TW201345545A

TW201345545A - 一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物

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Publication number: TW201345545A
Application number: TW101115833A
Authority: TW
Inventors: Ming-Hong Tai; Youn-Shen Bee; San-Cher Chen
Original assignee: Univ Nat Sun Yat Sen
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2013-11-16
Also published as: US20130296242A1; TWI445543B

Abstract

本發明之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其包含有源自於血管生成抑制因子的部分胺基酸片段，係如SEQ ID NO：1所示之序列。

Description

一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物

本發明係關於一種眼部的醫藥組合物，特別是關於一種可用以抑制眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物。

脈絡膜血管新生是造成高度近視、糖尿病視網膜病變、新生血管性青光眼和老年性黃斑部病變等患者失明的主因。目前治療脈絡膜血管新生與角膜血管增生的方式繁多，包括雷射光凝法、光動力療法及外科切除等，然而，習知治療脈絡膜血管新生之方法係屬於侵入性治療，容易造成創傷、發炎等副作用或其它併發症，且治療效果有限，無法杜絕新的血管新生情形。

蛋白質藥物係一種新的標靶治療方式，近年來逐漸成為生技產業發展主流。由於蛋白質藥物是源自人體內自然存在的生物大分子，其藥物有效性和安全性相對於人工合成的化學藥物來得高，舉例而言，如惡性腫瘤、風濕性關節炎等的治療，皆可藉由蛋白質藥物提高其標靶作用。

目前臨床常用脈絡膜血管新生之習用蛋白質藥物包含有Avastin及Lucentis，該習用蛋白質藥物係以注射器對眼球直接輸注給藥，然而，該習用蛋白質藥物在施用上有技術層面的限制，而需藉由醫師進行，無法供患者在家中自行使用。

再者，Avastin會引起如流鼻血、高血壓、血管栓塞以及輕微蛋白尿，少數有腸胃道出血及穿孔等副作用；而Lucentis可能會引起使用者的眼球內感染、結膜下出血、眼球內出血以及視網膜剝離等副作用。因此，二種習用蛋白質藥物皆會造成使用者許多不適情形，且使用技術層面的限制較高，無法供使用者於家中自行使用，導致使用者的施用意願不高，而無法達到抑制血管新生的效果。

查，鈣網蛋白(Calreticulin)具有抗腫瘤的血管新生作用，係由417個胺基酸組成，其中，又以該鈣網蛋白N端起算第1至180位胺基酸的片段，稱為血管生成抑制因子(Vasostatin，以下簡稱VS180)，係用以抑制血管新生作用的主要片段。

請參照Sheu等人於2009年在Molecular Vision發表「Inhibition of choroidal neovascularization by topical application of angiogenesis inhibitor vasostatin」之期刊論文，提供一種眼藥水，係以VS180做為抑制血管新生作用之抑制劑，係以原核系統(如E. coli)生產一VS180重組蛋白，然而，該VS180重組蛋白屬於大分子量化合物，其較不易進入細胞內，且也不易與血管內皮細胞結合，其抑制血管新生的效果亦較差。

此外，由於VS180胺基酸片段的水溶性較差，將之製備成眼藥水時不易溶於水中，因此，可選擇以有助於增進水溶性之標籤蛋白，如硫氧化還原蛋白(Thioredoxin，簡稱TRX)提高該VS180重組蛋白的水溶性，又同時做為純化該VS180重組蛋白之用，以便進行後續的蛋白質純化作業。

然而，將帶有TRX之VS180重組蛋白(簡稱TRX-VS180)作為抑制脈絡膜血管新生的抑制劑，施用於個體時，由於TRX係源自於一種細菌蛋白，其對個體容易產生免疫反應，使個體在實際使用時會產生紅眼、搔癢等不適症狀；若為改善TRX所引發的不良免疫反應，而將TRX剔除後，單以VS180重組蛋白作為抑制劑使用，由於該VS180之分子量較大，不易進入血管內皮細胞中發揮其抑制血管新生的作用，且其水溶性亦較差，將其製成一眼藥水劑型時容易產生沉澱，因此，單純VS180之胺基酸片段溶於水溶液中的穩定性較差，其作用於眼部血管新生抑制眼部血管新生的效果亦差強人意。

由上述可知，有必要提供一種可提高該VS180對於作用標的細胞的結合率及有效抑制血管新生的能力，又不會因標籤蛋白而對個體造成不良免疫反應的醫藥組合物。

本發明之主要目的係提供一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其係能提高VS180作用於眼部血管新生的抑制能力者。

本發明之次一目的係提供一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其係能提高VS180與血管內皮細胞的結合能力者。

本發明之又一目的係提供一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其係能提高VS180之水溶性者。

為達到前述發明目的，本發明之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其包含有源自於血管生成抑制因子的部分胺基酸片段，係如SEQ ID NO：1所示之序列。

其中，該醫藥組合物包含一溶劑，該胺基酸片段溶於該溶劑中。

其中，該醫藥組合物之溶劑為0.85~0.90%之生理鹽水。

其中，0.1~1000微克(μg)之胺基酸片段係溶於1毫升(ml)之溶劑中。

其中，該醫藥組合物之劑型為滴劑。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：

請參照第1圖所示，本發明之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物中，係包含有源自於鈣網蛋白N端第133至180位之胺基酸片段，即血管生成抑制因子中有效抑制血管新生的部份片段(以下簡稱本發明VS48)，係如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，共有48個胺基酸。更詳言之，本發明VS48較容易進入細胞中，與眼部的血管內皮細胞專一性地結合，有效作用於眼部的血管內皮細胞，進而抑制眼部血管新生現象，例如血管內皮細胞的移行(Migration)、微管柱形成(Tubular formation)及微血管形成。

請參照第1表，本發明VS48之水溶性較VS180或VS48以外之其餘片段(即VS132)高，VS48能夠不依賴其他助溶成份(如提高水溶性之標籤蛋白TRX)，直接溶於一溶劑中而不會產生沉澱，該溶劑可以選擇為與生物體之體液滲透壓(如血漿)相當之溶液，如0.85~0.9%之生理鹽水；本實施例較佳係選擇以0.85~0.90%之生理鹽水(NaCl)做為溶劑，該VS48於0.85~0.90%之生理鹽水中的儲存穩定性佳，能夠於溫度為4℃之條件下儲存至一年。

本發明VS48能夠選擇以上述溶劑配製成濃度為0.1~1000 μg/ml(其中，當濃度為1000 μg/ml時仍可完全溶解)之治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，將本發明VS48製成供使用者便於自行施用的眼部用滴劑。

第1表：比較本發明VS48與VS180之水溶性

此外，本發明另可包含一抗菌劑，較佳係該抗菌劑佔該醫藥組合物重量百分比之1%，有助於延長本發明用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物的儲存時間。舉例而言，本實施例之抗菌劑可以選擇為苯氧乙醇(phenoxetol)，其為液體狀，易於配製眼藥水之操作，且苯氧乙醇之安全性佳，使用濃度為1%時對眼睛、皮膚、黏膜不造成刺激或過敏反應。在有蛋白質存在狀況下，相當穩定，於室溫下不會揮發。

本發明藉由該VS48專一性地與血管內皮細胞結合，以抑制其移行或微管柱形成之機制，而能夠達到有效抑制血管內皮細胞新生的目的。本發明VS48亦可由基因重組技術之原核系統生產，本發明較佳實施例係選擇將VS48接合至一段不會引起不良免疫反應之標籤蛋白(如His組胺酸標籤蛋白)之後、或者在獲得該VS48重組蛋白後另進行一標籤蛋白剔除程序，將該VS48重組蛋白上的標籤蛋白去除後，再將之製成該醫藥組合物。如此，即可避免由標籤蛋白所引發生物體的不良免疫反應，又可確保該VS48重組蛋白能夠穩定地溶於水溶液中，而不會產生沉澱。

為證實本發明用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物確實對生物體具有較佳的結合性，且同時降低生物體對VS48重組蛋白的不良免疫反應，進而提高使用者的施用意願，以下為本發明之較佳實施例，其包含：(A)本實施例VS48之製備、(B)本實施例VS48與TRX-VS48之免疫反應試驗、(C)本實施例VS48抑制眼底脈絡膜血管新生試驗、(D)本實施例VS48抑制眼球表面血管新生試驗、(E)本實施例VS48與血管內皮細胞之專一結合性試驗、(F)本實施例VS48之血管內皮細胞移行與微管柱抑制試驗及(G)本實施例VS48之大鼠動脈環微血管生成抑制試驗。

(A)本實施例VS48之製備

本實施例係選擇以Raji淋巴瘤細胞株(購自台灣新竹食品工業發展研究所生資中心，寄存編號為BCRC 60116)中萃取總核糖核酸(total ribonucleic acid)，再利用反轉錄酶-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction)選殖該血管生成抑制因子(VS)之去氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，簡稱cDNA)，根據內質網蛋白之互補去氧核糖核酸(calreticulin cDNA)設計一組VS48引子對，係如第2表所示，並獲得一如SEQ ID NO：2所示之去氧核糖核酸。本實施例所揭示VS48之製備內容並不以此為限，可由本發明所屬技術領域且具有通常知識者依據所需進行合理修改或置換。

第2表：本實施例之VS48引子對

本實施例以限制酶選殖方式將該VS48之去氧核糖核酸送至一表現載體(如pET32a載體或pET28a載體，本實施例係選擇以pET28a載體表現該VS48重組蛋白，其係含有不會產生不良免疫反應之His標籤蛋白)，再將包含有該VS48的表現載體，送入BL21大腸桿菌細胞中表現一VS48重組蛋白，再以nickel-NTA親和性管柱對該VS48重組蛋白進行純化，於菌液中加入35 ml之PET溶解液，將菌液混合均勻，同時加入蛋白分解酵素抑制劑(包含1 mM之PMSF、1 μg/ml之aprotinin、1 μg/ml之pepstatin及1 μg/ml之leupeptin)，以超音波震盪將細胞打破，再以9000 rpm之轉速離心20分鐘後，收取上清液。

取10 ml之50% Ni-NTA agarose微珠膠體，先以PET溶解液清洗，再將上述的上清液與該Ni-NTA agarose微珠膠體混合形成一混合液，該混合液於4℃中作用40分鐘後，填裝於管柱中，靜置使液體流出，並依序通過30 ml之PET溶解液，將非專一性吸附的雜蛋白質充分去除。

以3 ml之緩衝溶液將該VS48重組蛋白沖洗出來，並裝於MW12000-14000的透析袋，以PBS透析3小時，測蛋白質濃度，再以12.5%之SDS-PAGE及蛋白質染色法(Coomassie Blue stain)確認該VS48重組蛋白之分子量及純度。

如此可獲得本實施例之VS48重組蛋白，且該VS48重組蛋白係包含有一段不會引起不良免疫反應之標籤蛋白His組胺酸標籤蛋白。

(B)本實施例VS48與TRX-VS48之免疫反應試驗

為證實本發明VS48係能夠避免對生物個體產生不良免疫反應，請參照第3表所示，本實施例係提供2組受試動物(各組包含8隻兔子，本實施例之兔子係購自行政院農業委員會畜產試驗所，其為紐西蘭白兔)，分別是第B1組：依試驗(A)所述之方式，選擇以pET28a載體製備一包含TRX標籤蛋白之VS48重組蛋白，及第B2組：依試驗(A)所述之方式，選擇以pET28a載體製備一包含有His標籤蛋白之VS48重組蛋白。

第3表：本實施例第B1及B2組之內容物

本實施例係每隔二週對第B1及B2組之實驗兔子，分別於腹腔注射如第3表所示之內容物，共注射4次，每次注射量為0.2毫克/毫升(mg/ml)之內容物。待試驗結束後，抽取各實驗兔子的血液後，將各組血清稀釋成1/100、1/500、1/1000、1/2000等比例，並測量各血清樣本之吸光值(OD₅₇₀)，製作出血液稀釋比例與免疫反應的長條圖。

請參照第2圖所示，第B1組之TRX-VS48確實會造成實驗兔子的免疫反應，第B2組之VS48重組蛋白相較於第B1組較不會造成實驗動物的免疫反應，且具有顯著差異(p<0.05)。由此可知，TRX確實會引發個體產生不良免疫反應。

(C)本實施例VS48抑制眼底脈絡膜血管新生試驗

為證實本發明VS48係能夠有效抑制眼底的脈絡膜血管新生，本實施例係提供2組受試動物(分別為第C1及C2組，各組包含8隻大鼠，本實施例之大鼠係購自財團法人國家實驗研究院實驗動物中心，其為挪威種大棕鼠)，以雷射光凝固法誘發各受試動物產生脈絡膜血管新生後，隔日開始施用如第4表所示之內容物，其中第C2組之內容物係以生理食鹽水配製成濃度為1 μg/ml之VS48重組蛋白溶液。

第4表：本實施例第C1及C2組之內容物

將第4表所示之內容物施予各組別之大鼠眼部，每天局部點眼3次，每次點眼之溶液體積為50 μl，連續治療20天後，各組分別於第21、28、35、42天以螢光素眼底血管造影(funds fluorescein angiography)觀察脈絡膜血管新生的情形，且於第42天採取各組大鼠之眼部檢體，各組之眼部檢體皆製成數個組織切片樣本，分別以蘇木紫-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin stain)和免疫螢光分析(Immuno-fluorescence analysis)觀察眼底血管造影的變化和新生微血管(von Willebrand factor-positive blood vessels)之分佈。

請參照第3及4圖，第C2組與第C1組相比，第C2組之VS48可藉由滴劑型式施予個體患部，且能夠明顯減低大鼠眼底的脈絡膜血管新生情形，此外，由雷射誘發的病灶較小，其視網膜下層組織也相對較為完整。由此可知，本發明VS48確實能夠有效抑制眼底之脈絡膜血管新生。

(D)本實施例VS48抑制眼球表面血管新生試驗

為證實本發明VS48係能夠有效抑制眼球表面的血管新生，本實施例係提供2組受試動物(分別為第D1及D2組，各組包含8隻大鼠，本實施例之大鼠係購自財團法人國家實驗研究院實驗動物中心，其為挪威種大棕鼠)，該二組大鼠先以異氟烷(Isoflurane)全身麻醉後，於眼部注射0.5%之丙美卡因(Proparacaine)做局部麻醉，將纖維母細胞生長因子(bFGF)氫聯合小體置入大鼠雙眼，以促進眼球表面的血管增生後，進行為期14天之測試，每天點眼3次，每次點眼之溶液體積為50 μl，一眼以生理食鹽水點眼，另一眼則施予如第5表所示之內容物，並於第14天觀察角膜血管長度和血管分佈面積的變化。

第5表：本實施例第D1及D2組之內容物

請參照第5圖，第D2與第D1組相比，第D2組之VS48可藉由滴劑型式施予生物體患部(本實施例係指眼球表面)，以減少血管增生因子(即纖維母細胞生長因子，bFGF)所誘發之角膜增生血管之長度和血管分佈的面積。由此可知，本發明VS48確實能夠有效抑制眼球表面的血管新生。

(E)本實施例VS48與血管內皮細胞之專一結合性試驗

為證實本發明所提供之VS48，與VS180中的其餘片段(如VS132)相較，係能夠與血管內皮細胞專一性地結合而達到抑制血管新生。

請參照第6表所示，本實施例係先將一人類臍帶靜脈內皮細胞HUVEC(BCRC編號為H-UV001)及一小鼠纖維母細胞NIH3T3(BCRC編號為60008)先置於無菌96孔盤中培養一天之後，再將1~10000奈克/毫升(ng/ml)不同濃度之VS48重組蛋白與VS132重組蛋白，分別與一人類臍帶靜脈內皮細胞HUVEC及一小鼠纖維母細胞NIH3T3共培養4小時後，以可辨認帶有His標籤蛋白的抗體，測試帶有His標籤蛋白的VS48與血管內皮細胞之間的專一性結合情形，以未添加任何內容物之組別為對照組，定義該對照組之細胞結合率為100%。

第6表：本實施例第E1及E2組之內容物

請參照第6及7圖所示，由第E2組分別於HUVEC及NIH3T3之結合情形可知，本發明VS48只有與HUVEC之細胞結合率係隨著本發明VS48之濃度增加而增加，相較於第E2組，第E1組之VS132重組蛋白不會與HUVEC或NIH3T3專一性結合。

由此可知，本發明VS48藉由與內皮細胞之結合而有助於抑制血管內皮新生的情況，特別係與VS180之其餘片段(VS132)相較，本發明VS48具有更好的結合率。

(F)本實施例VS48之血管內皮細胞移行與微管柱抑制試驗

本實施例係證實本發明VS48係藉由抑制「血管內皮細胞的移行」及「血管內皮細胞管柱的形成」，而達到抑制血管新生的作用。

「血管內皮細胞的移行」

本實施例係提供3組血管內皮細胞置於Boyden chamber中，分別將如第7表之內容物與血管內皮細胞共培養24小時，同時利用吸附因子(如鹼性纖維細胞生長因子bFGF)誘使該血管內皮細胞移動，待24小時後將細胞固定、染色，於顯微鏡下直接觀察血管內皮細胞，並計算移行細胞的數量。

第7表：本實施例第F1至F3組之內容物

請參照第8及9圖所示，第F3組與第F1及F2組相較，本發明VS48明顯抑制血管內皮細胞移行能力，而VS180之其餘片段(VS132)則無法抑制血管內皮細胞移行。

「血管內皮細胞微管柱的形成」

本實施例係提供3組血管內皮細胞，分別將如第8表之內容物與血管內皮細胞共培養48小時後，於顯微鏡下直接觀察血管內皮細胞的微管柱形成。

第8表：本實施例第F4至F6組之內容物

請參照第10及11圖所示，第F6組與第F4及F5組相較，本發明VS48明顯減少血管內皮細胞微管柱的形成，而VS180之其餘片段(VS132)則無法減少血管內皮細胞微管柱的形成。

(G)本實施例VS48之大鼠動脈環微血管生成抑制試驗

為證實本發明VS48重組蛋白確實能抑制微血管形成，本實施例係提供一來自於大鼠(本實施例之大鼠係購自財團法人國家實驗研究院實驗動物中心，其為挪威種大棕鼠)的主動脈，並確實清除包覆在主動脈上的結締組織，並將主動脈剪成數段(長度約0.2 cm)，將數段主動脈分成如第9表所示之第G1至G3組，分別置於含有膠原蛋白與細胞培養液混合液中(1 ml之膠原蛋白與3 ml之DMEM細胞培養液)充分混合，其中，第G1組係加入生理鹽水，第G2組加入濃度為100 ng/ml之VS132重組蛋白，第G3組則加入濃度為100 ng/ml之VS48重組蛋白，共培養5天後，觀察其微血管生成情形。

第9表：本實施例第G1至G3組之內容物

請參照第12及13圖所示，以第G1組之微血管生成長度為基準，其微血管生成率定為100%，計算第G2及G3組之微血管生成率，本發明VS48重組蛋白明顯抑制大鼠動脈環附近微血管增生的現象，而VS180之其餘片段(VS132)則無法抑制大鼠動脈環附近微血管增生的現象。

綜上所述，本發明用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物配製成濃度為0.1~1000微克/毫升(μg/ml)之VS48重組蛋白水溶液，確實能夠有效抑制眼底或眼球表面之血管新生作用，且根據試驗(E)之內容，本發明VS確實能夠專一性地與血管內皮細胞結合，並由試驗(F)及(G)之內容可知，本發明VS48確實能夠抑制血管新生之移行、微管柱形成或患部的微血管生成等現象；此外，本發明之醫藥組合物係製成一方便使用者自行施用的眼藥水劑型，其使用技術層面沒有限制，因此，本發明之醫藥組合物可供使用者便於自行使用，且能持續且定時地施用，達到有效抑制眼部血管新生的目的。

本發明之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，係以VS48作為有效抑制血管新生之胺基酸片段，其對於眼部血管內皮細胞之專一性高，而能有效提高抑制眼部血管新生效果之功效。

本發明之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，以VS48作為抑制血管新生的胺基酸片段，其與血管內皮細胞結合能力佳，能夠達到提高抑制眼部血管新生之功效。

本發明之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，以VS48作為抑制血管新生的胺基酸片段，其水溶性佳，能夠達到提高VS48溶於溶劑中的穩定性之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖：VS180、VS48及VS132之胺基酸片段示意圖。

第2圖：本實施例第B1及B2組之免疫反應長條圖。

第3圖：本實施例第C1及C2組之眼底脈絡膜血管新生抑制照片。

第4圖：本實施例第C1及C2組之眼底脈絡膜血管新生抑制長條圖。

第5圖：本實施例第D1及D2組之眼球表面血管新生抑制照片。

第6圖：本實施例第E1及E2組之HUVEC結合率長條圖。

第7圖：本實施例第E1及E2組之NIH3T3結合率長條圖。

第8圖：本實施例第F1至F3組之血管內皮細胞移行照片。

第9圖：本實施例第F1至F3組之血管內皮細胞移行長條圖。

第10圖：本實施例第F4至F6組之血管內皮細胞管柱照片。

第11圖：本實施例第F4至F6組之血管內皮細胞管柱形成長條圖。

第12圖：本實施例第G1至G3組之微血管生成照片。

第13圖：本實施例第G1至G3組之微血管生成率長條圖。

<110>國立中山大學

<120>一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物

<160> 2

<210> 1

<211> 48

<212> PRT

<213>

<400> SEQUENCE: 1

<210> 2

<211> 144

<212> DNA

<213>

<400> SEQUENCE: 2

Claims

一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其包含有源自於血管生成抑制因子的部分胺基酸片段，係如SEQ ID NO：1所示之序列。
如申請專利範圍第1項所述之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含一溶劑，該胺基酸片段溶於該溶劑中。
如申請專利範圍第1項所述之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其中該溶劑為0.85~0.90%之生理鹽水。
如申請專利範圍第2或3項所述之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其中0.1~1000微克(μg)之胺基酸片段係溶於1毫升(ml)之溶劑中。
如申請專利範圍第1項所述之用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物，其中該醫藥組合物之劑型為滴劑。