TW201335173A - 一種用以抑制ｎｍｄａ受體ｎｒ１之微小ｒｎａ、一種微小ｒｎａ用以製備抑制疼痛藥物之用途、以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物 - Google Patents

一種用以抑制ｎｍｄａ受體ｎｒ１之微小ｒｎａ、一種微小ｒｎａ用以製備抑制疼痛藥物之用途、以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物 Download PDF

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Abstract

一種用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA，該微小RNA係由一單股核糖核酸形成，該單股核糖核酸係包含一第一片段、一第二片段及一連接片段，該第二片段係與該第一片段互補之回文序列，該連接片段為任意排列之鹼基序列，該連接片段之兩端分別連接該第一片段及該第二片段，其中該第一片段係具有一裁切子切位及一Drosha切位，該裁切子切位及該Drosha切位之間包含一默化片段，該默化片段係與NMDA受體次單元NR1同源。本發明另揭示該微小RNA之用途及其醫藥組合物。

Description

一種用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA、一種微小RNA用以製備抑制疼痛藥物之用途、以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物
本發明係關於一種微小RNA、該微小RNA於製備抑制疼痛藥物之用途，及一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，特別是一種關於皮下組織疼痛之NMDA受體NR-1基因的微小RNA、其用以製備抑制疼痛藥物之用途，及以該微小RNA減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物。
RNA干擾(RNA interference)，係指一種部分對應於生物體內功能性基因之RNA片段，與生物體內生性的訊息RNA(messenger RNA，簡稱mRNA)配對後，所引起的基因默化(Gene silence)作用。最初係於1990年在牽牛花色素基因之異常表現情形所觀察到：一雙股RNA存在於細胞中，誘發細胞內的裁切子(Dicer)作用，而將該雙股RNA裁切成數個小段干擾RNA(small interfering RNA，簡稱siRNA)，該siRNA可解旋形成一單股RNA並與細胞中序列互補之mRNA結合，細胞內的RNA默化誘導複合體(RNA-induced silencing complex，簡稱RISC)將與該單股siRNA結合之mRNA進行裁切，使該mRNA被專一性地降解，該mRNA於轉錄後受到抑制，則對應於該mRNA之功能性基因無法表現而發生默化。
為了避免皮膚炎症性患者承受劇烈疼痛，請參照中華民國申請第099107164號「一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA、該小段干擾RNA用以抑制皮下組織NMDA受體NR1之方法、該小段干擾RNA之用途以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物」專利案，係一種利用RNA干擾原理，設計一段21個鹼基對(base pairs)的小段干擾RNA(後稱siRNA)，以皮下注射之方式使患部NMDA受體NR1次單元基因受到抑制而無法表現該NMDA受體NR1次單元蛋白，進而抑制患者的炎症性疼痛反應，降低皮膚創傷患者之疼痛感覺。
然而，該專利案所揭示之siRNA係一較不穩定的雙股RNA結構，因此，該siRNA在進入生物體後，實際能產生抑制疼痛作用之有效劑量很低，且必須以一高劑量之siRNA與一載劑混合，以幫助該siRNA進入細胞核內並產生抑制疼痛作用；此外，該siRNA抑制疼痛的作用時間僅能維持約7天左右，其疼痛抑制效果便逐漸減弱，而於第14天的抑制效果僅剩40%，該siRNA的抑制疼痛作用時間短，因此約7天左右就必須再注射，以維持抑制疼痛之效果。
為改善該siRNA之有效劑量低及抑制疼痛作用時間短之缺點，請參照中華民國申請第99146981號「一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA、一種以短夾RNA抑制NMDA受體NR1之方法以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物」專利案，揭示一種約為45~65個鹼基的短夾RNA(簡稱shRNA)，其係構築於一pSilencer質體，藉由一般細胞皆有之內生性RNA轉錄酶Ⅲ(RNA polymerase Ⅲ)轉錄構築於該pSilencer質體之shRNA，其中，該shRNA具有一第一片段、一第二片段及一連接片段而形成一似髮夾型結構，該第一片段係NMDA受體次單元NR1之同源性核糖核酸序列，而該第二片段係該第一片段之回文序列，該連接片段係連接該第一片段及該第二片段之3～23個任意鹼基序列。其中，該shRNA之第一片段中係含有可與一預定默化基因之mRNA配對，該配對之片段係由裁切子進行剪切作用而獲得。
雖然該shRNA作用於細胞內的時間可延長至14天以上，較該siRNA之抑制疼痛時間為久，然而，將該用以轉錄shRNA之pSilencer載體卻需要7天以上才能於生物體內發揮其抑制疼痛的效果，因此，對於正在承受皮膚炎症性疼痛之患者，仍無法由該pSilencer載體所轉錄出的shRNA即時緩解其所無法承受的痛感。此外，為達到有效抑制疼痛之效果，所施用可轉錄該shRNA之載體劑量亦較高，因此，該專利案所揭示shRNA之製備成本較高。
根據Stegmeier等人發表於PNAS(2005年)「A lentiviral microRNA-based system for single-copy polymerase Ⅱ-regulated RNA interference in mammalian cells」之期刊資料，係揭示一種微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)，其係由RNA轉錄酵素Ⅱ轉錄一pPRIME載體所構築之單拷貝DNA序列而獲得，該微小RNA在進入細胞後係經由細胞內生性酵素剪切所產生之siRNA，與該預定默化基因之mRNA相互配對後，發生RNA干擾作用使該預定默化基因無法表現。
雖該篇期刊資料揭示該pPRIME載體係能夠以特定細胞中之RNA轉錄酵素Ⅱ進行轉錄，以解決一般用以轉錄RNA載體不具有酵素專一性之問題。然而，對於正在承受皮膚炎症性疼痛之患者而言，仍無法縮短由該pSilencer載體轉錄而獲得該抑制NMDA受體NR1之shRNA的反應時間，使皮膚炎症性疼痛患者必須在該shRNA發揮作用之7天內承受痛感，而無法使皮膚炎症性疼痛患者即時得到緩解。
本發明之主要目的係提供一種用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA，其係具有即時發生抑制疼痛相關作用因子NMDA受體表現者。
本發明之次一目的係提供一種微小RNA之用途，係以該NMDA受體NR1次單元之微小RNA，應用於製備抑制疼痛藥物之用途，以即時減緩皮膚炎症性疼痛患者之痛感。
本發明之又一目的係提供一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，係以微小RNA之應用改善習知siRNA或shRNA無法即時發揮抑制疼痛作用的缺點。
本發明之再一目的係提供一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，可以減少用以表現習知shRNA載體之劑量。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容包含有：一種用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA，該微小RNA係由一單股核糖核酸形成，該單股核糖核酸係包含一第一片段、一第二片段及一連接片段，該第二片段係與該第一片段互補之回文序列，該連接片段為任意之鹼基序列，該連接片段之兩端分別連接該第一片段及該第二片段，其中該第一片段係具有一裁切子切位及一Drosha切位，該裁切子切位及該Drosha切位之間包含一默化片段，該默化片段係與NMDA受體次單元NR1同源。
本發明之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA中，該默化片段較佳係如SEQ ID NO：1或2所示之序列。
本發明之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA中，該連接片段序列個數大於10個。
本發明之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA中，該微小RNA係如SEQ ID NO：5或6所示之序列。
一種微小RNA用以製備抑制疼痛藥物之用途，係將如上所述之微小RNA應用於製備用以抑制皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物。
本發明之微小RNA用以製備抑制疼痛藥物之用途中，該微小RNA較佳係包含如SEQ ID NO：5或6之核糖核酸序列。
一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，係包含如上所述之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA及至少一載劑。
本發明之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物中，該用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA較佳係如SEQ ID NO：5或6之核糖核酸序列。
本發明之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物中，該用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA較佳係由pGIPZ載體所表現。
本發明之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物中，該pGIPZ載體之施用劑量較佳係為1~10微克，給予頻率較佳係為3~7天/次。
本發明之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物中，該pGIPZ載體與載劑之比例較佳係為5微克：1微升。
本發明之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物中，該載劑較佳係聚乙烯胺。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)，係包含有與該NMDA受體次單元NR1同源之核糖核酸序列，利用RNA干擾作用原理而阻斷細胞中NMDA受體次單元NR1之mRNA，使該NMDA受體基因表現默化，而達到抑制疼痛之效果。
本發明用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA(後簡稱本發明NR1 miRNA)，係由一段單股核糖核酸形成，請參照第1圖所示，本發明NR1 miRNA係包含一第一片段11、一第二片段12及一連接片段13，該第二片段12係與該第一片段11互補之回文序列，該連接片段13為任意排列之鹼基序列，本實施例之連接片段13序列長度較佳係大於10個鹼基，舉例而言，本實施例之連接片段係AUAGUGAAGCCACAGAUGUAU，共21個鹼基，該連接片段13之兩端分別連接該第一片段11及該第二片段12。
該第一片段11具有一Drosha切位111及一裁切子切位112，該Drosha切位111與該裁切子切位112之間包含一默化片段113，該默化片段113係與NMDA受體次單元NR1同源，藉由RNA干擾作用阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現；舉例而言，本實施例之默化片段113係如SEQ ID NO：1或2所示之序列。
本發明NR1 miRNA係可以專一性抑制該生物個體內NMDA受體次單元NR1之轉錄後基因表現，而該生物個體內由NMDA受體次單元NR1所參與而啟動之炎症性疼痛反應機制也相對被抑止；若將本發明NR1 miRNA施予至該生物體之皮下組織，則可抑制該皮下組織中NMDA受體相關之功能表現，達到減緩皮膚疼痛程度的效果。本發明NR1miRNA與習知shRNA不同處在於裁切子及Drosha酵素對於RNA剪切的機制：該習知shRNA係由裁切子進行剪切而獲得與目標基因相互配對之siRNA；本發明NR1 miRNA係藉由Drosha酵素辨認該Drosha切位111，及該裁切子辨認該裁切子切位112，由該裁切子與該Drosha酵素進行剪切作用，而獲得該默化片段113。目前已知Drosha酵素可辨認具有一環部(Loop)及一莖部(Stem)的microRNA並進行剪切，其中，該microRNA之環部鹼基個數較佳為大於10個，該環部之鹼基個數更佳係10~30個，該Drosha酵素能夠藉由辨認該鹼基數量大於10之環部，於遠離該環部與該莖部交接處延伸約2個螺旋扭轉(Helical turn，約22個鹼基)的位置進行剪切，即本發明所指Drosha切位111，且於該莖部之3’端形成兩個鹼基的突出部(Overhang)；該裁切子則藉由辨認經Drosha酵素剪切的雙股RNA之3’端突出部，並於距離該突出部之22個鹼基處進行第二道剪切(即本發明所指之裁切子切位112)。本發明藉由不同剪切酵素的RNA干擾作用途徑，本發明NR1 miRNA能夠快速抑制NMDA受體次單元NR1表現，達到即時緩解皮膚炎症性患者痛感之功效。
本發明NR1 RNA，可以藉由人工合成，或以一構築該默化片段之對應去氧核糖核酸之載體，經轉錄表現該用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA；本實施例較佳係將構築該默化片段之對應去氧核糖核酸之載體(如包含有如SEQ ID NO：3或4之pGIPZ載體)，施予至一生物個體之皮下組織，並於該生物個體之細胞中轉錄獲得本發明NR1 RNA，可減緩該生物個體之皮膚因接觸一刺激物所引發之炎症性疼痛反應，並且，經由實驗分析證實本發明NR1 RNA確實可抑制該NMDA受體次單元NR1之基因表現，以下為本發明所設計與製備該微小RNA之較佳實施例及相關驗證。
「用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA之設計與製備」
本實施例係依照大鼠之NMDA受體次單元NR1基因序列(取自NCBI基因庫GeneBank，accession number：NM 017010)，設計兩段包含NMDA受體次單元NR1之部分DNA之去氧核糖核酸序列，分別為SEQ ID NO：3及4，為簡化說明，依照該SEQ ID NO：3或4之DNA序列所轉錄出的RNA，爾後分別簡稱NR1-1 miRNA(如SEQ ID NO：5之核糖核酸序列)及NR1-2 miRNA(如SEQ ID NO：6之核糖核酸序列)。
本發明係可由該發明所屬技術領域者以習知基因重組技術，構築包含有如SEQ ID NO：3或4所示之DNA序列之載體，施予生物體後，表現如SEQ ID NO：5或6的核糖核酸，詳細操作步驟在此恕不贅述，而本實施例係選擇如第2圖所示之pGIPZ載體(Expresstion ArrestTM GIPZ lentiviral shRNAmir,Open Biosystems,cat no.RHS4349)作為表現本發明NR1 miRNA之載體，但不以上述為限。本實施例之包含SEQ ID NO：3及4之pGIPZ載體係委由探索生物科技有限公司製備；並另設計一pGIPZ載體為負控制組，其係轉錄一段無法引發NMDA基因默化之miRNA(non-silencing NR1 miRNA，後簡稱NS-NR1 miRNA)。
本實施例構築該SEQ ID NO：3或4之pGIPZ載體，係含有可供真核細胞中之RNA轉錄酶Ⅱ辨認之CMV促進子，本實施例之pGIPZ載體係能夠供RNA轉錄酶Ⅱ辨認該po1 Ⅱ促進子，並由該RNA轉錄酶Ⅱ即時地將如SEQ ID NO：3所示之DNA序列轉錄，而得到如SEQ ID NO：5之NR1-1 miRNA，或將SEQ ID NO：4所示之DNA序列轉錄，而得到如SEQ ID NO：6之NR1-2 miRNA，該NR1-1及NR1-2 miRNA係經過裁切子及Drosha酵素剪切後，分別產生針對序列如SEQ ID NO：1或2所示之雙股RNA，該雙股RNA之一股係具有與細胞內NMDA受體NR1之部分mRNA相對應之互補核醣核酸鹼基，可與NMDA受體NR1之mRNA結合而將之默化，使該NMDA受體表現量受到抑制。
據此，本實施例之pGIPZ載體與一般載體進行轉錄作用之辨認酵素不同，其轉錄作用之路徑不同，本實施例之pGIPZ載體具有增進轉錄該miRNA之效率，縮短該miRNA引發基因默化之反應時間，具有達到即時反應而有效抑制患者炎症性疼痛之功效
為證實本發明NR1 RNA，可以即時地抑制一生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1之表現及功能，而影響該生物個體所能感受之皮膚疼痛反應，係將本發明NR1 RNA施予至一模式動物之皮下組織，再分別觀察並紀錄該模式動物於一刺激試驗中所出現之疼痛反應，以及該模式動物皮下組織之NMDA受體次單元NR1之基因表現情形。
甲醛(Formalin)刺激試驗：
本實施例係將一甲醛注射至數隻雄性實驗白鼠(Sprague-Dawley rats，體重約250至350 g)進行刺激試驗，該甲醛係為一刺激性化學藥劑，對生物體之黏膜、皮膚皆具有刺激性，可能引發生物體皮膚之過敏反應；該實驗白鼠於試驗期間所接受之飲食係符合一般實驗室之飼養標準，並且置於一溫度、光照皆維持於正常範圍之環境進行餵養，以確保該實驗白鼠生理狀態正常。該實驗白鼠在注射該甲醛後會因注射部位受到刺激，致使該實驗白鼠感到痛苦、畏縮而出現兩階段的足爪回縮的反應，分別為急性期(Acute phase)及強性期(Tonic phase)，係為神經傳導反應之模式分析試驗。
本實施例係將該實驗白鼠隨機分配至數組，分別針對施予(A)可轉錄出不同miRNA片段之載體、(B)載體劑量及(C)施予載體後miRNA產生抑制疼痛作用之反應時間等不同條件進行甲醛刺激試驗，觀察各組實驗白鼠產生回縮反應之頻率，並分析各組實驗白鼠體內NMDA受體次單元NR1基因之表現狀態。
(A)不同miRNA片段之疼痛抑制試驗
本實施例係取4組實驗白鼠(各組6隻實驗白鼠)，將如第1表所示之內容物分別注射至4組實驗白鼠(第A1至A4組)之一側後腳掌，係為第一次注射，其中，第A1組為對照組，係施予本實施例載體之空白載劑-聚乙烯胺(Polyethyleneimine，簡稱PEI)溶液，該PEI溶液之濃度為100 mM；第A2組為控制組，係施予生理食鹽水；第A3及A4組為實驗組，該載體與該載劑之重量體積比為5 μg：1 μl，並以5%葡萄糖溶液調整體積至100 μl注射於各組實驗白鼠之後腳掌。
上述第A1至A4組實驗白鼠於第一次注射後3天再次接受第二次注射，該第二次注射係將1%甲醛溶液注射至該A1至A4組實驗白鼠後腳掌之同一注射處，觀察第A1至A4組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第3圖)，並分析第A1至A4組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量(紀錄於第4圖)。
請參照第3圖所示，第A1至A4組實驗白鼠在第二次注射(注射物為甲醛)後隨即出現急性期之足爪回縮反應，該急性期足爪回縮反應維持約3~5分鐘；其中，第A1至A4組之實驗白鼠足爪回縮頻率約為12~15次/分鐘，維持約5分鐘左右。該急性期之後約10~15分鐘，該A1至A4組實驗白鼠之足爪回縮情況逐漸趨緩(<8次/分鐘)，然又於第20分鐘左右再次出現強性期之足爪回縮反應，該強性期之足爪回縮反應維持時間較久，約為20~40分鐘，且足爪回縮的反應較劇烈；其中，第A1組及第A2組實驗白鼠係於第二次注射後第20分鐘即出現強性期之足爪回縮反應，反應頻率約為13次/分鐘左右；而第A3及A4組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則係遠低於該對照組之足爪回縮頻率，約為2~4次/分鐘。
由第3圖之結果顯示，由甲醛刺激一生物個體周邊神經之痛覺感受器，可立即活化周邊神經之痛覺感受器而感受疼痛，因此該生物個體會立即產生急性疼痛反應(如實驗白鼠所產生急性期之足爪回縮反應)；而當周邊神經之痛覺感受器持續被活化，且該周邊神經之活化刺激被傳遞至中樞神經，誘使中樞神經大量分泌神經傳導物質(如麩胺酸)使該NMDA受體持續活化，該生物體會產生更劇烈的續發性疼痛反應(如實驗白鼠所產生強性期之足爪回縮反應)；透過第A3及A4組之足爪回縮反應結果可明顯得知，透過注射可轉錄本發明NR1 RNA之載體，可以影響該生物個體對於甲醛刺激所產生之疼痛反應，使該生物個體之疼痛反應較緩和；因此，本發明NR1 miRNA確實可以抑制皮下組織中該NMDA受體次單元NR1之功能，減緩生物個體之周邊神經受體因受到刺激，活化痛覺感受器而產生的急性疼痛反應，以及，適度改善由該周邊神經受體之刺激傳遞至中樞神經所引發之續發性疼痛反應，使生物個體所能感受之疼痛程度較小。
請參照第4圖所示，係第A1至A4組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1 mRNA表現分析，係採樣上述4組實驗白鼠(第A1至A4組)之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行即時聚合酶連鎖反應(Real time PCR)分析試驗，分析比較第A1至A4組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。本實施例係採用一商用RNA抽取套組(RNA Mini Kit；from Geneaid Biotech Ltd)，抽取第A1至A4組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA，以一商用DNA反轉錄套組(DNA Reverse Transcription Kit；Applied Biosystems Inc)將該A1至A4組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA反轉錄為DNA，再以ABI Prism 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems Inc)進行即時聚合酶連鎖反應分析試驗；本實施例係分別針對NMDA受體次單元NR1設計專一性的NR1引子對(如SEQ ID NO：7及8所示)，利用該NR1引子對對第A1至A4組實驗白鼠之皮膚檢體進行即時聚合酶連鎖反應，觀測4組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之RNA表現量。
由第4圖結果，第A1組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於該對照組，第A2至A4組之實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則分別為93%、15%及30%；該結果顯示經由注射該可表現NR1-1 miRNA或NR1-2 miRNA載體的實驗白鼠皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量明顯低於未注射該載體的實驗白鼠；其中，又以第A3組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1的mRNA表現量最低。
由上述結果，本發明NR1 RNA可以與生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1 mRNA的部分序列互補而結合，形成RNA誘導默化複合體，對該生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1之mRNA進行裁切，抑制該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。
由上述(A)不同miRNA片段之疼痛抑制試驗的結果證實，本發明NR1 RNA係依照一生物個體NMDA受體次單元NR1之基因序列所設計的miRNA(NR1-1 miRNA及NR1-2 miRNA)，可確實影響該生物個體之皮膚在接觸一刺激物而活化皮下組織NMDA受體、引發炎症性疼痛反應，並且，該miRNA可抑制皮下組織NMDA受體次單元NR1的基因表現，而無法轉譯為具功能性的NMDA受體次單元NR1，而使其參與之痛覺傳遞機制受阻，因此，降低該生物個體之皮膚可能反應的疼痛程度。
(B)不同載體劑量之疼痛抑制試驗
本實施例係取7組實驗白鼠(各組6隻實驗白鼠)，將如第2表所示之內容物分別注射至7組實驗白鼠(第B1至B7組)之一側後腳掌，係為第一次注射，其中，第B1組為對照組，係施予本實施例載體之空白載劑-PEI溶液，該PEI溶液之濃度為100 mM；第B2至B4組為控制組，第B2組係施予生理食鹽水，第B3及B4組係施予一載體，該載體係轉錄出一段未與NMDA受體NR1之mRNA配對之NS-NR1 miRNA；第B5至B7組為實驗組，各實驗組之載體與該載劑之重量體積比例為5 μg：1 μl，並以5%葡萄糖溶液調整體積至100 μl注射於各組實驗白鼠之後腳掌，其中，第B5組之載體為1 μg，第B6組之載體為5 μg，第B7組之載體為10 μg。
上述第B1至B7組實驗白鼠於第一次注射後3天再次接受第二次注射，該第二次注射係將1%甲醛溶液注射至該B1至B3及B5至B7組實驗白鼠後腳掌之同一注射處，第B4組之第二次注射則係另一側後腳掌，作為校正系統誤差之控制組，觀察第B1至B7組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第5圖)，分析第B1至B3及B5至B7組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量(紀錄於第6圖)。
請參照第5圖所示，第B1至B7組實驗白鼠在第二次注射(注射物為甲醛)後隨即出現足爪回縮的反應，係為急性期，該急性期之足爪回縮的反應維持約3~5分鐘；其中，第B1至B7組之實驗白鼠足爪回縮的頻率約為11~16次/分鐘，維持約5分鐘左右。該急性期之後約10~15分鐘，該B1至B7組實驗白鼠之足爪回縮情況逐漸趨緩(＜3次/分鐘)，然又於第20分鐘左右再次出現高頻率之足爪回縮的反應，係為強性期，該強性期之足爪回縮反應維持時間較久，約為20~40分鐘，且足爪回縮的反應較劇烈；其中，第B1至B4組實驗白鼠係於第二次注射後第25分鐘即出現強性期之足爪回縮反應，反應頻率約為12~18次/分鐘左右；而第B5至B7組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則係遠低於該對照組之足爪回縮頻率，約為4~11次/分鐘。
由第5圖之第B5至B7組之足爪回縮反應結果可明顯得知，透過注射1~10 μg之可轉錄本發明NR1 RNA的載體，可使該生物個體之疼痛反應較緩和，特別係該疼痛抑制效果係與施予可轉錄本發明NR1 RNA載體之劑量有依存性。
請參照第6圖所示，係第B1至B3及B5至B7組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1 mRNA表現分析，係採樣上述6組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行NR1 RNA表現量分析，該NR1 mRNA表現之試驗條件、NR1引子對及所使用檢測套組係如試驗(A)相同，在此恕不贅述。
由第6圖結果，第B2組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於該對照組，第B1、B3、B5、B6及B7組之實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則分別為102%、94%、22%、18%及15%；該結果顯示經由注射1~10 μg之可表現NR1-1 miRNA載體的實驗白鼠皮膚檢體，該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量明顯低於未注射該載體的實驗白鼠，且第B5至B7組之NR1 mRNA表現量皆低於25%。
由上述結果，本發明NR1 RNA可以有效抑制NMDA受體次單元NR1之功能，影響該生物個體之周邊神經受體對外界刺激的感受能力，使得因刺激而引發的急性疼痛、續發性疼痛反應可以較為緩和；並且，藉由調整可轉錄本發明NR1 RNA之或體注射劑量，可以適度減輕該生物個體在周邊神經受體遭受刺激時所反應疼痛的程度，以改善一般生物個體在遭遇重大刺激時所承受的極度疼痛。
由上述(B)不同載體劑量之疼痛抑制試驗的結果證實，本發明NR1 RNA僅需1~10 μg即可抑制皮下組織NMDA受體次單元NR1的基因表現，使其參與之痛覺傳遞機制受阻，因此，本發明NR1 RNA確實能夠達到降低該載體劑量之功效，又能夠有效抑制炎症性疼痛反應。
(C)本發明用以抑制NMDA受體NR1之miRNA產生抑制疼痛作用之反應時間
本實施例係取8組實驗白鼠(各組6隻實驗白鼠)，將如第3表所示之注射時間分別將PEI溶液或可轉錄NR1-1 miRNA之載體注射至8組實驗白鼠(第C0-1至C0-4組及第C1-1至C1-4組)之一側後腳掌，係為第一次注射，其中，第C0-1至C04組為對照組，係施予本實施例載體之空白載劑-PEI溶液，該PEI溶液之濃度為100 mM；第C1-1至C1-4組為實驗組，該載體與該載劑之重量體積比為5 μg：1 μl，並以5%葡萄糖溶液調整體積至100 μl注射於各組實驗白鼠之後腳掌。
第3表：本實施例第C0-1至C0-4組及第C1-1至C1-4組
請參照第7至10圖所示，係本實施例以如第3表所示之條件，測試各組實驗白鼠之足爪回縮情形，皮膚組織NMDA受體次單元NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D及a-interferon之表現量，再以西方墨點法定量各組NMDA受體次單元NR1及β-actin之定量結果。
請參照第7圖所示，第C0-2至C0-4組及第C1-2至C1-4組實驗白鼠在第二次注射(注射物為甲醛)後隨即出現急性期足爪回縮的反應，該急性期之足爪回縮反應維持約3~5分鐘；其中，第C0-2至C0-4組及第C1-2至C1-4組之實驗白鼠足爪回縮的頻率約為10~16次/分鐘，維持約5分鐘左右。該急性期之後約10~15分鐘，該C0-2至C0-4組實驗白鼠之足爪回縮情況逐漸趨緩(<7次/分鐘)，然又於第20~25分鐘左右出現高頻率之強性期足爪回縮反應，該強性期之足爪回縮反應維持時間較久，約為20~40分鐘，且該強性期之足爪回縮反應較劇烈，反應頻率約為14~18次/分鐘左右；而第C1-2及C1-3組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則係遠低於該對照組之足爪回縮頻率，約為3~7次/分鐘。
由第7圖之結果顯示，第C1-2及C1-3組之足爪回縮反應結果可明顯得知，注射可轉錄本發明NR1 RNA的載體後3~7天內，即可產生抑制NMDA受體基因表現之效果，使該生物個體之疼痛反應較緩和。
請參照第8圖所示，係第C0-1至C0-4組及第C1-1至C1-4組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1 mRNA表現分析，係採樣上述8組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA進行NR1 RNA表現量分析，該NR1 mRNA表現之試驗條件、NR1引子對及所使用檢測套組係如試驗(A)相同，在此恕不贅述。
由第8圖結果，4組對照組實驗白鼠(第C0-1至C0-4組)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於該對照組，第C1-1至C1-4組之實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則分別為85%、14%、12%及92%；據此，該可轉錄本發明NR1 RNA之載體在經過一段時間後會自行分解，故對NMDA次單元NR1 mRNA表現的抑制狀態會逐漸恢復，不會對該生物個體的NMDA受體表現造成永久性的抑制，也不會有藥性殘留之慮。
請再參照第9圖所示，本實施例係分別針對NMDA受體次單元NR1、NR2及α-interferon分別設計專一性的引子對，包含一NR2A引子對(如SEQ ID NO：9及10所示)、一NR2B引子對(如SEQ ID NO：11及12所示)、一NR2C引子對(如SEQ ID NO：13及14所示)、一NR2D引子對(如SEQ ID NO：15及16所示)及一α-interferon引子對(如SEQ ID NO：17及18所示)，利用前述該些引子對針對第C0-2及C1-2組實驗白鼠之皮膚檢體進行即時聚合酶連鎖反應，觀測2組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR2(如NR2A、NR2B、NR2C及NR2D)及α-interferon之RNA表現量。無論係該對照組或該實驗組之實驗白鼠，其NMDA受體次單元NR2A、2B、2C、2D及α-interferon之RNA表現量皆不具顯著差異，證實本發明NR1 RNA係專一性抑制NMDA受體次單元NR1之作用以干擾皮下組織之痛覺傳遞途徑，該用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA不會對中樞神經或其他作用因子造成影響，具有避免副作用產生之功效。
請再參照第10及11圖所示，係上述第C0-1至C0-4組及第C1-1至C1-4組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量分析試驗。本實施例係先將該8組實驗白鼠之皮膚檢體以1:20之比例稀釋於該商用組織蛋白質抽取溶劑(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent；PIERCE)，進行均質處理，再利用該商用蛋白質定量套組(Protein Assay Kit；Invitrogen)分析並定量由各組實驗白鼠之皮膚檢體所抽取的蛋白質，取等量蛋白質，利用取自兔子之抗麩胺酸受體的多株抗體(from Sigma)進行西方墨點法分析，以該NMDA受體次單元NR1與β-actin表現量比值作為評量值。
由第10及11圖結果可知，該對照組實驗白鼠(第C0-1至C0-4組)的皮膚檢體中，其NMDA受體次單元NR1與β-actin表現量比值較高，約為46~52%，而第C1-1至C1-4組實驗白鼠的皮膚檢體中，其NMDA受體次單元NR1與β-actin表現量比值則明顯較低，特別係第C1-2及C1-3組之評量值皆小於10%。該結果顯示，經由注射可轉錄本發明NR1 RNA的實驗白鼠(第C1-2及C1-3組)，皮膚檢體中該NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現量明顯低於其他組別(第C0-1至C0-4組及第C1-1、C1-4組)，顯示該NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現係能夠受到本發明NR1 RNA的抑制至少3~7天。
由上述結果可知，本發明NR1 RNA可以於一較短時間內(3天內)即可抑制NMDA受體基因之表現，進而產生抑制疼痛的效果且能夠持續至少7天，因此，本發明NR1 RNA，確實可以縮短RNA干擾作用之反應時間，達到即時地改善一般生物個體在遭遇重大刺激時所承受的極度疼痛之功效；而經過7天之後，該用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA對NMDA受體次單元NR1蛋白質表現的抑制現象將會隨天數的增加而漸減弱。因此，將該可轉錄本發明NR1 RNA載體注射至一生物個體之皮下組織，可以即時產生抑制疼痛效果，並維持該抑制疼痛效果至少7天，該可轉錄本發明NR1 RNA載體於7天後，即被分解且不會造成永久性的抑制而影響NMDA受體之正常功能。
經此證實該可轉錄本發明NR1 RNA載體，可確實供真核細胞中之RNA轉錄酶Ⅱ辨認，並轉錄出該用以抑制NMDA受體NR1之miRNA，該miRNA可以藉由裁切子與Drosha酵素辨認後進行剪切作用，而於較短時間內有效影響該生物個體內由皮下組織NMDA受體所參與之痛覺傳導反應，降低皮膚疼痛之感受；因此，本發明NR1 RNA可以應用於製備抑制疼痛之藥物，特別係針對臨床燒傷、燙傷患者因皮膚嚴重創傷而引發之炎症性疼痛及痛覺敏感者，能夠即效性的緩和其痛感。本發明NR1 RNA較佳係藉由一載體表現，該可轉錄miRNA之載體可以以各種藥劑方式給予生物個體，如注射或塗抹方式，較佳給予途徑係經由注射，較佳給予方式係每3~7天給予一次，較佳給予劑量係1~10 μg；該可轉錄用以抑制NMDA受體NR1微小RNA之載體可以係由任何製備方法製成之各種習知造型之注射藥劑或塗抹藥劑，可以含一種或多種所需成分的載劑或輔助藥劑作混合而形成一醫藥組合物，該載劑為聚乙烯胺溶液，該PEI溶液之濃度較佳為100 mM，且該載體與該載劑之重量體積比例為5 μg：1 μl。
本發明NR1 RNA，其係具有即時發生抑制疼痛相關作用因子NMDA受體表現之功效。
本發明微小RNA之用途，係以該NMDA受體NR1次單元之微小RNA，應用於製備抑制疼痛藥物之用途，可以達到即時減緩皮膚炎症性疼痛患者痛感之功效。
本發明之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，可以在1~7天內發生抑制NMDA受體基因表現，具有縮短該疼痛抑制作用反應時間之功效。
本發明之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，係以包含一與NMDA受體次單元NR1同源之微小RNA，該微小RNA載體劑量僅需1 μg即可產生抑制疼痛作用，可達到減少載體使用劑量成本之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
11．．．第一片段
111．．．Drosha切位
112．．．裁切子切位
113．．．默化片段
12．．．第二片段
13．．．連接片段
第1圖：本發明用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA之結構示意圖。
第2圖：本發明較佳實施例之pGIPZ載體結構示意圖。
第3圖：本實施例第A1至A4組之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。
第4圖：本實施例第A1至A4組之實驗白鼠NR1 mRNA表現量長條圖。
第5圖：本實施例第B1至B7組之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。
第6圖：本實施例第B1至B7組之實驗白鼠NR1 mRNA表現量長條圖。
第7圖：本實施例第C0-2至C0-4組及第C1-2至C1-4組之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。
第8圖：本實施例第C0-1至C0-4組及第C1-1至C1-4組之實驗白鼠NR1 mRNA表現量長條圖。
第9圖：本實施例第C0-2及C1-2組之實驗白鼠NR1、NR2B、NR2C、NR2D及α-interferon mRNA表現量長條圖。
第10圖：本實施例第C0-1至C0-4組及第C1-1至C1-4組之實驗白鼠NR1蛋白質表現量電泳圖。
第11圖：本實施例第C0-1至C0-4組及第C1-1至C1-4組之實驗白鼠NR1/β-actin表現量比值長條圖。
<110>　義守大學
<120>　一種用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA、一種微小RNA用以製備抑制疼痛藥物之用途、以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物
<160> 20
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213>　人工序列
<220>
<221> NR1
<222>
<223>
<400> SEQUENCE: 1
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213>　人工序列
<220>
<221> NR1
<222>
<223>
<400> SEQUENCE: 2
<210> 3
<211> 97
<212> DNA
<213>　人工序列
<220>
<221> NR1
<222>
<223>　合成微小RNA
<400>　SEQUENCE: 3
<210> 4
<211> 96
<212> DNA
<213>　人工序列
<220>
<221> NR1
<222>
<223>　合成微小RNA
<400> SEQUENCE: 4
<210> 5
<211> 97
<212> RNA
<213>　人工序列
<220>
<221> NR1-1 miRNA
<222>
<223>
<400> SEQUENCE: 5
<210> 6
<211> 96
<212> RNA
<213>　人工序列
<220>
<221> NR1-2 miRNA
<222>
<223>
<400> SEQUENCE: 6
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR1 FWd.
<220>
<400> SEQUENCE: 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA引子-NR1 Rev.
<220>
<400> SEQUENCE:8
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR2A Fwd.
<220>
<400> SEQUENCE:9
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR2A Rev.
<220>
<400> SEQUENCE:10
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR2B Fwd.
<220>
<400> SEQUENCE:11
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR2B Rev.
<220>
<400> SEQUENCE:12
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR2C Fwd.
<220>
<400> SEQUENCE:13
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213>　成成DNA引子-NR2C Rev.
<220>
<400> SEQUENCE:14
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR2D Fwd.
<220>
<400> SEQUENCE:15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-NR2D Rev.
<220>
<400> SEQUENCE:16
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-α-interferon Fwd.
<220>
<400> SEQUENCE:17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213>　合成DNA引子-α-interferon Rev.
<220>
<400> SEQUENCE:18
11．．．第一片段
111．．．Drosha切位
112．．．裁切子切位
113．．．默化片段
12．．．第二片段
13．．．連接片段

Claims (13)

  1. 一種用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA，該微小RNA係由一單股核糖核酸形成，該單股核糖核酸係包含一第一片段、一第二片段及一連接片段，該第二片段係與該第一片段互補之回文序列，該連接片段為任意排列之鹼基序列，該連接片段之兩端分別連接該第一片段及該第二片段，其中該第一片段係具有一Drosha切位及一裁切子切位，該Drosha切位及該裁切子切位之間包含一默化片段，該默化片段係與NMDA受體次單元NR1同源。
  2. 如申請專利第1項所述之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA，其中該默化片段係如SEQ ID NO：1或2所示之序列。
  3. 如申請專利第1項所述之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA，其中該連接片段序列個數大於10個。
  4. 如申請專利第1項所述之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA，該微小RNA係如SEQ ID NO：5或6所示之序列。
  5. 一種微小RNA用以製備抑制疼痛藥物之用途，係將如申請專利範圍第1項所述之微小RNA應用於製備用以抑制皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物。
  6. 如申請專利第5項所述之微小RNA用以製備抑制疼痛藥物之用途，其中，該微小RNA係包含如SEQ ID NO：5或6之核糖核酸序列。
  7. 一種減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，係包含如申請專利範圍第1項所述之用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA及至少一載劑。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，其中，該用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA係如SEQ ID NO：5或6之核糖核酸序列。
  9. 如申請專利範圍第7或8項所述之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，其中，該載劑係聚乙烯胺。
  10. 如申請專利範圍第7或8項所述之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，該用以抑制NMDA受體NR1之微小RNA係由pGIPZ載體所表現。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，其中，該pGIPZ載體之施用劑量係為1~10微克，給予頻率係為3~7天/次。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，其中，該載劑係聚乙烯胺。
  13. 如申請專利範圍第10或12項所述之減緩皮膚炎症性疼痛之醫藥組合物，其中，該pGIPZ載體與載劑之比例係為5微克：1微升。
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