TW201346029A - 利用雙功能SRC-3 shRNA治療癌症之方法及組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明包含製造且利用表現載體之組合物及方法,該表現載體包括啟動子及以操作方式連接至該啟動子之核酸插入物,其中該插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾抑制SRC-3基因表現之短髮夾RNA(shRNA),其中該一或多種shRNA包括雙功能RNA分子,其活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物,以減少該SRC-3表現量。
Description
本申請案主張於2012年3月28日提出申請的美國臨時申請案第61/616,873號之優先權,該申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
本發明概言之係關於癌症治療領域,且更具體而言,關於用於治療性RNA干擾技術之雙功能SRC-3 shRNA。
無。
本申請案包含[序列表],其係以ASCII格式經由EFS-Web遞交且全文以引用方式併入本文中。該ASCII拷貝在2013年3月21日創建,命名為GRAD:1036.txt且大小為16KB。
在不限制本發明之範疇之情形下,結合乳癌及SRC-3 RNA干擾來闡述本發明之背景。
美國專利第7,282,576號(Riegel等人2007)係關於AIB1在人類乳癌亞群中之擴增及乳癌細胞中剪接變體之出現,該剪接變體缺少外顯子-3且使蛋白質缺少N端鹼性螺旋-環-鹼性螺旋(basic-loop-basic)結構
域。
美國專利申請案第2007/0099209號(Clarke等人2007)係關於用於治療、表徵且診斷癌症之組合物及方法並提供與實體腫瘤幹細胞相關之基因表現譜。
美國專利申請公開案第2010/0286244號(Addepalli等人,2010)係關於短干擾核酸分子(siRNA)抑制核有絲分裂器蛋白(NuMA)基因表現之用途及其治療疾病(包含癌症)之用途。
美國專利申請公開案第2004/0086911號(Cabello等人2004)係關於利用新穎組合物及方法之RNA干擾。在具體實施例中,RNA組合物包括雜有非互補區之雙股區,其中該等RNA組合物可有效調控轉錄。在特定實施例中,例如藉由破壞至少一個轉錄物來減少或抑制RNA組合物所針對之靶核酸序列之轉錄。在其他實施例中,本發明之RNA組合物靶向多個靶核酸序列。
本發明揭示與所採用SRC-3雙功能shRNA及癌症治療相關之方法及組合物。
在一實施例中,本發明揭示包括啟動子及以操作方式連接至該啟動子之核酸插入物之表現載體,其中該插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾抑制SRC-3基因表現之短髮夾RNA(shRNA)。本文所闡述之shRNA納入一或多種siRNA(裂解依賴型)及miRNA(非裂解依賴型)基序。此外,shRNA同時係SRC-3基因表現之裂解依賴型及非裂解依賴型抑制劑。在一態樣中,將shRNA進一步定義為雙功能shRNA。在另一態樣中,一或多種抑制SRC-3基因之shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。
本文之另一實施例揭示包括治療劑載劑及表現載體之治療性遞送系統,該表現載體包括啟動子及以操作方式連接至該啟動子之核酸插入物,其中該插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾抑制SRC-3基因表現之短髮夾RNA(shRNA)。
在一態樣中,治療劑載劑係經壓縮DNA奈米粒子,其中該DNA奈米粒子係使用一或多個聚陽離子壓縮。在特定態樣中,一或多個聚陽離子係經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸3聚體肽(CK30PEG10k)。在另一態樣中,將經壓縮DNA奈米粒子進一步囊封於脂質體中,其中該脂質體係雙層內陷性囊泡(BIV)或可逆式遮蔽脂質體。在又一態樣中,脂質體係經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾,其中該一或多個「聰明」受體靶向部分係小分子二價β-轉角模擬物。
在一態樣中,治療劑載劑係脂質體。在另一態樣中,脂質體係經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾之雙層內陷性囊泡(BIV),其中該脂質體係可逆式遮蔽脂質體,其中該等「聰明」受體靶向部分係小分子二價β-轉角模擬物。在又一態樣中,一或多種抑制SRC-3基因之shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。在另一態樣中,使用遞送系統自身或其與以下之組合來阻抑腫瘤細胞生長、治療乳癌或同時達成二者:一或多種化學治療劑、放射性療法、手術干預、抗體療法、維生素D或其任何組合。
本文所揭示之又一實施例係關於將一或多種shRNA遞送至表現SRC-3基因之靶組織之方法,該方法包括以下步驟:(i)製備表現載體,該表現載體包括啟動子及以操作方式連接至該啟動子之核酸插入物,該插入物編碼一或多種經由RNA干擾抑制SRC-3基因表現之
shRNA;(ii)組合表現載體與治療劑載劑,其中該治療劑載劑係經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾之脂質體;及(iii)向有需要之患者投與治療有效量之表現載體與治療劑載劑之複合物。
本發明進一步提供抑制SRC-3基因在一或多種靶細胞中之表現之方法,該方法包括以下步驟:選擇一或多種靶細胞;及用表現一或多種短髮夾RNA(shRNA)之載體轉染靶細胞,該一或多種短髮夾RNA能夠經由RNA干擾抑制SRC-3基因在一或多種靶細胞中之表現。
本文所揭示之另一實施例係在人類個體中阻抑腫瘤細胞生長、治療乳癌或同時達成二者之方法,該方法包括以下步驟:識別需要阻抑腫瘤細胞生長、治療乳癌或同時達成二者之人類個體;及向該人類個體投與足以阻抑腫瘤細胞生長、治療乳癌或同時達成二者之量之表現載體與治療劑載劑之複合物,其中該表現載體表現一或多種能夠經由RNA干擾抑制SRC-3基因在一或多種靶細胞中之表現之雙功能短髮夾RNA(shRNA),其中該抑制引起腫瘤細胞之細胞凋亡、增殖受阻或侵襲力下降。
在又一實施例中,本發明提供用於在人類或動物個體中治療一或多種抗拒化學療法之癌症、增加一或多種化學治療劑之有效性或同時達成二者之方法,該方法包括以下步驟:識別患有抗拒化學治療劑之癌症或需要增加一或多種化學治療劑之有效性之人類或動物個體,及向該人類或動物個體投與足以阻抑或抑制SRC-3基因在人類或動物個體中表現之量之表現載體與治療劑載劑之複合物,其中該表現載體表現一或多種能夠經由RNA干擾抑制SRC-3基因在人類或動物個體中之一或多種靶細胞中之表現之雙功能短髮夾RNA(shRNA),其中該抑制使得增強一或多種化學治療劑之作用,從而導致一或多種腫瘤細胞之細胞凋亡、增殖受阻或侵襲力下降。
在一態樣中,一或多種化學治療劑包括鉑藥物、卡鉑
(carboplatin)、他莫昔芬(tamoxifen)、ER拮抗劑或其任何組合。在另一態樣中,癌症係選自由結腸癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌或其任何組合組成之群。在特定態樣中,癌症係HER-2陽性乳癌。在又一態樣中,一或多種shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。在相關態樣中,載體係在一或多種化學治療劑之前、之後或同時投與。
在本發明之一實施例中提供在人類或動物個體中治療抗拒化學療法之HER-2陽性乳癌、增加化學治療方案在HER-2陽性乳癌中之有效性或同時達成二者之方法。如本發明所述之方法包括以下步驟:識別患有抗拒化學療法之HER-2陽性乳癌或需要增加化學療法針對HER-2陽性乳癌之有效性之人類或動物個體,及向該人類或動物個體投與足以阻抑或抑制SRC-3基因在人類或動物個體中之表現之量之表現載體與治療劑載劑之複合物,其中該表現載體表現一或多種能夠經由RNA干擾抑制SRC-3基因在人類或動物個體中之一或多種靶細胞中之表現之雙功能短髮夾RNA(shRNA),其中該抑制使得增強一或多種化學治療劑之作用,從而導致一或多種腫瘤細胞之細胞凋亡、增殖受阻或侵襲力下降。在該方法之一態樣中,一或多種化學治療劑包括鉑藥物、卡鉑、他莫昔芬、ER拮抗劑或其任何組合。
為更全面地理解本發明之特性及優點,現參考本發明之詳細說明及附圖。
圖1繪示有可能係更有效抗癌藥物之共活化劑-靶向劑之機制;圖2顯示,在人類卵巢癌中SRC-3過表現係與對卡鉑療法之抗性相關;
圖3記載,3個bishSRC-3載體(pGB145、48及49)可有效阻斷SRC-3蛋白在T-47D乳癌細胞中之表現。經由電穿孔將bishSRC-3載體(L4-L6)、Dharmacon siRNA SMART彙集物(L8及L9)及其非靶向性對照(L7)及bishSRC-3空載體pUMVC3(L3)引入細胞中且在72小時後分析SRC-3蛋白含量;圖4A及圖4B係顯示本發明之雙功能shRNA之設計之示意圖。圖4A顯示針對單一靶之序列排列,且圖4B顯示針對多個靶之序列排列;圖5A-圖5F係本發明之不同bi-shRNA-NCOA3之質體圖譜;圖6顯示,SRC-3靶向性雙功能shRNA可減少SRC-3蛋白在MCF-7乳癌細胞中之表現。將bishRNA載體(pGBI-45-pGBI-49)、空母體載體pUMCV3(Vec)及作為陽性對照之siRNA(siSRC-3)「逆」轉染至MCF-7細胞中。將1μg DNA/lipofectamine複合物添加至6孔板中,然後平鋪MCF-7細胞。細胞平鋪後48小時,藉由西方墨點(Western blotting)分析蛋白質提取物;圖7顯示,SRC-3靶向性雙功能shRNA可減少SRC-3蛋白在MDA-MB-231乳癌細胞中之表現。將bishRNA載體(pGBI-45-pGBI-49)、空母體載體pUMCV3(Vec)及作為陽性對照之siRNA(siSRC-3)「逆」轉染至MDA-MB-231細胞中。將1μg DNA/lipofectamine複合物添加至6孔板中,然後平鋪MDA-MB-231細胞。細胞平鋪後48小時,藉由西方墨點分析蛋白質提取物;圖8顯示,在4天時間段內SRC-1及SRC-3 bi-shRNA載體降低乳癌細胞生長。用如圖6及圖7中所闡述之針對SRC-1(pGBI40-pGBI-44)或SRC-3(pGBI-45-pGBI-49)之bi-shRNA載體或siRNA陰性對照(siGFP)或陽性對照(siSRC-3)轉染MCF-7細胞。4天後,藉由MTS分析量測細胞增殖;
圖9顯示,在5天時間段內SRC-1及SRC-3 bi-shRNA載體降低乳癌細胞生長。用如圖6及圖7中所闡述之針對SRC-1(pGBI40-pGBI-44)或SRC-3(pGBI-45-pGBI-49)之bi-shRNA載體或siRNA陰性對照(siGFP)或陽性對照(siSRC-3)轉染MCF-7細胞。5天後,藉由MTS分析量測細胞增殖;圖10顯示,在4天時間段內SRC-1及SRC-3 bi-shRNA載體降低三陰性乳癌細胞生長。用SRC-1(pGBI-40-pGBI-44)或SRC-3(pGBI-45-pGBI-49)或空載體對照轉染MDA-MB-231細胞。4天後,藉由MTS分析量測細胞增殖;且圖11顯示,SRC-1及SRC-3靶向性雙功能shRNA可減少SRC-3蛋白在A-549肺癌細胞中之表現。將針對SRC-1(pGBI-40-pGBI-44)或SRC-3(pGBI-45-pGBI-49)之bi-shRNA載體或空載體對照轉染至A-549細胞中。轉染後48hr,藉由西方免疫印跡(western immunoblot)監測SRC-3表現。
儘管下文詳細論述本發明之多個實施例之製備及利用,但應瞭解,本發明可提供許多可在眾多種特定背景下體現之適用發明概念。本文所論述之特定實施例僅例示性說明製造及利用本發明之特定方式而非限制本發明之範疇。
為便於理解本發明,下文將定義多個術語。本文所定義之術語具有如熟習本發明相關領域之一般技術者通常理解之含義。諸如「一(a、an)」及「該」等術語並非僅欲指單數實體,且包含可利用特定實例說明之一般類別。本文之術語係用於闡述本發明之特定實施例,但除非申請專利範圍中有所概述,否則其使用並不限制本發明。
如本文所利用,術語「核酸」或「核酸分子」係指多核苷酸(例如去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、藉由聚合酶鏈
式反應(PCR)產生之片段及藉由連接、剪切、內切酶作用及外切酶作用中之任一者產生之片段。核酸分子可係由單體組成,該等單體為天然核苷酸(例如DNA及RNA)或天然核苷酸之類似物(例如天然核苷酸之α-鏡像異構形式)或二者之組合。經修飾核苷酸之糖部分及/或嘧啶或嘌呤鹼基部分可有所改變。糖修飾包含(例如)用鹵素、烷基、胺及疊氮基替代一或多個羥基,或可將糖官能化為醚或酯。此外,整個糖部分可經空間上及電子上相似之結構(例如氮雜-糖及碳環糖類似物)替代。鹼基部分之修飾之實例包含烷基化嘌呤及嘧啶、醯化嘌呤或嘧啶或其他熟知雜環取代基。核酸單體可藉由磷酸二酯鍵或該等鍵之類似物連接。磷酸二酯鍵之類似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、胺基磷酸酯及諸如此類。術語「核酸分子」亦包含所謂「肽核酸」,其包括附接至聚醯胺骨架之天然或經修飾核酸鹼基。核酸可呈單股或雙股。
如本文在說明書及申請專利範圍中所利用之術語「表現載體」包含編碼在宿主細胞中表現之基因之核酸分子。通常,表現載體包括轉錄啟動子、基因及轉錄終止子。通常將基因表現置於啟動子之控制下,且稱該基因「以操作方式連接至」該啟動子。類似地,若調控元件調節核心啟動子之活性,則調控元件與核心啟動子以操作方式連接。術語「啟動子」係指當與宿主酵母菌細胞中之結構基因結合時,在適當生長條件下與不存在啟動子序列時之轉錄、轉譯或mRNA穩定性相比,促進該結構基因之1)轉錄、2)轉譯或3)mRNA穩定性(mRNA之半衰期較長)中之一或多者之任一DNA序列。
如本文所利用之術語「致癌基因」係指允許惡性贅瘤細胞形成及存活之基因(Bradshaw,T.K.:Mutagenesis 1,91-97(1986))。
如本文所利用,術語「受體」表示與稱為「配體」之生物活性分子結合之細胞相關蛋白。此相互作用介導配體對細胞之效應。受體
可係膜結合受體、細胞溶質受體或核受體;單體受體(例如甲狀腺促素受體、β-腎上腺髓素受體)或多聚體受體(例如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、紅血球生成素受體及IL-6受體)。膜結合受體之特徵在於多結構域結構,包括細胞外配體結合結構域及通常參與信號轉導之細胞內效應子結構域。在某些膜結合受體中,細胞外配體結合結構域及細胞內效應子結構域係位於包括完整功能性受體之單獨多肽中。
術語「雜交」係指任何使核酸股與互補股經由鹼基配對結合之過程。
術語「轉染」係指將外源DNA引入真核細胞中。轉染可藉由多種業內已知之方式完成,包含(例如)磷酸鈣-DNA共沈澱、DEAE-葡聚糖介導之轉染、聚凝胺(polybrene)介導之轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質融合、逆轉錄病毒感染及生物彈道學。
如本文所利用,術語「雙功能」係指具有兩條作用機制途徑之shRNA,該兩條作用機制途徑為類siRNA途徑(將shRNA前體裝載至裂解依賴型RISC上)及類miRNA部分途徑(將shRNA前體裝載至具有完整靶mRNA互補性之非裂解依賴型RISC上)。雙功能構築體同時阻遏靶mRNA之轉譯,促進mRNA降解及p-小體(p-body)mRNA隔離,且經由類RNA酶H裂解來裂解靶mRNA。
術語「傳統」shRNA係指藉由siRNA作用機制起作用之DNA轉錄源性RNA。術語「雙重」shRNA係指兩個各自針對兩個不同基因之表現但以「傳統」siRNA模式起作用之shRNA。
如本文所利用,術語「脂質體」係指由圍繞內部水性空間之脂質雙層組成之閉合結構。如本文所利用之術語「聚陽離子」表示在同一分子中具有多個陽離子部分(例如四級銨基團)之材料,且包含其游
離鹼以及其醫藥上可接受之鹽。
本發明者瞭解,存在多種用於靶向蛋白質相互作用結構域之策略。例如,可能可發現抑制蛋白質/蛋白質相互作用之小分子;此將需要高通量分析及廣泛篩選,然後優化該化合物用於臨床應用,此可能需要若干年之努力。另一選擇將係製備細胞滲透性肽衍生物,但臨床應用所需要之量可能會不切實際。因此,本發明包含利用質體脂複合物(Lipoplex)組合遞送將產生抑制AR作用之肽之表現質體之實施例。
在本發明之一實施例中,遞送媒劑包括囊封於陽離子雙層內陷性囊泡(BIV)中之DNA 在另一實施例中,自膽固醇及生物可降解1,2-二油醯基-3-三甲基-銨基丙烷(DOTAP)製備200-450nm BIV。在又一實施例中,藉由添加中性小分子量脂質(例如十二烷基-β麥芽吡喃糖苷)可逆地遮蔽(rm)正電荷,此防止初期非特異性攝取。
本發明者認識到,遞送媒劑BIV/質體脂複合物可穿透腫瘤微血管且因融合而被吸收,從而使DNA之降解降至最低;其在小鼠中注射時產生高於其他遞送方法之基因表現量;且可利用此技術在人類中在靶組織中表現轉基因而無嚴重毒性。
在較佳實施例中,組合兩種或更多種治療方式以提供比單獨方法更有效之治療。
本發明者已提出稱為雙功能shRNA之獨特RNAi平臺。在概念上,RNAi可經由裝載shRNA的RISC來達成,促進減弱裂解依賴型或非裂解依賴型mRNA。本發明者已顯示,由shRNA之兩種組態共同表現(因而命名為雙功能shRNA)促進裝載至多種類型之RISC上,從而更有效減弱靶基因,使其相較於siRNA,可以更快啟動沉默(不受mRNA及蛋白質代謝率影響)且具更強耐久性。雙功能shRNA表現單元之基本設計包括兩個莖-環shRNA結構;其中一個莖-環結構係由完全匹配
之過客股及引導股組成,用於裝載裂解依賴型RISC,且另一莖-環具有錯配過客股(在9-12位置),用於裝載非裂解依賴型RISC。此雙功能設計因以下兩個原因而顯著更有效:第一,雙功能促進引導股裝載至不同RISC類型上,因而促進mRNA之靶向;第二,針對相同靶mRNA之裂解依賴型及非裂解依賴型RISC之存在可藉由降解及轉譯抑制/隔離二種過程促進沉默。有效減弱基因效應子藉由在單一pol II啟動子控制下之多倍體shRNA來達成空間及時間控制。本發明者所設計之平臺模擬天然過程。他人及文獻之多種研究支持本發明者之方式。針對單一或針對多個靶之雙功能shRNA設計之示意圖分別顯示於圖4A及圖4B中。
脂質體遞送系統:脂質體遞送系統包含1,2-二油醯基-3-三甲基-銨基丙烷(DOTAP)及膽固醇。此調配物與DNA組合形成複合物,將核酸囊封在雙層內陷性囊泡(脂質體BIV)內。申請者已優化BIV遞送系統之若干特性,以改良RNA、DNA及RNAi質體之遞送。脂質體BIV具促融性,由此繞過可能導致核酸降解及TLR所介導脫靶效應之胞吞作用介導之DNA細胞進入。
本發明者認識到,優化遞送媒劑需要以匿蹤方式進行,此可藉由使ζ電位10mV之奈米粒子之聚乙二醇化以用於有效血管內轉運來達成,以使與帶負電荷之血清蛋白質(例如血清白蛋白)之非特異性結合(調理作用)降至最低。納入靶向部分(例如抗體及其單鏈衍生物(scFv)、碳水化合物或肽)可進一步促進將轉基因定位至靶細胞中。
本發明者已在活體內建立複合物之靶向遞送而未利用PEG,由此避免過度延長循環半衰期。儘管聚乙二醇化與改良DNA或siRNA寡核苷酸遞送之膜滲透性有關,但本發明者認識到,該方式可引起BIV脂質體結構中之位阻,從而導致DNA囊封無效及基因表現減少。此外,聚乙二醇化複合物主要經由胞吞途徑進入細胞,從而使大部分核酸在
溶酶體中降解。儘管PEG提供極長循環半衰期,但此已對患者造成困擾,如藉由囊封細胞毒性劑多柔比星(doxorubicin)之聚乙二醇化脂質體調配物doxil所例示。將配體添加至doxil以供遞送至特異性細胞表面受體(例如HER2/neu)之嘗試未能促進腫瘤特異性遞送。
本發明包含利用專利性手工擠出製程用DOTAP及合成膽固醇製造BIV之實施例。此外,利用可逆遮蔽技術優化遞送。可逆遮蔽使用小分子量脂質(約500及更小分子量;例如n-十二烷基-β-D-麥芽吡喃糖苷),其不帶電荷且由此與BIV複合物之表面鬆散結合,從而暫時屏蔽帶正電荷之BIV複合物以繞過非靶向器官。藉由血流中之剪切力移除該等小脂質。截至其到達靶細胞時,再次暴露電荷(視情況約45mV)以幫助其進入。
BIV遞送系統獨特地有效之一原因在於,複合物藉由與細胞膜融合將治療劑遞送至細胞中且避免了胞吞途徑。脂質體進入之兩種主要進入機制係經由胞吞作用或與細胞膜直接融合。本發明者發現,囊封於在活體外及活體內二種情況下遞送之BIV複合物中之核酸藉由直接融合進入細胞,且BIV顯著避免胞內體攝取,如用聚乙烯-胺(PEI)在小鼠肺泡巨噬細胞中之比較研究所證實。已知PEI可快速且熱切地溶解於胞內體中,如藉由經羅丹明(rhodamine)標記之寡核苷酸之95%在轉染後2-3hr內之定位所展示。
用經修飾BIV之靶向癌症之遞送:本發明者認識到,藉由靶向腫瘤之奈米粒子(NP)全身性遞送之siRNA與未經修飾之NP相比可顯著更有效地抑制皮下腫瘤之生長。靶向遞送並未顯著影響藥物動力學或生物分佈,此在很大程度上保留了EPR(增強之滲透性與滯留)效應之結果,但似乎經由增強細胞攝取而改良轉基因表現[95-97]。
實際上,在治療用BIV之研發中之關鍵的「丟失的一角(missing piece)」係對該等可置於BIV-複合物表面上以引導其靶向細胞之非免
疫原性配體之識別。儘管此可能使用在脂質體表面上多聚之小肽來達成,但該等小肽在重複注射後可產生免疫反應。其他較大配體(包含抗體、抗體片段、蛋白質、部分蛋白質等)遠比利用小肽更難用於在脂質體表面上達成靶向遞送。因此,本發明複合物之獨特之處在於,其不僅穿透緊密障壁(包含腫瘤脈管系統內皮孔及實體腫瘤之間隙壓力梯度),且亦直接靶向腫瘤細胞。因此,本發明之治療方式並不限於僅依賴EPR效應之遞送且亦直接靶向腫瘤。
經設計與蛋白質選擇性結合之小分子可用於本發明中。重要的是,所製備之小分子為「二價」,因此其尤其適於結合細胞表面受體,且類似於在蛋白質-配體相互作用中之熱點(hot-spot)處發現之二級結構基序。本發明者已調整策略以獲得具有烴尾之二價分子,且已自該等經調整小分子製備功能化BIV複合物。研發且運行篩選文庫之有效高通量技術。
經壓縮DNA奈米粒子:有絲分裂後之細胞中之安全且有效的DNA遞送:哥白尼(Copernicus)核酸遞送技術係非病毒性合成及模組式平臺,其中用聚陽離子壓縮DNA或siRNA單分子以產生具有最小可能體積之奈米粒子。經優化用於在活體內遞送之聚陽離子係經包括N端半胱胺酸及30個離胺酸殘基之肽修飾之10kDa聚乙二醇(PEG)(CK30PEG10k)。該等複合物之形狀部分取決於壓縮DNA時之離胺酸抗衡離子。不論負載質體大小如何,棒狀奈米粒子之最小橫截面直徑皆係8-11nm,而典型表現質體之橢球體之最小直徑係20-22nm。重要的是,該等DNA奈米粒子能夠在培養物中穩健地轉染未分裂細胞。與脂質體裸DNA混合物相比,經壓縮DNA之脂質體混合物產生增強1,000倍以上之基因表現量。活體內給予後,經壓縮DNA在肺、腦及眼中穩健地轉染有絲分裂後之細胞。在該等系統中之每一者中,經壓縮DNA轉染有絲分裂後細胞之非凡能力似乎歸因於該等奈米粒子之小
尺寸,該等奈米粒子可穿過25nm核膜孔。
該等DNA奈米粒子之一個攝取機制係基於與細胞表面核仁素(26nm KD)之結合,且隨後經由非降解性途徑細胞質輸送至核中,其中奈米粒子分解釋放生物活性DNA。已顯示,在基因轉移後,長期活體內表現可長達1年。該等奈米粒子具有良性毒性特徵且並不刺激類鐸受體(toll-like receptor),由此避免毒性細胞介素反應,甚至當經壓縮DNA具有數百個CpG島且與脂質體混合時,亦未觀察到毒性效應[114,115]。已在囊性纖維化試驗中將DNA奈米粒子投與人類且得到了令人鼓舞之結果,且奈米粒子未引起不良事件,且大多數患者展示CFTR蛋白之生物活性[116]。
本發明之新穎bi-shRNA治療劑之構築代表可減少經由轉錄後基因減弱達成有效治療結果所需要之有效全身性劑量之最新方式。有效且臨床上適用之遞送方式係可快速轉換為全身性靶向ESFT之原位遞送。
本發明闡述創新的基於雙功能shRNA之策略,該策略係經設計以達成類固醇受體共活化劑-3(SRC-3)之優異減弱。該等雙功能shRNA藉由同時促進靶mRNA之降解及轉譯阻遏來增強其功能。在乳癌中擴增之SRC-3係通常在雌激素受體-α(ERα)及HER2陽性乳癌中過表現或擴增之關鍵乳癌致癌基因;SRC-3之表現升高與HER2陽性乳癌對他莫昔芬療法之抗性及較差疾病結果相關。
本發明者亦認識到,靶向SRC-3限制乳癌細胞生長且恢復他莫昔芬之抗雌激素作用。本發明者瞭解到,業內已廣泛追求並研發靶向ERα及HER2二者之化學治療劑且其有效性及限制性二者已經充分表徵。
本發明包含採用靶向SRC-3之雙功能小髮夾RNA(bishRNA)作為針對他莫昔芬及HER2抗性乳癌之治療劑之實施例。一種評估該等
SRC-3 bishRNA(bishSRC-3)阻斷細胞生長及對他莫昔芬及抗HER2治療之抗性之能力之方式係利用他莫昔芬及抗HER2敏感性及抗性乳癌細胞系。
本發明者認識到SRC-3在乳癌中之中心作用及靶向SRC-3之臨床可用藥劑之缺乏,且本發明代表表徵及研發獨特類別之乳癌化學治療劑之獨特方式。
本發明者認識到,經設計以阻斷致癌共活化劑SRC-3表現之SRC-3 bishRNA(bishSRC-3)能夠阻斷乳癌細胞生長且能夠克服對他莫昔芬及抗HER2化學治療劑之抗性。一種證實此結果之方式係利用細胞培養物動物模型系統。
本發明者亦瞭解到確定SRC-3 bishRNA對癌細胞生長途徑之多效性影響之重要性及該影響在基於細胞培養之乳癌組合化學療法範例中之有效性。一種界定不同bishSRC-3如何影響負責癌細胞生長之整體基因表現模式之方式係在ERα-陽性、ERα-陽性他莫昔芬抗性及HER2-陽性乳癌細胞中進行mRNA微陣列分析。為在功能上評價bishSRC-3消除對化學療法之抗性之能力,利用抗拒他莫昔芬及賀癌平(herceptin)之乳癌細胞培養系統將bishSRC-3納入組合化學療法模型範例中。
一種在臨床前乳癌化學療法抗性動物模型系統中評估且評價SRC-3 bishRNA之方式係利用人類腫瘤細胞-小鼠宿主異種移植物模型(評估bishSRC-3阻斷來自他莫昔芬敏感性、他莫昔芬抗性及抗HER2抗性乳癌之異種移植腫瘤移植物之有效性)。一種促進遞送至腫瘤組織之方式係利用所研發之新穎脂複合物調配物。
本發明者認識到,乳癌係第二常見之癌症形式且佔所有癌症死亡人數之7%(根據美國癌症協會(American Cancer Society))。原發性乳癌患者之存活率基於多種因素而變化,尤其係乳癌亞型、核受體狀
態(Erα、孕酮受體(PR))、HER2/neu狀態及轉錄組表現模式。
本發明者瞭解到,ERα、PR及HER2/neu係引導用於乳癌治療之臨床干預之關鍵預後及診斷性標誌(1)。儘管已在ERα(+)及HER2(+)疾病之治療中取得進展,但許多患者仍在其腫瘤獲得對已建立化學療法之抗性後復發且死亡(2)。
本發明者主要目標之一亦係基於腫瘤生物標記或藥物基因組學因素「個人化」個別患者之治療,以研發對每一個別患者最佳之可能治療(3)。本發明者認識到任何一種治療靶或策略自身阻斷癌細胞生長之能力有限,且瞭解到利用靶及策略之組合之方式提高抗癌劑對抗拒化學療法之乳癌之效力的益處(4)。本發明者亦認識到,越來越多的數據表明,核受體共活化劑係癌細胞生長之關鍵驅動劑(5)。
本發明者認識到,在乳癌1中擴增之類固醇受體共活化劑-3(SRC-3)係乳癌中之關鍵致癌共活化劑,其在乳癌獲得對他莫昔芬及抗HER2療法之抗性中起驅動作用;且SRC-3係共活化劑靶向劑之適宜靶。
本發明者亦認識到,SRC-3係關鍵致癌核受體共活化劑;核激素受體共活化劑為核受體起轉錄因子作用所必需且作為測定對類固醇激素之生物反應之幅值之變阻器起關鍵作用(6);在眾多種癌症中涉及在乳癌1中擴增之類固醇受體共活化劑-3(SRC-3)之過表現且其通常以高百分比在諸如以下等激素依賴型癌症中過表現:乳癌、卵巢癌(2)、子宮內膜癌(7)及前列腺癌(4)及其他癌症(包含胰臟癌(8)、食道癌(9)、鼻咽癌(10)、尿道上皮細胞癌(6)及結腸直腸癌(7)。本發明者瞭解到,在首先對SRC-3基因進行表徵之乳癌及卵巢癌中,SRC-3基因在約10%之乳癌中擴增,且其mRNA有約64%之情況下過表現(8);且SRC-3之表現升高亦與對他莫昔芬療法之抗性及較差疾病結果相關(11)。
預測在美國每年發生至少322,000例新增SRC-3相關癌症病例及91,000例SRC-3癌症相關死亡(限於以上癌症類型)。癌症發病率死亡人數統計來源:美國癌症協會及國家癌症研究所(National Cancer Institute)。所有數字皆舍入至千位。
本發明者認識到,估計SRC-3在美國每年在322,000例新增癌症病例及91,000例癌症死亡中過表現(表1),且實驗性靶向SRC-3限制乳癌細胞生長且恢復SERM阻斷癌細胞生長之能力;在BT-474乳癌細胞中siRNA介導之對SRC-3表現之破壞恢復4-羥基他莫昔芬之生長抑制效應(12);siRNA介導對SRC-3表現之破壞亦損害多種細胞系中之表皮生長因子(EGF)活性(13);且siRNA靶向SRC-3導致E2F之轉錄活性降低,從而損害對進入S期至關重要之基因之表現(14)。
本發明者亦認識到,SRC-3之過表現促進前列腺癌細胞生長,而在SRC-3敲除小鼠中,AKT信號傳導下調(15,16);且過表現SRC-3之轉基因小鼠發生自發惡性乳房腫瘤(17);相反,SRC-3敲除小鼠可抗拒化學致癌物誘導及病毒誘導之乳房腫瘤形成;此外,SRC-3-/-小鼠可抗拒經誘導之前列腺癌惡化(18)。本發明者亦瞭解到,許多激素抗性晚期乳癌停止表現ERα,且降低SRC-3細胞蛋白濃度之試劑更具有包涵性且能在ERα陽性或陰性乳癌二者中起抗癌劑作用。
本發明者認識到,大多數癌症具有高度適應性且通常能夠逃避個別抗癌劑之生長抑制作用;諸如HER2/neu、PI3/AKT、NF-κB等生
長促進途徑通常在乳癌中因應抗雌激素治療而上調;且藉助如此多的可用生長促進機制,癌細胞可逃避靶向離散生長因子途徑之單一化學治療劑。本發明者尤其認識到,由於SRC-3如上所述係關鍵類固醇激素及生長因子信號傳導整合劑,癌細胞對靶向SRC-3之試劑之反應不同,此乃因SRC-3係藉由PI3/AKT16、NFkB19、PKCi、PKCz20及其他生長因子信號傳導系統中之激酶來接收生長信號傳導資訊。然後該等激酶對SRC-3之磷酸化使得SRC-3可起諸如ERα、NF-kB及E2F114等轉錄因子之共活化劑之作用。本發明者認識到,由於SRC-3在多個生長因子信號傳導途徑中樞處之關鍵地位,bishSRC-3同時干擾可能引起癌症對化學療法之抗性之備選生長信號傳導途徑之活性(圖1)。一種明確顯示此概念之方式係認識到,人類卵巢癌患者對卡鉑單一療法之反應係與SRC-3表現量高度相關;且自歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute)基於網絡之數據庫檢索之微陣列分析揭示,卵巢腫瘤對遺傳毒性劑卡鉑治療之抗性與其對卡鉑之抗性高度相關(圖2)。
就靶向SRC-3蛋白表現之雙功能小髮夾RNA干擾載體而言,本發明者認識到,RNA干擾係藉由轉錄機制、轉錄後機制及轉譯機制抑制基因表現之天然細胞調控過程;且已顯示仿效此過程之合成方式(小干擾RNA、短髮夾RNA)在此方面同樣有效。
SEQ ID NO:1代表人類核受體共活化劑3(NCOA3,亦稱為SRC-3),轉錄變體1,mRNA。
(SEQ ID NO:1).
SEQ ID NO:1中之5個加雙下劃線之區域代表靶位點且斜體區域係編碼區。
靶向SRC-3之雙功能shRNA高度有效且具有在顯著低於習用shRNA或siRNA之濃度下引發RNAi之優點。本發明者已研發最佳靶向SRC-3以減少其表現之bishRNA。3種靶向SRC-3 mRNA之不同區域之單獨bishSRC-3載體可有效地將SRC-3蛋白含量降低至藉由西方分析檢測之含量以下(圖3)。
本發明bi-shRNA-NCOA3之序列顯示於下文中且相應環狀圖譜呈現於圖5A-圖5F中:
pGBI-44(SEQ ID NO:2):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列(核苷酸1090-1108),其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-45(SEQ ID NO:3):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列(核苷酸1304-1322),其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-46(SEQ ID NO:4):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列,其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-47(SEQ ID NO:5):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列,其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-48(SEQ ID NO:6):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列,其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-49(SEQ ID NO:7):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列(核苷酸1090-1108),其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-40(SEQ ID NO:8):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列(核苷酸1684-1702),其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-41(SEQ ID NO:9):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列(核苷酸1331-1349),其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-42(SEQ ID NO:10):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列
(核苷酸2791-2809),其中加下劃線區域對應於反義序列。
pGBI-43(SEQ ID NO:11):
。加雙下劃線之序列區域對應於有義序列(核苷酸3361-3381),其中加下劃線區域對應於反義序列。
總之,本發明者認識到,SRC-3係必需乳癌致癌基因,其轉錄活化狀態及細胞蛋白質濃度係測定共活化劑之生物及致癌作用之關鍵參數;且靶向SRC-3之SRC-3 bishRNA係高度有效化學治療劑且很有可能可克服乳癌之抗雌激素及抗HER2抗性。
本發明者認識到,癌症在經兩種或更多種作用機制不同之抗癌劑同時治療時通常更有利地反應;癌症通常因活化多個生長信號傳導系統同時亦使細胞分裂檢查點及細胞凋亡途徑失效而達成不受控生長;且慮及SRC-3參與多個關鍵生長信號傳導途徑,因此在bishSRC-3存在下癌細胞較不可能產生抗性(參見圖1)。
本發明者亦認識到,SRC-3在細胞中之高含量引起「抗化學療法」之狀態;且bishSRC-3(以及在結合標準化學治療劑投與時)將在患者中提供更有利治療反應。
一種在化學療法敏感性及抗性乳癌細胞中測定SRC-3表現之損失如何干擾眾多生長因子途徑之方式係藉由微陣列分析評價bishSRC-3介導之SRC-3減弱在(例如)以下之細胞中對整體基因表現之效應:1)藉由在10mg/ml賀癌平中傳代兩周來針對賀癌平抗性選擇之他莫昔芬敏感性MCF-7細胞23,2)他莫昔芬抗性BT-47412及HER2陽性、ERα陰
性SKBr3細胞24(SKBr3R)。
本發明者認識到,可利用此數據之生物資訊學分析來評價SRC-3功能之損失對細胞中與生長、細胞凋亡及細胞週期控制相關之不同基因表現程式之多效性影響。
本發明者亦認識到,SRC-3在促進生長因子信號傳導中之多效性作用係與化學療法抗性相關,且shRNA介導之SRC-3減弱使得BT-474細胞對他莫昔芬敏感(12)。
一種恢復該等細胞中之他莫昔芬敏感性之方式係評估且利用3種不同bishSRC-3載體中之一種或其組合。
一種對未經治療及經bishSRC-3治療之MCF-7、BT-474及SKBr3R細胞實施基因表現剖析之方式係測定SRC-3表現之損失對基因表現模式之效應或在雌二醇、他莫昔芬或乙醇媒劑存在下測試SRC-3表現之損失對他莫昔芬敏感性MCF-7細胞之效應,從而評估bishSRC-3之效應;此外,可在bishSRC-3及bishRNA空載體轉染之對照載體存在下評估雌二醇及他莫昔芬阻斷BT-474細胞生長之效應;此外,可在存在或不存在引入SKBr3R細胞中之bishSRC-3時評估賀癌平(或對照治療)在干擾該等細胞生長中之效應。
一種分析基因表現之方法係利用代表14,500個經充分表徵之人類基因之Affymetrix GeneChipTM人類基因組U133A 2.0陣列實施轉錄譜分析。本發明者認識到,此陣列與先前UG-U133A陣列相比覆蓋經轉錄人類基因組中已充分證實之基因且大小更緊密,從而允許減小樣品體積且提高精確度。Affymetrix之獲準試劑及方案可結合UG133A陣列用於測定每一治療組之轉錄物範圍之特徵(Agilent Technologies,Wilmington,DE)。
一種測定SRC-3 bishRNA對癌細胞生長途徑之多效性影響及其在基於細胞培養之乳癌組合化學療法範例中之有效性之方式係用3種已
確立bishSRC-3載體對細胞進行電穿孔(圖3)且在72小時後用他莫昔芬或乙醇媒劑(MCF-7及BT-474)或賀癌平(SKBr3R)治療,以觀察表現在bishSRC-3載體存在下因應他莫昔芬或賀癌平治療之變化;此後8小時時,可收穫細胞且提取RNA進行分析。一種測定顯著經調控基因之方式係測定bishSRC-3細胞與對照細胞之間之Log2比率表現差異(經上調及經下調)。
可將上文所論述之細胞系分批與bishSRC-3或其pUMVC3對照載體一起進行電穿孔且然後平鋪於96孔板中;且用雌二醇、他莫昔芬(MCF-7及BT-474細胞)或賀癌平(SKBr3R細胞)治療該等細胞。2天、4天及6天後,根據製造商說明書利用MTS分析(Promega)測定細胞生長。利用活化半胱天冬酶活性分析(ApopTag螢光半胱天冬酶分析套組,Roche)測定細胞凋亡。將利用相同細胞之MitotrackerTM(Invitrogen)染色來識別干擾線粒體功能之化合物。
一種測定bishSRC-3之脫靶效應之方式係產生針對每一bishSRC-3載體之劑量-反應曲線數據,以測定最大有效劑量及該等劑量水準干擾SRC-3共活化劑生物學之能力之差異。本發明者認識到,為降低靶向其他基因之機率,可對bishSRC-3序列實施BLAST分析,且可對可能靶向之基因實施RT-PCR定量以驗證其不為該等載體之靶。本發明者亦認識到,對經bishSRC-3治療之細胞系之微陣列分析揭示之基因表現模式與SRC-3表現之損失一致,該等模式與一般shRNA毒性不同。
一種提供關於bishSRC-3載體恢復及/或增強乳癌細胞對他莫昔芬(BT-474)或抗HER2(SKBR3R)治療之敏感性之有效性之有價值資訊的方式係採用基於活體外細胞培養之方式,且亦可在動物模型系統中證實該等發現;此亦證實該等bishSRC-3/化學療法組合之有效性。
一種證實將bishSRC-3有效遞送至活動物之腫瘤、阻斷其生長且
顯示臨床前可行性之能力之方式涉及利用人類乳癌細胞-小鼠宿主異種移植物模型。該等異種移植物模型亦為組合該等bishSRC-3與雙層內陷性囊泡(BIV)提供重要平臺,且該等異種移植物模型用來證實,他莫昔芬或賀癌平及bishSRC-3+BIV脂複合物皆可有效組合在一起來阻斷乳癌細胞生長。
一種證實在暴露於適當化學治療劑(5mg,在MCF-7及BT-474細胞中經60天釋放他莫昔芬之石蠟顆粒)及16mg/kg經由腹膜內注射遞送之賀癌平(SKBR3R細胞)後bishSRC-3影響存活率及生長率之方式涉及將MCF-7、BT-474及SKBr3R細胞作為異種移植物皮下移植至裸小鼠中。
一種測試bishSRC-3單獨及與該等化學劑組合抑制或逆轉腫瘤生長之能力之方式係在60天時間段內與未經治療之對照小鼠以及與他莫昔芬及抗HER劑及空bishRNA載體(pUMVC3)比較異種移植物之生長。
本發明者認識到,為提供足夠統計檢定力以檢測腫瘤倍增(或減半)時間因應治療之顯著差異,每個治療組每種試劑可採用8只小鼠;此外,為提供腫瘤生長曲線,亦可評估經治療腫瘤在增殖(Ki67)、細胞凋亡(裂解的半胱天冬酶3)以及ERα、SRC-3及HER2之表現中之變化。
本發明者認識到,適用於活體內及臨床上之基因減弱會因為缺少有效全身性遞送而受到阻礙;小型雙股寡核苷酸即使經化學修飾亦僅具有數秒至數分鐘之循環半衰期(25,26);且大多數遞送媒劑因膠體不穩定性、聚集、非靶器官之高清除率、免疫原性、較差活體內轉染效率及基因表現受損而不適用。
本發明者已製造出BIV遞送媒劑,其已克服該等限制(27)且高度有效地用於將治療性負載物全身性遞送至原發性及轉移性人類癌症
(包含胰臟癌異種移植物灶)(28)。
在一實施例中,陽離子性BIV遞送媒劑包括生物可降解性1,2-二油醯基-3-三甲基銨基丙烷(DOTAP)及膽固醇之手工擠出調配物。在一些實施例中,BIV遞送媒劑不含有聚乙二醇(PEG)。本發明者認識到,聚乙二醇化減少首渡器官非靶滯留之「海綿效應」,但亦引起位阻及無效靶細胞攝取(儘管有修飾)。在一實施例中,BIV陽離子性遞送媒劑具有5小時之經優化半衰期且在循環中穩定。
在又一實施例中,囊封於該等200-450nm之撓性遞送媒劑中之核酸可穿透腫瘤微環境之毛細管膜孔、其他緊密細胞間接合(例如血液視網膜障壁),且與間質壓力梯度呈逆流方式滲入大型腫瘤。在小鼠中,BIV遞送媒劑已達到所記載之靜脈內注射後之最高基因表現量。
一種測定阻斷腫瘤生長之最大有效劑量之方式係在將腫瘤異種移植物插入宿主動物後一週時以不同劑量經腹膜內遞送bishSRC-3載體及對照物。
靶向SRC-3及SRC-1致癌基因之雙功能shRNA(bi-shRNA)載體。
在乳癌-1中擴增之類固醇受體共活化劑-3(SRC-3/AIB-1)及類固醇受體共活化劑-1(SRC-1)係通常在雌激素受體及HER2陽性乳癌中過表現或擴增之關鍵乳癌致癌基因。已顯示,實驗性靶向SRC-3或SRC-1限制乳癌細胞生長且恢復他莫昔芬之抗雌激素作用。在此處利用RNA干擾(RNAi)技術,利用基於雙功能shRNA(bi-shRNA)之設計用於減弱單一SRC-1或SRC-3(具有構築雙倍體之能力)。bi-shRNA效應子藉由同時促進裂解靶mRNA、降解mRNA(經由隔離p-小體)及阻遏轉譯來加強減弱標靶,從而降低劑量需求。
在細胞培養模型中評估靶向SRC-3及SRC-1之不同bi-shRNA以基於其阻斷共活化劑表現及乳癌細胞生長之能力識別最有效構築物變體。此已識別能夠在MCF-7乳癌細胞中將SRC-3及SRC-1之表現有效
減少至較低量(經由西方免疫印跡)之SRC-1及SRC-3 bi-shRNA構築物。首先,檢查SRC-3 bi-shRNA載體對SRC-3蛋白在MCF-7及MDA-MB-231乳癌細胞中之表現之效應(圖6及圖7)。所有bi-shRNA載體皆能夠減少SRC-3蛋白在MCF-7細胞中之表現。在MDA-MB-231細胞中,bi-shRNA載體pGBI-45及pGBI-49能夠有效減少SRC-3蛋白表現,同時bi-shRNA載體pGBI-46、pGBI-47及pGBI-48以較低程度減少SRC-3蛋白表現。
實施細胞生長分析以檢查SRC-3及SRC-1 bi-shRNA載體阻斷乳癌細胞生長之能力。用SRC-1及SRC-3 bi-shRNA載體轉染MCF-7細胞且在4天後(圖8)或5天後(圖9)經由MTT分析量測其對細胞增殖之效應。與陰性對照(siGFP)相比,所有靶向SRC之載體皆能夠有效減緩細胞生長。類似地,對經SRC-1及SCR-3 bi-shRNA載體轉染之MDA-MB-231細胞亦觀察到生長抑制(圖10)。該等結果確認,基於bi-shRNA之對SRC-1及SRC-3之靶向可在活體外減緩乳癌細胞生長。
用A-549肺癌細胞系進一步檢查SRC-3減弱。與空載體對照相比,轉染至A-549細胞中之靶向SRC-1及SCR-3之bi-shRNA表現載體能夠有效減弱SRC-3蛋白表現(圖11)。對於肺癌細胞而言,bi-shRNA載體pGBI-43、pGBI-48及pGBI-49在減少SRC-3表現中最有效。
總之,靶向SRC-1及SCR-3之bi-shRNA構築物可有效減少SRC-3蛋白在乳癌細胞(MCF-7及MDA-MB-231細胞)及肺癌細胞(A-549細胞)二者中之表現。該等構築物亦可在活體外減緩乳癌細胞生長。對活體外肺癌細胞之細胞生長抑制之論證正在進行中。
預期本說明書中所論述之任一實施例皆可根據本發明之任一方法、套組、試劑或組合物來實踐,且反之亦然。此外,可利用本發明之組合物來達成本發明之方法。
應理解,本文所闡述之具體實施例係以說明方式來顯示而非限
制本發明。本發明之主要特性可在不背離本發明範疇之情形下用於多個實施例中。彼等熟習此項技術者僅利用常規實驗即可認識到或能夠確定本文所闡述之特定程序之眾多等效物。認為該等等效物在本發明範疇內且為申請專利範圍所囊括。
本說明書中所提及之所有出版物及專利申請案皆指示彼等熟習本發明所屬領域技術者之技術水準。所有出版物及專利申請案皆以引用方式併入本文中,其程度如同指示每一個別出版物或專利申請案係特定地且個別地以引用方式併入本文中一般。
在申請專利範圍及/或說明書中,詞語「一(a或an)」在與術語「包括」結合使用時可意指「一個」,但其亦與「一或多個」、「至少一個」及「一個或一個以上」之含義吻合。儘管本發明支持所利用術語「或」僅指替代物及「及/或」之定義,但除非明確表明此術語僅指替代物或替代物相互排斥,否則申請專利範圍中所利用術語「或」用來意指「及/或」。在整個本申請案中,術語「約」係用於指示,一值包含用來測定該值之裝置、方法之固有誤差變異,或研究個體之間存在之變異。
如在本說明書及申請專利範圍中所利用,詞語「包括(comprising)」(及其任一形式,例如「包括(comprise)」及「包括(comprises)」)、「具有(having)」(及其任一形式,例如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包含(including)」(及其任一形式,例如「包含(includes)」及「包含(include)」)或「含有(containing)」(及其任一形式,例如「含有(contains)」及「含有(contain)」)具有包涵性或開放性,且不排除其他未列出之要素或方法步驟。
如本文所利用之術語「或其組合」係指在該術語之前所列出條目之所有排列及組合。例如,「A、B、C或其組合」意欲包含以下中之至少一者:A、B、C、AB、AC、BC或ABC,且在具體上下文中若
順序很重要,則亦包含BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續此實例,其明確包含含有一或多個條目或術語之重複之組合,例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟習此項技術者將理解,除非上下文中另外指明,否則通常並不限制任一組合中之條目或術語之數目。
如本文所利用,近似性詞語(例如但不限於)「約」、「實質的」或「實質上」係指條件經該等詞語修飾時應理解為不一定係絕對或完美的,但可被彼等熟習此項技術者認為足夠接近以保證指明該條件存在。該描述可變之程度將取決於可設立多大變化且仍使熟習此項技術者認識到經修改之特性仍具有未經修改特性之所需特徵及能力。通常且根據先前論述,本文中經近似性詞語(例如「約」)修飾之數值可自所述之值變化至少±1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、10%、12%或15%。
藉助本發明無需過多實驗即可製造且執行本文所揭示且主張之所有組合物及/或方法。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述,但彼等熟習此項技術者將明瞭,在不背離本發明之概念、精神及範疇之情形下可改變該等組合物及/或方法及本文所闡述方法之步驟或步驟之順序。對彼等熟習此項技術者顯而易見的所有該等類似取代及修改皆視為在如隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範疇及概念內。
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Claims (39)
- 一種表現載體,其包括:啟動子;及以操作方式連接至該啟動子之核酸插入物,其中該插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾來抑制SRC-3基因表現之短髮夾RNA(shRNA);其中該一或多種shRNA包括雙功能RNA分子,其可活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA所誘導之沉默複合物,以減少該SRC-3表現量。
- 如請求項1之表現載體,其中該一或多種shRNA包括選自以下之序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或其組合或修飾形式。
- 如請求項1之表現載體,其中該shRNA之序列排列包括5’莖臂-19個核苷酸靶(SRC-3基因)-TA-15個核苷酸環-19個核苷酸靶互補序列-3’莖臂-間隔體-5’莖臂-19個核苷酸靶變體-TA-15個核苷酸環-19個核苷酸靶互補序列-3’莖臂。
- 一種治療性遞送系統,其包括:治療劑載劑;及表現載體,其包括啟動子及以操作方式連接至該啟動子之核酸插入物,其中該插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾而抑制SRC-3基因表現之短髮夾RNA(shRNA);其中該一或多種shRNA包括雙功能RNA分子,其可活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA所誘導之沉默複合物,以減少SRC-3表現量。
- 如請求項4之遞送系統,其中該治療劑載劑係使用一或多個聚陽離子壓縮之經壓縮DNA奈米粒子。
- 如請求項5之遞送系統,其中該一或多個聚陽離子係經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸3聚體肽(CK30PEG10k)。
- 如請求項5之遞送系統,其中該等經壓縮DNA奈米粒子進一步囊封於脂質體中。
- 如請求項7之遞送系統,其中該脂質體係雙層內陷性囊泡(BIV)。
- 如請求項7之遞送系統,其中該脂質體係可逆式遮蔽脂質體。
- 如請求項7之遞送系統,其中該脂質體係經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾,其中該一或多個「聰明」受體靶向部分係小分子二價β-轉角模擬物。
- 如請求項4之遞送系統,其中該治療劑載劑係脂質體。
- 如請求項4之遞送系統,其中該一或多種shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。
- 如請求項4之遞送系統,其中該遞送系統係自身或與一或多種化學治療劑、放射性療法、手術干預、抗體療法、維生素D或其任何組合組合用於阻抑腫瘤細胞生長、治療乳癌或同時達成二者。
- 一種表現載體及治療劑載劑之用途,其用於製造用來將一或多種shRNA遞送至表現SRC-3基因之靶組織之藥劑,其中:該表現載體包括啟動子及以操作方式連接至該啟動子之核酸插入物,該插入物編碼該一或多種經由RNA干擾而抑制SRC-3基因表現之shRNA,其中該一或多種shRNA包括雙功能RNA分子, 其可活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物,以減少SRC-3表現量;且該表現載體係與該治療劑載劑組合,其中該治療劑載劑係經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾之脂質體。
- 如請求項14之用途,其中該治療劑載劑包括經壓縮DNA奈米粒子。
- 如請求項15之用途,其中該DNA奈米粒子係使用一或多個聚陽離子壓縮,其中該一或多個聚陽離子包括經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸3聚體肽(CK30PEG10k)或30聚體離胺酸縮合肽。
- 如請求項15之用途,其中該等經壓縮DNA奈米粒子進一步囊封於脂質體中,其中該脂質體係雙層內陷性囊泡(BIV)且經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾,其中該一或多個「聰明」受體靶向部分係小分子二價β-轉角模擬物。
- 如請求項17之用途,其中該脂質體係可逆式遮蔽脂質體。
- 如請求項14之用途,其中該一或多種shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。
- 一種抑制SRC-3基因在一或多種靶細胞中之表現之活體外方法,其包括以下步驟:選擇該一或多種靶細胞;及用表現一或多種短髮夾RNA(shRNA)之載體轉染該靶細胞,該一或多種短髮夾RNA能夠經由RNA干擾而抑制SRC-3基因在該一或多種靶細胞中之表現;其中該一或多種shRNA包括雙功能RNA分子,其可活化裂解 依賴型及非裂解依賴型RNA所誘導之沉默複合物,以減少SRC-3表現量。
- 如請求項20之方法,其中該shRNA之序列排列包括5’莖臂-19個核苷酸靶(SRC-3基因)-TA-15個核苷酸環-19個核苷酸靶互補序列-3’莖臂-間隔體-5’莖臂-19個核苷酸靶變體-TA-15個核苷酸環-19個核苷酸靶互補序列-3’莖臂。
- 如請求項20之方法,其中該一或多種shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。
- 一種含表現載體之治療劑載劑複合物之用途,其用於製造在人類中阻抑腫瘤細胞生長、治療乳癌或同時達成二者之藥劑,其中該表現載體表現一或多種能夠經由RNA干擾而抑制SRC-3基因在一或多種靶細胞中表現之雙功能短髮夾RNA(shRNA),其中該抑制導致該等腫瘤細胞之細胞凋亡、增殖受阻或侵襲力下降;且其中該一或多種shRNA包括雙功能RNA分子,其可活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA所誘導之沉默複合物,以減少SRC-3表現量。
- 如請求項23之用途,其中該一或多種shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。
- 如請求項23之用途,其中該shRNA之序列排列包括5’莖臂-19個核苷酸靶(SRC-3基因)-TA-15個核苷酸環-19個核苷酸靶互補序列-3’莖臂-間隔體-5’莖臂-19個核苷酸靶變體-TA-15個核苷酸環- 19個核苷酸靶互補序列-3’莖臂。
- 如請求項23之用途,其中該治療劑載劑係經壓縮DNA奈米粒子或經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾之可逆式遮蔽脂質體,其中該一或多個「聰明」受體靶向部分係小分子二價β-轉角模擬物。
- 如請求項23之用途,其中該治療劑載劑係使用一或多個聚陽離子壓縮之經壓縮DNA奈米粒子,其中該一或多個聚陽離子包括經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸3聚體肽(CK30PEG10k)或30聚體離胺酸縮合肽。
- 如請求項26之用途,其中該可逆式遮蔽脂質體係雙層內陷性囊泡(BIV)。
- 如請求項26之用途,其中該等經壓縮DNA奈米粒子係進一步囊封於脂質體中。
- 如請求項23之用途,其中該腫瘤細胞或乳癌會抗拒他莫昔芬(tamoxifen)療法。
- 如請求項23之用途,其中該腫瘤細胞或乳癌為HER-2陽性。
- 如請求項23之用途,其中該藥劑係與他莫昔芬組合使用。
- 如請求項23之用途,其中該藥劑係在一或多種選自由以下組成之群之治療之前、之後或同時作為其組合療法使用:化學療法、放射性療法、手術干預、抗體療法、維生素D治療或其任何組合。
- 一種含表現載體之治療劑載劑複合物之用途,其用於製造在人類或動物個體中治療一或多種抗拒化學療法之癌症、提高一或多種化學治療劑之有效性或同時達成二者之藥劑,其中該藥劑阻抑或抑制SRC-3基因在該人類或該動物個體中之表現,且其中該表現載體表現一或多種能夠經由RNA干擾而抑 制SRC-3基因在該人類或動物個體中之一或多種靶細胞中表現之雙功能短髮夾RNA(shRNA),其中該抑制結果會增強該一或多種化學治療劑之作用,從而導致一或多種腫瘤細胞之細胞凋亡、增殖受阻或侵襲力下降;其中該一或多種雙功能shRNA可活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA所誘導之沉默複合物,以減少SRC-3之表現量。
- 如請求項34之用途,其中該一或多種化學治療劑包括鉑藥物、卡鉑(carboplatin)、他莫昔芬、ER拮抗劑或其任何組合。
- 如請求項34之用途,其中該等癌症係選自由結腸癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌或其任何組合組成之群。
- 如請求項34之用途,其中該癌症為HER-2陽性乳癌。
- 如請求項34之用途,其中該一或多種shRNA係選自由以下組成之群:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其組合或修飾形式。
- 如請求項34之用途,其中該藥劑係在該一或多種化學治療劑之前、之後或同時投與。
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