TW201234978A - Feed additive composition - Google Patents

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TW201234978A TW101102304A TW101102304A TW201234978A TW 201234978 A TW201234978 A TW 201234978A TW 101102304 A TW101102304 A TW 101102304A TW 101102304 A TW101102304 A TW 101102304A TW 201234978 A TW201234978 A TW 201234978A
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Luis Fernando Romero Millan
Luke Barnard
Peter Plumstead
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Danisco
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Description

201234978 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用直接飼餵微生物與可源自（較佳地源 自）檸檬酸桿菌屬（Citrobacter spp·)之植酸酶、尤其可源自 (較佳地源自）布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii)之植酸 酶之組合來改良飼料組合物的方法，且係關於包含直接飼 傲微生物與源自檸檬酸桿菌屬之植酸酶、尤其可源自（較 佳地源自）布氏檸檬酸桿菌之植酸酶之組合的飼料添加劑 組合物。本發明進一步係關於用途及套組。 【先前技術】 使用補充酶作為動物飼料、尤其家禽及豬飼料之添加 劑’作為改良營養素利用及生產性能特性的方式。酶摻合 物可用於改良含有榖粒、大豆粉、動物蛋白粉或高纖維食 物副產品之飲食的營養價值。直接飼餵微生物（DFM)之概 念涉及在動物（例如肉雞）處於長期應力（疾病、日糧變化、 環境或生產攻毒）下時向其飼餵有益微生物。益生菌係此 類飼料添加劑之另一術語。在控制研究中已顯示益生菌或 DFM可改良動物性能。dfm包括直接飼餵細菌及或基於酵 母之產物。 儘官已涵蓋DFM與一些酶之組合，但從來沒有完全瞭解 動物飼料中之DFM與外源性酶間之相互作用。本發明係關 於新賴特定組合’其令人驚奇地顯著改良動物中之生產性 能特性。 【發明内容】 161722.doc 201234978 本發明之有潛力之發現係dfm與可
可源自（較佳地源自）檸 :菌）之植酸酶之組合對 動物之性成具有顯者有益作用。 具體而言，本發明之右港夬
死性腸炎之抗性、個體之免疫反應、 個體之胃腸道中之有 益細菌的生長。 在個I樣中，本發明提供飼料添加劑組合物，其包含 直接飼餵微生物（DFM)與可源自（較佳地源自）檸檬酸桿菌 屬（尤其源自布氏檸檬酸桿菌）之植酸酶之組合（或基本上由 其組成或由其組成）。 在另一態樣中，本發明提供用於以下之方法：改良個體 之性能或改良飼料中之原料的消化率（例如營養素消化 率，例如胺基酸消化率），或改良氮保留量，或避免壞死 性腸炎之負面影響或改良飼料轉化率（FCR)或改良個體之 重量增加或改良個體中之飼料效率或調節（例如改良）個體 之免疫反應或促進個體之胃腸道中的有益細菌生長，該方 法包含向個體投與直接飼餵微生物（DF]V1)與可源自（較佳地 源自）檸檬酸桿菌屬（尤其源自布氏檸檬酸桿菌）之植酸酶之 組合。 161722.doc 201234978 本發明之又一態樣係直接飼餵微生物（DFM)與可源自（較 佳地源自）檸檬酸桿菌屬（尤其源自布氏檸檬酸桿菌）之植酸 酶之組合的用途，其用於改良個體之性能或改良飼料中之 原料的消化率（例如營養素消化率，例如胺基酸消化率）或 改良氮保留量或避免壞死性腸炎之負面影響或改良飼料轉 化率（FCR)或改良個體之重量增加或改良個體中之飼料效 率或調節（例如改良）個體之免疫反應或促進㈣之胃腸道 中的有益細菌生長。 在本發明之又一態樣中，提供包含直接飼餵微生物 (DFM)、可源自（較佳地源自）擰檬酸桿菌屬（尤其源自布氏 檸檬酸桿菌）之植酸酶、視情況選用之至少一種維生素、 視If况選用之至少一種礦物質及投與說明書的套組。 在另一態樣中，本發明提供製備飼料添加劑組合物之方 法’其包含混合直接飼飯微生物（DFM)與可源自（較佳地源 自）擦檬酸桿菌屬（尤其源自布氏擦樣酸桿菌）之植酸酶及 (視情況）包裝。 在又態樣中，本發明提供包含飼料添加劑組合物之飼 料或飼料原料’該飼料添加劑組合物包含直接飼飯微生物 (DFM)與可源自（較佳地源自）擰檬酸桿菌屬（尤其源自布氏 檸檬馱柃菌)之植酸酶之組合(或基本上由其組成或由其組 。預Ί物包含飼料添加劑組合物及至少—種礦物質及/ 5 "" n & f ’該詞料添加劑組合物包含直接飼餵微 生物（DFM)與可泝白q 雄自（較佳地源自）檸檬酸桿菌屬（尤其源自 16J722.doc 201234978 布氏檸檬酸桿菌）之植酸酶之組合（或基本上由其組成或由 其組成）。 在另一態樣中，本發明提供製備飼料原料之方法，其包 含混合飼料組份與飼料添加劑組合物，該飼料添加劑組合 物包含直接飼餵微生物（DFM)與可源自（較佳地源自）檸檬 酸桿菌屬（尤其源自布氏檸檬酸桿菌）之植酸酶之組合（或基 本上由其組成或由其組成）。 在又一態樣中，本發明係關於本發明之飼料添加劑組合 物，其用於預防及/或治療個體中之球蟲病及/或壞死性腸 炎。 本發明又進一步提供預防及/或治療壞死性腸炎及/或球 蟲病之方法，其中向個體投與有效量之本發明之飼料添加 劑組合物。 【實施方式】 較佳地，本發明中所用之酶均對DFM係外源性的《換言 之，較佳將酶添加至DFM中或與其混合。 除非另外定義，否則本文所用所有技術及科學術語皆具 有與熟習本發明所屬領域技術者通常所瞭解意義相同之意 義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 20版，John Wiley and Sons，New York (1994)，及 Hale及 Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY » Harper Perennial ♦ NY (1991)為熟習此項技術者提供關於本發明中所用多個 術語之一般性字典。 161722.doc 201234978 本發明並不受本文所揭示例示性方法及材料之限制且 在本發明實施例之實踐或測試中可使用與本文所述方法及 材料類似或等效之任何方法及材料。數字範圍包括界定該 範圍之數字。除非另外指明，否則分別地，任何核酸序列 係在5至3疋向上自左至右書寫；胺基酸序列係在胺基至 羧基定向上自左至右書寫。 本文提供之標題並不限制可藉由整體參照本說明書具有 之本發明之各個態樣或實施例。因此，藉由整體參照說明 書更全面地疋義緊跟下文定義之術語。 本文使用胺基酸之名稱（即三個字母縮寫或單一字母縮 寫）提及胺基酸。 本文所用術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。 本文所用術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術 語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」 與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」 與術語「酶」同義。 術5吾蛋白質」與「多肽J在本文中可互換使用。在本 發明及申明專利範圍中，胺基酸殘基可使用習用單字母及 一子母雄、碼。胺基酸之3字母密碼係遵照iupAciUB j〇int
Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)定義。亦 應瞭解，由於遺傳密碼具有簡並性，故可藉由一個以上核 苷酸序列編碼多肽。 其他術"告定義可貫穿說明書出現。在更詳細闡述例示性 實施例之刖’應瞭解，本發明並不限於所述特定實施例， 161722.doc 201234978 因此當然可有所變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅出於 闡述特定實施例之目的而非意欲限制本發明之範圍，此乃 因本發明之範圍僅受限於隨附申請專利範圍。 若提供值之範圍，則應瞭解，亦明確揭示該範圍之上限 與下限間之每一中介值（除非上下文有其他明確指示，否 則精確至下限單位之十分之―）。本發明内涵蓋所述範圍 中之任-所述值或中介值與所述範圍中之任一其他所述值 或中介值間的每-較小範圍。可在該範圍中獨立地包括或 排除該等較小範圍之上限及下限，且除了所述範圍中明確 排除之任何限值以外，本發明内亦涵蓋任—限值、並限值 ;兩個限值包括於較小範圍中之每-範圍。若所述範圍包 =值之-者或二者’則本發明中亦包括排除彼等所包括 限值之任一者或二者的範圍。 申」〜㉟非上下文另外明確說明，否則本文及隨附 申睛專利範圍中所用之單數形式 ，)」均包括複數個指示物。因此，例如，在二「酶 時包括複數個該等候選試劑且 」 彼等熟習此項技術者已知之飼料」時包括提及 等。 或夕種飼料及其等效物，等 =所：論公開案僅因為其揭示内容先於本申請 枚曰期而提供。本文中之任何事情均 公開案構成隨附申請專利範圍之先前技;。專 用於本發明中之酶可 補料分批及連續流動方：體或次沒培養(包括分批、 ^動方法）製造。料心 16l722.doc 201234978 長培養基中完成：水性礦物鹽培養基、有機生長因子、碳 及能量來源材料、分子氧及（當然）一或多種欲採用之特定 微生物物質之起始接種物。 直接飼餵微生物（DFM) 本文中之術語「微生物（microbial)」可與「微生物 (microorganism)」互換使用。 本文術語「DFM」意指直接飼餵微生物。 較佳地’ DFM包含活的微生物。較佳地，dfm包含活的 細菌或活的酵母或活的真菌。 較佳地’ DFM包含活的細菌。 術語「活的微生物」意指具有代謝活性或能夠分化之微 生物。 在一個實施例中，DFM可為孢子形成細菌且因此，術語 DFM可包括或含有抱子’例如細菌孢子。因此，在一個實 施例中，本文所用術語「活的微生物」可包括微生物孢 子，例如内生孢子或分生孢子。 在另一實施例中，本發明之飼料添加劑組合物中之DFM 不包括或不含有微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。 微生物可為天然微生物或其可為轉化微生物。微生物亦 可為適宜微生物之組合。 在一些態樣中’本發明之DFM可為以下中之一或多者： 細菌、酵母、真菌。 較佳地，本發明之〇FM係益生菌微生物。 在本發明中’術語直接飼餵微生物（DFM)涵蓋直接飼餵 161722.doc 201234978 細菌、直接飼餵酵母、直接飼餵真菌及其組合。 較佳地，DFM係直接飼餵細菌。 較佳地，DFM係包含兩種或更多種細菌（例如三種或更 多種或四種或更多種）之組合。 較佳地，細菌係分離的。 適宜地，DFM可包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌 (Lactobacillus)、乳球菌（Lactococcus)、鍵球菌 (Streptococcus)、芽抱桿菌（Bacillus)、片球菌 (Pediococcus)、腸球菌（Enterococcus)、明串球菌 (Leuconostoc)、肉桿菌（Carnobacterium)、丙酸桿菌 (Propionibacterium)、雙歧桿菌（Bifidobacterium)、梭菌 (Clostridium)及巨球形菌（Megasphaera)及其組合。 在一個實施例中，DFM可選自以下芽孢桿菌屬：枯草芽 抱桿菌、胤狀芽抱桿菌（·5ασζ·//Μ·5 cereus)、地衣芽抱桿菌licheniformis)及解澱粉芽 抱桿菌amyloliquefaciens) 〇 在一個實施例中，DFM可為包含兩種或更多種芽孢桿菌 菌株之組合。 在一個實施例中，DFM可為包含兩種或更多種芽孢桿菌 菌株之組合。 在一個實施例中，DF Μ可為兩種或更多種以下枯草芽抱 桿菌菌株之組合：3Α-Ρ4 (ΡΤΑ-6506)、15Α-Ρ4 (ΡΤΑ-6507)、22C-P1 (ΡΤΑ-6508)、2084 (NRRL Β-500130)、 LSSA01 (NRRL-B-50104)、BS27 (NRRL Β-50105)、BS 18 161722.doc 201234978 (NRRL B-50633)及 BS 278 (NRRL B-50634)。 菌株 3A-P4 (PTA-6506)、15A-P4 (PTA-6507)及 22C-P1 (PTA-6508)係自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection)(ATCC)公開購得。 菌株 2084 (NRRL B-500130) 、LSSA01 (NRRL-B-50104)、BS27 (NRRL B-50105)係自美國農業部菌種中心 (Agricultural Research Service Culture Collection) (NRRL) 公開購得。菌株枯草芽孢桿菌LSSA01有時稱作枯草芽孢 桿菌8。 該等菌株教示於US 7, 754, 469 B2中。 在一些實施例中，DFM可為包含枯草芽孢桿菌菌株之組 合，如下表中詳細闡述：
枯草芽抱 桿菌菌株 Bs 2084 Bs8 (LSSAOl) Bs 3A-P4 Bs 15A-P4 Bs 22C-P1 X X X X X X X X X DFM 組合包含 X X X X X X X X X X X X X X X X 在一個實施例中，DFM可選自以下乳球菌屬：乳脂鏈球 菌（Lactococcus cremoris)及雷特氏乳球菌（Lactococcus 161722.doc 201234978 lactis)及其組合。 在一個實施例中，DFM可選自以下乳桿菌屬 spp):布赫内氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri)、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus)、乾酪 乳桿菌（Lactobacillus casei)、開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefiri)、雙又乳桿菌（Lactobacillus bifidus)、短乳桿菌 (Lactobacillus brevis)、瑞士 乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、副乾酷乳桿菌（Lactobacillus paracasei)、鼠李 糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus)、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus)、沙 克乳桿菌（Lactobacillus sakei)、羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum)、香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis)、乳酸 乳桿菌（Lactobacillus lactis)、對德氏乳桿菌（Lactobacillus delbreuckii)、胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum)、類植 物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum)、香腸乳桿菌、鼠 李糖乳桿菌、捲曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)、加氏 乳桿菌（Lactobacillus gasseri)、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii)及簡氏乳桿菌（Lactobacillus jensenii)及其任何組 合。 在一個實施例中，DFM可選自以下雙歧桿菌屬 (Bifidobacteria spp):雙歧桿菌乳酸（Bifid〇bacterium I61722.doc 201234978 lactis)、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidium)、長雙歧 桿菌（Bifidobacterium longum)、 動物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis)、键狀雙 歧桿菌（Bifidobacterium catenulatum)、假小鍵雙歧桿菌 (Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春雙歧桿菌 (Bifidobacterium adolescentis)及角形雙歧桿菌 (Bifidobacterium angulatum)及其任何組合。 適宜地’ DFM可包含來自以下一或多種菌種之細菌：枯 草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、屎腸球菌 (Enterococcus faecium)、腸球菌屬、及片球菌屬、乳桿菌 屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌（Pedioc〇csus acidilactici)、雷特氏乳球菌、兩歧雙歧桿菌、枯草芽孢桿 菌、特氏丙酸桿菌（Propionibacterium thoenii)、香腸乳桿 菌、鼠李糖乳桿菌、埃氏巨球形菌（Megasphaera elsdenii)、丁 酸梭菌（Clostridium butyricum)、動物雙歧桿 菌屬（Bifidobacterium animalis ssp. animalis)、羅伊氏乳桿 菌、臘狀芽孢桿菌、唾液乳桿菌屬、丙酸桿菌屬及其組 合。 本發明中使用之直接飼餵細菌可屬於相同類型（屬、物 種及菌株）或可包含屬、物種及/或菌株之混合物。 適宜地，本發明之DFM可為如下表中之產品或包含於彼 等產品中之微生物中的一或多者： 161722.doc 14 201234978 產品名稱 公司 微生物 共生成份 Enviva Pro® (先前稱作 Avicorr®) Danisco A/S 登錄號為NTRR1 B-50013 之枯草芽孢桿菌菌株 2084、 登錄號為NRRL B-50104 之枯草芽孢桿菌菌株 LSSA01 及 ATCC登錄號為PTA-6507之枯草芽孢桿菌菌 株15A-P4 Calsporin® Calpis - Japan 枯草芽孢桿菌菌株 C3102 Clostat® Kemin Industries 公司 枯草芽孢桿菌菌株PB6 Cylactin® DSM 屎腸球菌NCIMB 10415 (SF68) Gallipro® 及 GalliproMax® Chr.Hansen A/S 枯草芽孢桿菌菌株 C3102 Gallipro®Tect® Chr.Hansen A/S 地衣芽孢桿菌 Poultry star® Biomin公司 腸球菌及片球菌 果-寡糖 Protexin® Protexin Int 乳桿菌、雙歧桿菌及另 一者 Proflora® Alpharma 公司 枯草芽孢桿菌菌株QST 713 β-Mos β-甘露寡 糖及β-葡 聚糖 Ecobiol® 及 Ecobiol® Plus Norel S.A. 解澱粉芽孢桿菌CECT-5940 Fortiflora® 屎腸球菌SF68 BioPlus2B® DSM 枯草芽孢桿菌及地衣芽 孢桿菌 161722.doc 201234978
Lactiferm® Chr.Hansen 乳酸細菌7 屎腸球菌 CSI® Danisco A/S 芽孢桿菌菌株 Yea-Sacc® Alltech 釀酒酵母 Biomin IMB52® Biomin 屎腸球菌 Biomin C5® Biomin 乳酸片球菌、 屎腸球菌、 動物雙歧桿菌屬、 羅伊氏乳桿菌 唾液乳桿菌屬 Biacton® ChemVet 香腸乳桿菌 OralinE1707® Chevita GmBH 屎腸球菌 Probios-pioneer PDFM® Chr Hansen 屎腸球菌(2株菌株） 雷特氏乳球菌DSM 11037 Sorbiflore® Danisco Animal Nutrition 鼠李糖乳桿菌及 香腸乳桿菌 Animavit® KRKA 枯草芽孢桿菌 Bonvital® Lactosan GmbH 屎腸球菌 Levucell SB 20® Lallemand 釀酒酵母 Levucell SC 0 & SC10®ME Lallemand 釀酒酵母 Bactocell Lallemand 乳酸片球菌 ActiSaf®(先前 稱作 BioSaf®) Le Saffre 釀酒酵母 ActisafD SC47 Le Saf&e 釀酒酵母NCYCSc47 Miya-Gold® Miyarisan Pharma 丁酸梭菌 161722.doc -16- 201234978
Fecinor 及 Fecinor Plus® Norel S.A 屎腸球菌 InteSwine® ntegro Gida ve Ticaret AS，由 RM Associates 有限公司代表 釀酒酵母NCYCR-625 BioSprint® ProSol SpA 釀酒酵母 Provita® Provita 屎腸球菌及 氣李糖乳桿菌 PepSoyGen-C® Regal BV (Nutraferma) 括草芽孢桿菌及 米麯黴 Toyocerin® Rubinum 臘狀芽孢桿菌 TOYOCERIN® Rubinum toyoi變種臘狀芽孢桿菌 NCIMB 40112/CNCM I-1012 在一個實施例甲，適宜地，DFM可為Enviva Pro®。 Enviva Pro®係購自Danisco A/S且係登錄號為NRR1 B-50013之芽孢桿菌菌株2084、登錄號為NRRL B-501〇4之芽 孢桿菌菌株LSSA01及ATCC登錄號為PTA-6507之芽孢桿菌 菌株15A-P4的組合（如US 7,754,469 B中所教示-該案件以 引用方式併入本文中）。 適宜地，DFM可包含來自以下屬之酵母：酵母菌屬。 較佳地，欲根據本發明使用之DFM係通常認為安全且較 佳經GRAS批准之微生物。 熟習此項技術者將容易地自用於食品及/或農業工業及 通常認為適於動物攝取之本文所述屬内瞭解微生物之具體 物種及或菌株。 161722.doc 201234978 較佳地，根據本發明使用之DFM係適於動物攝取者。 有利地，若產品係飼料或飼料添加劑組合物，則活的 DFM應貫穿產品之正常「銷售」或「失效」日期在零售商 提供飼料或飼料添加劑組合物用於銷售之期間仍有效。期 望時間長度及正常存架壽命將因飼料原料不同而有所變化 且彼等熟習此項技術者應認識到存架壽命時間將端視飼料 原料類型、飼料原料尺寸、儲存溫度、處理條件、包裝材 料及包裝設備而有所變化。 在一些實施例中，重要的是，DFM具有耐熱性，即可耐 熱。在將飼料製成丸之情形下尤其如此。因此，在一個實 施例中，DFM可為耐熱微生物，例如耐熱細菌，包括（例 如）芽孢桿菌屬》 在一些實施例中，DFM係產生孢子之細菌（例如桿菌 (Bacilli)，例如芽孢桿菌屬）可為較佳。在生長條件不利 時’桿菌能夠形成穩定内生孢子，且其對熱、pH、水分及 消毒劑具有極強抗性。 在一個實施例中，適宜地，DFM可減少或防止病原體微 生物（例如產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens)及/或埃 希氏大腸桿菌（E_ coli)及/或沙門氏菌屬（Salm〇neUa spp)及/ 或彎曲桿菌屬（Campylobacter spp·))在腸内建立。 本發明之DFM可為任一適宜DFM。在一個實施例中，本 發明之DFM可為抑制性菌株（或抗病原體菌株）。在一個實 施例中，可使用以下分析「DFM分析」確定微生物成為 DFM之適宜性。為避免產生疑問，在一個實施例中，根據 161722.doc -18· 201234978 本文所教示「卿分析」選擇作為抑制 體DFM)之DFM係適用於本發明办。 怀（我抗病原 組合物中）之DFM。 ]由·添加劑 DFM分析： 將管各自用來自代表性簇之代表性病原體接種。 的上清液並培育
接種管中添加以好氧方式或厭氧方式生長之潛在DFM 在培育後，針對每一病原 的光密度（OD) « 體量測對照及上清液處理之管 將與對照相比產生降低0D之（潛在dfm)菌株之菌落分類 為抑制性菌株（或抗病原體DFM)。 在US2009/0280090(以引用方式併入本文中）中更詳細解 釋如本文所用DFM分析。 較佳地，分析中所用代表性病原體係以下中之一者（或 多者）：梭菌（例如產氣莢膜梭菌及/或難辨梭菌 (Clostridium difficile))、及/或埃希氏大腸桿菌及/或沙門 氏菌屬及/或彎曲桿菌屬。在一個較佳實施例中，利用以 下中之一或多者實施分析：產氣莢膜梭菌及/或難辨梭狀 芽孢桿菌及/或埃希氏大腸桿菌，較佳產氣莢膜梭菌及/或 難辨梭菌’更佳產氣莢膜梭菌。 在一個實施例中’本發明之DFM較佳係抗病原體。 本文所用術語「抗病原體」意指DFM抵消病原體之效應 (例如負面影響）。 在一個實施例中，為確定DFM是否為本發明之抗病原 161722.doc -19· 201234978 體，可使用上述DFM分析。若在上述「DFM分析」中將 DFM分類為抑制性菌株（尤其在病原體係產氣莢膜梭菌 時），則將DFM視為抗病原體或抗病原體DFM。 在一個實施例中，抗病原體DFM可為以下細菌中之一或 多者： 枯草芽孢桿菌菌株2084，登錄號NRRL B-50013， 枯草芽孢桿菌菌株LSSAOl，登錄號NRRL B-50104， 枯草芽孢桿菌菌株15A-P4 ATCC，登錄號PTA-6507， 枯草芽孢桿菌菌株3A-P4，ATCC登錄號PTA-6506，及 枯草芽孢桿菌菌株BS27，ATCC登錄號NRRL B-50105。 為避免產生疑問，該等菌株可獲得且在US 7,754,459 B中 提及。 在一個實施例中，根據本發明使用之DFM並非如WO 2008/016214中所教示登錄號為KCTC 10902BP之加氏乳桿 菌BNR 17菌株。 較佳地，DFM並非滅活微生物。 在一個實施例中，本文所用之DFM係包含一或多種如本 文所述DFM微生物之組合物。該組合物可另外包含本發明 之酶。可將該組合物作為直接飼餵微生物（DFM)飼餵給動 物。可向DFM中添加一或多種載劑或其他成份。DFM可以 各種物理形式呈現，例如，以表面加料（top dress)形式， 以用作液體獸用頓服藥或欲添加至代乳品中之水溶性濃縮 物、明膠膠囊或凝膠形式。在表面加料形式之一個實施例 中，將冷凍乾燥之發酵產物添加至載劑（例如乳清、麥芽 161722.doc -20- 201234978 糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石（碳酸鈣）、稻殼、酵母培養 物、乾燥澱粉及/或矽鋁酸鈉）中.在用於液體獸用頓服藥 或代乳品補充劑之水溶性濃縮物的一個實施例中，將冷凍 乾燥之發酵產物添加至水溶性載劑（例如乳清、麥芽糊 精、庶糖、右旋糖、乾燥澱粉、矽鋁酸鈉）中；且添加液 體以形成獸用頓服藥或向乳製品或代乳品中添加補充劑。 在明膠膠囊形式之-個實施财，將冷;東乾燥之發酵產物 添加至載劑（例如乳清、麥芽糊精、糖、石灰石（碳酸約）、 稻殼、酵母培養物、乾燥澱粉及/或矽鋁酸鈉）中。在一個 貫施例中，將細g及載劑封閉於可降解明㈣囊中。在凝 膠形式之-個實施例中，將冷;東乾燥之發酵產物添加至載 劑(例如植物油、蔗糖 '二氧化石夕、聚山梨醇醋8〇、丙二 醇、丁基化經基苯甲趟、檸檬酸、乙氧喧（eth〇xy—)及/ 或人工著色劑）中以形成凝膠。 DFM可視情況與添加劑（包括但不限於生長基質、酶、 糖、碳水化合物、提取物及促生長之微成份)之乾燥調配 物混合。糖可包括以下：乳糖、麥芽糖、右旋糖、麥芽糊 精、葡萄糖、果糖、甘露糖、塔蓋糖（吨㈣、山梨糖、 棉子糖及半乳I糖單獨或組合之範圍為观至95%。提 取物可包括酵母或乾焯醢Hu X乾炼酵母發酵可溶物，範圍為5。/〇至 50°/〇。生長基質可句括. 匕括·胰蛋白酶解酪蛋白，範圍為5%至 25% ;乳酸鈉，範圍為5〇/〇至3〇0/ υ/〇 ’ 及 Tween 80 ’ 範圍為 1〇/0 至5 %。碳水化合物可包括廿号 ^ l栝甘露醇、山梨醇、戊五醇及阿 糖醇。碳水化合物單獨岑έ日人+ # 平獨次組合之範圍為5%至50〇/〇。微成份 161722.doc 201234978 可包括以下：碳酸約’範圍為0.5%至5.0%;氣化約，範圍 為0.5°/。至5.0% ;磷酸氫二鉀，範圍為〇5%至5 〇% ;磷酸 辦’範圍為0.5%至5.0% ;蛋白錳，範圍為〇 25%至 1_00°/。；及猛’範圍為 〇·25°/〇至 1.0%。 為製備本文所述DFM，可將培養物及載劑（若使用）添加 至帶式或槳式混合器中並混合約15分鐘，但可增加或減少 時間。摻和各組份以便產生培養物與載劑之均勻混合物。 最終產物較佳係乾燥可流動之粉末。隨後可將DFM或包含 其之組合物添加至動物飼料或飼料預混合物中，添加至動 物水中，或以業内已知之其他方式投與（較佳與本發明之 酶同時投與）。動物用飼料可補充有本文所述之一或多種 DFM或本文所述組合物。 「至少兩種菌株之混合物」意指兩種、三種、四種、五 種、六種或甚至更多種菌株之混合物。在菌株之混合物之 一些實施例中’比例可自1〇/。變化至99〇/〇。菌株之混合物之 其他實施例係自25%至75%〇菌株之混合物之額外實施例 係每一菌株約為50%。在混合物包含兩種以上菌株時，菌 株可以實質上相專比例或以不同比例存於混合物中。 可適當地給予DFM。 適宜地，飼料中之DFM之劑量可介於約1><1〇3 CFlJ/g飼 料至約1 X 109 CFU/g飼料之間，適宜地介於約丨x丨〇4 cFU/g 飼料至約lxlO8 CFU/g飼料之間，適宜地介於約75χΐ〇4 CFU/g飼料至約料之間。 在一個實施例中，DFM係以超過約1 X1 〇3 CFU/g飼料、 I61722.doc •22· 201234978 適且地超過約1X104 CFU/g飼料、適宜地超過約7·5χΐ〇4 CFU/g飼料給予飼料原料中。 k 5且地飼料添加劑組合物中之DFM之劑量可介於約 1X10 CFU/g組合物至約1x10丨3 CFU/g組合物之間，適宜地 "於約1x10 CFU/g組合物至約lxl〇i2cFU/g組合物之間， 適且地"於約3·75χ1()7 CFU/g組合物至約ix10丨丨CFU/g組 合物之間。 在個實施例申’ DFM係以超過約lxl〇5 CFU/g組合 物適且地超過約1 X 106 CFU/g組合物、適宜地超過約 3,75Xl〇7CFU/g組合物給予飼料添加劑組合物中》 在個實施例中’ DFM係以超過約2xl〇5 CFU/g組合 物、適宜地超過約2χ1〇6 CFU/g組合物、適宜地超過約 3’75xl0 CFU/g組合物給予飼料添加劑組合物中。 本文所用術語「CFU」意指菌落形成單位且係活細胞之 里度，其中菌落代表源自單一袓細胞之細胞聚集物。 植酸酶 植义（肌醇，、碟酸酿（myo-inositol hexakisphosphate))係榖物、 丑類及/由料種子農作*巾之4*成份。鹽形式植酸鹽係該 等植物中磷之主要儲存形式。 植酸酶催化植酸之磷酸酯單酯水解，從而使得逐步形成 myo-肌醇五_、四_、叁·、雙_及單磷酸酯，以及釋放無機 磷酸酯。 術§吾「植酸酶」意指能夠催化磷酸酯（包括植酸鹽）之水 解並釋放無機碟酸酯之蛋白質或多肽。除水解植酸鹽外， 16l722.doc -23- 201234978
酸酿。 之肌醇-碟 可將用於本發明巾之植酸酶分類為6_植酸酶（分類為Μ 〖·3.26)或3-植酸酶（分類為E.C. 3.1.3.8)。 ’植酸酶較佳為6-植酸酶（e.c 在一個實施例中 3.1.3.26)。 用於本發明中之植酸酶可源自（較佳地源自）檸檬酸桿菌 用於本發明中之植酸酶係檸檬酸桿菌植酸酶，較佳係布 氏擦樣酸桿菌植酸酶。 在一個實施例中，用於本發明中之植酸酶可源自、較佳 地源自選自由以下組成之群之檸檬酸桿菌細菌：布氏檸檬 酸桿菌（例如布氏檸檬酸桿菌ATCC 51113)、弗氏檸檬酸桿 菌（Citrobacter freundii)(例如弗氏檸檬酸桿菌ncimb 41247) '無丙二酸檸檬酸桿菌（Citr〇bacter amalonaticus.)(例如無丙二酸檸檬酸桿菌ATcc 25405或無 丙二酸檸檬酸桿菌ATCC 25407)、吉氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter gillenii)(例如吉氏檸檬酸桿菌 DSM 13694)、 中間檸檬酸桿菌（Citrobacter intermedius)、柯瑟氏檸檬酸 桿菌（Citrobacter koseri)、鼠類檸檬酸桿菌（citrobacter murliniae)、替齒類檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium)、塞 拉克氏棒檬酸桿菌（Citrobacter sedlakii)、沃克曼氏檸檬酸 桿菌（ChroZmcier wer介mam·/)、楊葛氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter youngae)或棒樣酸桿菌屬。 161722.doc • 24· 201234978 在一個實施例中，植酸酶係源自（例如）以下之檸檬酸桿 菌植酸酶： • 布氏檸檬酸桿菌ATCC 51113(如WO 2006/037328(以 引用方式併入本文中）中所揭示）-用於酶之胺基酸序 列在本文中顯示為SEQ ID No. 1以及其變體，例 如，如WO 2007/11273 9(以引用方式併入本文中）及 WO 201 1/1173 96(以引用方式併入本文中）中所揭 示， • 布氏檸檬酸桿菌YH-15，如WO 2004/085638中所述-用於酶之胺基酸序列在本文中顯示為SEQ ID No. 7， • 弗氏檸檬酸桿菌、較佳地弗氏檸檬酸桿菌NCIMB 41 247及其變體，例如，如WO 2006/038062(以引用 方式併入本文中）及WO 2006/03 8128(以引用方式併 入本文中）中所揭示，或UniProtKB/TrEMBL登錄號 Q676V7(在本文中顯示為SEQ ID No. 9)或EBI登錄號 EM-PRO:AY390262(在本文中顯示為 SEQ ID No. 10) 中所教示之弗氏檸檬酸桿菌植酸酶， • 無丙二酸擰檬酸桿菌、較佳地無丙二酸檸檬酸桿菌 ATCC 25405或無丙二酸檸檬酸桿菌ATCC 25407, 如WO 2006037327(以引用方式併入本文中）中所揭 示， • 吉氏檸檬酸桿菌、較佳地吉氏檸檬酸桿菌DSM 13 694，如WO 2006037327(以引用方式併入本文中） 161722.doc -25· 201234978 中所揭示，或 •中間檸檬酸桿菌， •柯瑟氏檸檬酸桿菌， •鼠類檸檬酸桿菌， •齧齒類檸檬酸桿菌， •塞拉克氏檸檬酸桿菌， •沃克曼氏擰檬酸桿菌， •揚葛氏檸檬酸桿菌， • ’法氏檸檬酸桿菌（Citrobacter farmeri)。 在一較佳實施例中，用於本發明中之植酸酶係可源自或 源自布氏擰檬酸桿菌ATCC 51113(如W〇 2006/037328(以引 用方式併入本文中）中所揭示）且具有在本文中顯示為SEQ ID No. 1之胺基酸序列之植酸酶以及其變體，例如，如w〇 2007/11273 9(以引用方式併入本文中）及w〇 201 1/1 17396 (以引用方式併入本文中）中所揭示；或係可源自或源自弗 氏擦檬酸桿菌、較佳地弗氏檸檬酸桿菌NCIMB 41247且具 有在本文中顯示為SEQ ID No. 5之胺基酸序列之植酸酶或 其變體’例如，如WO 2006/038062(以引用方式併入本文 中）及WO 2006/038128(以引用方式併入本文中）中所揭 示；或係UniProtKB/TrEMBL登錄號Q676V7(在本文中顯示 為SEQ ID No. 9)中所教示之弗氏檸檬酸桿菌植酸酶；或係 EBI登錄號EM_PRO:AY39〇262(在本文中顯示為SEq ID N〇. 1 〇)中所教示之弗氏檸檬酸桿菌植酸酶；或係可源自或源 自布氏檸檬酸桿菌YH-15(如WO 2004/085638(以引用方式 161722.doc -26- 201234978 文中）中所揭不）且具有在本文中顯示為SEQ ID No. 7之胺基酸序列之植酸酶或其變體。 。在較佳實施例中，用於本發明中之植酸酶係可源自 (或源自）自布氏擰檬酸桿菌ATCC 51113(如WO 20G6/037328 .(、弓1肖^式併入本文中）中所揭示）之植酸酶（例如6-植酸 酶）或其變體，例如，如w〇 2〇〇7/1 12739(以引用方式併入 本文中）及WO 201 1/117396(以引用方式併入本文_)中所揭 示0 在較佳實施例中，用於本發明中之植酸酶包含具有植 酸酶活性之多肽，該多肽選自由以下組成之群：（a)具有與 以下序列具有至少7〇%、較佳地至少8〇%、更佳地至少 90Λ 甚至更佳地至少98.6%—致性之胺基酸序列之多 肽：⑴SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之胺基酸23-433及/或 (ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/或 (iii) SEQ ID No· 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及/或（vi) SEQ ID No· 10 ; (b)包含以下序 列中之一或多個胺基酸之缺失、插入及/或保守取代之變 體：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸 23-433及/或 (ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/或 (iii) SEQ ID No. 7，及 / 或（iv) SEQ ID No. 5，及 / 或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 1〇 ;及 /或⑷以下序 列之片段：（i) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之胺基酸23-433及/或（ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多狀部 分，及 /或（iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5 ’ 及 / 161722.doc -27- 201234978 或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（Vi) SEQ ID No· 10。 在一較佳實施例中’用於本發明中之植酸酶包含具有植 酸酶活性之多肽，該多肽選自由以下組成之群：（a)具有與 以下序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少 90°/。、甚至更佳地至少98.6% —致性之胺基酸序列之多 肽：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸 23-433 及/或 (ii) SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2之成熟多狀部分；（b)包 含以下序列中之一或多個胺基酸之缺失、插入及/或保守 取代之變體：（i) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之胺基酸 23-433及/或（ii) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2之成熟多肽
部分及/或（c)以下序列之片段··⑴SEQ ID NO: 1或SEQ ID
No. 2 之胺基酸 23-433 及/或（ii) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2之成熟多肽部分。 在一個實施例令，用於本發明中之植酸酶包含具有植酸 酶活性之多肽’該多肽包含與SEq ID No 1或2之胺基酸 23-433具有至少99.1 % —致性之胺基酸序列。 在一個實施例令，用於本發明中之植酸酶可由選自由以 下組成之群之多核苷酸編碼：（a)編碼具有與SEQ id NO: 1 或SEQ ID No. 2之胺基酸23-433具有至少98.6%—致性之胺 基酸序列之多肽的多核苷酸；及（b)與SEQ ID NO: 3或SEQ ID No. 4之核苷酸67至1299具有至少98.3%—致性之多核苦 酸。 用於本發明中之植酸酶可由如下多核苷酸編碼：其與編 碼由（i) SEQ ID NO: 1 之核苷酸 1 至 66 或（ii) SEQ ID NO: 3 161722.doc •28- 201234978 之核苷酸1至66組成之信號肽的核苷酸序列可操作地連 接。 在一些實施例中，用於本發明中之植酸酶可具有改良之 熱穩定性，如藉由以下方式測得之殘餘活性所示：將上清 液分成兩部分，將一部分在60°C下培育30分鐘，且將另一 部分在5°C下培育30分鐘，然後在37°C及pH 5.5下於對硝 基苯基磷酸酯中測定兩部分之活性，其中植酸酶之殘餘活 性係將在60°C下所培育試樣之活性除以在5°C下所培育相 同試樣之活性，其中植酸酶之殘餘活性為在本文中顯示為 SEQ ID No. 1之參考植酸酶之殘餘活性（在相同條件中量 測）的至少105%。 在一些實施例中，本發明中所使用之植酸酶與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2相比可包含至少一個變化且不超過4 個變化，其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以下： 4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E、241Q、 273L、276K、379K、385D、91C/46C、52C/99C、 31C/176C 、 31C/177C 、 59C/100C 、 141C/199C 、 162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q 及 362K，R。 在一些實施例中，本發明中所使用之植酸酶與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2相比可包含至少一個變化且不超過4 個變化，其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以下： 91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、 141CA99C、162C/247C、111P/241Q。 161722.doc -29- 201234978 在一較佳實施例中，用於本發明中之植酸酶係以 Ronozyme HiPhosTM在市場上出售之植酸酶。 酶Ronozyme HiPhos™具有在本文中顯示為SEQ ID No. 1 之胺基酸序列。 在一個實施例中，用於本發明中之植酸酶係布氏檸檬酸 桿菌YH-1 5植酸酶，其具有在本文中顯示為SEQ ID No. 7 之胺基酸序列或與SEQ ID No. 7具有至少75%、較佳地 80%、較佳地90%、較佳地98%—致性之胺基酸序列。 在一個實施例中，植酸酶可為來自弗氏擰檬酸桿菌之植 酸酶，例如WO 2006/03 8128(該參考文獻以引用方式併入 本文中）中所教示之植酸酶；或UniProtKB/TrEMBL登錄號 Q676V7中所教示之弗氏檸檬酸桿菌植酸酶（在本文中顯示 為 SEQ ID No. 9);或 EBI 登錄號 EM-PRO:AY390262 中所教 示之弗氏檸檬酸桿菌植酸酶（在本文中顯示為SEQ ID No. 10)。 在一個實施例中，植酸酶可為來自弗氏檸檬酸桿菌之植 酸酶，例如WO 2006/03 8128中所教示之植酸酶，該參考文 獻以引用方式併入本文中。 在一個實施例中，用於本發明中之植酸酶可包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID No. 9或SEQ ID No. 10中所示之胺基酸序 列或與 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9 或 SEQ ID No. 10 或其 功能片段具有至少75%、較佳地至少80%、更佳地至少 90%—致性之序列。 本文所用術語「功能片段」意指具有植酸酶活性。較佳 161722.doc -30- 201234978 地’「功能片段」意指該片段在植酸酶活性類型及/或活性 值方面與全長序列具有相同植酸酶活性。 在一個實施例中，較佳地，用於本發明中之植酸酶由選 自由以下組成之群之核苷酸序列編碼：（a)編碼具有與SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9或 SEQ ID No. 10具有至少 75%、 較佳地至少80%、更佳地至少90%—致性之胺基酸序列之 多肽之多核苷酸；及（b)與SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 11具 有至少 75%、80%、85%、90。/〇、95¾、96%、97。/。、98%或 99°/。一致性之多核苷酸。 在一個實施例中’用於本發明中之植酸酶由顯示為以下 之核苷酸序列編碼： (a) 呈現為SEQ ID No. 6之核苷酸序列， (b) 與呈現為SEQ ID No. 6之核苷酸序列具有至少75% 一致性之核苷酸序列； (c) 作為在（a)或中給出之核苷酸序列之補體之核苷酸 序列； (d) 能夠與在（a)、（b)或（c)中給出之核苷酸序列在嚴格 條件下雜交之核苷酸序列； (e) 作為在（d)中詳述之核苷酸序列之補體之核苷酸序 列。
在一個實施例申’用於本發明中之植酸酶可包含如SEQ ID No. 5中所示之胺基酸序列（其係弗氏檸檬酸桿菌植酸 酶）或與該胺基酸序列具有至少90%—致性之序列；其中該 多肽包含 161722.doc •31 - 201234978 選自由以下組成之群之突變之組合：R288M ; K46E/Q82H/E168D/Q274L ； Q82K/T154I/Q279E/N308T ； Q82R/D112V/Q274H/T362A ； D53N/D57Y/T199I/P229S/R288M ； K46E/Q82H/N148D/T154I/T362I ； D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R ； D53N/D57Y/T154I/P229S/R288M ； K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D3 83V ； D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P ； D53K/D57Y/M152V/P229S/R28 8M/A393P ； D5 3N/D5 7Y/F88Y/M152V/P229S/Q2 79E/N3 08T ； D5 3N/D5 7Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A3 93P ； D5 3N/D5 7Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A3 93P ； D53N/D5 7Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P ； K46E/D53N/D5 7Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A39 3P ； Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P ； Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I3 84L/P3 86Q/A393P ； H18Q/D53N/D5 7Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R28 8M/Q3 8 5R/A393P ； Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I3 84F/ A393P/D397N ； D5 3N/D57Y/F8 8Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D /N164D/Q274H/T362I/I384L/A393P ； 161722.doc -32- 201234978 D5 3N/D5 7Y/Q82K/F8 8Y/N95P/P102L/V105I/Y13 6N/N148D /Y177F/Q274H/Q279E/T362I/A393P ； D5 3N/D5 7Y/Q82K/F8 8Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/ Q274L/G343A/T362I/I384L/A393P ； E23K/K46E/Q82H ； K46E/Q82H/Q385R ； D5 3N/D5 7Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q3 85R/A3 93P ； 其中根據SEQ ID No. 5中之編號方式進行編號，且 其中該經分離多肽與具有在SEQ ID NO: 5中給出之序列之 多肽相比具有增加之熱穩定性。 在一個實施例中，用於本發明中之植酸酶可包含如SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列或與該胺基酸序列或其功能 片段具有至少75%、較佳地至少80%、更佳地至少90% — 致性之序列。 在一個實施例中，較佳地，本發明之檸檬酸桿菌植酸酶 具有3-4.5之最優pH範圍。在一個實施例中，較佳地，本 發明之檸檬酸桿菌植酸酶能夠在約3-3.5之pH範圍中具有 其最高活性。 如WO 2006/0373 28(以引用方式併入本文中）中所揭示之 布氏檸檬酸桿菌ATCC 51113(用於酶之胺基酸序列在本文 中顯示為SEQ ID No. 1)及如WO 2004/085638中所述之布 氏檸檬酸桿菌YH-15(用於酶之胺基酸序列在本文中顯示為 SEQIDNo. 7)二者皆具有3-4·5之最優pH範圍。 161722.doc -33- 201234978 如WO 2006/037328(以引用方式併入本文中）中所揭示之 布氏擦檬酸桿菌ATC C 51113(用於酶之胺基酸序列在本文 中顯示為SEQ ID No. 1)亦能夠在約3-3 · 5之pH範圍中具有 其最高活性。 如WO 2004/085638中所述之布氏檸檬酸桿菌γΗ—丨5(用 於酶之胺基酸序列在本文中顯示為SEQ ID No. 7)在約4之 pH下具有其最高活性。 一種以上之適宜植酸酶可組合使用，例如2或3種植酸 酶0 本發明亦涵蓋，可組合使用一種以上之檸檬酸桿菌植酸 酶（例如來自相同或不同物種或菌株）。另一選擇為，如本 文所詳述之至少一種檸檬酸桿菌植酸酶可與一或多種非檸 檬酸桿菌植酸酶組合使用。 在一個實施例中，較佳地，本發明中所使用之檸檬酸桿 菌植酸酶係6-植酸酶。 在一個實施例中’較佳地’本發明中所使用之檸檬酸桿 菌植酸酶並不與另一植酸酶（例如另一檸檬酸桿菌植酸酶 或另一非檸檬酸桿菌植酸酶）組合使用。 較佳地’植酸酶存於飼料原料中之範圍為約2〇〇 FTu/kg 至約1000 FTU/kg飼料、更佳約30〇 FTU/kg飼料至約750 FTU/kg飼料、更佳約400 FTU/kg飼料至約500 FTU/kg飼 料。 在一個實施例中’植酸酶係以超過約200 FTU/kg飼料、 適且地超過約3〇〇 FTU/kg飼料、適宜地超過約400 FTU/kg 161722.doc -34· 201234978 飼料存於飼料原料中。 在一個實施例中，植酸酶係以低於約1000 FTU/kg飼 料、適宜地低於約750 FTU/kg飼料存於飼料原料中。 較佳地，植酸酶存於飼料添加劑組合物中之範圍為約4 0 FTU/g至約40,000 FTU/g組合物，更佳約80 FTU/g組合物 至約20,000 FTU/g組合物，且甚至更佳約100 FTU/g組合物 至約10,000 FTU/g組合物，且甚至更佳約200 FTU/g組合物 至約10,000 FTU/g組合物。 在一個實施例中，植酸酶係以超過約40 FTU/g組合物、 適宜地超過約60 FTU/g組合物、適宜地超過約100 FTU/g 組合物、適宜地超過約1 50 FTU/g組合物、適宜地超過約 200 FTU/g組合物存於飼料添加劑組合物中。 在一個實施例中，植酸酶係以低於約40,000 FTU/g組合 物、適宜地低於約20,000 FTU/g組合物、適宜地低於約 15,000 FTU/g組合物、適宜地低於約1〇,〇〇〇 FTU/g組合物 存於飼料添加劑組合物中。 應瞭解，如本文所用1 FTU(植酸酶單位）定義為在ISO 2009植酸酶分析（用於測定植酸酶活性之標準分析）中所定 義反應條件下，在一分鐘内自受質釋放1 Mmol無機正填酸 酯時所需之酶用量，且1 FTU可參見國際標準ISO/DIS 30024: 1-17, 2009 « 在一個實施例中，宜採用上述E.C.分類對酶進行分類’ 且E.C.分類所指示之酶在本文所教示用於測定1 FTU之分 析中測試時具有該活性。 161722.doc •35· 201234978 優點 令人驚奇地發現’檸檬酸桿菌植酸酶（具體而言係布氏 檸檬酸桿菌植酸酶及/或弗氏檸檬酸桿菌植酸酶）與DFM之 組合改良個體對於壞死性腸炎之抗性，例如觀察到（例如） 損傷評分降低。 尤其令人驚奇的是，與業内已知之其他植酸酶（例如來 自非檸檬酸桿菌有機體）相比，在上文中所教示之檸檬酸 桿菌植酸酶（例如來自布氏擰檬酸桿菌及/或弗氏擰檬酸桿 菌）在與DFM組合時顯著改良個體對於壞死性腸炎之抗 性。 在一個實施例中，如本文所教示以Ronozyine HiPhosTM 形式出售之布氏檸樣酸桿菌植酸酶與來自其他布氏檸檬酸 桿菌菌株之植酸酶（例如來自菌株γΗ_15之布氏檸檬酸桿菌 植酸酶•其序列在本文中顯示為SEQ ID ν〇· 7)相比，其效 應甚至更為明顯-此完全屬於意料之外。 同樣，不期望受限於理論，檸檬酸桿菌植酸酶與DFM之 組合與其他植酸酶及DFM相比提供令人驚奇的較佳結果， 此表明布氏檸檬酸桿菌植酸酶與一些其他非檸檬酸桿菌植 酸酶相比在較低pH(例如3.5-4.5)下具有較高活性。因單胃 農場動物（例如豬或家禽）之胃腸（GI)道之第一部分具有低 PH-布氏檸檬酸桿菌植酸酶似乎在GI道之此部分中具有較 南活性，由此該等植酸酶與一些其他非檸檬酸桿菌植酸酶 相比能夠自植酸鹽受質更快地釋放磷及其他營養素（例如 蛋白質）。此在許多方面係有利的，包括期望盡可能快地 16I722.doc -36- 201234978 在植酸鹽上發揮作用，此乃因其往往會與諸如礦物質等其 他物質進行複合（尤其在pH升高時）。一旦植酸鹽發生複 合，裂解酶較不易接近該鹽。因此，期望在Gi道中之前段 在PH仍較低時對植酸鹽受質發揮作用。然而，植酸鹽在以 道之前段部分中裂解意味著，GI道之空腸及下部中可利用 之磷較少，此可對諸如乳桿菌（Lact〇baciUi)等共生「有 盈」細菌群體（已顯示其具有有益效應，例如免疫調節及 產生降低腸pH之有機酸）具有負面影響。對於駐留「有 益」細菌之此負面影響可導致機會病原體富有活性·由此 打破了腸中細菌之總體平衡。 對於本發明而&，已令人驚奇地發現，使用布氏檸檬酸 桿菌植酸酶之負面影響可藉由將其與一或多種DFM組合使 用來克服。DFM重新建立腸中之細菌平衡-由此減小由病 原性細菌引起之腸損害且使動物個體具有較高性能。 同樣，不期望受限於理論，棒檬酸桿菌植酸酶與DFM之 組合與其他植酸酶及DFM相比提供令人驚奇的較佳結果， 此進一步表明布氏檸檬酸桿菌植酸酶與一些其他非檸檬酸 桿菌植酸酶相比在較低pH(例如3.5-4.5)下具有較高活性。 因胃腸（GI)道之第一部分具有低pH_故布氏檸檬酸桿菌植 酸酶似乎在GI道之此部分中具有較高活性。此可改良個體 之蛋白質消化，此乃因植酸鹽可藉由結合蛋白質形成複合 物。蛋白質吸附之此早期增加之結果可導致動物產生較少 鹽酸（HC1)-此可隨後在GI道中具有負面影響，此乃因其可 增加GI道之後段部分中之pH。增加GI道之後段部分中之 161722.doc •37- 201234978 pH係不利的，此乃因其增加了病原體能夠在腸内定殖之機 會。在本發明中令人驚奇地發現，使用檸檬酸桿菌植酸酶 之該等負面影響可藉由將其與DFM組合來克服。 令人驚奇地，來自布氏檸檬酸桿菌菌株ATCC 51113之6-植酸酶（具有胺基酸序列SEQ ID No. 1)受到較甚至其他布 氏檸檬酸桿菌6-植酸酶（例如來自布氏檸檬酸桿菌菌株YH-15之6-植酸酶（具有胺基酸序列SEQ ID No. 7))甚至更強之 正面影響。 DFM與酶之調配物 可依任一適宜方式調配DFM與酶，以確保該調配物包含 活的DFM及活性酶。 在一個實施例中，可將DFM與酶調配為液體、乾粉或顆 粒。 乾粉或顆粒可藉由彼等熟習此項技術者已知之方式（例 如）在槽頂噴霧流化床塗佈器中、在槽底喷霧wurster設備 中或藉由轉鼓製粒（例如高剪切製粒）、擠出、盤式塗佈或 在微成份混合器中製得。 對於一些實施例而言，可塗佈（例如囊封）DFM及/或酶。 適宜地，DFM及酶可調配於同一塗層中或囊封於同一膠囊 中。另一選擇為，其中一或兩種酶可調配於同一塗層中或 囊封於同-膠囊中’且DFM可與其中—或兩種酶分開調配 於塗層中。在一些實施例中，例如若DFM能夠產生内生孢 子，則可在無任何塗層下提供DFM。在該等情況下，可簡 單地將DFM内生孢子與一種或兩種酶混合。在後一情形 161722.doc • 38 · 201234978 下，可塗佈（例如囊封）酶，舉例而言可塗佈（例如囊封）其 中一或兩種酶。酶可呈酶混合物（即包含一種或兩種酶）形 式囊封或可（例如）呈單一酶形式單獨囊封。在一個較佳實 施例中，可一起塗佈（例如囊封）兩種酶。 在一個實施例中’塗層保護酶免受熱影響且可視為防 熱。 在一個實施例中’將飼料添加劑組合物調配成乾粉或顆 粒，如WO 2007/044968(稱作 TPT 顆粒）或 WO 1997/016076 或WO 1992/012645中所述（每一案件均以引用方式併入本 文中）。
在一個態樣中，本發明之飼料包含經蒸汽處理之粒化飼 料組合物，該經蒸汽處理之粒化飼料組合物包含含有核心 及一或多種塗層之顆粒。核心可為鹽顆粒或諸如此類，該 核心上可喷塗酶溶液，以在上面形成層。核心包含一或多 種活性化合物，如：至少包含本發明之植酸酶及/或 DFM。其中至少一層塗層可為水分障壁塗層。在一些實施 例中，其中至少一層塗層包含鹽。對於某些實施例而言， 顆粒之尺寸大約為210 μηι至390 μηι。在一些實施例中，顆 粒之尺寸可為至多450 μηι或更大或尺寸為至多500 μιη或更 大。此一實施例之實例可參見WO 2006/034710、WO 00/01793、WO 99/32595、WO 2007/044968、WO 00/47060 、WO 03/059086 、WO 03/059087 、WO 2006/053564及US 2003/0054511，其皆以引用方式併入本 文中。 161722.doc -39- 201234978 用於丸粒塗層之較佳鹽係WO 2006/034710(以引用方式 併入本文中）中所述鹽中之一或多者。用於塗佈丸粒之較 佳鹽之實例包括以下中之一或多者：Na2S04、NaCl、 Na2C03、NaN03、Na2HP04、Na3P04、NH4CL、 (NH4)2HP04、NH4H2P〇4、（NH4)2S04、KC1、K2HP04、 KH2P04、KN03、k2S04、KHS04、MgS04、ZnS04及檸檬 酸納或其混合物。對於一些態樣而言，用於塗佈丸粒之更 佳鹽之貫例包括一或多種磷酸鹽’例如一或多種Na2s〇4、 (NH4)2S〇4、K2S04、KHS04、MgS04、ZnS〇4 或其混合 物。對於一些態樣而言，用於塗佈丸粒之更佳鹽之實例包 括一或多種Na2S04、（Nh4)2S04及MgS04或其混合物。對 於一些態樣而言，用於塗佈丸粒之較佳鹽至少係或包括 Na2S〇4 0 在某些態樣中，本發明之飼料包含含有核心之顆粒，其 中該核心至少包含本發明之植酸酶及/或DFM，且其中該 核心經-或多個塗層塗佈’纟中至少—層塗層包含水分障 壁。顆粒可為經蒸汽處理之顆粒。顆粒可為經蒸汽處理之 粒化顆粒。 在某些態樣中，本發明之飼料包含顆粒，其中該顆粒包 含至少包含本發明之植酸酶及/或DFM之核心，且其中該 核心經一或多個塗層塗佈，其中 „ ^ a . 人 丹甲至>一層塗層包含能夠 作水分障壁之鹽。顆粒可為經暮 勺1瘵π處理之顆粒。顆粒 經蒸汽處理之粒化顆粒。 两 其中該顆粒包 在某些態樣中’本發明之飼料包含顆粒 161722.doc •40· 201234978 含至少包含本發明之植酸酶及/或DFM之核心，且其中該 核心經一或多個塗層塗佈，其中至少一層塗層包含以下中 之一或多者：Na2S04、NaCl、Na2C03、NaN03、
Na2HP04、Na3P〇4、NH4C1、（NH4)2HP04、NH4H2P〇4、 (NH4)2S04 ' KC1 ^ K2HP〇4 ^ KH2P04 ' KNO3 ' K2S04 > KHS〇4、MgSCU、ZnS〇4及檸檬酸鈉或其混合物。顆粒可 為經蒸汽處理之顆粒《顆粒可為經蒸汽處理之粒化顆粒。 在某些態樣中，本發明之飼料包含顆粒，其中該顆粒包 含至少包含本發明之植酸酶及/或DFM之核心，且其中該 核心經一或多個塗層塗佈’其巾至少一層塗層包含一或多 種硫酸鹽，例如一或多種Na2S〇4、（NH4)2S〇4、Μα、 KHSO4、MgS〇4、ZnS〇4或其混合物。顆粒可為經蒸汽處 理之顆粒。顆粒可為經蒸汽處理之粒化顆粒。 、 在某些態樣中，本發明之飼料包含顆粒，其中該顆粒包 含至少包含本發明之植酸酶及/或DFM之核心，且其中該 核心經-或多個塗層塗佈，纟中至少—層塗層包含以下^ 之-或多者：Na2S〇4、（NH4)2S〇jMgS〇4或其混合物。 顆粒可為經蒸汽處理之顆粒。顆粒可為經蒸汽處理之粒化 在某些態樣中，本發明之飼料包含顆粒，其中該顆粒包 含至少包含本發明之植酸酶及/或DFM之核心，且其中气 核心經一或多個塗層塗佈’纟中至少-層塗層至少係或： = a2S〇4。顆粒可為經蒸汽處理之顆粒。顆粒可 處理之粒化顆粒。 “飞 161722.doc •41 · 201234978 在-個實施例中，可將铜料添加劑組合物調配成用於飼 料組合物之顆粒’纟包含：核心；活性劑；及至少一種塗 層，在選自以下中之一或多者之乞 有之條件後’顆粒之活性劑保 留至少50%活性、至少6〇。/0活祕 E _ '古性、至少70。/。活性、至少80〇/〇 活性.a)飼料製丸製程’ b)蒸汽加熱之飼料預處理製程， c)儲存’ d)在未經製丸混合物_作為成份儲存，及^在包 含至少-種選自以下之化合物之飼料基質混合物或飼料預 混合物中作為成份儲存：痕量礦物f、有機酸、還原糖、 維生素、氣化膽驗、及產生酸性或驗性飼料基質混合物或 飼料預混合物之化合物。 關於顆粒，至少-種塗層可包含佔顆粒之至少Μ咖％ 的水分水合材料；及/或至少一種塗層可包含兩種塗層。 該兩種塗層可為水分水合塗層及水分障壁塗層。在一些實 施例中，水分水合塗層可佔顆粒之介於25〜~%與6〇 W/W。/。之間且水分障壁塗層可佔顆粒之介於2 w/w%與i 5 W/W。/。之間。水分水合塗層可選自無機鹽、隸、殿粉及 麥芽糊精且水分障壁塗層可選自聚合物、樹膠、乳清及澱 粉。 顆粒可 < 用飼料製丸製程產生且飼料預處王里製程可在 70 C與95 C間實施高達若干分鐘，例如介於85。〇與95艺之 間。 ' 在一個實施例中，可將飼料添加劑組合物調配成用於動 物飼料之顆粒，其包含：核心；活性劑，在儲存之後及在 顆粒係成份之蒸汽加熱製丸製程之後，顆粒之活性劑保留 161722.doc • 42· 201234978 至少80%活性；水分障壁塗層；水分水合塗層，其佔顆粒 之至少25 w/w%，在蒸汽加熱製丸製程之前’該顆粒具有 小於0.5之水活性。 顆粒可具有選自聚合物及樹膠之水分障壁塗層且水分水 合材料可為無機鹽。水分水合塗層可佔顆粒之介於乃 w/w%與45 W/W%之間且水分障壁塗層可佔顆粒之介於2 从/\^/〇與10〜~〇/〇之間。 顆粒可使用$汽加熱製丸製程產±，該製程彳在8rc與 95°C之間實施高達若干分鐘。 八 在一些實施例中，可使用稀釋劑（例如澱粉粉末、石灰 石或諸如此類）稀釋DFM(例如DFMR生孢子）。 在一個實施射，、組纟物存於適於攝取之液體調配物 中，較佳地，該液體攝取物含有以下中之一或多者：緩衝 劑、鹽、山梨醇及/或甘油。 在另實施例中，可藉由將酶施加（例如噴霧）於載劑基 材（例如碾碎之小麥）上來調配飼料添加劑組合物。 在個1"施例+，本發明t飼料添加劑組合物可調配為 預混合物。僅舉例而言，預混合物可包含一或多種飼料組 份，例如一或多種礦物質及/或一或多種維生素。 在個實施例中，可將用於本發明中之DFM及/或酶與 至少一種選自以下中之至少一者之生理學上可接受之載劑 調配在一起：麥芽糊精、石灰石（碳酸鈣）、環糊精、小麥 或小麥組份、蔗糖、澱粉、Na2S〇4 '滑石粉、PVA、山梨 享笨甲酸鹽、山梨酸西旨、甘油、薦糖、丙二醇、1，3_丙 161722.doc -43· 201234978 二醇、葡萄糖、對羥基苯曱酸酯、氯化鈉、檸檬酸鹽、乙 酸鹽、磷酸酯、鈣、偏亞硫酸氫鹽、曱酸鹽及其混合物。 包裝 在一個實施例中’包裝本發明之飼料添加劑組合物及/ 或預混合物及/或飼料或飼料原料。 在一個較佳實施例中，將飼料添加劑組合物及/或預混 合物及/或飼料或飼料原料包裝於袋（例如紙袋）中。 在替代實施例中，可將飼料添加劑組合物及/或預混合 物及/或飼料或钥料原料密封在容器中。可使用任一適宜 容器。 飼料 本發明之飼料添加劑組合物可用作飼料或用於製備飼 料。 本文所用術語「飼料」與「飼料原料」同義。 端視用途及/或施加模式及/或投與模式而定，飼料可呈 溶液形式或呈固體形式。 在用作飼料（例如功能飼料）或用於其製備時’本發明之 組合物可與以下中之一或多者結合使用：營養上可 ::上::上可接受之稀釋劑、營養上可接受之賦形二 呂養上可接受之佐劑、營養活性成份。 在一較佳實施例中，將本發明之甸料添 料組份混合以形成飼料原料。 “口物與飼 本文所用術語「匈料租检 jt 4t 且伤」思指飼料原料之 分。飼㈣敎㈣可_㈣料-種絲或=厚部 161722.doc •44· 201234978 料之一種以上（例如2種或3種或4種）成份。在一個實施例 中’術§吾「飼料組份」涵蓋預混合物或預混合物成份。 較佳地，飼料可為草料或其預混合物、複合飼料或其預 混合物。在一個實施例中，可將本發明之飼料添加劑組合 物與複合飼料、複合飼料組份混合或混合至複合飼料之預 混合物或草料、草料組份或草料之預混合物中。 本文所用術語草料意指提供給動物（而非動物必須自己 見食）之任何食物。草料涵蓋經切割之植物。 術語草料包括枯草、稻草、青貯飼料、壓製及製丸飼 料、/由及混合日糧亦及發芽縠類及豆類。 草料可自選自以下之植物中之一或多者獲得：苜蓿（紫 苜稽（lucerne))、大麥、百脈根（birdsfoot trefoil)、葉菜類 (brassicas)、考目裏（chau moellier)、羽衣甘藍（kale)、油 菜籽（芸苔）、黃色蔓菁（蕪菁甘藍）、蕪菁、三葉草、阿爾 色三葉草、紅色三葉草、地三葉草、白色三葉草、草、燕 麥草、羊茅草、百慕大草（Bermuda grass)、雀麥、三齒稃 屬草（heath grass) '草地早熟禾（meacj〇w grasses)(來自天然 混合草原草地）、果樹草、黑麥草、貓尾草、玉米（c〇rn或 maize)、粟、燕麥 '高粱、大豆、樹（用於樹-枯草之截頭 樹秧）、小麥及豆類。 術語「複合飼料」意指呈膳食、丸粒、堅果、餅或碎屑 形式之商業飼料。複合飼料可自各種原料及添加劑摻和而 來。根據目標動物之具體需求調配該等摻合物。 複合飼料可為提供所有每日所需營養素之完整飼料、提 161722.doc -45- 201234978 供日糧（蛋自質、能量）之-部分之濃縮物或僅提供額外微 營養素（例如礦物質及維生素）之補充劑。 用於複合飼料中之主要成份係飼料榖物’其包括玉米、 大豆、高粱、燕麥及大麥。 適宜地，本文提及之預混合物可為包括諸如維生素、礦 物質、化學防腐劑、抗生素、發酵產品及其他基本成份等 微成份的組合物。預混合物通常係適於摻和至商業日糧中 之組合物。 本發明之任何飼料原料可包含一或多種選自包含以下戈 群之飼料材料：a)穀物，例如小粒縠物（例如小麥、大麥、 黑麥、燕麥及其組合）及/或大粒縠物（例如玉米或高粱）； b)榖物之副"σ，例如玉米榖蛋白粉、乾燥酒相可：* (DDGS)'小麥糠、小麥粗粉、碎小麥' 粳米糠、稻殼 燕麥殼、棕櫚仁及掛橘果肉；c)自諸如以下等來源獲得$ 蛋白質：大豆、向日葵、堅果、羽扇 又于 “ 立豌且、蠶豆、相 化、云台、魚粉、乾燥血漿蛋白質、
,^ J及月粉、馬鈴薯J 白質、乳清、乾椰子肉、芝麻；d)自植 之油及脂肪；e)礦物質及維生素。 /源獲4 本發明之飼料原料可含有至少3〇重
垔/。、至少4〇番E /〇、至少50重量。/〇或至少6〇重量％之玉一 1 及全脂大豆、或小麥粉或向日葵粉β 、 A或玉ϋ 另外或另-選擇為，本發明之飼料原料可小一 =铜料材料及/或至少一種高纖維甸料材料二’ 品以提供高纖維飼料原料。高纖維铜料材料之實々 161722.doc •46- 201234978 包括.小麥、大麥、黑麥、燕麥、穀物之副產品（例如玉 米榖蛋白粉、乾燥酒粕可溶物（DDgS)、小麥糠、小麥粗 粉、碎小麥、粳米糠、稻殼、燕麥殼、棕櫚仁及柑橘果 肉）°一些蛋白質來源亦可視為高纖維：自諸如向日蔡、 羽扇豆、蠶豆及棉花等來源獲得之蛋白質。 在本發明中，飼料可為以下中之一或多者：複合飼料及 預混合物，其包括丸粒、堅果或（牛用）餅；農作物或農作 物殘餘物：玉米、大豆、高粱、燕麥、大麥、玉米秸稈、 乾椰子肉、稻草、穀殼、甜菜廢料；魚粉；新鮮切割草及 其他飼料植物；肉及骨粉；冑蜜；油渣餅及壓濾餅；募 糖，保守飼料植物：枯草及青貯飼料；海藻；種子及穀 物，其係整個或藉由碾壓或研磨等製備；發芽榖類及豆 類；酵母提取物。 口在些實施例中，本發明中之術語飼料亦涵蓋寵物食 〇〇寵物食品係意欲由寵物攝取之植物或動物材料，例如 狗食品或I苗食品。寵物食品(例如狗及猫食品)可呈乾燥形 式（例如用於狗之食物）錢罐裝形式。㈣品可含有胺基 酸牛磺酸。 在-些實施例中，本發明中之術語飼料亦涵蓋魚食品。 魚食品通常含有使養殖魚保持健康所需之主要營養素、痕 ，素及、隹生素。魚食。。可呈小片、丸粒或錠劑形式。製 工、（其中之自快速/儿降）經常用於較大魚或底飼物 種。一些魚食品亦含有諸如β胡蘿蔔素或性激素等添加劑 以人工増強觀賞性魚之顏色。 161722.doc •47- 201234978 在—實施例中，本發明中之術語飼料亦涵蓋鳥食。鳥 。括用於鳥籠中及用於飼飯寵物鳥之食品。通常，鳥食 包含各種種子，但亦可涵蓋板油（牛或羊脂肪）。 本斤用術°°《觸」係指將本發明組合物間接或直接 施加至產品(例如飼料)中。可使用之施加方法之實例包括 但不限於.在包含飼料添加劑組合物之材料中處理產品， 藉由混合飼料添加㈣合物與產品直接施加，將飼料添加 劑組合物噴霧至產品表面上或將產品浸入飼料添加劑組合 物之製劑中。 在一個實施例中’較佳將本發明之飼料添加劑组合物與 產品(例如飼料原料)混合。或者，詞料原料之乳液或原始 成份中可包括飼料添加劑組合物。 對於施加而吕，重要的是，使組合物在欲影響/處 理之產品表面上可用或可用於欲影響/處理之產品表面。 此使得組合物可賦予以下有利特性中之—或多纟：性能益 處。 可施加本發明之飼料添加劑組合物以散佈、塗佈及/或 浸潰具有控制量之DFM及酶之產品（例如飼料原料或飼料 原料之原始成份）。 刪及酶可同時使用（例如，在其混合在—起時或甚至 在其藉由不同路徑遞送時）或依序使用（例如 同路徑遞送)。在-個實施例中，較佳地，同時施力= 及轉。較佳地，混合DFM與酶，之後將其遞送至匈料原料 或飼料原料之原始成份。 161722.doc •48· 201234978 可以適±濃度添加本發明之飼料添加劑組合物中之 DFM-例如最終飼料產品中之濃度可提供介於約2”〇5咖 至約2Xl〇n<：FU之間、適宜地介於約2xl06 CFU至約1χ1〇10 CFU之間、適宜地介於約3 75χ1〇7 CFU至約…〇ι〇㈣之 間之曰劑量。 較佳地，本發明之飼料添加齊I組合物將對高達約1C、 高達約饥或高達約95t之熱處理熱穩定。熱處理可實施 高達^分鐘、高達約5分鐘、高達約1G分鐘、高達約对 鐘间達，力60刀鐘。術語熱穩定意指在加熱至指定溫度之 前添加劑中存在/有活性之酶組份及/或dfm中之至少約 75。/◦在冷卻至室溫後仍存在/有活性1佳地，在加熱至指 定溫度之前添加劑中存在及有活性之酶組份及/或DFM中 之至少約80%在冷卻至室溫後仍存在及有活性 在尤佳貫施例中，將飼料添加劑組合物均質化以產生 粉末。 在替代較佳實施例中，將飼料添加劑組合物調配成顆 粒’如以引用方式併入本文中之w〇2〇〇7/〇44968中所述（稱 作TPT顆粒）。 在另-較㈣施例中’在將飼料添加劑組合物調配成顆 粒時’該等顆粒包含蛋白質核心上塗佈之水合障壁鹽。該 鹽塗層之優點係改良耐熱性、改良儲存穩定劑及保護免受 原本對酶及/或DFM具有不利作用之其他飼料添加劑的影 響。 較佳地， 用於鹽塗層之鹽於20«t下具有大於0 25之水活 161722.doc -49· 201234978 性或大於60%之恆定濕度。 較佳地，鹽塗層包含Na2S04 » 製備飼料添加劑組合物之方法亦可包含將粉末製成丸之 其他步驟。可將粉末與業内已知之其他組份混合。可迫使 粉末或包含粉末之混合物穿過模具且將所得鏈切成不同長 度之適宜丸粒。 視情況，製丸步驟可包括在形成丸粒之前之蒸汽處理或 調節階段。可將包含粉末之混合物放置於調節器(例如具 有蒸π注射之混合器）中。將混合物在調節器中加熱至指 定溫度，例如自60t至l〇(TC，典型溫度可為7〇〇c、 8〇°C、85°C、9G°C或95。(：。滞留時間可自數秒至數分鐘及 甚至數小時變化。例如5秒、1()秒、15秒、3〇秒、1分鐘、 2分鐘、5分鐘、1〇分鐘、15分鐘、3〇分鐘及丨小時。 應瞭解，本發明之飼料添加劑組合物適於添加至任何適 當飼料材料中。 本文所用術語飼料材料係指由動物攝取之基本飼料材 料。另外應瞭解，此飼料材料可包含（例如）至少一種或多 種未處理縠物、及/或經處理植物及/或動物材料，例如大 豆粉或骨粉。 本文所用術語「飼料原料」係指添加一或多種飼料添加 劑組合物之飼料材料。 熟習此項技術者應瞭解，不同動物需要不同飼料原料， 且端視所飼養動物之目的而定，即使相同動物亦可需要不 同飼料原料。 161722.doc •50- 201234978 較佳地，飼料原料可包含飼料材料’該等飼料材料包含 玉米（maize或corn)、小麥、大麥、黑小麥、黑麥、粳米、 木薯、高粱、及/或任何副產品、以及富含蛋白質之組 份，如大豆粉、油菜種子粉、芸苔粉、棉花種子粉、向日 葵種子粉、動物副產品粉及其混合物。更佳地，飼料原料 可包含動物脂肪及/或植物油。 視情況，飼料原料亦可含有額外礦物質（例如鈣）及/或額 外維生素。 較佳地，飼料原料係玉米大豆粉混合物。 在一個實施例中，較佳地，飼料並非寵物食品。 在另一態樣中，提供產生飼料原料之方法。飼料原料通 常係在飼料磨機中產生’其中首先將原料研磨成適宜粒徑 且隨後將其與適當添加劑混合。隨後可㈣液或丸粒形式 產生飼料原料；後者通常涉及將溫度升高至目標程度且隨 後使飼料通過飲食以產生微粒大小之丸粒的方法叫吏丸粒 冷卻。隨後可添加諸如脂肪等液體添加劑及酶。飼料原料 之產生亦可涉及額外步驟，其句 脹-尤其藉“括在製丸之前擠出或膨 尤其藉由可包括至少使用蒸汽之適宜技術。 飼料原料可為用於單胃動物（ 龅 Λ m 』那豕常（例如肉雞、蛋 別A雞、火雞、鴨、鵝、水產）、豬（所有年齡類 小寵物（例如狗、猶）或魚）之飼料原 原料用於家禽。 牧佳地飼枓 在一個貫施例中 僅舉例而言，用 ，飼料原料並非用於蛋雞。 於雞（例如肉雞）之匈料原料可包含下表 16l722.doc 201234978 中所列舉成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表 示： 成份 雛雞(％) 肥育難(％) 玉米 46.2 46.7 小麥粗粉 6.7 10.0 玉米DDGS 7.0 7.0 大豆粉，48% CP 32.8 26.2 動物/植物脂肪摻合物 3.0 5.8 L-離胺酸HC1 0.3 0.3 DL-曱硫胺酸 0.3 0.3 L-蘇胺酸 0.1 0.1 鹽 0.3 0.4 石灰石 1.1 1.1 磷酸氩鈣 1.2 1.2 家禽維生素及微礦物質 0.3 0.3 僅舉例而言，雞（例如肉雞）之飲食說明可如下表中所 述： 飲食說明 粗蛋白(％) 23.00 20.40 家禽之代謝能(kcal/kg) 2950 3100 鈣(％) 0.85 0.85 161722.doc •52· 201234978 可用磷(％) 0.38 0.38 鈉(〇/〇) 0.18 0.19 可消化之離胺酸(°/〇) 1.21 1.07 可消化之甲硫胺酸(％) 0.62 0.57 可消化之曱硫胺酸+半胱 胺酸(％) 0.86 0.78 可消化之蘇胺酸(°/〇) 0.76 0.68 僅舉例而言，用於蛋雞之飼料原料可包含下表中所列舉 成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表示： 成份 下蛋期(％) 玉米 10.0 小麥 53.6 玉米DDGS 5.0 大豆粉，48% CP 14.9 小麥粗粉 3.0 大豆油 1.8 L-離胺酸HC1 0.2 DL-曱硫胺酸 0.2 L-蘇胺酸 0.1 鹽 0.3 磷酸氫鈣 1.6 石灰石 8.9 家禽維生素及微礦物質 0.6 僅舉例而言，蛋雞之飲食說明可如下表中所述： 161722.doc •53· 201234978 飲食說明 粗蛋白(％) 16.10 家禽之代謝能(kcal/kg) 2700 離胺酸(％) 0.85 甲硫胺酸(％) 0.42 曱硫胺酸+半胱胺酸(％) 0.71 蘇胺酸(％) 0.60 鈣(％) 3.85 可用磷(°/〇) 0.42 納(％) 0.16 僅舉例而言，用於火雞之飼料原料可包含下表中所列舉 成份中之一或多者，例如以下表中給出之°/〇表示： 成份 階段1 (%) 階段2 (%) 階段3 (%) 階段4 (%) 小麥 33.6 42.3 52.4 61.6 玉米DDGS 7.0 7.0 7.0 7.0 大豆粉，48% CP 44.6 36.6 27.2 19.2 油菜種子粉 4.0 4.0 4.0 4.0 大豆油 4.4 4.2 3.9 3.6 L-離胺酸HC1 0.5 0.5 0.4 0.4 DL-曱硫胺酸 0.4 0.4 0.3 0.2 L-蘇胺酸 0.2 0.2 0.1 0.1 鹽 0.3 0.3 0.3 0.3 石灰石 1.0 1.1 1.1 1.0 磷酸氫鈣 3.5 3.0 2.7 2.0 家食維生素 及微礦物質 0.4 0.4 0.4 0.4 161722.doc • 54· 201234978 僅舉例而言，火雞之飲食說明可如下表中所述： 飲食說明 粗蛋白(％) 29.35 26.37 22.93 20.00 家禽之代謝能(kcal/kg) 2.850 2.900 2.950 3.001 鈣(％) 1.43 1.33 1.22 1.02 可用磷(％) 0.80 0.71 0.65 0.53 納(％) 0.16 0.17 0.17 0.17 可消化之離胺酸(％) 1.77 1.53 1.27 1.04 可消化之曱硫胺酸(％) 0.79 0.71 0.62 0.48 可消化之曱硫胺酸+半胱胺酸(％) 1.12 1.02 0.90 0.74 可消化之蘇胺酸(％) 1.03 0.89 0.73 0.59 僅舉例而言，用於仔豬之飼料原料可包含下表中所列舉 成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表示： 成份 階段1 (%) 階段2 (%) 玉米 20.0 7.0 小麥 25.9 46.6 黑麥 4.0 10.0 小麥粗粉 4.0 4.0 玉米DDGS 6.0 8.0 大豆粉，48% CP 25.7 19.9 乾燥乳清 10.0 0.0 大豆油 1.0 0.7 L-離胺酸HC1 0.4 0.5 161722.doc -55- 201234978 DL-曱硫胺酸 0.2 0.2 L-蘇胺酸 0.1 0.2 L-色胺酸 0.03 0.04 石灰石 0.6 0.7 磷酸氫鈣 1.6 1.6 豬維生素及微礦物質 0.2 0.2 鹽 0.2 0.4 僅舉例而言，仔豬之飲食說明可如下表中所述： 飲食說明 粗蛋白(％) 21.50 20.00 豬消化能(kcal/kg) 3380 3320 緒淨能量(kcal/kg) 2270 2230 鈣(％) 0.80 0.75 可消化之磷(％) 0.40 0.35 鈉(〇/〇) 0.20 0.20 可消化之離胺酸(％) 1.23 1.14 可消化之曱硫胺酸(％) 0.49 0.44 可消化之甲硫胺酸+半胱胺酸(％) 0.74 0.68 可消化之蘇胺酸(°/〇) 0.80 0.74 僅舉例而言，用於生長豬/肥育豬之飼料原料可包含下 表中所列舉成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表 I61722.doc -56- 201234978 示： 成份 生長豬/肥育豬(％) 玉米 27.5 大豆粉，48% CP 15.4 玉米DDGS 20.0 小麥糖 11.1 粳米糠 12.0 芸苔種子粉 10.0 石灰石 1.6 磷酸氫鈣 0.01 鹽 0.4 豬維生素及微礦物質 0.3 離胺酸-HC1 0.2 植物油 0.5 僅舉例而言，生長豬/肥育豬之飲食說明可如下表中所 述： 飲食說明 粗蛋白(％) 22.60 豬代謝能(kcal/kg) 3030 鈣(％) 0.75 可用磷(％) 0.29 可消化之離胺酸(％) 1.01 可消化之曱硫胺酸+半胱胺酸(％) 0.73 可消化之蘇胺酸(％) 0.66 161722.doc -57- 201234978 形式 本發明之飼料添加劑组合物及甘几 齊j澉〇物及其他組份及/或包含其之 飼料原料可以任一適宜形式使用。 本發明之飼料添加劑組合物可以固體或液體製劑或其替 代形式使用。固體製劑之實例包括粉劑、膏糊、大丸劑、 膠囊、丸粒、錠劑、粉末及顆粒，其可潤濕'喷霧乾燥或 ㈣㈣。液體製劑之實例包括但不限於水性、有機或水 性-有機溶液、懸浮液及乳液。 在一些應用中，本發明之DFM或飼料添加劑組合物可與 飼料混合或投與飲用水中。在一個實施例中，納入水中之 劑量範圍係約lxl〇3 CFU/動物/天至約ΐχΐ〇1〇 cfu/動物/ 天’且更佳約lxl〇7 CFU/動物/天。 適宜形式之實例包括以下中之一或多者：粉劑、膏糊、 大丸劑、丸粒、錠劑、藥丸、膠囊、陰道栓劑、溶液或懸 浮液’其可含有矯味劑或著色劑，其用於直接釋放、延遲 釋放、改良釋放、持續釋放、脈衝釋放或受控釋放施加。 舉例而言，若本發明之組合物以固體（例如製丸）形式使 用’則其亦可含有以下中之一或多者：賦形劑，例如微晶 孅· '維素 '乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣及甘胺酸； 崩解劑’例如澱粉（較佳玉米、馬鈴薯或木薯澱粉）、澱粉 -乙醇酸鈉、交聯羧曱基纖維素鈉及某些複合矽酸鹽；製粒 黏0劑’例如聚乙烯°比洛咬酮、經丙基甲基纖維素 (HPMC)、羥丙基纖維素（Hpc)、嚴糖、明勝及阿拉伯膠 (acacia);潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油山茶酸 161722.doc • 58 - 201234978 酯及滑石粉。 用:製備該等形式之營養上可接受之載劑的實例包括 。-水、鹽溶液、醇、聚矽氧、蠟、石油膠、植物油、 Λ —醇、丙二醇、脂質體、糖、明膠、乳糖、直鏈澱 ;更月曰&鎂、滑石粉、表面活性劑、石夕酸、點性石鐵、 香水油、脂肪酸甘油單醋及甘油二醋、石油喊 (petroethrai)月旨肪酸酯、甲基·纖維素、聚乙稀料咬酮 及諸如此類。 用於該等形式之較佳賦形劑包括乳糖、澱粉、纖維素、 奶糖或高分子量聚乙二醇。 對於水性懸浮液及/或酏劑而言’可合併本發明之組合 物與各種甜味劑或橋味劑、著色物質或染料、乳化劑及/ 或懸浮劑及稀釋劑（例如水、丙二醇及甘油）及其組合。 經常使用不吸水乳清作為DFM(尤其細菌DFM)<載劑且 其係開始生長之良好介質。 含有細菌DFM之膏糊可與植物油及惰性膠凝成份調配在 一起。 真菌產品可與作為載劑之榖物副產品調配在一起 在一個實施例中，較佳地，本發明之飼料添加劑組合物 並不呈微粒系統（例如W02005/123034中教示之微粒系 形式。 統） 給予 一次 本發明之DFM及/或飼料添加劑組合物可經設計以 給予或可經設計以每日計飼餵。 161722.doc •59- 201234978 欲用於本發明組合中之組合物（及其中之每一組份）之最 佳量將取決於欲處理之產品及/或產品與組合物之接觸方 法及/或其預期用途。 用於組合物中之DFM及酶之量應為該足夠量可有效且仍 足夠有效改良飼餵含有該組合物之飼料產品之動物的性 能。此有效之時間長度應延長至至少採用該產品（例如飼 料添加劑組合物或含有其之飼料）之時間。 飼料中之DFM與每一酶之比率可在下文給出之範圍内： DFM :植酸酶（CFU/FTU):範圍為 5.0xl02 CFU DFM : 1 卩丁1；酶至5.0><109€?1；:1?7'1；酶；較佳範圍為7.5><104€?1； DFM ： 1 FTU酶至 2.5xl07 CFU : 1 FTU酶》 在一個實施例中，較佳地，飼料原料包含以下物質： 植酸酶，至少500 FTU/kg飼料；及
Enviva Pro®(DFM)，75,000 CFU/g 至 150,000 CFU/g飼 料。 在一個實施例中，較佳地，飼料原料包含以下物質： 植酸酶，500 FTU/kg飼料；及
Enviva Pro®(DFM)，75,000 CFU/g 至 150,000 CFU/g飼 料。 在另一實施例中，飼料原料包含以下物質： 植酸酶，625 FTU/kg飼料；及
Enviva Pro®(DFM)，37,500 CFU/g 至 75,000 CFU/g 飼 料。 在一較佳實施例中，飼料添加劑組合物包含足夠給予飼 I61722.doc •60· 201234978 料原料之酶及dfm，如下所述： 植酸酶’ 500 FTU/kg飼料；及
Enviva Pro®(DFM) , 75,000 CFU/g J. 150,000 CFU/g#] 料。 在一較佳實施例中，飼料添加劑組合物包含足夠給予飼 料原料之酶及DFM，如下所述： 植酸酶，500 FTU/kg飼料；及
Enviva pro®(DFM)，37 5〇〇 cFu/g 至 75,000 CFU/g 飼 料。 ’ 該4較佳實施例中所列舉之Enviva Pro®可由本文所教 示之其他DFM替代。 較佳地，該等較佳實施例中所列舉之植酸酶包含具有植 酸酶活性之多肽，該多肽選自由以下組成之群：（a)具有與 以下序列具有至少7〇Q/〇、較佳地至少80%、更佳地至少 90%、甚至更佳地至少98.6% —致性之胺基酸序列之多 肽：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸 23-433及 / 或 (ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No· 2之成熟多肽部分，及/或 (iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及/或（vi) SEQ ID No. 10 ; (b)包含以下序 列中之一或多個胺基酸之缺失、插入及/或保守取代之變 體：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2之胺基酸 23-433 及/或 (ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/或 (iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（v〇 SEQ ID No. 10 ;及 /或（c)以下序 161722.doc -61 - 201234978 列之片段：（i) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之胺基酸23-433及/或（ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No· 2之成熟多肽部 分，及 /或（iii) SEQ ID No· 7，及/或（iv) SEQ ID No. 5，及 / 或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 10。 較佳地，該等較佳實施例中所列舉之植酸酶係酶 Ronozyme HiPhosT1 具有與 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸23-433具有至少98.6%—致性之胺基酸。 在一較佳組合中，飼料添加劑組合物包含如下植酸酶與 DFM之組合：其係酶Ronozyme HiPhosTM*具有與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2之胺基酸23-433具有至少98.6%—致 性之胺基酸，較佳地，該DFM選自由以下組成之群： Enviva Pro®、Calsporin®、Clostat®、Gallipro®、 GalliproMax® 、 Gallipro®Tect® 、 Poultry star® 、 Protexin® 、Proflora® 、Ecobiol® 、Ecobiol® Plus 、 Fortiflora®、BioPlus2B®、Lactiferm®、CSI®、Yea-Sacc®、Biomin IMB52®、Biomin C5®、Biacton®、Oralin E1707® 、Probios-pioneer PDFM® 、Sorbiflore® 、
Animavit®、Bonvital®、Levucell SB 20®、Levucell SC 0 & SC10®、ME Bactocell ActiSaf®(先前稱作 BioSaf®)、 Miya-Gold®、Fecinor、Fecinor Plus®»、InteSwine®、 BioSprint®、Provita®、PepSoyGen-C®、Toyocerin® 及 TOYOCERIN®。
在一個實施例中，飼料添加劑組合物包含如下植酸酶與 DFM之組合：其係酶Ronozyme 11丨？11〇81^1或具有與SEQ ID !61722.doc -62- 201234978
No. 1或SEQ ID No. 2之胺基酸23_433具有至少98 6% 一致 性之胺基酸，較佳地，該DFM係選自由以下組成之屬之細 菌.礼桿菌、乳球菌、鏈球菌、芽孢桿菌、片球菌、腸球 菌、明_球菌、肉桿菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌及巨 球形菌及其組合。飼料添加劑組合物包含如下植酸酶與 DFM之組σ •其係扭R〇n〇Zyme Hiph〇STM或具有與seq ID No. 1或SEQ ID No. 2之胺基酸23-433具有至少98.6%—致 性之胺基酸，較佳地，該DFM係選自由來自以下一或多種 菌種之細菌組成之群：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解 澱粉芽孢桿菌、屎腸球菌、腸球菌屬、及片球菌屬、乳桿 菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、雷特氏乳 球菌、兩歧雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌、特氏丙酸桿菌、香 腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、埃氏巨球形菌、丁酸梭菌、動 物雙歧桿菌屬、羅伊氏乳桿菌、臘狀芽孢桿菌、唾液乳桿 菌屬、丙酸桿菌屬及其組合。 在一較佳組合_，飼料添加劑組合物包含植酸酶與DFM 之組合，該植酸酶可源自、較佳地源自選自由以下組成之 群之檸檬酸桿菌細菌··布氏檸檬酸桿菌（例如布氏檸檬酸 桿菌ATCC 5 1113)、弗氏檸檬酸桿菌（例如弗氏檸檬酸桿菌 NCIMB 41247)、無丙二酸檸檬酸桿菌（例如無丙二酸檸檬 酸桿菌ATCC 25405或無丙二酸檸檬酸桿菌ATCC 254〇7)、 吉氏檸檬酸桿菌（例如吉氏檸檬酸桿菌DSM丨3694)、中間 擰檬酸桿菌、柯瑟氏檸檬酸桿菌、鼠類檸檬酸桿菌、齧齒 類檸檬酸桿菌、塞拉克氏檸檬酸桿菌、沃克曼氏擰檬酸桿 161722，doc •63· 201234978 菌及楊葛氏檸檬酸桿菌，該DFM選自由以下組成之群： Enviva Pro® 、 Calsporin® 、Clostat® 、Gallipro® 、 GalliproMax® 、 Gallipro®Tect® 、 Poultry star® 、 Protexin® 、Proflora® 、Ecobiol® 、Ecobiol® Plus 、 Fortiflora®、BioPlus2B®、Lactiferm®、CSI®、Yea-Sacc®、Biomin IMB52®、Biomin C5®、Biacton®、Oralin E1707® 、 Probios-pioneer PDFM® 、 Sorbiflore® 、
Animavit®、Bonvital®、Levucell SB 20®、Levucell SC 0 & SC10®、ME Bactocell ActiSaf®(先前稱作 BioSaf®)、 Miya-Gold®、Fecinor、Fecinor Plus®、InteSwine®、 BioSprint®、Provita®、PepSoyGen-C®、Toyocerin® 及 TOYOCERIN®。 與其他組份之組合 用於本發明中之DFM及酶可與其他組份組合使用。因 此，本發明亦係關於組合。DFM與檸檬酸桿菌植酸酶（例 如布氏檸檬酸桿菌植酸酶或弗氏檸檬酸桿菌植酸酶）之組 合在本文中可稱作「本發明之飼料添加劑組合物」。 本發明之組合包含本發明之飼料添加劑組合物（或其一 或多種成份）及適於動物攝取且能夠為攝取者提供醫學或 生理學益處之另一組份。 在一個實施例中，「另一組份」可為一或多種其他飼料 酶。 用於本發明中之適宜額外酶可為選自由以下組成之群的 酶中之一或多者：澱粉酶、木聚糖酶及/或蛋白酶。 161722.doc •64· 201234978 在一個實施例中，較佳地，該「另一組份」並非又一酶 或又一 DFM。 該等組份可為益菌素。益菌素通常係不在上消化道中降 解或吸收之非消化性碳水化合物（寡糖或多糖）或糖醇。用 於商業產品中且根據本發明有用之已知益菌素包括菊粉 (果-寡糖或FOS)及反式半乳-寡糖（GOS或TOS)。適宜益菌 素包括帕拉金糖寡糖（palatin〇seoligosaccharide)、大豆寡 糖、海藻酸鹽、黃原膠、果膠、刺槐豆膠（LBG)、菊粉、 瓜爾豆膠、半乳-寡糖（G〇S)、果_募糖（F〇S)、不可降解之 版粉、乳蔗糖（lact〇saccharose)、乳果糖、拉克替醇、麥芽 糖醇、麥芽糊精、聚右旋糖（即Litesse®)、拉克替醇、乳 蔗糖（lactosucrose)、大豆寡糖、帕拉金糖、異麥芽·寡糖、 葡糖-寡糖及木·寡糖、果膠片段、飲食纖維、甘露聚糖·寡 糖。 飲食纖.准可包括非澱粉多糖（例如阿拉伯糖木聚糖）、纖 維素及許多其他植物組份，例如抗性糊精、菊粉、木質 素、蠛、曱殼質、果膠、β·葡聚糖及寡糖。 在一個實施例中，本發明係關於本發明之飼料添加劑組 合物（或一或多種其成份）與益菌素之組合。在另一實施例 中’本發明係關於包含職與檸檬酸桿菌植酸酶及益菌素 之組合（或基本上由其組成或由其組成）之飼料添加劑組合 物。 益菌素可與本發明之飼料添加劑組合物（或其成份）同時 (例如，與其-起之混合物或藉由相同或不同路徑同時遞 161722.doc • 65 - 201234978 送）或在其之後（例如藉由相同或不同路徑）投與。 本發明之組合之其他組份包括聚右旋糖（例如Litesse®) 及/或麥芽糊精及/或拉克替醇。可視情況將該等其他組份 添加至飼料添加劑組合物中以輔助乾燥過程並有助於DFM 存活。 其他適宜組份之其他實例包括以下中之一或多者：增稠 劑、膠凝劑、乳化劑、黏合劑、晶體改良劑、甜味劑(包 括人造甜味劑）、流變性改良劑、穩定劑、抗氧化劑、染 料酶冑劑、媒劑、賦形劑、稀釋劑、潤滑劑、橋味 劑著色物質、懸浮劑、崩解劑、製粒黏合劑等。該等其 他、、且伤可為天然組份。該等其他組份可藉由使用化學及， 或酶技術製得。 在一個實施例中，可囊封DFM& /或酶。在一個實施例 中’將飼料添加劑組合物及/或DFM及/或酶調配成乾粉或 顆粒’如W〇2007/044968中所述（稱作τρτ顆粒）該參考文 獻以引用方式併入本文令。 在個較佳貫施例巾，用於本發明中之及/或酶可 與一或多種脂質組合使用。 /例而言’用於本發明中之DFM及/或酶可與—或多種 脂質膠粒組合使用。脂質膠粒可為簡單脂質膠粒或複雜脂 質之定向分子之聚集物，例如脂質 脂質膠粒可為兩性物 及/或油。 本文所用術語「增稠或膠凝劑」係指藉由減緩或防止粒 161722.doc -66· 201234978 子（不可混溶液滴、空氣或不溶性固體）運動而防止分離之 產品。在發生增稠時，個別水合分子致使黏度增加，從而 減緩刀離。在發生膠凝時，水合分子連接形成捕獲粒子之 二維網絡，藉此使該等粒子固定。 本文所用術語「穩定劑」係定義為保持產品(例如飼料 產品)免於隨時間流逝而變化之成份或成份之組合。 本文所用術語「乳化劑」係指防止乳液分離之成份（例 如飼料成份)。札液係兩種不混溶物質，一種以小滴形式 存在，包含於另一者中。乳液可由水中之油（其中小滴^ 分散相係油且連續相係水）或油中之水（其中水變為分散相 且連續相係油）組成。亦可經由使用乳化劑使發泡體（盆係 液體中之氣體）及_液（其係液财之關）穩定。 本文所用術語「黏合劑」係指經由物理或化學反應將產 品結合在一起之成份（例如飼料成份）。例如，在「膠凝」 期間，水被吸收，從而提供結合效應。然而，黏合劑可‘ 收其他液體(例如油），從而將其保持在產品中。在本發明 上下文中，黏合劑通常可用於固體或低水分產品（例如拱 烤產品：麵粉糕餅、炸麵包圈、麵包及其他產品)中。 「載劑」&「媒劑」意指適於投與DFM及/或酶之材料 且包括業内已知之任何該材料’例如任何液體、凝膠、溶 劑、液體稀釋劑、穩定劑或諸如此類，其無毒且並不以有 害方式與組合物之任何組份相互作用。 本發明提供製備飼料添加劑組合物之方法，其包含混合 DFM及擰檬酸桿菌植酸酶與至少一種選自 161722.doc -67- 201234978 者之生理學上可接受之載劑.麥$糊精、石灰石（碳酸 鈣）、環糊精、小麥或小麥組份、廉糖、澱粉、Na2S〇4、 滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸鹽、山梨酸酯、甘油、蔗 糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、對羥基苯甲酸酯、氣 化鈉、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸醋、鈣、偏亞硫酸氫鹽、 甲酸鹽及其混合物。 賦形劑之實例包括以下中之一或多者：微晶纖維素及其 他纖維素、乳糖、#檬酸納、碳酸約、鱗酸氫約、甘胺 酸、澱:粉、奶糖及高分子量聚乙二醇。 崩解劑之實例包括以下中之一或多者：澱粉（較佳玉 米、馬鈴薯或木薯澱粉）、澱粉乙醇酸鈉、交聯缓甲基纖 維素鈉及某些複合矽酸鹽。 製粒黏合劑之實例包括以下中之一或多者：聚乙稀。比〇各 啶酮、羥丙基甲基纖維素（HPMC)、羥丙基纖維素（Hpc)' 蔗糖、麥芽糖、明膠及阿拉伯膠。 潤滑劑之實例包括以下中之一或多者：硬脂酸鎂、硬脂 酸、甘油山茶酸酯及滑石粉。 曰 稀釋劑之實例包括以下中一 「τ夂一或多者.水、乙醇、丙二 醇及甘油及其組合。 一 其他組份可同時使用（例如，
同路徑遞送）。 ，在其混合在一起時或甚至 ^序使用（例如，其可藉由不
161722.doc 加劑組合物與另一組份混合 -68 - 201234978 在一個實施例中，較佳地， 不包含鉻或有機鉻。 在一個實施例中，較佳地， 葡聚糖酶。 在一個實施例中，較佳地， 山梨酸。 濃縮物 本發明之飼料添加劑組合物 本發明之飼料添加劑不含有 本發明之飼料添加劑不含有 用於本發明中之DFM可呈濃縮物形式。該等濃縮物通常 包含相當尚遭度之DFM。 本發明之飼料添加劑組合物所具有活細胞之含量(菌落 形成單位，CFU)可在至少1〇4 CFU/g(適宜地包括至少1〇5 CFU/g ’例如至少1〇6 CFU/g，例如至少i〇7 cFu/g，至少 1〇8 CFU/g)至約 1Gl。CFU/g(或甚至約 1G11 咖/§或約1〇12 CFU/g)範圍内。 在DFM呈濃縮物形式時’本發明之飼料添加劑組合物所 具有活細胞之含量可在$ φ ] η9 ρϋττ , ,, Κ 3里』牡主夕1〇 CFU/g至約1〇12 CFu/g、較 佳至少1010 CFU/g至約10u CFU/g範圍内。 呈濃縮物形式之粉劑、顆粒及液體組合物可經水稀釋或 再懸浮於水或其他適宜稀釋劑（例如適當生長培養基，例 如乳製品或礦物質或植物油）中，從而產生準備好使用之 組合物。 可根據業内已知方法製備呈濃縮物形式之本發明之Dm 或鈞料添加劑組合物或本發明之組合。 在本發明之一個態樣中，由呈、;費 田至/晨縮形式之組合物接觸酶 161722.doc •69· 201234978 或飼料。 可藉由業内已知之方法崎逸私逆 力去嗔霧乾燥或冷凍乾燥本發明之組 合物。 使用喷霧乾燥方法製借柄工+ & 教備粒子之典型方法涉及溶解於適當 ^ t # m體材料（例& ’發酵培養基中之之培養 )或者彳將材料懸浮或乳化於非溶劑中以形成懸浮 液或乳液。可視情況在此階段添加其他成份（如上文所論 述）或诸如抗微生物劑、籍々力丨 穩疋劑、染料及輔助乾燥過程之 試劑等組份。 隨後使溶液霧化以形成微細液滴。小滴立刻進入乾燥室 中其中其接觸乾燥氣體。將溶劑自小滴蒸發至㈣氣體 中以固化小滴’由此形成粒子。隨後自乾燥氣體分離粒子 並收集》 個體 本文所用術語「個體」意指欲投與或已投與本發明之飼 料添加劑組合物或包含本發明之該飼料添加劑組合物之飼 料原料的動物。 本文所用術語「個體」意指動物。較佳地，個體係哺乳 動物、烏、魚或甲殼類動物，包括（例如）家畜或馴養動物 (例如寵物）。 在一個實施例中，「個體」係家畜。 本文所用術s吾「豕畜」係指任何農場動物。較佳地，家 畜係以下中之一或多者：母牛或公牛（包括牛犢）、家禽、 豬（包括仔豬）、家禽（包括肉雞、雞及火雞）、鳥、魚（包括 161722.doc •70· 201234978 淡水魚(例如鮭魚、鳕魚、鱒魚及鯉魚(例如 海水魚(例如黑鱸))、甲殼類動物(例如 ？魚))、及 馬（包括_、料（包括㈣。 、°、及扇貝）、 雞在一個實施例中，術語家畜及/或家禽及/或雞不包括蛋 在另—實施例中， 動物園環境中之動物 個體」係馴養動物或寵物或維持於 本文所用術語「馴養動物或寵物或維持於動物園環境中 之動物」係指任何相關動物，包括犬科動物（例如狗貓 科動物（例如貓）' 齧齒類動物（例如豚鼠、大氣、小鼠） 鳥、魚（包括淡水魚及海水魚）及馬。 在一個實施例中，個體可受腸病原體攻毒。 舉例而言，個體之腸或消化道中可存在一或多種腸病原 體。舉例而言，個體之腸或消化道中具有之—或多種腸病 原體的量係如下： ’ i)導致動物之性能損失及/或 Π)係臨床相關量；或 iii)係床無症狀量。 腸病原體可為（例如）產氣莢膜梭菌。 性能 本文所用「動物性能」可藉由以下測定：動物之飼料效 率及/或重量增加及/或飼料轉化率及/或飼料中之營養素之 消化率（例如胺基酸消化率）及/或飼料中之消化能或代謝能 及/或氮保留量及/或動物避免壞死性腸炎之負面影響之能 161722.doc -71 - 201234978 力及/或個體之免疫反應。 較佳地，「動物性能」係藉由動物之飼料效率及/或重量 增加及/或飼料轉化率測定。 改良之動物性能」意指與不包含本發明之飼料添加劑 組合物之飼料相比，由於使用該飼料添加劑組合物，個體 中之飼料效率增加及/或重量增加增大及/或飼料轉化率降 低及/或飼料中之營養素或能量之消化率改良及/或氮保留 量改良及/或避免壞死性腸炎之負面影響之能力改良及/或 免疫反應改良。 較佳地’「改良之動物性能」意指飼料效率增加及/或重 量增加增大及/或飼料轉化率降低。 本文所用術語「飼料效率」係指在-段時間期間隨意飼 傲動物或對其飼飯指定量之食物時動物中發生之重量增加 增加之飼料效率」意指在飼料中使用本發明之飼料添 加劑：合物與不存在該飼料添加劑組合物下飼飯之動物相 比母單位攝取飼料之增加之重量增加。 飼料轉化率（FCR) 本文所用術語「飼料轉化率」係指使動物重量增加指定 量之飼银給動物之飼料量。 改良之飼料轉化率意指較低飼料轉化率。 「較低飼料轉化率」或「改良之飼料轉 添加劑組合物導致動物達到所指定體重-動物之飼料量低於該飼料在不包含該飼料 161722.doc -72- 201234978 添加劑組合物時使動物達到相同體重增加量時所需之 量。 料 營養素消化率 本文所用營養素消化率意指自胃腸道或胃腸道之指定區 段（例如小腸）消失之營養素的部分。營養素消化率可量= 為所投與個體與個體糞便中見者之間之差、或所投與個 體/、保留在月腸道之指定區段(例如回腸)上之消化物之 之差。 本文所用營養素消化率可如下量測：在一段時間期間收 集總排泄物，量測所攝取營養素與所排泄營養素之間之 差，或利用不會被動物吸收的惰性標記，容許研究者計算 在整個胃腸道或胃腸道區段中消失之營養素之量。該惰性 標記可為：氧化鈦、氧化鉻或不溶於酸之灰。消化率可採 用佔飼料中營養素之茗分比表示，或採用可消化營養素之 質量單位/飼料中營養素質量單位表示。 本文所用營養素消化率涵蓋殿粉消化率、脂肪消化率、 蛋白質✓肖化率及胺基酸消化率。 本文所用此量/肖化率意指所攝取飼料之總能量減去糞便 之總此里或所攝取飼料之總能量減去動物胃腸道之指定區 段（例如回腸）上剩餘消化物的總能量，本文所用代謝能係 才曰表觀代身追且意指所攝取飼料之總能量減去糞便、尿、 及氣態消化產物巾含有之總能量。可由所攝取總能量與翼 便或胃腸道之指定區段巾所存在消化物巾排泄之總能量之 間的差量測能量消化率及代謝能，其係使用與量測營養素 161722.doc -73- 201234978 針對氮排泄適當校正以計算飼料之 之消化率相同之方法 代謝能。 氮保留量 本=用iu呆留量意指個體自飲食保留氮作為體重之能 排泄超過每日攝取時發生負性氮平衡且在損失 肌肉時經常觀察到諸氮平衡。正性氮平衡經常與（尤其） 正生長動物中之肌肉生長相關。 兵) 段時間期間排泄物及尿之總收集量 氮之間之差。應瞭解，所排泄氮包 白質、内源性蛋白質性排泄物、微 氮保留量可借助在一 測為所攝取氮與所排泄 括來自飼料之未消化蛋 生物蛋白質及尿氮。 存活率 本文所用術語存活率會指# 蒽知保持活者之個體之數量。術語 改良之存活率I可為 午」了為降低之死亡率」之另一表達方 式。 暑宰率及產肉率 :文所用術5吾屠宰率意指在商業或實驗屠宰過程後屠體 之里，W活的體重之比例表示。術語㈣意指屠宰用於食 物之動物體’移除頭、臟腑、四肢之部分及羽毛或皮膚。 本文所用術語產肉率意指以活體重之比例表示之食用肉之 量、或以活體重之比例表示之指定肉塊之量。 重量增加 本發明進一步提供增加個體（例如家禽或猪）之重量增加 之方法1包含向該個體純包含本發明之飼料添加劑組 161722.doc 201234978 合物之飼料原料。 「增加之重量增加」係指動物在飼餵包含飼料添加劑組 合物之飼料時與飼餵不存在該飼料添加劑組合物之飼料的 動物相比體重增加。 壞死性腸炎 壞死性腸炎係在世界範圍内在雞、火雞及鴨中觀察到之 急性或慢性腸毒血症，其係由產氣莢膜梭菌引起。壞死性 腸炎之特徵經常在於通常中段小腸之纖維素性壞死性腸 炎。死亡率可為5°/。至50°/。，通常約丨0%。藉由糞便-口傳播 發生感染。致病有機體之孢子抗性極高。誘病因素包括球 蟲病（C〇CCidi〇sis/coccidiasis)、飲食（高蛋白）、在鴨中可能 為重應力、高黏度飲食（經常與飲食中之高黑麥及小麥納 入相關）、污染飼料及/或水、其他衰竭性疾病。 本發明係關於增加個體對壞死性腸炎之抗性之方法。換 言之，本發明係關於避免或減輕壞死性腸炎之負面影響。 本文所用術語「抗性」可涵蓋術語「耐受性」。因此， 在-個實施例中，個體可對壞死性腸炎無抗性但個體可能 夠耐受壞死性腸炎，即對個體之性能無負面影響。 在一個實施例中，本發明係關於本發明之飼料添加劑組 合物，其用於治療或預防個體之壞死性腸炎。個體通常可 為已由或將由產氣笑膜梭菌及/或艾美蟲屬（Eimeria)攻毒 者。該攻毒可來自環境，或在飼料或飲用水中活的微生物 之施加’（例如）此時使用活的球蟲疫苗。 在另一實施例中，本發明係關於飼料添加劑組合物，其 16I722.doc •75- 201234978 用於預防及/或治療個體之球蟲病。 本發明又進一步提供預防及/或治療壞死性腸炎及/或球 蟲病之方法，其中向個體投與有效量之本發明之飼料添加 劑組合物。 免疫反應 本文所用免疫反應意指以下多個方式中之一者：其中 DFM調節動物之免疫系統，包括增加抗體產生、上調細胞 調介之免疫、上調促發炎細胞因子及增加類鐸（toll_Uke)受 體信號傳導。應瞭解，由DFM對胃腸道進行免疫刺激可有 利於保護宿主抵抗疾病，且對胃腸道進行免疫抑制可對宿 主有利，此乃因使用較少營養素及能量來支持免疫功能。 較佳地，免疫反應係細胞免疫反應。 較佳地，藉由觀察免疫標記量測免疫反應。 益生菌 對於一些應用而言，據信本發明組合物中之可發揮 益生菌培養物效應。向本發明組合物中進一步添加益生菌 及/或益菌素亦在本發明之範圍内。 此處，益菌素係： 非消化性食物成份，其藉由選擇性刺激一種或限制數 量之有益細菌之生長及/或活性有利地影響宿主」。 本文所用術語「益生菌培養物」定義活的微生物（例 如’包括細菌或酵母）’其在（例如）以足夠數量攝入或局部 施加時有利地影響宿主有機 或多種可證實之健康益處。 體’即藉由賦予宿主有機體一 益生菌可改良一或多種黏膜表 161722.doc -76- 201234978 面中之微生物平衡。舉例而言，黏膜表面可為腸、尿道、 呼吸道或皮膚。本文所用術語「益生菌」亦涵蓋活微生 物，其可刺激免疫系統之有益分枝且同時減少黏膜表面 (例如腸）中之發炎反應。 儘管益生菌攝取無下限或上限，但已表明，至少1〇6_ 10較佳至少1〇6_1〇1<)、較佳108-109 cfu作為日劑量將可 在個體中有效達成有益健康效應。 分離 在個態樣中，適宜地，本發明中使用之酶或dfm可呈 分離形式。術語「分離」意指酶或DFM至少實質上不含至 少—種其他組份，該組份與酶或1)1?]^天然結合且存於自然 界中。本發明之酶或DFM可以實質上不含一或多種污染物 之形式提供，該等污染物可能原本與物質結合。因此，例 女其可貫質上不含一或多種潛在污染多肽及/或核酸分 子。 純化 在個態樣中，較佳地，本發明之酶及/或DFM係呈純 化形式。術#「純化」意指酶及/或dfm係以高含量存 在酶及/或DFM合意地係组合％中存在之主要組份。較 佳地，其係以至少約90%、或至少約95%或至少約98%之 含量存在，該含量係基於所考慮總組合物之乾重/乾重來 測定。 在本發明fe圍内設想可組合本發明之實施例以使本發明 範圍内包括本文所述特徵中之任_者之組合。具體而言， 161722.doc -77· 201234978 在本發明範圍内設想可同時展現細菌之治療效應中之任一 者。 核苷酸序列 本發明之範圍涵蓋編碼具有如本文所定義特定性質之蛋 白質之核苷酸序列。 本文所用術語「核苷酸序列」係指寡核苷酸序列或多核 苷酸序列、及其變體、同源物、片段及衍生物（例如其部 分）。核苷酸序列可具有基因組或合成或重組起源，其不 管是否代表有義或反義鏈均可為雙鏈或單鍵。 與本發明相關之術語「核苷酸序列」包括基因組DNa、 cDNA、合成DNA及RNA。較佳地，其意指編碼本發明之 DNA、更佳cDNA序列。 在-較佳實施例巾’與本發明之本身範圍相關或涵蓋於 該範圍中之核普酸序列不包括本發明之如下天然核普酸序 列·處於其自，然環境中或與其亦處於天然環境中之天然結 合序列連接。為易於參考，應將此較佳實施例稱作「非天 然核苷馱序列」。就此而言，術語「天然核苷酸序列」3 才曰處於其天然&境中且以可操作地方式與整個啟動子㈠ 與該核皆酸序列天妙纟士 、、* 4* ^ J太然σ )連接之整個核苷酸序列，該启 動子亦處於其天然壞境巾。然而，由本發明之範圍涵蓋』 胺基I序歹！可在核苷酸序列在其天然有機體中表現後加上 刀離及/或純化。然而，較佳地，由本發明之範圍涵蓋： 胺基I序列可由其天然有機體中之核#酸序列表現，但; 中核苦酸序列並不在啟動子之㈣下，在該有機體内該i 161722.doc •78- 201234978 動子與核苷酸序列結合。 通常使用重組DNA技術（即重組DNA)製備由本發明之範 圍涵蕙之核苷酸序列。然而，在本發明之替代實施例中， 可使用業内熟知之化學方法整體或部分合成核苷酸序列 (參見 Caruthers MH等人，（1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 及 Horn T 等人，（1980) Nuc Res Symp 〜 225-232) ° 核苷酸序列之製備 編碼具有如本文所定義特定性質之蛋白質或適於改質之 蛋白質之核苷酸序列可自產生該蛋白質之任何細胞或有機 體鑑別及/或分離及/或純化而來。業内已熟知用於鑑別及/ 或分離及/或純化核苷酸序列之各種方法。舉例而言，一 旦已鑑別及/或分離及/或純化適宜序列，則可使用PC R擴 增技術製備更多序列。 進一步舉例而言，可使用產生酶之有機體之染色體DNa 或信使RNA構建基因組DNA及/或cDNA庫。若已知酶之胺 基酸序列’則可合成經標記寡核苷酸探針且使用其從自有 機體製備之基因組庫鑑別編碼酶之純系。或者，可使用含 有與另一已知酶基因同源之序列之經標記募核苷酸探針鑑 別編碼酶之純系。在後一情形下，使用嚴格性較低之雜交 及洗滌條件。 或者’可藉由將基因組DNA之片段插入表現載體（例如 質粒）中、用所得基因組DN A庫轉化酶陰性細菌，且隨後 將所轉化細菌平鋪於含有酶之基質（即麥芽糖）之壤脂板上 161722.doc -79· 201234978 來鑑別編碼酶之純系，由此鑑別表現該酶之純系。 在又一替代實施例中，可藉由已確立標準方法（例如， 由 Beucage S.L.專人，（1981) Tetrahedron Letters 22，第 1859至1869頁闡述之亞磷醯胺方法，或由Mauhes等人， (1984) EMBO J. 3，第801至805頁闡述之方法）以合成方式 製備編碼酶之核苷酸序列。在亞磷醯胺方法中，在（例如） 自動DNA合成器中合成募核苷酸，對其進行純化，退火， 連接並在適當載體中選殖。 核苷酸序列可具有混合基因組及合成起源、混合合成及 cDNA起源、或混合基因組及CDNA起源，其係藉由根據標 準技術連接合成、基因組或cDNA起源（若適當）之片段製 得。每一連接片段對應於整個核苷酸序列之不同部分。 DNA序列亦可使用特定引物藉由聚合酶鏈反應（pcR)製 得，如（例如）US 4,683,202或 Saiki R K等人（Science (1988) 239，第487至491頁）中所述。 胺基酸序列 本發明之範圍亦涵蓋具有如本文所定義特定性質之酶的 胺基酸序列。 本文所用術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術 語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」 與術語「肽」同義》在一些情況下，術語「胺基酸序列」 與術語「酶」同義。 胺基酸序列可自適宜來源製備/分離，或其可以合成方 式製得或其可藉由使用重組DNA技術製備。 161722.doc • 80 - 201234978 本發明中涵蓋之蛋白質可與其他蛋白質（尤其酶）結合使 用。因此’本發明亦涵蓋蛋白質之組合，其中該組合包含 本發明之蛋白質/酶及可為本發明之另一蛋白質/酶之另一 蛋白質/酶。 較佳地’與本發明之本身範圍相關時及涵蓋於該範圍中 之胺基酸序列並非天然酶。就此而言，術語「天然酶」意 指處於其天然環境令且已由其天然核苷酸序列表現之全 酶。 序列一致性或序列同源性 本發明亦涵蓋與具有本文所定義特定性質之多肽的胺基 酸序列或編碼該多肽之任何核苷酸序列具有一定程度之序 列一致性或序列同源性的序列（下文稱作「同源序列」）之 用途。此處，術語「同源」意指與個體胺基酸序列及個體 核苷酸序列具有特定同源性之實體。此處，術語「同源 性」可荨同於「一致性」。 同源胺基酸序列及/或核苷酸序列應提供及/或編碼保留 功能活性及/或增強酶之活性的多肽。 在本發明上下文中，取同源序列包括可與個體序列至少 75%、85%或90%—致、較佳至少95%或98%一致之胺基酸 序列。同源物通常將包含與個體胺基酸序列相同之活性位 點等。儘管亦可根據類似性考慮同源性（即具有類似化學 性質/功能之胺基酸殘基），但在本發明之上下文中，較佳 根據序列一致性表示同源性。 在本發明上下文中，取同源序列包括可與編碼本發明多 161722.doc -81 _ 201234978 肽之核苷酸序列（個體序列）序列至少75%、85%或90%— 致、較佳至少95%或98% —致之核苷酸序列《同源物通常 將包含編碼與個體序列相同之活性位點等之序列。儘管亦 可根據類似性考慮同源性（即具有類似化學性質/功能之胺 基酸殘基）’但在本發明之上下文中，較佳根據序列一致 性表示同源性。 可藉由眼睛或更通常借助易於獲得之序列比較程式實施 同源性比對。該等市售電腦程式可計算兩個或更多個序列 間之同源性％。 可在鄰近序列上計算同源性％，亦即，使一個序列與另 一序列排比且直接比對一個序列中之每一胺基酸與另一序 列中之相應胺基酸，一次一個殘基。此稱作「無空位」排 比。通常僅在相對較少數量之殘基上實施該等無空位排 比。 儘管此係極為簡單且連續之方法，但其無法慮及以下情 況：例如，在原本一致之序列對中，一個插入或缺失將導 致接下來之胺基酸殘基不排比，由此潛在地導致在實施整 體排比時同源性％大幅降低。因&，大多數序列比較方法 經設計以產生最佳排比，其慮及可能之插入及缺失而不會 過度地損害總體同源性^分。此係藉由在序列排比中插入 「空位」以試圖使局部同源性最大化來達成。 然而，該等更複雜方法為排比中出現之每一空位賦予 「空位罰分」，使得對於相同數量之一致胺基酸，具有盡 可能少之空位-反映在兩個比較序列中具有較高相關性_之 161722.doc •82· 201234978 序列排比將達成比具有許多空位者高之評分。通常使用 「仿射性空位成本」，其為空位之存在支付相對較高成本 且為空位中之每一後續殘基支付較小罰分。此係最常用空 位評分系統。高空位罰分當然將產生具有較少空位之最佳 排比。大多數排比程式可改良空位罰分。然而，在使用該 軟體進行序列比較時，較佳使用缺設值。 因此，最大同源性％之計算首先需要產生最佳排比，慮 及空位罰分。適於實施該排比之電腦程式係Vector NTI (111¥丨仃(^611公司）。可實施序列比較之軟體之實例包括但不 限於（例如）BLAST包裝（參見Ausubel等人，1999 Short Protocols in Molecular Biology，第 4版，第 18章）、BLAST 2(參見 FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8Atatiana@ncbi.nlm.nih.gov) ' FASTA(Altschul 等人，1990 J. Mol. Biol· 403-410)及 AlignX。至少BLAST、BLAST 2及FASTA可用於離線及在 線搜尋（參見Ausubel等人，1999，第7-58至7_60頁）。 儘管可根據一致性來量測最終同源性％ ’但排比過程本 身通常並非基於全有或全無（all-or-nothing)成對比較。相 反，通常使用成比例之類似性評分矩陣’其基於化學類似 性或演化距離為每一成對比較賦予評分。常用之該矩陣之 實例係BLOSUM62矩陣-適於程式之BLAST之缺設矩陣。 Vector NTI程式通常使用公共缺設值或自定義符號比較表 (若供應）（關於進一步詳細内容參見用戶手冊）。射於一些 應用而言，較佳使用Vector NTI包裝之缺設值。 161722.doc •83- 201234978 或者，可基於與 CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988)，Gene 73(1)，237-244))類似之算法使用 Vector NTI (Invitrogen公司）中之多重排比特徵計算同源性百分比。 一旦軟體產生最佳排比，則可計算同源性％、較佳序列 一致性％。軟體通常將此作為序列比較之一部分來進行並 生成數值結果。 在測定序列一致性時應使用空位罰分，隨後較佳使用以 下參數進行成對排比： 對於BLAST 空位開放 0 空位延伸 0 對於 CLUSTAL DNA 蛋白質 字大小 2 1 K三元組(K triple) 空位罰分 15 10 空位延伸 6.66 0.1 在一個實施例中，CLUSTAL可與如上文所定義設定之 空位罰分及空位延伸一起使用。 適宜地，在至少20個鄰近核苷酸上、較佳在至少30個鄰 近核苷酸上、較佳在至少40個鄰近核苷酸上、較佳在至少 5 0個鄰近核苷酸上、較佳在至少60個鄰近核苷酸上、較佳 在至少100個鄰近核苷酸上測定關於核苷酸序列之一致性 之程度。 適宜地，可在整個序列上測定關於核苷酸序列之一致性 161722.doc -84- 201234978 之程度。 本發明亦涵蓋與本發明之核酸序列 j立補之序列或能夠與 本發明之序列或與其互補之序列雜交的序列。 本文所用術語「雜交」應包括「核酸鍵經由鹼基對與互 補鏈結合之方法」以及如聚合酶鍵反應（PCR)技術中所實 施之擴增方法。 本發明亦涵蓋能夠與本文所呈現序列互補之序列雜交之 核苷酸序列、或其任何衍生物、片段或衍生物之用途。 術語「變體」亦涵蓋與能夠與本文所呈現核苷酸序列雜 交之序列互補的序列。 較佳地互補序列係彼等在嚴格條件（例如，5 〇。匚及
0-2xSSC UXSSC=(M5 M NaC卜 0.015 Μ檸檬酸三鈉，pH 7.0})下能夠與本文所呈現核苷酸序列雜交者。 更佳地，互補序列係彼等在高度嚴格條件（例如，65<>c 及 O.lxSSC {lxSSC = 0.15 M NaCl，0.015 Μ 檸檬酸三鈉， pH 7.0})下能夠與本文所呈現核苷酸序列雜交者。 在一更佳態樣中，本發明涵蓋可在高度嚴格條件（例如 65°C及O.lxSSC)下與本發明之核苷酸序列或其補體雜交之 核苷酸序列 實例 實例1 方法 161722.doc 85· 201234978 自商業孵化場購買4000只1日齡之Cobb雄性離雞。在研 究開始時，分區（block)向每一處理畜舍分派50只雄性雛 雞，每一處理總共9個畜舍。研究由以下處理組成（表1): 表1.實例1之實驗設計
處理 產氣莢膜 梭菌攻毒 植酸酶 DFM 1 否 無 無 2 是 無 無 3 是 無 芽孢桿菌 DFM1 4 無 乳桿菌DFM2 5 是 Ronozyme P®3 500 FTU/kg 無 6 是 檸檬酸桿菌植酸酶A4 500 FTU/kg 無 7 是 檸檬酸桿菌植酸酶B5 500 FTU/kg 無 8 是 Ronozyme P® 500 FTU/kg 芽孢桿菌DFM 9 檸檬酸桿菌植酸酶A 500 FTU/kg 芽孢桿菌DFM 10 是 檸檬酸桿菌植酸酶B 500 FTU/kg 芽孢桿菌DFM 11 是 Ronozyme P® 500 FTU/kg 乳桿菌DFM 12 是 檸檬酸桿菌植酸酶A 500 FTU/kg 乳桿菌DFM 13 是 擰檬酸桿菌植酸酶B 500 FTU/kg 乳桿菌DFM 161722.doc -86· 201234978 「芽抱桿菌DFM」-係由Danisco Α/S提供之Enviva Pro® (其係枯草芽孢桿菌菌株Bs2084、LSSAOl及15AP4之組合） 且以150,000 CFU/g飼料給予。 「乳桿菌DFM」-係由Danisco Animal Nutrition提供之 Sorbiflore®(其係鼠李糖乳桿菌與香腸乳桿菌之組合）且以 350,000 CFU/g飼料給予》 3 「Ronozyme P®」係來自米麯黴中表現之隔孢伏革菌 (Peniphora lycii)之6-植酸酶-其胺基酸序列在本文中如SEQ ID No· 8所給出（此係「非檸檬酸桿菌」6植酸酶）。 4檸檬酸桿菌植酸酶A-係來自布氏檸檬酸桿菌菌株ATcc 5 1113之6-植酸酶。此酶之胺基酸序列在本文中如SEq id N 〇. 1所給出。 5檸檬酸桿菌植酸酶B-係來自布氏檸檬酸桿菌菌株YH_ i 5 之6-植酸酶。此酶之胺基酸序列在本文中如seq id No. 7 所給出。 在研究開始、第23天、第35天及結束（第42天）時記錄每 一畜舍之鳥重量。畜舍係量測單元。飼餵呈醪液飼料形式 之肉雞飲食。飲食滿足或超過NRC標準（表2)。沖洗混合器 以防止飲食交又污染。使用Davis S-20混合器混合所有處 理飼料。自每一批次開始、中間及結束自每一處理飲食收 集試樣並摻和在一起以確認飼料中之酶活性及Dfm存在 性0 161722.doc • 87 - 201234978 表2.實例1之實驗飲食組成。 成份(％) 雛雞 (第0至21天） 生長難（第 21至35天） 肥育雞（第 35至42天） 玉米 53.62 57.87 59.82 玉米DDGS 10.00 10.00 10.00 大豆粉，49% CP 26.93 23.97 21.36 Ampro 55 5.00 5.00 5.00 大豆油 2.07 0.91 1.74 離胺酸 0.24 0.24 0.24 DL-甲硫胺酸 0.21 0.19 0.18 L-蘇胺酸 0.01 0.01 0.01 ηΛί, 鹽 0.30 0.34 0.35 石灰石 1.04 1.07 0.94 磷酸氫鈣 0.26 0.11 0.02 維生素及痕量礦物質預混 合物 0.33 0.33 0.33 經計算之營養素組成(％) CP 22.60 21.50 20.39 能量，kcal/kg 3060 3025 3100 可消化之離胺酸 1.36 1.26 1.21 可消化之曱硫胺酸 0.58 0.61 0.53 可消化之蘇胺酸 0.83 0.83 0.80 鳥自第0至42天隨意接受適於處理之飼料。用於所有實 驗處理之酶及DFM皆係由Danisco以適當混合物及含量提 供。將畜舍佈置在設備内以防止直接接觸以避免污染。在 161722.doc -88 - 201234978 第21天時自雛雞飲食至生長雞飲食出現變化。在第35天時 用肥育雞飲食替代生長飲食。在每次改變飼料時，分區自 畜舍移除飼餵器，再次稱重，清空並再填充適當處理飲 食°在研究之最後一天對飼料進行稱重。每日針對死亡率 檢查畜舍。在鳥被淘汰或發現死亡時，記錄日期及移出重 量（kg)。對所有死亡或淘汰之鳥實施肉眼屍檢以確定性別 及可能之死亡原因。注意壞死性腸炎之跡象。 所有畜舍均具有約4英吋厚褥草，其具有新鮮松屑之包 被。在將所有鳥放置於畜舍之前用商業球蟲病疫苗 (Coccivac-B)對其進行噴霧疫苗接種。在第18、19及2〇 天’對所有鳥（處理1除外）投與產氣莢膜梭菌之肉湯培養 物。採用已知引起NE且源自商業肉雞操作之產氣莢膜梭 菌之野外分離株作為攻毒有機體。每天使用新鮮接種物。 滴疋量係約1.0 X 1 〇8·9 ^每一畜舍接受相同量之接種物。 藉由混合至管式飼顧器之基底中發現之飼料中來投與接種 物。在第21天，自每一畜舍選擇5只鳥，無痛致死，分組 稱重’並檢驗壞死性腸炎損傷之存在程度。評分係基於〇 至3刀’其中〇係正常且3係最嚴重（〇==無，ι =輕微，2=中 度 ’ 3 =顯著/嚴重；Hofacre等人，2003 J. Appl· Poult. Res. 12: 60-64)。在研究期間不使用伴隨藥物療法。在使用5 mL去離子水稀釋之新鮮試樣（〇.5 g)中且使用組合之玻璃· 參考微電極量測空腸消化物之pH。 試樣收集 在第21天，每次處理使總共8只鳥無痛致死且自每一鳥 161722.doc -89 * 201234978 收集自砂囊下方至回盲腸連接處的總胃腸道並送至實驗室 在冰上過夜。在實驗室中進一步解剖試樣以獲得Meckie憩 室周圍之空腸的20 cm部分；丟棄腸道之剩餘部分。將該 等部分用0.1 %蛋白脒清洗以移除腸内容物並縱向打開以暴 露上皮内層。將該等部分以7.0次衝程/3在99 ml 0.1%蛋白 脒中粉碎60 s以釋放黏膜結合之細菌細胞。藉由以12,〇〇〇 X g離心10分鐘自粉碎溶液收穫細菌。將所得細菌丸粒再 懸浮於10 ml MRS肉湯+1〇%甘油中，在液氮中快速冷凍， 並儲存於-20°C下直至進一步分析為止。 DNA分離 藉由盼氣仿提取自所有試樣分離基因組DNA並使用 Roche Applied Science High PUre PCR模板純化套組（R〇che Diagnostics公司，Indianapolis, IN)進行純化。 焦磷酸測序 如由D〇wd(D〇Wd等人，2008 ; 8，125)所述實施細菌標 籤編碼之FLX擴增子焦磷酸測序。分析相等量之自每一鳥 之腸黏膜分離的DNA。在每一試樣中使用引物28 F (5,_
GAGTTTGATCNTGGCTCAG)及 519R (5'-GTNTTACNGCGG CKGCTG)使16S rRNA基因之V1_V3區擴增。測序後，基於 質4選並修整原始數據。基於條碼序列藉由個別試樣對 序列進行分選。移除條碼標籤並移除非細菌核糖體序列。 使用與得自NCBIi經品質控制及人工審核之數據庫之 BlastN比較來測定細菌群落組成。針對每一試樣測定每一 細菌ID之相對含量。使用NCBI命名法以每一分類學等級 161722.doc 201234978 編輯數據。 統計分析 對於性flb而5，使用成對t測試分離數據平均數。認為 在P<0.05下具有顯著差異。使用畜舍作為實驗單元。自計 數數據計算細菌種屬之比例，且使用分類模型分析對結果 進行分析且隨後使用JMP 8.0.2 (SAS institute, Cary, NC)計 算卡方（Chi-square)概率，其中將代表一隻鳥之每一試樣視 為實驗單元。 結果及討論
與未經攻毒之對照相比，藉由產氣莢膜梭菌攻毒可顯著 減小體重增加及飼料效率。與其他處理相比，檸檬酸桿菌 植酸酶（具有或不具有DFM)在NE攻毒之前顯著改良肉雞之 體重增加及飼料效率。在總體實驗中（第〇至42天）（包括自 第18至20天之攻毒），與經攻毒對照相比，補充檸檬酸桿 菌植酸酶、Ronozyme P、芽孢桿菌DFM或乳桿菌DFM會略 微改良體重增加及飼料效率（自第〇至42天），且改良至經攻 毒對照與未經攻毒之對照之間之值。與R〇n〇zyme p或dFM 本身相比’ Ronozyme P及芽孢桿菌DMF或乳桿菌DFM之組 合並不顯著改良肉雞之體重增加或飼料效率。與之相比， 檸檬酸桿菌植酸酶（擰檬酸桿菌植酸酶A或B)與任一 DFM之 組合將肉雞之體重增加及飼料效率改良至大於未經攻毒之 對照的值’此表明檸檬酸桿菌植酸酶與DFM產品具有協同 效應。檸檬酸桿菌植酸酶A與檸檬酸桿菌植酸酶b相比之 此效應更為明顯-此表明出人意料地，與擰檬酸桿菌植酸 161722.doc -91 _ 201234978 酶B與DFM之組合相比使用檸檬酸桿菌a與DFM之組合可 獲得甚至更佳之效應。 在補充芽孢桿菌或乳桿菌DFM時，觀察到死亡率及損傷 評分減小至接近但不等於未經攻毒之對照之值。與經攻毒 對照相比，Ronozyme P會減小死亡率及損傷評分，但並不 減小至未經攻毒之對照之值。與經攻毒對照相比，檸檬酸 桿菌植酸酶A及B並不顯著改變損傷評分或死亡率（因NE) 之嚴重性》Ronozyme P與芽孢桿菌DFM或乳桿菌DFM之組 合將死亡率（因NE)及損傷評分減小至未經攻毒之對照之 值。檸檬酸桿菌植酸酶與芽孢桿菌DFM或乳桿菌DFM之組 合將死亡率（因NE)及損傷評分減小至略優於（較小死亡率 及損傷評分）未經攻毒之對照之值。檸檬酸桿菌植酸酶A與 檸檬酸桿菌植酸酶B相比之此效應更為明顯-此表明出人意 料地’與檸檬酸桿菌植酸酶B與DFM之組合相比使用檸檬 酸桿菌A與DFM之組合可獲得甚至更佳之效應。 與經攻毒對照相比，兩種DFM皆會減小空腸消化物之 pH ; Ronozyme P並不改變pH，且檸檬酸桿菌植酸酶會增 加pH。R〇noZyme p或擰檬酸桿菌植酸酶a或檸檬酸桿菌植 酸酶B與芽孢桿菌DFM或乳桿菌DFM之組合將空腸消化物 之pH減小至低於經攻毒及未經攻毒之對照處理的值。空腸 消化物之pH與乳桿菌屬之比例（作為第21天時空腸黏膜中 總細菌DNA之比例）負相關。繼而’乳桿菌屬之相對比例 與攻毒之後（21至35天）之體重增加及飼料效率正相關。 161722.doc •92- 201234978 採用檸檬酸桿菌植酸酶（尤其檸檬酸桿菌植酸酶A)與 DFM之組合之益處在於，防止尤其在產氣莢膜梭菌攻毒期 間之損失並將此植酸酶對於礦物質、蛋白質及能量之消化 率的正面影響最大化，該等正面影響轉變為與經攻毒及未 經攻毒之對照相比增加飼料效率及體重增加。與植酸酶本 身及經攻毒對照處理相比，該組合在減小腸損害及死亡率 (因NE)中之該等益處亦顯而易見。 时論 同樣不期望受限於理論，擰檬酸桿菌植酸酶與dfm之 組合與其他植酸酶及DFM相比提供令人驚奇的較佳結果， 此表明布氏檸檬酸桿菌植酸酶與一些其他非檸檬酸桿菌植 酸酶相比在較低pH(例如3·5_45)下具有較高活性。因單胃 農場動物（例如豬或家禽）之胃腸（(}1)道之第一部分具有低 PH-布氏檸檬酸桿菌植酸酶似乎在⑴道之此部分中具有較 间活性’由此該等植酸酶與—些其他非#檬酸判植酸酶 相比能夠自植酸鹽受質更快地釋放麟及其他營養素（例如 蛋白質）。此在許多方面係有利的，包括期望盡可能快地 在植酸鹽上發揮作用，此乃因其往往會與諸如礦物質等其 人物質進订複合（尤其在pH升高時）。一旦植酸鹽發生複 合’裂解酶較不易接近該鹽。因此，期望GI道中在pH仍較 =時較早對植酸鹽受質發揮作用。然而，植酸鹽在⑺道之 刀中裂解意味著，&道之空腸及下部中可利用之鱗 1 ’此可對諸如乳桿菌等共生「有益」細菌群體（已顯 161722.doc •93- 201234978 示其具有有益效應，例如免疫調節及產生降低腸pH之有機 酸)具有負面影響。對於駐留「有益」細菌之此負面影響 可導致機會病原體富有活性-由此打破了腸中細菌之總體 平衡。 對於本發明而言，已令人驚奇地發現，使用布氏轉樣酸 桿菌植酸酶之負面影響可藉由將其與一或多種dfm組合使 用來克服。DFM重新建立腸中之細菌平衡_由此減小由病 原性細菌引起之腸損害且使動物個體具有較高性能。 同樣，不期望受限於理論，檸檬酸桿菌植酸酶與DFM之 組合與其他植酸酶及DFM相比提供令人驚奇的較佳結果， 此進一步表明布氏檸檬酸桿菌植酸酶與一些其他非檸檬酸 桿菌植酸酶相比在較低pH(例如3.5_45)下具有較高活性。 因胃腸（GI)道之第一部分具有低ρΗ·故布氏擰檬酸桿菌植 酸酶似乎在GI道之此部分中具有較高活性。此可改良個體 之蛋白質消化，此乃因植酸鹽可藉由結合蛋白質形成複合 物。蛋白質吸附之此早期增加之結果可導致動物產生較少 鹽酸（HC1)-此可隨後在GI道中具有負面影響，此乃因其可 增加GI道之後段部分中之pH。增加GI道之後段部分中之 pH係不利的’此乃因其增加了病原體能夠在腸内定殖之機 會。在本發明中令人驚奇地發現，使用檸檬酸桿菌植酸酶 之該等負面影響可藉由將其與DFM組合來克服。 令人驚奇地，來自布氏檸檬酸桿菌菌株ATCC 5 1113之6-植酸酶（具有胺基酸序列SEq ID No. 1)較諸如來自布氏檸 161722.doc -94- 201234978 檬酸桿菌菌株YH-l 5之6-植酸酶（具有胺基酸序列SEQ ID No. 7)等其他布氏檸檬酸桿菌6-植酸酶甚至具有更高正面 影響。 實例2_性能研究 方法 自商業孵化場購買4000只1日齡之Cobb雄性雛雞。在研 究開始時，分區向每一處理畜舍分派50只雄性雛雞，每一 處理總共8個畜舍。研究由以下處理組成（表1): 表1.實例2之實驗設計 處理 植酸酶 DFM 可用P含量 Ca含量 1 PC 無 無 基礎值 基礎值 2NC 無 無 -0.17 -0.16 3 無 芽孢桿菌 DFM1 -0.17 -0.16 4 無 乳桿菌DFM2 -0.17 -0.16 5 Ronozyme P®3 500 FTU/kg 無 -0.17 -0.16 6 檸檬酸桿菌植酸酶 A4 500 FTU/kg 無 -0.17 -0.16 7 檸檬酸桿菌植酸酶 B4 500 FTU/kg 無 -0.17 -0.16 8 Ronozyme P®3 500 FTU/kg 芽孢桿菌 DFM -0.17 -0.16 9 檸檬酸桿菌植酸酶 A 500 FTU/kg 芽孢桿菌 DFM -0.17 -0.16 161722.doc -95- 201234978 10 檸檬酸桿菌植酸酶 B 500 FTU/kg 芽孢桿菌 DFM -0.17 -0.16 11 Ronozyme P®3 500 FTU/kg 乳桿菌DFM -0.17 -0.16 12 檸檬酸桿菌植酸酶 A 500 FTU/kg 乳桿菌DFM -0.17 -0.16 13 檸檬酸桿菌植酸酶 B 500 FTU/kg 乳桿菌DFM -0.17 -0.16 「芽抱桿菌DFM」-係由Danisco Α/S提供之Enviva Pro® (其係枯草芽孢桿菌菌株Bs2084、LSSAOl及15AP4之組合） 且以150,000 CFU/g飼料給予。 2 「乳桿菌 DFM」-係由 Danisco Animal Nutrition提供之 Sorbiflore®(其係鼠李糖乳桿菌與香腸乳桿菌之組合）且以 350,000 CFU/g飼料給予 ° 3 「Ronozyme P®」係來自米麯黴中表現之隔孢伏革菌 之6-植酸酶-其胺基酸序列在本文中如SEQ ID No. 8所給 出。（此係「非檸檬酸桿菌」6植酸酶） 4檸檬酸桿菌植酸酶A-係來自布氏檸檬酸桿菌菌株ATCC 51113之6-植酸酶。此酶之胺基酸序列在本文中如SEQ ID No. 1所給出。 5檸檬酸桿菌植酸酶B-係來自布氏檸檬酸桿菌菌株YH-1 5 之6-植酸酶。此酶之胺基酸序列在本文中如SEQ ID No· 7 所給出。 161722.doc •96· 201234978 表2.實例2之實驗飲食組成。 雛難 生長難 肥育雞 PC NC PC NC PC NC 玉米 59.54 62.20 60.10 63.30 61.24 64.50 大豆粉 34.35 33.90 32.80 32.20 31.41 30.80 鈉膨潤土 - 0.28 - — 睡 — 磷酸氫鈣 2.14 1.17 1.87 0.91 1.72 0.76 精細石灰石 1.162 1.32 0.94 1.10 0.91 1.08 精細鹽 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 L-離胺酸HC1 0.34 0.34 0.16 0.16 0.015 0.01 DL-曱硫胺酸 0.17 0.16 0.12 0.11 0.09 0.08 蘇胺酸 0.09 0.07 0.01 — - — 維生素-礦物質預混合物 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 大豆油 1.62 — 3.46 1.66 4.03 2.22 粗蛋白 22.00 22.00 21.00 21.00 20.34 20.3 ΑΜΕ 家禽(MJ/KG) 12.6 12.4 13.2 12.9 13.4 13.1 離胺酸-AVL 1.31 1.30 1.12 1.11 0.99 0.97 曱硫胺酸 0.51 0.50 0.45 0.44 0.41 0.40 蘇胺酸 0.94 0.92 0.83 0.82 0.80 0.80 鈣 1.05 0.89 0.9 0.74 0.85 0.69 磷(AVL) 0.50 0.33 0.45 0.28 0.42 0.25 磷(TOT) 0.77 0.60 0.72 0.54 0.68 0.51 鳥自第0至42天隨意接受適於處理之飼料。用於所有實 驗處理之酶及DFM皆係由Danisco以適當混合物及含量提 161722.doc •97· 201234978 供將畜舍佈置在設備内以防止直接接觸以避免飲食之交 叉污染。在第21天時用生長雞飲食替代雛雞飲食，且在第 35天時用肥育雞飲食替代生長飲食。在每次改變飼料時， 分區自畜舍移除飼餵器，再次稱重，清空並再填充適當處 理飲食。在研究之最後一天對飼料進行稱重。每日針對死 亡率檢查畜舍。在鳥被淘汰或發現死亡時，記錄日期及移 出重量（kg)。 所有畜舍均具有約4英吋厚褥草，其具有新鮮松屑之包 被。在將所有鳥放置於畜舍之前用商業球蟲病疫苗 (Coccivac-B)對其進行噴霧疫苗接種。在研究期間不使用 伴隨藥物療法。 使用成對t測試分離平均值。認為在P<0.05下具有顯著差 異。使用畜舍作為實驗單元。 結果及討論 在42天中，陰性對照處理顯著減小體重增加。在補充任 一 DFM時’並無顯著性能改良。與此相反，在飲食中補充 檸檬酸桿菌植酸酶會將體重增加顯著改良至與陽性對照類 似之值。然而’ Ronozyme P並不較陰性對照產生顯著改 良。在補充Ronozyme P與芽孢桿菌DMF或乳桿菌DFM之組 合時，與陰性對照相比，在42天中體重增加之數值有所改 良。檸檬酸桿菌植酸酶與芽孢桿菌DFM或乳桿菌DMF之組 合顯示與陰性對照飲食相比具有顯著改良，此表明檸檬酸 桿菌植酸酶及DFM之增強效應。 在分析飼料轉化率（FCR)時，觀察到類似觀察結果。補 161722.doc -98- 201234978 充任一益生菌對於飼料轉化效率並無顯著效應，僅引起輕 微數值增加。在單獨補充植酸酶時，檸檬酸桿菌植酸酶具 有顯著效應’但Ronozyme P並無顯著效應。類似地，在補 充乳桿菌或芽抱桿菌與Ronozyme P之組合時，與陰性對照 相比並無顯著改良。然而，擰檬酸桿菌植酸酶與芽抱桿菌 DFM或乳桿菌DFM之組合將FCR顯著改良至以下值：其低 於陰性對照（改良之飼料效率），且低於單獨補充乳桿菌 DFM或芽孢桿菌DFM與植酸酶之加和效應（改良之飼料效 率）。檸檬酸桿菌植酸酶A與檸檬酸桿菌植酸酶b相比之此 效應更為明顯-此表明出人意料地，與檸檬酸桿菌植酸酶B 與DFM之組合相比使用檸檬酸桿菌a與DFM之組合可獲得 甚至更佳之效應。 總而言之’檸檬酸桿菌植酸酶與DFM-芽孢桿菌及乳桿 菌中之任一者具有正面影響。此藉由體重增加及飼料效率 增加至大於任一單獨補充劑之效應總和來支持。與棒檬酸 桿菌植酸酶Β相比，檸檬酸桿菌植酸酶Α之此效應更為明 顯。 實例3-消化率研究 方法 在地面畜舍中將1000只雄性Ross 308肉離雞铜養至12天 且飼餵典型商業雛雞飲食。在第13天，對鳥進行分派以使 每個處理具有8個重複，每個處理總計64只鳥（8只鳥/籠）。 自第13至21天，飼餵處理飲食（表1)。 表1.實例3之實驗設計 161722.doc •99- 201234978 處理 植酸酶 DFM P含量 Ca含量 1 PC 無 無 0.684 0.9 2NC 無 無 0.474 0.73 3 無 芽孢桿菌DFM1 0.474 0.73 4 無 乳桿菌DFM2 0.474 0.73 5 Ronozyme P®3 500 FTU/kg 無 0.474 0.73 6 檸檬酸桿菌植酸 酶A4 500 FTU/kg 無 0.474 0.73 7 檸檬酸桿菌植酸 酶B4 500 FTU/kg 無 0.474 0.73 8 Ronozyme P®3 500 FTU/kg 芽孢桿菌DFM 0.474 0.73 9 檸檬酸桿菌植酸 酶A 500 FTU/kg 芽孢桿菌DFM 0.474 0.73 10 檸檬酸桿菌植酸 酶B 500 FTU/kg 芽孢桿菌DFM 0.474 0.73 11 Ronozyme P®3 500 FTU/kg 乳桿菌DFM 0.474 0.73 12 檸檬酸桿菌植酸 酶 A 500 FTU/kg 乳桿菌DFM 0.474 0.73 13 檸檬酸桿菌植酸 酶B 500 FTU/kg 乳桿菌DFM 0.474 0.73 161722.doc -100- 1 「芽孢桿菌DFM」-係由Danisco A/S提供之Enviva Pro®(其係枯草芽孢桿菌菌株Bs2084、LSSAOl及15AP4之 2 組合）且以150,000 CFU/g飼料給予。 3 「乳桿菌 DFM」-係由 Danisco Animal Nutrition提供 4 之Sorbiflore®(其係鼠李糖乳桿菌與香腸乳桿菌之組合）且 201234978 以350,000 CFU/g飼料給予。 3 「Ronozyme P®」係來自米麯黴中表現之隔孢伏革菌 之6-植酸酶-其胺基酸序列在本文中如SEQ ID No. 8所給 出。（此係「非檸檬酸桿菌」6植酸酶） 4擰檬酸桿菌植酸酶A-係來自布氏檸檬酸桿菌菌株ATCC 51113之6-植酸酶。此酶之胺基酸序列在本文中如SEQ ID N 〇. 1所給出。 5檸檬酸桿菌植酸酶B-係來自布氏檸檬酸桿菌菌株YH-1 5 之6-植酸酶。此酶之胺基酸序列在本文中如SEQ ID No. 7 所給出。 飼餵呈醪液形式之肉雞飲食。飲食滿足或超過NRC標準 (表2)。沖洗混合器以防止飲食交叉污染。使用Davis S-20 混合器混合所有處理飼料。自每一批次開始、中間及結束 自每一處理飲食收集試樣並摻和在一起以確認飼料中之酶 活性及DFM存在性。 表2.實例3之實驗飲食組成。 成份 陽性對照 陰性對照 玉米 55.67 57.06 大豆粉，48% 37.60 37.35 大豆油 2.56 2.13 L-離胺酸HC1 0.16 0.16 DL-曱硫胺酸 0.28 0.28 L-蘇胺酸 0.07 0.07 161722.doc -101 - 201234978 鹽 0.38 0.38 石灰石 0.81 0.81 磷酸氫鈣 1.87 1.17 維生素/痕量礦物質預混合物1 0.30 0.30 氧化鈦 0.30 0.30 計算分析 乾物質 88.9 88.8 粗蛋白 23.0 23.0 ME (MJ/kg) 12.7 12.7 ME(kcal/kg) 3025 3025 鈣 0.90 0.73 可用P 0.45 0.33 鈉 0.18 0.18 可消化之離胺酸 1.21 1.21 可消化之甲硫胺酸 0.60 0.60 可消化之曱硫胺酸+胱胺酸 0.86 0.86 可消化之蘇胺酸 0.76 0.76 可消化之色胺酸 0.22 0.22 在整個研究持續時間内，自第〇至21天使鳥隨意接受適 於處理之飼料。在研究期間不使用伴隨藥物療法。用於所 有實驗處理之酶及DFM皆係由Danisco以適當混合物及含 量提供。將籠物理地分開以防止直接接觸以避免污染。在 研究之最後一天，將鳥以及飼餵器中之飼料稱重。 在第18、19及20天收集糞便試樣，稱重並記錄，且隨後 161722.doc -102- 201234978 在收集之日在-2(TC下冷凍。隨後將排泄物彙集於各處理 組内，使用攙和器混合並獲取兩份試樣。將試樣冷凍乾燥 並研磨以通過0.5 mm篩，再次冷凍並儲存直至用於分析乾 物質（DM)、總能量（GE)、氮（N)、構（P)及約（Ca)時為止。 在第2 1天，將所有鳥無痛致死且藉由使用蒸餾水沖洗來 獲得回腸之下半部分之内容物。彙集每一籠内鳥之消化物 並在收集之後立即冷凍。對飲食、回腸消化物及排泄物之 DM、N、胺基酸、GE、Ca、P及惰性標記實施重複近似分 析。 藉由將所有試樣在l〇(TC下乾燥24 h來測定DM。對飲食 及回腸消化物實施高效液相層析（HPLC)以測定相對胺基酸 濃度。藉由感應耦合電漿原子發射質譜分析來測定磷及鈣 含量並使用斷熱式熱量計（型號1261，Parr Instrument公 司，Moline，IL)測定能量。最後’藉由燃燒法（型號 FP2000 ’ LECO公司，St· Joseph，MI)量測N含量。計算糞 便及回腸消化率之消化係數。 使用成對t測試分離平均值。在P<〇.〇5下視為具有顯著差 異’且使用每一籠作為實驗單元。 結果及討論 與陰性對照相比，在單獨補充芽孢桿菌DFM或乳桿菌 DFM時，對於回腸磷消化率並無顯著效應。然而，補充檸 檬酸桿菌植酸酶會將回腸磷消化率增加至等於陽性對照之 值。在將Ronozyme P單獨添加至飲食中時，回腸磷消化率 顯著增加至低於陽性對照飲食之值。在將檸檬酸桿菌植酸 l6I722Tdoc •103- 201234978 酶與DFM之組合添加至飲食中時，與單獨補充之擰樣酸桿 菌植酸酶相比，回腸磷消化率有所增加。與之相比，在：
Ronozyme P與DFM之組合添加至飲食巾時，回腸鱗消化係 數與彼等在單獨補充R_yme ?時所觀察者類似。該等趙 勢反映於磷之總腸道消化率中。 在將檸檬酸桿菌植酸酶補充至飲食中時，與陰性對照相 比，回腸胺基酸消化率顯著增加。在補充R〇n〇zyme ， 與陰性對照相比，回腸胺基酸消化率略有增加◊在單獨補 充芽抱桿菌DFM或乳桿菌DFM時，回腸胺基酸消化率僅略 有增加。與單獨補充DFM或檸檬酸桿菌植酸酶相比，補充 檸檬酸桿菌植酸酶與芽孢桿菌DFM或乳桿菌DFM2組合對 於胺基酸消化率具有顯著效應，其大於單獨補充任一者時 所增加效應之總和。在將R〇n〇zymep + DFM之組合添加至 飲食中時，並未觀察到此遞增效應。檸檬酸桿菌植酸酶A 與檸檬酸桿菌植酸酶B相比之此效應更為明顯·此表明出人 意料地，與檸檬酸桿菌植酸酶B與DFm之組合相比使用檸 檬酸桿菌A與DFM之組合可獲得甚至更佳之效應。 在將檸樣酸桿菌植酸酶補充至飲食中時，能量消化率 (ΑΜΕ)自陰性對照之值顯著增加。在將R〇n〇Zyme p添加至 飲食中時，並未觀察到此情形；其中僅觀察到AME具有輕 微數值增加。在將芽孢桿菌DFM或乳桿菌DFM補充至飲食 中時，ΑΜΕ具有極輕微增加，然而，其與陰性對照並不顯 著不同。在補充任一 DFM與檸檬酸桿菌植酸酶之組合時， ΑΜΕ顯著增加至大於自單獨之植酸酶或任一 dFM所增加效 161722.doc -104. 201234978 應之總和。在使用Ronozyme p植酸酶補充任一dfm時，並 未觀察到此情形。 總而δ之，檸檬酸桿菌植酸酶與芽孢桿菌dfm或乳桿菌 DFM具有顯著效應。檸檬酸桿菌植酸酶A與檸檬酸桿菌植 酸酶B相比之此效應更為明顯_此表明出人意料地，與擰檬 酸桿菌植酸酶B與D F M之組合相比使用檸檬酸桿菌A與 DFM之組合可獲得甚至更佳之效應。此反映為p、ame及 回腸胺基酸消化率之增加。在補充產品之組合時，所觀察 之消化係數增加大於單獨補充任一者時之改良之總和。 上述說明書中提及之所有公開案均以引用方式併入本文 中。彼等熟習此項技術者應明瞭本發明所述方法及系統之 各種修改及變化，此並不背離本發明之範圍及精神。儘管 已結合具體較佳實施例對本發明進行了闡述，但應瞭解所 主張之本發明不應過度地限於該等具體實施例。實際上， 彼4熟S生物化學及生物技術或相關領域者顯而易見之用 於實施本發明之所述方式的多種修改意欲涵蓋於以下申請 專利範圍之範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1顯示來自布氏擰檬酸桿菌ATCC 51113之具有植酸酶 (6-植酸酶）活性之多肽之序列（SEq id No. 1)，該序列中之 第一Xaa代表Gly且該序列中之第二Xaa代表Pr〇。前22個胺 基酸（加下劃線）係在成熟蛋白質中裂解之信號肽。成熟蛋 白質由此始於此胺基酸序列之胺基酸23 β因此，成熟蛋白 質為 23-433。此扭係由 DSM/Novozymes 以 Ronozyme 161722.doc -105· 201234978
HiPhos™在市場上出售。 圖2顯不來自布氏檸檬酸桿菌之具有植酸酶活性之多肽 之序列（SEQ ID No· 2) ’該序列中之第一 Xaa代表Giy且該 序列中之第二Xaa代表pro。前22個胺基酸（加下劃線）係在 成熟蛋白質中裂解之信號肽。成熟蛋白質由此始於此胺基 酸序列之胺基酸23»因此，成熟蛋白質為23-433。 圖3顯不編碼具有植酸酶（6_植酸酶）活性之多肽之核苷酸 序列之序列（SEQ ID No. 3)。SEQ ID No. 3之核苷 酸67至 1299編碼具有植酸酶活性之多肽（即SEq m N〇 1中所示之 多肽）（其中存在之r意指g或a ; y意指t/u或c ;且s意指呂或 c)。 圖4顯示編瑪具有植酸酶活性之多肽之核苷酸序列之序 列（SEQ ID No. 4)。SEQ ID No. 4之核苷酸67至1299編碼具 有植酸酶活性之多肽（即SEQ ID No. 2中所示之多肽）（其中 存在之r意指g或a ; y意指t/u或〇 ;且3意指§或勾。 圖5顯示來自弗氏檸檬酸桿菌之具有植酸酶（6_植酸酶）活 性之多肽之胺基酸序列（SEQ ID No. 5)。 圖6顯示編碼具有植酸酶活性之多肽（即seq id No. 5中 所示之多肽）之核苷酸序列（SEQ id No. 6)。 圖7顯示來自布氏檸檬酸桿菌γΗ_15之具有植酸酶（6_植 酸酶）活性之多肽之胺基酸序列（SEq id No. 7)。 圖8顯示來自米麯黴中表現之隔孢伏革菌且由dSm & N〇vozymes以Ronozyme ρτΜ出售之具有植酸酶（6•植酸酶） 活性之多肽的胺基酸序列（SEQ ID No. 8)。 161722.doc •106- 201234978 圖9顯示來自弗氏檸檬酸桿菌之具有植酸酶活性之多肽 之序列（SEQ ID No. 9)(UniProtKB/TrEMBL 登錄號 Q676V7) ° 圖10顯示來自弗氏檸檬酸桿菌之具有植酸酶活性之多肽 - 之序列（SEQ ID No. 10)(EBI 登錄號 EM-PRO:AY390262)。 圖11顯示編碼具有植酸酶活性之多肽（即SEQ ID No. 10 中所示之多肽）之核苷酸序列（SEQ ID No. 11)。 161722.doc -107- 201234978 序列表 <110>丹麥商丹尼斯克公司 <】20>飼料添加劑組合物 <140〉 101102304 <141〉 2012-0卜19 <150> 1102865.1; 1102857.8 <151> 2011-02-18；2011-02-18 <160> 13 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 433 <2I2> PRT <213〉 <220〉布氏檸檬酸桿菌 <221〉miscjeature <222> (40)..(40) <223> <220> Xaa可為任一天然胺基酸 <221> misc^feature <222> (345)..(345) <223> <400〉文aa可為任一天然胺基酸
Met Ser Thr Phe lie lie Arg Leu Leu Phe Phe Ser Leu Leu Cys Gly 15 10 15
Ser Phe Ser lie His Ala Glu Glu Gin Asn Gly Met Lys Leu Clu Arg 20 25 30
Val Val He Val Ser Arg His Xaa Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr 35 40 45
Pro lie Met Lys Asn Val Thr Pro Asp Gin Trp Pro Gin Trp Asp Val 50 55 60
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Gly Gin Tyr Gin Arg Leu Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn 85 90 95
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Cln Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro 115 120 125
Lys Cys Gin lie Gin Val His Tyr Gin Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp 130 135 140 16丨722·序列表.doc 201234978
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Asn Val Ser Leu Pro Gly Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu 225 230 235 240 lie Phe Leu Leu Gin Glu Ala Gin Gly Met Pro Gin Val Ala Trp Gly 245 250 255_
Arg lie Thr Gly Glu Lys Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn 260 265 270
Ala Gin Phe Asp Leu Leu Gin Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg 275 280 285
Ala Thr Pro Leu Leu Asp Met lie Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly 290 295 300
Thr Thr Glu Asn Arg Tyr Gly lie Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe 305 310 315 320 lie Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp 325 330 335
Leu Asn Trp Ser Leu Pro Gly Gin Xaa Asp Asn Thr Pro Pro Gly Asp 340 345 350
Lys Leu Val Phe Glu Lys Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp 355 360 365
Val Gin Val Ser Phe Val Tyr Gin Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp lie 370 375 380
Gin Pro Leu Ser Leu Glu Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu 385 390 395 400 lie Ala Cys Glu Glu Lys Asn Ser Gin Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser 405 410 415
Phe Ser Arg Leu lie Lys Glu lie Arg Val Pro Clu Cys Ala Val Thr 420 425 430
Glu 161722-序列表.doc 201234978
<210> 2 <211> 433 <212> PRT <213>布氏檸檬酸桿菌 <400> 2
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Glu
<210> 3 <211> 1302 <212> DNA <213>布氏檸樣酸桿菌 <400> 3 atgagtacat tcatcattcg tttattattt ttttctctct tatgcggttc tttctcaata 60 catgctgaag agcagaatgg tatgaaactt gagcgggttg tgatagtgag tcgtcatggr 120 gtaagagcac ctacgaagtt cactccaata atgaaaaatg tcacacccga tcaatggcca 180 caatgggatg tgccgttagg atggctaacg cctcgtgggg gagaacttgt ttctgaatta 240 ggtcagtatc aacgtttatg gttcacgagc aaaggtctgt tgaataatca aacgtgccca 300 tctccagggc aggttgctgt tattgcagac acggatcaac gcacccgtaa aacgggtgag 360 gcgtttctgg ctgggttagc accaaaatgt caaattcaag tgcattatca gaaggatgaa 420 gaaaaaaatg atcctctut taatccggta aaaatgggga aatgttcgtt taacacattg 480 caggttaaaa acgctattct ggaacgggcc ggaggaaata ttgaactgta tacccaacgc 540 tatcaatctt catttcggac cctggaaaat gttttaaatt tctcacaatc ggagacat£t 600 aagactacag aaaagtctac gaaatgcaca ttaccagagg ctttaccgtc tgaacttaag 660 gtaactcctg acaatgtatc attaccCggt gcctggagtc tttctcccac gctgactgag 720 -4- 161722-序列表.doc 201234978 atatttctgt tgcaagaggc ccagggaatg ccacaggtag cctgggggcg tattacggga 780 gaaaaagaat ggagagattt gttaagtctg cataacgctc agtttgatct tttgcaaaga 840 actccagaag ttgcccgtag tagggccaca ccattactcg atatgataga cactgcatta 900 ttgacaaatg gtacaacaga aaacaggtat ggcataaaat tacccgtatc tctgttgttt 960 attgctggtc atgataccaa tcttgcaaat ttaagcgggg ctttagatct taactggtcg 1020 ctacccggtc aaccsgataa yaccccgccg ggcgacaagc ttgtattcga aaagtggaaa 1080 agaaccagtg ataatacgga ttgggttcag gtttcatttg tttatcagac gctgagagat 1140 atgagggata tacaaccgtt gtcgttagaa aaacctgctg gcaaagttga tttaaaatta· 1200 attgcatgtg aagagaaaaa tagtcaggga atgtgttcgt taaaaagttt ttccaggctc 1260 attaaggaaa ttcgcgtgcc agagtgtgca gttacggaat aa 1302 <210> 4 <211> 1299 <212> DNA <213>布氏檸檬酸桿菌 <400> 4 atgagtacat tcatcattcg tttattattt ttttctctct tatgcggttc tttctcaata 60 catgctgaag agcagaatgg tatgaaactt gagcgggttg tgatagtgag tcgtcatgga 120 gtaagagcac ctacgaagtt cactccaata atgaaaaatg tcacacccga tcaatggcca 180 caatgggatg tgccgttagg atggctaacg cctcgtgggg gagaacctgt ttctgaatta 240 ggtcagtatc aacgtttatg gttcacgagc aaaggtctgt tgaataatca aacgtgccca 300 tctccagggc aggttgctgt tattgcagac acggatcaac gcacccgtaa aacgggtgag 360 gcgtttctgg ctgggttagc accaaaatgt caaattcaag tgcattatca gaaggatgaa 420 gaaaaaaatg atcctctttt taatccggta aaaatgggga aatgttcgtt taacacattg 480 caggttaaaa acgctattct ggaacgggcc ggaggaaata ttgaactgta tacccaacgc 540 tatcaatctt catttcggac cctggaaaat gttttaaatt tctcacaatc ggagacatgt 600 aagactacag aaaagtctac gaaatgcaca ttaccagagg ctttaccgtc tgaacttaag 660 gtaactcctg acaatgtatc attacctggt gcctggagtc tttcttccac gctgactgag 720 atatttctgt tgcaagaggc ccagggaatg ccacaggtag cctgggggcg tattacggga 780 gaaaaagaat ggagagattt gttaagtctg cataacgctc agtttgatct tttgcaaaga 840 actccagaag ttgcccgtag tagggccaca ccattactcg atatgataga cactgcatta . 900 ttgacaaatg gtacaacaga aaacaggtat ggcataaaat tacccgtatc tctgttgttt 960 attgctggtc atgataccaa tcttgcaaat ttaagcgggg ctttagatct taactggtcg 1020 ctacccggtc aacccgataa tacccctcct ggtggggagc ttgtattcga aaagtggaaa 1080 agaaccagtg ataatacgga ttgggttcag gtttcatttg tttatcagac gctgagagat 1140 atgagggata tacaaccgtt gtcgttagaa aaacctgctg gcaaagttga tttaaaatta 1200 attgcatgtg aagagaaaaa tagtcaggga atgtgttcgt taaaaagttt ttccaggctc 1260 attaaggaaa ttcgcgtgcc agagtgtgca gttacggaa 1299
<210> 5 <211> 433 <212> PRT 161722-序列表.doc 201234978 <213>弗氏檸檬酸桿菌 <400> 5
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Ala Thr Pro Leu Leu Asp Met lie Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly 290 295 300
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Glu
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<210> 7 <211> 433 <212> PRT <213>布氏檸檬酸桿菌 <400> 7
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Tyr Thr Gin Arg Tyr Gin Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu 180 185 190 161722·序列表.doc 201234978
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Asn Val Ser Leu Pro Gly Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu 225 230 235 240 lie Phe Leu Leu Gin Glu Ala Gin Gly Met Pro Gin Val Ala Trp Gly 245 250 255
Arg lie Thr Gly Glu Lys Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn 260 265 270
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<210> 9 <211> 433 <212> PRT <213>弗氏檸檬酸桿菌 <400> 9
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Glu
<210> 11 <211> 3279 <212> DNA <213>弗氏檸檬酸桿菌 07^^0717^7^0717^^0717^7370717^7^ 2222 2222 2222 2222 2222 ^^含 dsisis}含含^含^含含 misc^feature (185)..(185) η 係 a、c、g 或 t misc一feature "5) g或t (515)..(515) n 係 a ' c ' misc feature (536)..(536) n 係 a、c、g 或 t misc-feature (612)..(612) n 係 a、c、g 或 t <400> misc_feature (9037..(903) n 係 a、c、g 或 t 11 • 14· 161722·序列表.doc 201234978 aaagggaagc ccgttgtcgt tctttcaaac aacgatggct gcgttattgc cagtagcgta 60 gaggcaaagg cgcttggcgt taatatgggc gctccgtact tcaaacagaa agatctgttc 120 aggcgctatg gcgtgttctg ttttagttcg aactacgaac tgtatgcgga tatgagcagc 180 agggntgatg tcgattctgg aggagttgtc gccacgcgtg gagatataca gtattgatga 240 agccttttgt gatttaacgg gcgtgcgaaa ctgcagggat cttacggatt ttggtcagga 300 aatcagagca accattttgc agaaaacacg tctcacggtt ggggtcggca ttgctcagac 360 caaaaccctg gccaaactgg cgaaccatgc ggccaaaaag tggcaggaac agacgggcgg 420 agtcgtggat ctctcaaata ttgaacgcca gcgtaagctg atggcagcac tcccggttga 480 tgaagtctgg ggcatcggac gccgtatcgg caagnaactg gaacgtcatg ggcatncaaa 540 cggttctcga acctcgcggg tcccgatcat tcgcttcatt cgtcaaacat cttcagcgtc 600 gtgcttgaag cncaaccgtc c£ggcattgc gcggtgagcc ttgttctggc gctggaaaaa 660 gtttgcgccg gaatcagcag gcaattatct gctcagaatc gtttggtgaa aaactcacgg 720 aattacaacg ccatgaaaaa aggccatttg cacctatgct tcacgtgctg cggaaaagct 780 gcgcagaaaa caccagtact gccggtttat ctctacgttt atcaaaacca gtccgtttgc 840 cctgaatgaa ccttattacg gtaacagcgc atcgataaaa ctgctgacgc caactcagga 900 tanccgggac attattacag cagccacgcg cagcctggac sccgtttggc gagaggggct 960 acgttatcaa aaagcgggcg ttatgctggg ggattttttt agctctggcg ttgcacagct 1020 gaatcttttt gataataacg ccccgcggcg taacagcgat aaattgatgg acctactgga 1080 tactcttaat gctgaaaagg ggaaaggaac gctctacttt gccgggcaag ggatacagca 1140 gccgtgggcg atgaagcgag acatgctttc accacgttat acaacaagat acagtgattt 1200 gctgcgggta aattgatagc caaacaaggc ttccgcccac cttatttata ccggatcaat 1260 tatcctttca atgacaggac gttgtaaatt gccaacgatt ccataacctt gggatacctt 1320 tccagcgcgg ctaaattagc gctcctttaa tacttcgata agatacaaag ttgatatgca 1380 aaaagttgga ttgttgtgaa ctcaggagta ggattatttc tatctgatag aaccagttat 1440 cgaactggct tataogagtt gtttgttttt cacttacgaa aaggtggtgc tggctaatga 1500 gtacattcat cattcgttta ttattttttt ctctcttatg cggttctttc tcaatacatg 1560 ctgaagagca gaacggtatg aaacttgagc gggttgtgat agtgagccgc catggagtaa 1620 gagcacctac gaagttcact ccaataatga aagatgtcac acccgatcaa tggccacaat 1680 gSgatgtgcc gttaggatgg ctaacgcctc gtgggggaga acttgtttct gaattaggtc 1740 agtatcaacg tttatggttc acgagcaaag gtctgttgaa taatcaaacg tgcccatctc 1800 cagggcaggt tgctgttatt gcagacacgg atcaacgcac ccgtaaaacg ggtgaggcgt 1860 ttctggctgg gttagcacca aaatgtcaaa ttcaagtgca ttatcagaag gatgaagaaa 1920 aaactgatcc tctttttaat ccagtaaaaa tggggacatg ttcgtttaac acattgaagg 1980 ttaaaaacgc tattctggaa cgggccggag gaaatattga actgtatacc caacgctatc 2040 aatcttcatt tcggaccctg gaaaatgttt taaatttctc acaatcggag acatgtaaga 2100 ctacagaaaa gtctacgaaa tgcacattac cagaggcttt accgtctgaa cttaaggtaa 2160 ctcctgacaa tgtatcatta cctggtgcct ggagcccttc ttccacgctg actgagatat 2220 ttctgttgca agaggcccag ggaatgccac aggtagcctg ggggcgtatt acgggggaaa 2280 •15· 161722·序列表,doc 201234978 aagaatggag agatttgtta agtctgcata acgctcagtt tgatcttttg caaagaactc 2340 cagaagttgc ccgtagtaga gccacaccat tactcgatat gatagacact gcattattga 2400 caaatggtac aacagaaaac aggtatggca taaaattacc cgtatctctg ttgtttattg 2460 ctggtcatga taccaatctt gcaaatttaa gcggggcttt agatcttaac tggtcgctac 2520 ccggtcaacc cgataatacc cctcctggtg gggagctt£t attcgaaaag tggaaaagaa 2580 ccagtgataa tacggattgg gttcaggttt catttgttta tcagacgctg agagatatga 2640 g££atataca accgttgtcg ttagaaaaac ctgccggcaa agttgattta aaattaattg 2700 catgtgaaga gaaaaatagt' cagggaatgt gttcgttaaa aagtttttcc aggctcatta 2760 aggaaatccg cgtgccagag tgtgcagtta cggaataagt aattaattat tatatatata 2820 gcgtattaaa aaatagaaac ccccggtttg tagtcggggg tattcgtatt gtttcataat 2880 tacatgagtc ttcaactgac tgctctttgc gagtgacaat ccagttacgc tgctccagaa 2940 aaaatccgga ctgttcagcg atgcagaata catcgaaaag cgctcggtgt tggactgcga 3000 ctctaaaacc gcttaacacg gttatatgcc cacatatgtc taaatgtgct gtttgtgcaa 3060 cgtattaaat aataacaagt tattaatttt acaattagtt aaaaaaactg atagtatacc 3120 cccctatagt atttggaggg cgtat£ccgc attcacccga agataaaaaa cgcattctca 3180 cccgtgtacg ccgtattcgc ggtcaggttg atgcgcttga gcgcgcgctg gagtccggcg ' 3240 agccgtgttt ggctatcctg caacaaattg ccgccgtgc 3279 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 引物 28F <220> <221> raisc_feature <222> (11)7.(11) <223> n 係 a、c、g 或 t <400> 12 gagtttgatc ntggctcag 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 引物 519R <220> <221> misc feature <222> (3)..(3) <223> n^a、c、g 或t <220> <221> raise feature <222> (8)..(8) <223> n存a、c、g或t <400> 13 gtnttacngc ggckgctg 18 •16· 161722-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201234978 七、申請專利範圍： 1 · 一種飼料添加劑組合物，其包含直接飼餵微生物（DFM) 與可源自檸樣酸桿菌屬（Citrobacter spp.)之植酸酶之組 合。 2.如請求項1之飼料添加劑組合物，其中該植酸酶可源自 選自由以下組成之群之棒檬酸桿菌細菌：布氏檸檬酸桿 菌（Citrobacter braakii)、弗氏檸檬酸桿菌（citr〇bacter freundii)、無丙二酸檸檬酸桿菌 amalonaticus)、吉氏檸檬酸桿菌（Citrobacter gillenii)、 中間檸板酸才干菌（Citrobacter intermedius)、柯瑟氏檸檬 酸桿菌（Citrobacter koseri)、鼠類檸檬酸桿菌（Citr〇bacter mUrlmiae)、齧齒類檸檬酸桿菌（Citr〇bacter ^咖丨⑽）、 塞拉克氏檸檬酸桿菌（Citrobacter secUakii)、沃克曼氏檸 檬酸桿菌（Citrobacter werkmanii)及揚葛氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter youngae)。 其中該植酸酶係源 明本項1或2之飼料添加劑組合物 自布氏檸檬酸桿菌。 4. 如：求項1至3中任一項之飼料添加劑組合物，其中該植 酸酶係源自布氏擰檬酸桿菌八取5⑴3。 5. =之3:添加劑組合物’其中該植酸酶植酸 6.如前述請求項中任— 項之飼料添加劑組合物，其令 酸酶包含選自由以下組御其中該植 列具有至少70%、較佳妯s丨 (厂、有與Μ下序 佳地至少80%、更佳地至少90%、甚 161722.doc 201234978 至更佳地至少98.6% —致性之胺基酸序列之多肽：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸 23 至 433，及/或 (ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/ 或（iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及/或（vi) SEQ ID No. 10 ; (b)包含以下序 列中之一或多個胺基酸之缺失、插入及/或保守取代之變 體：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸 23 至 433，及/或（Π) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽 部分，及/或（iii) SEQ ID No· 7，及/或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 10 ; 及/或（c)以下序列之片段：（i) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2 之胺基酸 23 至 433，及/或（ii) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/或（iii) SEQ ID No. 7，及/ 或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 10。 7. 如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該植 酸酶包含含有與SEQ ID No_ 1或2之胺基酸23至433具有 至少99.1 % —致性之胺基酸序列之多肽。 8. 如請求項6或7之飼料添加劑組合物，其中該植酸酶與 SEQ ID No. 1或SEQ ID No· 2相比包含至少1個變化且不 超過4個變化，其中該1個至4個變化中之至少一者係選 自以下：4P、46E、107G、11 IP、119K、162C、223E、 24IQ、273L、276K、379K、385D、91C/46C、 52C/99C 、 31C/176C 、 31C/177C 、 59C/100C 、 161722.doc 201234978 141C/199C、162C/247C、iiip/241Q、31C、119K、 202N、286Q及 362K，R。 9. 如凊求項8之飼料添加劑組合物，其中該植酸酶與seq ID No. 1或SEQ ID No. 2相比包含至少1個變化且不超過4 個變化，其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以 下：91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、 59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q。 10. 如前述請求項中任__項之飼料添加劑組合物，其中該植 酸酶具有在3至4.5範圍内之最佳ρΗβ 11. 如前述請求項W項之飼料添加劑組合物，其中該植 酸酶具有介於3與3.5之間之最佳ρΗ。 12. 如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該直 接飼餵微生物係抗病原體直接飼餵微生物。 13. 如前述請求項中任—項之飼料添加劑組合物，其中該直 接飼餵微生物係活的細菌。 14. 如前述請求項t任—項之飼料添加劑組合物，其中該直 接飼傲微生物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌 (Lactobacillus)、乳球菌（Lact〇e〇ccus)、鍵球菌 (Streptococcus)、芽抱桿菌（BaciUus)、片球菌 (Pedi〇C〇CCUS)、腸球菌（Enterococcus)、明串球菌 (LeUC〇n〇St〇c)、肉桿菌（Carn〇bacterium)、丙酸桿菌 (Pr〇pi〇nibaCterium)、雙歧桿菌（Bifidobacterium)、梭菌 (Clostridium)及巨球形菌（Megasphaera)及其組合。 15·如前述請求項中任—項之飼料添加劑組合物，其中該直 161722.doc 201234978 接飼傲微生物包含以下一或多種菌種的細菌：枯草芽孢 桿菌（Bacillus subtilis)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、解澱粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、屎腸球菌（Enterococcus faecium)、 腸球菌屬（Enterococcus spp)、及片球菌屬（Pediococcus spp)、乳桿菌屬（Lactobacillus spp)、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium spp)、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus)、乳酸片球菌（Pediococsus acidilactici)、雷 特氏乳球菌（Lactococcus lactis)、兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacterium bifidum)、 特氏丙 酸桿菌 (Propionibacterium thoenii)、香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳桿菌（lact〇bacillus rhamn〇sus)、 丁酸梭菌（Clostridium butyricum)、動物雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium animalis ssp· animalis)、羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)、臘狀芽孢桿菌（BacUlus cereus)、唾液乳桿菌屬（Lact〇baciUus salivarius up salivarius)、埃氏巨球形菌（Megasphaera 61以的丨丨）、丙酸 桿菌屬（Propionibacteria sp)及其組合。 16. 如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該直 接飼飯微生物係呈内生孢子形式。 ' 17. 如前述請求項中任—項之飼料添加劑組合物其中該植 酸酶係以介於200 FTU/g飼料添加劑組合物㈣刪 FTU/g飼料添加劑組合物間之劑量存在。 18. 如前述請求項中任一瑁 項之飼料添加劑組合物，其中該蛋 161722.doc 201234978 = :r_PU/g飼料添加劑組合物與_ ]抖添加劑組合物間之劑量存在。 g 19 20. 21. 22. 23. 24. 則述請求項中任一項之飼料添加劑組 〇?1^係以介於3 7 7 口初具中該 CFT“ g料添加劑組合物與 g飼料添加劑組合物間之劑量存在。 :種以下方法：改良個體之性能、或改良飼料中之 、消化率（例如營養素消化率，如： ，、’ 胺基S夂 化率）、戍 e良氮保留量、或避免壞死性腸炎之負面影響、或" =轉化率(FCR)、或改良個體之重量增加、或改良： 體中之飼料效率、或調節(例如改良)該個體之免疫反 應、或促進個體之胃腸道中的有益細菌生長，該方法包 括向個體投與直接飼M微生物（_)與可源自檸樣酸桿 菌屬之植酸酶之組合。 如請求項20之方法，其包括投與如請求項1至19中任一 項之飼料添加劑組合物。 如印求項20或21之方法，其中該植酸酶可源自選自由以 下組成之群之擰檬酸桿菌細菌：布氏檸檬酸桿菌、弗氏 檸檬酸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌、吉氏檸檬酸桿菌、 中間檸檬酸桿菌、柯瑟氏檸檬酸桿菌、鼠類檸檬酸桿 菌、齧齒類檸檬酸桿菌、塞拉克氏檸檬酸桿菌、沃克曼 氏檸檬酸桿菌及楊葛氏檸檬酸桿菌。 如請求項20至22中任一項之方法，其中該植酸酶係源自 布氏檸檬酸桿菌。 如請求項20至23中任一項之方法，其中該植酸酶係源 16l722,doc 201234978 布氏檸檬酸桿菌ATCC 5 1113。 25. 如請求項20至24中任一項之方法，其中該植酸酶係6_植 酸酶（E.C· 3.1.3.26)。 26. 如請求項20至25中任一項之方法，其中該植酸酶包含選 自由以下組成之群之多肽：（a)具有與以下序列具有至少 70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%、甚至更佳地至 少98_6%—致性之胺基酸序列之多肽：⑴SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸 23 至 433，及/或（ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/或（iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及/或（vi) SEQ ID No. 10 ; (b)包含以下序列中之一或 多個胺基酸之缺失、插入及/或保守取代之變體：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No· 2 之胺基酸 23 至 433，及/或 (ii) SEQ ID NO·· 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/ 或（iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（vi) SEQ ID No· 10 ;及 /或（c)以下 序列之片段：（i) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之胺基酸 23 至 433，及/或（ii) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No· 2之成熟 多肽部分，及/或（iii) SEQ ID No. 7，及/或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No· 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 10 ° 27.如請求項20至26中任一項之方法’其中該植酸酶包含含 有與SEQ ID No 1或2之胺基酸23至433具有至少99.1°/〇 — 致性之胺基酸序列之多肽。 161722.doc • 6 - 201234978 28. 如請求項20至22中任一項之方法，其中該植酸酶與SEq ID No. 1或SEQ ID No. 2相比包含至少1個變化且不超過4 個變化，其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以 下：4P、46E、107G、llip ' 119K、162C、223E、 . 241Q、273L、276K、379K、385D、91C/46C、 52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、 162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q 及 362K，R。 29. 如請求項28之方法，其中該植酸酶與SEq ID N〇. i或 SEQ ID No. 2相比包含至少1個變化且不超過4個變化， 其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以下： 91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、 141C/199C、162C/247C、111P/241Q。 30. 如請求項20至29中任一項之方法，其中該植酸酶具有在 3至4.5範圍内之最佳pH。 31. 如請求項20至30中任一項之方法，其中該植酸酶具有介 於3與3.5之間之最佳pH。 . 32.如6青求項20至31中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物係抗病原體直接飼餵微生物。 33. 如請求項20至32中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物係活的細菌。 34. 如請求項20至33中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌、乳球菌、鏈 球菌、芽孢桿菌、片球菌、腸球菌、明串球菌、肉桿 161722.doc 201234978 菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌及巨球形菌及其組合。 35. 如請求項20至34中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌種的細菌：枯草芽孢桿菌、地衣 芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、屎腸球菌、腸球菌屬、及 片球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸 片球菌、雷特氏乳球菌、兩歧雙歧桿菌、特氏丙酸桿 菌 '香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、丁酸梭菌、動物雙歧 桿菌屬、羅伊氏乳桿菌' 臘狀芽孢桿菌、唾液乳桿菌 屬、埃氏巨球形菌、丙酸桿菌屬及其組合。 36. 如請求項20至35中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物係呈内生孢子形式。 37. 種直接飼傲微生物（DFM)與可源自檸檬酸桿菌屬之植 酸酶之組合之用途，其用於改良個體之性能、或改良飼 料中之原料的消化率(例如營養素消化率，如：胺基酸消 化率）、或改良氮保留量、或避免壞死性腸炎之負面影 響、或改良飼料轉化率（FCR)、或改良個體之重量增 加、或改良個體中之飼料效率、或調節（例如改良）該個 體之免疫反應、或促進個體之胃腸道中的有益細菌生 長。 °月求項37之用途，其中使用如請求項1至19中任一項 之飼料添加劑組合物。 39 求項37至38中任一項之用途’其中該植酸酶可源自 菌、由以下组成之群之檸檬酸桿菌細菌：布氏檸樣酸桿 、弗氏檸檬酸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌、吉氏檸檬 16I722.doc 201234978 酸桿菌、中間檸檬酸桿菌、柯瑟氏檸檬酸桿菌、鼠類棒 檬酸桿菌、齧齒類檸檬酸桿菌、塞拉克氏檸檬醆桿菌、 沃克曼氏檸檬酸桿菌及揚葛氏檸檬酸桿菌。 40. 如請求項37至39中任一項之用途，其中該植酸酶係源自 布氏檸檬酸桿菌。 41. 如請求項37至40中任一項之用途，其中該植酸酶係源自 布氏擰檬酸桿菌ATCC 5 111 3。 42. 如請求項37至41中任一項之用途’其中該植酸酶係6植 酸酶（E.C. 3.1.3.26)。 43. 如請求項37至42中任一項之用途’其中該植酸酶包含選 自由以下組成之群之多肽：（a)具有與以下序列具有至少 70%、較佳地至少80。/。、更佳地至少90%、甚至更佳地至 少98_6°/〇—致性之胺基酸序列之多肽：⑴SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2之胺基酸 23 至 433，及/或（ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/或（iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及/或（vi) SEQ ID No. 10 ; (b)包含以下序列中之一或 多個胺基酸之缺失、插入及/或保守取代之變體：（i) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2之胺基酸 23 至 433，及/或 (ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/ 或（iii) SEQ ID No· 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No_ 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 10 ;及/或（c)以下 序列之片段：（i) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之胺基酸 23 至 433，及/或（ii) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之成熟 161722.doc -9- 201234978 多狀部分，及/或（ii〇 SEQ ID No. 7 ’ 及/或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 10 〇 44. 如請求項37至43中任一項之用途’其中該植酸酶包含含 有與SEQ ID No 1或2之胺基酸23至433具有至少99.1% — 致性之胺基酸序列之多肽。 45. 如請求項3 7至44中任一項之用途，其中該植酸酶與SEQ ID No. 1或SEQ ID No_ 2相比包含至少1個變化且不超過4 個變化，其.中該1個至4個變化中之至少一者係選自以 下：4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E ' 241Q、273L、276K、379K、385D ' 91C/46C、 52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、 162C/247C ' 111P/241Q、31C、119K、202N、286Q 及 362K，R » 46_如請求項45之用途，其中該植酸酶與SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 2相比包含至少1個變化且不超過4個變化， 其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以下： 91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、 141C/199C、162C/247C、111P/241Q。 47. 如請求項37至46中任一項之用途，其中該植酸酶具有在 3至4.5範圍内之最佳pH。 48. 如請求項37至47中任一項之用途，其中該植酸酶具有介 於3與3 ·5之間之最佳pH。 49. 如請求項37至48中任一項之用途，其中該直接飼餵微生 161722.doc -10* 201234978 物係抗病原體直接飼餵微生物》 5 0·如請求項37至49中任一項之用途，其中該直接飼餵微生 物係活的細菌。 51.如請求項37至50中任一項之用途，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌、乳球菌、鏈 球菌、芽抱桿菌、片球菌、腸球菌 '明_球菌、肉桿 菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌及巨球形菌及其組合。 52·如請求項37至51中任一項之用途，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌種的細菌：枯草芽孢桿菌、地衣 芽抱桿菌、解澱粉芽孢桿菌、屎腸球菌、腸球菌屬、及 片球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸 片球菌、雷特氏乳球菌、兩歧雙歧桿菌、特氏丙酸桿 菌、香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、丁酸梭菌、動物雙歧 桿菌屬、羅伊氏乳桿菌、臘狀芽孢桿菌、唾液乳桿菌 屬、埃氏巨球形菌、丙酸桿菌屬及其組合。 53.如請求項37至52中任一項之用途，其中該直接飼飯微生 物係呈内生孢子形式。 54.=套組，其包含直接飼银微生物（DFM)、可源自棒樣 酸桿菌屬之植酸酶、視情況選用之至少—種維生素、視 隋况選用之至少一種礦物質及投與說明書。 55·如=求項54之套組，其中該套組包含如請求項Kb中 ^ 項之飼料添加劑組合物》 56.如 下 :奮求項54或55之套組，纟中該植酸酶可源自選自由以 、且成之群之檸檬酸桿菌細菌：布氏檸檬酸桿菌、弗氏 161722.doc 201234978 檸檬酸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌、 中間檸檬酸俨結. 樣酉夂桿菌、 氏檸檬酸㈣、鼠 菌、每齒類檸檬酸桿菌、塞拉克氏檸檬酸桿菌 才干 氏棒檬酸桿菌及楊葛氏檸檬酸桿菌。干菌'沃克曼 57. 58. 59. 60. 其中該植酸酶係源自 其中該植酸酶係源自 如請求項54至56中任一項之套組 布氏棒檬酸桿菌。 如請求項54至57中任一項之套組 布氏擰檬酸桿菌ATCC 5 1113。 其中該植酸酶係6-植 如請求項54至58中任一項之套組 酸酶（E.C. 3.1.3.26)。 其中該植酸酶包含選 如請求項54至59中任一項之套組 自由以下組成之群之多肽：（a)具有與以下序列具有至少 70%、較佳地至少80%、更佳地至少90% '甚至更佳地至 少98.6%—致性之胺基酸序列之多肽：⑴SEq id NO: 1 或 SEQ ID No. 2 之胺基酸 23 至 433，及/或（ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多肽部分，及/或（iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 /或（v) SEQ ID No. 9，及/或（vi) SEQ ID No. 10 ; (b)包含以下序列中之一或 多個胺基酸之缺失、插入及/或保守取代之變體：⑴ SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No· 2之胺基酸 23 至 433 ’ 及/或 (ii) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之成熟多狀部分，及/ 或（iii) SEQ ID No. 7，及 /或（iv) SEQ ID No. 5，及 / 或（v) SEQ ID No. 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 1〇 ;及/或（c)以下 序列之片段：（i) SEQ ID NO: 1或SEQ ID No. 2之胺基酸 I61722.doc 12 201234978 23 至 433，及 /或（ii) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID No. 2之成熟 多肽部分，及/或（iii) SEQ ID No. 7，及/或（iv) SEQ ID No. 5 ’ 及 /或（v) SEQ ID No· 9，及 /或（vi) SEQ ID No. 10 〇 61. 如請求項54至60中任一項之套組，其中該植酸酶包含含 有與SEQ ID No 1或2之胺基酸23至433具有至少99.1% — 致性之胺基酸序列之多肽。 62. 如請求項54至61中任一項之套組，其中該植酸酶與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2相比包含至少1個變化且不超過4 個變化，其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以 下：4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E ' 241Q、273L、276K、379K、385D、91C/46C、 52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、 162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q 及 362K，R。 63·如請求項62之套組’其中該植酸酶與SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 2相比包含至少1個變化且不超過4個變化， 其中該1個至4個變化中之至少一者係選自以下： 91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、 141C/199C、162C/247C、111P/241Q。 64. 如明求項54至63中任一項之套組，其中該植酸酶具有在 3至4.5範圍内之最佳pH。 65. 如請求項54至64中任一項之套組，其中該植酸酶具有介 於3與3.5之間之最佳pH。 161722.doc •13· 201234978 66. 如請求項54至65中任一項之套組’其中該直接飼餵微生 物係抗病原體直接飼餵微生物。 67. 如請求項54至66中任一項之套組，其中該直接飼餵微生 物係活的細菌。 68. 如請求項54至67中任一項之套組’其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌、乳球菌、鏈 求菌芽抱桿菌、片球菌、腸球菌、明串球菌、肉桿 菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌及巨球形菌及其組合。 69·如請求項54至68中任一項之套組，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌種的細菌：枯草芽孢桿菌、地衣 芽孢和·菌、解澱粉芽孢桿菌、屎腸球菌、腸球菌屬、及 片球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸 片球菌、雷特氏乳球菌、兩歧雙歧桿菌、特氏丙酸桿 菌香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、丁酸梭菌、動物雙歧 桿菌屬、羅伊氏乳桿菌、臘狀芽孢桿菌、唾液乳桿菌 屬埃氏巨球形菌'丙酸桿菌屬及其組合》 :求項54至69巾任-項之套組，其巾該直接飼飯微生 物係呈内生抱子形式。 71. -種製備飼料添加劑組合物之方法，其包括混合直接飼 餵微生物（DFM)與可源自檸檬酸桿菌屬之植酸酶，及 情況）包裝。 72. 種匈料，其包含如請求項β 19中任一項之飼料添加 劑組合物。 长項72之飼料，其中該植酸酶係以介於ρ丁 161722.doc 201234978 飼料與1 000 FTU/kg飼料間之劑量存在。 74. 如請求項72至73中任一項之飼料，其中該〇1?]^係以介於 7·5χ104 CFU/kg飼料與lxl〇7 CFU/kg飼料間之劑量存在。 75. 種製備飼料原料之方法，其包含混合飼料組份與如請 求項1至1 9中任一項之飼料添加劑組合物。 76. —種預混合物，其包含含有直接飼餵微生物與檸檬酸桿 菌植酸酶之組合的飼料添加劑組合物及至少一種礦物質 及/或至少一種維生素。 77· 一種預混合物，其包含如請求項丨至19中任一項之飼料 添加劑組合物與至少一種礦物質及/或至少一種維生素的 組合。 78. 如請求項丨至19中任一項之飼料添加劑組合物，其用於 預防及/或治療個體中之球蟲病及/或壞死性腸炎。 79. -種預防及/或治療壞死性腸炎及/或球蟲病之方法其 中向個體投與有效量之如請求項1至19中任-項之飼料 添加劑組合物。 8〇· -種飼料添加劑組合物或飼料或套組或方法或用途或預 混合物，其係如本文中參照附圖及實例之一般定義。 I61722.doc •15·
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