TW201416085A - 一種可用來提高肝臟保護功能之黑蒜頭食品 - Google Patents
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Abstract
肝臟為人體解毒及代謝作用的重要器官,而造成肝病的兩主因為酗酒和肝炎病毒感染。隨著全球酒精消費量的增加,使得酒精性肝病的發病率顯著上升,此機轉與自由基的產生有密切關係,因此具有預防或減緩酒精性肝損傷的抗氧化食品乃成為營養醫學重要議題。本發明以酒精液體飼料誘發大白鼠形成慢性酒精性肝炎後,以黑蒜頭進行餵食試驗,並利用肝臟及血液生化活性之檢測來判斷攝食黑蒜頭是否具有維護肝臟功能。結果顯示,控制組和實驗組因每日攝食含酒精之飲食,因此血漿中天門冬胺酸轉胺酶(AST)與丙胺酸轉胺酶(ALT)之酵素的活性隨著飼養週期的增加而提高;但餵食黑蒜頭之實驗組,隨著每組劑量的提高血液生化活性值都有下降的效果。另外,餵食黑蒜頭組皆顯著比控制組有較低的肝醣含量之趨勢。從餵食黑蒜頭降低血漿ALT、AST活性的情形來看,肝醣含量減少(肝醣分解)亦也是提供修補肝損傷的能量。酒精肝臟害大白鼠攝食黑蒜頭後,提高酒精肝障害大白鼠肝臟抗氧化酵素GPx的活性表現,其可催化過氧化氫和脂質氫過氧化物的分解並消耗GSH含量,因此,黑蒜頭組之GSSG含量顯著較控制組高。黑蒜頭組之GSH、GSSG含量及GSH/GSSG比值顯著較控制組高,整體上,攝食黑蒜頭能有效增強酒精肝障害大白鼠抗氧化能力。本發明為揭示黑蒜頭對酒精誘發肝臟損傷氧化傷害之保護效果。
Description
一種用來保護已受酒精損傷肝臟之黑蒜頭食品及其用途。
國人罹患肝臟疾病的原因主要是因為病毒的感染,根據行政院衛生署的九十九年統計資料顯示,慢性肝病及肝硬化等肝臟疾病位居國人十大死因的第八位。另外藥物的濫用、長期酗酒等也是國人罹患肝臟疾病的原因;有鑑於此保肝食品的開發為當務之急。
近年來,台灣地區酒精類飲料的消費量大幅提昇,使酒精性肝臟疾病罹患率也相對提高。長期攝取酒精之後,在人體內引起之生化以及病理學上之傷害非常複雜,而其中受影響最深的組織就是酒精代謝的主要組織-肝臟。長期攝取酒精所造成之肝臟損傷包括:脂肪肝、酒精性肝炎以及肝硬化等,若不即時治療更會引起肝癌。
經研究顯示,患有酒精性肝炎的病人容易受到病毒的侵入而併發病毒性肝炎,其中又以酒精性肝炎併發B型及C型肝炎罹患率最高;而病毒性慢性肝炎的病人攝取酒精後,肝臟疾病也會快速惡化,增加併發症及死亡機率。因此,在病毒性慢性肝炎罹患率高的台灣地區,更應該重視酒精攝取所引起的肝臟疾病問題。
脂肪肝是酒精性肝臟疾病最早的病徵。研究顯示,罹患酒精性脂肪肝的病人形成肝纖維化與肝硬化的機率大為增加,另有研究指出,脂肪肝與肝癌的發生具有相關性(Teli et al.,1995)。因此,若能改善脂肪肝的情形,就能降低發生肝纖維化與肝硬化的機會。然而,目前並沒有有效治療脂肪肝的方法,臨床上大多建議病人少吃油脂含量多的食物,多攝取蔬菜水果,適當運動與保持正常作息,最重要的是禁止酒精的攝取。但是對於罹患脂肪肝之酒精依賴症的病人,短時間內戒酒是十分困難的,若能計畫性降低酒精攝取搭配食用可以降低脂肪肝的食品,可達到最大治療的效果。
根據近年來的研究報告指出,酒精性肝臟疾病之形成與自由基有密切的關聯性(Lieber and DeCarli,1994)。身體之Microsomal Ethanol Oxidizing System(MEOS)MEOS在代謝酒精時,會同時誘導cytochrome P450ⅡE1以及xanthine oxidase pathway產生活性氧類(reactive oxygen species,ROS),尤其是超氧自由基(superoxide free radicals)及氫氧自由基(hydroxyl free radicals)。因此在大量酒精出現於體內時,自由基之生成也隨之增加,危害身體組織(Porta et al.,1997)。
因此,長期攝取酒精會造成體內抗氧化酵素活性與抗氧化能力降低,使得脂質過氧化物大量產生,進而引起各種酒精性肝臟疾病(Rouach et al.,1997)。
之前研究護肝的配方往往都是用單一配方或使用複方方式為之,如專利公告第277413號,其技術內容揭示glycine(甘胺酸)、alanine(丙胺酸)、taurine(牛磺酸)、Vit C(維他命C)、vit E(維他命E)搭配而成之一種可用來保護肝臟的胺基酸、維生素組合物。
所以本發明收集文獻上研究的配方,由肝臟損傷的路徑,找尋最佳的天然食物,而是否具有天然食材的加入及風味的考量於本發明中也給予注意到,希望可以找到一種食品,可用來保護已受酒精障害之肝臟及增強該肝臟代謝能力。
肝臟是人體負責解毒或代謝作用重要器官。而酗酒與肝炎病毒感染是造成肝病的兩個主要病因,隨著全球酒精消費量逐年增加,也使得酒精性肝病(alcohol liver disease)的發病率明顯上升,其中機轉與自由基的產生有密切關係,因此找尋預防或減緩酒精性肝損傷的抗氧化食品為營養醫學重要議題。
酒精濫用(alcohol abuse)、酒精依賴(alcohol dependence)以及其他酒精引起之健康問題是現代社會極具挑戰性及重要性之公共衛生健康課題。長期攝取酒精之後,在人體內引起之生化以及病理學上之傷害是非常複雜的,而其中受影響最深的組織就是酒精代謝的主要組織-肝臟。長期攝取酒精所造成之肝臟損傷包括:脂肪肝、酒精性肝炎以及肝硬化等,若不即時治療更會引起肝癌。脂肪肝主要是因為肝臟中發生脂肪堆積的現象,而酒精性肝炎則是指肝細胞遭受破壞,引起肝臟廣泛發炎的現象。
酒精在人體內的代謝作用主要發生於肝臟。已知酒精在肝臟內主要經由醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase;ADH)轉換成乙醛,再經由乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase;ALDH)轉換成乙酸,排出體外。因此在研發減緩或消除食用含酒精成分物質後產生的種種不適反應之相關領域中,多對於代謝酒精的酵素進行研究。
例如有研究顯示萃取自綠茶的茶胺酸(theanine)可增加肝臟中ADH及ALDH的濃度,而且可誘導具有抗氧化功能的穀胱甘肽(glutathione;GSH)的濃度升高,顯示酒精及茶胺酸之組合可降低血中酒精濃度,減少食用酒精後對肝臟的傷害(Yasuyuki S.et al.,Biol.Pharm.Bull.28(9)1702-1706(2005))。
在2004年Erman等人在評估betaine或taurine預防肝纖維化之護肝功能時,在大白鼠飲水中添加5%酒精(v/v),另外每週兩次腹腔注射四氯化碳(0.2 mL/kg BW),四週後老鼠的肝臟有纖維化的情形,顯示酒精引起之肝臟受損是緩慢且非急性的,若要短時間達到嚴重之肝損傷,必須加入誘導劑,例如增加脂質含量或另外注射四氯化碳才能達成,而酒精搭配四氯化碳誘導的肝纖維化與人類之酒精性肝硬化相似。
M.Kano等人也提出大豆醱酵乳產品在老鼠急性及慢性食用含酒精食物後餵食,可增加胃內酒精濃度、降低血液中的酒精濃度、提高細胞內穀胱甘肽硫轉換酶(glutathione S-transferase;GST)活性及使ALDH活性升高,認為大豆醱酵乳產品可抑制酒精的吸收及促進酒精代謝(M.Kano,et al.,J Nutr 132:238-244(2002))。
另有複合的中草藥萃取物揭露具有減緩或消除宿醉症狀及相關毒性反應的功效,例如M.V.Venkataranganna等人提出以羅比親王海棗(Phoenix dactylifera)、橡樹(Cichorium intybus)、穿心蓮(Andrographis paniculata)、葡萄(Vitis vinifera)、小還魂(Phyllanthus amarus)及印地安鵝莓(Emblica officinalis)組合的複方草藥,可使肝臟的ADH、ALDH活性升高,促進酒精及乙醛的代謝。
美國專利案US 4,496,548也揭示一種防止宿醉之組合物,包含硫胺素(維生素B1)、抗壞血酸(維生素C)、胱胺酸(cystein)及類黃酮(flavonoid)複合物。另外,中國專利公開案CN 101332289 A揭露一種醒酒保肝的保健品,包含甘草萃取物、恰瑪古萃取物、生薑萃取物、胺基酸、維生素、牛磺酸、葉酸、鈣、鎂、鋅、鉀等。
黑蒜頭是以蒜頭經過特殊製程發酵而成。黑蒜頭使造成刺激的蒜素轉化成無蒜臭、低刺激性的S-烯丙基半胱氨酸成分,食用黑蒜頭不會產生難聞的口氣及刺激腸胃的感覺,同時,S-烯丙基半胱氨酸成分還具有預防心肌梗塞、腦梗塞和動脈硬化的功效。黑蒜頭比生蒜的多酚類物質含量多10倍以上,抗氧化能力大大增強;SOD活性達到普通大蒜的10倍;游離氨基酸含量是生蒜的1.5倍,更易於為人體吸收;且味道酸甜似果脯,食後不會產生難聞的口氣,是無任何添加劑、營養成分豐富、美味可口的純綠色食品。
日本弘前大學醫學部教授佐佐木甚-通過白老鼠試驗證明,黑蒜頭的有效成分可提高免疫力。在具有抗氧化功能的300多種食品對比中,黑蒜的抗氧化能力名列前茅,它有效的抗癌的成份或其他一些有功效的含硫化合物大概會增強三到五倍,抗氧化力提升十倍以上。
本發明之黑蒜頭可適當投予動物,例如人、狗、貓、豬、牛、羊、或其他哺乳動物。
投予路徑可包括口服、皮下注射、肌肉注射、或類似的投予路徑,考慮便利性,較佳以口服投予。
本發明之黑蒜頭成份可以溶劑萃取(包括例如水、酒精、丙酮等等),但考慮方便性及消費者習慣,較佳為直接口服、未來商品化後作成水溶液、糖漿或膠囊型態皆無受限。本發明之具體實施詳細說明如下,然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容,不應藉以限制本案的發明範疇。
本發明以酒精液體飼料以誘發大白鼠形成慢性酒精性肝炎後,以黑蒜頭進行餵食試驗並利用肝臟及血液生化活性之檢測,判斷攝食黑蒜頭是否具有維護肝臟功能,做為本發明之實施方式之基礎。
以市售黑蒜頭進入冷凍乾燥機,磨成粉末。
本發明之動物模式及實驗設計參考Moon-Hee Kim et al.,Effect of an Acute Ethanol Administration on Rat Liver Alcohol ehydrogenase, Korean Biochem. J.(1993) Vol. 26,No. 5 p.402-407 ; Yasuyuki Sadzuka et al.,Effects of Theanine on Alcohol Metabolism and Hepatic Toxicity. Biol Pharm. Bull. 28(9) 1702-1706(2005);及M. V. Venkataranganna et al.,Pharmacodynamics & toxicological profile of PartySmart,a herbal preparation for alcohol hangover in Wister rats. Indian J Med Res 127 ,May 2008,p.460-466.。此述之文獻併入本案之發明內容中。
利用雄性Wistar品系大白鼠,以二週齡、重約120 g,飼養環境為室溫23±2℃、相對濕度55±10%、12小時明暗自動更替,大白鼠個別飼養於不銹鋼吊籠之中。
根據Lieber-DeCarli之方法(1976),依體重大小及有無黑蒜頭之酒精流質飲食,分成兩大部份:分別為有無餵食黑蒜頭之酒精所誘發之肝障害大白鼠,本發明飼養的飼料配方如表一所示,飼養方式依實驗室大白鼠飼養方式飼養。
所有二週齡大白鼠先以正常流質飲食預養一週後,取血液樣本進行丙胺酸轉胺酶(ALT)活性及天門冬胺酸轉胺酶(AST)活性,確認實驗之大白鼠的生化反應值正常;再進行酒精流質飲食試驗二週,再以相同方法篩選出大白鼠血液中ALT及AST活性高者(前標30%),藉此二血液生化值判斷應罹患酒精肝障害。之後分成:無餵食黑蒜頭之酒精所誘發之肝障害大白鼠(控制組)、餵食黑蒜頭之酒精所誘發之肝障害大白鼠(實驗組),進行黑蒜頭餵食試驗,依實驗設計取樣進行生化檢驗。
有關劑量換算法依據體重60kg之成人除以受試物之每日人體建議攝取量,即可得每公斤體重之建議攝取量,再乘以實驗動物相對於人體之代謝係數(大白鼠相對於人體之代謝係數為6.25),即可得該實驗動物每日攝取劑量。以計算式表示則為:大白鼠每公斤體重之攝取劑量=人體建議攝取量÷體重60kg×6.25。蒜頭本身在食材上為天然食品,經發酵熟成為黑蒜頭在文獻上還未有毒性報告的記載。因此實驗中設計投與至實驗動物的劑量為11 g/kg/day、21 g/kg/day及31 g/kg/day;換算成人體相當劑量為100 g/day、200 g/day、300 g/day。
先取1.0ml Enzymatic Kits(Sigma Co.,U.S.A.)之反應基質(No.505-1)放入試管中,於37℃水浴溫熱後,再加入0.2ml的血漿樣品溫和混合後,放入37℃水浴中反應一小時。再取出加入1.0mL之呈色劑(No.505-2),溫和混合後放置於室溫。二十分鐘後加入10.0mL 0.40 N之氫氧化鈉溶液,激烈混合後待測。等待5分鐘後,即可取部分的反應後已呈色溶液以分光光度計以505 nm測其吸光。所得吸光值和標準曲線相較後,以內插法換算即可得到ALT活性。
先取1.0ml Enzymatic Kits(Sigma Co.,U.S.A.)之反應基質(No.505-10)放入試管中,於37℃水浴溫熱後,再加入0.2ml的血漿樣品溫和混合後,放入37℃水浴中反應半小時。再取出加入1.0mL之呈色劑(No.505-2),溫和混合後放置於室溫。二十分鐘後加入10.0mL 0.40 N之氫氧化鈉溶液,激烈混合後待測。等待5分鐘後,即可取部分的反應後已呈色溶液以分光光度計以505 nm測其吸光。所得吸光值和標準曲線相較後,以內插法換算即可得到AST活性。
取一定量之肝臟加入9倍量的0.15 M KCl,以組織均質器均質成肝臟均質液。取870μl反應混合液(含200μl 5units/mlGRd,50μl 40mM GSH pH7.0,400μl Potassium phosphate buffer pH7.4,220μl distilled water)和混合(25℃),五分鐘後再加入10μl NADPH,再2分鐘後即可加入20μl t-tutylhydroperoxide,混合以340nm測定2分鐘內NADPH消失速度。GPx之活性以nmol NADPH oxidized/min/mg protein表示之。
取0.5克肝臟加入5倍1% picric acid予以均質機均質,之後再以10000g離心20分鐘。上層液取5μl供測GSH+GSSG含量。再取100μl上層液加上2-vinylpyridine均勻混合,置室溫1小時後待測其GSSG含量。以20、1、0.1mmol/l glutathione溶液做標準曲線。反應液包含0.7ml NADPH緩衝溶液(0.2mmol/l NADPH,100mmol/l phosphate,5mmol/l EDTA,pH 7.5),0.1ml DTNB溶液(0.6 mmol/l),5μl樣品與195μl二次水,置於石英管混合。達37℃恆溫後,加入5μl GRd溶液,均勻混合以412nm測其3分鐘內吸光值變化。⊿A/⊿t值以內插法可以得到GSH濃度。
取一定量之肝臟加入10倍量的0.1 M Citrate Buffer(pH 4.2),以組織均質器均質後,於4℃、10000g離心30分鐘。取上層液20 μL測定游離葡萄糖含量(測定方法同血漿葡萄糖之測定方法)。其餘的加入Amyloglucosidase粉末振盪混合,置於37℃水浴4小時後,離心(條件同前述)取上層液20μL測定總葡萄糖含量,所得之葡萄糖量減去游離葡萄糖含量即為肝糖含量。
實驗數據以SPSS/PC統計分析軟體作變異數分析(Analysis of variance,ANOVA),測式各實驗組是否有差異,若有差異再以鄧肯氏多變試驗(Duncan’s multiple range test)作進一步分析。此外,也以Student t-test比較各實驗組是否有差異。
Teli MR, Day CP, Burt AD, Bennett MK and James OF (1995) Determinants of progression to cirrhosis or fibrosis in pure alcoholic fatty liver. Lancet 346: 987-990.
Lieber CS and DeCarli LM (1994) Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods Enzymol 233: 585-594.
Porta EA(1997) Dietary modulation of oxidative stress in alcoholic liver disease in rats. J Nutr 127: 912s-915s.
Rouach H, Fataccioli V, Gentil M, French SW, Morimoto M and Nordmann R (1997) Effect of chronic ethanol feeding on lipid peroxidation and protein oxidation in relation to liver pathology. Hepatol 25: 351-355.
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Lieber CS, Lasker JM, DeCarli LM, Saeli J and Wojtowicz T (1988) Role of acetone, dietary fat and total energy intake in induction of hepatic microsomal ethanol oxidizing system. J Pharmacol Exp Ther 247:791-795.
Weber LW, Boll M and Stampfl A (2003) Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model. Crit Rev Toxicol 33: 105-136.
血漿中天門冬胺酸轉胺酶與丙胺酸轉胺酶之活性常作為肝功能檢查的代表值。在表2、實驗結果中,控制組和實驗組因每日攝食含酒精之飲食,因此血漿中二酵素的活性隨著飼養週期的增加而提高;但餵食黑蒜頭之實驗組,隨著每組劑量的提高血液生化活性值都有下降的效果。
肝損傷狀況下,肝醣代謝的改變可以解釋成「為了保護和處理肝損傷」所造成的現象(Sanjay and Harihara,1996)。肝醣的耗損,可以提供五碳糖磷酸途徑中的葡萄糖-6-磷酸原料,有利於NADPH的合成增加,作為抗氧化酵素還原脂質過氧化物之用。在表2中,可明顯看出餵食黑蒜頭組三組皆顯著比控制組有較低的肝醣含量之趨勢。從餵食黑蒜頭降低血漿ALT、AST活性的情形來看,肝醣含量減少(肝醣分解)亦也是提供修補肝損傷的能量。
由表3中可知道,酒精肝障害大白鼠攝食黑蒜頭後,提高酒精肝障害大白鼠肝臟抗氧化酵素GPx的活性表現,其可催化過氧化氫和脂質氫過氧化物的分解並消耗GSH含量,因此,黑蒜頭組之GSSG含量顯著較控制組高。黑蒜頭組之GSH、GSSG含量及GSH/GSSG比值顯著較控制組高,與表2能降低血漿ALT和AST活性的結果來看,整體上,攝食黑蒜頭能有效增強酒精肝障害大白鼠抗氧化能力。
Sanjay, C. and Harihara, M. M. (1996) Role of nutrition in the survival after hepatotoxic injury. Toxicology 111:163-178.
Claims (2)
- 一種用來保護已受酒精損傷肝臟之黑蒜頭食品,其用量為每日至少攝食300克。
- 一種用來保護已受酒精損傷肝臟之黑蒜頭用途,其係用以製備提高酒精損傷肝臟之丙胺酸轉胺酶(ALT)、天門冬胺酸轉胺酶(AST)、麩胱甘肽過氧化酶活性及增加肝醣及還原型與氧化型麩胱甘肽代謝能力之醫藥組成物。
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