TW201300121A - 山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途 - Google Patents

山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途 Download PDF

Info

Publication number
TW201300121A
TW201300121A TW100123163A TW100123163A TW201300121A TW 201300121 A TW201300121 A TW 201300121A TW 100123163 A TW100123163 A TW 100123163A TW 100123163 A TW100123163 A TW 100123163A TW 201300121 A TW201300121 A TW 201300121A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
composition
individual
use according
bitter gourd
momordica charantia
Prior art date
Application number
TW100123163A
Other languages
English (en)
Inventor
Bi-Fong Lin
Ching-Jang Huang
Hsueh-Yun Lu
Original Assignee
Univ Nat Taiwan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Nat Taiwan filed Critical Univ Nat Taiwan
Priority to TW100123163A priority Critical patent/TW201300121A/zh
Priority to US13/484,716 priority patent/US20130005812A1/en
Publication of TW201300121A publication Critical patent/TW201300121A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/42—Cucurbitaceae (Cucumber family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/02—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms with only carbon-to-carbon double bonds as unsaturation
    • C07C57/03—Monocarboxylic acids
    • C07C57/12—Straight chain carboxylic acids containing eighteen carbon atoms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本發明揭露一種山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途，該山苦瓜組成物包括至少一有效劑量之共軛次亞麻油酸(CLN,conjugated linolenic acid)，其中將該山苦瓜組成物施用至一具有過敏性氣喘之個體，可改善該個體的症狀。未來可將山苦瓜開發成保健食品，用來預防氣喘的發生或減緩氣喘病的症狀，以改善因過敏原所引起的氣喘之症狀，包含呼吸道過度反應、呼吸道發炎、肺組織中發炎細胞的浸潤與血清中高的IgE含量等過敏症狀。

Description

山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途
本發明係關於一種山苦瓜的相關醫療用途，特別是關於一種山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途。
近年來世界各國過敏性疾病的發生逐漸增加，其中包含異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘等。一般認為，過敏疾病之發生與遺傳的過敏體質、生活環境的污染、飲食習慣的改變等因素有關。過敏反應是人體或動物接觸到外來過敏原，所產生的一連串免疫反應。過敏原的種類也相當廣泛，包括有塵蹣、花粉或小分子蛋白等，皆可能引起過敏免疫反應。一般的過敏疾病大多屬於第一型過敏免疫反應(Type I hypersensitivity)，也就是由IgE所主導的過敏反應，如氣喘、花粉熱與蕁麻疹等。
由美國National Heart,Lung and Blood Institute (NHLBI)於1997年的定義，氣喘為一種呼吸道慢性發炎疾病，在症狀上，病人有週期性哮喘、咳嗽、胸悶甚至呼吸困難，易發作於早晚溫差變化較大、接觸到過敏原或是其他刺激時。臨床上主要症狀為呼吸氣流阻塞(airflow obstruction)，通常會自發地或經治療後回復正常；接觸到刺激時會有呼吸道過度敏感反應(airway hyperreactivity)的出現，以及長期造成的慢性呼吸道發炎反應(chronic airway inflammation)。由於氣管長久在慢性發炎下，只要有過敏原刺激，就容易引發支氣管收縮造成呼吸困難等症狀，稱為呼吸道過度反應(airway hyperresponsiveness,AHR)。
近四十年來過敏性疾病在世界各國的盛行率顯著增加(Beasley et al.,2000)，根據WHO在2005年的估計中，全球約有30億人因氣喘而感到不適，且約有25萬人死於氣喘；台灣在這20至30年間，兒童與青少年氣喘的盛行率皆有顯著的增加趨勢；以學齡兒童為例，台灣從1973年至2003年間，氣喘的盛行率就從1.3%攀升到19.0%(Huang et al.,2005)。
目前對於過敏性疾病的治療，常見而直接的方法是給予支氣管擴張劑或是抗發炎藥物，像抗組織胺、β2交感神經興奮劑以及糖皮質素(glucocorticoid)，主要是針對氣喘症狀的緩解(barnes et al.,1997:holgate and Broide,2003)，並無治療的效果。此外，亦有使用單株抗體進行細胞活性的抑制，或是採用口服抗原使免疫反應產生耐受性，因此達到減緩過敏免疫之效用，而支氣管擴張劑與類固醇則是臨床上最普遍使用的藥物，臨床上最常使用的類固醇口服藥劑為prednisolone(Vuillermin et al.,2007)，然而使用藥物的同時可能伴隨著副作用的發生。
目前已知，食用山苦瓜(bitter gourd)對於人體有許多好處，包括可能具有降低血糖等功效，特別是其中所含有的大量且特殊之脂肪酸，例如共軛次亞麻油酸(CLN,conjugated linolenic acid)等，都是可能的相關活性成分。然而，山苦瓜及該些活性成分是否確實可用於改善過敏性氣喘藥物之用途，以及是否可影響免疫調節與發炎反應，仍是先前研究中所未確定的部份。因此，若能夠以平常會接觸到的食材或其成份(例如山苦瓜)，達到減緩過敏性氣喘的效果且無習知使用藥物可能伴隨的副作用，對具有過敏體質的人來說，是當務之急。
近年來流行病學研究顯示，除了基因及環境因素之外，飲食也可能是氣喘的危險因子之一。抗氧化物、n-3多元不飽和脂肪酸攝取增加及n-6多元不飽和脂肪酸攝取降低等，都可能減少氣喘發生的機會，顯示飲食的確具有調節過敏性氣喘的作用。過敏性氣喘一般的特徵為：呼吸時氣流阻塞，呼吸道過度反應、慢性呼吸道發炎以及體內傾向於Th2免疫反應。目前市面上已有一些減緩過敏症狀之保健食品，因此，若能以平常會接觸到的食材，透過免疫調節的方式，達到減緩過敏性氣喘的效果，而減少藥物引起的副作用，或許可開發為保健食品。
緣此，本發明之一目的即是提供一種山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途。
本發明之另一目的即是提供一種改善過敏性氣喘之山苦瓜組成物。
本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係為一種山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途，該山苦瓜組成物包括至少一有效劑量之共軛次亞麻油酸(CLN,conjugated linolenic acid)，其中將該山苦瓜組成物施用至一具有過敏性氣喘之個體，可改善該個體的症狀。
另外，亦提供一種改善過敏性氣喘之山苦瓜組成物，其包括至少一有效劑量之共軛次亞麻油酸(conjugated linolenic acid,CLN)，可改善一具有過敏性氣喘之個體的症狀。
本發明以氣喘模式小鼠，證明攝食山苦瓜與共軛次亞麻油酸對於其發炎和過敏免疫反應之影響，相關指標包括：局部呼吸道發炎反應、肺呼吸阻力、全身性免疫反應及肺組織基因表現的變化。在本發明之實施例中，利用山苦瓜經由冷凍乾燥後所得之凍乾粉餵食卵蛋白(ovalbumin,OVA,albumin chicken egg,Sigma A-5378)致敏的過敏性氣喘小鼠，可顯著減緩氣喘病症狀的效果，包括降低呼吸道過度反應(airway hyperresponsiveness,AHR)、減少呼吸道嗜伊紅性白血球(eosinophil)細胞聚集數量、減少肺氣管沖洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中IL-4、IL-5、IL-13、IL-6等細胞激素分泌量的功效。此外，在苦瓜籽中含量豐富的共軛次亞麻油酸(CLN)，經本發明餵食過敏性氣喘小鼠CLN純品之結果顯示，可顯著減緩氣喘病症狀的效果，包括降低呼吸道過度反應、減少呼吸道嗜伊紅性白血球細胞聚集數量、減少肺氣管沖洗液中IL-5細胞激素分泌量的功效等。
經由本發明所採用之技術手段，包括以山苦瓜全果凍乾粉末(BGP)及共軛次亞麻油酸(CLN)餵食卵蛋白致敏的過敏性氣喘小鼠結果顯示，給予OVA致敏BALB/c小鼠餵食含5%山苦瓜凍乾粉的飼料或每天管餵35mg的共軛次亞麻油酸(CLN)，16天後具有改善氣喘病呼吸道症狀與抑制過敏反應的效果。山苦瓜全果凍乾粉末的效果主要包括以下幾點：(1)降低呼吸道過度反應；(2)降低肺氣管沖洗液中IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、嗜酸細胞趨化因子(Eotaxin)與前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量(表3.)；(3)抑制脾臟細胞OVA特異性刺激下分泌IL-13的能力；(4)減少血清中總IgE抗體含量，增加IgG抗體含量；及(5)增加肺組織中PPAR-αmRNA基因表現量。而餵食共軛次亞麻油酸(CLN)也至少改善了上述的(1)~(3)點。可證實含有共軛次亞麻油酸(CLN)之山苦瓜全果凍乾粉末(BGP)具有改善過敏性氣喘之功效性。在未來可開發成保健食品，用來預防氣喘的發生或減緩氣喘病的症狀，可以是一種改善過敏性氣喘所引發之症狀的食品組成物或其內的單一成份，可單獨包含一有效劑量的本發明食材或成份，或再進一步包含一添加物，該添加物係為一保健食品成份、一食材成份或一保健食品成份與一食材成份之組合，以改善因過敏原所引起的氣喘之症狀，包含呼吸道過度反應、呼吸道發炎、肺組織中發炎細胞的浸潤與血清中高的IgE含量等過敏症狀。
本發明之山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
本發明以氣喘模式小鼠，探討攝食山苦瓜、共軛次亞麻油酸與共軛亞麻油酸對於其呼吸道發炎之影響，研究的指標包括：局部呼吸道發炎反應、肺呼吸阻力、全身性免疫反應及肺組織基因表現的變化。
材料與方法： 1.　山苦瓜凍乾粉製備或共軛次亞麻油酸(CLN)的取得
本發明所選用品種為花蓮四號山苦瓜，由花蓮農業改良場所提供。將山苦瓜洗淨後切片，經由冷凍乾燥後，再利用粉碎機製成山苦瓜凍乾粉末(Bitter gourd powder,BGP)。動物實驗以飼料中含有5%山苦瓜凍乾粉末餵食小鼠。而共軛次亞麻油酸(c9,t11,t13-CLN)由Cayman購得，純度大於98%。
2.　動物實驗設計 (1)動物飼養
四週大BALB/c雌鼠購自台大動物中心，溫度控制於23±2℃，光暗循環時間各為12小時，自由攝食飼料及飲水，每3-4天記錄飼料攝取量，每週記錄小鼠體重。小鼠8週大時開始進行致敏實驗，於8週、10週和12週腹腔注射(intraperitoneal,i.p.)卵蛋白抗原，以Imject Alum為佐劑(adjuvant)，並於每次注射前兩天及最後一次注射後二週採血液分析特異性抗體，並以OVA特異性IgE抗體與體重分五組，分別為OVA-oil控制組、飼料含5%山苦瓜凍乾粉的OVA-BGP組、每天管餵35 mg CLN的OVA-CLN組、和固醇類藥物波尼松龍(prednisolone)正對照OVA-Pred組，另有一組為未致敏的PBS-oil組，飼料組成以AIN-76配方為基礎，其配方組成份參J. Nutr. 107：1340-1348(1977)所述。前述固醇類藥物波尼松龍的投予時機在呼吸道過度反應(AHR)前4天開始以管餵方式給予，並管餵至犧牲前，飼料配方與管餵劑量如表1a-1b。開始餵食後四天，以5%霧化的OVA溶液進行吸入性致敏，而PBS-oil組給予霧化PBS，餵食13天後測量小鼠呼吸道阻力的變化，16天後犧牲小鼠。
(2)　致敏方式
致敏方法是以OVA為抗原，溶於佐劑氫氧化鋁中，在小鼠8週、10週和12週腹腔注射(i.p.)，PBS-oil組則以高溫殺菌處理的PBS取代OVA，每隻小鼠施打體積為0.2 mL。分組餵食期間、進行呼吸道阻力測試前一天及犧牲前一天以5%霧化的OVA溶液進行吸入性刺激，誘發呼吸道過敏性發炎反應，PBS-oil組則以霧化PBS代替OVA，致敏流程參第1圖。
(i) OVA腹腔注射致敏(i.p.)
第一次採用OVA(10 μg/mice)與Al(OH)3(2 mg/mice)溶於PBS，定容為0.2 mL。
第二及第三次採用OVA(30 μg/mice)與Al(OH)3(2 mg/mice)溶於PBS，定容為0.2 mL。
抗原(antigen)：卵蛋白(Ovalbumin,OVA;albumin chicken egg,Sigma A-5378)，以PBS配製成20 mg/mL，於-20℃保存。
(ii)　佐劑(adjuvant): Imject Alum，40 mg/mL (iii) OVA吸入性致敏(inhalation,i.h.)
配製5% OVA(50 mg/mL)溶於PBS中，利用超音波振盪器(ULTRA99)使OVA溶液霧化，控制流速為0.4 mL/min，並讓每隻小鼠吸入30分鐘。
表1a：飼料配方(餵食單位：g/kg)
註1：AIN-76维生素混合物及AIN-76礦物質混合物之組成分如J. Nutr. 107：1340-1348(1977)所述。
表1b：各組管餵內容物與飼料
3 .　各種免疫指標測定 (1)　呼吸道過度反應(AHR)測定
小鼠在吸入性過敏原刺激後，於隔天接受呼吸道阻力的測試。測試系統為Buxco system(Biosystem XA,Buxco Electronics Inc. Sharon,CT,USA)。利用系統中的分壓轉能器(differential pressure transducer,Buxco)及前置放大器(preamplifier,MAX II,Buxco)收集小鼠呼吸道變化的訊息而計算出肺呼吸阻力值(Penh,enhanced pause)。小鼠在意識清醒狀態下置於全體體積變化描記室(whole body plethysmograph chamber)中，以超音波震盪氣化的PBS導入室中三分鐘，接著抽掉室中多餘的霧化氣體之後，紀錄小鼠三分鐘內每分鐘平均肺呼吸阻力值(Penh)，再以漸增濃度之乙醯甲膽鹼(Methacholine,6.25、12.5、25、50 mg/mL)噴霧化給予小鼠刺激，各濃度皆在一樣的操作程序後，紀錄三分鐘刺激之後小鼠呼吸道三分鐘內的平均Penh值。
Penh值的計算方式為pause×PIF/PEF；Pause=(Te-Tr)/Tr,(PIF：peak inspiratory flow(尖峰吸氣流量)；PEF：peak expiratory flow(尖峰呼氣流量)；Te：expiratory time(呼氣時間)；Tr：relaxation time(放鬆時間))。
(2)　肺氣管沖洗液(BALF)細胞之取得與處理
將小鼠犧牲後，剪開頸部的皮毛及肉，用躡子將氣管外側肌肉撕開，使氣管露出，用蝴蝶剪將較靠近頭部之氣管上剪一個小洞，以靜脈置留管插入氣管，用細繩將軟管綁緊，取0.5 mL的滅菌PBS注入肺部沖洗再抽回，接著注入15 mL離心管中，重複注入並抽回共4次，抽取約2 mL BALF於15mL離心管，在4℃以1500 rpm離心7分鐘，取上清液，保存於-80℃冰箱，待分析細胞激素含量。下層細胞以HBSS緩衝液沖洗二次後，以10% FBS/RPMI培養液重新懸浮，利用錐藍染色排除法(trypan blue dye exclusion)染色，以細胞計數器計算所有白血球存活數目。調整細胞密度至5x105 cell/mL，取約100 μL細胞液，利用cytospin細胞離心塗片機在500 rpm下離心2分鐘。取下載玻片風乾，以Liu A染劑染色30秒，沖去多餘染劑，風乾後再以Liu B染劑染色5秒，沖去多餘染劑，待玻片風乾後，以阿拉伯膠封片。觀察細胞時，以1000x油鏡，計數至少5個不同視野之細胞組成比例。
(3)　血清之收集與血清中抗體測定 (i)　血液樣品的收集
小鼠於特定時間採血，分別對小鼠進行眼窩採血，首先將小鼠置於含有乙醚的容器中，待其昏迷後迅速以微量毛細管自眼窩靜脈竇採血，體積約為100 μL，於4℃靜置3-4小時後，以12000 rpm轉速離心20分鐘，收集血清，保存於-80℃待分析。
(ii)　血清特異性抗體IgE、IgG1、IgG2a測定
於平底96孔盤(Nunc-Immuno plate)中加入溶於塗布緩衝液(coating buffer)中的卵蛋白(OVA) 10 μg/mL，200 μL/well，置於4℃過夜。以PBST洗4次，洗去未結合的單株抗體，加入阻斷緩衝液(blocking buffer) 200 μL/well以減少非特異性的結合。室溫反應2小時後，以PBST洗5次，再加入已知濃度之標準品或適量稀釋的待測樣品，OVA特異性IgE於4℃反應過夜，OVA特異性IgG1或IgG2a於室溫反應2小時後，以PBST洗6次，加入連結生物素的抗細胞激素二級抗體100 μL/well，室溫反應2小時，以PBST洗7次，加入親和素-過氧化物酶(avidin-peroxidase) 100 μL/well，反應2小時後，以PBST洗8次，最後與基質液TMB反應，待適當時間的作用呈色，測定吸光值620 nm。結果以ELISA unit表示。本次實驗中，以前人實驗中致敏小鼠的血清為正控制，OVA特異性IgE稀釋50倍；OVA特異性IgG1稀釋160000倍、OVA特異性IgG2a稀釋8000倍。E.U.的計算方式如下：ELISA unit=(ODsample-ODblank)/ODPC-ODblank。
(iii)　血清總IgE、IgG、IgA、IgM抗體含量測定
於平底96-孔盤中加入100 μL/well濃度為10 μg/mL之親和力純化抗體(affinity-purified antibody)，室溫下反應1小時，以TBST洗4次；加入阻斷溶液(blocking solution) 200 μL/well，室溫反應1小時，以TBST洗5次；加入標準品和經過適當稀釋之待測血清，100 μL/well室溫反應2小時，以TBST洗6次；加入HRP共軛親和力純化抗體(HRP-conjugated affinity purified antibody) 100 μL/well，室溫反應1小時，以TBST洗7次；最後加入基質液TMB 100 μL/well，避光反應，待適當時間呈色後測量620 nm吸光值。
(4)　脾臟細胞取得與培養
老鼠犧牲後取出脾臟，置於有3 mL TCM/RPMI培養液的3 cm培養盤中。以無菌針筒尾端將脾臟磨碎，將上層細胞懸浮液吸取至15 mL離心管中，在加入3 mL的HBSS緩衝液，繼續將剩餘的磨碎，在吸取至離心管中，最後用3 mL HBSS緩衝液沖洗dish，將殘留細胞收集。細胞懸浮液以1500 rpm離心10分鐘後，倒去上清液，沉澱的細胞拍散後加入ACK溶解緩衝液(ACK lysing buffer)，靜置1分鐘後加入HBSS緩衝液，以1500 rpm離心10分鐘後，以HBSS緩衝液洗3次，洗去ACK溶解緩衝液。加入2mL TCM/RPMI培養液使成細胞懸浮液。計算細胞總數，將細胞數調整至1x107 cell/mL，取500 μL培養於48孔盤中，加入含有各食材樣品與ConA的TCM/RPMI培養液，使最終細胞密度為5x106 cell/mL，ConA最終濃度為5 mg/mL，培養48小時收取上清液，保存於-80℃，以MTT法進行細胞存活分析。
(5)　細胞激素含量測定
以BD Pharmingen系統為例。細胞激素測定採用ABC(avidin-biotin conjugates system)酵素連結免疫分析法(ELISA)。於96孔盤中加入1°Ab，於4℃放置隔夜，以PBST清洗4次後，以阻斷緩衝液進行阻斷(blocking) 1小時。清洗5次後加入適當稀釋的樣品與適當濃度的標準品，反應2~3小時，清洗6次後加入2°Ab反應1小時，清洗7次後再加入HRP，反應30分鐘。清洗8次後加入過氧化酵素基質液，呈色20-30分鐘後測定405 nm吸光值。
(6) Real-time PCR法分析分析肺組織相關基因 (i)　總RNA之抽取
取下右肺加入1 mL之TRIZOL Reagent(Invitrogen)，以均質機於冰上磨碎均質。將均質液移至1.5 mL微量離心管，室溫靜置5分鐘，於4℃以12,000 rpm離心20分鐘，取粉紅層至新1.5 mL離心管後，加入0.2 mL氯仿(Merck)。震盪均勻後，室溫靜置2-3分鐘使其自然分層，於4℃以12,000 rpm離心15分鐘。離心後小心吸取上層無色水層至新的微量離心管中。加入0.5 mL異丙醇(Merck)混勻，於4℃靜置1小時，再以12,000 rpm離心20分鐘，去除上清液。沉澱之pellet加入0.4 mL DEPC-H2O，劇烈震盪至RNA pellet溶解，再加入等體積之DEPC-H2O saturated phenol(Amreso 0981)，劇烈震盪30秒，於4℃以12,000 rpm離心5分鐘。取上層水層加入0.4 mL chloroform，劇烈震盪30秒後，於4℃以12,000 rpm離心20分鐘。吸取上清液定體積，加入0.1倍體積之3 M sodium acetate(pH 5.2)與兩倍體積之絕對酒精，混勻置於-20℃進行RNA沉澱1小時(可沉澱過夜增加產率)，於4℃以12,000 rpm離心20分鐘。倒去上清液，以70%酒精清洗RNA pellet兩次，於室溫下晾乾，再以20 μL之DEPC-H2O回溶。取少量RNA溶液稀釋100倍後，測260nm/280nm吸光值計算RNA濃度。
公式：260nm吸光值1 unit=40 μg RNA/mL。
(ii)　總RNA反轉錄成cDNA
將RNA溶液以DEPC水稀釋為0.2 μg/uL，取10 μL RNA溶液，加入10X RT buffer、25X dNTP mixture、10X RT Random Primer、無菌水及RTase，其體積依序為2 μL、0.8 μL、2 μL、4.2 μL及1 μL，總體積為10 μL，將此混合物進行反轉錄，條件為於25℃10分鐘，37℃反應120分鐘，85℃ 5秒鐘，最後冷卻至4℃。cDNA儲存於-20℃。
iii) Real-time PCR分析
採用市售Taqman Universal PCR Master Mix試劑分析，並以GAPDH作為內部對照組(internal control)。將cDNA以無菌水稀釋至10 ng/mL，取10 μL cDNA，加入12.5 μL Tagman Universal PCR Master Mix，1.25 μL探針/引子混合物與1.25 μL無菌水，總體積為25 μL。注入ABI PRISM Optical Strip，再蓋上MicroAmp Optical Cap。離心去除氣泡後即可上機(ABI PRISM 7000 Sequence Detection)進行定量分析。上機條件為50℃ 2分鐘(Stage 1)，95℃ 10分鐘(Stage 2)，95℃ 15秒鐘(Stage 3)，60℃1分鐘(Stage 4)，再回到Stage3，重複40個循環。
【計算】
Ct值(Threshold Cycle)：C代表Cycle(循環數)，T代表threshold(閾值)，Ct值是每個反應管內的螢光信號到達設定的閾值時所經過的PCR循環數。因此當Ct值小表示cDNA量多基因表現量多。PCR產物與起始放入的cDNA量成正比，Ct值與input cDNA濃度之對數值成反比，當input cDNA量固定，產物量與2n成正比。
步驟1. Ct(Target gene)-Ct(internal control)=△Ct
步驟2. △Ct(Sample)-△Ct(mean of control)=△△Ct
步驟3.　基因表現量以2-△△Ct表示
(6)　統計方法
實驗結果以Mean±SD或Mean±SEM表示，各組數據以Student’s t-test分析與OVA-oil組比較，若p<0.05表示有顯著差異，*p<0.05，**p<0.01，#0.05<p<0.1。
結果： 實施例1、生長情形與攝食狀況
BALB/c小鼠隔週共三次致敏，距離最後一次致敏兩星期之後，依血清OVA特異性IgE含量與體重分組後，即開始餵食不同飲食16天。小鼠餵食前體重與犧牲時各組之間體重皆無顯著差異(表2)，顯示餵食山苦瓜凍乾粉末(BGP)或共軛次亞麻油酸(CLN)不會影響小鼠的生長。在攝食量方面，各組每天的攝食量是沒有差異的。
表2.　餵食山苦瓜與共軛次亞麻油酸對OVA致敏小鼠生長情形與攝食的影響
註：各數值以平均值±標準差(mean±SD)表示
實施例2、器官重量與相對重量
餵食山苦瓜凍乾粉末(BGP)及共軛次亞麻油酸(CLN)對小鼠器官重量與相對重量結果如表3。小鼠在餵食山苦瓜16天後，心臟的絕對重量與相對重量顯著的低於OVA-oil組，而肝臟絕對重量有較低的趨勢(p=0.08)；相對重量則顯著較低。OVA-CLN組與控制組相比皆無顯著差異。固醇類藥物OVA-Pred組肺臟比控制組OVA-oil有較小的趨勢(p=0.06)，並且肝臟絕對重量有較輕的趨勢；相對重量顯著較低。PBS-oil組肺臟絕對重量與相對重量都比致敏組顯著較低。
表3.　餵食BGP與CLN對OVA致敏小鼠組織器官重量與相對組織器官重量的影響
註1：各數值以平均值±標準差(mean±SD)表示
註2：* p<0.05;** p<0.01;#0.05≦p<0.1是利用Student’s t-test與OVA-oil組別比較所得結果。
實施例3、呼吸道過度反應(AHR)
參閱第2圖，其顯示餵食山苦瓜凍乾粉末(BGP)及共軛次亞麻油酸(CLN)對OVA致敏小鼠呼吸道過度反應的影響。結果如第2圖所示，隨著乙醯甲膽鹼(Mch)刺激濃度增加，作為負對照的未致敏PBS-oil組只緩慢增加，肺呼吸阻力值(Penh值)最低且顯著的比OVA-oil組低，顯示致敏的操作的確有增加呼吸道阻力。與OVA-oil組相比，給予藥物潑尼松龍(Predisolone)可顯著降低12.5 mg/mL Mch濃度以上引起的呼吸道過度反應(AHR)，餵食山苦瓜與CLN同樣在12.5 mg/mL Mch濃度以上刺激下，明顯降低過敏氣喘小鼠的AHR，效果與藥物處理組(OVA-Pred)相同。顯示餵食山苦瓜凍乾粉末(BGP)及共軛次亞麻油酸(CLN) 13天後，能顯著減緩呼吸道過度反應的現象。
實施例4、肺氣管沖洗液(BALF)中各項指標變化
對於肺氣管沖洗液中細胞激素的影響，如表4所示降低BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、嗜酸細胞趨化因子(Eotaxin)與前列腺素E2(PGE2)含量。
對於肺氣管沖洗液中細胞激素的影響，如表4所示。未致敏PBS-oil組小鼠的IL-4、IL-5含量都顯著最低。餵食BGP可顯著降低BALF中IL-4、IL-5與IL-13含量，OVA-CLN組BALF中細胞激素IL-5的含量顯著低，也趨勢的降低IL-4的含量。顯示餵食山苦瓜與CLN可以降低呼吸道中Th2細胞激素的含量。
餵食BGP與CLN對肺氣管沖洗液中發炎介質含量的影響如表4。PBS-oil組小鼠的IL-6、IL-1β、嗜酸細胞趨化因子與前列腺素E2(PGE2)含量都顯著最低。與OVA-oil組小鼠相比，餵食BGP顯著降低IL-6、嗜酸細胞趨化因子、與前列腺素E2含量，也有降低TNF-α與IL-1β含量的趨勢；餵食CLN小鼠在發炎介質含量都有較OVA-oil組低，但並未達統計差異。由以上結果顯示，餵食山苦瓜可降低呼吸道發炎介質的含量，包括降低BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、嗜酸細胞趨化因子(Eotaxin)與前列腺素E2(PGE2)含量。
表4.　餵食BGP與CLN對OVA致敏小鼠BALF中細胞激素與化學趨化激素的影響
註1：各數值以平均值±標準差(mean±SD)表示
註2：* p<0.05;** p<0.01;#0.05≦p<0.1是利用Student’s t-test與OVA-oil組別比較所得結果。
實施例5、肺氣管沖洗液中各種類細胞數目
飲食處理對肺氣管沖洗液各種細胞數目的影響，結果如第3A~3B圖所示。PBS-oil組在總細胞數、嗜伊紅性白血球(eosinophils)、嗜鹼性白血球(basophils)、嗜中性白血球(neutrophils)、巨噬細胞(macrophage)與淋巴球(lymphocytes)、單核球(monocytes)等細胞數目都顯著的最低，OVA-Pred組小鼠的總細胞數與各種類細胞數，也均顯著低於OVA-oil組，顯示此藥物可抑制免疫細胞的數目或聚集。餵食BGP顯著降低肺沖洗液中總細胞數、嗜伊紅性白血球、嗜鹼性白血球、嗜中性白血球與淋巴球的數目，OVA-CLN組有顯著較少的嗜伊紅性白血球聚集。此結果顯示，餵食山苦瓜凍乾粉末(BGP)及共軛次亞麻油酸(CLN)可改善肺部細胞聚集的情形，尤其可降低造成過敏性呼吸道發炎反應的嗜伊紅性球聚集。
實施例6、脾臟細胞的細胞激素分泌量
餵食BGP與CLN的OVA致敏小鼠脾臟細胞以OVA做特異性刺激，結果如表5。與OVA-oil組相比，PBS-oil組脾臟細胞分泌的IL-2顯著較低，IL-5、IL-13的分泌也顯著較低，表示未經致敏操作的小鼠分泌這些細胞激素能力較低，而致敏小鼠的全身性免疫反應傾向於Th2免疫反應。
然而，餵食BGP可以顯著的降低脾臟細胞分泌IL-13能力，但也顯著的減少TGF-β分泌；OVA-Pred組則有降低IL-5與IL-13分泌的趨勢(p=0.09;p=0.06)。
表5.　餵食BGP對OVA致敏小鼠脾臟細胞在OVA刺激下細胞激素影響
實施例7、血清中總IgE、IgG、IgA與IgM抗體含量
餵食BGP與CLN對OVA致敏小鼠血清中總IgE、IgG、IgA與IgM抗體生成量的結果如第4A~4B圖。致敏的OVA-oil組與PBS-oil組相比，血清總IgE抗體顯著較高而總IgG與總IgA含量顯著較低。餵食BGP可顯著的降低血清總IgE抗體含量，並增加總IgG抗體的含量。
實施例8、肺組織內PPAR-α基因mRNA表現
飲食處理對肺組織PPAR-α基因表現量，如第5圖所示。與OVA-oil組相比，PBS-oil組有顯著高的PPAR-α基因表現量。顯示致敏引起過敏免疫傾向會使得肺組織中PPAR-α基因表現量下降，而在餵食山苦瓜小鼠可以顯著的提升PPAR-α表現量。
由本實驗結果可以觀察到餵食BGP及CLN皆能顯著的減緩小鼠肺呼吸阻力。在肺沖洗液中的細胞方面，餵食山苦瓜能顯著減少呼吸道中總細胞數目、以及嗜伊紅性白血球、嗜中性白血球、嗜鹼性白血球等發炎細胞的聚集。給予BGP可降低呼吸道中IL-4、IL-5、IL-13等Th2細胞激素，與IL-6、嗜酸細胞趨化因子、PGE2等發炎介質。並可減少血清中總IgE抗體含量，增加IgG抗體含量，增加肺組織中PPARα mRNA基因表現量。由上述結果皆顯示，餵食山苦瓜確實可減緩氣喘模式小鼠呼吸道發炎的情形
綜上所述，在未來可將山苦瓜開發成保健食品，用來預防氣喘的發生或減緩氣喘病的症狀，可以是一種改善過敏性氣喘所引發之症狀的食品組成物或其內的單一成份，可單獨包含一有效劑量的本發明食材或成份，或再進一步包含一添加物，該添加物係為一保健食品成份、一食材成份或一保健食品成份與一食材成份之組合，以改善因過敏原所引起的氣喘之症狀。
由以上實施例可知，本發明所提供之山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
第1圖顯示氣喘模式小鼠致敏與餵食飼養流程；
第2圖顯示餵食BGP與CLN對OVA致敏小鼠呼吸道過度反應的影響；
第3A~3B圖顯示餵食BGP與CLN對OVA致敏小鼠BALF中各種類細胞數目的影響；
第4A~4B圖顯示餵食BGP對OVA致敏小鼠血清中總抗體含量的影響；
第5圖顯示餵食BGP對OVA致敏小鼠肺部PPARα mRNA表現量的影響。

Claims (14)

  1. 一種山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途，該山苦瓜組成物包括至少一有效劑量之共軛次亞麻油酸(CLN,conjugated linolenic acid)，其中將該山苦瓜組成物施用至一具有過敏性氣喘之個體，可改善該個體的症狀。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物係為山苦瓜直接經由冷凍乾燥所製成之山苦瓜全果粉末。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中將該山苦瓜組成物與至少一可食性成分混合後施用至該個體。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該共軛次亞麻油酸之有效劑量較佳為大於1%(W/V)。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物施用至該個體後不影響該個體之生長狀況。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物可降低該個體之呼吸道過度反應(AHR,airway hyperresponsiveness)。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物可降低該個體之肺氣管中的介白素-4(interleukin-4,IL-4)、介白素-5(interleukin-5,IL-5)、介白素-13(interleukin-13,IL-13)、介白素-6(interleukin-6,IL-6)、嗜酸細胞趨化因子(Eotaxin)或前列腺素E2(PGE2)或其組合之含量。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物可減少該個體之肺部與氣管中嗜伊紅性白血球、嗜鹼性白血球或嗜中性白血球或其組合之聚集數目。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物不影響該個體之脾臟細胞之卵蛋白(ovalbumin,OVA)特異性增生能力。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物可降低該個體之脾臟細胞在卵蛋白(ovalbumin,OVA)特異性刺激下分泌IL-13的能力。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物可降低該個體之血清中總免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,IgE)抗體含量。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該山苦瓜組成物可增加該個體之血清中總免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)抗體含量。
  13. 一種改善過敏性氣喘之山苦瓜組成物，其包括至少一有效劑量之共軛次亞麻油酸(conjugated linolenic acid,CLN)，可改善一具有過敏性氣喘之個體的症狀。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之山苦瓜組成物，其中該山苦瓜組成物係為山苦瓜直接經由冷凍乾燥所製成之山苦瓜全果粉末。
TW100123163A 2011-06-30 2011-06-30 山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途 TW201300121A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW100123163A TW201300121A (zh) 2011-06-30 2011-06-30 山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途
US13/484,716 US20130005812A1 (en) 2011-06-30 2012-05-31 Method for alleviating allergic asthma and allergic response by using bitter melon composition

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW100123163A TW201300121A (zh) 2011-06-30 2011-06-30 山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201300121A true TW201300121A (zh) 2013-01-01

Family

ID=47391273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100123163A TW201300121A (zh) 2011-06-30 2011-06-30 山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20130005812A1 (zh)
TW (1) TW201300121A (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWM547701U (zh) * 2017-02-21 2017-08-21 Hades-Gaming Corp 具多片導光板之滑鼠墊

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585400A (en) * 1996-02-27 1996-12-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of attenuating the allergic response in animals
CN1348709A (zh) * 2001-11-02 2002-05-15 山东省农业科学院中心实验室 苦瓜冻干超微粉全果制品及其加工方法
CA2436650A1 (en) * 2003-08-06 2005-02-06 Naturia Inc. Conjugated linolenic acid (clnatm) compositions: synthesis, purification and uses

Also Published As

Publication number Publication date
US20130005812A1 (en) 2013-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ma et al. Immunoregulatory effects of glycyrrhizic acid exerts anti-asthmatic effects via modulation of Th1/Th2 cytokines and enhancement of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in ovalbumin-sensitized mice
Lee et al. Polysaccharide isolated from Aloe vera gel suppresses ovalbumin-induced food allergy through inhibition of Th2 immunity in mice
Chang et al. Anti‐IgE antibodies for the treatment of IgE‐mediated allergic diseases
Shieh et al. Zerumbone enhances the Th1 response and ameliorates ovalbumin-induced Th2 responses and airway inflammation in mice
ES2399993T3 (es) Composición farmacéutica para la protección frente a alergias y enfermedades inflamatorias
Nagakura et al. Dietary supplementation with fish oil rich in omega-3 polyunsaturated fatty acids in children with bronchial asthma
Jaudszus et al. Cis-9, trans-11-Conjugated Linoleic Acid Inhibits Allergic Sensitization and Airway Inflammation via a PPAR γ-Related Mechanism in Mice3
Sy et al. Propolis extracts exhibit an immunoregulatory activity in an OVA-sensitized airway inflammatory animal model
JP2012528893A (ja) アトピー治療用組成物
Villani et al. Effect of dietary supplementation with polyunsaturated fatty acids on bronchial hyperreactivity in subjects with seasonal asthma
Đurić-Filipović et al. Allergen specific sublingual immunotherapy in children with asthma and allergic rhinitis
JP2003514869A (ja) アレルギー性疾患の処置のための組成物および方法
Liu et al. Influence of rutin on the effects of neonatal cigarette smoke exposure-induced exacerbated MMP-9 expression, Th17 cytokines and NF-κB/iNOS-mediated inflammatory responses in asthmatic mice model
Roh et al. Effects of radix adenophorae and cyclosporine A on an OVA-induced murine model of asthma by suppressing to T cells activity, eosinophilia, and bronchial hyperresponsiveness
JPWO2002055091A1 (ja) 抗アレルギー剤
TW201300121A (zh) 山苦瓜組成物在製備改善過敏性氣喘藥物之用途
CN108066353A (zh) 一种对过敏性哮喘有抑制作用的芸香柚皮苷
JP5804592B2 (ja) 抗アレルギーのための医薬品組成物
US20090054360A1 (en) Method and Composition for Treating Allergic Diseases
Sabin et al. Advances in upper airway diseases and allergen immunotherapy
TWI480044B (zh) A high molecular weight heparin or low molecular weight heparin for the preparation of a composition for at least two consecutive days of administration to improve the allergic constitution
Matsuse et al. Sodium cromoglycate inhibits antigen-induced cytokine production by peripheral blood mononuclear cells from atopic asthmatics in vitro
Fei et al. Shuang-Huang-Lian prevents basophilic granulocyte activation to suppress Th2 immunity
Sharma et al. Management of allergic rhinitis with Rajanyadi Churna and Guduchi Kwatha-A case report
CN117904008B (zh) 一种预防和缓解抑郁的戊糖片球菌jypr-9187及其菌剂和应用