TW201249999A - An integrated approach to the isolation and purification of antibodies - Google Patents

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201249999 六、發明說明： 本申請案主張對20 11年3月15曰提出申請的美國臨時申 請案第61/452,968號之優先權，其全部揭示内容以引用方 式併入本文中。 【先前技術】 由哺乳動物細胞培養物產生之醫藥級單株抗體的純化製 程通常涉及4個基本步驟》該等步驟包括（1)收穫/淨化·自 細胞培養液分離宿主細胞；（2)捕獲_自經淨化收穫物中之 大部分組份分離抗體；（3)精細純化-自殘餘宿主細胞污染 物、其他雜質及聚集體/產物相關物質分離或減少抗體； 及（4)調配-將抗體置於合適載劑/賦形劑中以達成最大穩定 性及存架壽命。 然而，僅貫踐該等步驟未必會產生具有用於醫藥背景下 之充足純度之抗體組合物。舉例而言，在某些情形下，需 要納入多個獨立捕獲及/或精細純化分離。另外，市售抗 體產生中傳統採用之許多緩衝液中存在腐㈣絲及使用 用於個別分離不同緩衝系統之習用策略可導致成本增加、 製程研發時間較長及純化運行時間延長。因此，當前需要 純化用於醫藥應用之所關注抗體的改良方法^本發明滿足 此需要。 【發明内容】 本發明係關於純化製程研發及製造之整合方法的使用。 在某些實施例中’此-整合方法允許將單__平臺純化製程 或系統經部署用於藉由使用有限數目之緩衝液組份及/或 163143.doc 201249999 具最低腐儀性之不含氣化物之緩衝液來純化不同抗體，且 在某些實施例中用於實現效率。 在某些實施例中’整合方法係關於包含特定捕獲及精細 純化步驟之製程之研發。舉例而言，在某些實施例中，本 文所述方法可採用單一捕獲分離，例如基於蛋白A之分 離，隨後為單一精細純化分離’例如混合模式分離。： 而，在某些實施例中，精細純化步驟可包括丨次、2次、3 次或更多次個別分離，例如（但不限於）混合模式分離，隨 後為基於陰離子或陽離子交換膜之分離。 本發明之另-態樣，純化製程研發之整合方法係關於在 製程進程期間使用最小數目之緩衝液系統。舉例而言，在 某些實施例中，在整個捕獲及精細純化步驟中採用單一緩 衝液系統。在特定實施例中，緩衝液系統將基本上由水及 兩種其他離子組份（亦即陰離子組份及陽離子組份）組成， 其中將兩種離子組份以不同組合及濃度混合以產生適於任 何特定純化製程需要之緩衝液。 在本發明之又一態樣中，純化製程研發之整合方法係關 於具最低腐蝕性之緩衝液系統之使用。某些緩衝液系統採 用可對市售抗體產生及純化設備具有腐蝕性影響之鹽，例 如氣化物鹽。在某些實施例中，本發明係關於採用具最低 腐蝕性之不含氯化物之緩衝液系統的緩衝液系統，例如 (但不限於）彼等採用與乙酸鹽或檸檬酸鹽配對之tris或三乙 醇胺者。 在某些實施例中，本發明係關於採用純化製程研發之整 163 丨 43.doc 201249999 合方法之1個、2個或所有3個態樣的純化製程。舉例而 言，在某些實施例中，本發明之純化製程將包含單一捕獲 分離及單一精細純化分離，其中兩種分離均採用相同緩衝 液系統。此外，在某些此等實施例中，該單一緩衝液系統 將為具最低腐触性之不含氯化物之緩衝液系統。 在某些實施例中，本發明係關於自包含抗體及至少一種 宿主細胞蛋白之試樣混合物產生宿主細胞蛋白減少之抗體 製劑的方法，其中該方法包含：（a)使該試樣混合物與加載 緩衝液接觸及在使抗體保持於層析載體上之條件下使該加 載緩衝液及試樣混合物與捕獲分離層析載體接觸；（b)用洗 滌緩衝液洗滌該捕獲分離層析載體以去除未保持於該捕獲 分離層析載體上之試樣混合物組份；及（()）使該捕獲分離層 析載體與溶析緩衝液接觸以藉此產生捕獲分離溶析液；其 中該等加載、洗滌及溶析緩衝液由水及基本上相同之陰離 子及陽離子組份組成；且其中該捕獲分離溶析液包含宿主 細胞蛋白減少之抗體製劑。在某些此等實施例中，陰離子 及陽離子組份係選自由以下組成之群：Tris及檸檬酸根、 Tris及乙酸根；三乙醇胺及擰檬酸根；以及三乙醇胺及乙 酸根。 在某些實施例中’本發明方法包含：（a)使包含抗體及 至乂 種稍主細胞蛋白之武樣混合物與加載緩衝液接觸及 在使抗體保持於層析載體上之條件下使該加載緩衝液及試 樣混合物與捕獲分離層析載體接觸；（b)用洗滌緩衝液洗滌 該捕獲分離層析載體以去除未保持於該捕獲分離層析載體 163143.doc 201249999 上之試樣混合物組份；（C)使該捕獲分離層析載體與溶析緩 衝液接觸以藉此產生捕獲分離溶析液，（d)使該捕獲分離溶 析液與該加載緩衝液接觸及使該捕獲分離溶析液及加載緩 衝液混合物與能夠進一步減少該捕獲分離溶析液之宿主細 胞蛋白含量的精細純化分離層析載體接觸；用洗條緩衝 液洗滌該精細純化層析載體以去除未保持於該精細純化層 析載體上之捕獲分離溶析液組份；及（f)使該精細純化層析 載體與溶析緩衝液接觸以藉此產生精細純化分離溶析液； 其中該等捕獲分離及精細純化分離加載、洗滌及溶析緩衝 液由水及選自由以下組成之群之基本上相同的陰離子及陽 離子組份組成：Tris及檸檬酸根、Tris及乙酸根；三乙醇 胺及檸檬酸根；以及三乙醇胺及乙酸根。 在某些實施例中，本發明係關於研發自兩種試樣混合物 產生宿主細胞減少之製劑之整合純化方案的方法，其中每 一試樣混合物包含不同抗體及至少一種宿主細胞蛋白：^) 選擇能夠保持試樣混合物之不同抗體的捕獲分離層析載 體’及（b)選擇分別用於力0載、洗蘇及產生捕獲分離溶析液 之加載、洗滌及溶析緩衝液；其中該等加載、洗滌及溶析 緩衝液由水及基本上相同之陰離子及陽離子組份組成；且 其中X捕獲刀離溶析液包含宿主細胞蛋白減少之抗體製 劑。在某些此等實施例中，陰離子及陽離子組份係選自由 以下組成之群：Tris及檸檬酸根、THs及乙酸根；三乙醇 胺及檸檬酸根；以及三乙醇胺及乙酸根。 在某些實施例中，本發明係關於研發自兩種試樣混合物 163143.doc 201249999 產生宿主細胞減少之製劑之整合純化方案的方法，其中每 一試樣混合物包含不同抗體及至少一種宿主細胞蛋白·（a) 選擇能夠保持試樣混合物之不同抗體的捕獲分離層析載 體；（b)選擇分別用於加載、洗滌及產生捕獲分離溶析液之 加載、洗滌及溶析緩衝液；（c)選擇能夠進一步減少該捕獲 分離溶析液之該宿主細胞蛋白含量的精細純化分離層析載 體，及（d)選擇分別用於加載、洗滌及產生精細純化分離溶 析液之加載、洗滌及溶析緩衝液；其中該等捕獲分離及精 細純化分離緩衝液由水及選自由以下組成之群之基本上相 同的陰離子及陽離子組份組成：Tris及檸檬酸根、。“及 乙酸根；三乙醇胺及檸檬酸根；以及三乙醇胺及乙酸根。 【實施方式】 本發明係關於純化製程研發之整合方法的使用。在某些 實施例中，此方法係關於包含特定捕獲及精細純化步驟之 製程之研發。舉例而言，在某些實施例中，本文所述方法 可採用單一捕獲分離’例如基於蛋白A之分離，隨後為單 一精細純化分離’例如混合模式分離。然而，在某些實施 例中，精細純化步驟可包括i次、2次、3次或更多次個別 分離’例如（但不限於）混合模式分離（即，基於一種以上分 子或離子相互作用之分離，例如藉由基於能夠進行離子相 互作用、氫鍵結及疏水相互作用之層析介質的分離），隨 後為基於陰離子或陽離子交換膜之分離。 本發明之另一態樣，純化製程研發之整合方法係關於在 製程進程期間使用最小數目之緩衝液系統。舉例而言，在 163143.doc 201249999 某些實施例中，在整個捕獲及精細純化步驟中採用單一緩 衝液系統。在特定實施例中，緩衝液系統將基本上由水及 兩種其他離子崎（亦即陰離子組份及陽離子組份）組成， 其中將兩種離子組份以不同組合及濃度混合以產生適於任 何特定純化製程需要之緩衝液。 在本發m態樣中’純化製程研發之整合方法係關 於具最低腐蝕性之不含氣化物之緩衝液系統的使用。某些 緩衝液系統採用可對市售抗體產生及純化設備（例如不錄 鋼）具有腐蝕性影響之氯化物鹽。在某些實施例中，本發 明係關於採用具最低腐蝕性之緩衝液系統的緩衝液系統， 例如（但不限於）彼等採用與乙酸鹽（如乙酸）或檸檬酸鹽（如 檸檬酸）配對之Tris或三乙醇胺者。不包括諸如鈉等相對離 〇 在某些實施例中，本發明係關於採用純化製程研發之整 合方法之1個、2個或所有3個態樣的純化製程。舉例而 言，在某些實施例中，本發明之純化製程將包含單一捕獲 分離及單一精細純化分離，其中兩種分離均採用相同緩衝 液系統。此外，在某些此等實施例中，該單一緩衝液系統 將為具最低腐蝕性之缓衝液系統。 為清楚說明起見且並不具有限制性，將本實施方式劃分 為下列子部分： 1.定義； 2 ·抗體生成； 3·抗體表現； 163143.doc 201249999 4. 整合抗體純化步驟； 5. 緩衝液系統； 6. 具最低腐触性之緩衝液系統；及 7. 實例性整合純化策略 1.定義 為更容易瞭解本發明，首先定義某些術語。 術語「抗體」包括包含由二硫鍵相互連結之四條多肽鏈 (兩條重（H)鏈及兩條輕（L)鏈）的免疫球蛋白分子。各重鏈 包含重鏈可變區（本文縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區 (CH)。重鏈恆定區包含三個結構域：CHI、CH2及CH3。 各輕鏈包含輕鏈可變區（本文縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆 定區。輕鏈恆定區包含一個結構域（CL)。可將VH及VL區 進一步細分成高度可變區（稱為互補決定區（CDR))及較為 保守之區（稱為框架區（FR))，二者間雜排列。各VH及VL 由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按下列順 序列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

術語抗體之「抗原結合部分」（或「抗體部分」）包括保 持特異性結合至抗原（例如，hIL-12、hTNFa或hIL-18)之能 力的抗體片段。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗 體片段來實施。術語抗體之「抗原結合部分」内所涵蓋結 合片段之實例包括（i) Fab片段，即包含VL、VH、CL及 CH1結構域之單價片段；（ii) F(ab')2片段，即包含兩個由 鉸鏈區之二硫橋鍵所連接Fab片段的二價片段；（iii)包含 VH及CH1結構域之Fd片段；（W)包含抗體單臂之VL及VH 163143.doc 201249999 結構域的Fv片段；（v) dAb片段（Ward等人，（1989) Nature 341:544-546，其全部教示内容以引用方式併入本文中）， 其包含VH結構域；及（vi)分離互補決定區（CDR)。此外， 儘管Fv片段的兩個結構域（VL&VH)係由單獨基因編碼， 但該等結構域可利用重組方法藉由成連接體來連接該合 成連接體使該等結構域能夠以VL及VH區域配對形成單價 分子的單一蛋白鏈（稱作單鏈Fv (scFv))製備；參見（例 如）Bird等人，（1988) Science 242:423-426;及Huston等人 (1988) Proc· Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883，該等文 獻之全部教示内容以引用方式併入本文中）。此等單鏈抗 體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」内。亦涵蓋 單鏈抗體之其他形式，例如雙键抗體。雙鏈抗體係雙價雙 特異性抗體，其中VH及VL結構域在單一多肽鏈上表現， 但所用連接體太短以致不容許相同鏈上的兩個結構域之間 配對’從而迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並 產生兩個抗原結合位點（例如，參見H〇uiger，p等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ； Poljak, R. J_ 等人（I994) Structure 2:1121-1123，該等文獻之全部教 示内容均以引用方式併入本文中）。此外，抗體或其抗原 結合部分亦可為藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白 或肽共價或非共價締合所形成的較大免疫黏附分子之一部 分。此等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素 (streptavidin)核心區域來製造四聚體scFv分子（Kipriyanov， S· Μ.等人（1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93- 163143.doc 201249999 101，其全部教示内容以引用方式併入本文中）及使用半胱 胺殘基、標記物肽及C·末端聚組胺酸標籤來製造二價及生 物素化 scFv 分子（Kipriyanov，S. Μ.等人（1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058 ’其全部教示内容以引用方式併入 本文中）。諸如Fab及F(ab')2片段等抗體部分可使用習用技 術自全抗體製備’例如全抗體的分別木瓜蛋白酶或胃蛋白 酶消化。此外’抗體、抗體部分及免疫黏附分子可使用如 本文所述標準重組DNA技術來獲得。在一個態樣中，抗原 結合部分係完整結構域或完整結構域對。 術語「人類抗體j包括具有對應於如Kabat等人所述人 類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體（參見， Kabat 等人（1991) Sequences of proteins of Immunological Interest ’第五版’美國健康及人類服務部（Department of Health and Human Services)，NIH出版號91-3242)。本發 明人類抗體可在（例如）CDR内且尤其CDR3内包括並非由人 類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如，藉由活 體外隨機誘變或位點特異性誘變或藉由活體内體細胞突變 所引入之突變）。該等突變可使用「選擇性誘變方法」來 引入。人類抗體可有至少一個位置經並非由人類種系免疫 球蛋白序列編碼的胺基酸殘基代替，例如，活性增強胺基 酸殘基。人類抗體可有至多二十個位置經並非人類種系免 疫球蛋白序列一部分之胺基酸殘基代替。在其他實施例 中，至多十個、至多五個、至多三個或至多兩個位置經代 替。在一個實施例中，該等代替位於CDR區内。然而，本 163143.doc 201249999 文所用術語「人類抗體」不欲包括衍生自另一哺乳動物物 種（例如小鼠）種系之CDR序列已移植到人類框架序列上的 抗體。 片語「重組人類抗體」包括藉由重組手段製備、表現' 產生或分離之人類抗體，例如使用轉染至宿主細胞中之重 組表現載體表現之抗體、自重組組合人類抗體庫分離之抗 體、自人類免疫球蛋白基因轉基因動物（例如，小鼠）分離 之抗體（例如，參見Taylor, L. D.等人（1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295，其全部教示内容以引用方式併入本文 中）或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列拼接至其他 DNA序列上的任何其他手段製備、表現、產生或分離的抗 體。此等重組人類抗體具有衍生自人類種系免疫球蛋白序 列的可變區及恆定區（參見’ Kabat，E. A.等人（1991) Sequences 〇f Proteins 〇f lmmunol〇gical Interest，第五 版’美國衛生及人類服務部，NIH出版號91-3242)。然 而，在某些實施例中，此等重組人類抗體可經受活體外誘 變（或者，當使用人類Ig序列轉基因動物時，經受活體内體 細胞誘變），且因此重組抗體之VH及VL區的胺基酸序列儘 管衍生自人類種系VH及VL序列並與其相關，但其係可不 天然存在於人類活體内抗體種系譜中的序列。然而在某 些實施射，&等重組抗體係選擇性誘冑方法或回復突變 或二者所致。 片語「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主細胞」）包括已 引入重組表現載體之細胞《應瞭解，此等術語不僅意欲指 特定個體細胞而且亦指此一細胞之子代。由於突變或環境 163143.doc 12 201249999 影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可 能與母細胞不同但卻仍涵蓋於本文所用術語「宿主細胞」 之範圍内》 本文所用術語「修飾」意欲指改變抗體或其抗原結合部 分中一或多個胺基酸。可藉由在一或多個位置增加'取代 或缺失胺基酸來產生改變。可使用諸如PCR誘變等已知技 術來產生改變。 本文所用術語「約」意欲指大於或小於參照值之大約 10%至2G%之範圍。在某些情形下，熟f此項技術者將認 識到，由於參照值之性質，因此術語「約」可意指偏離該 值之大於或小於1 〇%至2〇〇/0。 本文所用片語「病毒減少/不活化」意欲指特定試樣中 病毒粒子之數量之降低（「減少」）、以及特定試樣中病毒 粒子之活性（例如但不限於感染性或複製能力）之降低（「不 活化」）。此等病毒粒子之數目及/或活性之降低可為以下 數量級：約1%至約99.99999。/。、較佳約20。/。至約99%、更 佳約30%至約99%、更佳約40。/。至約99%、甚至更佳約5〇% 至、”勺99/ί>甚至更佳約60%至約99%、仍更佳約7〇%至約 99%、仍更佳約至99%且仍更佳約9〇❶至約。在某 些非限制性實施例中，純化抗體產物中病毒之量（若存在） 小於該病毒之ID50(將感染50%目標群體之病毒量），較佳 至多為該病毒之ID50之十分之一，更佳至多為該病毒之 ID50之百分之一，且更佳至多為該病毒之1]〇5〇之千分之 一。在某些實施例中，量化方法係感染性或複製能力之約 163143.doc -13· 201249999 0.5 log至8 log減少之log減少。 片語「接觸位置」包括抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區 之CDR1、CDR2或CDR3中之胺基酸位置，該胺基酸位置 由接觸26種已知抗體-抗原結構之一者中之抗原的胺基酸 佔據。若2 6種已知解析的抗體-抗原複合物結構之任一者 中之CDR胺基酸接觸抗原，則可認為該胺基酸佔據接觸位 置。接觸抗原之胺基酸佔據接觸位置之概率高於非接觸位 置。在一個態樣中，接觸位置係CDR位置，其含有接觸26 種結構之3種以上（>1.5%)中之抗原的胺基酸。在另一態樣 中’接觸位置係CDR位置’其含有接觸25種結構之8種以 上（>32%)中之抗原的胺基酸。 2.抗體生成 本發明抗體可藉由多種技術來生成，該等技術包括用所 關注抗原對動物實施免疫且隨後實施習用單株抗體方法， 例如’ Kohler及Milstein (1975) Nature 256: 495之標準體 細胞雜交技術。儘管原則上體細胞雜交程序較佳，但可採 用產生單株抗體之其他技術’例如，B淋巴細胞之病毒或 致癌轉化。 一種製備雜交瘤之較佳動物系統係鼠類系統。雜交瘤產 生係經充分確定之程序。業内已知分離融合用免疫脾細胞 之免疫方案及技術。亦已知融合伴侶（例如，鼠類骨髓瘤 細胞）及融合程序。 抗體較佳可係人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。本發 明之嵌合或人類化抗體可根據如上文所述所製備非人類單 163143.doc • 14· 201249999 株抗體之序列來製備。編碼免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之 DNA可自所關注非人類雜交瘤獲得並利用標準分子生物學 技術加以改造以含有非鼠類（例如，人類）免疫球蛋白序 列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用業内已知方法 (例如’參見頒予Cabilly等人之美國專利第4,816,567號）將 鼠類可變區連接至人類恆定區。為產生人類化抗體，可使 用業内已知方法（例如，參見頒予Winter之美國專利第 5,225,539號及頒予Queen等人之美國專利第5,530，101號； 第5,585,089號；第5,693,762號及第6，180,370號）將鼠類 CDR區插入人類框架中。 在一個非限制性實施例中’本發明抗體係人類單株抗 體。可使用攜帶有人類免疫系統而非小鼠系統之部分的轉 基因或轉染色體小鼠來生成此等人類單株抗體。該等轉基 因及轉染色體小鼠包括本文稱為HuMAb Mouse®(Medarex 公司）、KM Mouse®(Medarex公司）及 xenoMouse(g) (Amgen) 之小鼠。 此外，業内可用表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色 體動物系統且可使用其來培育本發明抗體。舉例而言，可 利用攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體二者之小 鼠（稱為「tc小鼠」）；此等小鼠闡述於T〇mizuka等人 (2000) proc. Natl· Acad. Sci. USA 97:722-727 中。此外， 業内（例如，Kuroiwa 等人（2002) Nature Biotechn〇1〇gy 20.889-894及PCT申請案第WO 2002/092812號）已闡述攜帶 人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛且可利用其來培育本發明之 163143.doc -15- 201249999 抗體。 本發明之重組人類抗體或其抗原結合部分可藉由篩選重 組組合抗體文庫（例如，scFv噬菌體展示文庫）來分離，該 重組組合抗體文庫係使用自源自人類淋巴球之mRNA製備 之人類VL及VH cDNA來製備。業内已知製備及篩選此等 庫之方法。除了生成噬菌體展示庫之市售套組（例如， Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄編號27-9400-01 ;及 Stratagene SurfZAPTM喔菌體展示套組，目錄編號 240612，其全部教示内容以引用方式併入本文中）以外， 尤其適用於生成及篩選抗體展示庫之方法及試劑的實例可 參見（例如）以下文獻：Ladner等人美國專利第5,223,409 號；Kang等人PCT公開案第WO 92/18619號；Dower等人 PCT公開案第WO 91/17271號；Winter等人PCT公開案第 WO 92/20791 號；Markland等人PCT公開案第 WO 92/15679 號；Breitling等人PCT公開案第WO 93/01288號； McCafferty 等人 PCT 公開案第 WO 92/01047 號；Garrard 等 人 PCT 公開案第 WO 92/09690 號；Fuchs 等人（1991) Bio/Technology 9:1370-1372 ; Hay 等人（1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85 ; Huse 等人（1989) Science 246:1275-1281 ； McCafferty 等人，Nature (1990) 348:552-554 ; Griffiths 等人（1993) EMBO J 12:725_734; Hawkins 等人 (1992) J Mol Biol 226:889-896 ; Clackson 等人（1991) Nature 352:624-628 ; Gram 等人（1992) PNAS 89:3576-3580 ; Garrard 等人（1991) Bio/Technology 9:1373-1377 ; 163143.doc 16 201249999

Hoogenboom 等人（1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137;及 Barbas 等人（1991) PNAS 88:7978-7982;該等文獻之全部 教示内容均以引用方式併入本文中。 本發明人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備，其中 人類免疫細胞已經重構以使得可在實施免疫後生成人類抗 體反應。此等小鼠闡述於（例如）頒予Wilson等人之美國專 利第5,476,996號及第5,698,767號中。 在本發明又一實施例中，可改變本發明之抗體或其片 段’其中抗體恆定區經修飾以相對於未經修飾抗體降低由 至少一個恆定區調介之生物效應子功能。為了修飾本發明 抗體以使得其展現與Fc受體之結合降低，可在fc受體 (FcR)相互作用所必需之特定區域使抗體之免疫球蛋白恆 疋£片4又發生犬變（例如’參見Canfield及Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491 ;及 Lund 等人（1991) J. 〇f Immunol. 147:2657-2662，其全部教示内容均以引用方式 併入本文中）。降低抗體之FcR結合能力亦可降低其他效應 子功能’該等效應子功能依賴於FcR相互作用，例如調理 作用及吞嗤作用及抗原依賴性細胞毒性。 3.抗體表現 為了表現本發明抗體，將編碼部分或全長輕鏈及重鏈之 DNA插入一或多個表現載體中，以使得基因以可操作方式 連接至轉錄及轉譯控制序列。（例如，參見美國專利第 6,914，128號，該專利之全部教示内容以引用方式併入本文 中。）在此情形中，術語「以可操作方式連接」意欲指使 163143.doc -17- 201249999 抗體基因接合至载體以使得該載體内之轉錄及轉譯控制序 列發揮其調節抗體基因之轉錄及轉譯之期望功能。所選擇 表現載體及表現控料列應與所用表現宿主細胞相容。可 將抗體輕鍵基因及抗體重鍵基因插人單獨載體中，或者， 更通常地’將此^種基因插人相同表現載體中。藉由標準 2法（例如，使抗體基因片段上之互補限制位點與載體接 °或者若不存在限制位點，則使用平端接合）將抗體基 因插入表現載體中。在插入抗體或與抗體有關之輕鏈或重 鏈序列之前，表現載體可業已攜帶抗體恆定區序列。舉例 而言，一種將與抗體有關之VH&VL序列轉化為全長抗體 基因之方法係將其分別插入業已編碼重鏈恆定區及輕鏈恆 定區之表現載體中，以使得VH片段以可操作方式連接至 該載體内之CH片段且使VL片段以可操作方式連接至該載 體内之CL片段。另外或或者，重組表現載體可編碼促進宿 主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體 中’以使得信號肽框内連接至抗體鍵基因之胺基末端。作 號肽可係免疫球蛋白信號肽或異源信號狀（即，來自非免 疫球蛋白之信號肽）。 除了抗體鍵基因以外，本發明重組表現載體亦可攜帶一 或多個控制抗體鍵基因在宿主細胞中表現之調節序列。術 5吾「调郎序列」意欲包括控制抗體鍵基因轉錄或轉譯之啟 動子、增強子及其他表現控制元件（例如，聚腺苦酸化信 號）。此等調節序列闡述於（例如）Goeddel ; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 163143.doc • 18 - 201249999

Academic Press’ San Dieg〇, CA (199〇)中該文獻之全部 教示内容以引用方式併入本文中。彼等熟習此項技術者應 瞭解’表現載體之設計（包括調節序列之選擇）可端視諸如 所欲轉化宿主細胞之選擇、期望蛋白之表現程度等因素而 疋。供哺乳動物宿主細胞表現之適宜調節序列包括在哺乳 動物細胞中引導較高程度之蛋白表現之病毒元件’例如衍 生自以下之啟動子及/或增強子：巨細胞病毒（CMV)(例如 CMV啟動子/增強子）、猿病毒4〇 (SV4〇)(例如SV4〇啟動子/ 增強子）、腺病毒（例如，腺病毒主要晚期啟動子（AdMLp)) 及多瘤。病毒調節元件及其序列之進一步說明參見（例如） 頒予Stinski之美國專利第5168 〇62號、頒予BeU等人之美 國專利第4,510,245號及頒予Schaffner等人之美國專利第 4,968,615號，該等專利之全部教示内容均以引用方式併入 本文中。 除了抗體鏈基因及調節序列以外，本發明之重組表現载 體亦可攜帶一或多個額外序列，例如調節載體在宿主細胞 中複製之序列（例如，複製起點）及/或可選標記物基因。可 選標記物基因有助於選擇已引入載體之宿主細胞（例如， 參見均頒予Axel等人之美國專利第4 399,216號、第 4,634,665號及第5，179,017號，該等專利之全部教示内容均 以引用方式併入本文中）。舉例而言，通常可選標記物基 因賦予已引入載體之宿主細胞對藥物（例如G418、潮黴素 (hygromycin)或胺曱蝶呤）之抗性。適宜可選標記物基因包 括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於經胺曱蝶呤選擇/擴增 163143.doc •19· 201249999 之dhfr-宿主細胞）及neo基因（用於G418選擇）。 本發明之抗體或抗體部分可藉由在宿主細胞中重組表現 免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因來製備β為了以重組方式表現 抗體’用一或多個攜帶編碼該抗體之免疫球蛋白輕鏈及重 鍵之DNA片段的重組表現載體轉染宿主細胞，以使得該等 輕鏈及重鏈在該宿主細胞中表現並分泌至培養宿主細胞之 培養基中’可自該培養基回收抗體。使用標準重組DN Α方 法來獲得抗體重鏈及輕鏈基因，將該等基因納入重組表現 載體中並將該等載體引入宿主細胞中，例如彼等闡述於以 下文獻中者：Sambrook、Fritsch 及 Maniatis (編輯），

Molecular Cloning ; A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，（1989)，Ausubel 等人（編輯）Current

Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing

Associates，（1989)及美國專利第 4,816,397號及第 6,914,128 號，該等文獻之全部教示内容均以引用方式併入本文中。 為了表現輕鏈及重鏈，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈 之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式 意欲涵蓋眾多種習用於將外源DNA引入原核或真核宿主細 胞中之技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖 轉染及諸如此類。儘管理論上可在原核或真核宿主細胞中 表現本發明抗體，但在真核細胞（例如哺乳動物宿主細胞） 中表現抗體較為適宜，此乃因此等真核細胞，且特定而言 哺乳動物細胞，比原核細胞更有可能裝配並分泌經適當摺 疊且具有免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對 163143.doc •20- 201249999 於產生高產率活性抗體係無效的（Boss及Wood (1985) Immunology Today 6:12-13，其全部教示内容以引用方式 併入本文中）》 在本文中’選殖或表現載體中DNA之適宜宿主細胞係上 述原核細胞、酵母細胞或高等真核細胞。用於此目的之適 宜原核生物包括諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體等真 細菌’例如腸才干菌科（五，例如埃希氏菌 屬（五Μ/ιβΓίο/πα)(例如大腸桿菌（£ c〇/z·))、腸桿菌屬 (五《…以此…）、歐文氏菌屬（&w⑴·幻、克雷伯氏菌屬 、變形桿菌屬（iv〇⑽5)、沙門氏菌屬 (心〜_/⑷（例如鼠傷寒沙門氏菌⑽/w — 〇；p/nmMr/Wm))、沙雷菌屬如）（例如黏質沙雷氏菌 (&rra如則則)）、及志贺氏菌屬（从如心）、以及桿 菌屬（Bad/h)(例如枯草桿菌（β SM6ii/z·5)及地衣芽孢桿菌 (β. (例如於1989年4月12曰公開之dd 266,710號中所揭示之地衣芽孢桿菌41p))、假單胞菌屬 例如綠膿桿菌（p ⑽ία))、及鏈黴菌 屬一種適宜的大腸桿菌株選殖宿主為大腸 桿菌294(ATCC 31，446)，但諸如大腸桿菌β、大腸桿菌 X1776 (ATCC 31，537)及大腸桿菌 W3u〇 (ATCC 27,325)等 其他菌株亦適合》該等實例係為說明性而非限制性。 除原核生物外’諸如絲狀真菌或酵母等真核微生物亦為 多肽編碼载體之適宜選殖或表現宿主。釀酒酵母 (心Caevwae)或常見麵包酵母（^^以丫⑽㈨ 163143.doc •21 - 201249999 係最習用低等真核宿主微生物。然而，多種其他屬、種及 菌株可以一般方式獲得且可用於本文中，例如裂殖酵母菌 (Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母屬 (尺/wyverowyces)宿主，例如乳酸克魯維酵母（尺./acib)、脆 壁克魯維酵母（A：. 12,424)、保加利亞克魯 維酵母（尺.6w/garkwi)(ATCC 16,045)、威克海姆克魯維酵 母（/：. \Wc/:erawz7)(ATCC 24，178)、瓦爾特克魯維酵母（尺. wa/"、.）（ATCC 56,500)、果繩克魯維酵母（尺· i3?rc»5£?p/n7arwm) (ATCC 36,906)、而子熱克魯維酵母(尺.i/iermoio/eraw)、及 馬科斯克魯維酵母（尺· ;子囊菌酵母屬 (yarrowia)(E? 402,226);巴斯德畢赤酵母菌（Ρ~；π·α pasior/diXEP 183,070);念珠菌屬;裏氏木徽菌 (Trichoderma reeha)(EP 244,234);粗链鏈抱黴菌 (iVeMrosporor craisa);許旺酵母屬（《Sc/iwawm’omyces)，例如 西方許旺酵母（/SVAwflww/owycei occMewia/Zi);及絲狀真 菌，例如鏈孢黴屬（iVewrospora)、青黴屬（PemW//z’ww)、彎 頸黴屬山’wm)、及曲黴菌屬（y^pergi/Zw·?)宿主（例 如構巢麯黴（i 及黑麯黴（儿w/ger))。 適用於表現糖基化抗體之宿主細胞源自多細胞生物體。 無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多 種杆狀病毒株及變體及來自諸如以下等宿主之對應許可性 昆蟲宿主細胞：草地黏蟲（Spoi/opiera/rwgVperda)(毛蟲）、 埃及伊蚊（Zei/es aegxpiz·)(蚊子）、白紋伊蚊 α/όο/Η·£^Μ·5)(蚊子）、黑腹果繩（Drosop/n'/ii me/imogajier) 163143.doc -22- 201249999 (果繩）、及家蠢mor〇)。多種轉染用病毒株可自公 開途在獲得’例如者禮銀纹夜蛾印以 NPV之L-1變體及家蠶NPV之Bm_5株，且根據本發明此等 病毒可用作本文中之病毒’特定而言用於草地黏蟲細胞之 轉染。亦可利用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牵牛、番 茄及煙草之植物細胞培養物作為宿主。 用於表現本發明重組抗體之適宜哺乳動物宿主細胞包括 中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）（包括dhfr-CHO細胞（闡述於

Urlaub 及 Chasin，（1980) PNAS USA 77:4216-4220中），其與 DHFR可選標記物（例如，如 Kaufman及 Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中所述）連用，該等文獻之全部教示内容 均以引用方式併入本文中）、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及 SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動 物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養一段時間來產生抗 體’該段時間足以使宿主細胞中表現抗體或使抗體分泌至 生長宿主細胞之培養基中。可用哺乳動物宿主細胞系之其 他實例係由SV40轉化之猴腎CV1細胞系（COS-7，ATCC CRL 165 1);人類胚腎細胞系（293細胞或經亞選殖以在懸 浮培養中生長之293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10);中國 倉鼠卵巢細胞 /-DHFR(CHO、Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad· Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠支持細胞（TM4, Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 I63143.doc -23· 201249999 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細 胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠（buffalo rat)肝細胞 (BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳房腫瘤 (MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人， Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞； FS4細胞；及人類肝瘤細胞系（Hep G2)，其全部教示内容 均以引用方式併入本文中。 用上述用於抗體產生之表現或選殖載體轉化宿主細胞， 且在習用營養培養基中加以培養，若適宜修改該等培養基 以誘導啟動子 '選擇轉化體、或擴增編碼期望序列之基 因。 可在多種培養基中培養用於產生抗體之宿主細胞。諸如 以下等市售培養基適用於培養宿主細胞：Ham's F10TM (Sigma)、最小必需培養基™ (MEM) (Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco's Modified Eagle's MediumTM)((DMEM)，Sigma)。另外，可 使用以下文獻中所述任一培養基來作為宿主細胞培養基： Ham 等人，Meth. Enz. 58:44 (1979) ; Barnes 等人，Anal· Biochem. 102:255 (1980);美國專利第 4,767,704號、第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 163143.doc •24· 201249999 5,122,469號；WO 90/03430 ; WO 87/00195 或美國專利第 Re_ 3 0,985號’該等文獻之全部教示内容均以引用方式併 入本文中。可根據需要向任一該等培養基中補充激素及/ 或其他生長因子（例如胰島素、鐵傳遞蛋白、或表皮生長 因子）、鹽（例如氣化鈉、鈣、鎂、及磷酸鹽）、緩衝液（例 如HEPES)、核苷酸（例如腺苷及胸苷）、抗生素（例如健他 黴素（gentamycin)藥物）、痕量元素（定義為通常以微莫耳範 圍之最終;農度存在之無機化合物）、及葡萄糖或等效能 源。亦可以彼等熟習此項技術者所熟知之適當濃度引入任 一其他所需補充物。培養條件（例如溫度、pH及諸如此類） 係彼等先前用於所選表現用宿主細胞者，且應為熟習此項 技術者顯而易見。 亦可使用宿主細胞來產生完整抗體之部分，例如Fab片 段或scFv分子》應瞭解，上述程序之變化形式在本發明之 範圍内。舉例而言，在某些實施例中，可期望用編碼本發 明抗體之輕鏈或重鏈（但並非二者均有）之DNA轉染宿主細 胞亦可使用重組DNA技術來去除編輯輕鏈及重鏈之一者 或者中並非為結合至特定乾抗原所必需的一些或全部 DNA。本發明抗體亦涵蓋自此等截短dna分子表現之分 子另外，可藉由標準化學交聯方法使本發明抗體與第二 父聯來產生雙功能抗體，其中一條重鍵及一條輕鏈係 本發明抗體且另-重鏈及輕鏈對除初始乾抗原α外之抗原 163143.doc •25· 201249999 具有特異性。 在用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合部分之適宜 系統中’藉由磷酸鈣調介之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕 鏈二者之重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現 載體内，抗體重鏈及輕鏈基因各自以可操作方式連接至 CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件以驅動較高程度之基 因轉錄。重組表現載體亦攜帶DHFR基因，從而使得可對 已利用胺甲蝶呤選擇/擴增經載體轉染的CH0細胞進行選 擇。對所選轉化體宿主細胞進行培養以表現抗體重鏈及輕 鏈並自培養基回收完整抗體。利用標準分子生物學技術來 製備重組表現載體’對宿主細胞實施轉染，選擇轉化體， 培養宿主細胞並自培養基回收抗體。 在使用重組技術時，抗體可在細胞内、在壁膜間隙中產 生’或直接分;必至培養基中。在一個態樣中，若抗體係在 細胞内產生，則作為第一步驟，可藉由（例如）離心或超濾 去除宿主細胞或裂解細胞之微粒碎屑（例如，自均質化所 得）。倘若抗體係分泌至培養基中，則通常可首先利用市 售蛋白濃縮過濾器（例如AmiconTM4 Millip〇re peiiiconTM超 濾單元）濃縮來自此等表現系統之上清液。 在實施本發明方法之前，用於自細胞碎屑純化抗體的程 序首先取決於抗體之表現位點。一些抗體可自細胞直接分 泌至周圍生長培養基中；其他抗體係在細胞内產生。就後 I63143.doc •26- 201249999 者抗體而言，純化製程之第一步驟通常涉及細胞裂解，其 可藉由多種方法來實施，包括機械剪切、渗透衝擊或酶促 處理。此破壞將細胞之全部内含物釋放至均質物中，且另 外產生因大小較小而難以去除之亞細胞片段。該等片段通 常藉由差式離心或藉由過渡來加以去除。倘若分泌抗體， 則通常首先利用市售蛋白濃縮過濾器（例如Amicon™或 MilliP〇re PelliC0n™超濾單元）濃縮來自此等表現系統之上 清液。倘若抗體係分泌至培養基中，則亦可藉由（例如）切 向流過濾自細胞培養基分離重組宿主細胞。可利用本發明 之抗體純化方法自培養基進一步回收抗體。 4.整合抗體純化步驟 41 整合方法與傳統抗體純化之比較 用於自包含抗體及至少一種HCP之混合物產生純化（宿 主細胞蛋白-或「HCP-減少」）之抗體製劑的傳統純化方法 通常採用4個步驟：（1)收穫/淨化_自發酵培養物分離宿主 細胞；（2)捕獲-自淨化收穫物中之大部分組份分離抗體； (3)精細純化-自殘餘HCP污染物及聚集體分離抗體；及（4) 調配-將抗體置於合適載劑中以達成最大穩定性及存架壽 命。表1匯總此一傳統純化方案之一個實施例。如該方案 中所概述，傳統純化製程中經常採用多個捕獲及精細純化 分離以產生實質上不含HCP之抗體組合物。 163143.doc 27- 201249999 表1 具有其相關目的之純化步称 ，綱麵_#.'釋 ' * , V 初步回收 淨化試樣基質 陽離子交換或親和 性層析 捕獲抗體，減少宿主細胞蛋白及相關雜 質 超濾/透析過濾 (若需要） 濃縮及緩衝液交換 病毒不活化 藉由低pH處理使病毒不活化 陰離子交換或混合 模式層析 減少宿主細胞蛋白及DNA 苯基瓊脂糠TM (Phenyl Sepharose™) HP層析或陽離子交 換層析 減少抗體聚集體及宿主細胞蛋白 病毒過遽 基於大小去除病毒，若存在 最終超濾/透析過濾 濃縮及調配抗體 與通常自對每一所關注個別抗體之搜尋來設計的傳統純 化製程相反，在某些實施例中，本發明係關於純化製程的 研發，該等製程包含可在多種抗體中採用且仍允許有效減 少HCP之步驟。儘管整合方法遵循淨化、捕獲、精細純化 及調配之傳統4個步驟’但整合方法允許藉由（在某些實施 例中）使每一步驟處發生之個別分離之數目最小化來改良 所得抗體之純度以及製程設計及運行時間效率。傳統純化 製程與本發明整合製程之並行比較繪示於圖1中。 4.2 淨化及初步回收步驟 本發明純化方法之初始步驟涉及自試樣基質淨化及初步 163143.doc • 28 · 201249999 回收抗體。另外，初步回收製程亦可係一點，在此點下可 減少或不活化可存在於試樣基質中之病毒。在本發明整合 純化製程之語景下，在純化之初步回收階段期間可使用多 種病毒減少/不活化方法中之任一或多者，包括熱不活化 . (巴氏消毒法（pasteurization))、PH不活化、溶劑/試劑處 • 理、uv及γ射線輻照及添加某些化學不活化劑（例如p_丙内 酯或例如，如美國專利第4,534,972號中之菲咯啉銅，該專 利之全部教示内容以引用方式併入本文中）。在本發明之 某些實施例中，在初步回收階段期間使試樣基質暴露於pH 病毒減少/不活化。 pH病毒減少/不活化之方法包括（但不限於）在低下將 混合物培育-段時間，且隨後中和該阳並藉由過渡去除微 粒。在某些實施财，將在以下pH下培育混合物：介於約 2與5之間，較佳介於約3與4之間，且更佳約爻5。試樣混 合物之pH可藉由任一適宜酸來降低’該酸包括（但不限於） 檸檬酸、乙酸、辛酸或其他適宜酸。pH值之選擇主要取決 於抗體產物及緩衝液組份之穩定性型態。已知在低？11病毒 . 減少/不活化期間，及低PH培育之持續時間影響靶抗體 * 之品質。在某些實施例中’低PH培育之持續時間將為〇·5 ' ^至2 & ’較佳〇·5心至1.5 hr ’且更佳持續時間將為i hr。 除蛋白濃度以外，病毒減少/不活化亦取決於該等相同參 數，其在高濃度下可限制減少/不活化。因此，蛋白濃 度、pH及減少/不活化之持續時間之恰當參數可經選擇以 達成病毒減少/不活化之期望程度。 163143.doc -29- 201249999 在某些實施例中’可經由使用適宜過濾器來達成病毒減 少/不活化。適宜過濾器之非限制性實例係來自Pall公司之 Ultipor DV50TM過濾器。儘管在捕獲階段期間，本發明某 些實施例採用此過濾，但在其他實施例中其可用於純化製 程之其他階段，包括作為倒數第二或最終純化步驟。在某 些實施例中，採用替代過濾器來實施病毒減少/不活化， 該等過渡器例如（但不限於Ultipor DV20™過濾、器（pali公 司）；ViroSart CPV (Sartorius) ; Viresolve™ 過濾器 (Millipore，Billerica，Mass.) ; Zeta Plus VRTM 過據器 (CUNO ; Meriden，Conn·);及 Planova™ 過滤器（Asahi

Kasei Pharma，Planova Division, Buffalo Grove, 111.) » 在彼等採用病毒減少/不活化之實施例中，可視需要調 節試樣混合物用於進一步純化步驟。舉例而言，在實施低 pH病毒減少/不活化後，通常將試樣混合物之pH調節至更 接近中性之pH，例如，約4.5至約8.5，且較佳約4.9，隨後 繼續純化製程。另外，可用注射用水(WFI)洗滌混合物以 獲得期望導電率。 在某些實施例中，初步回收將包括一或多個離心步驟以 使試樣基質進-步淨化並藉此有助於純化所關注抗體。試 樣離心可在(例如但不限於)7，_ χ g至大約i2 75〇 X经下運 行在大規模純化之情形下，此離心可在線以所設定流速 發生以達成（例如但不限於）所得上清液中i 5 〇 n T U之濁度 量然後可收集此上清液以供進一步純化。 某二實施例中，初步回收將包括使用一或多個深層過 163143.doc 201249999

濾步驟以使試樣基質進一步淨化並藉此有助於純化本發明 抗體。深層過濾器含有具有分級密度之過濾介質。此分級 密度使較大粒子陷獲於過濾器表面附近，而較小粒子穿透 過濾器表面之較大開放區域，僅陷獲於更靠近過濾器中心 之較小開口中。在某些實施例中，深層過濾步驟可係去脂 深層過濾步驟。儘管某些實施例僅在初步回收階段採用深 層過;慮步驟，但其他實施例在一或多個額外純化階段期間 採用包括去脂深層過濾器在内之深層過濾器。可用於本發 明上下文中之深層過濾器的非限制性實例包括Cun〇TM 30/60ZA型深層過濾器（3^^公司）及〇 45/〇 2 μιη Sart〇p〇reTM 雙層濾筒。 4.3捕獲步驟 在本發明之某些實施例中’使初步回收試樣經受捕獲步 驟以進一步自含有HCP之發酵培養基純化出所關注抗體。 在某些實施例中，捕獲步驟採用能夠選擇性或特異性結合 至所關注抗體之層析材料。此層析材料之非限制性實例包 括：蛋白A、蛋白G、包含由所關注抗體所結合抗原之層 析材料及包含Fc結合蛋白之層析材料。 在本發明之具體實施例中，捕獲步驟涉及使初步回收試 樣經受包含適宜蛋白A樹脂之管柱處理。蛋白a樹脂可用 於親和性純化及分離多種抗體同種型，尤其IgG,、IgG2及 IgG4 °蛋白A係主要藉助其Fc區結合至哺乳動物IgG之細菌 細胞壁蛋白。在其天然狀態中，蛋白A具有5個IgG結合結 構域以及其他未知功能之結構域。 163143.doc 31 201249999 蛋白A樹脂具有若干市售來源。一種適宜樹脂係來自ge Healthcare之MabSelect™。其他適宜蛋白a樹脂包括（但不 限於）來自 GE Healthcare 之 mAbSelect SurRe™ 及來自 Millip〇re 之 pr〇sep Ultra Plus™。填塞有 MabSelectTM 之適 宜管柱的一非限制性實例係約1 ·〇 cm直徑χ約21.6 cm長度 之管柱（約17 mL床體積）。該大小管柱可用於小規模純化 且可與用於放大之其他管柱進行比較。舉例而言，床體積 為約6·6 L之20 cm χ 21 cm管柱可用於較大規模純化。無論 管柱如何，均可使用諸如MabSelectTM等適宜樹脂來填塞該 管柱》 如下文第5部分及第6部分中所詳細論述，在某些實施例 中，本發明係關於在捕獲步驟進程期間使用最小數目之緩 衝液系統以及包含具最低腐触性之組份之緩衝液的純化製 程。舉例而言，在某些實施例中，在整個捕獲步驟中採用 單一緩衝液系統。在特定實施例中，緩衝液系統將僅由水 及兩種其他離子組份（亦即陰離子組份及陽離子組份）組 成，其中將兩種離子組份以不同組合及濃度混合以產生適 於任何特定純化製程需要之缓衝液。在某些實施例令，捕 獲步驟情形中所用緩衝液系統採用Tris或三乙醇胺組份。 在某些實施例中，捕獲步驟情形中所用緩衝液系統採用乙 酸鹽或檸檬酸鹽組份。在特定實施例中，捕獲步驟情形中 所用緩衝液系統係Tris-乙酸鹽緩衝液、Tris-檸檬酸鹽緩衝 液、三乙醇胺-乙酸鹽緩衝液或三乙醇胺-檸檬酸鹽緩衝 液0 163143.doc •32· 201249999 4.4精細純化步驟

除捕獲步驟外，在某些實施例中，本發明之整合純化製 程亦包含精細純化步驟。在某些實施例中，精細純化步驟 包含單一分離，例如（但不限於）基於離子交換之分離、基 於疏水相互作用之分離或基於混合模式之分離。在某些實 施例中，精細純化步驟包含2次、3次、4次或更多次個別 分離。舉例而言，但並非具有限制性，精細純化步驟可包 含基於混合模式之層析分離、之後離子交換分離。在特定 非限制性實施例中，精細純化步驟包含使用 CaptoAdhere™樹脂之基於混合模式之分離、之後陰離子 交換層析分離或陰離子交換膜分離（例如Chr〇maS〇rbTM Q 膜）。在特定非限制性實施例中，精細純化步驟包含使用 CaptoAdhereTM樹脂之基於混合模式之分離或陰離子交換 分離、之後陽離子交換分離或疏水相互作用分離。 如下文第5部分及第6部分中所詳細論述，在某些實施例 中，本發明係關於在精細純化步驟進程期間使用最小數目 之緩衝液系 '统以及包含具最低腐姓性之組份之緩衝液的純 化製程。舉例而言’在某些實施例中，在整個精細純化步 驟中採用單-緩衝㈣、統。在特定實施例中，緩衝液系統 將僅由水及兩種其他離子组份（亦即陰離子組份及陽離子 組份）組成’纟中將兩種離子組份以不同組合及濃度混合 以產生適於任何特定純化製程需要之緩衝液。在某些實施 例中’精細純化步驟情形令所用緩衝液系,统採用ΤΑ或三 乙醇胺組伤。在某些實施例中，精細純化步驟情形中所用 I63I43.doc -33- 201249999 緩衝液系統採用乙酸鹽或檸檬酸鹽組份。在特定實施例 中，精細純化步驟情形中所用緩衝液系統係打泳乙酸鹽緩 衝液、Tds-檸檬酸鹽緩衝液、三乙醇胺_乙酸鹽緩衝液或 二乙醇胺-檸檬酸鹽緩衝液。 4·4·1離子交換分離 在某些實施例中，本發明提供自包含抗體及至少一種 HCP之混合物產生Hcp減少之抗體製劑之方法其係藉由 使該混合物經受至少一個離子交換分離以獲得包含該抗體 之溶析液來達成。離子交換分離包括兩種物質基於其各自 離子電何之差異藉以分離的任—方法，且可採用陽離子交 換材料或陰離子交換材料。 在某些實施例中，使來自第一精細純化離子交換分離之 試樣經受第二離子交換分離。較佳地，該第二離子交換分 離將涉及基於第-離子交換分離之相反電荷之分離。舉例 而言’若首先採用陰離子交換步驟，則第二離子交換層析 步驟可係陽離換步冑。反之帛一離+交換分離係 陽離子交換分離，則該步驟之後為陰離子交換分離。使用 陽離子交換材料對陰離子交換材料係基於蛋白之總體電荷 及是否意欲實施分離，該分離係藉由以下方式來達成：使 所關注抗體保持於管柱上且允許Hcp流過，或反之，使 HCP保持於管柱上且允許所關注抗體流過。 在實施分離時，可藉由使用多種技術中之任一者（例 如，使用分批純化技術或層析技術）使初始抗體混合物與 離子交換材料接觸。舉例而言，在分批純化之情形下離 163143.doc •34- 201249999 ::換材料係在期望之起始緩衝液中製備或在該緩衝液中 :在製備或平衡後，獲得離子交換材料之漿液。使抗 與聚液接觸，以使離子交換材料吸附所欲分離之抗 體:猎由（例如）使漿液沉降並移出上清液即可自聚液中 分離出包含不與離子交換材料結合之Hcp之溶液。可使浆 液經文-或多次洗條。若需要，可使漿液與具有較高導電 率之溶液接觸’以使已結合至離子交換材料之,解吸 附。為溶析結合的多肽，可增加緩衝液之鹽濃度。 亦可使用離子交換層析作為離子交換分離技術。離子交 換層析基於分子總電荷間之差異來分離分子。就抗體純化 而言，抗體必須具有與附著至離子交換材料（例如，樹脂） 之官能團之電荷相反的電荷，以進行結合。舉例而言，通 吊在pH低於其pi之緩衝液中具有總正電荷之抗體可較好地 結合至含有帶負電荷官能團之陽離子交換材料。 在離子交換層析中，溶質表面上之帶電荷片狀物被附著 至層析基質之相反電荷所吸引，前提係周圍緩衝液之離子 強度較低。溶析通常係藉由增加緩衝液之離子強度（即， 導電率）以與溶質競爭離子交換基質之帶電荷位點來達 成。改變pH並藉此改變溶質電荷係達成溶質溶析之另一方 式。可逐漸（梯度溶析）或逐步（分步溶析）改變導電率或 pH。 陰離子或陽離子取代基可附著至基質以形成供層析用之 陰離子或陽離子載體。陰離子交換取代基之非限制性實例 包括二乙基胺基乙基（DEAE)、四級胺基乙基（qae)及四級 163143.doc •35- 201249999 胺（Q)基團，且其用於市售產品中’例如（但不限於）（：邛比-QTM (GE Healthcare)、Toyopearl QAE55TM (Toso Haas 公 司）、Poros 50HQTMAP〇ros 50PITM (Applied Biosystems)。 陽離子取代基包括羧甲基（CM)、磺乙基（SE)、磺丙基 (SP)、磷酸根（P)及磺酸根（S)，且其用於市售產品中，例 如（但不限於）Capto-S™ (GE Healthcare)、Gigacap-STM (Toso Haas 公司）及 Nuvia-STM (BioRad)。諸如DE23TM、 DE32TM、DE52TM、CM-23TM、CM-32TM及 CM-52TM 等纖維 素離子交換樹脂係贈自Whatman有限公司，Maidstone, Kent，U.K »基於SEPHADEX®且交聯之離子交換劑亦為業 内已知。舉例而言，DEAE-、QAE-、CM-及SP-SEPHADEX®及DEAE-、Q-、CM-及S-瓊脂糖®及瓊脂糖® 快速流動（SEPHAROSE® Fast Flow)均係賭自 Pharmacia AB »此外，DEAE及CM二者衍生之乙二醇·曱基丙烯酸酯 共聚物（例如TOYOPEARL™ DEAE-650S或Μ及 TOYOPEARL™ CM-650S 或 Μ)係購自 Toso Haas 公司， Philadelphia，Pa 〇 在某些實施例中，將包含所關注抗體及雜質（例如， HCP)之混合物加載至離子交換管柱（例如陽離子交換管柱） 上。舉例而言’但並非具有限制性，可根據所用管柱以約 80 g蛋白/L樹脂之加載量加載混合物。適宜陽離子交換管 柱之實例係80 cm直徑X 23 cm長度之管柱，其床體積係約 116 L。加載至該陽離子管柱上之混合物可隨後用洗蘇緩 衝液（平衡緩衝液）洗滌。然後自管柱溶析抗體，並獲得第 163143.doc -36· 201249999 一溶析液。 4.4.2疏水相互作用分離 本發明之特徵亦在於自包含抗體及至少一種HCP之混合 物產生HCP減少之抗體製劑之方法，其包含疏水性相互作 用分離。舉例而言，在某些實施例中，自捕獲步驟獲得之 第一溶析液可經受疏水性相互作用材料處理以獲得HCP含 量減少之第二溶析液。在替代實施例中，在精細純化步驟 之情形下採用HIC分離作為第二、第三或後續分離。通常 實施疏水性相互作用層析步驟（例如彼等本文所揭示者）以 去除蛋白聚集體（例如抗體聚集體）及與製程有關之雜質。 在實施HIC分離時’使用（例如）分批純化技術或使用管 柱使試樣混合物與HIC材料接觸。在HIC分離前，可能需 要藉由（例如）使混合物穿過前置管柱來去除任何離液劑或 極疏水性物質。 舉例而言，在分批純化之情形下，在期望平衡緩衝液中 製備HIC材料或將該HIC材料平衡至該緩衝液中。獲得HIC 材料之漿液。使抗體溶液與漿液接觸以將所欲分離抗體吸 附至HIC材料。藉由（例如）使聚液沉降並去除上清液自漿 液分離包含不結合至HIC材料之HCP之溶液。漿液可經受 —或多次洗滌》若需要，可使漿液與具有較低導電率之溶 液接觸以使已結合至HIC材料之抗體解吸附。為溶析結合 抗體，可降低鹽濃度。 離子交換層析依賴於抗體之電荷來將其分離，而疏水性 相互作用層析（HIC)取決於抗體之疏水性質。抗體上之疏 163143.doc -37- 201249999 水性基團與管柱上之疏水性基團相互作用。蛋白之疏水性 愈高’其與管柱相互作用將愈強。因此，HIC分離能夠去 除源自宿主細胞之雜質（例如，DN A及與其他高及低分子 量產物有關之物質）。 由於在高離子強度下疏水性相互作用最強，因此，可在 鹽沈溯:或離子交換程序後方便地（但非排他地）實施此形式 之分離。儘管高鹽濃度有助於將抗體吸附至Hicj管柱，但 實際濃度可依抗體性質及所選特定HIC配體而在寬範圍内 變化。各種離子可以所謂的疏溶劑性序列排列，此取決於 其促進疏水性相互作用（鹽析效應）抑或破壞水結構（離液效 應）並導致疏水性相互作用弱化。可將陽離子按鹽析效應 遞增之順序排列：Ba++ ; Ca++ ; Mg++ ; Li+ ; Cs+ ; Na+ ; K+ ; Rb+ ; NH4+ ;同時可將陰離子按離液效應遞增之順序 排列：PO··· ; S04 - ; CH3C03- ; Cl·，· Br- ; N03- ; CKV ; Γ ;SCN—。在某些實施例中，陰離子係c3h5〇(COO)33、 一般而言’ Na、K或NH4之硫酸鹽可有效地促進HIC中之 配體-蛋白相互作用。可如以下關係所述來調配可影響相 互作用強度之鹽：（NH4)2S04>Na2S04>NaCl>NH4Cl> NaBr>NaSCN。一般而言’可使用以下鹽濃度：介於約 0.75 Μ與約2 Μ之間之硫酸錄或介於約1 μ與4 Μ之間之

NaCl»「溶液」之一種組份（陰離子或陽離子）具有疏水相 互作用促進性足夠。一個非限制性實例係Tris_檸檬酸鹽， 其中#檬酸鹽可有效促進疏水相互作用。 HIC管柱通常包含疏水性配體（例如，烷基或芳基）所偶 163143.doc • 38 · 201249999 合之基底基質（例如，交聯瓊脂糖或合成共聚物材料）》適 宜HIC管柱包含經苯基取代之瓊脂糖樹脂（例如，苯基瓊脂 糖™管柱）。許多HIC管柱可自市面購得。各實例包括（但 不限於）具有低或高取代之苯基瓊脂糖™ 6快速流動管柱 (Pharmacia LKB Biotechnology，AB，Sweden);笨基瓊脂糖™ 高效管柱（Pharmacia LKB Biotechnology，AB，Sweden);辛 基壤脂糖™高效管柱（Octyl Sepharose™ High Performance column) (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden)； Fractogel™ EMD 丙基或 Fractogel™ EMD 苯基管柱（丑· Merck，Germany) ; Macro-Prep™ 曱基或 Macro-PrepTM 第三 丁基載體（Bio-Rad，California); WP HI-丙基（C3)tm 管柱（j T. Baker, New Jersey);及 ToyopearlTMSt、苯基或丁 基管柱 (TosoHaas, PA) ° 4.4.3混合模式分離 本發明之特徵亦在於自包含抗體及至少一種HCP之混合 物產生HCP減少之抗體製劑之方法，其進一步包含混合模 式分離。舉例而言，在某些實施例中，可使自捕獲步驟獲 得之第一溶析液經受混合模式分離材料，以獲得具有減少 程度之HCP之第二溶析液。在替代實施例中，在精細純化 步驟之情形下採用混合模式分離作為第二、第三或後續分 離。 市售混合模式樹脂之非限制性實例包括：MEP-

Hypercel™ (Pall公司）；Capto-MMCTM (GE Healthcare); 及Capto-AdhereTM (GE Healthcare)。具體而言，本發明製 163143.doc •39· 201249999 程之非限制性實施例包括採用基於Capto-AdhereTM (GE Healthcare)之分離的精細純化步驟。Capto-Adhere™ (GE Healthcare)係具有配體（N-苄基-N-甲基乙醇胺）之高度交聯 之瓊脂糖，該配體展現多種相互作用功能，例如離子相互 作用、氫鍵結及疏水相互作用。 在本發明之某些實施例中，根據以下條件來實施採用基 於Capto-AdhereTM (GE Healthcare)之分離之精細純化步 驟：樹月旨-4.7 mL HiScreen Capto-Adhere™ (GE Healthcare) ; Tris-乙酸鹽緩衝液；pH 7.0-8.2 ;導電率為4-12 mS/cm ;抗體加載量至多為300 g/L樹脂；使用3M Tris 或3M乙酸調節之pH ;利用Tris-乙酸鹽之濃度調節之導電 率。在特定非限制性實例中，導電率維持在4.0-5.0 mS/cm 下，pH維持在7.8-8.0下，且抗體加載量限定於150-200 g/L 樹脂。 4.5 超濾/透析過濾及病毒不活化 本發明某些實施例採用超濾及/或透析過濾步驟來進一 步純化並濃縮抗體試樣。如圖1中所概述，此等UF/DF及 病毒不活化步驟可在純化製程進程期間在不同時間發生多 次。超濾詳細闡述於以下文獻中·· Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications，L. Zeman及 A. Zydney(Marcel Dekker公司，New York，N.Y·，1996);及 Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan(Technomic Publishing, 1986 ; ISBN編號為 87762-456-9)。較佳過濾方 法係正切流動過濾，如以下文獻中所述：the Millipore 163143.doc -40- 201249999 catalogue ’ 標題為「Pharmaceutical Process Filtration Catalogue」第 177-202 頁（Bedford，Mass·，1995/96)。通常 認為超慮意指使用孔徑小於〇 · 1 pm之過遽器進行過渡。藉 由採用具有此小孔徑之過濾器，使試樣緩衝液透過過渡器 而抗體保持在過濾器後面可減少試樣體積。 透析過濾係使用超濾器來去除並交換鹽、糖及非水性溶 劑，與結合物質分離’去除低分子量材料及/或引起離子 及/或pH環境快速變化的方法。可藉由以大約等於超濾速 率之速率將溶劑添加至超濾溶液中來最有效地去除微小溶 質。此可以恆定體積洗滌來自該溶液之微小物質，從而有 效地純化所保持抗體。在本發明某些實施例中，視情況在 進一步層析或其他純化步驟之前，採用透析過濾步驟來交 換與本發明結合使用之各種緩衝液以及去除來自抗體製劑 之雜質。 5·緩衝液系統 在本發明之另一態樣中，純化製程研發之整合方法係關 於最小數目之緩衝液系統之使用。在某些實施例中，此最 小數目之緩衝液系統發生在整個純化製程中。在某些實施 例中其發生於捕獲及精細純化步驟中》舉例而言，在某 些實施例中，在整個捕獲及精細純化步驟中採用單一緩衝 液系統。在特定實施例中，緩衝液系統將僅由水及兩種其 他離子組份（例如陰離子組份及陽離子組份）組成。在某些 實施例中，將該兩種離子組份以不同組合及濃度混合以產 適；任何特疋純化製程之需要的緩衝液，其通常為pH約 163143.doc 201249999 :至二。在某些實施例中，可將其他組份(例如金屬養 。劑及/或蛋白酶抑制劑)納入緩衝液系統中。 在本發明之某些實施财，例如在單—緩衝液純化方案 中使用特定緩衝液組份允許控制淑導電率。pH控制係 藉由用對應離子組份滴定陰離子（較低pH)或陽離子（較高 PH)來達成。導電率係、藉由組份之濃度㈣㈣加其㈣ :組份（通常為氯化鈉）來控制。如下文實例中所概述，調 節此等組份及所致對pH及導電率之控制可影響雜質Hcp&/ 或聚集體去除以及改良產物回收。 在某些實施例中，緩衝液系統將納入平衡緩衝液，其包 含（例如）25 mM Tris·乙酸鹽pH 7.2 ; 25 mM三乙醇胺乙酸 鹽pH 7.2 ; 25 mM Tris-檸檬酸鹽pH 7.2 ; 25 mM三乙醇胺-檸檬酸鹽pH 7.2 ; 25 mM Tris-磷酸鹽pH 7.2 ; 25 mM三乙 醇胺-填酸鹽pH 7·2 ; 25 mM破酸鈉pH 7.2 ; 25 mM擰樣酸 鈉 pH 7.2 ; 140 mM Tris-123 mM 乙酸鹽 pH 7_2 ; 15〇 mM 三 乙醇胺-120 mM乙酸鹽pH 7.2 ; 70 mM Tris-21 mM棒樣酸 鹽pH 7.2 ; 80 mM三乙醇胺-22 mM檸檬酸鹽pH 7.2 ; 105 mM Tris-62 mM構酸鹽 pH 7.2 ; 115 mM三乙醇胺-62 mM鱗 酸鹽pH 7.2 ;或90 mM Na-60 mM磷酸鹽pH 7.2 »在某些實 施例中，緩衝液系統將納入洗滌緩衝液，其包含（例如）25 mM Tris-乙酸鹽pH 7.2 ; 25 mM三乙醇胺-乙酸鹽pH 7.2; 25 mM Tris-檸檬酸鹽pH 7.2 ; 25 mM三乙醇胺-檸檬酸鹽 pH 7.2 ; 25 mM Tris-磷酸鹽pH 7.2 ; 25 mM三乙醇胺-磷酸 鹽 pH 7.2 ; 25 mM 磷酸鈉 pH 7.2 ; 25 mM 檸檬酸鈉 PH 7.2 ; 163143.doc • 42- 201249999

590 mM Tris-65 5 mM 乙酸鹽 pH 5.7 ; 595 mM三乙醇胺-658 mM 乙酸鹽 pH 5,7 ; 355 mM Tris-158 mM檸檬酸鹽 pH 6.0 ; 360 mM 三乙醇胺-159 mM 檸檬酸鹽 pH 6.0; 545 mM Tris-483 mM填酸鹽pH 6.3 ; 555 mM三乙醇胺_485 mM填酸鹽 pH 6.3 ; 535 mM Na-482 mM磷酸鹽 pH 6.3 ; 300 mM Tris-乙酸鹽pH 7.2 ; 300 mM三乙醇胺-乙酸鹽pH 7.2;或300 mM三乙醇胺-檸檬酸鹽pH 7.2。在某些實施例中，緩衝液 系統將納入溶析緩衝液，其包含（例如）1 〇〇 mM乙酸鈉pH

3.5 ; 100 mM 乙酸鹽（5 mM Tris) pH 3.5 ; 100 mM 乙酸鹽（5 mM三乙醇胺）pH 3.5 ; 25 mM乙酸鈉pH 3.5，25 mM乙酸 鹽（1 mM Tris) pH 3.5，25 mM 乙酸鹽（1 mM三乙醇胺）pH 3.5，25 mM 檸檬酸鹽（5 mM Tris) pH 3.5 ; 25 mM 檸檬酸鹽 (5 mM 三乙醇胺）pH 3·5 ; 25 mM 磷酸鹽（Tris) pH 3.2 ; 25 mM磷酸鹽（三乙醇胺）pH 3.2 ; 25 mM磷酸鹽（鈉）pH 3·2 ; 25 mM擰檬酸（檸檬酸鈉）pH 3.5 ; 100 mM乙酸鹽（4.89 mM Tris) pH 3.5 ; 100 mM 乙酸鹽（4.89 mM三乙醇胺）pH 3.5 ; 25 mM檸檬（Tris)酸pH 3.5 ; 25 mM檸檬（三乙醇胺）酸pH 3.5 ; 25 mM 乙酸鹽（0.89 mM Tris) pH 3.5 ; 25 mM 乙酸鹽 (0.89 mM 三乙醇胺）pH 3_5 ; 7.5 mM 檸檬（5.3 mM Tris)酸 pH 3.5 ; 7.5 mM 檸檬（5.3 mM三乙醇胺）酸 pH 3.5 ; .5 mM 磷 酸鹽（4.0 mM Tris) pH 3.2 ; 5 mM填酸鹽（4.0 mM三乙醇胺） pH 3.2 ;或5 mM 磷酸鹽（4·〇 mM 鈉）pH 3.2。 在某些實施例中’緩衝液系統將包含水及Tris_檸檬酸 鹽、三乙醇胺-檸樣酸鹽、Tris_乙酸鹽或三乙醇胺-乙酸 163143.doc -43· 201249999 鹽，pH為7.0-8.2 ;且導電率為：2-12 mS/cm »在某些實施 例中，緩衝液系統將包含水及Tris-檸檬酸鹽、三乙醇胺_ 檸檬酸鹽、Tris-乙酸鹽或三乙醇胺-乙酸鹽，pH為TAiOj 且導電率為4.5±0.5 mS/cm β在替代實施例中，緩衝液系統 將包含水及Tris-檸檬酸鹽、三乙醇胺-檸檬酸鹽、Tris-乙 酸鹽或三乙醇胺-乙酸鹽’卩!1為7.7±0.1且導電率為2.5±0.5 mS/cm。 6.具最低腐蝕性之緩衝液系统 在本發明之又一態樣中，純化製程研發之整合方法係關 於具最低腐蝕性之不含氣化物之緩衝液系統的使用。某些 緩衝液系統採用可對市售抗體產生及純化設備（例如不錄 鋼）具有腐触性影響之氣化物鹽。因此，本發明範圍通常 (但非一律地）不包括包含氣化物鹽或類似腐蝕性替代物之 緩衝液。 在某些實施例中’本發明係關於採用具最低腐蝕性緩衝 液系統的緩衝液系統’例如(但不限於)彼等採用與乙酸雖 或棒檬酸鹽配對之tris或三乙醇胺者。舉例…緩衝液 '統之某一非限制性實施例將包含Τγ“·乙酸鹽、ΤΑ·擰檬 酸鹽、三乙醇胺-乙酸鹽或三乙醇胺檸檬酸鹽。 7.實例性整合純化策略 在本發明之某些實施例 妓人u 半现. 中’整合純化策略包含以下4個 步驟.（1)收穫/淨化_自發 m & 货酵培養物分離宿主細胞；（2)捕 獲-自淨化收穫物中之大部八4 自焱+ , a 卩分組份分離抗體；（3)精細純化· 自殘餘宿主細胞污染物及 取渠體分離柷體；及（4)調配。 I63143.doc 201249999 在某些實施例中’收穫/淨化步驟係藉由離心及/或深層 過濾達成。可用於此等收穫/淨化步驟中之深層過滤器的 非限制性實例包括CunoTM 30/60ZA型深層過遽器（3M公司） 及0.45/0.2pmSartoporeTM雙層滤筒。 在某些實施例中，捕獲及精細純化步驟係藉由雙管柱程 序達成。舉例而言，但不具有限制性，可將基於蛋白A之 捕獲步驟與基於混合模式之精細純化步驟組合。在特定非 限制性實例中’基於蛋白A之步驟採用來自Ge Healthcare 之MabSelect™、來自 GE Healthcare之mAbSelect SuReTlv^ 來自Millipore之ProSep Ultra PlusTM。在某些實施例中，基 於混合模式之步驟採用Capto-AdhereTM (GE Healthcare)。 在某些實施例中’雙管柱策略可補充有存在一或更多次 過濾分離及或一或更多個病毒不活化步驟。在某些實施例 中’捕獲步驟之後為病毒不活化步驟，例如（但不限於）低 PH病毒不活化步驟；及過遽步驟，例如（但不限於）F0HC (Millipore)過濾步驟。 在某些實施例中’精細純化步驟可補充有存在一或多次 額外分離’例如（但不限於）離子交換分離或疏水相互作用 分離。在某些實施例中，此等補充分離係選自由基於 Chromosorb Q之分離及基於苯基Hp之分離組成之群。 整合純化製程之特定實例包括（但不限於）彼等納入以下 者： 163143.doc -45· 201249999

MabSelect SuRe-FOHC-CaptoAdhere-ChromaSorb Q-ViroSart ；

Prosep Ultra Plus-FOHC-CaptoAdhere-ChromaSorb Q-ViroSart ； MabSelect SuRe-FOHC-Nuvia S-ChromaSorb Q-ViroSart

Prosep Ultra Plus -FOHC-Nuvia S-ChromaSorb Q-ViroSart ;及

MabSelect SuRe-FOHC-Q壤脂糖-苯基HP壤脂糖。 在某些實施例中，此等純化製程亦可包含奈米過濾步 驟、超濾/透析過濾步驟及調配（裝瓶/冷凍）步驟。 實例 1.捕獲步驟 在純化製程的捕獲步驟之情形下使用實際淨化之收穫材 料之前，針對已評價為有效之緩衝液系統實施空白運行， 該等空白運行追縱在所評價3種蛋白A樹脂之間之pH及導 電率轉變。所評價3種樹脂係：Pr〇Sep ultima Plus ; Mabselect;及Mabselect Sure。評價3種陰離子組份：乙酸 根；檸檬酸根；及磷酸根。評價3種陽離子組份：納； Tris ;及三乙醇胺。如下文所述詳細論述，評價以下所得 緩衝液系統之空白運行.由多種組份（對照）構成之習用蛋 白A緩衝液系統；Tris乙酸鹽；Tris棒檬酸鹽；Tris填酸 鹽；三乙醇胺乙酸鹽；三乙醇胺檸檬酸鹽；三乙醇胺磷酸 鹽；及磷酸鈉》 對於第一組空白運行而言’基於可比性，對於每一緩衝 液系統而言’在蛋白A捕獲製程中使用具有類似離子強度 163143.doc •46- 201249999 之緩衝液進行平衡、洗滌及溶析步驟，從而產生下表2中 所示之緩衝液，該表顯示用於所評價每一緩衝液系統之緩 衝液。使用離子強度計算器來測定所用濃度，該計算器使 用戴維斯方程式（Davis Equation)作為測定離子濃度之基 礎。 表2 用於初步空白運行之緩衝液 系統 平衡 洗滌 溶析 對照(習用 緩衝液） 25 mM Tris+100 mMNaClpH7.2* 20 mM檸檬酸鈉，500 mMNaClpH6.0 100 mM乙酸鈉pH 3.5* Tris乙酸鹽 140 mM Tris-123 mM乙酸鹽pH 7.2 590 mM Tris 655 mM 乙酸鹽pH 5.7 100 mM乙酸鹽 (4.89 mM Tris) pH 3.5 三乙醇胺乙 酸鹽 150 mMTrol-120 mM乙酸鹽pH 7.2 595 mM Trol-658 mM 乙酸鹽pH 5.7 100 mM乙酸鹽 (4.89 mM Trol) pH 3.5 Tris檸檬睃鹽 70 mM Tris-21 mM 檸檬酸鹽pH 7.2 355 mM Tris 158 mM 檸檬酸鹽pH 6.0 7.5 mM 檸樣（5.3 mM Tris)酸pH 3.5 三乙醇胺檸檬 酸鹽 80 mM Trol-22 mM 檸檬酸鹽pH 7.2 360 mM Trol 159 mM 檸檬酸鹽pH 6.0 7.5 mM 檸檬（5.3 mM Trol)酸pH 3.5 Tris磷酸鹽 105 mMTris-62 mM磷酸鹽pH 7.2 545 mM Tris 483 mM 磷酸鹽pH 6.3 5 mM碟酸鹽(4.0 mM Tris) pH 3.2 三乙醇胺磷 酸鹽 115 mMTrol-62 mM磷酸鹽pH 7.2 555 mM Trol 485 mM 磷酸鹽pH 6.3 5 mM碟酸鹽(4.0 mM Trol) pH 3.2 磷酸鈉 90 mM Na-60 mM 磷酸鹽，pH 7.2 535 mM Na 482 mM填 酸鹽pH 6.3 5 mM磷酸鹽(4.0 mMNa)pH3.2 為評價每一緩衝液系統在蛋白A樹脂之間之pH及導電率 轉變，以與習用蛋白A捕獲製程類似之方式來構造空白運 行，其中首先使平衡緩衝液運行穿過每一管柱（初始在儲 存緩衝液中）直至pH及導電率讀數達成平衡（10管柱體積 163143.doc -47- 201249999 (CV))以模擬平衡、加載及洗務丨步驟。此後為模擬洗條η 步驟之20 CV洗滌緩衝液。20 CV平衡緩衝液模擬洗滌m 步驟，之後為20 CV溶析緩衝液。然後將管柱放回儲存， 其中使用I5 CV儲存緩衝液（5〇 111；^乙酸鈉，20/〇苄醇，pH 5.0)。以2分鐘停留時間運行所有製程步驟。亦實施類似運 行，其中不使用管柱作為管柱效應評價之陰性對照。然後 覆蓋所得層析圖以評價管柱與緩衝液系統之間之差異。 對於第二組空白運行而言，評價儲存後再生對在加載前 平衡管柱所需平衡緩衝液之體積的效應及改變溶析緩衝液 濃度對pH及導電率轉變之效應。通常使用〇 2 M乙酸使 Mabselect樹脂再生，同時出於相同目的對pup使用〇 15 μ 磷酸。對於該等運行組而言，針對所有3種樹脂評價兩種 再生緩衝液，且僅評價含有Tris之緩衝液系統。使用以下 表3中所示溶析陰離子濃度進行第二組空白運行。在此組 實驗中，將管柱自儲存轉移至10 CV儲存後再生緩衝液、 之後用10 CV水沖洗以模擬儲存後再成製程然後進展至 各為20 CV之平衡及溶析 '及最終15 CV儲存緩衝液。 表3 第二組空白運行之溶析陰離子濃度 系統 初步陰離子濃 度(mM) 運行1陰離子 濃度(mM) 運行2陰離子濃度 (mM) 對照 100 100 100 Tris乙酸鹽 100 100 50 Tris檸檬酸鹽 7.5 15 30 Tris磷酸鹽 5 25 50 163143.doc •48· 201249999 在評價所用緩衝液對樹脂之效應後，下一步驟係評價當 將淨化收穫材料加載至樹脂上時，緩衝液對蛋白A捕獲性 能之效應。評價此組運行中之第9緩衝液系統（擰檬酸鈉系 統）。對於該等運行而言，以3分鐘停留時間實施所有製程 步驟。沒有洗滌II步驟用於該等運行，此意味著僅使用10 CV平衡緩衝液作為洗滌相，且使用0.15 Μ磷酸作為所有3 種樹脂之再生緩衝液。以30 g抗體/L樹脂固定所有3種樹脂 之加載。除該等條件以外，以與習用製程類似之方式實施 Mabselect及Mabselect Sure運行，只是在運行不同緩衝液 系統時改變平衡及溶析緩衝液。對於Prosep Ultra Plus樹 脂而言，以與Mabselect運行類似之方式實施運行，只是以 1 _6分鐘停留時間實施平衡及洗滌步驟，且亦去除清潔II及 衛生處理步驟。用於緩衝液系統中每一者之平衡及溶析緩 衝液顯示於表4中。 表4 用於基線運行之平衡及溶析緩衝液 系統 平衡 洗蘇 溶析 對照 (習用緩衝液） 25 mM Tris+100 mM NaCl pH 7.2* 20 mM檸檬酸 納，500 mM NaCl pH 6.0 100 mM乙酸納 pH 3.5* Tris乙酸鹽 25 mM Tris-乙酸鹽pH 7.2 25 mM Tris-乙酸 鹽 pH 7.2 100 mM乙酸鹽 (4.89 mM Tris) pH 3.5 三乙醇胺乙 酸鹽 25 mM Trol-乙酸鹽pH 7.2 25 mM Trol-乙酸 鹽 pH 7.2 100 mM乙酸鹽 (4.89 mM Trol) pH 3.5 Tris檸檬酸鹽 25 mM Tris-檸檬酸鹽 pH 7.2 25 mM Tris-檸檬 酸鹽pH 7.2 25 mM檸檬(Tris) 酸pH 3.5 163143.doc -49- 201249999 三乙醇胺檸檬 酸鹽 25 mM Trol-檸檬酸鹽 pH 7.2 25 mM Trol·檸樣 酸鹽pH 7.2 25 mM檸檬(Trol) 酸pH 3.5 Tris填酸鹽 25 mM Tris-填酸鹽pH 7.2 25 mM Tris-罐酸 鹽pH 7.2 25 mM破酸鹽 (Tris) pH 3.2 三乙醇胺碟 酸鹽 25 mM Trol-填酸鹽 pH 7.2 25 mM Trol-碳酸 鹽pH 7.2 25 mM填酸鹽 (Trol) pH 3.2 磷酸鈉 25 mM填酸納，pH 7.2 25 mM填酸鈉， pH 7.2 25 mM填酸鹽 (Na)pH3.2 檸檬酸鈉 25 mM檸檬酸鈉pH 7.2 25 mM檸檬酸鈉 pH 7.2 25 mM 檸檬(Na) 酸 pH 3.5 根據基線運行之產物品質結果，藉由去除彼等具有磷酸 鹽或鈉離子者以僅留下Tris/三乙醇胺乙酸鹽及三乙醇胺檸 檬酸鹽系統，能夠縮小適宜緩衝液系統之列表。對於該等 緩衝液系統而言，使用如圖12中所示之基質在產生聚集體 及宿主細胞蛋白（HCP)清除方面評價洗滌II陽離子濃度及 緩衝液pH對蛋白A性能之效應。 使用簡化緩衝液系統實施比較運行以評價對於兩種其他 抗體即抗體B (本文中亦稱為「分子B」）及抗體C (本文中 亦稱為「分子C」）而言Mabselect Sure之捕獲性能。根據 抗體A (本文中亦稱為「分子A」）運行結果將所用洗滌緩 衝液最佳化，且顯示於表5中。 163143.doc -50- 201249999 表5 用於比較運行之緩衝液 系統 平衡 洗滌 溶析 對照 25mMTris+100 mMNaClpH7.2 20 mM檸檬酸 納，500 mM NaCl pH 6.0 100 mM乙酸納 pH 3.5 Tris乙酸鹽 25 mM Tris-乙酸鹽 pH 7.2 300 mM Tris-乙酸 鹽 pH 7.2 25mM乙酸鹽 (0.89 mM Tris) pH 3.5 三乙醇胺乙酸鹽 25 mM Trol-乙酸鹽 pH 7.2 300 mM Trol·乙酸 鹽 pH 7·2 25mM乙酸鹽 (0.89 mM Trol) pH 3.5 三乙醇胺檸檬 酸鹽 25 mM Trol-檸樣酸 鹽 pH 7.2 300 mM Trol-擦檬 酸鹽pH 7.2 25 mM檸檬 (Trol)酸 pH 3.5 藉由UV 280 nm下之分光光度分析來測定自實驗室研究 獲得之溶析液試樣中的抗體濃度。該方法利用一式兩份25 倍稀釋之存於IX磷酸鹽缓衝鹽水（PBS)中之測試試樣，且 在Agilent 8453 UV/可見分光光度計（Agilent，目錄編號為 G1 8 15 AA，Santa Clara，CA)上在 280 nm之波長下讀數。 藉由Poros A HPLC方法來測定來自實驗室研究之淨化收 穫材料中之抗體濃度。該方法利用一式兩份1〇〇 pL之5種 標準物之注射液（0.025 、0.05 、0.10 pg/pL、 0.50 pg/pL、1.0 pg~L)用於標準曲線且施加試樣稀釋液以 達成在標準曲線範圍内之讀數。Shimadzu HPLC系統經組 態而具有 Poros A ImmunoDetection 感測器筒（Applied Biosystems，Foster City, CA)。將管柱維持在 20-22°C 下且 將自動取樣器托盤溫度設定在4°C下。使系統以2 mL/min 運行10分鐘之運行時間，在UV 280 nm下監測吸光度。 163143.doc -51 - 201249999 藉由SEC方法來測定溶析液試樣中之聚集體含量。該方 法利用5種20 濃度為1.〇 _L之參考標準物之注射液且 對該等試樣中之每-者進行一式兩份運行，將該等試樣全 部稀釋至1.0 pg/HL之抗體濃度》Shimadzu hplc系統經組 態而具有TOSOH BioScience TSKgel G3000SWXL SEC管 j。將管柱維持在20_22t下且將自動取樣器托盤溫度設 定在4°C下》使系統以0·50 mL/min運行6〇分鐘之運行時 間，在214 nm下監測吸光度且所用緩衝液係1〇〇 mM磷酸 鈉、200 mM硫酸鈉（pH 6.8)。 圖8顯示自第一組空白運行生成之層析圖疊加圖之實 例。圖8顯示對於所有3種樹脂及無管柱之條件而言THs乙 酸鹽系統在CV方面的所有PH及導電率轉變曲線。導電率 轉變曲線係在圖之底部，而pH轉變係在圖之頂部。不使用 管柱在線實施之運行（以無符號之線顯示）顯示轉變的發生 因不存在管柱而比使用樹脂快約丨個cv。除此差異外對 於所有樹脂條件而言，pH與導電率二者之轉變曲線的形狀 之間沒有其他顯著差異。對於所有其他乙酸鹽系統及檸檬 酸鹽系統觀察到相同情形。 對於峨酸鹽緩衝液系統而言，儘管轉變在不同樹脂之間 看起來類似，但溶析曲線之pH轉變與無管柱之條件不同， 如可在圖9中發現。pH曲線形狀存在差異’且無管柱之條 件與其他3種樹脂之轉變曲線之間存在約6 cv之顯著滯 後。此係因磷酸鹽緩衝液與樹脂之相互作用所致。 對於相同陰離子系統及相同樹脂而言，比較不同陽離 163143.doc -52· 201249999 子，自圖10可發現pH及導電率之轉變均類似，從而指示陽 離子組份在影響蛋白A樹脂之間pH轉變方面不起顯著作 用。 對於相同陽離子系統及相同樹脂而言，比較不同陰離 子，自圓11可發現陰離子顯著影響卩{^轉變曲線之形狀，尤 其在溶析步驟期間》 總之，亦可發現所用樹脂或存在之離子組份不影響導電 率轉變《藉助獲得之結果，確定減少認為含有Tris之緩衝 液系統的緩衝液，此乃因陽離子對pH及導電率轉變之效應 不顯著。 對於不同緩衝液系統而言，在HCP減少方面之產物品質 結果可在圖2B中發現。自圖2B可觀察到，一般而言，對 於相同緩衝液系統而言，Mabselect樹脂在HCP清除方面比 PUP執行得更佳。亦明顯的是，某些緩衝液系統比其他更 佳地清除HCP，如檸檬酸鹽系統與乙酸鹽系統以及THs及 三乙醇胺相比。 圖12顯示所獲得各3種緩衝液系統之抗體A溶析液Hcp含 量隨不同洗滌II pH及陽離子濃度而變化的所得等高線圖。 自獲得之結果明顯的是，對於較高洗滌π陽離子濃度而 s，存在更佳雜質清除，但產率略有降低（數據未顯示）， 對於研究範圍而言，pH似乎對HCP清除不具有顯著效應。 對於研究條件而言，三乙醇胺檸檬酸鹽緩衝液系統執行得 最佳，具有400-900 ng/mg之最低溶析液HCP範圍》因此， 在某些實施例中，欲用於洗滌^階段之條件可係3〇() mM之 163143.doc •53· 201249999 陽離子濃度及pH 7.2，且該等條件係用於抗體B及抗體C比 較運行之條件。 表7比較不同抗體及不同緩衝液系統之間之溶析液HCP 含量。儘管HCP清除性能在不同抗體之間有所不同，但簡 化緩衝液系統似乎執行得與習用製程緩衝液相當或比其更 佳。 表7. HCP結果之抗體A/B/C比較* 抗體(ng/mg) C B A 習用製程 2580 589 1625 Tris乙酸鹽 2508 1409 739 三乙醇胺乙酸鹽 2604 1542 1103 三乙醇胺檸檬酸鹽 2293 441 565 *相對於加載量=100,000 自空白運行確定，所有3種蛋白A樹脂當經受相同緩衝液 系統時均執行得類似，且陽離子物質對樹脂上之pH或導電 率轉變不具有顯著效應。然而，陰離子物質因其pKa性質 而影響轉變形狀。亦確定，簡化緩衝液系統與習用製程緩 衝液相比在管柱平衡方面執行得更佳，且緩衝液濃度與平 衡體積成反比。 自基線運行確定，不同緩衝液系統在HCP清除方面執行 地不同，且MabselectTM樹月旨在此方面比Prosep Ultra PlusTM執行得更佳。亦確定，由於在磷酸鹽緩衝液系統之 溶析期間發生pH逐漸轉變，因此其會導致延遲及大得多之 溶析液體積。 163143.doc -54· 201249999 自各運行之結果，針對產物品質及產率性能將中間洗滿 條件最佳化為3〇〇 mM之陽離子濃度及7 22pH。 最終，對不同抗體實施之運行表明，對於忖4乙酸鹽、 三乙醇胺乙酸鹽及二乙醇胺擰檬酸鹽系統而言，蛋白A捕 獲性能與當使用習用製程緩衝液時相當或比其更佳，從而 指示該3種緩衝液系統適於使用單一緩衝液系統之精簡純 化製程。 2.精細純化 2.1兩組份無鹽緩衝液系统中之陰離子交換樹脂及 Q膜性能 對於mAb純化平臺精細純化步驟而言，pH、導電率及緩 衝液系統組份可影響陰離子交換（ΑΕχ)介質之性能。因 此，重要的是瞭解具有不同單株抗體分子之各種陰離子交 換介質（樹脂與膜二者）在一系列條件下的性能。 本研究之目標係藉由針對兩種單株抗體對各種樹脂實施 高通量篩選（HTS)研究來確定溢流模式AEX層析條件。在 產物結合及雜質去除方面評價導電率、pH及蛋白濃度之效 應。在最佳條件下，針對各種AEX介質評估雜質漏出型 態。 以溢流模式施加高通量篩選（HTS)實施研究以確定AEX 操作範圍。在預加載preDictor板（GE Healthcare)中使用 AEX樹脂來實施hts。使用來自存於兩組份緩衝液系統 Tris-乙酸鹽中之Mabsdect溶析液之抗體a與抗體b分子二 者來製備加載材料。將變量設定成pH為7.0至8.5 ,導電率 163143.doc -55- 201249999 為 2 mS/cm 至 12 mS/cm，且 mAb 濃度為 4 g/L 至 16 g/L·。加 載量係每升介質50 g mAb。利用3M乙酸將抗體a MabSelect溶析液調節至pH 3 5用於病毒不活化，隨後使用 3M Tris中和至所設計之pH。利用Tris及乙酸之濃度來控制 導電率。將所製備之加載材料離心並藉助〇 2 μιη過濾器過 濾’然後加載。此實驗之結果提供於圖丨3中。 在P值<0_05下，將參數影響視為顯著。舉例而言，pH影 響抗體A與抗體B二者之產物產率。最高產物回收產率係 在pH 7.65下。此外’抗體a與抗體b二者之導電率顯著影 響HCP log減少因子。導電率與蛋白濃度之相互作用及導 電率與pH之相互作用對抗體a之HCP減少具有顯著影響。 抗體A與抗體B二者之較高HCP LRF係利用較低導電率來達 成。pH顯著影響抗體B聚集體百分比。較高pH產生較低聚 集體之百分比。鑑別為有效之非限制性條件：pH 7.7 士0.1，且導電率為 2.5±0.5 mS/cm。 在有效條件之非限制性實例（pH 7.7及2·5 mS/cm之導電 率’ Tris·乙酸鹽緩衝液）下，選擇4種AEX樹脂用於進一步 管柱層析研究。樹脂選擇係基於8種AEX樹脂之初步HTS 結果。用每一樹脂填充1x10 cm管柱》對於抗體A與抗體B 分子二者而言，自4種AEX管柱及兩種Q膜獲得雜質漏出曲 線。抗體A及抗體B MabSelect溶析液在pH 3.5 (3 Μ乙酸） 下病毒不活化，且用3 M Tris中和至pH 7.7。藉由將Milli Q水添加至pH經調節之材料中將導電率調節至2.5 mS/cm » 將該等材料離心並用0.2 μιη過濾器過濾，然後加載。 I63143.doc •56· 201249999 對於該等實驗而言，採用以下條件：pH 7.7，2.5 mS/cm，47 mM乙酸鹽/69 mM Tris ;採用以下AEX樹脂： Q 填脂糖 FF (GE Healthcare) ; Toyopearl QAE 550C (Tosoh) ； Poros 50HQ (Applied Biosystems)；及Poros 50PI (Applied Biosystems);且採用以下 Q 膜：Sartobind (Sartorius)及 ChromaSorb (Millipore)。 該等實驗之結果繪示於圖14中。特定而言，4種AEX樹 脂對於每一 mAb具有類似HCP去除能力：對於抗體A而 言，HCP減少到10/27至1/4且對於抗體B而言，HCP減少到 1/8至1/11倍。ChromaSorb Q在5000 g/L加載量下具有最高 HCP去除能力：對於抗體A而言，HCP減少到5/28且對於抗 體B而言，HCP減少到5/78。 在下一組實驗中，自所確定最佳化之pH 7.7及2.5 mS/cm 修改導電率及pH條件以經合理化而適合Capto-Adhere"™管 柱，該管柱最佳在pH 7.9及4.5 mS/cm下執行。在自平臺緩 衝液去除氣化物之努力中，將簡化兩組份緩衝液系統設計 成不含鹽。利用Q膜性能評價該等緩衝液，其含有乙酸根 或檸檬酸根之陰離子組份及Tris或三乙醇胺之陽離子組 份。利用3種Q膜中之一者來測試4種緩衝液系統中之每一 者，總共進行12次運行。藉由添加3M檸檬酸或3M乙酸使 具有4種緩衝液系統之抗體A之MabSelect溶析液在pH 3.5 下病毒不活化，然後藉由添加3M Tris或3M三乙醇胺中和 至pH 7.9。用水將最終導電率調節至4.5 mS/cm。將材料離 心，隨後進行0.2 μηι過慮，之後進行膜加載。 163143.doc -57- 201249999 對於該等實驗 而言 採用以下加載條件：pH :

Q ’ 及 Sartobind Q。

HCP漏出最少。在轉檬酸鹽緩衝液系 統（Tris-檸檬酸鹽及三乙醇胺擰檬酸鹽）中，chromas〇rb Q 比Sartobind Q及Mustang Q具有顯著更低之HCP漏出，至 多為3000 g/L加載量。對於所有3種膜、尤其ChromaSorb 而言，Tris-乙酸鹽缓衝液系統具有最少HCP漏出。 總之，該等實驗指示如下：導電率顯著影響HCP去除。 較低導電率產生較高減少。PH顯著影響聚集體含量。 較高pH產生較低聚集體百分比。PH影響產物回收。較高 pH產生較高產率。

Tris-乙酸鹽系統與其他緩衝液相比，總體HCP減少更 高。Tris-乙酸鹽系統中之ChromaSorb清除至多5000 g/L加 載量之浸出蛋白A ’而其他膜及系統未顯示顯著清除聚集 體型態。在任何膜中在任何系統中均未觀察到顯著聚集體 增加或減少。大多數缓衝液及系統具有合理回收產率 (>90%)，存於三乙醇胺乙酸鹽中之Sartobind (84%)除外’ 此可能歸因於加載量不足（2430 g/L加載量）° 163l43.doc -58 · 201249999 另外，結果指示所選緩衝液系統之多種影響。對於所有 3種Q膜而言，TriS-乙酸鹽產生最佳雜質清除。Tris_乙酸鹽 緩衝液亦對CaptoAdhere層析顯示最佳性能。在相同條件 下對AEX介質之比較指示強aEX樹脂（q Sephars〇e、 Toyopead QAE、P〇ros 50HQ)在加載能力及雜質去除方面 相當。（^膜、尤其ChromaSorb Q比強AEX樹脂具有更高加 載能力。ChromaSorb加載量可根據加載材料中之雜質濃度 潛在地增加。 就所加載分子之性能而言，結果指示如下。在所有所測 試之ΑΕΧ樹脂及Q膜中，抗體Β比抗體Α觀察到更高HCp減 ’此可細'因於HCP物質及/或分析敏感性之差異。 2.2使用Capt〇-AdhereTM管枉層析及精簡無鹽緩衝 液系統之MAb平臺精細純化步琢的研發

Capto-Adhere™係混合模式樹脂且經設計用於單株抗體 之蛋白A後純化。其可去除污染物，例如浸出之蛋白a、 HCP、DNA及聚集體。其基底基質係高度交聯之具有配體 (N-苄基-N_甲基乙醇胺）之瓊脂糖，該配體展現許多相互作 用功能，例如離子相互作用、氫鍵結及疏水相互作用。其 係由 GE Healthcare製造。

Capto-Adhere™係以單一精細純化步驟、以溢流模式、 以兩管柱MAb (抗體A及抗體B)純化平臺製程來評價。應 用靶向高加載能力之研究以界定使用簡化兩組份無鹽緩衝 液系統之操作條件。比較4種緩衝液系統且THs_乙酸鹽緩 163143.doc •59· 201249999 衝液系統在雜質減少方面表現良好。 在此研究之初始實驗組中，採用以下條件來評價緩衝液 條件.樹脂管柱.4.7 mL HiScreen Capto-AdhereTM (GE Healthcare) ; Tris-乙酸鹽緩衝液；PH : 7.0-8.2 ;導電率： 4-12 mS/cm ;加載量··抗體A至多300 g/L樹脂；抗體B至 多250 g/L樹脂；使用3M Tris或3M乙酸調節pH，利用Tris_ 乙酸鹽之濃度來控制導電率。

pH與導電率二者顯著影響抗體回收產率；僅導電率之相 互作用顯著影響抗體B回收產率。對於兩種抗體而言，較 低導電率及較低pH產生較高產率。對於兩種抗體而言，導 電率顯著影響浸出之蛋白A含量；對於抗體8而言，？11對 蛋白A含量具有微小影響。對於兩種抗體而言，較低導電 率產生溢流中之較低浸出蛋白A濃度。對於兩種抗體而 言，導電率顯著影響HCP減少。對於抗體A而言，pH&pH 與導電率之相互作用顯著影響HCP去除。對於抗體B而 言’ PH對HCP去除具有微小效應。 *對於抗體A而言，較低導電率及較高_生較高Hcp減 少。對於抗體B而言，較低導電率產生較高Hcp減少。對 於兩種抗體而言’導電率及pH顯著影響產物單體較低 =電率及較高pH產生較高產物單體對於所有條件而 吕’兩種抗體之總產率係2914%0 杜Γ據前文，可接受之產率及產物品質的非限制性有效條 括：導電率：4.0-5.0ms/cm;PH:7 8 8 0;及管柱加 163I43.doc •60· 201249999 載：150-200 g/L樹脂。對於兩種其他混合模式樹脂hEA_

HyperCel (己胺）及 PPA-HyperCel (丙基苯基胺）（Pall)而 言，獲得相當結果。 使用以下條件進一步評價經簡化兩組份緩衝液系統在最 佳化條件下對雜質減少之影響：緩衝液系統：Tris-檸檬酸 鹽；二乙醇胺·檸檬酸鹽；Tris-乙酸鹽；三乙醇胺-乙酸 鹽；pH : 7.9士0·1 ;導電率：4.5±0.5 ms/cm ;加載量：300 g/L·樹脂。如圖16中所圖解說明，加載物之病毒不活化導 致Tds-棒檬酸鹽及三乙醇胺_檸檬酸鹽緩衝液系統之聚集 增加’但Tris-乙酸鹽不會》加載材料之病毒不活化導致 Tris-乙酸鹽、三乙醇胺-乙酸鹽及三乙醇胺_檸檬酸鹽緩衝 液系統中之HCP減少。Tris-乙酸鹽在所有測試加載量下顯 示最大HCP減少。Tris-乙酸鹽在高加載量下顯示最小聚集 體漏出。Tris-檸檬酸鹽緩衝液顯示較快聚集體漏出》Tris_ 乙酸鹽及三乙醇胺-檸檬酸鹽在低加載量範圍中顯示類似 聚集體漏出（三乙醇胺-乙酸鹽緩衝液數據因顯著聚集而未 顯示）〇基於本文所述實驗之資訊，在整個製程中使用 Tris-乙酸鹽無鹽緩衝液系統以工作臺規模執行自淨化至純 化之整合平臺製程。圖3中比較抗體A之整合純化製程步驟 (如下文所示）且亦表明抗體B之一個整合製程。 抗體A :

MabSelect SuRe-FOHC-CaptoAdhere-ChromaSorb Q-ViroSart ； Prosep Ultra Plus-FOHC-CaptoAdhere-ChromaSorb Q-ViroSart ； 163143.doc 61 201249999

MabSelect SuRe-FOHC-Nuvia S-ChromaSorb Q-ViroSart ；

Prosep Ultra Plus -FOHC-Nuvia S-ChromaSorb Q-ViroSart ;及 MabSelect SuRe-FOHC-Q瓊脂糖-苯基HP瓊脂糖。 抗體B :

MabSelect SuRe-FOHC-CaptoAdhere-ChromaSorb Q-ViroSart 所有所評價平臺製程均產生相當的病毒濾液。抗體A HCP比現有製程低得多。呈溢流模式之Capto-Adhere™改 良製程通量及製程時間，但Capto-Adhere™不能降低β-葡 聚糖。 根據前文，在MAb純化平臺製程中使用精簡兩組份無鹽 緩衝液系統證明以精細純化步驟研發之Capto-Adhere™層 析。將Capto-AdhereTM之非限制性有效操作範圍確定為： 緩衝液·· Tris-乙酸鹽緩衝液（90 mM乙酸鹽/約125 mM Tris)，其中PH為7.9±〇.1且導電率為4.5±0.5 mS/cm ;加載 量範圍：150-200 g/L。 另外，已鑑別，抗體A HCP顯著低於習用製程且抗體B HCP與習用製程相比《在溢流模式及高加載能力下， Capto-Adhere™與習用製程相比具有顯著減少之製程時 間。 本文引述各種出版物，其全部内容均以引用方式併入本 文中。 【圖式簡單說明】 163143.doc -62- 201249999 圖1圖解說明使用多種緩衝液之傳統mAb純化製程與利 用經簡化兩組份緩衝液系統之整合純化平臺製程之非限制 性實例之間的差異。 圖2 A-B繪示某些緩衝液系統對蛋白A樹脂之影響。圖A 顯示在產物溶析期間乙酸、鱗酸及檸檬酸系統對溶析PH轉 變（粗線）之影響（UV信號以細線顯示）。圖B顯示對於所選 蛋白A樹脂而言，所選缓衝液系統對HCP減少（如以溶析液 彙集物所量測）之影響。此研究中使用抗體A。 圖3繪示對於抗體A而言’與傳統製程相比，4種代表性 整合純化製程在製程步驟產率（圖A)及雜質去除（宿主細胞 蛋白-圖B、聚集體-圖C及浸出之蛋白A-圖D)方面之匯總。 對於每一步驟而言，所述製程係以下列順序提供：⑴ mAbSelect Sure -F0HC 深層過濾器-Capto Adhere -Chromasorb Q -Virosart ; (ii) Prosep Ultra Plus -F0HC深層 過滤器-Capto Adhere -Chromasorb Q -Virosart ； (iii) mAbSelect Sure -F0HC深層過遽器-Nuvia S -Chromasorb Q -Virosart ; (iv) Prosep Ultra Plus -F0HC深層過滤器-Nuvia S -Chromasorb Q -Virosart ; (v) mAbSelect Sure -F0HC深 層過濾器-Q瓊脂糖-苯基HP瓊脂糖-Virosart。 圖4繪示兩種分子及所選深層過濾器在低PH不活化深層 過濾後之HCP減少。所得HCP含量以條形顯示且通量以點 顯示。以對照0,2 μιη過濾器顯示單獨pH不活化之效應。 圖5繪示對於抗體A而言，所選具最低腐蝕性之兩組份緩 衝液系統在通量（左圖）及宿主細胞蛋白漏出型態（右圖）方 163143.doc -63- 201249999 面對深層過濾器性能之影響。 囷6繪示對於抗體A而言，加載至Chr〇masorb Q膜上之蛋 白A溶析液在所選具最低腐㈣之兩組份緩衝液系統中之 HCP漏出型態。 圖7繪示對於抗體八之所選陽離子交換樹脂Nuvias (圖a) 及Capto S (圖B)而言，改變仙濃度對聚集體減少及回收 之影響。GigaCap s顯示與Capt〇 s類似之性質（數據未顯 不）。>谷析收以閉符號顯示且聚集體型態以開符號顯 示。 圖8繪示與無管柱之運行相比空白運行之實例性層析圖 叠加圖，其顯示對於所有3種樹脂而言，丁士乙酸鹽系統之 pH及導電率轉變曲線。 圖9繪示空白運行（以與_相同之方式實施）之實例性層 析圖叠加圖’其顯示納磷酸鹽緩衝液系統之延遲之pH及導 電率轉變曲線。 圓10繪不相同陰離子系統在不同陽離子之間之空白運行 (以與圖U相同之方式實施)的實例性層析圖疊加圖，此圖 解說明pH及導電率之轉變獨立於陽離子。 圖11相同陽離子系統在不同陰離子之間之空白運行（以 與圖11相同之方式實施）的實例性層析圖疊加圖，此圖解 說明陰離子顯著影響师變曲線之形狀，尤其在溶析步驟 期間。 圓12緣不對於抗體A而言所選兩組份緩衝液系統中在經 mAbSeleet Sure捕獲後在不同洗肺陽離子漠度及pH下所 I63143.doc -64- 201249999 得HCP含量之等高線圖β 圖13繪示來自所選通量篩選研究之匯總，該研究係利用 預加載PreDictor板（GE Healthcare)來實施以確定兩種分子 在Tris乙酸鹽緩衝液中之陰離子交換樹脂性能。自pH不活 化之mAbSelect溶析液評價一系列pH、導電率及蛋白濃度 之回收及雜質減少。 圖I4繪示對於Tris乙酸鹽（ρΗ η，2 5 mS/cm)中之兩種分 子而s ’所選陰離子交換樹脂及膜之Hcp減少(以減少因子 表示）。 圖15繪示所選緩衝液系統對所選陰料交換膜之Hcp漏 出型態之影響。所用緩衝液係pH 7.9、4 5心⑽下之兩組 份緩衝液系統。

所選緩衝液系統對宿主細 癌之影響，其中使用pH 圖16繪示對於所選分子而言， 胞蛋白（HCP)及聚集體漏出型 7.9、4.5 mS/cm下之兩組份緩衝液系统 163143.doc •65·

Claims (1)

1. 201249999 七、申請專利範圍： 1. 一種自試樣混合物產生宿主細胞蛋白減少之抗體製劑之 方法’該試樣混合物包含抗體及至少一種宿主細胞蛋 白，該方法包含： (a) 使該試樣混合物與加載緩衝液接觸及在使該抗體 保持於捕獲分離層析載體上之條件下使該加載緩衝液及 試樣混合物與該層析載體接觸； (b) 用洗滌緩衝液洗滌該捕獲分離層析載體以去除未 保持於該捕獲分離層析載體上之試樣混合物組份；及 (c) 使該捕獲分離層析載體與溶析緩衝液接觸以藉此 產生捕獲分離溶析液； 其中該等加載、洗滌及溶析緩衝液係由水及基本上相 同之陰離子及陽離子組份組成；且 其中該捕獲分離溶析液包含該宿主細胞蛋白減少之抗 體製劑》 2. 如請求項1之方法，其中該等陰離子及陽離子組份係選 自由以下組成之群：Tris及檸檬酸根、THs及乙酸根、三 乙醇胺及檸檬酸根以及三乙醇胺及乙酸根。 3. 如請求項1之方法，其中該捕獲分離層析載體係選自由 以下組成之群之蛋白A樹脂：MabSelect™樹脂（GE Healthcare)、MabSelect SureTM 樹脂（GE Heahhcare)及 ProSep Ultra Plus (Millipore)。 4. 如请求項i之方法’其包含以下步驟： (d) 使該捕獲分離溶析液與加載緩衝液接觸及使該捕 163143.doc 201249999 獲分離溶析液及加載緩衝液混合物與精細純化分離層析 載體接觸，該#細純化分離層;^載體能夠進一步減少該 捕獲分離溶析液之宿主細胞蛋白含量；及 (e) 用洗滌緩衝液洗滌該精細純化層析載體，以去除 未保持於該精細純化層析載體上之捕獲分離溶析液組 份；及 (f) 使該精細純化層析載體與溶析緩衝液接觸，以藉 此產生精細純化分離溶析液， 其中該等捕獲分離及精細純化分離加載、洗滌及溶析 緩衝液係由水及基本上相同之陰離子及陽離子組份組 成，該等陰離子及陽離子組份係選自由以下組成之群： Tris及檸檬酸根、Tris及乙酸根；三乙醇胺及檸檬酸根； 及三乙醇胺及乙酸根。 5. 如請求項4之方法，其中該精細純化分離層析載體係選 自由以下組成之群之離子交換基質：陰離子交換基質及 陽離子交換樹脂；混合模式樹脂或疏水相互作用樹脂。 6. 如請求項5之方法，其中該離子交換基質係選自由以下 組成之群之陽離子交換樹脂：Fract〇ge】、羧甲基（CM)、 項乙基（SE)、磺丙基（SP)、磷酸根（p)、磺酸根（s)、 Nuvia S (BioRad)、Capto S (GE Healthcare)及 Gigacap S (Tosoh);或選自由以下組成之群之陰離子交換基質：q 環脂糖、二乙基胺基乙基（DEAE)、四級胺基乙基 (QAE)、四級胺（Q)基團、Q瓊脂糖FF (GE Healthcare)、 Toyopearl QAE 550C (Tosoh) ' Poros 50HQ (Applied 163143.doc 201249999 Biosystems)、Poros 50PI (Applied Biosystems)、 Sartobind Q (Sartorius)、ChromaSorb Q (Millipore)及 Mustang Q (Pall)。 7. 如請求項5之方法，其中該層析載體係選自由以下組成 之群之混合模式樹脂 ：Capto-Adhere™ (GE Healthcare)、HEA -HyperCel (己胺）及 PPA-HyperCel (丙 基苯基胺）（Pall);選自由以下組成之群之疏水相互作用 樹脂：烷基瓊脂糖、芳基瓊脂糖、苯基瓊脂糖、苯基瓊 脂糖™ 6快速流動管柱（Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow column)、苯基瓊脂糖™高性能管柱、辛基瓊脂糖tm高性 能管柱、Fractogel™ EMD 丙基、Fractogel™ EMD 苯基管 柱、Macro-PrepTM 曱基、Macro-PrepTM 第三丁基載體、 WP HI-丙基（C3)TM管柱、Toyopearl™醚、苯基或丁基管 柱及其組合。 8. 如請求項1之方法，其進一步包含深層過濾步驟、選自 由病毒過濾步驟及pH調介之病毒不活化步驟組成之群的 病毒不活化步驟或其組合。 9. 一種研發自兩種試樣混合物產生宿主細胞減少之製劑之 整合純化方案的方法，其中每一試樣混合物包含不同抗 體及至少一種宿主細胞蛋白： (a) 選擇能夠保持該等試樣混合物之不同抗體的捕獲 分離層析載體；及 (b) 選擇分別用於加載、洗滌及產生捕獲分離溶析液 的加載、洗務及溶析緩衝液； 163143.doc 201249999 其中該等加載、洗滌及溶析緩衝液係由水及基本上相 同之陰離子及陽離子組份組成；且 其中該捕獲分離溶析液包含該宿主細胞蛋白減少之抗 體製劑。 10. 如請求項9之方法，其中該等陰離子及陽離子組份係選 自由以下組成之群：Tris及檸檬酸根' 丁士及乙酸根、三 乙醇胺及檸檬酸根以及三乙醇胺及乙酸根。 11. 如請求項9之方法，其中該捕獲分離層析載體係選自由 以下組成之群之蛋白A樹脂：MabSelect™樹脂（GE Healthcare)、MabSelect SureTM 樹脂（GE Heahhcare)及 ProSep Ultra Plus (Millip0re)。 12. 如明求項ii之方法，其進一步包含以下步驟： (〇)選擇能夠進一步減少該捕獲分離溶析液之宿主細 胞蛋白含量的精細純化分離層析載體；及 (d)選擇分別用於加載、洗滌及產生精細純化分離溶 析液的加載、洗滌及溶析緩衝液； 其中該等捕獲分離及精細純化分離緩衝液係由水及基 本上相同之陰離子及陽離子組份組成，該等陰離子及陽 離子組份係選自由以下組成之群：THs及捧樣酸根、Tds 及乙酸根二乙醇胺及檸檬酸根以及三乙醇胺及乙酸 根。 13. 如清求項12之方法’其中該精細純化分離層析載體係選 自由以下組叙群之離子交換基質：轉子交換基質或 陽離子交換樹脂。 163143.doc 201249999 14. 如請求項13之方法，其中該離子交換樹脂係選自由以下 組成之群之陽離子交換樹脂：Fractogel、羧曱基（CM)、 磺乙基（SE)、磺丙基（SP)、磷酸根（P)、磺酸根（S)、 Nuvia S (BioRad)、Capto S (GE Healthcare)及 Gigacap S (Tosoh);或選自由以下組成之群之陰離子交換基質：Q 瓊脂糖、二乙基胺基乙基（DEAE)、四級胺基乙基 (QAE)、四級胺（Q)基團、Q壤月旨糖 FF (GE Healthcare)、 Toyopearl QAE 550C (Tosoh) ' Poros 50HQ (Applied Biosystems)、Poros 50PI (Applied Biosystems)、 Sartobind Q (Sartorius)、ChromaSorb Q (Millipore)及 Mustang Q (Pall)。 15. 如請求項12之方法，其中該精細純化分離層析載體係混 合模式樹脂或疏水相互作用樹脂。 16·如請求項15之方法，其中該層析載體係選自由以下組成 之群之混合模式樹脂 ：Capto-Adhere™ (GE Healthcare)、HEA -HyperCel (己胺）及 PPA-HyperCel (丙 基苯基胺）（Pall);或選自由以下組成之群之疏水相互作 用樹脂：烷基瓊脂糖、芳基瓊脂糖、苯基瓊脂糖、苯基 瓊脂糖TM 6快速流動管柱、苯基瓊脂糖tm高性能管柱、 辛基瓊脂糖TM高性能管柱、Fractogel™ EMD丙基、 FractogelTM EMD笨基管柱、Macro-PrepTM甲基、Macro-PrepTM第三丁基載體、WP HI-丙基（C3)™管柱、及 Toyopearl™醚、苯基或丁基管柱及其組合。 17.如請求項U之方法，其進一步包含深層過濾步驟、選自 163143.doc 201249999 由病毒過濾步驟及pH調介之病毒不活化步驟組成之群的 病毒不活化步驟或其組合。 18 _種自試樣混合物產生宿主細胞蛋白減少之抗體製劑之 方法’該試樣混合物包含抗體及至少一種宿主細胞蛋 白’該方法包含： U)使該試樣混合物與加載緩衝液接觸及在使該抗體 保持於捕獲分離層析載體上之條件下使該加載緩衝液及 試樣混合物與該層析載體接觸； (b) 用洗蘇緩衝液洗滌該捕獲分離層析載體，以去除 該等未保持於該捕獲分離層析載體上之試樣混合物組 份； (c) 使該捕獲分離層析載體與溶析緩衝液接觸，以藉 此產生包含該抗體之捕獲分離溶析液； (d) 在使該抗體保持於第二捕獲分離層析載體上之條 件下使該捕獲分離溶析液與該第二捕獲分離層析載體接 觸’其中該第二捕獲分離層析載體係選自由以下組成之 群.離子交換基質、混合模式樹脂及疏水相互作用樹 脂；及 (e) 使該第二捕獲分離層析載體與溶析緩衝液接觸， 以藉此產生第二捕獲分離溶析液， 其中該等加載、洗滌及溶析緩衝液係由水及基本上相 同之陰離子及陽離子組份組成；且 其中該第二捕獲分離溶析液包含該宿主細胞蛋白減少 之抗體製劑。 163143.doc 201249999 19.如請求項1 8之方法，其中該等陰離子及陽離子組份係選 自由以下組成之群：Tris及#檬酸根、Tris及乙酸根、三 乙醇胺及檸檬酸根以及三乙醇胺及乙酸根。 2〇.如請求項18之方法，其進一步包含深層過濾步驟、選自 由病毒過據步驟及pH調介之病毒不活化步驟組成之群的 病毒不活化步驟或其組合。 163143.doc