TW201408777A - 一種癌症篩檢的檢驗套組 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於癌症之生物標記分子及篩檢的檢驗套組與其檢測方法，係利用分析檢體標的基因PAX1、ZNF582、SOX1以及NKX6-1甲基化區域，設計數段對標的基因特異性的寡核苷酸引子或探針，利用該寡核苷酸探針檢測標的基因甲基化的有無，進一步判斷癌症發生的可能性。甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)、酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等。
Description
本發明係關於癌症之生物標記分子及篩檢的檢驗套組，係利用分析檢體標的基因甲基化區域，設計數段對標的基因具特異性的寡核苷酸引子或探針，利用該具特異性寡核苷酸檢測標的基因甲基化的有無，以判斷癌症發生的可能性。
根據2008世界衛生組織調查結果顯示，癌症是目前世界上十大死亡原因之一，其中男性又以肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、口腔癌致死率較高；女性則為乳癌、肺癌、子宮頸癌、大腸癌致死率較高。因此各國研究者對於能提早預防性檢測或是罹癌預後檢測的方法皆積極研究，且大多數早期癌症若能提早篩檢出來，治癒的機率皆提高許多。傳統檢驗癌症的有無，例如X光、抹片、血液腫瘤標誌、超音波等等，癌症篩檢率約為0.2~0.3%，若再加上消化道內視鏡檢查，篩檢率提高約0.5%，但是上述數據還不足以說服大眾這些一般性健康檢查能有效的早期診斷癌症。然而這些檢驗與判讀往往耗工費時，方便性不足，且篩檢率仍然偏低。
目前科學界普遍了解異常的表遺傳(epigenetic)修飾，對於改變基因表達和誘導腫瘤的形成，發揮了至關重要的作用(Ting et al.,2006)，其中DNA甲基化修飾就是其中一種。影響表現型(phenotype)的訊息，可能存於被修飾過的鹼基5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)中，5-甲基胞嘧啶被發現存在於哺乳類動物細胞內的迴文序列5’-CpG-3’中，在哺乳類動物細胞內除了一些被稱
為“CpG島”(CpG islands,CGIs)的區域之外，大多數的CpG雙核苷酸對都被甲基化，CpG島是指在大約1000個鹼基對(1Kb)的區域內含有大量的GC-以及CpG-，通常位於基因的附近，且在廣泛表現的基因之啟動子附近。胞嘧啶的甲基化發生在DNA合成後，自一甲基捐贈者s-腺核苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine,SAM)將一甲基經酵素轉移到胞嘧啶第5個碳的位置上，該酵素反應係由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)執行，DNMT1是哺乳類動物主要的甲基轉移酶，係負責將半甲基化位置複製後修復(post-replicative restoration)為全甲基化，被稱為維持甲基化(maintenance methylation)；反之，DNMT3A及DNMT3B則被認為主要負責甲基化新的位置，進行一種稱為重新甲基化(de novo methylation)的步驟。CpG雙核苷酸對甲基化的遺失(loss of methylation)，意即一般的低度甲基化，是癌細胞內的第一個超遺傳異常(epigenetic abnormality)；然而，在過去幾年內的研究卻顯示，特定位置(例如：一些腫瘤抑制基因)的高度甲基化(site-specific hypermethylation)與其功能的喪失有關，這可能會在癌症生成時提供選擇優勢(selective advantages)；在啟動子區域上CpG島的高度甲基化，可以藉由組蛋白修飾(histone modification)伴隨接續而來的基因默化現象(gene silencing)，來引起染色質改造(chromatin remodeling)；除了染色體缺失及基因突變之外，經由啟動子的高度甲基化所造成腫瘤抑制基因的超遺傳默化現象(epigenetic silencing)也常見於人類癌症中(Estelle et al.,1999；Herman et al.,2003)。
最近的流行病學研究顯示，血清葉酸鹽(serum folate)的濃度(一種甲基
的主要來源)與HPV的感染和清除有關聯；在甲基週期(methyl cycle)的代謝作用中，酵素的基因多型性(genetic polymorphisms)也曾被報導與子宮頸上皮內病變的發展有關；如同超基因演化的觀念一般，DNA甲基化與子宮頸癌間關聯的研究也同樣盛行，子宮頸癌的DNA甲基化研究日與遽增，顯示使用甲基化作為子宮頸癌篩檢的可能性；由於遺傳與環境交互作用的特性，腫瘤抑制基因甲基化程度，因不同的基因及不同的族群而異，不同的疾病也會有不同的甲基化表現型(methylator phenotypes)；然而，子宮頸癌的甲基化表現型以及其與HPV基因型的關聯仍未知，而子宮頸癌中有何特定的基因會被甲基化，以及需要多少基因方可達到臨床應用的需求，這些問題仍是未來需要被確認的議題。
國防賴鴻政博士先前已於台灣(TW Pat.Pub.No.200831900、TW Pat.Pub.No.201038739)、中國(CN Appl.No.200810094659.2、CN Appl.No.200910135501.X)、馬來西亞(UI20085354)及美國(US Pat.Pub.No.20080311570、US Pat.Pub.No.20110045465)於所屬技術領域中提出相關發明及其不同之技術手段與方法，包括專利之申請(下稱前案)。基因甲基化檢測學理雖發展已有相當時日，亦為學術研究者廣泛使用，然如欲應用於醫療檢測等臨床相關領域，則測試穩定度及具有重複性是非常重要，而甲基化基因檢測目前於醫療檢測上尚未普遍應用，其部分原因除需大量研究來支持標定基因臨床意義及相關驗證外，如何提供穩定的測試方法亦有相當的技術障礙。
本案發明人深刻瞭解前案之不足與缺陷，乃亟思加以改良創新，並經
多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件可適用多種癌症篩檢的方法及其檢驗套組，亦使相關標的基因的甲基化檢測具產業可利用性，例如定義標的基因相關序列及濃度範圍，另外於癌症應用領域亦提供更多資訊予以驗證支持，使標的基因檢測得有重複性結果，並得以應用於醫療領域。本設計癌症篩檢套組可更精確檢驗，並設計以試劑盒的形式，達到更快更方便與更有效率，提供檢驗上之一完善產品。
本發明之目的即在於提供一種檢測套組，其係用以測定一檢測檢體中標的基因CpG序列甲基化的存在，亦即先由檢體萃取出其gDNA，此gDNA經過適當前處理及化學反應，即可使用本檢測套組進行標的基因甲基化的存在測試，本檢測套組包括：(1)一濃度範圍在20 nM-1250 nM標的基因引子混合液，其至少包含有一正向引子與一反向引子，該正向引子、反向引子的序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種，最佳為序列完全相同；(2)一濃度範圍在20 nM-1250 nM內部控制基因核酸分子偵測混合液，其至少包含有一正向引子及一反向引子；(3)一聚合酶連鎖擴增反應主要混合液，其主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及鎂鹽。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，該一內部控制基因核酸分子偵測混合液，其中正向引子、反向引子所包含的序列亦係選自由SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種，最佳為序列完全相同。其中標的基因與內部控制基因的引子可混和成為單管核酸分子偵測混合液。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，該標的基因引子混合液更包含探針，其探針序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種或其互補序列，最佳為序列完全相同；該內部控制基因核酸分子偵測混合液，更包含可偵測內部控制基因擴增產物的探針。藉由本發明進一步提供包含其中內部控制基因正向引子、反向引子所包含的序列係選自SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種，最佳為序列完全相同；探針序列係選自由SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種或互補序列，最佳為序列完全相同。其中標的基因與內部控制基因的引子可混和成為單管核酸分子偵測混合液。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其聚合酶連鎖反應主要混合液，更包含可辨識連鎖擴增反應產物的螢光物質或與選自可與DNA雙股作用產生螢光進而被偵測到的物質，此物質包含SYBR系列物質如SYBER Green,Syber Gold等。。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其中該檢測檢體中之內部控制基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：Col2A、β-Globin、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-actin所組成的群組。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其標的基因與內部控制組基因的探針具有螢光標記，此螢光標記係選自由於任一螢光：FAM、HEX、TET、
TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2及BHQ-3所組成之群組
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其中該檢測檢體中之基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1所組成的群組。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其可更進一步用以檢測不正常細胞增生現象。其中不正常細胞增生包含癌前病變檢測、腫瘤檢測、腫瘤復發檢測或腫瘤用藥預測或癒後效果檢測。其中該惡性腫瘤係為下列群組之一：子宮頸癌、口腔癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、肺腺癌以及皮膚癌。
可達成上述發明目的之檢驗套組，其中連鎖擴增產物之鑑定方法可用螢光法、定序法(sequencing)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。
術語「檢測檢體」係指離體之檢測樣本，該樣本包括子宮頸抹片、腹水、血液、尿液、糞便、痰、口腔黏膜細胞、胃液、膽汁、子宮頸上皮細胞、或手術後之癌症組織等離體之檢體樣本。本發明之癌症篩檢方法，係用於檢測該些離體樣本中之目標基因甲基化的狀態，以作為各類癌症的篩檢指標。本發明所提供之癌症篩檢方法及其篩檢指標，可供檢測研究人員於實驗室中進行檢測。
本發明將就下列實施例作進一步說明，然該等實施例僅為表現與敘述本發明之發明涵義與其精神，故所敘實施例等為例示說明之用，而不應作為限縮或被解釋為實施本發明之限制或僅限於該些所述實施例或方式。
本發明之目的即在於提供一種檢測套組，其係用以測定一檢測檢體中基因CpG序列甲基化的存在，亦即先由檢體萃取出其gDNA，此gDNA經過適當前處理及化學反應，即可使用本檢測套組進行基因甲基化的存在測試，本檢測套組包括：(1)一濃度範圍在20 nM-1250 nM標的基因引子混合液，其至少包含有一正向引子與一反向引子，該正向引子、反向引子的序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種，最佳為序列完全相同；(2)一濃度範圍在20 nM-1250 nM內部控制基因核酸分子偵測混合液，其至少包含有一正向引子及一反向引子；(3)一聚合酶連鎖擴增反應主要混合液，其主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及鎂鹽。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，該一內部控制基因核酸分子偵測混合液，其中正向引子、反向引子所包含的序列係選自由SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種，最佳為序列完全相同。其中標的基因與內部控制基因的引子可混和成為單管核酸分子偵測混合液。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，該標的基因引子混合液更包含
探針，其探針序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種或其互補序列，最佳為序列完全相同；該內部控制基因核酸分子偵測混合液，更包含可偵測內部控制基因擴增產物的探針。藉由本發明進一步提供包含其中內部控制基因正向引子、反向引子所包含的序列係選自SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種，最佳為序列完全相同；探針序列係選自由SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種或互補序列，最佳為序列完全相同。其中標的基因與內部控制基因的引子可混和成為單管核酸分子偵測混合液。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其聚合酶連鎖反應主要混合液，更包含可辨識連鎖擴增反應產物的螢光物質或與選自可與dna雙股鍵結產生螢光進而被偵測到的物質。此物質包含SYBR系列物質如SYBER Green,Syber Gold等。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其中該檢測檢體中之內部控制基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：Col2A、β-Globin、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-actin所組成的群組。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其標的基因與內部控制組基因的探針具有螢光標記，此螢光標記係選自由於任一螢光：FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima
Yellow,BHQ-1、BHQ-2及BHQ-3所組成之群組。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其中該檢測檢體中之基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1所組成的群組。
可達成上述發明目的之一種檢驗套組，其可更進一步用以檢測不正常細胞增生現象。其中不正常細胞增生包含癌前病變檢測、腫瘤檢測、腫瘤復發檢測或腫瘤用藥預測或癒後效果檢測。其中該惡性腫瘤係為下列群組之一：子宮頸癌、口腔癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、肺腺癌以及皮膚癌。
可達成上述發明目的之檢驗套組，其中連鎖擴增產物之鑑定方法可用螢光法、定序法(sequencing)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。
以下為相關具體實施例之敘述，包括材料與檢測方法等，以進一步闡述本發明之技術特徵與功效；惟，可以理解的是，本發明具體實施例或方式不應作為限縮或被解釋為實施本發明之限制或僅限於該些所述實施例或方式。
檢體樣本，先抽取其DNA，在經過重亞硫酸鹽(bisulfite)的轉換，並以表一至表四揭示可用於擴增含有PAX1、ZNF582、SOX1、NKX6-1以及
內部控制組甲基化區域之引子對及探針組(如表一至五)，來進行檢測。試劑盒主要組成如下表六：
PCR擴增反應如下：(i)在95℃下活化聚合酶10分鐘，(ii)在95℃下變性DNA模板10秒及在60℃下鍵合/延長DNA鏈40秒，及(iii)進行變性/鍵合/延長循環30至50次。
PCR擴增反應，其中一組混合物包括一個目標基因及內控組基因的引子對及其探針混和物，引子對為包含一個正向引子及一個反向引子，不同探針則以不同波長且互相干擾性低的螢光進行標記，於本實施例，目標基因探針用FAM標記，內控組探針用VIC標記。除螢光染料外，所有探針亦會加上quencher基團，因此當探針序列和擴增序列能互補結合，則螢光染料會被釋出螢光，進而被偵測到。目標基因甲基化基因的程度由Cp值(循環數值)及訊號強度來決定，而內控基因則可用以校正及偵錯。以本實施例中的PAX1為例，如果PAX1的Cp值和內控基因Cp值差距不超過12，則表示有PAX1有顯著甲基化。其他目標基因依此類推。
本測試應用表一至表四所揭示可用於擴增含有PAX1、ZNF582、SOX1
及NKX6-1甲基化區域之引子對及探針組，來進行不同癌症細胞株檢測，其甲基化狀態分析結果如表七所示。結果顯示，於子宮頸癌相關的細胞株Hela中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆偵測到有甲基化；子宮頸癌相關的細胞株SiHa中，PAX1、ZNF582及SOX1偵測到有甲基化；子宮頸癌相關的細胞株CaSki中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆偵測到有甲基化；子宮頸癌相關的細胞株C-33A中，ZNF582、SOX1及NKX6-1偵測到有甲基化。大腸癌相關的細胞株COLO 205中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆偵測到有甲基化；大腸癌相關的細胞株Caco-2中，ZNF582、、SOX1及NKX6-1偵測到有甲基化；大腸癌相關的細胞株HT-29中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆偵測到有甲基化。肝癌相關的細胞株HuH-7中，SOX1及NKX6-1偵測到有甲基化；肝癌相關的細胞株Mahlavu中，ZNF582及SOX1偵測到有甲基化。肺癌相關的細胞株A549中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1無偵測到甲基化。皮膚癌相關的細胞株A-375中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1無偵測到甲基化。卵巢癌相關的細胞株A2780中，ZNF582及SOX1偵測到有甲基化。乳癌相關的細胞株T47D中，PAX1及NKX6-1偵測到有甲基化；乳癌相關的細胞株BT474中，PAX1、ZNF582及SOX1偵測到有甲基化；乳癌相關的細胞株MDA-MB-231中，ZNF582、SOX1及NKX6-1偵測到有甲基化；乳癌相關的細胞株ZR-75-1中，ZNF582、SOX1及NKX6-1偵測到有甲基化；乳癌相關的細胞株HCC1954中，ZNF582及SOX1偵測到有甲基化；乳癌相關的細胞株MCF-7中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1偵測到有甲基化。舌癌相關的細胞
株SAS中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆偵測到有甲基化。口腔癌相關的細胞株Ca9-22中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆偵測到有甲基化。
由此可知，於子宮頸癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、口腔癌、肺癌、肺腺癌以及皮膚癌相關之細胞株中，該四個基因至少其中之一偵測到甲基化現象。因此PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1至少其中之一被甲基化確實可作為篩檢癌症有無的篩檢指標。
本測試使用279位台灣已知診斷的正常與疾病的子宮頸抹片樣本，如表八所示分別為正常239位(85.7%)、輕度(CIN1)22位(7.9%)、中度(CIN2)2位(0.7%)、重度(CIN3)/原位癌(CIS)12位(4.3%)、鱗狀細胞癌4位(1.4%)，並抽取其DNA，在經過重亞硫酸鹽(bisulfite)的轉換，並以表一至表四揭示可用於擴增含有PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1甲基化區域之引子對及探針組，來進行檢測。如表九所示，相較於正常子宮頸抹片樣本，分別以PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1作為標的基因偵測重度以上子宮頸抹片樣本有85.45倍(95%信賴區間=33.95~215.11)、289.17倍(95%信賴區間=39.20~2133.14)、67.69倍(95%信賴區間=20.55~223.01)及2.56倍(95%信賴區間=1.36~4.82)的危險會罹患重度子宮頸癌。如表十所示，當同時合併個別甲基化標的基因與子宮頸抹片檢測疾病時，意即只要任一甲基化標的基因或子宮頸抹片檢測結果為陽性，則認定該測試樣本的子宮頸癌篩檢結果為陽性。相較於正常子宮頸抹片樣本，分別以PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1作為標的基因偵測並搭配子宮頸抹片檢測重度以上子宮頸抹片樣本有475.64倍(95%信賴區間=63.94~3538.43)、543.31倍(95%信賴區間=33.11~8914.18)、95.08倍(95%信賴區間=20.55~223.01)及14.25倍(95%信賴區間=6.12~33.18)的危險會罹患重度子宮頸癌，且各項敏感度相對於沒有搭配子宮頸抹片檢測結果皆有提升(PAX1：75%提升至94%、ZNF582：87%
提升至94%、SOX1：75%提升至100%、NKX6-1：50.00%提升至84.78%)。
本測試使用8位已知診斷的正常與疾病的口腔抹片樣本，並抽取其DNA，在經過重亞硫酸鹽(bisulfite)的轉換，並以表一至表四揭示可用於擴增含有PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1甲基化區域之引子對及探針組，來進行檢測，其甲基化狀態分析結果如表十一所示。結果顯示，於口腔1
中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆無甲基化；口腔2中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆無甲基化；口腔3中，PAX1及ZNF582有甲基化；口腔4中，PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1皆甲基化；口腔5中，PAX1及ZNF582有甲基化。口腔6中，ZNF582有甲基化；口腔7，ZNF582、SOX1及NKX6-1有甲基化。口腔8中，PAX1及ZNF582有甲基化。由此可知，於口腔癌於不同時期不同症狀中，該四個基因至少其中之一大幅地被甲基化。因此PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1至少其中之一甲基化程度確實可作為篩檢口腔癌的篩檢指標。
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Claims (20)
- 一種檢測套組，其係用以測定一檢測檢體中基因CpG序列甲基化的存在，亦即先由檢體萃取出其gDNA，此gDNA經過適當前處理及化學反應，即可使用本檢測套組進行基因甲基化的存在測試，本檢測套組包括：(1)一濃度範圍在20 nM-1250 nM標的基因引子混合液，其至少包含有一正向引子與一反向引子，該正向引子、反向引子的序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種；(2)一濃度範圍在20 nM-1250 nM內部控制基因核酸分子偵測混合液，其至少包含有一正向引子及一反向引子；(3)一聚合酶連鎖擴增反應主要混合液，其主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及鎂鹽。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測套組，(1)該標的基因引子混合液更包含探針，其探針序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種或其互補序列；(2)該內部控制基因核酸分子偵測混合液，更包含可偵測內部控制基因擴增產物的探針。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測套組，該一內部控制基因核酸分子偵測混合液，其中正向引子、反向引子所包含的序列係選自SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種。
- 如申請專利範圍第2項所述之檢測套組，該內部控制基因核酸分子偵測混合液，更包含探針，其中內部控制基因正向引子、反向引子所包含的序列係選自SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種；探針序列係選自 SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列至少有80%的序列同一性或至少連續十個核苷酸相同之序列之一種或多種或互補序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測套組，其中標的基因正向引子與反向引子的序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列之一種或多種。
- 如申請專利範圍第2項所述之標的基因其正向引子與反向引子的序列係選自SEQ ID No：1-70所示之核苷酸序列之一種或多種；所述標的基因探針的序列係選自SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列之一種或多種或互補序列。
- 如申請專利範圍第4項所述內部控制組基因，其正向引子、反向引子所包含的序列係選自SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列之一種或多種；探針序列係選自SEQ ID No：71-80所示之核苷酸序列之一種或多種或互補序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測套組，其聚合酶連鎖反應主要混合液，更包含可辨識連鎖擴增反應產物的螢光物質或與選自可與DNA雙股作用產生螢光進而被偵測到的物質。
- 如申請專利範圍第2項所述之檢測套組，其標的基因與內部控制組基因的探針具有螢光標記，此螢光標記係選自由於任一螢光：FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2及BHQ-3所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測套組，其更進一步可用以檢測不正常細胞增生現象。
- 如申請專利範圍第10項所述之檢測套組，其中檢測不正常細胞增生包含癌前病變檢測、腫瘤檢測、腫瘤復發檢測或腫瘤用藥預測或癒後效果檢測。
- 如申請專利範圍第11項所述之腫瘤係為下列群組之一：子宮頸癌、口腔癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、肺癌、 肺腺癌以及皮膚癌。
- 如申請範圍第2項所述之檢測套組，其更進一步可用以檢測不正常細胞增生現象。
- 如申請範圍第13項所述之檢測套組，其中檢測不正常細胞增生包含癌前病變檢測、腫瘤檢測、腫瘤復發檢測或腫瘤用藥預測或癒後效果檢測
- 如申請範圍第14項所述腫瘤係為下列群組之一：子宮頸癌、口腔癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、乳癌、舌癌、肺癌、肺腺癌以及皮膚癌。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測套組，其中標的基因與內部控制基因的引子可混和成為單管核酸分子偵測混合液。
- 如申請專利範圍第2項所述之檢測套組，其中標的基因與內部控制基因的引子及探針可混和成為單管核酸分子偵測混合液。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之檢測套組，其中該檢測檢體中之標的基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：PAX1、ZNF582、SOX1及NKX6-1所組成的群組。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之檢測套組，其中該檢測檢體中之內部控制基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：Col2A、β-Globin、GAPDH及β-actin所組成的群組。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之檢測套組，其中連鎖擴增產物之鑑定方法可用螢光法、定序法(sequencing)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。
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