TWI380992B - 一種抑制ｎｍｄａ受體ｎｒ１之小段干擾ｒｎａ、該小段干擾ｒｎａ用以抑制皮下組織ｎｍｄａ受體ｎｒ１之方法、該小段干擾ｒｎａ之用途以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物 - Google Patents

一種抑制ｎｍｄａ受體ｎｒ１之小段干擾ｒｎａ、該小段干擾ｒｎａ用以抑制皮下組織ｎｍｄａ受體ｎｒ１之方法、該小段干擾ｒｎａ之用途以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物 Download PDF

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Description

一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA、該小段干擾RNA用以抑制皮下組織NMDA受體NR1之方法、該小段干擾RNA之用途以及一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物
本發明係關於一種小段干擾RNA、小段干擾RNA之使用及其於製藥學上之用途，特別是一種關於皮下組織疼痛相關基因之小段干擾RNA、其用於抑制皮下組織疼痛相關基因之表現及其在減輕皮膚疼痛製藥的用途。
疼痛，係一種生物個體感受組織損傷而產生生理上的意識感覺，是一般人對疾、病、傷及患最直接的反應，也是多數病患就醫的主要原因或徵狀；可依照疼痛的時間、位置、程度及形式(如燒痛、刺痛或絞痛等)為依據判斷疼痛發生的原因。一般性疼痛會自然消退，或於患部移除及用藥處理後1至3個月內減緩其疼痛的程度，係為急性疼痛，如因盲腸炎所引起之疼痛；若疼痛的時間超過預期復原的時間，或是疼痛自身已成為疾病，則係慢性疼痛，如癌症所引起之長期疼痛，一般慢性疼痛的時間多長達6個月以上，患者需要接受適當治療以改善疼痛的情況。
疼痛的感受(nociception)係由位於周圍神經系統(位於皮膚等處)或中樞神經系統(脊髓和腦)的痛覺感受器(nociceptor)，因遭受刺激而引發的無意識感覺；一般來說，當痛覺感受器感受到化學、熱力或撞擊等各種可損傷身體組織的刺激，該刺激將傳遞至神經結末梢，分泌麩胺酸(Glutamate；Glu)，該麩胺酸係脊椎動物中樞神經系統主要的興奮性神經傳遞物質(excitatory transmitter)，可活化位於腦或脊椎的麩胺酸受體(Glutamate receptors；GluRs)，產生一連串的神經傳導，反應疼痛感受；由該麩胺酸刺激活化麩胺酸受體之神經傳導途徑在正常性或疾病性的痛覺感受上皆扮演重要意義。
該麩胺酸受體主要分為代謝型受體(metabotropic receptor)與離子型受體(ionotropic receptor)，分別係由不同的反應來源、反應時間及麩胺酸的分泌量所刺激活化，以引導不同的疼痛傳遞反應(如急性或慢型疼痛)產生；其中，該離子型受體係屬配位體控制通道(ligand-gate channel)，又可再細分為NMDA受體(N-methyl-D-aspartate receptor)、AMPA受體(α-methyl-3-hydroxy-methylisoxazole-4-propionate receptor)及KA受體(kainate receptor)，皆由多個次單元(subunits)所組成，舉例說明之，該NMDA受體係由一NR1次單元、一NR2次單元群體(包含NR2A、NR2B、NR2C及NR2D)及一NR3(包含NR3A及NR3B)次單元群體所共同組成，而該NR1次單元係NMDA受體之功能性表現所必須存在的次單元。
麩胺酸突觸(glutamatergic synapses)之後膜係同時存在有多種麩胺酸受體，其中，該NMDA受體係參與多數由中樞神經末梢所分泌的興奮性傳遞(麩胺酸)，由該NMDA受體之活化可以使鈣離子(Ca2+ )等通過。一般來說，NMDA受體平時係處於一靜止膜電位狀態，此時該NMDA受體之通道存在有二價鎂離子(Mg2+ )，使其他離子(如鈣離子)無法通過，然而當組織發炎或損傷時，中樞神經釋出麩胺酸活化該NMDA受體，造成該NMDA受體之構型改變，使該NMDA受體之細胞膜電位產生去極化(depolarization)，對該二價鎂離子產生一排斥力量而離開通道，此時，鈣離子即可通過NMDA受體之通道而進入神經元細胞，開啟疼痛傳導機制；而該NMDA受體之活化又可同時被代謝型受體所調控之正回饋機制或負回饋機制影響，增加或減少該NMDA受體之活化程度，使更多或較少鈣離子進入神經元細胞，調控疼痛反應之程度。
該NMDA受體係細胞內調控生理、生化作用之重要相關因子，早期研究顯示，脊髓背角NMDA受體次單元NR1，對於生物體的中樞神經敏感化(central sensitization)及神經病變(neuropathy)具有直接關係，在一些生物個體的發炎反應模式中，皆可以觀察到NMDA受體構型的改變，顯示該NMDA受體參與生物個體體內許多複雜的痛覺傳導及病理過程，如痛覺敏感的產生和維持作用。
臨床上由皮膚創傷所引發的疼痛較為複雜，特別是皮膚的燒傷、燙傷及灼傷，若患者傷部面積較大，傷口的疼痛程度往往令人難以忍受。一般而言，皮膚創傷(燒、燙傷)的患者若傷及真皮層，造成皮膚破損使得位於皮膚組織的神經末梢暴露，刺激分泌大量的神經傳遞物質(如麩胺酸、神經胜肽等)，活化麩胺酸受體，開啟炎症性疼痛反應之機制，使得患部之痛覺感受器對疼痛的感受會變得較為敏感，疼痛閾值下降而導致痛覺過敏(hyperalgesia)；因此，皮膚創傷患者對於疼痛的耐受力會漸漸降低，即使係稍微的移動傷部、清理傷口或是更換紗布用藥，都會導致患者無法承受的疼痛；而後續的臨床醫療措施如皮膚移植、復健，對患者來說更是一項痛苦的煎熬。
由上所述，習知用於減緩皮膚創傷患者疼痛之藥劑，如ketamine、gabapentin或meperidine等，多以NMDA受體為藥劑作用標靶，以抑止因神經暴露導致痛覺敏感所引起之劇烈疼痛反應。該習知藥劑(如ketamine等)係結合於該NMDA受體上所具有之抑制結合端(antagonist binding site)，避免該NMDA之細胞膜電位產生去極化而使大量鈣離子進入神經元細胞，避免炎症性疼痛反應機制所之開啟。
然而，該習知藥劑(如ketamine等)於生物體內作用之過程中，該習知藥劑之代謝物可經由體內循環而運送至中樞神經，累積於生物體內，因此，一般患者在服用後容易引發中樞神經相關的副作用，如噁心、昏睡、暈眩、記憶力下降及平衡感失調等；再者，該習知藥劑(如ketamine、meperidine等)本身的止痛作用期短(僅數小時)，需要藉由多次施藥才可達到長久鎮痛的效果，而患者若長期接受該習知藥劑的治療更可能導致藥物成癮的問題。
由此，臨床上使用該習知減緩皮膚創傷患者疼痛之藥劑，不僅無法有效緩解患者的疼痛，更可能造成導致諸多中樞神經相關的副作用及藥物上癮等問題衍生，對於一些飽受炎症性疼痛所苦之皮膚創傷患者(如燒、燙傷之患者)，無疑係雪上加霜，有必要針對習知藥劑加以改進，以提升臨床醫療的水平。
本發明之主要目的係針對上述習知用於減緩皮膚疼痛之藥劑所具有的缺點，提供一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，以小段干擾RNA的應用，抑制疼痛相關作用因子NMDA受體的表現。
本發明之次一目的係提供一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA及其抑制皮下組織NMDA受體之方法，係以小段干擾RNA的應用，抑制皮下組織NMDA受體以減緩皮膚疼痛，改善習知藥劑在減緩皮膚疼痛所引發之中樞神經副作用。
本發明之又一目的係提供一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA之用途，係以小段干擾RNA應用於製備用以減輕皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，改善臨床上皮膚創傷患者(燒、燙傷)炎症性疼痛的問題。
本發明之再一目的係提供一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，係以小段干擾RNA之應用改善習知藥劑無法長效作用的缺點。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，係具有一NMDA受體次單元NR1之同源性核醣核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，且該小段干擾RNA為21~25個核糖核酸。
一種利用小段干擾RNA抑制皮下組織NMDA受體NR1之方法，係將具有NMDA受體次單元NR1同源性核醣核酸序列之小段干擾RNA，施予至一生物個體之皮下，以阻斷皮下組織內NMDA受體次單元NR1之表現。
一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA的用途，係將小段干擾RNA應用於製備用以減輕皮膚炎症性疼痛之藥物化合物。
一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，係包含一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA係利用小段干擾RNA(small interfering RNA；siRNA)之作用原理，依照NMDA受體次單元NR1之基因序列(參考自基因庫GenBank)設計一小段NMDA受體干擾RNA，該小段NMDA受體干擾RNA係可以抑制該NMDA受體之功能；將該小段NMDA受體RNA施予至一生物個體之皮下組織，可減緩該生物個體之皮膚因接觸一刺激物所引發之炎症性疼痛反應，並且，經由實驗分析證實該小段NMDA受體干擾RNA確實可抑制該NMDA受體次單元NR1之基因表現。
本發明所應用之小段干擾RNA之作用原理，係一種僅在少數真核生物(如線蟲、果蠅)上發現的基因靜默(gene silence)現象，最早係於1990年由牽牛花色素基因之異常表現情形所觀察到；一雙鏈RNA在細胞中可誘發一裁切子(dicer)作用而被裁切為數小段干擾RNA，該小段干擾RNA之雙鏈可解開而成為單鏈狀之小段干擾RNA，該單鏈狀之小段干擾RNA可與序列互補的訊息RNA(mRNA)結合，再次誘發該裁切子之作用，對該訊息RNA進行裁切，使該訊息RNA之核醣核酸專一性地被降解，由此，該訊息RNA之基因表現即在轉錄後(post-transcription)被抑制。
由上述原理，本發明之小段NMDA受體干擾RNA係參考自一生物個體NMDA受體次單元NR1之基因序列而設計並製備，因此，該小段NMDA受體干擾RNA之核醣核酸序列係與該生物個體NMDA受體次單元NR1之基因序列同源；由此，本發明之小段NMDA受體干擾RNA係可以專一性抑制該生物個體內NMDA受體次單元NR1之轉錄後基因表現，而該生物個體內由NMDA受體次單元NR1所參與而啟動之炎症性疼痛反應機制也相對被抑止；若將本發明之小段NMDA受體干擾RNA施予至該生物體之皮下組織，則可抑制該皮下組織中NMDA受體相關之功能表現，達到減緩皮膚疼痛程度的效果。
小段NMDA受體干擾RNA之設計與製備：
本實施例係針對一老鼠NMDA受體次單元NR1之基因序列(源自於基因庫GenBank，U11418，2957鹼基對base pairs)，分別設計一NR1-1、NR1-2及一NR1-3小段干擾RNA(siRNA)，即為本發明之小段NMDA受體干擾RNA；其中，該NR1-1 siRNA之雙鏈RNA序列係分別自該老鼠NMDA受體次單元NR1之基因序列中正、負股序列的第278~298個鹼基對(bps)所設計，共21個核糖核酸；而該NR1-2 siRNA、NR1-3 siRNA之雙鏈RNA序列則係分別與該老鼠NMDA受體次單元NR1之基因序列中正、負股序列的第512~532、957~977個鹼基對同源；該NR1-1 siRNA、NR1-2 siRNA及NR1-3 siRNA皆係由一人工合成方式製備，本實施例係採用一商用小段干擾RNA製備套組(Ambion,Austin,TX)進行合成，該NR1-1 siRNA、NR1-2 siRNA及NR1-3 siRNA之核醣核酸序列紀錄於第1表。
為證實本發明一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，可以抑制一生物個體內皮下組織NMDA受體之次單元NR1之表現及功能，而影響該生物個體所能感受之皮膚疼痛反應，係將本發明之小段NMDA受體干擾RNA施予至一模式動物之皮下組織，再分別觀察並紀錄該模式動物於一刺激試驗中所出現之疼痛反應，以及該模式動物皮下組織NMDA受體次單元NR1之基因表現情形。
甲醛(formalin)刺激試驗：
本實施例係將一甲醛(formalin)注射至數隻實驗白鼠(Sprague-Dawley rats)進行刺激試驗，該甲醛係為一刺激性化學藥劑，對生物體之黏膜、皮膚皆具有刺激性，可能引發生物體皮膚之過敏反應；該實驗白鼠於試驗期間所接受之飲食係符合一般實驗室之飼養標準，並且置於一溫度、光照皆維持於正常範圍之環境進行餵養，以確保該實驗白鼠生理狀態正常。該實驗白鼠在注射該甲醛後會因注射部位受到刺激，致使該實驗白鼠感到痛苦、畏縮而出現兩階段的足爪回縮的反應[急性期(acute phase)及強性期(tonic phase)]，係為神經傳導反應之模式分析試驗。本實施例係將該實驗白鼠隨機分配至數組，分別針對本發明之小段NMDA受體干擾RNA之序列、劑量及作用時間等不同條件進行甲醛刺激試驗，觀察各組實驗白鼠產生回縮反應之頻率，並分析各組實驗白鼠體內NMDA受體次單元NR1基因之表現狀態。
a.序列試驗： 請參照第1a~e圖所示，該序列試驗係將2μL聚乙烯胺溶液(polyethyleneimine；重量百分比濃度為20%)以及本發明之小段NMDA受體干擾RNA(包含NR1-1 siRNA、NR1-2 siRNA及NR1-3 siRNA)分別注射至4組實驗白鼠(a1~a4)之一側後腳掌，係為第一次注射，其中，注射該聚乙烯胺溶液之實驗白鼠(a1)，係為試驗對照組，而本發明之小段NMDA受體干擾RNA(包含NR1-1 siRNA、NR1-2 siRNA及NR1-3 siRNA)係於注射時分別混合一定體積之注射載劑[如聚乙烯胺溶液(濃度同對照組)]再分別注射至a2~a4組實驗白鼠，本實施例較佳係採用將1nmole之siRNA混合2μL聚乙烯胺溶液進行注射；上述a1~a4組實驗白鼠於第一次注射後3天再次接受第二次注射，該第二次注射係將1%甲醛溶液注射至該a1~a4組實驗白鼠後腳掌之同一注射處，觀察a1~a4組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第1a圖)，並分析a1~a4組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1之基因表現，包含mRNA之表現(紀錄於第1b、1c圖)及蛋白質之表現(紀錄於第1d、1e圖)；該a1~a4組實驗白鼠之注射情形紀錄於第2表。
請再參照第1a圖所示，其中，該a1~a4組實驗白鼠在第二次注射(甲醛)後隨即出現足爪回縮的反應，係為急性期，該急性期之足爪回縮的反應維持約3~5分鐘；其中，該對照組之實驗白鼠(a1)，足爪回縮的頻率約為12~13次/分鐘，維持約5分鐘左右；相較於該對照組之實驗白鼠，另外第a2~a4組實驗白鼠之足爪回縮的頻率，除了第一次注射NR1-3 siRNA之實驗白鼠(a2)係與該對照組實驗白鼠具有相同的足爪回縮頻率(12~13次/分鐘)；其餘第a3及a4組實驗白鼠之足爪回縮頻率則較該對照組之實驗白鼠為低(4~6次/分鐘)，且維持時間也較短，約為3分鐘左右。該急性期之後約10~15分鐘，該a1~a4組實驗白鼠之足爪回縮情況逐漸趨緩(<5次/分鐘)，然又於第二次注射後第15~20分鐘左右再次出現高頻率之足爪回縮的反應，係為強性期，該強性期之足爪回縮反應維持時間較久，約為20~40分鐘，且足爪回縮的反應較劇烈；其中，該對照組實驗白鼠係於第二次注射後第20分鐘即出現強性期之足爪回縮反應，反應頻率約為20次/分鐘左右；而該第a2組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則同樣近似於該對照組之回縮頻率；而第a3及a4組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則係遠低於該對照組之足爪回縮頻率，約為8~12次/分鐘。
由第1a圖之結果顯示，由甲醛刺激一生物個體週邊神經之痛覺受器(皮膚)，可立即活化週邊神經之痛覺受器而感受疼痛，因此該生物個體會立即產生急性疼痛反應(如實驗白鼠所產生急性期之足爪回縮反應)；而當週邊神經之痛覺受器持續被活化，且該週邊神經之活化刺激被傳遞至中樞神經，誘使中樞神經大量分泌神經傳導物質(如麩胺酸)使該NMDA受體持續活化，因而該生物體會產生更劇烈的續發性疼痛反應(如實驗白鼠所產生強性期之足爪回縮反應)。而透過第a3及a4組之足爪回縮反應結果可明顯得知，透過注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA，可以影響該生物個體對於甲醛刺激所產生之疼痛反應，使該生物個體之反應較緩和；因此，本發明之小段NMDA受體干擾RNA確實可以抑制皮下組織中該NMDA受體次單元NR1之功能，減緩生物個體之週邊神經受體因受到刺激，活化痛覺受體而產生的急性疼痛反應，以及，適度改善由該週邊神經受體之刺激傳遞至中樞神經所引發之續發性疼痛反應，使生物個體所能感受之疼痛程度較小。
請再參照第1b、1c圖所示，係a1~a4組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1mRNA表現分析。係採樣上述4組實驗白鼠(a1~a4)之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析試驗，分析比較a1~a4組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。本實施例係採用一商用RNA抽取套組(RNA Mini Kit；from Geneaid Biotech Ltd)，抽取a1~a4組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA，以一商用DNA反轉錄套組(DNA Reverse Transcription Kit；Applied Biosystems Inc)將該a1~a4組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA反轉錄為DNA，再以ABI Prism 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems Inc)進行即時聚合酶連鎖反應分析試驗；本實施例係分別針對NMDA受體次單元NR1、NR2及α-interferon分別設計專一性的引子對(primers)，包含一NR1引子對、一NR2A引子對、一NR2B引子對、一NR2C引子對、一NR2D引子對及一α-interferon引子對(引子對設計列表如第3表所示)，利用前述該些引子對分別針對a1~a4組實驗白鼠之皮膚檢體進行即時聚合酶連鎖反應，觀測4組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元(NR1、NR2A、NR2B、NR2C及NR2D)及α-interferon之RNA表現量。
由第1b圖結果，該對照組實驗白鼠(a1)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於該對照組，其他a1~a3組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則分別為90%(第a2組)、50%(第a3組)及30%(第a4組)；該結果顯示經由注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA實驗白鼠的皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量明顯低於未注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA的實驗白鼠；其中，又以注射NR1-1 siRNA的實驗白鼠(a4)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1的mRNA表現量最低。由上述結果，本發明之小段NMDA受體干擾RNA可以與生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1mRNA的部分序列互補而結合，誘發該生物個體內裁切子之作用，對該生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1之mRNA進行裁切，抑制該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。
再由第1c圖結果，係比較未注射本發明小段NMDA受體干擾RNA的實驗白鼠(對照組；a1)與注射本發明小段NMDA受體干擾RNA的實驗白鼠(以注射NR1-1 siRNA之第a4組實驗白鼠為代表)中，其他參與疼痛反應之NMDA受體次單元(如NR2A、NR2B、NR2C及NR2D)以及一免疫相關蛋白(α-interferon)的mRNA表現量；由該對照組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR2A、NR2B、NR2C、NR2D及α-interferon的RNA表現量係為100%，而相較於該對照組，第一次注射NR1-1 siRNA的實驗白鼠(a4)，其皮膚檢體的NMDA受體次單元(NR2A、NR2B、NR2C、NR2D)及α-interferon的mRNA表現量則為100%上下，沒有受到NR1-1 siRNA的抑制。結果顯示，將本發明小段NMDA受體干擾RNA注射至生物個體，該NMDA受體干擾RNA係專一性與生物個體內NMDA受體次單元NR1mRNA的部分結合，而專一性抑制該生物個體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現，該小段NMDA受體干擾RNA不會抑制其他同樣參與疼痛反應之NMDA受體次單元(如NR2A、NR2B、NR2C及NR2D)的基因表現，同時，該小段NMDA受體干擾RNA不會引發生物個體內的免疫反應，而使免疫相關蛋白(如α-interferon)的基因表現量增加；因此，本發明之小段NMDA受體干擾RNA僅係專一性的抑制生物個體內，皮下組織中NMDA受體次單元NR1的基因表現，而不會對其他同樣參與疼痛反應的NMDA受體次單元或免疫反應造成任何影響。
請再參照第1d及1e圖所示，係上述a1~a4組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量分析試驗。係採樣a1~a4組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之蛋白質，由西方墨點法分析a1~a4組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1蛋白質的表現量。本實施例係將a1~a4組實驗白鼠之皮膚檢體以一定比例(較佳係1:20)稀釋於一商用組織蛋白質抽取溶劑(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent；PIERCE)，進行均質處理，再由一商用蛋白質定量套組(Protein Assay Kit；Invitrogen)分析由各組實驗白鼠之皮膚檢體所抽取的蛋白質總量，取等量蛋白質，利用取自兔子之抗麩胺酸受體的多株抗體(from Sigma)進行西方墨點法分析。
由第1d圖結果，係上述4組實驗白鼠之西方墨點法分析結果；其中，該對照組實驗白鼠(a1)的皮膚檢體中具有較多量的NMDA受體次單元NR1表現(訊號較明顯)，而其他a2~a3組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1的表現量則相對較少(訊號較不明顯)；若由一相對定量方式與一生物個體內正常表現之蛋白質表現量作比較，本實施例係與皮膚檢體中b-tubulin蛋白表現量為定量標準(表現量設定為100%)，相對定量4組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1的表現量(如第1e圖所示)，對照組實驗白鼠之皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量係為90%，而其他3組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量則分別為60%(a2)、40%(a3)及20%(a4)。
該結果顯示經由注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA實驗白鼠(a2~a4)的皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量明顯低於未注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA的實驗白鼠(a1)；其中，又以注射NR1-1 siRNA的實驗白鼠(a4)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之蛋白質的表現量最低；因此，本發明之小段NMDA受體干擾RNA，可以抑制生物個體皮下組織中NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量。
由上述a.序列試驗 的結果證實，本發明之小段NMDA受體干擾RNA，係依照一生物個體NMDA受體次單元NR1之基因序列所設計的小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1 siRNA、NR1-2 siRNA及NR1-3 siRNA)，可確實影響該生物個體之皮膚在接觸一刺激物而活化皮下組織NMDA受體、引發炎症性疼痛反應，並且，該小段NMDA受體干擾RNA注射生物個體之皮下組織後，可專一性抑制皮下組織NMDA受體次單元NR1的基因表現；並且該皮下組織NMDA受體次單元NR1的基因，係於基因轉錄後(post-transcrption)被專一性的抑制，顯示該生物個體係因皮下組織NMDA受體次單元NR1的基因在轉錄為核醣核酸後受到本發明之小段NMDA受體干擾RNA專一性的結合，而使該NMDA受體次單元NR1的mRNA被降解且無法轉譯為具功能性的NMDA受體次單元NR1，而使其參與之痛覺傳遞機制受阻，因此，降低該生物個體之皮膚可能反應的疼痛程度。
b.劑量試驗： 請參照第2a~d圖所示，該劑量試驗係將不同劑量[0.5~2奈米莫耳(nmole)]之小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1 siRNA)、100微升(μL)生理食鹽水以、2微升聚乙烯胺溶液(polyethyleneimine；濃度為20%)及1奈米莫耳(nmole) MM-NR1-1 siRNA分別注射至6組實驗白鼠(b1~b6)再次進行甲醛刺激試驗，觀察該b1~b6組實驗白鼠之足爪回縮反應及皮膚組織中NMDA受體次單元NR1的基因表現情形。而注射該聚乙烯胺溶液、MM-NR1-1 siRNA及生理食鹽水之實驗白鼠係為劑量試驗之對照組；其中，該MM-NR1-1 siRNA係為一雙鏈RNA序列，同樣係經由該商用小段干擾RNA製備套組(Ambion,Austin,TX)進行合成，該MM-NR1-1 siRNA之雙股RNA序列雖與本發明NR1-1 siRNA之部分雙股序列相對應，且同樣設計為21個鹼基對，然該MM-NR1-1 siRNA卻係不與該老鼠基因序列(U11418)的任一部分同源，該MM-NR1-1 siRNA之雙鏈RNA序列如下方第4表所示。
承上所述，不同劑量之NR1-1 siRNA、生理食鹽水、聚乙烯胺溶液(polyethyleneimine；濃度為20%)及MM-NR1-1 siRNA等係注射於b1~b6組實驗白鼠之後腳掌處，係為第一次注射，其中，該MM-NR1-1 siRNA與NR1-1 siRNA同樣係於注射時混合該注射載劑進行注射；b1~b6組實驗白鼠於第一次注射後3天於相同注射處再次接受第二次注射，該第二次注射同樣係注射1%甲醛溶液，觀察b1~b6組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第2a圖)，並分析b1~b6組實驗白鼠皮下組織NMDA受體次單元NR1之基因表現[包含NR1之mRNA的表現量(紀錄於第2B圖)及NR1之蛋白質表現(紀錄於第2c、2d圖)]；該6組實驗白鼠之注射情形紀錄於第5表。
請再參照第2a圖所示，其中，該b1~b6組實驗白鼠在第二次注射後隨即出現急性期之足爪回縮的反應，該急性期之足爪回縮的反應維持約3~5分鐘；其中，該對照組之實驗白鼠(b1~b3)，足爪回縮的頻率約為8~16次/分鐘，維持5分鐘左右；相較於該對照組之實驗白鼠，第一次注射0.5~2奈米莫耳NR1-1 siRNA的3組實驗白鼠(b4~b6)，除了第b4組實驗白鼠(第一次注射0.5nmole)於該急性期之足爪回縮頻率、時間係約等同於3組對照組實驗白鼠；而第b5及b6組實驗白鼠(第一次注射1、2nmole NR1-1 siRNA)於急性期之足爪回縮頻率則較3組對照組實驗白鼠之足爪回縮頻率明顯為低，約為4~5次/分鐘左右，且b5及b6組實驗白鼠於急性期之足爪回縮情形僅持續約3分鐘以下，另外，該第b6組實驗白鼠之足爪回縮狀態較第b5組實驗白鼠的足爪回縮狀態略為緩和。
再者，該b1~b6組實驗白鼠於強性期之足爪回縮皆出現於急性期反應趨緩後的10~15分鐘，且維持約30~40分鐘；其中，該對照組實驗白鼠(b1~b3)於強性期之足爪回縮頻率約為10~18次/分鐘；而該第b4組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率約為8~15次/分鐘，該b4組實驗白鼠僅在強性期之足爪回縮反應初期(第二次注射後約20分鐘)出現低於10次/分鐘的回縮頻率，之後的反應則與該對照組近似；而第b5、b6組實驗白鼠於強性期之足爪回縮頻率則係遠低於該對照組之足爪回縮頻率，約為4~8次/分鐘，並且，該第b6組實驗白鼠於強性期的足爪回縮狀態同樣較第b5組實驗白鼠的狀態略為緩和。
由第2a圖結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1 siRNA)可以有效抑制該NMDA受體次單元NR1之功能，影響該生物個體之週邊神經受體對外界刺激的感受能力，使得因刺激而引發的急性疼痛、續發性疼痛反應可以較為緩和；並且，藉由調整本發明之小段NMDA受體干擾RNA的注射劑量可以適度調控該生物個體在週邊神經受體遭受刺激時所反應疼痛的程度，以改善一般生物個體在遭遇重大刺激時所承受的極度疼痛。
請再參照第2b圖所示，係上述b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1mRNA表現量分析試驗。係採樣b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析試驗，分析比較b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。本實施例係依照該a.序列試驗 所述之即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析方式，同樣由該商用RNA抽取套組抽取b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA，將該b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA經商用DNA反轉錄套組反轉錄為DNA，再以該ABI Prism 7500 Sequence Detection System進行即時聚合酶連鎖反應分析試驗，以便即時檢視該b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量；本實施例所使用之專一性引子對係為該NR1引子對：正股Fwd. 5'-GCG ACT CCC GCA GCA AT-3'；反股Rev. 5'-CCC CTG CCA TGT TCT CAA AA-3'。
由第2b圖結果，該第b1~b3組實驗白鼠(對照組)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於該第b1~b3組實驗白鼠，第b4~b6組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則分別為55%(第b4組)、<10%(第b5組)及10%(第b6組)，其中，第一次注射1nmole NR1-1 siRNA的實驗白鼠，皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1的mRNA表現量最低；該結果顯示經由注射本發明NR1-1 siRNA之實驗白鼠(b4~b6)的皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量明顯低於未注射本發明NR1-1 siRNA的實驗白鼠(b1~b3)，而注射1nmole NR1-1實驗白鼠(b5)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1的mRNA表現量最低。由上述結果，將一定劑量之本發明小段NMDA受體干擾RNA注射至生物個體，可以抑制該生物個體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量，而注射較高劑量的小段NMDA受體干擾RNA，對該生物個體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現係具有較佳的抑制效果；因此，本發明之小段NMDA受體干擾RNA對NMDA受體次單元NR1基因表現的抑制現象係呈現一正向劑量取向關係。
請再參照第2c、2d圖所示，係上述b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量分析試驗。係採樣b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之蛋白質，依照該a.序列試驗 的分析手段，由西方墨點法進行b1~b6組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量之分析。本實施例同樣係先將b1~b6組實驗白鼠之皮膚檢體以1:20之比例稀釋於該商用組織蛋白質抽取溶劑，進行均質處理，再利用該商用蛋白質定量套組分析並定量由各組實驗白鼠之皮膚檢體所抽取的蛋白質，取等量蛋白質，利用該多株抗體(抗麩胺酸受體)進行西方墨點法分析。
由第2c圖結果，係上述b1~b6組實驗白鼠之西方墨點法分析結果；其中，該對照組實驗白鼠(b1~b3)的皮膚檢體中具有較多量的NMDA受體次單元NR1表現(訊號較明顯)，而其他b4~b6組實驗白鼠的皮膚檢體中，僅第一次注射0.5nmole NR1-1 siRNA的實驗白鼠(b4)，NMDA受體次單元NR1的表現量與對照組實驗白鼠的差異較小，其他b5及b6組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1的表現量則明顯較低(由2c圖之訊號)；而由該上述相對定量方式比較(由第2d圖)，以該b-tubulin蛋白表現量為定量標準，則對照組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量約為70%左右，而其他b4~b6組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量則分別為50%(b4)、10%(b5)及<10%(第b6組)，其中，於第一次注射2nmole本發明之NR1-1的實驗白鼠，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現量最低。該結果顯示，經由注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA的實驗白鼠(b4~b6)，皮膚檢體中該NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現量明顯低於未注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA的實驗白鼠(b1~b3)，顯示該NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現係受到本發明小段NMDA受體干擾RNA的抑制，並且，較高劑量的小段NMDA受體干擾RNA，對NMDA受體次單元NR1的蛋白質表現具有較佳的抑制效果；因此，再次證實本發明之小段NMDA受體干擾RNA對皮下組織NMDA受體次單元NR1基因表現的抑制現象係呈現一正向劑量取向關係。
由上述b.劑量試驗 的結果證實，本發明小段NMDA受體干擾RNA注射於生物個體之皮下組織後，可確實抑制該生物個體中NMDA受體次單元NR1之基因表現，而使該NMDA受體之功能無法正常表現，因此當該生物個體之皮膚在接觸一刺激物，由該NMDA受體所傳遞引發之疼痛反應將相對減緩，使該生物個體所感受之疼痛程度下降；並且，該小段NMDA受體干擾RNA對於該生物個體內NMDA受體次單元NR1之基因表現的抑制現象係為一正向劑量取向關係，故可以藉由調節該小段NMDA受體干擾RNA之注射劑量而酌量抑制該生物個體內NMDA受體之功能表現，以適當控制生物個體的皮膚所能感受疼痛的程度。
c.作用時間試驗： 請參照第3a~d圖所示，該作用時間試驗係將2微升(μL)聚乙烯胺溶液(polyethyleneimine；濃度為20%)及1奈米莫耳(nmole)本發明之小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1)分別於甲醛刺激試驗前3天、7天、14天及21天注射至c1~c8組實驗白鼠，觀察該c1~c8組實驗白鼠在甲醛刺激試驗中所反應之足爪回縮情形，以及，皮膚組織中NMDA受體次單元NR1的基因表現量；其中，分別於甲醛刺激試驗前3天、7天、14天及21天注射聚乙烯胺溶液之4組實驗白鼠(c1~c4)，係為作用時間試驗之對照組。
本實施例係比照上述a.序列試驗 及b.劑量試驗 之注射方式，同樣係經由兩次注射將本發明之NR1-1 siRNA、聚乙烯胺溶液(polyethyleneimine；濃度為20%)及甲醛溶液分別注射至實驗白鼠之後腳掌處，詳細注射情況如下方第6表所示；其中，該對照組之實驗白鼠(c1~c4)係分別於第二次注射前第3、7、14及21天注射該聚乙烯胺溶液，而其餘4組實驗白鼠(c5~c8)則係分別於第二次注射前第3、7、14及21天注射該NR1-1 siRNA，係為第一次注射，該第一、第二次注射係分別注射於該8組實驗白鼠後腳掌之相同處；紀錄各組實驗白鼠所表現之足爪回縮反應(紀錄於第3a圖)，以及各組實驗白鼠NMDA受體次單元NR1之基因表現[包含NR1 mRNA(紀錄於第3b圖)及NR1蛋白質(紀錄於第3c、3d圖)]。
請再參照第3a圖所示，該c1~c4組實驗白鼠在第二次注射後即出現急性期之足爪回縮的反應，維持約3~5分鐘，而後10~15分鐘8組實驗白鼠的足爪回縮情況皆較為緩和，直至強性期之足爪回縮反應出現(約第二次注射後20分鐘)，維持約30~40分鐘；其中，因第c4及c8組實驗白鼠之足爪回縮反應分別與於第c3及c7組實驗白鼠大略相同，而在此(第3a圖中)省略相關討論。其中，該對照組之實驗白鼠(第二次注射前3、7及14天注射聚乙烯胺的3組實驗白鼠；c1~c3)，於急性期之足爪回縮頻率約為8~16次/分鐘，維持5分鐘左右；而其他於第二次注射前3、7及14天注射本發明之NR1-1 siRNA的3組實驗白鼠(c5~c7)，其中，僅第c5及c6組實驗白鼠於急性期之足爪回縮頻率則較對照組實驗白鼠(c1~c3)明顯為低，約為4~6次/分鐘左右，維持時間也較短，約為3分鐘左右；而第c7組實驗白鼠，於該急性期之足爪回縮頻率、時間係與對照組實驗白鼠(c1~c3)的情況大致相同，約為8~13次/分鐘左右。
再者，該對照組實驗白鼠(c1~c3)於強性期之足爪回縮頻率約為8~18次/分鐘；而相較於對照組之實驗白鼠，第c5及c6組實驗白鼠，在強性期之足爪回縮頻率約為5~11次/分鐘；而第c7組實驗白鼠在強性期之足爪回縮反應僅較對照組實驗白鼠(c1~c3)之足爪回縮反頻率略為緩和，約為8~12次/分鐘。
由第3a圖結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾RNA可以長時間(約7天左右)抑制生物個體體內NMDA受體之功能，並且，該小段NMDA受體干擾RNA在生物體內之抑制作用僅為暫時性的反應，一段時間後(14~21天)該生物個體內NMDA受體之功能則會回復正常狀態；若將該小段NMDA受體干擾RNA注射至該生物個體內，則可以暫時性緩和該生物個體之皮膚在感受一刺激物而引發的疼痛反應，因此，該小段NMDA受體干擾RNA，可以暫時性改善一般生物個體在遭遇重大刺激時所承受的極度疼痛，並且，在一段時間後即回復一般生物個應有的疼痛反應，不會對生物個體本身的正常反應途徑造成負面影響。
請再參照第3b圖所示，係上述c1~c8組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1mRNA表現量分析試驗。係採樣c1~c8組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之RNA，進行即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析試驗，分析比較c1~c8組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。本實施例同樣係按照該a.序列試驗 及b.劑量試驗 中所操作之即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)進行分析，同樣由該商用RNA抽取套組抽取c1~c8組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA，將該8組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA經商用DNA反轉錄套組反轉錄為DNA，再以該ABI Prism 7500 Sequence Detection System進行即時聚合酶連鎖反應分析試驗，以便即時檢視該c1~c8組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量；本實施例所使用之專一性引子對係為該NR1引子對：正股Fwd. 5'-GCG ACT CCC GCA GCA AT-3'；反股Rev. 5'-CCC CTG CCA TGT TCT CAA AA-3'。
由第3b圖結果，4組對照組實驗白鼠(c1~c4)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為100%，而相較於對照組實驗白鼠，第c5、c6、c7及c8組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則係由注射時間的差異而有不同；其中，於第二次注射前3天、7天注射NR1-1 siRNA的實驗白鼠(c5；c6)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量最低，約為20%；而於第二次注射前14天注射NR1-1 siRNA的實驗白鼠(c7)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為60%；而於第二次注射前21天注射NR1-1 siRNA的實驗白鼠(c8)，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則為99%，約等於對照組實驗白鼠(c1~c4)的表現量。
由上述結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾RNA對於生物個體內NMDA次單元NR1 mRNA表現的抑制能力可以維持7天左右，7天以後，該小段NMDA受體干擾RNA對NMDA次單元NR1 mRNA的抑制將會隨天數的增加而漸減弱；由此可之，將該小段NMDA受體干擾RNA注射至生物個體之皮下組織，可以暫時性抑制該生物個體中皮下組織NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量，而一段時間後，該小段NMDA受體干擾RNA會自行分解，故對NMDA次單元NR1mRNA表現的抑制狀態會逐漸恢復，不會對該生物個體的NMDA受體表現造成永久性的抑制。
請再參照第3c、3d圖所示，係上述c1~c8組實驗白鼠皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量分析試驗。係採樣c1~c8組實驗白鼠之皮膚檢體，抽取該皮膚檢體之蛋白質，同樣係依照上述a.序列試驗 及b.劑量試驗 所採用的分析手段，由西方墨點法進行c1~c8組實驗白鼠皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1蛋白質表現量之分析。本實施例同樣係先將c1~c8組實驗白鼠之皮膚檢體以1:20之比例稀釋於該商用組織蛋白質抽取溶劑，進行均質處理，再利用該商用蛋白質定量套組分析並定量由各組實驗白鼠之皮膚檢體所抽取的蛋白質，取等量蛋白質，利用該抗麩胺酸受體之多株抗體，針對各組實驗白鼠之皮膚檢體進行西方墨點法分析試驗。
由第3c圖結果，4組對照組實驗白鼠(c1~c4)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1的訊號皆較明顯，而其餘c5~c8組實驗白鼠的皮膚檢體中，該NMDA受體次單元NR1的表現量係依照該NR1-1 siRNA注射的時間而有明顯差異，於第二次注射前3、7天注射該NR1-1 siRNA的2組實驗白鼠(c5；c6)，NMDA受體次單元NR1的表現量明顯較少；由上述該相對定量方式比較(如第3d圖)，該對照組實驗白鼠的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量係為90%，而第c5~c8組實驗白鼠，皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量分別為10%(c5)、>10%(c6)、60%(c7)及>100%(c8)。
上述結果顯示，本發明之小段NMDA受體干擾RNA對於NMDA受體次單元NR1蛋白質表現的抑制能力約可以維持7天左右，而7~14天之後，該小段NMDA受體干擾RNA對NMDA受體次單元NR1蛋白質表現的抑制現象將會隨天數的增加而漸減弱；因此，將該小段NMDA受體干擾RNA注射至一生物個體之皮下組織，可以暫時性抑制該生物個體中皮下組織NMDA受體次單元NR1之蛋白質表現量，而一段時間後，該生物體內NMDA受體NR1之蛋白質表現即逐漸恢復，不會對該生物個體內NMDA受體之基因表現造成永久性的抑制而影響其正常功能。
由上述c.作用時間試驗 的結果證實，本發明依照NMDA受體次單元之基因序列所設計的小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1 siRNA)，可暫時性抑制NMDA受體次單元NR1之基因表現，而使該NMDA受體次單元NR1之功能在一定時間內無法正常表現；因此，將該小段NMDA受體干擾RNA注射於該生物個體之皮下組織，可以暫時性的影響該生物個體之皮膚在接觸一刺激物時，由皮下組織NMDA受體次單元傳遞引發之疼痛反應，使該生物個體所能感受之疼痛程度下降。另外，該小段NMDA受體干擾RNA可以在生物個體內自行分解，因此一段時間後，該小段NMDA受體干擾RNA對於該生物個體內皮下組織NMDA受體次單元之基因表現的抑制現象係逐漸減緩，而該生物體內NMDA受體次單元之表現及功能皆可以逐漸回復，不會對該生物個體之正常功能造成負面影響。
完全佛氏佐劑(complete Freund’s adjuvant；CFA)刺激試驗：
完全佛氏佐劑刺激試驗係於1998年在神經科學年會上所提出，為一種持續炎症性疼痛之研究模式，係於實驗白鼠之後腳掌底部注射完全佛氏佐劑，觀察該實驗白鼠在研究模式中所反應的發炎、疼痛現象；該完全佛氏佐劑係一種刺激性化學藥劑，可引發皮膚持續性的疼痛及炎症性反應，將該完全佛氏佐劑注射至實驗白鼠之後腳掌底部，可誘發該實驗白鼠產生持續性的發炎而引發高度痛覺過敏(hyperalgesia)，係與臨床皮膚創傷病患所產生之疼痛情況類似，經前人研究報導，由該完全佛氏佐劑所引發實驗白鼠產生之高度痛覺過敏係與NMDA受體的活化相關。
請參照第4圖所示，係將本發明之小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1 siRNA)、MM-NR1-1 siRNA、100微升生理食鹽水及2微升聚乙烯胺溶液分別注射至d1~d4組實驗白鼠之後腳掌，係為第一次注射，其中，該NR1-1 siRNA係於注射時混合一定體積之注射載劑，本實施例係將1nmole混合2μL聚乙烯胺溶液進行注射；該d1~d4組實驗白鼠於第一次注射後兩天，再次接受第二次注射，係於d1~d4組實驗白鼠之後腳掌注射該完全佛氏佐劑(0.1mL；Sigma)，其中，於第一次注射聚乙烯胺溶液及生理食鹽水之2組實驗白鼠(d1；d2)係為實驗對照組，詳細注射情況如下方第7表所示。本實施例所採用之實驗白鼠，於試驗期間所接受之飲食、飼養環境皆按照一般實驗室之飼養標準，並且於試驗前兩天即將d1~d4組實驗白鼠置於既定試驗環境，以確保該實驗白鼠對於該試驗環境之適應性。
該d1~d4組實驗白鼠於第一次注射後，隨即進行滾輪試驗，觀察d1~d4組實驗白鼠之運動協調性(紀錄於第4a圖)；而兩天後再接受完全佐劑刺激試驗。本實施例係採用一商用完全佛氏佐劑(0.1mL；Sigma)進行注射，d1~d4組實驗白鼠係於兩次注射後分別觀察體內NMDA受體次單元NR1基因表現量(紀錄於第4b圖)及CFA發炎試驗(紀錄於第4c圖)。
請參照第4a圖所示，該滾輪試驗係將實驗白鼠置於一轉動滾輪上，設定一固定轉速，如12~40rpm/分鐘，則該實驗白鼠需要持續跑動，維持平衡，以避免從該轉動滾輪上落下，由測定該實驗白鼠由轉動滾輪上掉落的時間，可以判定該實驗白鼠之運動協調度。本實施例係將d1~d4組實驗白鼠依序置於一旋桿平衡測定儀(from Ugo Basile)，先以一低轉動速度，較佳係12rpm/分鐘，進行30秒之轉動訓練，使d1~d4組實驗白鼠可以熟悉轉動模式，再調整轉速至一高轉動速度，較佳係40rpm/分鐘，計算該實驗白鼠由旋桿平衡測定儀掉落的時間。
由第4a圖結果，該對照組實驗白鼠(第一次注射聚乙烯胺及生理食鹽水之2組；d1、d2)由高速轉動(40rpm/分鐘)之旋桿平衡測定儀上所掉落的時間約為50秒左右，而第一次注射本發明MM-NR1-1及NR1-1之實驗白鼠(d3；d4)，由該旋桿平衡測定儀上所掉落的時間則分別為>50秒及45~46秒左右。由結果顯示，注射本發明MM-NR1-1及NR1-1之實驗白鼠(d3；d4)於滾輪試驗結果與2組對照組差異甚小，由此可得知本發明之MM-NR1-1及NR1-1不會對實驗白鼠的運動協調平衡功能造成影響；因此，注射本發明之小段NMDA受體干擾RNA，不會對生物個體造成運動協調度之異常。
請參照第4b圖所示，係4組實驗白鼠(d1~d4)於第二次注射後皮膚檢體之NMDA受體次單元NR1 mRNA表現分析。本實施例係於4組實驗白鼠(d1~d4)接受第二次注射後，採樣4組實驗白鼠之皮膚檢體，以該商用RNA抽取套組抽取該皮膚檢體之total RNA，由該商用DNA反轉錄套組將4組實驗白鼠皮膚檢體之total RNA反轉錄為DNA，以進行即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析試驗；本實施例係以該NR1引子對(正股Fwd. 5'-GCG ACT CCC GCA GCA AT-3'；反股Rev. 5'-CCC CTG CCA TGT TCT CAA AA-3')為作用引子對，由ABI Prism 7500 Sequence Detection System進行即時聚合酶連鎖反應，比較4組實驗白鼠之皮膚檢體中NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量。
由第4b圖結果，該對照組實驗白鼠(d1；d2)的皮膚檢體中，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量係為≧100%，第d3組實驗白鼠，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量僅略低於100%，而d4組實驗白鼠，NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量則係明顯低於其他d1~d3組實驗白鼠，約為20%左右。由此再次證實，本發明之小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1 siRNA)，因其核醣核酸序列與該實驗老鼠NMDA受體次單元NR1之基因序列(U11418)同源，因此可以抑制該實驗白鼠NMDA受體次單元NR1之mRNA表現量；而該MM-NR1-1 siRNA之核醣核酸序列不與老鼠NMDA受體次單元NR1之基因序列同源，故未有抑制該NR1之mRNA表現情形發生。
請參照第4c圖所示，該d1~d4組實驗白鼠係於該第二次注射(CFA注射)前一天先測定其基礎疼痛閾值(baseline)，再於第二次注射後一天，再次刺激d1~d4組實驗白鼠之後腳掌，觀察d1~d4組實驗白鼠因後腳掌再次受到刺激而產生腿部收縮的反應強度，以推算其疼痛閾值，同時比較4組實驗白鼠於第二次注射前後，疼痛閾值之變化。
本實施例係在第二次注射前一天，分別在d1~d4組實驗白鼠後腳掌之固定位置施予一穩定刺激，該穩定刺激可以係一針刺或熱刺激，較佳係一物理針刺[如von Frey hairs(Stoelting，Wood Dale，IL)]，該穩定刺激所持續之時間約為4~5秒/次，而該穩定刺激之刺激程度係以對數增值之方式逐漸遞增，如0.6，1，1.4，2，4，6，8，10，15及26克/次，觀察d1~d4組實驗白鼠因刺激而反應之力量強度，依照Dixon在1980所提出的上下估量法(up and down methods)計算d1~d4組實驗白鼠之疼痛閾值，係為基礎疼痛閾值。而第二次注射後一天，則依照上述方式，再次對該d1~d4組實驗白鼠施予該穩定刺激，定且計算d1~d4組實驗白鼠所反應之疼痛閾值。
由第4c圖結果，d1~d4組實驗白鼠於第二次注射前所測得之基礎疼痛閾值約為10~12公克/次，而試驗對照組(d1；d2)與注射本發明MM-NR1-1 siRNA或NR1-1 siRNA之實驗白鼠(d3；d4)所表現的基礎疼痛閾值，沒有明顯差異；而第二次注射後，試驗對照組以及注射本發明MM-NR1-1 siRNA之實驗白鼠(d3)，所表現的疼痛閾值明顯較該基礎疼痛閾值為低，約為2公克/次，而注射本發明NR1-1 siRNA之實驗白鼠(d4)，所表現之疼痛閾值雖仍較該基礎疼痛閾值為低，約明顯高於其他d1~d3組實驗白鼠，為7.5公克/次左右。該結果顯示，經由CFA刺激後，該實驗白鼠之受創部位係產生持續發炎現象，而使該受創部位呈現高度痛覺敏感，故疼痛閾值明顯下降，而本發明之小段NMDA受體干擾RNA，係可以抑制該實驗白鼠體內NMDA受體NR1之功能，使該實驗白鼠因CFA刺激，活化NMDA受體而產生高度痛覺過敏的現象較為減緩，因此，疼痛閾值下降的程度較輕微，而實驗白鼠所感受疼痛的敏感度也相對較低。
由完全佛氏佐劑刺激試驗 結果，本發明依照NMDA受體次單元之基因序列所設計的小段NMDA受體干擾RNA(NR1-1 siRNA)，可確實抑制緩解一生物個體體內由一持續性發炎反應活化NMDA受體而引發高度痛覺過敏之現象，避免該生物個體之疼痛閾值大幅下降，故該生物個體不會對外界刺激產生過度的疼痛感受；並且，本發明之小段NMDA受體干擾RNA不會對生物個體本身產生任何副作用，不會造成該生物個體在運動平衡方面的影響。
經此證實本發明一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，可確實抑制生物個體之皮下組織NMDA受體之次單元NR1表現，而可以於一定時間內有效影響該生物個體內由皮下組織NMDA受體所參與之痛覺傳導反應，降低皮膚疼痛之感受；因此，本發明一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA以減輕皮膚疼痛之方法可以應用於製備減緩皮膚疼痛之藥物化合物，特別係針對臨床燒傷、燙傷患者因皮膚嚴重創傷而引發之炎症性疼痛及痛覺敏感。本發明之小段干擾RNA，可以以各種藥劑方式給予生物個體，較佳給予途徑係經由注射，較佳給予方式係每7~14天給予一次，較佳給予劑量係1~2奈米莫耳(nmole)；該小段干擾RNA可以係由任何製備方法製成之各種習知造型之注射藥劑或塗抹藥劑，可以含一種或多種所需成分的載劑或輔助藥劑作混合，以製成所需之藥劑形式。
本發明一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，係提供一種小段NMDA受體干擾RNA，具有與NMDA受體次單元NR1之基因同源之序列，可專一性抑制該NMDA受體次單元NR1於轉錄後之基因表現，影響該NMDA受體之功能，係具有可以影響NMDA受體所參與痛覺傳導機制之功效。
本發明係一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA及其抑制皮下組織NMDA受體之方法，係提供一種小段NMDA受體干擾RNA，專一性抑制皮下組織NMDA受體次單元NR1之作用以干擾皮下組織之痛覺傳遞途徑，該小段NMDA受體干擾RNA不會對中樞神經或其他作用因子造成影響，具有避免副作用產生之功效。
本發明係一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA製備用以減輕皮膚炎症性疼痛之藥物化合物的用途，係提供一種小段NMDA受體干擾RNA，可以應用於製備用以減輕皮膚疼痛之藥物化合物，具有改善臨床皮膚創傷患者產生炎症性疼痛及痛覺敏感問題之功效。
本發明係一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，係包含一種小段NMDA受體干擾RNA，可以在7~14天內有效抑制生物個體內皮下組織NMDA受體次單元NR1之表現，減緩皮膚疼痛，具有長效作用之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1a圖：本發明序列試驗之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。
第1b圖：本發明序列試驗之實驗白鼠NR1 mRNA表現量示意圖。
第1c圖：本發明序列試驗之實驗白鼠NR2及Interferon mRNA表現量示意圖。
第1d圖：本發明序列試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量示意圖。
第1e圖：本發明序列試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量又一示意圖。
第2a圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。
第2b圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠NR1 mRNA表現量示意圖。
第2c圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量示意圖。
第2d圖：本發明劑量試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量又一示意圖。
第3a圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠足爪回縮頻率折線圖。
第3b圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠NR1mRNA表現量示意圖。
第3c圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量示意圖。
第3d圖：本發明作用時間試驗之實驗白鼠NR1蛋白質表現量又一示意圖。
第4a圖：本發明滾輪試驗之實驗白鼠掉落時間示意圖。
第4b圖：本發明完全佛氏佐劑刺激試驗之實驗白鼠NR1 mRNA表現量示意圖。
第4c圖：本發明完全佛氏佐劑刺激試驗之實驗白鼠腿部收縮強度示意圖。

Claims (9)

  1. 一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，係具有一NMDA受體次單元NR1之同源性核醣核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，且該小段干擾RNA為21~25個核糖核酸，該小段干擾RNA之序列如序列識別編碼：1及2所示。
  2. 一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，係具有一NMDA受體次單元NR1之同源性核醣核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，且該小段干擾RNA為21~25個核糖核酸，該小段干擾RNA之序列如序列識別編碼：3及4所示。
  3. 一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA，係具有一NMDA受體次單元NR1之同源性核醣核酸序列，用以阻斷該NMDA受體次單元NR1之表現，且該小段干擾RNA為21~25個核糖核酸，該小段干擾RNA之序列如序列識別編碼：5及6所示。
  4. 一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA的用途，係將小段干擾RNA應用於製備用以減輕皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，該小段干擾RNA之序列如序列識別編碼：1及2；3及4；或5及6所示。
  5. 一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，係包含如申請專利範圍第1、2或3項所述之一種抑制NMDA受體NR1之小段干擾RNA及至少一載劑。
  6. 依申請專利範圍第5項所述之一種減緩皮膚炎症性疼 痛之藥物化合物，其中，該抑制NMDA受體NR1小段干擾RNA之劑量係為1~2奈米莫耳(nmole)/單位。
  7. 依申請專利範圍第5項所述之一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，其中，該抑制NMDA受體NR1小段干擾RNA之給予頻率係為7~14天/次。
  8. 依申請專利範圍第5項所述之一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，其中，該載劑係聚乙烯胺。
  9. 依申請專利範圍第5項所述之一種減緩皮膚炎症性疼痛之藥物化合物，其中，該小段干擾RNA與載劑之體積比係為1奈米莫耳(nmole)：2微升(μL)。
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