TW201305557A - 用於鑑定改變細胞ｄｄｒ活性的化合物之測試系統及方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於用於鑑定改變細胞盤狀結構域受體酪胺酸激酶活性的化合物之測試系統及方法。

Description

用於鑑定改變細胞DDR活性的化合物之測試系統及方法

本發明係關於用於鑑定改變細胞盤狀結構域受體(DDR)(Discoidin domain receptor)酪胺酸激酶活性的化合物之測試系統及方法。

盤狀結構域受體(DDR)為膠原蛋白之非整合素型受體。二種哺乳動物基因產物，盤狀結構域受體1和2(DDR1和DDR2)構成酪胺酸激酶受體之亞家族，其係選擇性表現在器官的許多不同細胞類型上。當DDR被膠原蛋白活化時，DDR調節細胞黏附、增生和細胞外基質重塑。DDR1可在已缺乏膠原蛋白之細胞表面形成非配體依賴的同型二聚體。膠原蛋白結合DDR1二聚體引發其內化及隨後經由酪胺酸自動-/轉磷酸化而活化。DDR1之膠原蛋白活化跟隨一段延遲的時程，且依照細胞類型和所運用的膠原蛋白，最大刺激通常係在90分鐘至16小時後觀察到。受體內化作用最後導致磷酸化及隨後涉及訊號傳遞集聯分子如ShcA、Shp-2、Nck2，轉錄因子NF-κb、Stat5和激酶p38、PI3K、Pyk2、JNK及cJun之一連串轉導。最後，訊號傳遞集聯影響分化、ECM重塑、遷移和細胞週期控制。咸信DDR分子在各種適應症和疾病上扮演一個角色，例如癌症包括腫瘤侵襲和轉移、動脈硬化包括動脈栓塞形成、纖維化，特別是腎、肝、肺 和皮膚之纖維化、糖尿病，特別是糖尿病腎病變及發炎和關節炎。因此需要鑑定DDR路徑抑制劑之測試系統和分析方法。為了滿足臨床早期研究之需求，亦需要可靠、中-至-高通量的分析系統，其能鑑定影響DDR激酶功能及/或經由膠原蛋白活化DDR之調節劑。

KR2009042397揭示了一種使用基因轉殖昆蟲細胞之分析系統，其中係測量細胞與表面結合的膠原蛋白之結合。KR2009042398揭示放射菌素D(Actinomycin D)作為DDR與膠原蛋白結合之抑制劑。WO2007/044894係揭示無細胞轉譯/轉錄系統。WO2003/082328係揭示其中使用樹突細胞熟化作為讀數之DDR分析。WO 98/45711係揭示用於DDR1和DDR2活性之分析。以解離的細胞、免疫沉澱及隨後免疫墨點測量磷酸-酪胺酸含量。WO98/34954係揭示用於涉及PTB結構域之DDR1的分析。WO95/14089係揭示MCK-10和截短的CCK-2，其亦揭示可以通用方式用於分析系統之程序。WO95/02187係以非常通用的方式揭示可用於WO95/02187的SEQ ID No.1之蛋白質酪胺酸激酶的細胞分析。Vogel W.F.等人((2006),Cellular Signalling,18：1108-1116)和Vogel W.F.((1999),FASEB J.,13(S)：S77-S82)係給予DDR多肽之一般性概觀。Vogel W.等人((1997),Mol Cell.1(1)：13-23)揭示了盤狀結構域受體酪胺酸激酶係被膠原蛋白所活化。Vogel W.等人((2000),J.Biol.Chem.,275(8)：5779-5784)揭示了盤狀結構域受體1之活化與β1- 整合素無關。Bantscheff M.等人((2007),Nat Biotechnol.25(9)：1035-44)尤其揭示了受體酪胺酸激酶DDR1為酪胺酸激酶抑制劑伊馬替尼(imatinib)之目標。

本發明之盤狀結構域受體(DDR)為受體酪胺酸激酶亞家族之多肽，其具有與凝集素(lectin)盤有關的胞外結構域，係於黏菌盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum)中所發現。所有的亞家族享有大約160個-胺基酸-長的胺基末端盤狀同源結構域，接續著一個單一跨膜區和延伸的近膜區，以及催化性酪胺酸激酶結構域。

二種具有盤狀結構域同源性之受體酪胺酸激酶基因已於人類中選殖出並稱為盤狀結構域受體DDR1和DDR2。

DDR1出現至少五種異構型：

DDR1a(876AA)：NM_001954(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_001954；cDNA：SEQ ID No.1；蛋白：SEQ ID No.2)，DDR1b(913AA)：NM_013993(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_013993；cDNA：SEQ ID No.3；蛋白：SEQ ID No.4)，DDR1c(919AA)：NM_013994(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_013994；cDNA：SEQ ID No.5；蛋白：SEQ ID No.6)，以及DDR1d(登錄號AF353182)和DDR1e(登錄號AF353183)，其係以選擇性剪接所產生。

DDR1a和DDR1b受體異構型分別在近膜區(juxtamembrane)和激酶區缺乏37個或6個胺基酸。

DDR1d和DDR1e為缺乏整個激酶區或部分近膜區和ATP結合位置之截短型變體(Alves等人，(2001),FASEB J.,15(7)：1321)。

就DDR2，存有二種剪接異構型，亦即NM_006182.2(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_006182.2)和NM_001014796.1(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001014796.1；SEQ ID No.7)，轉譯之差異係與5’UTR有關。此等異構體編碼相同的蛋白(SEQ ID No.8)。

DDR蛋白序列經完整保存，包括該等來自人類、蠕蟲和蒼蠅的序列(Vogel,(2006),Cellular Signalling,18：1108-1116)。

鼠科DDR1多肽例如經公開為DDR1轉錄變體2，NCBI登錄號NM_172962。(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_172962；多肽：SEQ ID No.10；cDNA：SEQ ID No.9)。

大鼠DDR1多肽例如經公開為DDR1轉錄變體2，NCBI登錄號NM_001166022(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001166022；polypeptide：SEQ ID No.12；cDNA：SEQ ID No.11)。

獼猴DDR1多肽例如經公開為DDR1，ENSMMUT00000026155(http：//www.ensembl.org/Macaca_mulatta/Transcript/ Summary？db=core；g=ENSMMUG00000018601；h=BLAST_NEW：BLA_OBMblVC32！！20100804；r=4：30458895-30475882；t=ENSMMUT00000026155；多肽：SEQ ID No.14；cDNA：SEQ ID No.13)。

本發明係關於測定盤狀結構域受體DDR膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性之測試系統，其包含：a)至少一種細胞，其含有至少一種位於細胞質膜中的DDR多肽或其功能性衍生物，b)b1)或b2)中任一者：b1)能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體(binding partner)，其中該配合體為經標定的結合配合體，b2)能選擇性辨識磷酸酪胺酸及另一種結合配合體之結合配合體，其為經標定的結合配合體，且其能選擇性辨識該辨識磷酸酪胺酸之結合配合體，c)至少一種將細胞固定在固體支撐體並滲透此細胞之試劑，d)至少一種用於固定細胞及培養細胞之固體支撐體，e)至少一種膠原蛋白，f)視需要，至少一種疑似改變至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的化合物，及g)用於偵測b)或c)之結合配合體的裝置。

在另一實施例中，本發明係關於用於鑑定改變DDR膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性的化合物，特別是DDR1a、DDR1b、DDR1c及/或DDR2膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性，特言之，一或多個具有選自下列序列之多肽的膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性之方法：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14，其包括下列步驟：a)於固體支撐體上培養至少一種細胞，該細胞含有至少一種位於細胞質膜中的DDR多肽或其功能性衍生物，b)於步驟a)的細胞培養中加入至少一種膠原蛋白，特別是其中該膠原蛋白係選自第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白或第IV型膠原蛋白或其混合物，c)將步驟b)之細胞置於細胞緩衝液中培養，d)將步驟c)之細胞固定在固體支撐體上並滲透此固定的細胞，及視需要清洗細胞，e)在步驟d)之前，加入至少一種疑似改變至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的化合物，f)進行步驟f1)或f2)：f1)將結合配合體加到步驟d)之細胞中，其中該結合配合體能選擇性辨識磷酸酪胺酸，及該 結合配合體為經標定的結合配合體，f2)i)將結合配合體加到將步驟d)之細胞中，其中該結合配合體能選擇性辨識磷酸酪胺酸，ii)將另一種結合配合體加到將步驟i)之細胞中，其中該結合配合體為經標定的結合配合體，且其中另一種結合配合體能選擇性辨識該能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體，g)偵測經標定的結合配合體。

較佳地，若適當可包括清洗步驟。例如在固定滲透細胞後及在加入抗磷酸酪胺酸抗體之前，可包括一清洗步驟。在一較佳的實施例中，清洗細胞係在本發明方法步驟a)、步驟c)、步驟d)、步驟f1)、步驟f2i)及/或步驟f2ii)之後進行。清洗可使用熟習技術者已知之適當的緩衝劑，例如緩衝食鹽水溶液來進行。

請了解，所有下列實例係用於本發明之測試系統及方法。

在一較佳的實施例中，DDR多肽為哺乳動來源之多肽。在一較佳的實施例中，DDR多肽係選自DDR1a、DDR1b、DDR1c和DDR2。此等異構型，如用於實例中，例如為在人類、小鼠、大鼠和獼猴中已知的。

在一更佳的實施例中，DDR多肽可為人類多肽及/或可選自SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8或其組合之多肽。在另外較佳的實施例中，DDR多肽缺乏訊號胜肽。此訊號胜肽可存在或可刪 除，而並不會顯著地改變DDR活性。

在另外較佳的實施例中，DDR多肽可為鼠科多肽，較佳地鼠科DDR1多肽及更佳地鼠科DDR1a多肽，及/或可選自SEQ ID No.10之多肽。再者，DDR多肽可為大鼠DDR多肽，較佳地大鼠DDR1多肽及更佳地大鼠DDR1a多肽及/或選自SEQ ID No.12之多肽。此DDR多肽亦可為獼猴多肽，較佳地獼猴DDR1多肽及更佳地獼猴DDR1b多肽及/或可選自SEQ ID No.14之多肽。

根據本發明，可使用人類DDR蛋白，包括所有異構型和直系同源物(ortholog)。較佳的係使用人類DDR1a、人類DDR1b、人類DDR1c和人類DDR2。

在一特佳的實施例中，係使用根據SEQ ID No.2或由SEQ ID No.1所編碼之人類DDR1a多肽，根據SEQ ID No.4或由SEQ ID No.3所編碼之人類DDR1b多肽，根據SEQ ID No.6或由SEQ ID No.5所編碼之人類DDR1c多肽，及/或根據SEQ ID No.8或由SEQ ID No.7所編碼之人類DDR2多肽。在另外較佳的實施例中，DDR多肽係缺乏訊號胜肽。又在另一實施例中，可使用其組合物。

在另外特佳的實施例中，係使用根據SEQ ID No.10或由SEQ ID No.9所編碼之鼠科DDR1多肽，根據SEQ ID No.12或由SEQ ID No.11所編碼之大鼠DDR1多肽，及/或根據SEQ ID No.14或由SEQ ID No.13所編碼之獼猴DDR1多肽。

又，可使用來自其他生物體之DDR蛋白，特別是哺乳動物體。例如可使用來自小鼠、大鼠或獼猴，特別是小鼠之DDR1a、DDR1b、DDR1c。小鼠DDR1異構型已為所知且例如係描述於NCBI登錄號NM_007584.2、NM_172962.1、NM_001198831.1、NM_001198833.1，和小鼠DDR2多肽公開NCBI登錄號為NM_022563.2。小鼠和鼠科在文中可交換使用。

如實例中所示，本發明之方法可以各種人類DDR異構型及以鼠科DDR異構型來進行。因此，此方法非常有彈性。本發明之測試系統可含有這些異構型。

在另外較佳的實施例中，DDR多肽為大鼠、小鼠、獼猴、蒼蠅、蠕蟲、黏菌或魚類DDR多肽。

此外，可使用天然的DDR蛋白之功能性衍生物。DDR多肽之功能性衍生物係理解為與野生型DDR多肽，特別是具有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8序列之DDR多肽，具有至少80%序列一致性，更佳地至少90%序列一致性，甚佳地至少95%序列一致性，最佳地至少98%序列一致性，及實質上具有與野生型DDR多肽相同的膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用活性。在一較佳的實施例中，實質上相同的膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性係理解為至少10%、20%、30%、50%、70%或90%之野生型DDR多肽的膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性。此活性可如實例1中所說明來測定。特言之，可無訊號胜肽。在一較佳 的實施例中，功能性衍生物為來自小鼠、大鼠、獼猴、牛、豬、馬、魚或狗之非人類DDR1a、DDR1b、DDR1c或DDR 2的同系物。

根據本發明，係使用至少一種含至少一種位於細胞質膜之DDR多肽或其功能性衍生物的細胞。此定位可例如以免疫螢光法使用專一性辨識DDR多肽或其功能性衍生物之抗體來測定。

DDR多肽或其功能性衍生物之表現可例如以西方墨點分析使用專一性辨識DDR多肽或其功能性衍生物之抗體來測定。

在一較佳的具體實施例中，此細胞為哺乳動物來源之細胞。在另一較佳的實施例中，此細胞為哺乳動物細胞。在另外的實施例中，此細胞能穩定表現DDR多肽或其功能性衍生物。在一實施例中，該至少一種DDR多肽或其功能性衍生物係以轉殖基因來表現。在一較佳的實施例中，細胞係由重組產生。較佳地，此等細胞係以適合的載體系統轉染細胞而得。

以DNA轉染產生穩定和不穩定(過渡的)細胞或細胞株。過渡細胞株係反映轉染的DNA之非染色體形式的存活；穩定的細胞株據了解係由整合入基因組使轉染的基因穩定表現所產生。細胞可使用任何適當的方法，包括病毒載體、化學轉染物、電穿孔、磷酸鈣共沉澱及DNA直接擴散來轉染。

細胞可如熟習技術者所知來分離、保存和培養。除 了溫度和氣體混合物外，細胞培養系統中最常見的變化因子為生長培養基。生長培養基之配方可就(尤其是)pH、葡萄糖濃度、生長因子和其他營養組分之存在來變化。用於添補培養基之生長因子通常係由動物血液所衍生，例如牛血清。如熟習技術者所知，藉由插入所指組份之全長編碼序列，可得到基因改造細胞。熟習本項技術者已知如何衍生編碼彼等之核酸序列及如何使用標準的分子生物技術來分離或製造此核酸序列。此可例如使用限制酶藉由使用和組合現存的序列來進行。核酸可與另外的元素，例如啟動子和轉錄起始及停止訊號組合，以提供DDR多肽之表現。如文中所用，載體為將轉殖基因運送到細胞之試劑，並可包括適當的轉錄和轉譯控制訊號，例如啟動子。載體可為質體、病毒或其他本項技術中已知者。啟動子可為可誘導或建構性、通用或細胞專一性、核或細胞質專一性啟動子。啟動子、載體和其他元素之選擇為本項技術之一般技術者層級內常規設計之事項。許多此等元素係描述於文獻中並可由市面供應商來取得。

在實例中，係使用pcDNA5-FRT-TO_DEST載體，並轉染Flp-In^TM-CHO細胞(Invitrogen)。因此，在一較佳的實施例中，該細胞為以編碼至少一個DDR多肽或其功能性衍生物之多核苷酸轉染的哺乳動物細胞，特言之，該細胞為轉染的CHO細胞，最佳地轉染的Flp-In^TM-CHO細胞。

在一特佳的具體實施例中，係使用哺乳動物細胞，最佳地Flp-In^TM-CHO細胞做為親代細胞。Flp-In^TM-CHO細胞在轉錄上具活性的基因座上含有單一穩定結合的FRT位置。該Flp-In^TM-CHO細胞係以pFRT/lacZeo2轉染CHO細胞並選擇具Zeocin^TM-(Invitrogen)阻抗性選殖株所產生。Flp-In^TM表現載體和Flp重組酶載體pOG44之共轉染使表現載體標的性整合至每個細胞之相同的基因座。

在一較佳的具體實施例中，親代細胞不含有位於細胞質膜之DDR多肽。如實例1所示，如西方墨點分析所測定，Flp-In^TM-CHO不具有顯著的DDR表現。

視需要，細胞可為組織之部分；然而，本發明方法較佳地為活體外方法。在一較佳的具體實施例中，該細胞係來自細胞株(其中許多已完全定性並提供恆定狀況和方便處理)，特別是哺乳動細胞株，更特別是人類或小鼠細胞株。適合的細胞株之實例包括(但不限於)HEK 293、745-A、A-431、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-1、CC531、CFPAC、CHO、CHO K1、COS-1、COS-7、CV-1、EAHY、EAHY 926、F98、GH3、H-295 R、H-4-II-E、HACAT、HACAT A131、HEK、HEL、HeLa、Hep G2、High Five、Hs 766T、HT29、HUV-EC R24、HUV-EC-C、IEC 17、IEC 18、Jurkat、K 562、KARPAS-299、L 929、LIN 175、MAt-LYLU、MCF-7、MNEL、MRC-5、MT4、N64、NCTC 2544、NDCK II、Neuro 2A、NIH 3T3、 NT2/D1、P19、SF9、SK-UT-1、ST、SW 480、SWU-2 OS、U-373、U-937和Y-1。其他適合的細胞為熟習本項技術者已知之細胞。

將轉殖基因導入受體細胞之過程稱為轉染。一般而言，細胞株係以任何上述的方法來轉染，其中該轉殖基因係操作上與可選擇的標記相連接。在轉染細胞生長後，例如於強化培養基數天後，然後再換至選擇性培養基。轉染的細胞對該選項具有抗性並能生長，而非-轉染的細胞一般則會死亡。可選擇的標記之實例包括嘌呤黴素(puromycin)、博來黴素zeocin)、新黴素(neomycin)(neo)和潮黴素B(hygromycin B)，其分別給予抗嘌呤黴素、博來黴素、胺基糖甘G-418和潮黴素之抗性。然而，其他熟習技術者已知的選擇方法可能亦為適合的。

如上所述，細胞可於適合的培養基(例如包括血清和抗生素之市售培養基)中培養。細胞通常係在適合的氣壓(5% CO₂)、相對濕度(例如90%)和溫度(例如於37℃)中培養。對於高通量篩選及/或方便操作之細胞可於多孔盤，例如96孔盤、24孔盤等等中培養。將實例中之Flp-In-CHO細胞植入完全培養基中並於37℃和5% CO₂下培養24小時。

可使用有或無FCS之培養基來培養細胞。在實例中，培養基為F-12K營養素混合物、青黴素/鏈黴素(Pen/Strep)、10% FCS和潮黴素(300μg/ml)。

在一較佳的實施例中，測試系統另包括定量細胞， 特別是活細胞之方法。此為細胞數目與訊號媒介的標記之關聯性，特別是源自DDR多肽偵測之螢光。因此，在一較佳的實施例中，係使用另外至少一種將細胞染色的試劑，特別是將細胞核染色之試劑。特言之，如實例中所示，可使用Hoechs染劑HOE 33342。此步驟可在固定和滲透細胞後來進行。較佳地，此步驟係在於細胞中添加能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體後進行。特言之，此步驟係與於細胞中添加能選擇性辨識該選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體的結合配合體同時進行。在一實施例中，Hoechst染劑HOE 33342可用將細胞核染色。因此，在一實施例中，係加入至少一種將細胞染色之試劑，特言之，加入至少一種用於將細胞核染色之試劑，其中該步驟係在本發明方法之步驟d)之後再進行，較佳地與本發明方法之步驟f1)、f2)i)或f2ii)同時進行。

在另一較佳的具體實施例中，能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體為抗酪胺酸抗體或抗體片段。此等抗體已為本項技術所知。

在另外較佳的具體實施例中，測試系統係包括經標定且能選擇性辨識該能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體的另外結合配合體。因此，測試系統之b2)的變化和本發明方法之變化型f2)為較佳。較佳地，能選擇性辨識該選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體的另外結合配合體為一抗體或抗體片段。因此，在此具體實施例中，此另外的結合配合體為辨識初級抗磷酸酪胺酸抗體之經標 定的二級抗體。

因此，在一特佳的具體實施例中，係使用選擇性辨識磷酸酪胺酸之初級抗體或抗體片段，及選擇性辨識該初級抗體之二級經標定的抗體或抗體片段。在實例中，係使用於兔子中所產生的抗磷酸酪胺酸抗體(Sigma，型號T-1575)作為初級抗體。此抗體為較佳的本發明之抗體。在另外較佳的具體實施例中，可使用Alexa Fluor F(ab)2片段山羊抗兔IgG(Alexa)作為標定的二級抗體。此抗體係顯示可有效用於本發明之實例中。

在一較佳的具體實施例中，係在加入選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體，特言之，抗磷酸酪胺酸抗體或抗體片段之前，加入阻斷緩衝液並培養。阻斷緩衝液可在固定細胞及滲透細胞之後加入。阻斷緩衝液已為本項技術所知。例如可使用描述於實例1之阻斷緩衝液。

在本文中，術語抗體或抗體片段係理解為有意義的抗體、抗體片段或其抗原結合部分，特言之，抗體之互補決定區(CDR)，其係經重組製備，且若適當，經修飾，例如嵌合抗體、人源化抗體、多功能性抗體、雙專一性或寡專一性抗體、單鏈抗體及Fab、Fab’或F(ab)₂片段(參見，例如EP-B1-0 368 684、US 4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213或WO 98/24884)，由Fab表現庫所產生的片段、抗獨特型(抗-Id)抗體及任何上述之表位結合片段。

其亦可為經典型抗體之替代物，例如使用蛋白骨架 作為結合配合體，例如以脂質運載蛋白(lipocalin)為主的抗運載蛋白(anticalin)(Beste等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,1898-1903)。天然的脂質運載蛋白之配體結合位置，例如視黃醇結合蛋白或後膽色素結合蛋白，可例如藉由「組合蛋白設計」法來改變，以此種方式，其係與選擇的半抗原(hapten)結合(Skerra,2000,Biochim.Biophys.Acta,1482,337-50)。其他已知的蛋白架構已知為分子辨識抗體之替代物(Skerra(2000)J.Mol.Recognit.,13,167-187)。

根據本發明，係使用至少一種經標定的結合配合體。該標籤可為可用於偵測之任何共價或非共價結合的化學實體。可使用常見的標定方法來標定一或多個在結合配合體表面上的功能基團。這些可為例如，存在各多肽鏈之N-端和離胺酸殘基之側鏈的一級胺基基團；存在半胱胺酸殘基上藉由將二硫鍵以還原劑處理，或以例如SATA試劑修飾離胺酸殘基所得到之巰基基團。結合配合體可以一系列不同的試劑標定，例如生物素(用於親和素-生物素化學)、酵素、用於以例如FITC、螢光素、羅丹明(rhodamine)、Cy染劑或Alexa fluors標定胺、巰基或其他功能機團之活化的螢光染劑。亦可使用放射活性標籤，例如³H、³²P、³⁵S、¹²⁵I或¹⁴C以及常見的酵素標籤，包括青黴素酶、辣根過氧化酶及鹼性磷酸酶。

在一較佳的具體實施例中，係使用螢光標定的結合配合體，特別是螢光標定的抗體或抗體片段。較佳地， 該經標定及能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體為螢光標定之結合配合體。因此，在一特佳的具體實施例中，係使用專一性辨識抗-磷酸酪胺酸抗體或抗體片段之螢光標定的抗體或抗體片段。在此具體實施例中，該抗-磷酸酪胺酸不需要標定，較佳地，該抗-磷酸酪胺酸係未經標定或經與專一性辨識抗-磷酸酪胺酸抗體或抗體片段之抗體或抗體片段標籤不同的標籤標定。

螢光為一種光學現象，其中光子的分子吸收觸發了另外具較長波長的光子發射。吸收和發射光子間能量的差異最終變為分子震動或熱。通常，吸收光子係在紫外線範圍內，而發射光係在可見光範圍內，但此乃依特定螢光團之吸收曲線和斯托克斯位移(Stokes shift)而定。螢光應用的次數在生物醫學和相關科學中逐漸成長。儘管縮寫形式之不合宜的命名法越來越多，這些領域中之分析方法亦逐漸成長，例如FLIM、FLI、FLP、CALI、FLIE、FRET、FRAP、FCS、PFRAP、smFRET、FIONA、FRIPS、SHREK、SHRIMP、TIRF。大多數這些技術係依賴螢光顯微鏡。這些顯微鏡係於觀察下使用高密度光源，通常為汞或氙燈、LED或雷射來激發樣本之螢光。然後以光學濾波器分離激發光和發射螢光，以眼睛，或以(CCD)攝影機或其他光偵測器(光電倍增管、攝譜儀等)來偵測。

較佳地，係使用螢光染劑作為標籤以便於偵測所要的訊號之效應(本處為DDR多肽之膠原蛋白引發自動-/轉磷酸作用)。螢光染劑包括螢光團。螢光團，類似發色 團，為造成分子具螢光之分子組份。其為分子中之功能基團，其吸收特定波長之能量及以不同的(但同等特定的)波長再發射能量。發射能量之量和波長係依照螢光團和螢光團的化學環境而定。異硫氰酸螢光素，一種螢光素之反應性衍生物，為化學上與其他非螢光分子相連接以產生新的和螢光分子供各種應用之最常見的螢光團之一。其他史上常見的螢光團為羅丹明、香豆素(coumarin)和花青(cyanine)之衍生物。螢光染劑之實例包括(不限於)7-胺基-放射菌素D、吖啶橙、吖啶黃、Alexa Fluor、AnaSpec、金黃胺O、金黃胺-羅丹明染劑、苯并蒽酮、9,10-雙(苯乙炔基)蔥、5,12-雙(苯乙炔)稠四苯、CFDA-SE、CFSE、鈣黃綠素(calcein)、羧基螢光素、1-氯-9,10-雙(苯乙炔基)蔥、2-氯-9,10-雙(苯乙炔基)蔥、香豆素、花青、DAPI、Dioc6、DyLight Fluor、溴化乙錠(ethidium bromide)、螢光素、Fura-2、Fura-2-乙醯氧基甲基酯、綠色螢光蛋白、Hilyte Fluor、Hoechst染劑、印度黃、Indo-1、螢光素(luciferin)、二萘嵌苯(perylene)、藻膽素(phycobilin)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、藻紅膽素(phycoerythrobilin)、碘化丙錠(propidium iodide)、螢光黃(pyranine)、羅丹明、(RiboGreen)、紅螢烯(rubrene)、三(菲咯啉二磺酸)釕(II)、SYBR綠、二苯乙烯(stilbene)、磺醯羅丹明101、TSQ、德州紅(Texas Red)、傘形花內酯(umbelliferone)和黃色螢光蛋白。如實例中所述，較佳的係使用Alexa Fluor。

在本發明內文中，螢光染劑係共價或非共價與本發明之結合配合體鍵結，較佳地，其係共價鍵結。

對於本發明之方法，可使用任何適合的偵測。此偵測為適合偵測標籤之系統。在一實施例中，該分析為DELFIA(解離增強鑭系元素螢光免疫分析)、FRET(螢光共振能量轉移)分析或TR-FRET(時差性螢光共振能量轉移)分析。

DELFIA(解離增強鑭系元素螢光免疫分析)分析為固相分析。抗體通常係以銪或另外的鑭系元素標定並清洗未結合的銪標定抗體後，偵測銪螢光。

在一較佳的具體實施例中，用於偵測之裝置係適合偵測螢光。此等偵測裝置係用來偵測螢光標籤。

在一較佳的具體實施例中，用於偵測之裝置為自動化或半自動化。特言之，用於偵測之裝置為共軛焦顯微鏡。特言之，如實例中所述，可使用ImageXpress Ultra共軛焦高通量篩選系統(Molecular Devices)。又，在另外的實施例中，可使用螢光微孔盤細胞儀，例如Acumen Explorer^TM。

在一較佳的實施例中，用於固定細胞和培養細胞之固體支撐體為多孔盤，特言之包括12孔或更多，24孔或更多，48孔或更多，96孔或更多，384孔或更多。

固體支撐體，使用適合的試劑，係適合用於培養其上的細胞，及用於固定其上的細胞。

固定細胞可以本項技術中已知的適合試劑來進行。 特言之，亦如實例中所述，可使用多聚甲醛。又，亦如實例中所述，可另外加入原釩酸鹽，特別是原釩酸鈉來固定試劑，以便於阻斷磷酸酶活性。

對於細胞滲透，可使用本項技術中已知的適合試劑。特言之，亦如實例中所述，可使用Triton-X-100。

在一較佳的具體實施例中，該測試系統係包含：a)至少一哺乳動物細胞，較佳地至少一CHO細胞，更佳地至少一Flp-In-CHO細胞，其係表現至少一種位於細胞質膜、選自哺乳動物DDR1a、DDR1b、DDR1c和DDR2之哺乳動物DDR多肽，b)一抗磷酸-酪胺酸抗體或抗體片段c)一選擇性與抗磷酸-酪胺酸抗體或抗體片段結合之螢光標定的抗體或抗體片段，d)一包括至少12孔之多孔盤，e)至少一哺乳動物膠原蛋白，f)視需要，至少一種疑似改變至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用的化合物，及g)用於偵測d)孔槽中之螢光量的偵測裝置。

在另一較佳的具體實施例中，本發明方法係使用這些測試系統之組成份來進行。

本發明之測試系統和方法係利用至少一種膠原蛋白。該膠原蛋白係用來媒介DDR多肽之膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用。膠原蛋白為一組天然生成的蛋白。 基本上，僅在動物中發現，特別是哺乳動物之肉和結締組織。膠原蛋白的辨別特徵為在這些膠原蛋白亞單位之各三條鏈上的胺基酸規則排列。順序通常係依照Gly-Pro-X或Gly-X-Hyp之模式，其中X可為任何各種的其他胺基酸殘基。

在一較佳的具體實施例中，膠原蛋白為哺乳動物來源之膠原蛋白，特言之來自人類、大鼠或小鼠之膠原蛋白。最佳地，該膠原蛋白為人類膠原蛋白。已辨識出29種膠原蛋白，第I至XXIX型膠原蛋白，其中以第I、II、III、IV和V型膠原蛋白為最常見。

在一較佳的具體實施例中，膠原蛋白係選自第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白或第IV型膠原蛋白，或其混合物。這些膠原蛋白特佳的為DDR1異構型和直系同源物。在一較佳的具體實施例中，膠原蛋白係選自人類第I型膠原蛋白、人類第II型膠原蛋白、人類第III型膠原蛋白和人類第IV型膠原蛋白，或其混合物。在另外較佳的具體實施例中，可使用大鼠第I型膠原蛋白、大鼠第II型膠原蛋白、大鼠第III型膠原蛋白或大鼠第IV型膠原蛋白，或其混合物。在另外較佳的具體實施例中，係使用纖維膠原蛋白。此等膠原蛋白為纖維形成的。此等膠原蛋白特別可用於DDR2異構型和直系同源物。

在一較佳的具體實施例中，根據本發明方法添加，及存在本發明測試系統中之至少一種膠原蛋白係溶於適 當的溶劑，較佳地溶於酸性溶劑中。適合的溶劑已為本項技術所知，特言之，乙酸及/或HCl，例如可使用0,1N HCl做為酸性溶劑。特言之，如實例1所述，可使用乙酸，更佳地0,1%乙酸或0,1N乙酸。在一特佳的具體實施例中，至少一種膠原蛋白係在根據本發明方法添加之前，溶於溶劑中。

以膠原蛋白培養的時間可不同並可就各培養基、DDR多肽和膠原蛋白作最適化。典型地，膠原蛋白培養係進行約5分鐘至約4天。在一較佳的實施例中，膠原蛋白培養係進行約10分鐘至約60小時，更佳地約1至36小時，甚佳地約1至25小時，最佳地約2至18小時。就本發明之特定的實驗設定，在實施例中決定最適化膠原蛋白培養時間為約2小時和約18小時。

根據本發明，「大約」請了解係指實驗錯誤範圍，特言之±5%或±10%。

細胞培養可在各種細胞緩衝液中進行。適合的細胞緩衝液使細胞得以存活。根據本發明可使用完全培養基或無FCS之培養基。在一較佳的具體實施例中，細胞緩衝液，視需要，為包含FCS之培養基。FCS可以各種濃度存在。特言之，如實例1所例示，培養基可含有約0,1%至20% FCS，特言之，約1%至約10% FCS。FCS係被了解為指胎牛血清。

在一較佳的具體實施例中，此方法係以中度通量分析或高通量分析來進行。較佳地此方法係以高通量分析 來進行。在此方法中，係於全細胞分析中篩檢大量的化合物。典型地，這些篩檢係使用自動、機器人站為基礎之技術於至少96孔盤中或以高密度陣列(「晶片」)模式來進行。

本發明方法分別可用於篩檢診斷劑及/或供診斷、預防及/或治療涉及DDR多肽疾病之醫藥品，特言之，用於預防及/或治療任何上述疾病。若用於篩檢目的，該試驗化合物可為一其功能仍未知或尚未與DDR多肽相關之化合物。又，此方法可用於鑑定改變膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用之新化合物。另外，已知改變膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用之化合物可使用本發明方法來試驗其效用，特別是用於定量。

在一較佳的具體實施例中，係進行定量偵測。特言之，該偵測裝置可配置轉化數值之實驗參數的軟體。

在一特佳的具體實施例中，係測定至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的濃度依賴改變。因此，較佳地係測定至少二種不同濃度的化合物之改變。

改變可為抑制或活化，較佳地抑制。特言之，係測定DDR多肽之磷酸化%。特言之，就抑制性化合物而言，係測定IC₅₀值。

如上述，疑似改變DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的化合物可為任何化學性質之物質。其可為一已知的藥物或醫藥品或疾病診斷 劑。另外，在另一具體實施例中，其可為已知的化合物但尚未了解是否具有治療或診斷效用，及該化合物可為新穎的或目前未知的化合物。該試劑亦可為物質或化合物之混合物。

在一具體實施例中，化合物係以化學化合物庫之形式提供。化學化合物庫包括多數個化學化合物並已從任何多個來源匯集，包括化學合成分子或天然產物或由組合化學技術所產生者。其特別適合用於高通量篩檢並可包括特別結構之化合物或特別有機體，例如植物之化合物。在本發明內文中，化學化合物庫較佳地為包括蛋白質和多肽或小的有機分子之儲庫。較佳地，小的有機分子之大小係低於500道爾頓，特別是可溶性、非寡聚性有機化合物。

在另外較佳的具體實施例中，該化合物為生物分子，如抗體或抗體片段、抗體模擬物、胜肽或RNA分子或其儲庫。

改變DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的化合物可為抑制劑或活化劑。較佳地為抑制劑。

在一較佳的具體實施例中，該抑制劑係以至少5%，更佳地10%、30%、50%、70%或90%的對照量，抑制DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用。膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用可如實例1所述來測定。

在另外較佳的實施例中，該抑制劑具有低於約1μg/μl之IC₅₀值，較佳地低於約100ng/μl，更佳地低於約10ng/μl，最佳地低於2 ng/μl。IC₅₀值可如實例1所示來測定。

在另外較佳的實施例中，該抑制劑具有低於約10 μM之IC₅₀值，較佳地低於約1 μM，更佳地低於約0.1 μM，甚佳地低於約10 nM，最佳地低於約7 nM。

該化合物可在細胞固定於固體支撐體之前的任何時間點加入並滲透該固定的細胞，及視需要清洗細胞。在一較佳的具體實施例中，該化合物係在添加膠原蛋白之前、同時或之後加入。

下列實驗係顯示：測試系統和方法藉由使用適合的各種濃度之無或有FCS培養基，而得以測定細胞系統中DDR1之膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用之IC₅₀值。又，可使用任何DDR1或DDR2直系同源物或異構型，包括哺乳動物或非哺乳動物之直系同源物或異構型。此外，在活化DDR之自動-/轉磷酸作用之範圍內，可使用各種膠原蛋白。又，對於投予的膠原蛋白可使用各種培養時間，以及培養濃度如，例如可進行抑制性或活化性試劑之預培養或與膠原蛋白同時投予調節化合物來進行。又，本發明之測試系統和方法可用於定量測定化合物試劑或生物分子如，例如調節DDR多肽之膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用的胜肽或抗體。再者，此等測試系統和方法可以各種分析模式來進行如，例如12-孔、24- 孔、48-孔、96-孔或384-孔盤模式。此分析可以中度或高通量分析模式來進行。

SEQ ID No.1係顯示編碼人類DDR1a之cDNA(NM_001954；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_001954)

SEQ ID No.2人類DDR1a多肽序列(NM_001954；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_001954)

SEQ ID No.3係顯示編碼人類DDR1b之cDNA(NM_013993；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_013993)DDR1b(913AA)：NM_013993

SEQ ID No.4係顯示人類DDR1b多肽序列(NM_013993；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_013993)

SEQ ID No 5係顯示編碼人類DDR1c之cDNA(NM_013994；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_013994)

SEQ ID No.6係顯示DDR1c多肽序列(NM_013994；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val=NM_013994)

SEQ ID No.7係顯示編碼人類DDR2之cDNA(NM_001014796.1(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001014796.1)

SEQ ID No.8係顯示人類DDR2多肽序列(NM_001014796.1(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001014796.1)

SEQ ID No.9係顯示編碼鼠科DDR1多肽之cDNA(transcript variant 2；NM_172962；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_172962)

SEQ ID No.10係顯示鼠科DDR1多肽序列(NM_172962；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_172962)

SEQ ID No.11係顯示編碼大鼠DDR1多肽之cDNA(轉錄變體2；NM_001166022.1；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001166022)

SEQ ID No.12係顯示大鼠DDR1多肽序列(NM_001166022.1；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001166022.1)

SEQ ID No.13係顯示編碼獼猴DDR1多肽之cDNA ENSMMUT00000026155 http：//www.ensembl.org/Macaca_mulatta/Transcript/Summary？db=core；g=ENSMMUG00000018601；h=BLAST_NEW：BLA_OBMblVC32！！20100804；r=4：30458895-30475882；t=ENSMMUT00000026155)

SEQ ID No.14係顯示獼猴DDR1多肽序列(ENSMMUT00000026155 http：//www.ensembl.org/Macaca_mulatta/Transcript/Summary？db=core；g=ENSMM UG00000018601；h=BLAST_NEW：BLA_OBMblVC32！！20100804；r=4：30458895-30475882；t=ENSMMUT00000026155)

實例 實例1

對於分析系統之設定，係將Flp-In CHO細胞以SEQ ID No.1之異構型DDR1a的人類全長基因穩定轉染。另外，Flp-In CHO細胞以SEQ ID No.9之鼠科全長基因、SEQ ID No.11之大鼠全長基因或SEQ ID No.13之獼猴全長基因穩定轉染。這些細胞株係於質膜以正確的定位表現對應的DDR1異構型。此表現係以西方墨點分析來確認，且該正確的生理定位係以免疫螢光實驗來偵測。在親代細胞株中，使用上述方法無法偵測到DDR1表現。將表現人類或鼠科DDR1之細胞植入含1-10% FCS的完全培養基之透明底、黑色96-孔或384-孔微量滴定盤中。將細胞於CO₂(5%)培養器中以37℃培養至隔夜後，將細胞以市售第I型膠原蛋白處理2小時。將表現大鼠或獼猴DDR1之細胞植入含1-10% FCS的完全培養基之透明底、黑色96-孔或384-孔微量滴定盤中。將細胞於CO₂(5%)培養器中以37℃培養4-6小時後，將細胞以市售第I型膠原蛋白處理12-18小時。若需要，在投予膠原蛋白之前或同時可投予各種劑量之疑似改變 DDR1活性的化合物，用於偵測對應的IC₅₀值。之後，將細胞固定及滲透。然後，將其置於阻斷緩衝液中培養，及隨後以抗磷酸酪胺酸抗體培養至隔夜。此抗體與存在細胞內的所有磷酸酪胺酸結合。隔天將經螢光染劑標定的對應第二抗體投予細胞並培養1小時。同時，以對細胞核專一性之染劑處理細胞核。

以對應的測量系統如，例如Molecular Devices或system Acumen公司之ImageXpress偵測標定細胞的密度。以特定的軟體法分析所測量的數據，測定DDR1磷酸化之百分比。實驗的流程概述係如圖6所示。

使用此法，測定與化合物，如抗體或小的化學分子之DDR1多肽磷酸化抑制作用有關的IC₅₀值。

實驗中係使用下列試劑：

載體：pcDNA5-FRT-TO_DEST(Invitrogen Life Technologies)

細胞：CHO Flp-In wt供產生穩定表現CHO-hDDR1a、CHO-mDDR1a、CHO-大鼠DDR1a、CHO獼猴DDR1、CHO-hDDR1b和CHO-hDDR1c。

培養基：F-12K營養素混合物(Kaighn’s Modification；Gibco，型號：21127)、Pen/Strep(PAN)、10% FCS(PAN)、潮黴素300μg/ml(Roche Diagnostics Deutschland GmbH)

緩衝液：PBS

試劑：第I型膠原蛋白(鼠尾；Sigma)、膠原蛋白人類VitroCol(AdvancedBiomatrix)；乙酸0,1%；正釩酸鈉 20μM；多聚甲醛4%；Triton X-100；Tween 20；Odyssey阻斷緩衝液(LI-COR，型號：P2151)；抗-磷酸酪胺酸兔(Sigma，型號：T-1575)；抗-磷酸酪胺酸小鼠4G10(Upstate，型號：05-321)；Alexa Fluor 488 F(ab)2片段山羊-抗-兔IgG(Invitrogen，型號：A11070)；Alexa Fluor 488 F/ab)2片段山羊-抗-小鼠IgG(Invitrogen型號：A11017)；HOE 33342(Invitrogen，型號：H3570)

細胞培養盤：BD Falcon,96孔

參照化合物：抗人類DDR1抗體(R&D Systems，型號：AF2396)

Normal Goat IgG(R&D Systems，型號：AB-108-C)達沙替尼(Sprycel,BMS-354825)；伊馬替尼(Gleevec,STI-571)；尼羅替尼(Tasigna,AMN107)

實例2

以SEQ ID No.3之人類DDR1b和SEQ ID No.5之DDR1c據此進行對應的實驗。

實例3

實驗設置顯示可應用於不同的細胞緩衝液條件：於細胞為基礎的系統中，藉由使用穩定表現全長DDR1蛋白之CHO-Flp-in細胞株，使用含不同FCS濃度之CHO培養基培養，於DDR1之膠原蛋白引發的自動-/轉磷酸作用期間進行DDR1之自動-/轉磷酸作用的定量測定。這些不同的細胞緩衝液之結果係如圖1所示。其可能顯示，本發明之方法可使用含不同FCS濃度的CHO培養 基作為細胞緩衝液來進行。

實例4

膠原蛋白引發的DDR1和DDR2活性之潛在調節劑之效用可使用此分析來測定。此可以中度-至高度-通量分析模式來進行。在此實驗中，市售的抗-hDDR1抗體(R&D Systems，型號AF2396；多株山羊IgG；免疫原：小鼠多發性骨髓瘤細胞株NS0，係衍生自重組的人類DDR1,Asp21-Thr416)，其係與抗DDR1的胞外區有關，顯示於各種細胞緩衝液條件下，依調節劑的濃度抑制了膠原蛋白引發的DDR1磷酸化作用。加入各種濃度的抗體。其可測定出在CHO培養基中IC₅₀值為約0.5 ng/μl。結果係如圖2所示。

實例5

ABL激酶或SRC家族激酶之臨床抑制劑顯示顯著地抑制膠原蛋白引發的DDR1磷酸化。達沙替尼，一種此類的抑制劑，經測定具有約7 nM之IC₅₀(10% FCS；參見圖3A)。圖5A和5B顯示伊馬替尼(圖5A)和尼羅替尼(圖5B)抑制大鼠之膠原蛋白引發的hDDR1磷酸化。伊馬替尼之IC₅₀為約0.89 μM(10% FCS)；尼羅替尼之IC₅₀經測定為約0.096 μM(10% FCS)。

實例6

在此實驗中係使用穩定表現小鼠全長DDR1a之Flp-In-CHO細胞。將細胞以大鼠膠原蛋白刺激2小時。使用專一性抗-DDR1 pAB抗體作為抑制劑。結果係如圖 3B所示。IC₅₀經計算為約2.4 ng/μl。

實例7

在此實驗中係使用穩定表現人類全長DDR1a(SEQ ID No.1)之Flp-In-CHO細胞。將細胞以大鼠膠原蛋白刺激2小時。使用如實例1中所述之市售專一性抗-DDR1抗體作為抑制劑。結果係如圖2所示。抗體之IC₅₀經計算為約0.025 μg/孔，相當約0.5 ng/μl。

實例8

就實驗的第一部分係使用人類第I型膠原蛋白(新生兒纖維母細胞)來刺激人類DDR1磷酸化。此實驗係於一般的培養基中進行。在2或6小時並無觀察到磷酸化發生。對於磷酸化，最適合的膠原蛋白培養時間經測定為約18小時。

就實驗的第二部分係使用大鼠第I型膠原蛋白(鼠尾)來刺激人類DDR1磷酸化。對於磷酸化，最適合的膠原蛋白培養時間經測定為約2小時。

就二個實驗部分，係測定專一性抗-DDR1抗體pAB之IC₅₀。就人類膠原蛋白之實驗，IC₅₀為約1.8 ng/μl，就大鼠膠原蛋白，IC₅₀為約1.7 ng/μl。圖4A和4B係顯示人類第I型膠原蛋白引發的DDR1磷酸化係以劑量依賴的方式受專一性抗-DDR1抗體抑制，與大鼠第I型膠原蛋白(鼠尾)所引起的做比較。

圖1A係顯示於+和-FCS CHO培養基中所測定的hDDR1a之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用。

圖1B係顯示於-FCS CHO培養基中所測定的hDDR1c之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用。

圖1C係顯示於CHO培養基中所測定的大鼠DDR1之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用。

圖1D係顯示於CHO培養基中所測定的獼猴DDR1之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用。

圖2係顯示CHO培養基中劑量依賴抑制人類DDR1a之自動-/轉磷酸作用。大鼠膠原蛋白I-引發hDDR1a磷酸作用係以劑量量依賴的方式受到市售專一性抗-DDR1抗體抑制。IC₅₀經測定為約0.5 ng/μl。

圖3A係顯示abl激酶或src家族激酶之臨床抑制劑顯著地抑制人類DDR1之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用。就達沙替尼(Dasatinib)作為抑制劑，IC₅₀經測定為約10 nM。

圖3B係顯示大鼠膠原蛋白I-引發mDDR1a自動-/轉磷酸作用係以劑量依賴的方式受到專一性抗-DDR1 pAB抗體抑制。IC₅₀經測定為約2.4 ng/μl。

圖4A、4B和4C係顯示人類膠原蛋白I引發hDDR1a酪胺酸磷酸化作用及人類膠原蛋白I引發hDDR1a磷酸化作用，同樣係以劑量依賴的方式受到專一性抗-DDR1抗體抑制，與第I型大鼠膠原蛋白(鼠尾)所引發的作比 較。

圖5A和5B係顯示伊馬替尼(imatinib)(圖7A)和尼羅替尼(nilotinib)(圖7B)抑制大鼠膠原蛋白-引發的hDDR1磷酸化作用。伊馬替尼之IC₅₀為約0.89 μM(10%FCS)；尼羅替尼之IC₅₀為約0.096 μM(10% FCS)。

圖6係顯示實例中所依循的典型實驗方法。

<110> Sanofi

<120> 用於鑑定改變DDR活性的化合物之測試系統及方法

<130> DE2011/081 WO PCT

<150> EP 11305488.6

<151> 2011-04-26

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3840

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 876

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<211> 3703

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 9

<210> 10

<211> 874

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 10

<210> 11

<211> 2834

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 11

<210> 12

<211> 910

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 2742

<212> DNA

<213> 獼猴

<400> 13

<210> 14

<211> 913

<212> PRT

<213> 獼猴

<400> 14

Claims (16)

1. 一種測定盤狀結構域受體(DDR)膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性之測試系統，其包含：a)至少一種細胞，其含有至少一種位於該細胞質膜中之DDR多肽或其功能性衍生物，b)b1)或b2)中任一者：b1)能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體(binding partner)，其中該配合體為經標定的結合配合體，b2)能選擇性辨識磷酸酪胺酸及另一種結合配合體之結合配合體，其為經標定的結合配合體，且其能選擇性辨識該辨識磷酸酪胺酸之結合配合體，c)至少一種將細胞固定在固體支撐體並滲透此細胞之試劑，d)至少一種用於固定細胞及培養細胞之固體支撐體，e)至少一種膠原蛋白，f)視需要，至少一種疑似改變至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的化合物，及g)用於偵測b)或c)之結合配合體的裝置。
2. 如申請專利範圍第1項之測試系統，a)其中該細胞及/或DDR多肽為哺乳動物來源，及/或b)其中至少一種DDR多肽或其功能性衍生物係表現在哺乳動物細胞中，特別是CHO細胞，及/或c)其中該DDR多肽係選自DDR1a、DDR1b、DDR1c 和DDR2。
3. 如前述申請專利範圍中任一項之測試系統，其中該DDR多肽為哺乳動物，較佳地人類多肽，及/或係選自根據SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14之多肽或其組合。
4. 如前述申請專利範圍中任一項之測試系統，其中該選擇性辨識如申請專利範圍第1項b1)或b2)之磷酸酪胺酸之結合配合體為抗-酪胺酸抗體或抗體片段。
5. 如前述申請專利範圍中任一項之測試系統，其中該標定的結合配合體為經螢光標定之結合配合體。
6. 如前述申請專利範圍中任一項之測試系統，其中如申請專利範圍第1項g)之偵測裝置係適用於偵測螢光。
7. 如前述申請專利範圍中任一項之測試系統，其中該膠原蛋白係選自第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白或第IV型膠原蛋白或其混合物。
8. 如前述申請專利範圍中任一項之測試系統，其中該細胞為重組細胞。
9. 如前述申請專利範圍中任一項之測試系統，其中該測試系統另包含至少一種用於將細胞染色、特別是用於將細胞核染色之試劑。
10. 如申請專利範圍地1至9項中任一項之測試系統，其胞含：a)至少一哺乳動物細胞，特別是CHO細胞，其係表現 至少一種選自哺乳動物DDR1a、DDR1b、DDR1c和DDR2之哺乳動物DDR多肽，b)一抗磷酸-酪胺酸抗體或抗體片段，c)一選擇性與抗磷酸-酪胺酸抗體或抗體片段結合之螢光標定的抗體或抗體片段，d)一包含至少12孔槽之多孔盤，e)至少一哺乳動物膠原蛋白，f)視需要，至少一種疑似改變至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的化合物，及g)用於d)之孔槽供螢光定量偵測的偵測裝置。
11. 一種用於鑑定改變DDR膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性的化合物之方法，特別是DDR1a、DDR1b、DDR1c及/或DDR2膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性，特言之，一或多個具有選自下列序列之多肽的膠原蛋白-引發的自動-/轉磷酸作用活性：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14，其包括下列步驟：a)於固體支撐體上培養至少一種細胞，該細胞含有至少一種位於細胞質膜的DDR多肽或其功能性衍生物，b)於步驟a)的細胞培養中加入至少一種膠原蛋白，特言之，其中該膠原蛋白係選自第I型膠原蛋白、第 II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白或第IV型膠原蛋白或其混合物，c)於細胞緩衝液中培養步驟b)之細胞，d)將步驟c)之細胞固定在固體支撐體上並滲透此固定的細胞，及視需要清洗細胞，e)在步驟d)之前，加入至少一種疑似改變至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之膠原蛋白-引發自動-/轉磷酸作用的化合物，f)進行步驟f1)或f2)：f1)將結合配合體加到將步驟d)之細胞中，其中該結合配合體能選擇性辨識磷酸酪胺酸，及該結合配合體為經標定的結合配合體，f2)i)將結合配合體加到將步驟d)之細胞中，其中該結合配合體能選擇性辨識磷酸酪胺酸，ii)將另一種結合配合體加到將步驟i)之細胞中，其中該結合配合體為經標定的結合配合體，且其中另一種結合配合體能選擇性辨識該能選擇性辨識磷酸酪胺酸之結合配合體，g)偵測經標定的結合配合體。
12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞，其係經編碼至少一種DDR多肽或其功能性衍生物之多核苷酸轉染，特言之，該細胞為經轉染的CHO細胞。
13. 如申請專利範圍第11或12項之方法，其中該方法係 以高通量分析來進行。
14. 如申請專利範圍第11至13項中任一項之方法，其中i)該結合配合體為經螢光標定的結合配合體，及/或ii)其中係進行定量偵測，及/或iii)其中係加入至少一種用於將細胞染色之試劑，特言之，其中係加入至少一種用於將細胞核染色之試劑，其中步驟iii)係在申請專利範圍第11項之步驟d)之後進行，較佳地係與申請專利範圍第11項之步驟f1)、f2i)或f2ii)同時進行。
15. 如申請專利範圍第11至14項中任一項之方法，其中a)膠原蛋白培養係進行約10分鐘至約60小時，更佳地約1至約36小時，甚佳地約1至約25小時，最佳地約2至約18小時，及/或b)其中用於申請專利範圍第11項步驟c)之細胞緩衝液為視需要包含FCS之培養基。
16. 如申請專利範圍第11至14項中任一項之方法，a)其中阻斷緩衝液係於申請專利範圍第11項步驟f1)或f2i)之前加入，及/或b)其中清洗細胞係在申請專利範圍第11項的步驟a)、步驟c)、步驟d)、步驟f1)、f2ii)及/或步驟f2ii)之後進行。