TW201329239A - 牙齦蛋白酶抑制性原胜肽 - Google Patents

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Stuart Geoffrey Dashper
Noorjahan Laila Huq
Elena Chiew Yeen Toh
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Abstract

本發明係有關於抑制、降低或防止蛋白酶活性之化合物、肽或擬肽及該等化合物、肽或擬肽治療或預防一病況之用途。尤其該病況可為牙周病。該蛋白酶活性可為牙齦蛋白酶的活性。本發明的化合物、肽或擬肽亦可用於辨識蛋白酶抑制劑之分析法中。

Description

牙齦蛋白酶抑制性原胜肽 發明領域
本發明係有關於抑制、降低或防止蛋白酶活性之化合物、肽或擬肽及該等化合物、肽或擬肽治療或預防一病況之用途。尤其該病況可為牙周病。該蛋白酶活性可為牙齦蛋白酶的活性。本發明的化合物、肽或擬肽亦可用於辨識蛋白酶抑制劑之分析法中。
發明背景
牙周病係與細菌相關之牙齒支持組織的炎性疾病，亦為重大的公共衛生問題。幾乎所有人類族群在某種程度上都受到牙周病的影響。1989年的美國口腔健康調查指出，在所研究的人群中之85%患有牙周病。牙周病的主要形式是牙齦炎，其係與牙菌斑在牙齦緣的非特異性堆積相關聯。更具破壞性的牙周病形式(牙周炎)係與由特定革蘭氏陰性細菌所引起的齦下感染相關聯。涉及該疾病的主要細菌病原體係稱作“紅色複合體”，其係由福賽斯坦納菌(Tannerella forsythia)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)及齒垢密螺旋體(Treponema denticola)所組成。牙齦卟啉單胞菌係慢性牙周炎的主要致病原。
牙齦卟啉單胞菌的主要致病性因子係其細胞外半胱胺酸蛋白酶，其等被統稱為牙齦蛋白酶。最常見的是RgpA與RgpB(精胺酸-牙齦蛋白酶)及Kgp(離胺酸-牙齦蛋白 酶)。精胺酸-牙齦蛋白酶係在精胺酸殘基的羧基側剪切蛋白，而離胺酸-牙齦蛋白酶離胺酸殘基的羧基側剪切蛋白。
該等細胞表面的半胱胺酸蛋白酶被認為攸關蛋白質降解作用，而提供其生長所需的肽以及其他固有與非固有的存活與致病性功能。該等存活與致病性功能中之數者可為細菌在宿主組織的附著作用、血球凝集作用及細菌的細胞表面與分泌型蛋白之處理。RgpA與Kgp的催化域可結合成為細胞表面上的一複合體，及具有一系列與非共價結合序列相關的血球凝集素/黏連蛋白域；已顯示RgpB並非以蛋白酶黏連蛋白複合體的一部分存在，而可能僅由催化域所組成。
如同其他半胱胺酸蛋白酶，所合成的牙齦蛋白酶係不活化型；當移除N端的一原胜肽區時，則產生成熟的活性型。牙齦蛋白酶具有高度保守性，及成熟酵素與原胜肽的胺基酸序列揭露其等與其他半胱胺酸蛋白酶的關係較遠。
需要對於涉及不同疾病及尤其是牙周病致病機轉的細菌性酵素之較佳或任擇的抑制劑。
說明書中對於任何先前技術之參考，並非及不應視為認知或以任何形式暗示該先前技術構成澳洲或其他任何管轄區域的一般常識之一部分或可合理地預期該先前技術係經嫻熟本領域技術者確認、瞭解及視為相關。
發明概要
如本發明提供用於抑制、降低或防止一細菌性酵素活性之一化合物、肽或擬肽，該化合物、肽或擬肽係包含牙齦蛋白酶原胜肽或其片段之一胺基酸序列。在一實施例中，該酵素可為一種細胞外蛋白酶。該細胞外蛋白酶較佳為一種半胱胺酸蛋白酶，更佳為一種牙齦蛋白酶。該蛋白酶可為從牙齦卟啉單胞菌之一菌株所衍生的RgpA、RgpB或Kgp。
在特定實施例中，該化合物、肽或擬肽係包含選自由序列辨識編號：1至10(示於圖1中)所組成之群組的一胺基酸序列之一肽或擬肽。
在其他實施例中，該肽或擬肽係包含序列辨識編號：1至10中所示的該等序列之旁系同源與直系同源序列。
在其他實施例中，該肽或擬肽係包含上述胺基酸序列中的保守性取代作用。該等取代作用係如下文中進一步說明。本發明之一肽可為分離型、純化型、富集型、合成型或重組型。
本發明之一肽或擬肽係包括原胜肽或其片段之一種分離型、純化型或重組型胺基酸序列，如在部分的同源牙齦蛋白酶中所天然存在者。在其他實施例中，本發明之肽或擬肽可包括原胜肽或其片段的一種合成性胺基酸序列，及選擇性地具有轉譯後改質作用。
在特定的實施例中，該肽或擬肽係由一胺基酸序列所組成或實質上由其所組成，該胺基酸序列係選自由序列辨識編號：1至10中任一者所組成之群組。
在其他實施例中，本發明之一肽或擬肽係包含一胺基酸序列，其與選自由序列辨識編號：1至28所組成之群組之一胺基酸序列的一致性係至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。較佳係由序列辨識編號：1至10所組成之群組，甚至更佳係由序列辨識編號：1至3所組成之群組。
在其他實施例中，本發明之一肽或擬肽係由一胺基酸序列所組成或實質上由其所組成，該胺基酸序列與選自由序列辨識編號：1至28所組成之群組之一胺基酸序列的一致性係至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在該等實施例中，包括序列辨識編號：1至28以及附加的胺基酸殘基之一化合物、肽或擬肽將“實質上由序列辨識編號：1至28所組成”，只要其展現可依據後述分析法測定之用於抑制、降低或防止一細菌性酵素活性之活性。同樣地，當一化合物、肽或擬肽比對應的序列辨識編號之序列短時，只要其展現如可依據後述分析法測定之用於抑制、降低或防止一細菌性酵素活性之活性，其係“實質上由序列辨識編號：1至28中之一者所組成”。該等實施例因而不包括全長式牙齦蛋白酶序列。較佳，本發明之一化合物、肽或擬肽係由一胺基酸序列所組成或實質上由其所組成，該胺基酸序列與選自由序列辨識編號：1至10所組成之群組的一胺基酸序列之一致性係至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。甚至更佳係由序列辨識編號：1至3所組成之群組。
本發明之一‘化合物’係藉由本文中所述的一分析法確定為抑制劑之一化合物。該化合物可為一蛋白(諸如一抗體或其片段或一抗體模擬物)、肽、核酸(包括RNA、DNA、反義寡核苷酸、肽核酸)、碳水化合物、有機化合物、小型分子、天然產物、庫萃取物或來自體液。
在一些實施例中，本發明之一化合物、肽或擬肽的長度係介於約10個至約300個胺基酸之間。在其他實施例中，該長度係介於約20個與205個之間，或介於約50個與約210個之間。在其他實施例中，該長度係約100至約200個胺基酸。
牙齦卟啉單胞菌係一種格蘭氏陰性細菌，其經演化而在富含蛋白質的厭氧條件下生長。最近已定序出存在於富含蛋白質的厭氧條件或更極端條件之數種其他細菌與古細菌的基因體；該等物種中之一些尚未在試管中培養。該等基因體研究已提供證據顯示，有些蛋白具有與牙齦蛋白酶的序列相似性及與牙齦蛋白酶的原胜肽之顯著序列相似性。如針對原胜肽所預期者，與牙齦蛋白酶原胜肽的顯著序列相似性係存在於N端區，除了在裂解烯烴脫硫桿菌(Desulfatibacillum alkenivorans)AK-01的情況以外。
該等細菌包括：Candidatus Cloacamonas acidaminovorans係存在於眾多厭氧消化槽中的一種互養型細菌；Candidatus Kuenenia stuttgartiensis係一種銨氧化細菌；海洋綠滑菌(Chloroherpeton thalassium)係一種非絲狀、撓曲與滑溜型綠硫細菌及為專性光合生物；裂解烯烴 脫硫桿菌(Desulfatibacillum alkenivorans)AK-01係從河口沉積物所分離的一種減少硫酸鹽之嗜溫菌及其係以C13至C18烷烴類、1-烯烴類(C15與C16)及1-烷醇類(C15與C16)作為生長受質；食油脫硫球菌(Desulfococcus oleovorans)(菌株DSM 6200/Hxd3)係從德國北部油田之油-水分離器的鹽水水層分離出之一種降解烷烴及減少硫酸鹽之細菌(Hxd3係可在厭氧環境及C12至C20烷烴上生長之一種δ-變形桿菌)；及深海發光菌(Photobacterium profundum)，其被歸類為嗜壓生物，因其可在高壓下存活及曾自2500公尺的深度分離出。
來自古細菌超界之二種物種所揭露的序列，亦顯示與牙齦蛋白酶原胜肽的顯著相似性。高溫甲烷菌(Methanosaeta thermophila)係從淹沒的稻田與污水消化池分離出之一種厭氧、嗜熱的專性乙酸營養型產甲烷菌。波尼氏深海嗜酸菌(Aciduliprofundum boonei)係來自深海熱液噴口之一種所培養的專性嗜熱嗜酸廣古菌。
來自該等細菌及顯示與序列辨識編號：1至10之牙齦蛋白酶原胜肽的相似性之原胜肽，係位於本發明的範圍內。該等肽之實例包括但不限於該等具有序列辨識編號：11至28(示於圖2中)的序列者。
在特定實施例中，提供用於抑制一細菌性酵素之一組成物，其包含本發明之一化合物、肽或擬肽及一種藥學上可接受的載劑。該組成物可進一步包括一種二價陽離子。
本發明的一組成物可包括具有不同胺基酸序列之原胜肽，以使得該組成物抑制一種以上的細菌性酵素類型。例如，本發明的一組成物可再包括二種原胜肽及其等各展現對於一特異性牙齦蛋白酶如RgpA或RgpB及Kgp之選擇性。在一實施例中，本發明的一組成物所包括之原胜肽係具有序列辨識編號：1至28及較佳序列辨識編號：1至10中的任一或多種序列。例如，該組成物中的一些原胜肽所具有之一胺基酸序列，係與Kgp所衍生的一原胜肽具有一致性；該組成物的其他原胜肽所具有之一胺基酸序列，係與Rgp所衍生的一原胜肽具有一致性。在本文中已提及序列的一致性水平。
本發明的一組成物係包括從一生物組織或體液純化或富集之一種牙齦蛋白酶原胜肽或其片段。
在一實施例中，提供用於治療或預防本文所述的一或多種病況之一種方法，其包括對於一個體投予一有效量之本發明的化合物、肽、擬肽或組成物。在一實施例中，係將該化合物、肽、擬肽或組成物直接投藥在該個體的牙齦上。
在另一實施例中，本發明的一種方法進一步包括投予一作用劑，該作用劑係選自由消炎劑、抗生素及抗生物膜劑所組成之群組。抗生素可選自由阿莫西林(amoxicillin)、多西環素(amoxicillin)及甲硝唑(metronidazole)所組成之群組。消炎劑包括非類固醇類消炎藥物(NSAID)。NSAID之實例包括抑制環氧合酶之化合物。 NSAID的具體實例包括阿司匹靈、布洛芬(ibuprofen)及萘普生(naproxen)。
在另一實施例中，提供用於治療或緩解一個體的牙周病症狀之一種方法，該方法包括對於該個體投予本發明的一化合物、肽、擬肽或組成物。在另一實施例中，該方法進一步包括投予一蛋白，該蛋白係用於引發對於涉及牙周病起始或進程的細菌之一免疫反應。在一實施例中，該細菌是牙齦卟啉單胞菌。
在另一實施例中，本發明提供一有效量之本發明的一化合物、肽、擬肽或組成物在製備用於治療或預防牙周病及/或本文所確定適合治療的其他病況之一藥劑之用途。
本發明亦提供用於治療或預防牙周病(及/或上文所確定適合治療的其他病況)之一種藥學組成物，其包含一有效量之本發明的一化合物、肽或擬肽及一種藥學上可接受的載劑。該組成物可進一步包括選自由消炎劑、抗生素及抗生物膜劑所組成之群組之一作用劑。該抗生素可選自由阿莫西林(amoxicillin)、多西環素(amoxicillin)及甲硝唑(metronidazole)所組成之群組。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防牙周病(及/或上文所確定適合治療的其他病況)之一組成物，其包含本發明之一化合物、肽或擬肽作為一有效成分。該組成物可進一步包括一種二價陽離子。
在另一實施例中，本發明提供一種藥學組成物， 其包含一有效量之本發明的一化合物、肽或擬肽作為一主要成分。該組成物可用於例如治療或預防牙周病及/或本文所確定適合治療之其他病況。該組成物較佳進一步包含一種二價陽離子。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防牙周病及/或本文所確定適合治療之其他病況之本發明的一化合物、肽或擬肽。
在另一實施例中，本發明提供一組成物，其包含用於治療或預防牙周病之本發明的一化合物、肽或擬肽。該組成物較佳進一步包含一種二價陽離子。
二價陽離子係較佳選自由鋅2+、鈣2+、銅2+、鎳2+、鈷2+、鐵2+、錫2+及錳2+所組成之群組。另外，二價陽離子可與氟化物結合，諸如氟化錫+與氟化銅+。然而，目前較佳的二價陽離子為鈣2+或鋅2+。
二價陽離子相對於肽之比例又較佳位於1.0：2.0至1.0：10.0之範圍，較佳位於1.0：4.0之範圍。
本發明亦提供用於辨識半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之一種分析法，其步驟包括：-在本發明的一化合物、肽或擬肽之存在下，將半胱胺酸蛋白酶與一候選化合物接觸，-判定該候選化合物是否與本發明的化合物、肽或擬肽競爭；其中之競爭作用表示該候選化合物係半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。
本發明亦提供用於辨識半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之一種分析法，其步驟包括：-在一候選化合物存在或不存在下，將半胱胺酸蛋白酶與本發明的一化合物、肽或擬肽接觸，-測定與蛋白酶結合之化合物、肽或擬肽的水平，其中相較於在候選化合物不存在下之情況，若在候選化合物存在下之化合物、肽或擬肽的水平下降，則得以確定該候選化合物係半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。
本發明亦提供用於辨識半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之一種分析法，其步驟包括：-本發明的一化合物、肽或擬肽存在或不存在下，將半胱胺酸蛋白酶與一候選化合物接觸，-測定與蛋白酶結合之候選化合物的水平，其中相較於在化合物、肽或擬肽不存在下之情況，若在化合物、肽或擬肽存在下之候選化合物的水平下降，則得以確定該候選化合物係半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。
本發明亦提供用於辨識半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之一種分析法，其步驟包括：-在容許本發明的化合物、肽或擬肽與半胱胺酸蛋白酶結合之條件下，在一候選化合物存在或不存在下，提供本發明之一化合物、肽或擬肽，-測定與蛋白酶結合之化合物、肽或擬肽的水平，其中相較於在候選化合物不存在下之情況，若在候選化合物存在下之化合物、肽或擬肽的水平下降，則得以確定該 候選化合物係半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。
本發明亦提供用於辨識半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之一種分析法，其步驟包括：-在容許候選化合物與半胱胺酸蛋白酶結合之條件下，在本發明的一化合物、肽或擬肽存在或不存在下，提供一候選化合物，-測定與蛋白酶結合之候選化合物的水平，其中相較於在化合物、肽或擬肽不存在下之情況，若在化合物、肽或擬肽存在下之候選化合物的水平下降，則得以確定該候選化合物係半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。
較佳依據本文中所述步驟，用另一種半胱胺酸蛋白酶及本發明之相同或另外的一化合物、肽或擬肽，分析經確定為半胱胺酸蛋白酶抑制劑之該候選化合物一或多次，以判定該候選化合物是否抑制一或多種半胱胺酸蛋白酶。
候選化合物較佳為一抗體或其片段，或為一抗體模擬物諸如一種抗運轉蛋白。候選化合物可為一庫的一部分；在該情況下，該分析法係以高通量方式進行。
半胱胺酸蛋白酶較佳為一種牙齦蛋白酶，更佳為Kgp、RgpA或RgpB。該牙齦蛋白酶甚至更佳為Kgp。
已在本文界定適用於本發明的一分析法中之本發明的一化合物、肽或擬肽。本發明的化合物、肽或擬肽較佳包含一胺基酸序列，其與選自由序列辨識編號：1至28所組成之群組之一胺基酸序列的一致性係至少60、70、80、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。較佳係由序列辨識編號：1至10所組成之群組，甚至更佳係由序列辨識編號：1至3所組成之群組。在其他實施例中，本發明之一化合物、肽或擬肽係由一胺基酸序列所組成或實質上由其所組成，該胺基酸序列與選自由序列辨識編號：1至28所組成之群組之一胺基酸序列的一致性係至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。
在一實施例中，本發明提供本發明的一化合物、肽或擬肽供用於本發明的一分析法中。在一實施例中，本發明提供當用於本發明的一分析法中之本發明的一化合物、肽或擬肽。在一實施例中，本發明提供經標記用於本發明的一分析法中之一化合物、肽或擬肽。
本發明亦提供一種重組或合成蛋白，其係由Kgp的催化域之一胺基酸序列所組成或實質上由其所組成。換言之，由Kgp的催化域之一胺基酸序列所組成之蛋白並不與一黏連蛋白域連接或交互作用。
在一實施例中，本發明提供由Kgp或Rgp的催化域之一胺基酸序列所組成或實質上由其所組成之重組或合成蛋白在本發明的一分析法中之用途，以辨識較佳為Kgp或Rgp的半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。在一實施例中，本發明提供當用於本發明的一分析法中之由Kgp或Rgp的催化域之一胺基酸序列所組成或實質上由其所組成之重組或合成蛋白，以辨識較佳為Kgp或Rgp的半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。
本發明亦提供藉由本文所述的一分析法所辨識之一化合物在抑制半胱胺酸蛋白酶之用途。半胱胺酸蛋白酶較佳為Kgp或Rgp。半胱胺酸蛋白酶甚至更佳為Kgp。在一實施例中，本發明亦提供一化合物在治療或預防牙周病之用途，該化合物係藉由本文所述的一分析法確定為抑制劑。
本發明亦提供治療或預防牙周病及/或本文所確定適合治療或預防之其他病況之一種方法，包括投予本發明的一肽或擬肽及/或藉由本文所述的一分析法確定為半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之一化合物。
因其等的蛋白酶抑制性活性係由肽的物理性質而非該肽的特異性序列所導致，故可在肽序列中進行所謂的保守性取代作用，而不造成活性大幅損失。在本發明中意欲涵蓋該等不造成活性大幅損失之保守性取代作用。
雖然嫻熟本領域技術者充分理解上文所提及之保守性取代作用的概念，為了清楚起見，保守性取代作用係如下所載列者。甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸；天門冬胺酸、麩胺酸；天冬醯胺酸、麩醯胺；丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸、組胺酸；苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、組胺酸；及脯胺酸、Nα-alkalamino acids。
除非文意另有所指，如本文所用之“包含”一詞及該詞的變體，諸如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”及“包含(comprised)”，並非意欲排除其他添加劑、組分、整數或步驟。
圖1：來自牙齦卟啉單胞菌的不同菌株之牙齦蛋白酶原胜肽的胺基酸序列。
圖2：來自牙齦卟啉單胞菌以外的細菌之原胜肽的胺基酸序列。
圖3：來自牙齦卟啉單胞菌Kgpcat △ABM1突變體ECR368培養上清液之經脫鹽、丙酮沉澱的蛋白之離子交換層析法，其係使用與AKTA基礎型FPLC系統連接之Q-瓊脂糖凝膠(Sepharose)管柱。用pH 5.3的10 mM乙酸鈉洗提管柱，然後施加0至1M氯化鈉於10 mM乙酸鈉中的線性梯度。在280奈米吸光度監測洗提液。測量所收集的分液之具離胺酸特異性與具精胺酸特異性的蛋白質分解活性。將含有離胺酸活性之分液匯合收集供進一步純化。
圖4：在脫鹽後，使用與AKTA基礎型FPLC系統連接之Superdex G75管柱進行ECR368培養上清液的濃縮試樣之凝膠過濾純化作用。使用pH 8.0的TC50緩衝液，以1.0毫升/分鐘洗提管柱。在280與215奈米吸光度監測洗提液。分液A8-A9含有活性Kgpcat△ABM1。
圖5：來自牙齦卟啉單胞菌ECR368的Kgpcat△ABM1富集 型分液之SDS-PAGE。各道含有：第1道為See-Blue®預染標準，其中標明以kDa為單位之尺寸；第2道為培養上清液；第3道為丙酮沉澱後之培養上清液；第4道為丙酮沉澱與超離心後之培養上清液；第5道為經凝膠過濾純化之Kgpcat △ABM1富集型分液。凝膠係經Coomassie®染色。
圖6：(A)rKgp原胜肽之凝膠過濾層析法，其係使用與AKTA基礎型FPLC系統連接之Superdex G75管柱，及經50 mM碳酸氫銨平衡。在280與215奈米吸光度監測洗提液。(B)仍連接著組胺酸標籤的rKgp原胜肽之MALDI-TOF質譜分析，顯示一個單電荷(m/z 25,446.9[M+H]+)、一個雙電荷(m/z 12728.8[M+2H]2+)及一個三電荷(m/z 8486.5[M+3H]3+)訊號，各對應於標的分子質量(25,285道爾頓)。
圖7：在使用顯色GPKNa受質的分析法中，在1 mM半胱膠酸及使用20.0與40.0毫克/公升的rKgp原胜肽(rKgpPro)之Kgpcat△ABM1富集型分液的蛋白質分解活性(單位/毫克)。每孔的Kgpcat△ABM1富集型分液之最終濃度為1.16毫克/公升。所有試樣皆與對照組顯著不同(p<0.05)。
圖8：經使用顯色受質GPKNa之蛋白質分解分析法確認，受質水解速率在整個分析過程中皆為線性。在使用顯色GPKNa受質的分析法中，在1 mM半胱胺酸及使用0毫克/公升()與40.0毫克/公升的rKgp原胜肽(rKgpPro)()之Kgpcat△ABM1富集型分液的蛋白質分解活性(單位/毫克)。每孔的Kgpcat△ABM1富集型分液之最終濃度為1.16毫克/公升。受質水解速率在整個分析過程中皆為 線性。
圖9：培養後的混合物之顯色分析法(GPKNa)的RP-HPLC廓型，該混合物係施加至一分析級RP-HPLC管柱(C18)，及在30分鐘內以1.0毫升/分鐘的流速使用0至100%緩衝液B的線性梯度洗提。在214奈米檢測洗提液。(A)不具有原胜肽的Kgpcat△ABM1富集型分液之培養混合物；(B)Kgpcat△ABM1富集型分液與rKgp原胜肽之培養混合物。
圖10：藉由SDS-PAGE分析具離胺酸特異性之顯色分析(GPK-NA)產物。進行下列分析內容之電泳：具有rKgp原胜肽(rKgpPro)之Kgpcat△ABM1富集型分液(第2道)。第1道顯示分子量(MW)標記(See-Blue®預染標準，第1道)，其係以kDa為單位標記。凝膠係經Coomassie®染色。
圖11：藉由rKgp原胜肽估算Kgpcat△ABM1富集型分液的抑制常數(Ki’)之二級圖。將Vmax觀測值相對於抑制劑濃度繪圖。Kgp原胜肽的Ki’經計算為2.01 μM。
圖12：使用螢光性BSA受質(DQTMBSA)與1、5及10毫克/公升的rKgp原胜肽(rKgpPro)所測量之Kgp蛋白質分解活性。每孔的Kgp最終濃度為1.16毫克/公升。自各數值減去負對照組(經1 mM的TLCK處理之蛋白酶)的螢光數值。按3至6重複的標準偏差計算誤差槓。所有試樣皆與對照組顯著不同(p<0.05)。
圖13：藉由SDS-PAGE分析螢光性BSA分析產物。凝膠係經Coomassie®染色。(A)進行下列分析內容之電泳：Kgpcat△ABM1富集型分液(來自位於第2至3道之對照組各 孔)；具有rKgp原胜肽(rKgpPro)之Kgpcat△ABM1富集型分液(第4至5道)。第1道顯示分子量(MW)標記(See-Blue®預染標準，第1道)，其係以kDa為單位標記。(B)如下進行來自分析法的試樣之電泳；Kgpcat△ABM1富集型分液(Kgp)(來自位於第2至3道之對照組各孔)；具有rKgp原胜肽(rKgpPro)之Kgpcat△ABM1富集型分液(第4至5道)；具有TLCK之Kgpcat△ABM1富集型分液(第6至7道)。MW係指分子標記(See-Blue®預染標準，第1道)，其中標明以kDa為單位之尺寸。
圖14：使用DQ-BSA螢光性受質之RgpB蛋白質分解活性的時間歷程。在37℃測量螢光達11小時，及每小時讀取測量值一次。
圖15：使用螢光性BSA受質(DQTMBSA)及0.1、1、5、10毫克/公升的rRgp原胜肽(rRgpPro)所測量之RgpB蛋白質分解活性。每孔RgpB的最終濃度為1.16毫克/公升。自各數值減去負對照組(經1 mM的TLCK處理之蛋白酶)的螢光數值。按3至6重複的標準偏差計算誤差槓。所有試樣皆與對照組顯著不同(p<0.05)，除了使用0.1毫克/公升所得的數值以外；及與其他組別的數值不同，除了使用5與10毫克/公升的二組所得之數值以外。
圖16：藉由RgpB原胜肽估算RgpB富集型分液的抑制常數(Ki’)之二級圖。將Vmax觀測值相對於抑制劑濃度繪圖。RgpB原胜肽的Ki’經計算為11.8 nM。
圖17：在rRgpB原胜肽(R-pp)及/或Kgp原胜肽(K-pp)之 存在下，牙齦卟啉單胞菌在一種蛋白式基本培養基中之相對生長作用。
實施例之詳細說明
現在將詳細參照本發明的特定實施例。雖然本發明係連同實施例說明，應瞭解其意圖並非將本發明侷限於該等實施例。反之，本發明係意欲涵蓋由申請專利範圍所界定之本發明的範圍內可包括之所有任擇方案、改質作用及等效物。嫻熟本領域技術者將知悉與本文所述者類似或等效之可用於施行本發明的多種方法與材料。本發明絕非受限於所述之方法與材料。
將瞭解在本說明書中所揭露與界定之本發明，係擴及所提及或從內文或圖式中顯而易見的二或多項個別特性之所有任擇組合。所有的該等不同組合係構成本發明的各種任擇方面。嫻熟本領域技術者將瞭解，如具體實施例中所示，可進行本發明的多種變化及/或改質作用，而不偏離本發明之如廣義說明的精神與範圍。本實施例因此在所有方面係視為說明性而非限制性。
在本文中所提及的所有專利與公開案係在此完整地併入本案以為參考資料。在本說明書中所包括之有關文件、法令、材料、裝置、物件之類，係純粹為了提供本發明景況之目的。不應視為承認該等事項中之任一或所有者，在本申請案的各項申請專利範圍之優先權日之前，構成在澳洲或他處所存在之先前技術的部分基礎或本發明相 關領域中的一般常識。
展現蛋白酶抑制性活性之化合物、肽或擬肽具有研發用於口腔護理、功能性食品及醫藥品之潛力。本發明所包括的肽之特徵在於抑制細胞外蛋白酶活性之能力。該等肽可由合成方式產生或藉由重組方式表現。該等肽具有數項優點，包括但不限於其等的無毒性、生物可相容性及係衍生自同源的酶原。
如本文所用之“原胜肽”係位於催化域N端的一胺基酸序列，當從牙齦蛋白酶剪切而使其不再與牙齦蛋白酶連接時，造成牙齦蛋白酶的催化性活性之顯著增加。
本發明亦包括序列辨識編號：1至28的胺基酸序列之功能性片段。一功能性片段係比對應於序列辨識編號：1至28的胺基酸序列短之一胺基酸序列，但仍保有序列辨識編號：1至28的對應胺基酸序列之功能。可藉由縮短胺基酸序列而輕易地測定功能性片段，例如使用肽鏈端解酶，或藉由合成長度較短的胺基酸序列，然後試驗是否存在任何蛋白酶抑制性活性。
對應於直系同源或旁系同源序列之序列辨識編號：1至3的胺基酸序列變異體，亦位於本發明的範圍內。該等序列的實例係包括序列辨識編號：4至28中所示者。
嫻熟本領域技術者將瞭解可對於由序列辨識編號：1至28中之任一者所界定的胺基酸序列進行一或多種胺基酸刪除作用，而不會喪失該化合物、肽或擬肽抑制、降低或防止蛋白酶活性之能力。可進行實驗及包括本文中所 述者，來測定當一化合物、肽或擬肽藉由一或多種胺基酸刪除作用而具有不同於序列辨識編號：1至28中之任一者的一胺基酸序列時，是否仍可抑制、降低或防止蛋白酶活性。
可將本發明的化合物、肽、擬肽或組成物直接投藥至需治療或預防牙周病之個體的牙齦。其中較佳為本發明的組成物之局部投藥作用；然而嫻熟本領域技術者將理解，一化合物、肽、擬肽或組成物亦可依非經腸方式投藥，如藉由靜脈內、腹膜內、肌內、脊椎內或皮下注射作用。
在一實施例中，該化合物、肽或擬肽可為適用於口腔的一組成物之一部分，諸如潔牙劑及包括牙膏、牙粉與液體潔牙劑、漱口水、口含錠、口香糖、牙糊膏、牙齦按摩霜、漱口錠、乳製品及其他食品。
任擇地，可將本發明的化合物、肽、擬肽配製成供口(包括舌下與口頰)投藥、肺部投藥(鼻內與吸入作用)、經皮膚投藥及直腸投藥用之一組成物。
酵素抑制作用可為競爭性或非競爭性。在不希望受任何理論或作用模式約束之前提下，據信原胜肽係非競爭性抑制劑，其在與一標的酵素的催化性位點結合方面，係不和受質競爭。據信原胜肽係在催化性位點以外的一位點與酵素結合。
本發明的一組成物可包括本發明的一肽或擬肽及經確定為一細菌性酵素諸如半胱胺酸蛋白酶的催化性位點之抑制劑之一化合物。半胱胺酸蛋白酶較佳為牙齦蛋白酶，諸如Kgp或Rgp。在一實施例中，該組成物包括本發明 的一肽或擬肽及一化合物，該化合物係經確定為本發明的肽或擬肽所抑制的酵素之競爭性抑制劑。
雖然發現本發明可應用於人類，本發明亦適用於獸醫學用途。本發明係適用於家畜或農場動物諸如牛、羊、馬及家禽；適用於寵物諸如貓與狗；及適用於動物園動物。
需要治療的一個體可為展現牙周病的亞臨床或臨床症狀者。牙周病的亞臨床或臨床表現形式係包括急性或慢性牙齦發炎。可能存在的急性發炎特徵包括血漿與白血球從血液至受傷組織之移動增加。亦可能存在的牙齦急性感染之臨床徵象包括rubor(發紅)、calor(灼熱)、tumor(腫脹)、dolor(疼痛)及functio laesa(功能下降)。慢性發炎之特徵可能在於白血球細胞(單核白血球、巨噬細胞、淋巴細胞、血漿細胞)浸潤。可能觀察到組織與骨質流失。需要治療的一個體之特徵亦可能在於其牙周位點所存在的牙齦卟啉單胞菌細菌水平增加，及高於無牙周病個體中所觀察到的正常範圍。
投藥途徑可能依數項因子而定，包括待投藥的化合物、肽、擬肽或組成物之性質及個體病況的嚴重性。據瞭解本發明的一化合物、肽、擬肽或組成物之投藥頻率及本發明的化合物、肽、擬肽或組成物之投藥量可能因個體而異，及除了其他事項外，尚依該個體的牙周病起始或進程分期而定。投藥頻率可由臨床醫師決定。
亦設想由牙齦蛋白酶或相關蛋白酶的蛋白酶活性所造成或與其相關聯之任一疾病、病況或症侯群，及其 等可藉由本發明的一化合物、肽、擬肽或組成物預防或治療。另外，由牙齦蛋白酶或相關蛋白酶的蛋白酶活性所造成或與其相關聯之疾病、病況或症侯群的一症狀，可藉由本發明的一化合物、肽、擬肽或組成物降低其嚴重性或發病率。此外，亦可治療由牙周病所造成或與其相關聯之其他疾病、病況或症侯群，或降低罹患該等疾病、病況或症侯群之風險。例如，牙周病可能增加一個體罹患心血管疾病之風險。可藉由對於患有牙周病的個體投予本發明的一化合物、肽、擬肽或組成物來治療牙周病，而將所增加之罹患心血管疾病的風險降低。
用以辨識半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之一種代表性分析法，係“競爭性結合分析法”或“競爭作用結合分析法”。競爭性結合分析法係血清分析法，其中未知物(如候選化合物)係藉由其等抑制一種經標記的已知化合物與其特異性標的結合之能力而進行檢測與定量。本文中所用之經標記的已知化合物可為本發明之一化合物、肽或擬肽及當其用於免疫分析法時，可經標記或未經標記。一種經標記的化合物、肽或擬肽可用於採用種類繁多的標記之各式各樣的分析法中。可藉由將一種可檢測性物質連接至化合物、肽或擬肽上，而促進對於本發明的一化合物、肽或擬肽與一種半胱胺酸蛋白酶之間的化合物-標的複合體形成作用之檢測。適宜的檢測方式包括使用標記，諸如放射性核苷酸、酵素、輔酶、螢光劑、化學發光劑、色素原、酵素受質或輔因子、酵素抑制劑、輔基複合體、自由基、顆 粒、染料之類。該等經標記的試劑可用於多種眾所周知的分析法中，諸如放射性免疫分析法、酵素免疫分析法如ELISA、螢光性免疫分析法之類。例如參見第3,766,162號、第3,791,932號、第3,817,837號及第4,233,402號美國專利。
競爭作用分析法係技藝中所知。競爭性分析法係廣泛用於不同的用途，諸如促效劑/拮抗劑與一受體之交互作用或用於分析所感興趣的一藥物之濃度。在一實例中，使用預塗佈在一微量平皿上之一種親和性純化捕捉抗體，及對其同時添加一有限濃度之與酵素連接的分析物以及未經標記的試樣分析物。該二分析物然後競爭初級抗體上之有限數目的結合位點。添加受質及藉由酵素進行水解，以使得產生可被測量的一種彩色產物(正如ELISA)。所結合之標記分析物的量係與呈現該試樣之未標記分析物的量成反比(訊號係隨著分析物濃度增加而減少)。
候選化合物可為希望試驗的任一化合物，包括但不限於蛋白類(諸如抗體或其片段或抗體模擬物)、肽、核酸(包括RNA、DNA、反義寡核苷酸、肽核酸)、碳水化合物、有機化合物、小型分子、天然產物、庫萃取物、體液。候選化合物可為一庫的一部分，例如含有變異作用或改質作用的化合物之集合。
抗體模擬物或任擇的免疫球蛋白分子之非限制性實例係包括Dimitrov於2009年期刊“MAbs”第1期第26-28頁乙文中所述者；而非免疫球蛋白的蛋白質鷹架之實例係述於Skerra於2007年期刊“Current Opinions in Biotechnology”第18期第295-304頁乙文中。
抗運轉蛋白在結構上與抗體不相關，但為一種抗體模擬物類型之蛋白。抗運轉蛋白係衍生自人類載脂蛋白，人類載脂蛋白係一個結合蛋白家族。抗運轉蛋白約比抗體小八倍，其大小約為180個胺基酸及質量約為20 kDa。
抗運轉蛋白的組織滲透性係優於抗體及在高達70℃的溫度仍然安定。不同於抗體，其等可在細菌細胞如大腸桿菌(E.coli)中大量產生。
本發明的分析方法包括應用高通量篩選。例如，可使用包含如本發明的任一分析法之高通量篩選分析法，其中半胱胺酸蛋白酶的等分試樣係暴露於多孔式平皿的不同孔中之多種候選化合物。此外，如本揭露內容之高通量篩選分析法係涉及半胱胺酸蛋白酶的等分試樣，其暴露於任何類型的小型化分析系統中的多種候選化合物。
本揭露內容的方法可藉由任一可接受的小型化方法，而在一分析系統中予以“小型化”，其包括但不限於多孔式平皿，諸如24孔、48孔、96孔或384孔式平皿、微晶片或載玻片。該分析法可將微晶片載體上待進行的尺寸縮小，及有利地涉及較少量的試劑與其他物質。有利於高通量篩選之該方法的任何小型化作用，係位於本發明的範圍內。
在本發明之前，並無可靠的分析法可用於辨識半胱胺酸蛋白酶之抑制劑。本案發明者的研究工作導致生產分離型牙齦蛋白酶原胜肽，及其等保有抑制牙齦蛋白酶活 性之能力。在分析法中可使用該等原胜肽，以引導辨識不僅與半胱胺酸蛋白酶結合並且抑制半胱胺酸蛋白酶活性之化合物。所辨識出之半胱胺酸蛋白酶活性的該等抑制劑，然後可在臨床環境中用於治療涉及半胱胺酸蛋白酶活性之疾病。任擇地，可對於所辨識出的抑制劑進行最佳化作用，以提高其對於一種半胱胺酸蛋白酶之親和性及/或抑制性活性。
本發明的分析法亦容許辨識對於一特定類型的半胱胺酸蛋白酶具有抑制性活性之抑制劑。可在不同的半胱胺酸蛋白酶存在下，重複分析一候選化合物，以判定該候選化合物是否僅抑制一種半胱胺酸蛋白酶類型，或者對於一種以上的半胱胺酸蛋白酶類型具有抑制性活性。例如一種Kgp或一種Kgp類牙齦蛋白酶，或任擇地抑制一種Rgp或Rgp類牙齦蛋白酶。
與半胱胺酸蛋白酶結合之本發明的標記化合物、肽或擬肽之濃度，係與該候選化合物在結合分析法中的競爭能力成反比。相反地，若標記該候選化合物，則本發明的一化合物、肽或擬肽在結合分析法中之競爭能力，係表示該候選化合物所結合的半胱胺酸蛋白酶區域係與牙齦蛋白酶原胜肽相似。
在篩選分析法中亦可包括其他多種試劑。該等試劑例如包括用於促進最佳的蛋白-蛋白結合作用及/或降低非特異性或背景交互作用之鹽類、中性蛋白如白蛋白、清潔劑等。可使用提高分析法效率之試劑，諸如蛋白酶抑制 劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。該等組分的混合物係依提供所需結合作用之任一順序添加。培養作用係在任一適宜溫度進行，典型地介於約0至約40℃之間，較佳為20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃。培養期間係選自約0.05至約10小時。該培養期間較佳足以讓分析法中所發生的分子交互作用達到平衡。
本發明亦提供用於產生本發明的一肽之方法。在一個較佳實施例中，該方法包括下列步驟：(1)在一適當的原核或真核表現系統中表現一核酸，該核酸係編碼如序列辨識編號：1至28中的任一者之一肽；及(2)分離或純化所表現的肽。
該方法較佳進一步包括產生編碼本發明的一肽(例如序列辨識編號：1至28中的任一者)之一核酸之先前步驟，該核酸係經改質，以使得該肽中的一已知或預期的剪切位點失去活性。離胺酸與精胺酸殘基係成熟的牙齦蛋白酶處理過程中之預期的自剪切位點，因此使用抑制或降低剪切作用的胺基酸例如麩醯胺與天冬醯胺酸，來置換該等或其他剪切位點之胺基酸序列與編碼其等的核酸序列，係位於本發明的範圍內。
表現系統係分子生物學技藝中眾所周知的，用於分離與純化所表現的蛋白之方法亦然。
例如可將編碼本發明的一肽之核酸分子插入適用於生產該肽的一表現載體中，及將該表現載體插入一原核或真核宿主細胞。重組肽若要成功地表現，則該表現載 體需要含有轉錄作用與轉譯作用所需的調控元素，該等調控元素係與供表現用的特定宿主細胞系統相容及為其等所辨識。可使用多種宿主細胞系統來表現該重組蛋白，其包括但不限於經噬菌體載體、質體載體或黏接質體DNA轉形之細菌；含有酵母載體之酵母；含有真菌載體之真菌；經病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞株；及經質體或病毒表現載體轉染或經重組病毒(如牛痘病毒、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒等)感染的的哺乳類動物細胞株。
使用分子生物學技藝中所知的方法，可在表現載體中納入各種啟動子與增強子，以提高重組肽的表現作用，前提在於所提高的胺基酸序列表現作用係與所用的特定宿主細胞系統相容(例如不具毒性)。
啟動子之選擇將依所用的表現系統而定。啟動子的強度亦即促進轉錄作用的能力不同。一般而言，最好使用強啟動子，以獲得編碼核苷酸序列的高轉錄水平及表現成為重組蛋白。例如，已在包括大腸桿菌(E.coli)在內的宿主細胞系統中觀察到高轉錄水平之技藝中所知的細菌、噬菌體或質體啟動子，係包括lac啟動子，trp啟動子、recA啟動子、核糖體RNA啟動子、PR與PL啟動子、lacUV5、ompF、bla、lpp之類，其等可用於轉錄所插入的編碼胺基酸序列之核苷酸序列。
供高效率轉錄作用或轉譯作用所用之其他控制元素，係包括增強子及調控訊號。增強子序列係似乎提高轉錄效率之DNA元素，而其等的方式係與其等相對於附近 的一編碼核苷酸序列之位置與定向相對無關。因此，依所用的宿主細胞表現載體系統而定，可將一增強子置於所插入的編碼序列之上游或下游，來提高轉錄效率。可使用其他調控位點，諸如轉錄作用或轉譯作用起始訊號，來調節編碼序列的表現作用。
在另一實施例中，表現質體可選擇性地含有標籤，而方便分離及/或純化所表現的蛋白。表現質體之使用及帶有標籤的蛋白產物之分離與純化方法，係技藝中眾所周知。
可藉由多種已知技術產生本發明的肽。例如可合成(如藉由化學方式或重組方式)、分離、純化該等肽或其片段，及使用本文中所述的方法或技藝中所知的方法試驗其等與成熟的牙齦蛋白酶形成複合體之能力。任擇地，如技藝中眾所周知，可使用各種表現系統(如大腸桿菌(E.coli)、中國倉鼠卵巢細胞、COS細胞桿狀病毒)，以重組方式產生肽或其片段。亦可使用例如一種蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)，藉由分解天然存在或以重組方式產生的牙齦蛋白酶原胜肽或牙齦蛋白酶前驅物，而產生本發明的一肽。可使用電腦分析來確定蛋白質分解性剪切位點。任擇地，可使用技藝中的標準技術，如藉由化學剪切(如溴化氰、羥胺、甲酸)，從天然存在或以重組方式產生的牙齦蛋白酶原肽肽或牙齦蛋白酶前驅物產生肽。
本發明的一化合物、肽或擬肽可包含與標的蛋白酶結合所需的眾多胺基酸，以使得抑制部分或全部的蛋白 酶活性。在一實施例中，在涉及牙齦卟啉單胞菌全細胞或所採集的外膜複合體或純化的牙齦蛋白酶之分析法中，可顯示一種牙齦蛋白酶中的標的蛋白酶及對於牙齦蛋白酶活性的部分或完全抑制作用。
具有序列辨識編號：1至28的一序列之一化合物、肽或擬肽亦可具有所引入的點突變作用或其他改質作用(包括插入作用、刪除作用及取代作用)，以增進一種生化性質，例如增進活性或循環或儲存半衰期。另外，如本文中所進一步討論者，點突變作用可引入一或多個蛋白質分解性剪切位點，以防止或抑制該化合物、肽或擬肽在活體內的蛋白質分解性降解作用。本文中所論及的所有變異體若保有抑制、降低或防止一細菌性酵素活性之能力，則位於本發明的範圍內。
因此，本發明除了包括編碼序列辨識編號：1至28的該等核酸之外，亦包括因對偶基因變異(物種族群中之天然存在的鹼基改變及其等可能會或可能不會導致胺基酸改變)而具有不同的核苷酸序列之核酸。本發明亦包括藉由點突變作用或藉由所引發的改質作用(如插入作用、刪除作用及取代作用)所造成之核酸序列，以增進亦適用於本發明之所編碼的牙齦蛋白酶原胜肽之活性、半衰期或生產作用。用於測定DNA序列同源性的電腦程式係技藝中所知。
‘擬肽’係一種合成的化學化合物，其所具有的結構及/或功能特徵係與本發明的一肽實質上相同，在本文中進一步說明後者。典型地，擬肽具有與本發明的一肽相同 或類似的結構，例如序列辨識編號：1至28的相同或類似序列或其片段。擬肽一般含有至少一個非天然合成的殘基。擬肽化合物的非天然組分可如下列一或多者：a)天然醯胺鍵(‘肽鍵’)鍵結以外的殘基連結基；b)取代天然存在的胺基酸殘基之非天然殘基；或c)引發二級結構擬態之殘基，亦即引發或穩定一種二級結構如β轉折、γ轉折、β摺板、α螺旋構形之類。
可使用科學與專利文獻中所述的多種程序與方法而合成擬肽，如美國紐約的約翰威利父子(John Wiley & Sons)出版有限公司所出版及由Gilman等人所編輯之“有機合成作用合輯(Organic Syntheses Collective Volumes)”乙書；al-Obeidi(1998年)於期刊“Mol.Biotechnol.”第9期第205-223頁乙文；Hruby(1997年)於期刊“Curr.Opin.Chem.Biol.”第1期第114-119頁乙文；Ostergaard(1997年)於期刊“Mol.Divers.”第3期第17-27頁乙文；Ostresh(1996)於期刊“Methods Enzymol.”第267期第220-234頁乙文。
本發明的化合物、肽或擬肽能以一種藥學組成物的形式投予。可在GMP條件下，或在一些實施例中藉由習用的混合、溶解、製粒、製造糖衣錠、研磨、乳化、膠囊化、包埋或冷凍乾燥製程，製造該等組成物。
可使用一或多種生理上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑，配製藥學組成物。該等成分可促進將肽或擬肽製成可供藥學上使用的製劑之處理過程。
用於治療之投藥作用可為非經腸、靜脈內、口、 皮下、動脈內、顱內、脊椎內、腹膜內、局部、鼻內或肌內投藥作用。
供非經腸投藥的藥學組成物一般為無菌及實質上等張。可使用生理上相容的緩衝液諸如漢克氏(Hank)液、林格氏(Ringer)液、生理食鹽水或乙酸鹽緩衝液。該溶液亦可含有懸浮劑、安定劑及/或分散劑。該肽或擬肽可能以粉末形式提供，及在使用之前溶於溶劑諸如無菌無熱原水中。
就一肽或多肽序列亦即在本文中所界定之本發明的一肽而言，“胺基酸序列一致性百分比(%)”或“一致百分比(%)”係界定為在排比該等序列及必要時引入間隙以達到最大的序列一致性百分比之後，及不將任何保守性取代作用視為序列一致性的一部分時，一候選序列中的胺基酸殘基與特異性肽或多肽序列亦即本發明的一肽中的胺基酸殘基一致之百分比。
嫻熟本領域技術者可判斷用於測量排比的適當參數，包括在所比較序列的全長達到最大排比所需之任一演算法(如後述的非限制性實例)。當進行胺基酸序列排比時，一特定胺基酸序列A對於、與或相較於一特定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(其可任擇地表達為具有或包含對於、與或相較於一特定胺基酸序列B之特定的胺基酸序列一致性百分比之一特定胺基酸序列A)可計算為：胺基酸序列一致性百分比=(X/Y)x100，其中X係藉由序列排比程式或演算法進行A與B之排比而評分為一致性配對之胺基 酸殘基數目，及Y係B中的胺基酸殘基總數。若胺基酸序列A的長度係與胺基酸序列B的長度不相等，A相對於B之胺基酸序列一致性百分比，將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性百分比。
在計算一致性百分比時，典型地計數確切的配對。可使用一種數學演算法，測定二序列之間的一致性百分比。用於比較二序列之數學演算法的一個非限制性實例，係Karlin與Altschul於1990年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第87期第2264頁乙文中之演算法，及於Karlin與Altschul於1993年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第90期第5873-5877頁乙文中所修改者。該演算法被納入Altschul等人於1990年期刊“J.MoI.Biol.”第215期第403頁乙文中之BLASTN與BLASTX程式。為了就比較之目的獲得間隙排比，可採用如Altschul等人(1997年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第25期第3389頁乙文中所述之間隙BLAST(在BLAST第2.0版中)。任擇地，可使用PSI-Blast進行偵測分子間的遙遠關係之疊代搜尋。參見上述Altschul等人(1997年)乙文。當採用BLAST、間隙BLAST及PSI-Blast程式時，可使用個別程式(如BLASTX與BLASTN)的預設參數。亦可藉由目測而以人工方式進行排比。用於比較序列的數學演算法之另一非限制性實例，係ClustalW演算法(Higgins等人於1994年期刊“Nucleic Acids Res.”第22期第4673-4680頁乙文)。ClustalW比較序列及排比完整的胺基酸或DNA序列，及因而可提供有關完整胺基酸序列的序列保守性之數據。 ClustalW演算法被數種商品化DNA/胺基酸分析套裝軟體所採用，諸如偉特(Vector)NTI套裝程式(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)的ALIGNX模組。在以ClustalW排比胺基酸序列之後，可評估胺基酸一致性百分比。適用於分析ClustalW排比之軟體程式的一個非限制性實例係GENEDOCTM或JalView(http：//www.jalview.org/)。GENEDOCTM可評估多種蛋白之間的胺基酸(或DNA)相似性與一致性。用於比較序列的數學演算法之另一非限制性實例，係Myers與Miller之演算法(於1998年期刊“CABIOS”第4期第11-17頁乙文)。該演算法被納入排比(ALIGN)程式(第2.0版)中，其係GCG威斯康辛遺傳學(Wisconsin Genetics)套裝軟體第10版(可自美國加州聖地牙哥斯克蘭頓(Scranton)路9685號的阿賽樂德(Accelrys)有限公司取得)的一部分。當採用供比較胺基酸序列用的排比(ALIGN)程式時，可使用PAM 120權重殘基表及間隙長度罰分為12與間隙罰分為4。
可製備含有上文所提及的藥學組成物之本發明的口用組成物，及以適用於口腔的各種形式使用，諸如潔牙劑及包括牙膏、牙粉與液體潔牙劑、漱口水、口含錠、口香糖、牙糊膏、牙齦按摩霜、漱口錠、乳製品及其他食品。依一特定口用組成物的類型與形式而定，如本發明的一種口用組成物可進一步包括眾所周知的附加成分。
選擇性地，該組成物可進一步包括對於格蘭氏陰性厭氧細菌具有毒性或抑制其生長之一或多種抗生素。任 一抑細菌性或殺細菌性抗生素均可能用於本發明的一組成物中。適宜的抗生素較佳包括阿莫西林(amoxicillin)、多西環素(amoxicillin)或甲硝唑(metronidazole)。
在本發明的一些較佳形式中，口用組成物可具有實質上液態之性質，諸如漱口水或漱口液。在該種製劑中，載劑典型為一種水-醇混合物，及理想地包括如後述的一種保濕劑。水相對於醇之重量比例一般位於約1：1至約20：1之範圍。該類型製劑中的水-醇混合物總量，典型係位於約70至約99.9%的製劑重量之範圍。該醇典型為乙醇或異丙醇。其中較佳為乙醇。
該液體與本發明的其他製劑之pH值一般位於約5至約9之範圍，及典型係自約5.0至7.0。可用酸(如檸檬酸或苯甲酸)或鹼(如氫氧化鈉)控制pH值，或加以緩衝(如用檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等)。
在本發明的其他有利形式中，該組成物可具有實質上固態或膏狀之性質，諸如牙粉、潔牙錠或牙膏(牙科用乳膏)或凝膠潔牙劑。該等固態或膏狀口用製劑的載劑一般含有牙科可接受的拋光物質。
在牙膏中，液態載劑可包含水與保濕劑，其量典型為製劑重量之約10%至約80%。甘油、丙二醇、山梨糖醇及聚丙二醇係適宜的保濕劑/載劑之實例。水、甘油及山梨糖醇的液態混合物亦為有利的。在透明凝膠中，折射率係一重要考慮因素，較佳使用約2.5至30%重量/重量的水，0 至約70%重量/重量的甘油及約20至80%重量/重量的山梨糖醇。
牙膏、乳膏及凝膠典型含有一種天然或合成的增稠劑或膠凝劑，其比例約為0.1至約10，及較佳約0.5至約5%重量/重量。適宜的增稠劑係合成的水輝石、合成的膠體矽酸鎂鹼金屬複合黏土，及例如可取得拉波特工業(Laporte Industries)有限公司所銷售的拉波特(Laponite)(如CP、SP 2002、D)。拉波特(Laponite)D包含約58.00重量%的二氧化矽、25.40重量%的氧化鎂、3.05重量%的氧化鈉、0.98重量%的氧化鋰及一些水與微量金屬。其真比重為2.53，及在8%濕度的表觀容積密度為1.0克/毫升。
其他適宜的增稠劑包括紅藻膠、ι-鹿角菜膠、黃蓍膠、澱粉、聚乙烯吡咯啶酮、羥乙基丙基纖維素、羥丁基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素(如以納纖索(Natrosol)形式取得)、羧甲基纖維素鈉及膠質氧化矽諸如細磨型矽洛德(Syloid)(如244)。亦可包括助溶劑，諸如保濕劑多元醇類，諸如丙二醇、二丙二醇及己二醇；賽璐蘇(cellosolve)類，諸如甲基賽璐蘇與乙基賽璐蘇；在一直鏈中含有至少約12個碳之植物油與蠟類，諸如橄欖油、蓖麻油；及石蠟脂與酯類，諸如乙酸戊酯、乙酸乙酯及苯甲酸苄酯。
將瞭解如常規該口用製劑通常以帶有標示的適宜包裝銷售或以其他方式經銷。因此，一瓶漱口液的標示將說明其實質內容係漱口液或漱口水，及具有其使用說 明；而牙膏、乳膏或凝膠通常置於一種內襯為鉛或塑料之典型為鋁的可折疊式管中，或置於其他用於計量所取出的內容物之擠壓、泵送或加壓型分配器，及標示說明其實質內容係牙膏、凝膠或牙科用乳膏。
可在本發明的組成物中使用有機表面活性劑，以增加治療性或預防性作用，協助活性劑徹底與完全分散在整個口腔，及使得本組成物更為美觀上可接受的。有機表面活性物質的性質較佳為陰離子性、非離子性或兩性離子性，及較佳不與活性劑交互作用。較佳使用清潔劑材料作為表面活性劑，其賦予該組成物清潔與發泡性質。陰離子性表面活性劑的適宜實例係高級脂肪酸單甘油酯單硫酸鹽的水溶性鹽類，諸如單硫酸化氫化椰油脂肪酸甘油酯的鈉鹽；高級烷基硫酸鹽諸如月桂基硫酸鈉；烷基芳基磺酸鹽類諸如十二烷基苯磺酸鈉；高級烷基磺乙酸鹽類；1,2-二羥基丙磺酸鹽的高級脂肪酸酯類；及低級脂族胺基羧酸化合物之實質上飽和的高級脂族醯基醯胺類，諸如該等在脂肪酸、烷基或醯基自由基中具有12至16個碳者之類。最後提及的醯胺類之實例為N-月桂醯基肌胺酸，及應實質上不含皂或類似的高級脂肪酸物質之N-月桂醯基肌胺酸、N-肉豆蔻醯基肌胺酸或N-棕櫚醯基肌胺酸的鈉、鉀及乙醇胺鹽。在本發明的口用組成物中使用該等肌胺酸鹽化合物係特別有利的，因該等物質除了降低牙齒琺瑯質在酸性溶液中的溶解度之外，還在抑制口腔中因碳水化合物分解而起的酸形成作用方面展現長期顯著效應。適用的水溶性非離子性 表面活性劑之實例係環氧乙烷與具有長疏水鏈(如具有約12至20個碳原子之脂族鏈)及與其反應的各種反應性含氫化合物之縮合產物，該等縮合產物(“ethoxamer”)含有親水性聚氧乙烯基團，諸如聚(環氧乙烷)與脂肪酸、脂肪醇、脂肪醯胺、多羥基醇(如去水山梨醇單硬脂酸酯)及聚氧化丙烯(如普朗尼克(Pluronic)材料)之縮合產物。
表面活性劑的典型存在量係約0.1至5重量%。可在本發明的口用製劑中納入其他各種物質，諸如增白劑、防腐劑、聚矽氧、葉綠素化合物及/或氨化材料諸如尿素、磷酸二銨及其混合物。當該等佐劑存在時，其等在製劑中所納入的量對於所欲的性質與特性並無實質上不良的影響。
亦可使用任一適宜的調味或甜化物質。適宜的調味組分之實例係香料油，如綠薄荷、薄荷、冬青、擦樹、丁香、鼠尾草、桉樹、馬鬱蘭、肉桂、檸檬及柑橘的油及柳酸甲酯。適宜的甜化劑包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、環己胺磺酸鈉、紫蘇糖、AMP(天門冬胺醯基苯基丙胺酸的甲基酯)、糖精之類。香料與甜化劑可適宜地各構成或一起構成該製劑的約0.1%至5%以上。
亦可將本發明的化合物、肽或擬肽的組成物納入含片或納入口香糖或其他產物中，如藉由攪拌至溫的口香糖原膠中或塗佈在口香糖原膠的外表面，口香糖原膠的實例為節路頓膠、橡膠乳膠、乙烯基樹脂等，理想地具有習用的塑化劑或軟化劑、糖或其他增甜劑或者諸如葡萄糖、 山梨糖醇之類。
本發明提供用於治療或緩解一個體的牙周病症狀之一種方法，該方法包括對於該個體投予本發明的一化合物、肽、擬肽或組成物及用於引發對於牙齦卟啉單胞菌的免疫反應之一種蛋白。用於引發對於牙齦卟啉單胞菌的免疫反應之蛋白，係包括PCT/AU2009/001112(WO/2010/022463)中所述的該等蛋白，其在此併入本案以為參考資料。
在另一方面，本發明提供一部件套組，其包括(a)一化合物、肽、擬肽或組成物及(b)一種藥學上可接受的載劑。理想地，該套組進一步包括其等在需要該種治療的一病患中用於治療或預防牙周病之使用說明書。
可依據技藝中所知用於製造藥學組成物的任一方法，製備擬供口用的組成物；及該等組成物可含有一或多種選自由甜化劑、調味劑、著色劑及防腐劑所組成之群組之作用劑，以提供藥學上雅緻與適口的製劑。錠劑含有該有效成分，及摻合適用於製造錠劑之藥學上可接受的無毒性賦形劑。該等賦形劑例如可為惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；製粒劑與崩散劑，例如玉米澱粉或褐藻酸；結合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。該等錠劑可未經塗佈或可藉由已知技術塗佈，以延遲在胃腸道中的崩解作用與吸收作用，而使得在較長的時間提供持續性作用。例如，可使用一種延時物質，諸如單硬脂酸甘油酯 或雙硬脂酸甘油酯。
供口用的調配物亦可能以硬質明膠膠囊形式存在，其中該有效成分係與一種惰性固態稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合；或以軟質明膠膠囊形式存在，其中該有效成分係與水或一油性介質例如花生油、液態石蠟或橄欖油混合。
水懸液係含有活性物質及摻合適用於製造水懸液的賦形劑。該等賦形劑係懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；分散劑或潤濕劑可為一種天然存在的磷脂例如卵磷脂，或環氧烷與脂肪酸的縮合產物例如硬脂酸聚氧乙烯，或環氧乙烷與長鏈脂族醇類的縮合產物例如十七乙烯鯨蠟醇，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸類與已醣醇的偏酯之縮合產物諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸類與已醣醇酐類的偏酯之縮合產物例如聚乙烯山梨醇酐單油酸酯。
水懸液亦可含有一或多種防腐劑，例如苯甲酸酯類，諸如苯甲酸乙酯或苯甲酸正-丙基對-羥基酯；一或多種著色劑；一或多種調味劑；及一或多種甜化劑，諸如蔗糖或糖精。
可藉由將有效成分懸浮於一植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油中，或懸浮於一礦物油諸如液態石蠟中，而配製油性懸浮液。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可添加諸如上文所闡明 的該等甜化劑及調味劑，以提供適口的口用製劑。可藉由添加一種抗氧化劑諸如抗壞血酸，而保存該等組成物。
為了更詳細地說明本發明，而陳述下列實例來說明本發明的一些方面與實施例。
第1例-製備Kgp原胜肽及抑制Kgp活性 細菌菌株與生長條件
牙齦卟啉單胞菌W50與Kgpcat△ABM1突變體ECR368的甘油或冷凍乾燥培養物係在37℃及以厭氧方式生長於馬血瓊脂(HBA；奧克歐德(Oxoid)公司)上。藉由繼代培養維持牙齦卟啉單胞菌，及僅使用第3至7繼代來接種20毫升與200毫升的腦心浸出物培養液(37克/公升)，增補氯化血紅素(5毫克/公升)與半胱胺酸(0.5克/公升)，及針對ECR368(BHI)增補紅黴素補充劑(10微克/毫升)。藉由在650奈米波長測量培養物的光密度(OD)，而測定生長作用。對於培養物進行格蘭氏染色法，以檢查有無污染。在指數級生長期藉由離心作用(在4℃與8000 g進行20分鐘)採集牙齦卟啉單胞菌細胞，及用含有0.5克/公升的半胱胺酸之TC150緩衝液(50 mM Tris-HCl、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣及pH值為8.0)清洗一次。將清洗後的細胞重新懸浮於2毫升的TC150緩衝液(具有0.5克/公升的半胱胺酸)中，及置於4℃待立即用於蛋白質分解分析法中。
牙齦卟啉單胞菌W50係在基本培養基中生長至少6個繼代，及儲存於-80℃以供後續生長實驗之用。如下製備基本培養基：在基礎緩衝液(10 mM磷酸二氫鈉、10 mM 氯化鉀及10 mM氯化鎂)中增補血紅素(50 nM)與BSA(3% A-7906；西克瑪艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司)及pH值為7.4，及進行過濾消毒(薩爾斯塔特(Sarstedt)公司之0.1微米的膜過濾器Filtropur BT50)。在96孔式微滴定平皿(葛萊娜第一生化(Greiner Bio-One)公司的96孔式細胞培養皿)之具有100毫克/公升的Kgp原胜肽(Kgp-PP)、RgpB原胜肽(RgpB-PP)或Kgp-PP加上RgpB-PP的各孔中，接種細胞(位於200微升中的108個細胞)。平皿係在厭氧室及37℃培養過夜，用一種密封平皿的微滴定平皿封口機(澳洲維多利亞省羅維爾(Rowville)的珀金埃爾默生物科技(Perkin Elmer Life Sciences)公司)密封。使用微量平皿讀數器(熱電(Thermo Electron)公司的Multiskan Ascent微量平皿讀數器)，在37℃監測620奈米的吸光度達50小時。使用牙齦卟啉單胞菌W50之缺乏RgpA、RgpB與Kgp的同基因型三重突變體作為在基本培養基中生長的負對照組。在原胜肽存在下之生長作用，係與牙齦卟啉單胞菌在基本培養基中的生長作用相比較。
離胺酸-牙齦蛋白酶(Kgp)之純化作用
為採集與純化成熟的Kgpcat△ABM1，使用4毫升的Kgpcat△ABM1突變體ECR368起始培養物來接種200毫升的BHI培養液，然後在37℃培養三天。首先藉由在4℃與8,000 g離心30分鐘而移除牙齦卟啉單胞菌細胞，之後收集上清液及於-10℃與100,000 g進行超離心達1小時而移除囊泡。將沉澱物棄置，收集上清液及儲存於冰/鹽混合物上。按3：2的體 積/體積比例，將冷藏的丙酮緩慢添加至冷藏的上清液中，及藉由離心作用(於-10℃與8,000 g離心30分鐘)將蛋白沉澱。將上清液小心地棄置，及在TC50緩衝液(50 mM Tris-HCl、50 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣及pH值為7.4)中清洗沉澱物。在離心作用(於-10℃與8,000 g離心30分鐘)後，將沉澱物重新懸浮於TC50緩衝液中，及過濾通過一個0.22微米的過濾器。將該萃取物施加至一個與AKTA基礎型FPLC系統連接的脫鹽管柱(Sephadex G25，XK26/40)，使用TC50緩衝液及依5毫升/分鐘的流速洗提。在280與254奈米監測洗提液。收集空隙體積，及藉由使用切點為10,000 MW的膜(Vivaspins)之超過濾作用，濃縮至10毫升以下。將濃縮後的試樣施加至陰離子交換管柱(Q-瓊脂糖凝膠(Sepharose))，以將具離胺酸活性的分液與具精胺酸活性的該等分液分開(圖3)。然後將具離胺酸活性的濃縮分液匯集及施加至陽離子交換管柱S-瓊脂糖凝膠(Sepharose)。然後使用凝膠過濾管柱(Superdex G75，XK16/100)，進行所洗提出之具離胺酸活性的分液之尺寸分級，以將Kgp蛋白酶與其他蛋白分開。用TC50緩衝液及依1毫升/分鐘的流速洗提管柱。在280、254及215奈米監測洗提液，加以收集及儲存於-70℃。
重組型Kgp-原胜肽之表現作用與純化作用
藉由使用Kgp的基因體DNA作為模板之聚合酶鏈反應(PCR)，擴增編碼Kgp的原胜肽(第20至228個胺基酸)之基因體DNA。在PCR中使用引子5’ACG CAG CAT ATG CAA AGC GCC AAG ATT AAG CTT GAT 3’與5’ACG CAG CTC GAG TCA TCT ATT GAA GAG CTG TTT ATA AGC 3’。該等引子含有Nde1與Xhol限制酶酶切位點。在反義位置設計一個附加的終止密碼子位點。藉由SDS-PAGE核對DNA的大小，及使用TA選殖套組(英杰(Invitrogen)公司)，將PCR產物選殖至PGEM-T易載體(普洛麥格(Promega)公司)中。用酵素Nde1與Xhol剪切之後，將PCR插入物移除，藉由凝膠萃取作用純化，然後插入PET-28b表現載體(諾凡基(Novagen)公司)中。進行插入物的定序，以確認擴增作用與接合作用之正確。
為了在大腸桿菌(Escherichia coli)BL-21(DE3)(諾凡基(Novagen)公司)中表現，將PET-28b載體轉形至BL-21(DE3)細胞中。藉由添加1 mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃醣苷(IPTG)，而引發表現作用。在所引發的表現作用達4小時之後，藉由在8,000 g離心20分鐘而採集細胞。將包涵體中含有重組原胜肽之該等細胞，懸浮於溶胞緩衝液(50 mM磷酸氫二鈉、300 mM氯化鈉、10 mM咪唑及pH值為8.0)中，及用音波處理(15分鐘)破碎及進行攪拌(於4℃達30分鐘)。將溶胞產物離心，及使用鎳親和性層析法純化所得的上清液，而獲得經純化的重組型原胜肽。
在上清液中添加50%鎳-NTA(凱傑(Qiagen)公司)漿料(4毫升)，然後在4℃攪拌15分鐘。將混合物添加至柱床體積為20毫升的開放式管柱中，及移除所流通的液體。用10毫升的純化作用緩衝液(pH值為8.0的50 mM磷酸鉀、150 mM氯化鈉、20 mM咪唑)清洗樹脂二次。然後在漿料中添 加含有25 NIH單位的凝血酶(西克瑪(Sigma)公司)之純化作用緩衝液(2毫升)，及在室溫培養2小時，使得凝血酶可將原胜肽與其組胺酸標籤剪切，而使得該標籤從鎳親和性樹脂釋出。用15毫升的純化作用緩衝液，收集所釋出之具有凝血酶蛋白酶的原胜肽。將該溶液添加至含有1毫升的苯甲脒瓊脂糖凝膠樹脂(法瑪西亞(Pharmacia)公司)之另一管柱，及在室溫進行反應15分鐘，使得凝血酶蛋白酶與苯甲脒瓊脂糖凝膠樹脂結合。收集所流通的分液。用2.5毫升的清洗緩衝液(pH值7.0的5 mM磷酸鉀、50 mM氯化鈉)清洗苯甲脒瓊脂糖凝膠樹脂二次，及收集清洗液。將所流通的分液與二次清洗分液合併，產生待冷凍乾燥的20毫升溶液。將重新溶解的萃取物施加至一個與AKTA基礎型FPLC系統連接之凝膠過濾管柱(Superdex G75，XK16/100)中，用50 mM碳酸氫銨及依1毫升/分鐘的流速洗提。在280與215奈米監測洗提液。收集洗提液，加以冷凍乾燥及儲存於-70℃。
蛋白濃度之分光光度測定
使用ExPASy伺服器上的“ProtParam”程式(Gasteiger等人2005年乙文)，測定280奈米的莫耳消光係數(ε)(M-1公分-1)及蛋白分子量。Kgpcat△ABM1的ε值為105,340M-1公分-1，而rKgp原胜肽的ε值為11,920M-1公分-1。使用分光光度方式(Grimsley與Pace於2003年乙文)，測定Kgpcat△ABM1富集型分液與rKgp原胜肽的濃度。使用瓦里安(Varian)公司(澳洲)的開利(Cary)50雙光束分光光度計，藉由掃瞄從200奈米至300奈米的吸光度，而測量各試樣的吸光度。使用由色胺 酸、酪胺酸及半胱胺酸殘基所吸收之280奈米的吸光度，利用比爾-朗伯定律(Beer-Lamberts Law)(A280nm=εbC)計算蛋白濃度。之後將Kgpcat△ABM1富集型分液稀釋，以供蛋白酶抑制分析之用。
MALDI TOF/TOF質譜法
在MTP 384標的磨光鋼板上，用位於標準緩衝液(50%乙腈、0.1% TFA)中的飽和2,5-二羥基苯甲酸(DHB)基質，將肽試樣共結晶(體積/體積為1：1)。在Ultraflex MALDI TOF/TOF質譜儀(德國布萊梅(Bremen)的布魯克(Bruker)公司)上分析試樣。使用布鲁克道爾頓(Bruker Daltonics)公司的flexAnalysis 2.4與布鲁克道爾頓公司的BioTools 3.0軟體以及與安裝在當地MASCOT伺服器上的酪蛋白數據庫匹配之片段光譜，進行分析。
電灑質譜法
使用在電灑質譜法模式運作之Esquire-LC MS/MS系統(布鲁克道爾頓公司)，分析自RP-HPLC所收集的分液。按340微升/小時進行試樣注射作用，氮氣流量為5公升/分鐘及乾燥氣體溫度為300℃。
蛋白酶抑制分析法
使用合成的顯色受質N-(p-Tosyl)-甘胺酸-脯胺酸-離胺酸4-硝基苯胺乙酸鹽(GPK-NA)(西克瑪艾爾迪希(Sigma Aldrich)公司)，測定離胺酸特異性蛋白質分解活性。離胺酸特異性反應緩衝液含有溶於30%體積/體積的異丙醇中之2 mM GPK-NA、0.93 mM半胱胺酸、pH值8.0的400 mM Tris-HCl及100 mM氯化鈉。在無菌的96孔式微滴定平皿(美國紐約的康寧(Corning Incorporated)公司)中進行蛋白酶分析，所有分液與對照組皆以三重複進行分析。在該等孔中添加最終濃度為20.0毫克/公升(0.85 μM)與40.0毫克/公升(1.71 μM)的rKgp原胜肽以及10微升之pH值8.0的10 mM半胱胺酸與最終濃度為1.16毫克/公升(0.02 μM)的Kgpcat△ABM1富集型分液，及用TC150緩衝液(50 mM Tris-HCl、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣及pH值為8.0)使體積達到100微升。在37℃培養試樣15分鐘，然後添加100微升的顯色受質(2 mM)(總體積為200微升)。使用珀金埃爾默(PerkinElmer)公司的1420多標記計數器VICTOR3TM，在37℃與pH值8.0，藉由間隔10秒測量405奈米的吸光度達約20分鐘，而測定蛋白酶活性。以單位/毫克為單位，測定Kgpcat△ABM1富集型分液的蛋白質分解活性。
亦使用DQTM格林(Green)牛血清白蛋白(BSA)(美國的分子探針Molecular Probes)公司)(Grenier等人2001年乙文；Yoshioka等人2003年乙文)，測定細菌性蛋白酶抑制性活性。該蛋白係用一種強力的自淬熄性胺染料標記，當該染料被剪切時，在535奈米有最大發射，然後在485奈米激發。該分析法的混合物含有Kgpcat△ABM1富集型分液(1.16毫克/公升，0.02 μM)、rKgp原胜肽(40.0毫克/公升)、1 mM半胱胺酸及DQ BSA(10微升；0.1克/公升)，及用TC150緩衝液使最終體積成為200微升。使用經Nα-對-甲苯磺醯-1-離胺酸氯甲基酮TLCK(1 mM)處理的Kgpcat△ABM1蛋白酶 作為對照組。TLCK係一種強力的半胱胺酸蛋白酶抑制劑，及已知抑制Rgp與Kgp二者的活性(Fletcher等人1994乙文；Pike等人1994乙文)。在分析中添加一種Rgp抑制劑即亮肽素，以抑制可能存在的任何精胺酸-牙齦蛋白酶活性(Kitano等人2001乙文)。在37℃及黑暗中培養該分析的混合物2小時，然後使用螢光計(珀金埃爾默(PerkinElmer)公司的1420多標記計數器VICTOR3TM)測量螢光，該螢光係表示白蛋白降解程度。從所有數值減去負對照組(經TLCK處理)所得的螢光值。除非另有說明，所有分析係以2至3個生物複製體進行三重複，及計算平均值±標準偏差。
使用逆相高性能液態層析法(RP-HPLC)與SDS-PAGE，分析各孔試樣的原胜肽與蛋白酶水解作用。在與安捷倫(Agilent)製備級1100 HPLC儀器(安捷倫技術(Agilent Technologies)公司)連結的分析級Zorbax 300 SB-C18逆相管柱(4.6毫米x250毫米)上，在30分鐘內使用流速為1毫升/分鐘及0至100%溶劑B(90%乙腈-位於去離子水中的0.1%(體積/體積)TFA)之梯度，分析200微升的各試樣。就SDS-PAGE分析而言，在14,500 rpm離心各分析試樣(200微升)達5分鐘，然後用5%(體積/體積)的1 M DTT與25%(體積/體積)的4x還原性試樣緩衝液將50微升的上清液變性，在70℃加熱10分鐘，進行短暫的微離心作用，然後添加至一個預製的8至12%梯度之Bis-Tris凝膠上。使用SeeBlue®預染標準品作為一種分子標記，及使用150伏特的電位差與MES緩衝液來運作該凝膠。用Coomassie®亮藍(G250)將該凝膠染色過 夜，及在去離子水中脫色。使用與Proteineer SP系統(布鲁克道爾頓公司)連結之愛普生智能面板(Epson Smart Panel)掃描器，來掃描該凝膠。
統計分析
進行蛋白酶活性數據的單因子變異數分析(ANOVA)。當ANOVA顯示所試驗的抑制劑之平均值之間存在統計上顯著之差異(P<0.05)時，進行該等數據的改良式塔基(Tukey)檢定，以辨識哪些抑制劑係顯著不同(Zar於1984年乙文；Fowler與Cohen於1997年乙文)。
分子模式化
使用Fugue程式(Shi等人2001年乙文)，來辨識該三種牙齦蛋白酶原胜肽針對所策展的蛋白質資料庫HOMSTRAD(Mizuguchi等人1998年乙文)的可能結構基序。並行運作PSI-BLAST程式，以辨識出其他任何的推定性直系同源物與旁系同源物。
離胺酸-牙齦蛋白酶(Kgp)之純化作用
牙齦卟啉單胞菌ECR368係在厭氧環境生長三天，及針對Kgpcat△ABM1藉由丙酮沉澱作用與離心作用採集培養上清液。將經丙酮沉澱的蛋白添加至一脫鹽管柱(Sephadex G25)上，及藉由pH值5.3的50 mM乙酸鈉緩衝液洗提。收集第一尖峰，及使用切點為10,000 MW的膜進行濃縮。該萃取物係進行陰離子交換與陽離子交換層析法及最終進行尺寸排阻層析法(圖4)，以將Kgpcat△ABM1上清液中的其他蛋白分開。使用SDS-PAGE凝膠，分析來自各純化 步驟之試樣的酵素純度(圖5)。Kgpcat△ABM1的純度隨著每個後續純化步驟增加，而產生Kgpcat△ABM1富集型分液(圖5中的第5道)。
重組型Kgp原胜肽(rKgp)之表現作用與純化作用
RKgp原胜肽之設計係在原胜肽的N端使用一個組胺酸標籤序列，及接著一個凝血酶剪切位點。rKgp原胜肽係在大腸桿菌(E.coli)中表現，及使用鎳親和性層析法萃取細胞溶胞產物。為移除該組胺酸標籤，用凝血酶處理與鎳管柱結合之大腸桿菌(E.coli)細胞的溶胞產物，凝血酶將原胜肽剪切，而留下與鎳管柱連接的組胺酸標籤。收集所釋出的原胜肽及施加至具有苯甲脒瓊脂糖凝膠的一開放式管柱中，以移除凝血酶蛋白酶，接著使用一凝膠過濾管柱來純化rKgp原胜肽(圖6A)。使用MALDI-TOF質譜分析，測定rKgp原胜肽之一致性(圖6B)。
蛋白濃度之分光光度測定
使用分光光度方式(Grimsley與Pace於2003年乙文)，測定Kgpcat△ABM1富集型分液(分子量為50,114道爾頓，454個胺基酸)與rKgp原胜肽的濃度。Kgpcat△ABM1富集型分液在280奈米的吸光度(A280奈米)為0.033及消光係數為105,340 M-1公分-1；因此Kgpcat△ABM1富集型分液的濃度為0.0157克/公升。藉由A280奈米分析數個批次的Kgpcat△ABM1富集型分液的蛋白濃度。然而，在各分析中之Kgpcat△ABM1富集型分液的最終濃度係設定為1.16毫克/公升(0.02 μM)。
依同方式測定rKgp原胜肽的濃度。rKgp原胜肽(分子量為23,403道爾頓，213個胺基酸)的A280奈米為0.1169，及消光係數為11,920 M-1公分-1，因此濃度為0.23克/公升。在分析法中的rKgp原胜肽最終濃度為20.0毫克/公升(0.85 μM)與40.0毫克/公升(1.71 μM)。
蛋白酶抑制分析法
使用顯色型與螢光型受質，測定rKgp原胜肽對於Kgpcat△ABM1的抑制作用。在顯色型受質的分析法中，rKgp原胜肽的最終濃度為20.0毫克/公升(0.85 μM)與40.0毫克/公升(1.71 μM)；而Kgpcat△ABM1富集型分液的濃度為1.16毫克/公升(0.02 μM)。使用濃度為1mM的TLCK作為對照組。rKgp原胜肽在40.0毫克/公升(1.71 μM)的濃度抑制約75%的Kgpcat△ABM1活性，及rKgp原胜肽在20.0毫克/公升(0.85 μM)的濃度抑制約60%的Kgpcat△ABM1活性(圖7)。受質水解速率在整個分析過程中皆為線性(圖8)。
收集來自該等分析法的試樣及使用RP-HPLC進行分析，以測定rKgp原胜肽或Kgpcat△ABM1的潛在水解作用。HPLC廓型顯示rKgp原胜肽仍然完整(圖9)。將試樣(200微升)離心，用DTT與試樣緩衝液處理50微升的上清液，及藉由SDS-PAGE進行分析。SDS-PAGE分析顯示原胜肽仍在所預期的分子量出現(圖10)
使用顯色型受質GPKNa所測定之rKgp原胜肽對於Kgpcat△ABM1的抑制作用動力學，揭露該抑制作用係非競爭性抑制作用。Kgp原肽肽的Ki’經計算為2.01 μM(圖11)。
在2小時的培養期間，進行螢光性BSA受質分析。rKgp原胜肽在10.0毫克/公升(0.45 μM)的濃度抑制約66%的Kgpcat△ABM1富集型分液活性(圖12)。然而，該分析法測量總蛋白酶活性，因此由於存在會剪切BSA的殘餘RgpA，而低估了rKgp原胜肽對於Kgpcat△ABM1之抑制作用。
收集來自該等分析法的試樣，及藉由SDS-PAGE分析(圖13A)。對照組含有約0.03微克的Kgpcat△ABM1及約1微克的BSA。在含有rKgp原胜肽與Kgpcat△ABM1富集型分液的離心後試樣中觀察到沉澱物，但在僅含有Kgpcat△ABM1富集型分液(對照組)的離心後試樣中未觀察到沉澱物。將該等沉澱物重新懸浮於上清液中，及施加至SDS凝膠上。SDS凝膠顯示在2小時的培養期間後，Kgpcat△ABM1(分子量約為50,000)與rKgp原胜肽(分子量約為25,000)仍然完整(圖13A與13B)。亦在凝膠上觀察到存在BSA(分子量為62,000)與其剪切產物。Kgpcat△ABM1將所有BSA剪切成為難以檢測的小型肽，因該等剪切產物極有可能在凝膠末端流失(圖13A之第2道與第3道)；當對於Kgpcat△ABM1添加rKgp原胜肽(第4與4道)時，完整的BSA仍然存在及所剪切的肽仍然相當大型及介於約14與3kDa之間，顯示原胜肽對於Kgp蛋白酶活性之抑制作用。TLCK對照組顯示蛋白酶受到抑制及未觀察到BSA降解作用(圖13B)。
第2例-製備RgpB原胜肽及抑制Rgp活性 牙齦卟啉單胞菌HG66之生長條件
牙齦卟啉單胞菌菌株HG66的甘油培養物係在37℃及具有10%二氧化碳、5%氫氣、85%氮氣的氣體環境之厭氧菌室中，以厭氧方式在馬血瓊脂(HBA；奧克歐德(Oxoid)公司)上生長。藉由每星期繼代培養維持牙齦卟啉單胞菌之培養，直到完成7至10個繼代培養為止，之後從甘油庫存回收新鮮培養物。為了讓牙齦卟啉單胞菌在培養液的培養作用中生長，藉由在增補氯高鐵血紅素(5毫克/公升)、半胱胺酸(0.5克/公升)、維生素K3(甲萘醌)(5毫克/公升)的20毫升BHI培養液(腦心浸出物培養液(37克/公升))中接種數個菌落(選自一個5至7天的平皿)而製備起始培養物，然後在37℃培養過夜。例行地藉由格蘭氏染色法評估培養純度，及觀察HBA平皿上的菌落形態。
精胺酸-牙齦蛋白酶(RgpB)之純化作用
為採集與純化成熟的RgpB，使用40毫升的起始培養物來接種2公升的BHI培養液，然後在37℃培養三至四天。藉由在4℃與17,700離心1小時而移除牙齦卟啉單胞菌細胞，之後收集上清液及用50 mM乙酸鈉將pH值調整至pH 5.3，然後過濾通過0.8/0.2微米過濾器以移除囊泡(包含在沉澱物中)。將上清液倒出、收集及儲存於冰/鹽混合物上；按3：2的體積/體積比例，將冷藏的丙酮緩慢添加至冷藏的上清液中，及藉由離心作用(於-10℃與8,000 g離心30分鐘)收集所沉澱的蛋白。將上清液小心地棄置，及將沉澱物溶於pH值為5.5的醋酸鈉緩衝液中。在離心作用(於-10℃與8,000 g離心30 分鐘)後，將上清液過濾通過0.22微米的過濾器。將該萃取物施加至一個與AKTA基礎型FPLC系統連接的凝膠過濾管柱(Superdex G75，XK16/100)，以將牙齦蛋白酶與其他蛋白分開。用pH值為5.5的醋酸鈉緩衝液及依0.5毫升/分鐘的流速洗提管柱，在280、254及215奈米監測洗提液，收集所產生的分液及儲存於-70℃。
重組型RgpB-原胜肽之表現作用與純化作用
藉由使用RgpB的基因體DNA作為模板之聚合酶鏈反應(PCR)，擴增編碼RgpB的原胜肽之基因體DNA。在PCR中使用引子5’ACG CAG CAT ATG CAA AGC GCC AAG ATT AAG CTT GAT 3’與5’ACG CAG CTC GAG TCA TCT ATT GAA GAG CTG TTT ATA AGC 3’。該等引子含有Nde1與Xhol限制酶酶切位點。在反義位置設計一個附加的終止密碼子位點。藉由SDS-PAGE核對DNA的大小，及使用TA選殖套組(英杰(Invitrogen)公司)，將PCR產物選殖至PGEM-T易載體(普洛麥格(Promega)公司)中。用酵素Nde1與Xhol剪切之後，將PCR插入物移除，藉由凝膠萃取作用純化，然後插入PET-28b表現載體(諾凡基(Novagen)公司)中。進行插入物的定序，以確認擴增作用與接合作用之正確。
為了在大腸桿菌(E.coli)BL-21(DE3)(諾凡基(Novagen)公司)中表現，將PET-28b載體轉形至BL-21(DE3)細胞中。藉由添加1 mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃醣苷(IPTG)，而引發表現作用。在15℃及所引發的表現作用達 20小時之後，藉由在8,000 g離心20分鐘而採集細胞。將細胞懸浮於溶胞緩衝液(50 mM磷酸氫二鈉、300 mM氯化鈉、10 mM咪唑及pH值為8.0)中，然後用音波處理(20分鐘)破碎及進行攪拌(於4℃達30分鐘)。將溶胞產物離心，及使用鎳親和性層析法純化所得的上清液，而獲得經純化的重組型原胜肽。
在上清液中添加50%鎳-NTA(凱傑(Qiagen)公司)漿料(4毫升)，在4℃攪拌15分鐘，及將混合物添加至柱床體積為20毫升的開放式管柱中，及移除所流通的液體。用10毫升的純化作用緩衝液(pH值為8.0的50 mM磷酸鉀、150 mM氯化鈉及20 mM咪唑)清洗樹脂二次。在漿料中添加含有25 NIH單位的凝血酶(西克瑪(Sigma)公司)之純化作用緩衝液(2毫升)，及在室溫培養2小時。用15毫升的純化作用緩衝液，將所釋出之具有凝血酶蛋白酶的原胜肽從管柱中清洗出來，及將該溶液添加至含有1毫升的苯甲脒瓊脂糖凝膠樹脂(法瑪西亞(Pharmacia)公司)之另一管柱。讓該溶液在室溫進行反應15分鐘，使得凝血酶蛋白酶與苯甲脒瓊脂糖凝膠樹脂結合。一旦收集所流通的分液之後，用2.5毫升的清洗緩衝液(pH值7.0的5 mM磷酸鉀、50 mM氯化鈉)清洗苯甲脒瓊脂糖凝膠樹脂二次，及收集各次的清洗液。將所流通的分液與二次清洗分液合併，產生待冷凍乾燥的20毫升溶液。將重新溶解的萃取物施加至一個與AKTA基礎型FPLC系統連接之凝膠過濾管柱(Superdex G75，XK16/100)中，用50 mM碳酸氫銨及依1毫升/分鐘的流速洗提。在280與215 奈米監測洗提液。收集洗提液，加以冷凍乾燥及儲存於-70℃。
蛋白酶抑制分析法
在使用一種螢光性DQ-BSA受質之一分析法中，測定RgpB的蛋白質分解活性。在37℃測量螢光達11小時，及每小時讀取測量值一次。添加10毫克/公升(0.44 μM)或20毫克/公升(0.88 μM)的RgpB原胜肽，而在整個分析期間幾近完全地抑制RgpB蛋白質分解活性，顯示RgpB原胜肽對於蛋白酶的持續抑制作用。負對照組為1 mM TLCK(圖14)。
在2小時的培養期間內，顯示RgpB原胜肽的劑量反應，其中1毫克/公升抑制約50%的RgpB活性，而5毫克/公升完全除去活性(圖15)。使用顯色型受質BapNA測定RgpB原胜肽的抑制作用動力學(圖16)。非競爭性抑制作用的Ki’經計算為11.8 nM。
原胜肽之選擇性與特異性
RRgpB與rKgp原胜肽二者均顯示對於其等的同源蛋白酶之選擇性，當rKgp原胜肽與RgpB一起培養時，並未觀察到抑制作用，反之亦然(表1)。使用二種半胱胺酸蛋白酶實例，進一步檢視原胜肽的特異性。CA蛋白酶家族之木瓜酶的原胜肽具有115個殘基，並未顯著地受到rKgp與rRgpB原肽胜之抑制(表1)。CD蛋白酶家族之第3型凋亡蛋白酶與RgpB及Kgp催化域具有結構同源性，亦未受到rKgp或rRgpB原肽肽之抑制。該二原胜肽所顯示的非競爭性抑制模式，加上對於同源蛋白酶的選擇性，係暗示該等原胜肽的 外結合位點式結合作用。
浮游性生長之抑制作用
牙齦卟啉單胞菌W50係在一種蛋白式基本培養基中生長，及在培養40小時後，達到相當於OD620奈米為0.32之最大細胞密度。該二種原胜肽均展現對於牙齦卟啉單胞菌W50浮游性生長的顯著抑制性效應(圖17)。牙齦卟啉單胞菌之缺乏RgpA、RgpB與Kgp牙齦蛋白酶的三重蛋白酶突變體，在該基本培養基中並不生長；因而確認牙齦蛋白酶的蛋白質分解活性，係分解蛋白BSA與血紅素成為供細菌後續攝取的短肽所必需者。
第3例-組成物與調配物
提供下列的樣品調配物，以協助說明本發明的組 成物導向治療或預防之實施方面。
下列係牙膏調配物之一實例。
下列係另一牙膏調配物之實例。
下列係另一牙膏調配物之實例。
下列係液態牙膏調配物之一實例。
下列係漱口水調配物之一實例。
下列係另一漱口水調配物之實例。
下列係含片調配物之一實例。
下列係牙齦按摩霜調配物之一實例。
下列係牙周凝膠調配物之一實例。
下列係口香糖調配物之一實例。
雖然已在本文中詳細說明本發明，應理解該等實例僅供說明之用。意欲將嫻熟分子生物學、牙科治療及相關學科技術者所顯而易見之本發明實施例的其他改質作用，涵蓋在本發明的範圍內。
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<213> 食油脫硫球菌(Desulfococcus oleovorans)
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<210> 26
<211> 156
<212> PRT
<213> 深海發光菌(Photobacterium profundum)
<400> 26
<210> 27
<211> 127
<212> PRT
<213> 波尼氏深海嗜酸菌(Aciduliprofundum boonei)
<400> 27
<210> 28
<211> 127
<212> PRT
<213> 波尼氏深海嗜酸菌(Aciduliprofundum boonei)
<400> 28

Claims (13)

  1. 一種用於抑制、降低或防止一細菌性酵素活性之肽或擬肽，該化合物、肽或擬肽係實質上由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列係選自由序列辨識編號：1至28及其中的保守性取代作用所組成之群組。
  2. 一種用於抑制、降低或防止一細菌性酵素活性之肽或擬肽，該化合物、肽或擬肽係由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列係選自由序列辨識編號：1至28及其中的保守性取代作用所組成之群組。
  3. 一種治療或預防牙周病之方法，其包括對於一個體投予一有效量之如申請專利範圍第1或2項之一種肽或擬肽。
  4. 一種如申請專利範圍第1或2項之肽或擬肽在製造用於治療或預防牙周病的一藥劑之用途。
  5. 一種用於辨識半胱胺酸蛋白酶的抑制劑之分析法，其步驟包括：-在一肽或擬肽之存在下，將半胱胺酸蛋白酶與一候選化合物接觸，-判定該候選化合物是否與該肽或擬肽競爭；其中之競爭作用表示該候選化合物係半胱胺酸蛋白酶之抑制劑，其中該肽或擬肽係包含牙齦蛋白酶原胜肽或其片段之一胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第5項之分析法，其中該牙齦蛋白酶原胜肽係選自由RgpA、RgpB及Kgp所組成之群組。
  7. 如申請專利範圍第5或6項之分析法，其中該原胜肽的胺基酸序列係選自由序列辨識編號：1至28及其中的保守性取代作用所組成之群組。
  8. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之分析法，其中該原胜肽或其片段係天然存在者。
  9. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之分析法，其中該原胜肽或其片段係衍生自牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)。
  10. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之分析法，其中該半胱胺酸蛋白酶係一種牙齦蛋白酶。
  11. 如申請專利範圍第10項之分析法，其中該牙齦蛋白酶係選自由RgpA、RgpB及Kgp所組成之群組。
  12. 一種藉由如申請專利範圍第5至11項中任一項之一種分析法鑑定為半胱胺酸蛋白酶之抑制劑的化合物於治療或預防牙周病之用途。
  13. 一種包含牙齦蛋白酶原胜肽或其片段之一胺基酸序列之化合物、肽或擬肽，其係用於如申請專利範圍第5至11項中任一項之一種分析法中。
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