TWI417109B - 一種用以抑制ｎｍｄａ受體ｎｒ１之短夾ｒｎａ、一種以短夾rna製備用以抑制ｎｍｄａ受體ｎｒ１之試劑之用途以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物 - Google Patents

Description

一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA、一種以短夾RNA製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途以及一種 減緩皮膚炎症性疼痛之藥物

本發明係關於一種短夾RNA，及以該短夾RNA製備而成之藥物，特別是一種關於皮下組織疼痛相關基因之短夾RNA，及以該短夾RNA減緩皮膚炎症性疼痛之藥物。

疼痛的感受(nociception)係由位於周圍神經系統(位於皮膚等處)或中樞神經系統(脊髓和腦)的痛覺感受器(nociceptor)，因遭受刺激而引發的無意識感覺，當痛覺感受器感受到化學、熱力或撞擊等各種可損傷身體組織的刺激，該刺激將傳遞至神經結末梢，分泌麩胺酸(Glutamate；Glu)，該麩胺酸係脊椎動物中樞神經系統主要的興奮性神經傳遞物質(excitatory transmitter)，可活化位於腦或脊椎的麩胺酸受體(Glutamate receptors；GluRs)，產生一連串的神經傳導，反應疼痛感受。

該麩胺酸受體主要分為代謝型受體(metabotropic receptor)與離子型受體(ionotropic receptor)，其中，該離子型受體的NMDA受體係由一NR1次單元、一NR2次單元群體(包含NR2A、NR2B、NR2C及NR2D)及一NR3(包含NR3A及NR3B)次單元群體所共同組成，而該NR1次單元係NMDA受體之功能性表現所必須存在的次單元。

麩胺酸突觸(glutamatergic synapses)之後膜係同時存在有多種麩胺酸受體，該NMDA受體係參與多數由中樞神經末梢所分泌的興奮性傳遞(麩胺酸)，由該NMDA受體之 活化可以使鈣離子(Ca²⁺ )等通過，開啟疼痛傳導機制。

臨床上由皮膚創傷所引發的疼痛較為複雜，特別是皮膚的燒傷、燙傷及灼傷，若患者傷部面積較大，傷口的疼痛程度往往令人難以忍受。一般而言，皮膚創傷(燒、燙傷)的患者若傷及真皮層，造成皮膚破損使得位於皮膚組織的神經末梢暴露，刺激分泌大量的神經傳遞物質(如麩胺酸)，活化麩胺酸受體，開啟炎症性疼痛反應之機制，使得患部之痛覺感受器對疼痛的感受會變得較為敏感，疼痛閾值下降而導致痛覺過敏(hyperalgesia)；因此，皮膚創傷患者對於疼痛的耐受力會漸漸降低，即使係稍微移動傷部、清理傷口或是更換紗布用藥，都會導致患者無法承受的疼痛；而後續的臨床醫療措施如皮膚移植、復健，對患者來說更是一項痛苦的煎熬。

請參照中華民國申請第099107164號「一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA、該小段干擾RNA用以抑制皮下組織NMDA受體NR1之方法、該小段干擾RNA之用途以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物」專利案，係一種21個鹼基對(base pairs)的小段干擾RNA，以皮下注射之方式使患部NMDA受體之NR1次單元基因受到抑制而無法表現該NR1次單元蛋白，進而抑制患者的炎症性疼痛反應，降低皮膚創傷患者之疼痛感覺。然而，該小段干擾RNA係一較不穩定的雙股RNA結構，因此，該小段干擾RNA在進入生物體後，實際能產生疼痛抑制作用之有效劑量很低，且必須以一高劑量之小段干擾RNA與一載劑混合，以幫助該小段干擾RNA進入細胞核內並產生疼痛 抑制作用；此外，該小段干擾RNA抑制疼痛的作用時間僅能維持約7天左右，其疼痛抑制效果便逐漸減弱，而於第14天的抑制效果僅剩40%，該小段干擾RNA的疼痛抑制作用時間短，因此約7天左右就必須再注射，以維持抑制疼痛之效果。

此外，生物體係將周邊神經系統之痛覺感受傳遞至中樞神經系統，進而使患者感受到疼痛。舉例而言，生物體的背根神經節(dorsal root ganglion；簡稱DRG)細胞係聚集在每塊脊椎骨的隙縫，形成一顆顆的節狀構造，該DRG細胞係屬於周邊神經系統並將該痛覺傳遞至中央神經系統。每個DRG細胞具有二條向外延伸的分支，一條係向脊椎外延伸的感覺受器(包含痛覺感受器)，另一條係伸入脊髓內用以傳遞神經衝動之脊髓神經元，藉由該感覺受器接收周邊神經所傳達的神經傳導物質，再由該脊髓神經元將疼痛感覺傳遞至脊髓，使疼痛感覺進一步傳到中樞神經系統，在此過程中，如能進一步抑制該背根神經節之疼痛傳遞作用，則更能有效抑制患者的疼痛感覺。

本發明之主要目的係提供一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，延長抑制疼痛相關作用因子NMDA受體的表現。

本發明之次一目的係提供一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，係具有抑制背根神經節之NMDA受體NR1，以減緩背根神經節傳導疼痛之效果。

本發明之又一目的係提供一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，係可專一性地抑制皮下組織NMDA受體次單元作用以干擾皮下組織之痛覺傳遞途徑，減緩皮膚疼痛，且經過一段時間後，該小段NMDA受體干擾短夾RNA之抑制作用消失，不會有藥性殘留之問題。

本發明之再一目的係提供一種短夾RNA在製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途，係以短夾RNA抑制皮下組織及背根神經節之NMDA受體次單元作用以減緩疼痛感覺，延長抑制疼痛感覺之效果。

本發明之又一目的係提供一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物，係以短夾RNA之應用改善習知小段干擾RNA無法長效作用的缺點。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容包含有：一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，該短夾RNA包含一第一片段、一第二片段及一連接片段，該第一片段係一段NMDA受體次單元NR1之同源性核糖核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，該第一片段及該第二片段之序列為互補回文序列，該連接片段之兩端分別與該第一片段及該第二片段結合。

其中，該抑制NMDA受體NR1短夾RNA係編碼自如SEQ ID NO：1或2所示之序列。

一種短夾RNA在製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途，係將具有NMDA受體次單元NR1同源性核糖 核酸序列之短夾RNA，用以阻斷NMDA受體次單元NR1之表現。

其中，該抑制NMDA受體NR1短夾RNA之劑量係為5~20微克(μg)，使用頻率係為7~21天/次。

一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物，係包含如上所述之一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA及至少一載劑，該短夾RNA係以一短夾RNA載體表現。

其中，該短夾RNA載體之施用劑量係為5~20微克(μg)，給予頻率係為7~21天/次。

其中，該藥物包含有該短夾RNA載體與至少一載劑，該短夾RNA載體與該載劑之比例係為1微克(μg)：0.2微升(μL)，該載劑為聚乙烯胺。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA(即short hairpin RNA，簡稱shRNA)係利用RNA干擾(RNA interference)之作用原理，依照NMDA受體次單元NR1之基因序列(參考自基因庫GeneBank)設計一小段NMDA受體干擾短夾RNA，該小段NMDA受體干擾短夾RNA係可以抑制該NMDA受體之功能；將該小段NMDA受體干擾短夾RNA施予至一生物個體之皮下組織，可減緩該生物個體之皮膚因接觸一刺激物所引發之炎症性疼痛反應，並 且，經由實驗分析證實該小段NMDA受體干擾短夾RNA確實可抑制該NMDA受體次單元NR1之基因表現，為簡化說明，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA簡稱為本發明之短夾RNA。

短夾RNA係藉由一shRNA載體表現，並且轉入細胞，經細胞內自生性之RNA轉錄酵素(RNA polymerase Ⅲ)轉錄而表現；本實施例之載體係選擇但不限定為質體類型之載體[pSilencer 4.1- cytomegalomavirus(CMV)hygro vector(Ambion,Austin,TX)]作為本發明之shRNA載體，係用以表現本發明之shRNA，該shRNA之兩端互相黏合形成一個似髮夾型結構，本發明之shRNA可不斷被合成於細胞中具有較長之有效存在時間，並且在細胞中進一步被分解成一單股RNA，該單股RNA係具有與目標基因相結合之互補基因，可與目標基因結合而將之默化，該短夾RNA具有延長該基因默化之作用時間，能夠確實延長抑制患者之炎症性疼痛之效果。

由上述原理，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA係參考自一生物個體NMDA受體次單元NR1之基因序列而設計並製備，該小段NMDA受體干擾短夾RNA之核糖核酸序列係與該生物個體NMDA受體次單元NR1之基因序列同源，如本發明之NR1-1 shRNA及NR1-2 RNA；由此，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA係可以專一性抑制該生物個體內NMDA受體次單元NR1之轉錄後基因表現，而該生物個體內由NMDA受體次單元NR1所參與而啟動之炎症性疼痛反應機制也相對被抑止；若將本發 明之小段NMDA受體干擾短夾RNA施予至該生物體之皮下組織，則可抑制該皮下組織中NMDA受體相關之功能表現，達到減緩皮膚疼痛程度的效果。

小段NMDA受體干擾短夾RNA之設計與製備：

本實施例係針對一老鼠NMDA受體次單元NR1之基因序列(源自於基因庫GenBank，編號U11418，2957 base pairs)分別設計一NR1-1短夾RNA(NR1-1 shRNA，編碼自如SEQ ID NO：1所示之序列)、NR1-2短夾RNA(NR1-2 shRNA，編碼自如SEQ ID NO：2所示之序列)及一NR1-3短夾RNA(NR1-3 shRNA，編碼自如SEQ ID NO：3所示之序列)，其中，該NR1-1及NR1-2短夾RNA即為本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA，該NR1-3 shRNA之序列係未與NR1 mRNA完全配對之序列；本實施例之NR1-1短夾RNA係由NR1-1 shRNA載體所表現，該NR1-2短夾RNA係由NR1-2 shRNA載體所表現，以及該NR1-3短夾RNA係由NR1-3 shRNA載體所表現。

本發明之短夾RNA之5’端設有一第一片段，該短夾RNA之3’端設有一第二片段，該第一片段及第二片段之序列為互補回文序列，其中，該第一片段係NMDA受體次單元NR1之同源性核糖核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，且該第一片段及第二片段之鹼基序列個數相同，並且，該第一片段及第二片段之間設有一段未互補之連接片段，該連接片段包含有數個任意鹼基N，該連接片段之兩端分別與該第一片段及第二片段連接，當該第一片段及第二片段之序列相互黏合時，該連接片段形成 一環部，使本發明之短夾RNA形成一髮夾型結構。該連接片段之數個鹼基N可選擇為3至23個，本實施例之第一片段及第二片段為21個鹼基，而該連接片段係為9個鹼基，該9個鹼基為TTCAAGAGA。

為證實本發明一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，可以抑制一生物個體內皮下組織NMDA受體之次單元NR1之表現及功能，而影響該生物個體所能感受之皮膚疼痛反應，係將本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA施予至一模式動物之皮下組織，再分別觀察並紀錄該模式動物於一刺激試驗中所出現之疼痛反應，以及該模式動物皮下組織及背根神經節之NMDA受體次單元NR1之基因表現情形。

甲醛(formalin)刺激試驗：

本實施例係將一甲醛(formalin)注射至數隻實驗白鼠(Sprague-Dawley rats，體重約250至350g)進行刺激試驗，該甲醛係為一刺激性化學藥劑，對生物體之黏膜、皮膚皆具有刺激性，可能引發生物體皮膚之過敏反應；該實驗白鼠於試驗期間所接受之飲食係符合一般實驗室之飼養標準，並且置於一溫度、光照皆維持於正常範圍之環境進行餵養，以確保該實驗白鼠生理狀態正常。該實驗白鼠在注射該甲醛後會因注射部位受到刺激，致使該實驗白鼠感到痛苦、畏縮而出現兩階段的足爪回縮的反應[急性期(acute phase)及強性期(tonic phase)]，係為神經傳導反應之模式分析試驗。本實施例係將該實驗白鼠隨機分配至數組，分別針對本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA之序列、劑 量及作用時間等不同條件進行甲醛刺激試驗，觀察各組實驗白鼠產生回縮反應之頻率，並分析各組實驗白鼠體內NMDA受體次單元NR1基因之表現狀態。

a.序列試驗

請參照第1a及1b圖所示，該序列試驗係將(a1)2μL聚乙烯胺溶液(polyethyleneimine；莫耳濃度為100mM)、(a2)100μL生理食鹽水、(a3)一NR1-1 shRNA載體及(a4)一NR1-2 shRNA載體分別注射至4組實驗白鼠(第a1~a4組)之一側後腳掌，係為第一次注射，其中，(a1)為對照組、(a2)為控制組，而(a3)及(a4)為實驗組。本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA(NR1-1 shRNA載體及NR1-2 shRNA載體)係於注射時分別混合一定體積之注射載劑[如聚乙烯胺溶液(濃度同對照組)]再分別注射至第a3及a4組實驗白鼠，本實施例之shRNA載體與該注射載劑係以1μg：0.2μL之比例混合，本實施例係選用10μg之shRNA載體混合2μL聚乙烯胺溶液，並以5%葡萄糖溶液調整體積至100μL進行皮下注射；上述第a1~a4組實驗白鼠於第一次注射後3天再次接受第二次注射，該第二次注射係將1%甲醛溶液注射至該a1~a4組實驗白鼠後腳掌之同一注射處，觀察第a1~a4組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第1a圖)，並分析第a1~a4組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量(紀錄於第1b圖)；該a1~a4組實驗白鼠之注射情形紀錄於第1表。

請再參照第1a圖所示，其中，該a1~a4組實驗白鼠在第二次注射(甲醛)後隨即出現足爪回縮的反應，係為急性期，該急性期之足爪回縮的反應維持約3~5分鐘；其中，該對照組之實驗白鼠(a1)、該控制組(a2)及第a3及a4組實驗白鼠之足爪回縮的頻率約為12~15次/分鐘，維持約5分鐘左右。該急性期之後約10~15分鐘，該a1~a4組實驗白鼠之足爪回縮情況逐漸趨緩(<5次/分鐘)，然又於第15~20分鐘左右再次出現高頻率之足爪回縮的反應，係為強性期，該強性期之足爪回縮反應維持時間較久，約為20~40分鐘，且足爪回縮的反應較劇烈；其中，該對照組(a1)及控制組(a2)實驗白鼠係於第二次注射後第20分鐘即出現強性期之足爪回縮反應，反應頻率約為15次/分鐘左右；而第a3及a4組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則係遠低於該對照組之足爪回縮頻率，約為6~12次/分鐘。

由第1a圖之結果顯示，由甲醛刺激一生物個體周邊神經之痛覺感受器(皮膚)，可立即活化周邊神經之痛覺感受器而感受疼痛，因此該生物個體會立即產生急性疼痛反應(如實驗白鼠所產生急性期之足爪回縮反應)；而當周邊神經之痛覺感受器持續被活化，且該周邊神經之活化刺激被 傳遞至中樞神經，誘使中樞神經大量分泌神經傳導物質(如麩胺酸)使該NMDA受體持續活化，因而該生物體會產生更劇烈的續發性疼痛反應(如實驗白鼠所產生強性期之足爪回縮反應)。而透過第a3及a4組之足爪回縮反應結果可明顯得知，透過注射本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA載體，可以影響該生物個體對於甲醛刺激所產生之疼痛反應，使該生物個體之反應較緩和；因此，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA確實可以抑制皮下組織中該NMDA受體次單元NR1之功能，減緩生物個體之周邊神經受體因受到刺激，活化痛覺感受器而產生的急性疼痛反應，以及，適度改善由該周邊神經受體之刺激傳遞至中樞神經所引發之續發性疼痛反應，使生物個體所能感受之疼痛程度較小。

請再參照第1b圖所示，係第a1~a4組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1 mRNA表現分析，係採樣上述4組實驗白鼠(第a1~a4組)之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析試驗，分析比較第a1~a4組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。本實施例係採用一商用RNA抽取套組(RNA Mini Kit；from Geneaid Biotech Ltd)，抽取a1~a4組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA，以一商用DNA反轉錄套組(DNA Reverse Transcription Kit；Applied Biosystems Inc)將該a1~a4組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA反轉錄為DNA，再以ABI Prism 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems Inc)進行即時聚合酶 連鎖反應分析試驗；本實施例係分別針對NMDA受體次單元NR1、NR2及α-interferon分別設計專一性的引子對(primers)，包含一NR1引子對(如SEQ ID NO：4及5所示)、一NR2A引子對(如SEQ ID NO：6及7所示)、一NR2B引子對(如SEQ ID NO：8及9所示)、一NR2C引子對(如SEQ ID NO：10及11所示)、一NR2D引子對(如SEQ ID NO：12及13所示)及一α-interferon引子對(如SEQ ID NO：14及15所示)，利用前述該些引子對分別針對第a1~a4組實驗白鼠之皮膚檢體進行即時聚合酶連鎖反應，觀測4組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元(NR1、NR2A、NR2B、NR2C及NR2D)及α-interferon之RNA表現量。

由第1b圖結果，該對照組實驗白鼠(第a1組)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於該對照組，該控制組(第a2組)及該實驗組(第a3及a4組)之實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則分別為97%(第a2組)、20%(第a3組)及37%(第a4組)；該結果顯示經由注射該短夾RNA載體的實驗白鼠皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量明顯低於未注射該短夾RNA載體的實驗白鼠；其中，又以注射NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠(第a3組)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1的mRNA表現量最低。由上述結果，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA可以與生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1 mRNA的部分序列互補而結合，形成RNA誘導靜默複合體，對該生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1 之mRNA進行裁切，抑制該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。

由上述a.序列試驗 的結果證實，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA，係依照一生物個體NMDA受體次單元NR1之基因序列所設計的小段NMDA受體干擾短夾RNA(NR1-1 shRNA及NR1-2 shRNA)，可確實影響該生物個體之皮膚在接觸一刺激物而活化皮下組織NMDA受體、引發炎症性疼痛反應，並且，該小段NMDA受體干擾短夾RNA可抑制皮下組織NMDA受體次單元NR1的基因表現，而無法轉譯為具功能性的NMDA受體次單元NR1，而使其參與之痛覺傳遞機制受阻，因此，降低該生物個體之皮膚可能反應的疼痛程度。

b.劑量試驗

請參照第2a~d圖所示，該劑量試驗係將(第b1組)100μL生理食鹽水、(第b2組)2μL聚乙烯胺溶液(莫耳濃度100mM)、(第b3組)一NR1-3 shRNA(mismatch RNA)載體及(第b4~b6組)不同施用劑量(5~20μg)之一NR1-1 shRNA載體，並配合該注射載劑(shRNA載體：注射載劑=1μg：0.2μL)分別注射至6組實驗白鼠(第b1~b6組)再次進行甲醛刺激試驗，觀察該b1~b6組實驗白鼠之足爪回縮反應及皮膚組織中NMDA受體次單元NR1的基因表現情形；此外，該b5組實驗白鼠於測試後7天，另注射甲醛至相對一側之後腳掌，並計算其足爪回縮反應(第b7組)，以證實shRNA之止痛效果係由於直接抑制局部疼痛傳導之效果，而非抑制中樞神經之NMDA受體次單元NR1之效果。而注射該 聚乙烯胺溶液、NR1-3 shRNA載體及生理食鹽水之實驗白鼠係為劑量試驗之對照組，該NR1-3 shRNA之雙股RNA序列雖與本發明NR1-1 shRNA之部分雙股序列相對應，且同樣設計為21個鹼基對，然該NR1-3 shRNA卻係不與該老鼠基因序列(U11418)同源。

承上所述，生理食鹽水、聚乙烯胺溶液(莫耳濃度為100mM)、NR1-3 shRNA載體及不同劑量之NR1-1 shRNA載體等係分別注射於第b1~b6組實驗白鼠之一側後腳掌處，係為第一次注射，其中，該NR1-3 shRNA載體與NR1-1 shRNA載體同樣係混合該注射載劑後進行注射；第b1~b6組實驗白鼠於第一次注射後7天於相同注射處再次接受第二次注射，該第二次注射同樣係注射50μL甲醛溶液(1%)，觀察第b1~b6組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第2a圖)，並分析第b1~b6組實驗白鼠皮下組織NMDA受體次單元NR1之基因表現[包含NR1之mRNA的表現量(紀錄於第2b圖)及NR1之蛋白質表現(紀錄於第2c及2d圖)]；該6組實驗白鼠之注射情形紀錄於第2表。

請再參照第2a圖所示，其中，該b1~b6組實驗白鼠在第二次注射後隨即出現急性期之足爪回縮的反應，該急性期之足爪回縮的反應維持約3~5分鐘，足爪回縮的頻率約為25~35次/分鐘，維持5分鐘左右；其中，該對照組之實驗白鼠(第b1~b3組)；該b1~b6組實驗白鼠於強性期之足爪回縮皆出現於急性期反應趨緩後的10~15分鐘，且維持約30~40分鐘，其中，該對照組實驗白鼠(第b1~b3組)於強性期之足爪回縮頻率約為15~30次/分鐘，該第b4組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率約為13~17次/分鐘，其回縮頻率略低於該對照組；而第b5、b6組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則係遠低於該對照組之足爪回縮頻率，約為5~12次/分鐘，並且，該第b6組實驗白鼠於強性期的足爪回縮狀態同樣較第b5組實驗白鼠的狀態略為緩和。

由第2a圖結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA(NR1-1 shRNA)可以有效抑制該NMDA受體次單元NR1之功能，影響該生物個體之周邊神經受體對外界刺激的感受能力，使得因刺激而引發的急性疼痛、續發性疼痛反應可以較為緩和；並且，藉由調整本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA載體的注射劑量可以適度減輕該生物個體在周邊神經受體遭受刺激時所反應疼痛的程度，以改善一般生物個體在遭遇重大刺激時所承受的極度疼痛。

請再參照第2b圖所示，係上述第b1~b6組實驗白鼠 皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1 mRNA表現量分析試驗。係採樣第b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析試驗，分析比較第b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。本實施例係依照該a.序列試驗 所述之即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析方式，同樣由該商用RNA抽取套組抽取第b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA，將該b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA經商用DNA反轉錄套組反轉錄為DNA，再以該ABI Prism 7500 Sequence Detection System進行即時聚合酶連鎖反應分析試驗，以便即時檢視該b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量；請參照SEQ ID NO：4及5係本實施例所使用之NR1專一性引子對。

由第2b圖結果，該第b1~b3組實驗白鼠(對照組)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於該第b1~b3組實驗白鼠，第b4~b6組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則分別為80%(第b4組)、40%(第b5組)及17%(第b6組)，其中，第一次注射NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠，皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1的mRNA表現量最低；該結果顯示經由注射該NR1-1 shRNA載體之實驗白鼠(第b4~b6組)的皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量明顯低於未注射該NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠(第b1~b3組)，而注射20μg NR1-1實驗白鼠(第 b6組)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1的mRNA表現量最低。由上述結果，將一定劑量之本發明小段NMDA受體干擾短夾RNA載體注射至生物個體，可以抑制該生物個體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量，而注射較高劑量的小段NMDA受體干擾短夾RNA載體，對該生物個體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現係具有較佳的抑制效果；因此，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA對NMDA受體次單元NR1基因表現的抑制現象係呈現一正向劑量取向關係。

請再參照第2c及2d圖所示，係上述第b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量分析試驗。本實施例係採樣第b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之蛋白質，由西方墨點法進行第b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量之分析。本實施例同樣係先將第b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體以1：20之比例稀釋於該商用組織蛋白質抽取溶劑(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent；PIERCE)，進行均質處理，再利用該商用蛋白質定量套組(Protein Assay Kit；Invitrogen)分析並定量由各組實驗白鼠之皮膚檢體所抽取的蛋白質，取等量蛋白質，利用取自兔子之抗麩胺酸受體的多株抗體(from Sigma)進行西方墨點法分析。

由第2c及2d圖結果，係上述第b1~b6組實驗白鼠之西方墨點法分析結果；其中，該對照組實驗白鼠(第b1~b3組)的皮膚檢體中具有較多量的NMDA受體次單元NR1表現(訊號較明顯)，而其他第b4~b6組實驗白鼠的皮膚檢體 中，其NMDA受體次單元NR1的表現量則明顯較低(由第2c圖之訊號)；而由該上述相對定量方式比較(由第2d圖)，以該b-tubulin蛋白表現量為定量標準，則對照組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量約為70%左右，而其他第b4~b6組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量則分別為55%(第b4組)、10%(第b5組)及<10%(第b6組)，其中，於第一次注射20μg該NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現量最低。該結果顯示，經由注射本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA載體的實驗白鼠(第b4~b6組)，皮膚檢體中該NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現量明顯低於未注射該NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠(第b1~b3組)，顯示該NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現係受到本發明小段NMDA受體干擾短夾RNA的抑制，並且，較高劑量的小段NMDA受體干擾短夾RNA載體對NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現具有較佳的抑制效果；因此，再次證實本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA對皮下組織NMDA受體次單元NR1基因表現的抑制現象係呈現一正向劑量取向關係。

由上述b.劑量試驗 的結果證實，本發明小段NMDA受體干擾短夾RNA載體注射於生物個體之皮下組織後，可確實抑制該生物個體中NMDA受體次單元NR1之基因表現，而使該NMDA受體之功能無法正常表現，因此當該生物個體之皮膚在接觸一刺激物，由該NMDA受體所傳遞引發之疼痛反應將相對減緩，使該生物個體所感受之疼痛程 度下降；並且，該小段NMDA受體干擾短夾RNA對於該生物個體內NMDA受體次單元NR1之基因表現的抑制現象係為一正向劑量取向關係，故可以藉由調節該小段NMDA受體干擾短夾RNA之注射劑量而酌量抑制該生物個體內NMDA受體之功能表現，以適當控制生物個體的皮膚所能感受疼痛的程度。

c.作用時間試驗

請參照第3a~e圖所示，該作用時間試驗係將(第c1組)10μg之一NR1-1 shRNA載體分別於甲醛刺激試驗前3天、7天、14天、21天及28天注射至第c1-1~c1-5組實驗白鼠，觀察該c1-1~c1-5組實驗白鼠在甲醛刺激試驗中所反應之足爪回縮情形，以及皮膚組織中NMDA受體次單元NR1的基因表現量；其中，各第c1-1~c1-5組分別於甲醛刺激試驗前3天、7天、14天、21天及28天另對應有第c0-1~c0-5組實驗白鼠，係注射聚乙烯胺溶液作為作用時間試驗之對照組。

本實施例係比照上述a.序列試驗 及b.劑量試驗 之注射方式，同樣係經由兩次注射將該NR1-1 shRNA載體、聚乙烯胺溶液及甲醛溶液分別注射至實驗白鼠之後腳掌處，詳細注射情況如下方第3表所示；其中，該對照組之實驗白鼠(第c0-1~c0-5組)係分別於第二次注射前第3、7、14、21及28天注射該聚乙烯胺溶液，而第c1-1~c1-5組實驗白鼠則係分別於第二次注射前第3、7、14、21及28天注射該NR1-1 shRNA載體，係為第一次注射，該第一、第二次注射係分別注射於該5組實驗白鼠後腳掌之相同處；紀錄各 組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第3a圖)，以及各組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1之基因表現[包含NR1 mRNA(紀錄於第3b圖)及NR1蛋白質(紀錄於第3c、3d圖)]。

請再參照第3a圖所示，該c0-2、c1-2、c0-3、c1-3、c0-4及c1-4組實驗白鼠在第二次注射後即出現急性期之足爪回縮的反應，維持約3~5分鐘，而後10~15分鐘8組實驗白鼠的足爪回縮情況皆較為緩和，直至強性期之足爪回縮反應出現(約第二次注射後20分鐘)，維持約30~40分鐘。其中，該對照組實驗白鼠(第c0-2~c0-4組)於強性期之足爪回縮頻率約為8~18次/分鐘；而相較於對照組之實驗 白鼠，第c1-2~c1-4組實驗白鼠，在強性期之足爪回縮頻率約為1~17次/分鐘；而第c1-3及c1-4組實驗白鼠在強性期之足爪回縮反應僅較對照組實驗白鼠(第c1~c3組)之足爪回縮反頻率略為緩和，約為1~8次/分鐘。

由第3a圖結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA可以長時間(約21天左右)抑制生物個體體內NMDA受體之功能，以較長時間之作用緩和該生物個體之皮膚在感受一刺激物而引發的疼痛反應，因此，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA，確實可以長效性之作用改善一般生物個體在遭遇重大刺激時所承受的極度疼痛。

請再參照第3b圖所示，係上述10組(包含實驗組及對照組)實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1 mRNA表現量分析試驗。係採樣該10組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析試驗，分析比較該10組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。本實施例同樣係按照該b.劑量試驗 中所操作之即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)進行分析，同樣由該商用RNA抽取套組抽取該10組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA，將該10組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA經商用DNA反轉錄套組反轉錄為DNA，再以該ABI Prism 7500 Sequence Detection System進行即時聚合酶連鎖反應分析試驗，以便即時檢視該10組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量；本實施例所使用之NR1專一性引子對係SEQ ID NO：4及5。此外，對該c1-2組實驗白鼠另進行其他NMDA 受體次單元NR2A、B、C、D及α-interferon之RNA表現量之測試(如第3c圖所示)。

由第3b圖結果，5組對照組實驗白鼠(第c0-1~c0-5組)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於對照組實驗白鼠，第c1-1~c1-5組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則係由注射時間的差異而有不同；其中，於第二次注射前7天、14天注射NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠(第c1-2及c1-3組)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量最低，皆小於20%；於第二次注射前21天注射NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠(第c1-4組)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為70%；於第二次注射前3天注射NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠(第c1-1組)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則為85%；於第二次注射前28天注射NR1-1 shRNA載體的實驗白鼠(第c1-5組)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則為99%，約等於對照組實驗白鼠(第c0-1~c0-5組)的表現量。此外，由第3c圖所示，無論係該對照組或該實驗組之實驗白鼠，其NMDA受體次單元NR2A、2B、2C、2D及α-interferon(IFN)之RNA表現量皆不具顯著差異，證實本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA係專一性抑制NMDA受體次單元NR1之作用以干擾皮下組織之痛覺傳遞途徑，該小段NMDA受體干擾短夾RNA不會對中樞神經或其他作用因子造成影響，具有避免副作用產生之功效。

由上述結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA對於生物個體內NMDA次單元NR1 mRNA表現的抑制能力可以維持14天左右，14至21天之間，該小段NMDA受體干擾短夾RNA對NMDA次單元NR1 mRNA的抑制將會隨天數的增加而漸減弱；由此可之，將該小段NMDA受體干擾短夾RNA載體注射至生物個體之皮下組織，可維持較長一段時間以抑制該生物個體中皮下組織NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量，而一段時間後，該小段NMDA受體干擾短夾RNA載體會自行分解，故對NMDA次單元NR1 mRNA表現的抑制狀態會逐漸恢復，不會對該生物個體的NMDA受體表現造成永久性的抑制，也不會有藥性殘留之慮。

請再參照第3d、3e圖所示，係上述該10組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量分析試驗。係採樣該10組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之蛋白質，同樣係依照上述b.劑量試驗 所採用的分析手段，由西方墨點法進行該10組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量之分析。本實施例同樣係先將該10組實驗白鼠之皮膚檢體以1：20之比例稀釋於該商用組織蛋白質抽取溶劑，進行均質處理，再利用該商用蛋白質定量套組分析並定量由各組實驗白鼠之皮膚檢體所抽取的蛋白質，取等量蛋白質，利用該抗麩胺酸受體之多株抗體，針對各組實驗白鼠之皮膚檢體進行西方墨點法分析試驗。

由第3d圖結果，5組對照組實驗白鼠(第c0-1~c0-5組) 的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1的訊號皆較明顯，而c1-1~c1-5組實驗白鼠的皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1的表現量係依照該NR1-1 shRNA載體注射的時間而有明顯差異，於第二次注射前7、14及21天注射該NR1-1 shRNA載體的3組實驗白鼠(第c1-2、c1-3及c1-4組)，NMDA受體次單元NR1的表現量明顯較少；由上述該相對定量方式比較(如第3e圖)，該對照組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量係為80%，而第c1-1~c1-5組實驗白鼠，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量分別為75%(第c1-1組)、10%(第c1-2組)、<10%(第c1-3組)、55%(第c1-4組)及87%(第c1-5組)。

上述結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA對於NMDA受體次單元NR1蛋白質表現的抑制能力約可以維持21天左右，而21天之後，該小段NMDA受體干擾短夾RNA對NMDA受體次單元NR1蛋白質表現的抑制現象將會隨天數的增加而漸減弱；因此，將該小段NMDA受體干擾短夾RNA載體注射至一生物個體之皮下組織，可以維持一較長時間抑制該生物個體中皮下組織NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量，而一段時間後，該生物體內NMDA受體NR1之蛋白質表現即逐漸恢復，不會對該生物個體內NMDA受體之基因表現造成永久性的抑制而影響其正常功能。

由上述c.作用時間試驗 的結果證實，本發明依照NMDA受體次單元之基因序列所設計的小段NMDA受體 干擾短夾RNA(NR1-1 shRNA)，可較長效性抑制NMDA受體次單元NR1之基因表現，而使該NMDA受體次單元NR1之功能在一定時間內無法正常表現；因此，將該小段NMDA受體干擾短夾RNA載體注射於該生物個體之皮下組織，可以較長效性的影響該生物個體之皮膚在接觸一刺激物時，由皮下組織NMDA受體次單元傳遞引發之疼痛反應，使該生物個體所能感受之疼痛程度下降。另外，該小段NMDA受體干擾短夾RNA載體可以在生物個體內自行分解，因此一段時間後，該小段NMDA受體干擾短夾RNA對於該生物個體內皮下組織NMDA受體次單元之基因表現的抑制現象係逐漸減緩，而該生物體內NMDA受體次單元之表現及功能皆可以逐漸回復，不會對該生物個體之正常功能造成負面影響。

d.背根神經節抑制試驗

請參照附件一及第4a~c圖所示，該背根神經節抑制試驗係將10μg之一NR1-1 shRNA載體注射至4隻實驗白鼠之一側後腳掌，7天後將該4隻實驗白鼠犧牲後，取實驗白鼠L5之背根神經節進行免疫組織化學標定，觀察該背根神經節(L5)之NMDA受體次單元NR1的表現量；其中，實驗組之(第d1組)注射NR1-1 shRNA載體之後腳掌同側之DRG，及對照組之(第d2組)未注射NR1-1 shRNA載體之另一側後腳掌之DRG，比較該d1與d2組之背根神經節的NMDA受體次單元NR1表現量。

本實施例係將該NR1-1 shRNA載體注射至實驗白鼠之後腳掌處，七天後取該實驗白鼠之背根神經節組織進行 切片固定，以商用冷凍切片套組(Image-iT Fix signal Enhancer；Invitrogen)進行冷凍切片，利用取自小鼠之抗麩胺酸受體NR1的多株抗體(1：400；Franklin Lakes)及二抗(1：1000 dilution；Jackson ImmunoResearch Laboratories)標定該多株抗體，並以螢光顯微鏡取得該顯微影像，並以影像分析軟體(Advanced spot software；Diagnostic instruments Inc)計算該抗體之標定量。

第4a圖係(第d1組)實驗組注射NR1-1 shRNA載體之後腳掌同側之DRG所標定之NMDA受體次單元NR1，第4b圖係(第d2組)對照組注射NR1-1 shRNA載體之另一側後腳掌之DRG所標定之NMDA受體次單元NR1。第4a及4b圖之箭頭所指係被標定之NMDA受體次單元NR1，比較該二圖之標定比例(即綠色螢光處)，證實該d1實驗組注射該NR1-1 shRNA載體者，該背根神經節之神經元上具有較低之NMDA受體次單元NR1表現量，並參照第4c圖所示，係藉由影像分析軟體計算該d1及d2組之神經元中NMDA受體次單元NR1標定量之比例，該d2對照組之NMDA受體次單元NR1表現量為42%，而該d1實驗組之NMDA受體次單元NR1表現量為22%，因此，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA確實能抑制背根神經節之神經元中NMDA受體次單元NR1之表現量。

上述結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA注射至生物體之皮下組織後，能夠傳送至背根神經節之神經元及神經軸索，並且抑制背根神經節中約50%之神經元及神經軸索上的NMDA受體次單元NR1蛋白質表 現；因此，將該小段NMDA受體干擾短夾RNA載體注射至一生物個體之皮下組織，不僅可直接對周邊神經之痛覺感受器進行抑制，更可以進一步傳送至該生物個體之背根神經節，並直接抑制該背根神經節之神經元上的NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量，進而直接抑制背根神經節之痛覺感受器，藉此，本發明之小段NMDA受體干擾短夾RNA具有更有效地抑制疼痛的效果。

經此證實本發明一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，可確實抑制生物個體之皮下組織NMDA受體之次單元NR1表現，而可以於一定時間內有效影響該生物個體內由皮下組織NMDA受體所參與之痛覺傳導反應，降低皮膚疼痛之感受；因此，本發明一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA以減輕皮膚疼痛之方法可以應用於製備減緩皮膚疼痛之藥物，特別係針對臨床燒傷、燙傷患者因皮膚嚴重創傷而引發之炎症性疼痛及痛覺敏感。本發明之短夾RNA係藉由一shRNA載體表現，該shRNA載體可以以各種藥劑方式給予生物個體，較佳給予途徑係經由注射，較佳給予方式係每7~21天給予一次，較佳給予劑量係5~20μg；該短夾RNA載體可以係由任何製備方法製成之各種習知造型之注射藥劑或塗抹藥劑，可以含一種或多種所需成分的載劑或輔助藥劑作混合，以製成所需之藥劑形式。

本發明係提供一種小段NMDA受體干擾短夾RNA，具有延長抑制疼痛相關作用因子NMDA受體表現之功效。

本發明一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA， 係具有抑制背根神經節之NMDA受體NR1傳導疼痛之效果，具有加強抑制疼痛傳導之功效。

本發明係一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，可專一性抑制皮下組織NMDA受體次單元NR1之作用以干擾皮下組織之痛覺傳遞途徑，且該小段NMDA受體干擾短夾RNA在經過一段時間後，該疼痛抑制現象係逐漸減緩，使該生物體內NMD受體次單元之表現及功能逐漸回復，不會對該生物個體之神經系統或功能造成負面影響，具有暫時性之抑制疼痛機制且於生物體內不發生藥性殘留之功效。

本發明係一種短夾RNA在製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途，係以短夾RNA抑制皮下組織及背根神經節之NMDA受體次單元作用以減緩疼痛感覺，具有延長抑制疼痛感覺之功效。

本發明係一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物，係包含一種小段NMDA受體干擾短夾RNA，可以在7~21天內有效抑制生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1之表現，減緩皮膚疼痛，具有長效作用之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1a圖：本發明序列試驗之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。

第1b圖：本發明序列試驗之實驗白鼠NR1 mRNA表現量示意圖。

第2a圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。

第2b圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠NR1 mRNA表現量示意圖。

第2c圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量示意圖。

第2d圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量又一示意圖。

第3a圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。

第3b圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠NR1 mRNA表現量示意圖。

第3c圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠NR2A、2B、2C、2D及α-interferon mRNA表現量示意圖。

第3d圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量示意圖。

第3e圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量又一示意圖。

第4a圖：本發明背根神經節抑制試驗之實驗白鼠NR1標定示意圖。

第4b圖：本發明背根神經節抑制試驗之實驗白鼠NR1標定又一示意圖。

第4c圖：本發明背根神經節抑制試驗之實驗白鼠NR1 mRNA表現量示意圖。

<110> 義守大學

<120> 一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA、一種短夾RNA製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物

<160> 15

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> NR1-1

<222> 第22~30 bp

<223> 合成短夾RNA

<400> SEQUENCE：1

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> NR1-2

<222> 第22~30 bp

<223> 合成短夾RNA

<400> SEQUENCE：2

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> NR1-3

<222> 第22~30 bp

<223> 合成短夾RNA

<400> SEQUENCE：3

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR1 Fwd.

<220>

<400> SEQUENCE：4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR1 Rev.

<220>

<400> SEQUENCE：5

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2A Fwd.

<220>

<400> SEQUENCE：6

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2A Rev.

<220>

<400> SEQUENCE：7

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2B Fwd.

<220>

<400> SEQUENCE：8

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2B Rev.

<220>

<400> SEQUENCE：9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2C Fwd.

<220>

<400> SEQUENCE：10

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2C Rev.

<220>

<400> SEQUENCE：11

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2D Fwd.

<220>

<400> SEQUENCE：12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-NR2D Rev.

<220>

<400> SEQUENCE：13

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-α -interferon Fwd.

<220>

<400> SEQUENCE：14

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成DNA引子-α -interferon Rev.

<220>

<400> SEQUENCE：15

Claims (13)

1. 一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，該短夾RNA包含一第一片段、一第二片段及一連接片段，該第一片段係NMDA受體次單元NR1之同源性核糖核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，該第二片段之序列為該第一片段之互補回文序列，該連接片段為任意之鹼基序列，該連接片段之兩端分別與該第一片段及該第二片段結合，該短夾RNA係編碼自如SEQ ID NO：1所示之序列。
2. 一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，該短夾RNA包含一第一片段、一第二片段及一連接片段，該第一片段係NMDA受體次單元NR1之同源性核糖核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，該第二片段之序列為該第一片段之互補回文序列，該連接片段為任意之鹼基序列，該連接片段之兩端分別與該第一片段及該第二片段結合，該短夾RNA係編碼自如SEQ ID NO：2所示之序列。
3. 依照申請專利第1項所述之一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，該短夾RNA之第一片段及第二片段皆為21個鹼基。
4. 依照申請專利第1項所述之一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，該連接片段之鹼基個數為3至23個。
5. 一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物，係包含一短夾 RNA及至少一載劑，該短夾RNA包含一第一片段、一第二片段及一連接片段，該第一片段係NMDA受體次單元NR1之同源性核糖核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，該第二片段之序列為該第一片段之互補回文序列，該連接片段為任意之鹼基序列，該連接片段之兩端分別與該第一片段及該第二片段結合，該短夾RNA係以一短夾RNA載體表現，其中，該短夾RNA係編碼自如SEQ ID NO：1或2所示之序列。
6. 依申請專利範圍第5項所述之一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物，其中，該短夾RNA載體之施用劑量係為5~20微克(μg)，給予頻率係為7~21天/次。
7. 依申請專利範圍第5項所述之一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物，其中，該載劑係聚乙烯胺。
8. 依申請專利範圍第5或7項所述之一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物，其中，該短夾RNA載體與載劑之比例係為1微克(μg)：0.2微升(μL)。
9. 一種短夾RNA在製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途，係將編碼自如SEQ ID NO：1或2所示之序列之短夾RNA用以阻斷NMDA受體次單元NR1之表現。
10. 依申請專利範圍第9項所述之一種短夾RNA在製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途，其中，該短夾RNA係以一短夾RNA載體表現，該短夾RNA載體之劑量係5~20微克(μg)。
11. 依申請專利範圍第9項所述之一種短夾RNA在製備用以抑制NMDA受體NR1之試劑之用途，其中，該短夾RNA載體之使用頻率係7~21天/次。
12. 依照申請專利第2項所述之一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，該短夾RNA之第一片段及第二片段皆為21個鹼基。
13. 依照申請專利第2項所述之一種用以抑制NMDA受體NR1之短夾RNA，該連接片段之鹼基個數為3至23個。