第22圖至第27圖中。
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Claims (27)
- 一種一穿膜乘載胜肽及一有效成分之共軛物，其中該乘載胜肽為包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一個胺基酸序列之該胜肽、具有與該等上述胜肽序列超過80%同源性之該胜肽或該等上述胜肽之該片段，其中具有與該等序列超過80%同源性之該胜肽及該片段為保持SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一者之穿膜能力的該等胜肽。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該片段係由至少3個胺基酸組成。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽係由30個或更少胺基酸組成。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽為具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之至少一個胺基酸序列的該胜肽或具有與該等上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的該胜肽。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該有效成分為選自以下各者中之至少一者：蛋白質、核酸、胜肽、脂質、乙二醇脂質、礦物、糖、奈米粒子、生物製品、對比造影劑、藥物及化合物。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽及該有效成分係經由一共價鍵組合，藉由一連接子選擇性間接。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽及該有效成分係經由非共價鍵組合。
- 如請求項7所述之共軛物，其中該有效成分為一蛋白質或一胜肽。
- 如請求項8所述之共軛物，其中該有效成分為一細胞介素、抗體、抗體之片段、治療酶、可溶受體或配位子。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽係與螢光異硫氰酸鹽共軛。
- 如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽係與綠螢光蛋白(Green Fluorescent Protein；GFP)共軛。
- 如請求項5所述之共軛物，其中該對比造影劑係選自由以下各者組成之群組：不透射線對比造影劑、順磁對比造影劑、超順磁對比造影劑及CT對比造影劑。
- 如請求項12所述之共軛物，其中該對比造影劑係基於鐵。
- 如請求項13所述之共軛物，其中該對比造影劑為一二茂鐵羧酸鹽。
- 一種對比造影劑，該對比造影劑包含如請求項1至14中任一項所述之共軛物。
- 如請求項15所述之對比造影劑，其中該對比造影劑係用於對比造影一細胞。
- 如請求項16所述之對比造影劑，其中該細胞為一幹細胞。
- 一種組成物，該組成物包含如請求項1至14中任一項所述之共軛物作為一有效成分。
- 如請求項18所述之組成物，其中該有效成分係用於治療或預防疾病，且其中該組成物為一醫藥組成物。
- 如請求項18所述之組成物，其中該有效成分為功能性化妝品之一有效成分，且其中該組成物為一化妝品組成物。
- 如請求項18所述之組成物，其中該有效成分為健康功能食品之一有效成分，且其中該組成物為一健康食品組成物。
- 一種用於輸送有效成分至一細胞內之方法，該方法包含給需要之該對象施用如請求項1至14中任一項所述之共軛物的一步驟，其中該乘載胜肽為執行該有效成分至一細胞內之輸送的一穿膜胜肽，其中具有與該等序列超過80%同源性之胺基酸序列之該胜肽及該片段為保持SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一胜肽之穿膜能力的該胜肽。
- 如請求項22所述之方法，其中該方法為在一細胞內部局部地輸送該有效成分至粒線體內。
- 一種穿膜胜肽，其中該胜肽由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6之任一胺基酸序列組成。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項24所述之胜肽。
- 一種載體，該載體包含如請求項25所述之多核苷酸。
- 一種轉形細胞，該轉形細胞包含如請求項26所述之載體。
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