TW201231663A - Human multipotent embryonic stem cell-like progenitor cells - Google Patents

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TW201231663A TW100137771A TW100137771A TW201231663A TW 201231663 A TW201231663 A TW 201231663A TW 100137771 A TW100137771 A TW 100137771A TW 100137771 A TW100137771 A TW 100137771A TW 201231663 A TW201231663 A TW 201231663A
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Description

201231663 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一群前驅/先驅細胞，其特別富集有多能性類 胚胎幹細胞間葉共同前驅細胞（mesenchymal common progenitor cells，MCPCs)群，及富集該等細胞之方法。 【先前技術】 於再生醫學中，鑑別出高度安全且有效之幹細胞來源，係 為發展生物材料，用以修復及更新損壞及具缺陷的組織之第一 步。人類胚胎幹細胞（hESCs)可保持為未分化的狀態；但當 將之培養於適當環境中時’便會開始自發地分化為多種不同型 態之細胞。此點給予一重要之啟示，在於胚胎幹細胞之培養可 做為生產多種不同細胞型態之來源。然而，此方法卻非有效率 之方法，原因在於仍須控制胚胎幹細胞之分化（參閱：#細應 科學進度及未來研究方向（Stem Cells: Scientific PrOgress and Future Research Directions) ° Department of Health and Human Sevice，2001 年 6 月）。 間葉幹細胞（MSCs)為多能性幹細胞，可分化為多種不 同之細胞型態。MSCs可從胎盤、脂肪組織、肺、骨趙、牙趙 及血液分離。已知MSCs於活體外或活體内可分化之細胞型態 包括成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞及卜胰島細胞。 從骨髓中可發現稀少的MSCs，於1〇,〇〇〇有核細胞中佔約j 個。雖然該MSCs並非永生的，但該等細胞於培養時，具可增 殖數倍之能力，且仍維持其生長及分化多向之潛能。pitt'enger 等人（科學284, 143 (1999))揭露分離的間葉（幹）細胞皆一 致表現 SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、 CD120a、CD124及其他許多表面蛋白；然而該等間葉細胞不 表現造血細胞系之其他標記，包括脂多醣體受器CD14、 CD34，及白血球共同抗原CD45。MSCs可藉由許多分子（包 201231663 含CD44及CD105)之表現以及不表現造血性標記㈣ 及CD14來鑑定。
報導指出，羊膜的間葉基質細胞及人類絨毛膜的間葉美質 細胞可從胎盤中分離。該等細胞之表面抗原表現，如A 所示，顯示其無法表現CD45、CD34、CD14及HLA-DR (PAROLINI 等人，斧細廣 26:300-311,2008)。 表A·羊膜的間葉基質細胞及人類絨毛膜的間葉基質細胞 於2-4代時，其特定抗原之裊規，
陽性泛95°/〇) 陰性 CD90 CD45 CD73 CD34 CD 105 CD14 HLA-DR
Caplice (US 7,790,453 B2)教示衍生自血液的成體平滑肌 先驅細胞為CD34陽性的。然而，Caplice所揭露之平滑肌先 驅細胞並沒有將之特徵化描述為間葉基質幹/先驅細胞，且該 等先驅細胞具有侷限之分化潛能。
Lucas 等人（US 7,259,011 B2)教示表現 CD13、CD34、 CD56及CD117之分離的人類多能的成體幹細胞（ppASCs)。 根據Lucas等人，該PPASCs不會表現CD10、CD14及階段特 異性胚胎抗原SSEA2。該PPASCs亦未被特徵化描述為間葉基 質幹/先驅細胞。
Hariri (US 7,468,276 B2)教示分離的人類胎盤幹細胞為 OCT4+及CD34+。由Hariri揭露之人類胎盤幹細胞為SSEA3_ 及SSEA4-。由Hariri揭露之人類胎盤幹細胞未被特徵化描述 為間葉基質幹/先驅細胞。
Edinger等人（US 2008/0206343 A1)揭露來自胎盤的非附 著之CD34+CD45·幹細胞。根據Edinger等人所述之胎盤幹細 201231663 胞為非附著的，故其非為間葉的。 對於組織工程而言’年輕且可長時 能性幹細麟為組織工賴欲者。 集化多 【發明内容】 因^本發明提供-群類胚胎幹細胞前驅細胞，其係為富 集化之夕能性人類間葉共同先驅細胞（MCpCs)群。^細 胞自人類體細胞組織中，藉由系統性筛選人類間葉g先 驅細胞之方式分離，接著以選自由CD34、CDm、c]^先 CD201及GloboH所組成群組之細胞抗原進行細胞分 =’及-^或多種生長因子之培養基巾。本發明不可預期 現，該專細胞會表現CD34 ;該等細胞於本發明預中|為 MCPCs，其與習知之不表現CD34之人類_基質（幹）細^ 不同。該等MCPCs於初代時會形成球狀細胞聚^，且在活體 外會表現多能性類胚胎幹細胞（ESCs)之特性。 在-扣，本發明提供—群富集化之乡能性人朗葉丘同 先驅細胞（MCPCs)，其被鑑定為間葉基質幹〆先驅細胞了且 具有至少下列特徵：CD14+、CD34+、CDm+、CD# (AC133 )、CD201+、Nestin+、SSEA3+、SSEA4+及 GloboH+。 另-方面’本發明提供-難備本發明之富之多能性 jMCPCs群之方法’包含藉由系統性筛選人類職基質幹 /先驅細胞從人類體細胞組織中分離，接著藉由選自由 fDU7、CD133、CD201、G1〇b〇H戶斤組成之群組之細 胞抗原進行細胞分選，以及將該等細胞培養於添加選自由皮質 類固醇及膽轉所組成群組中至少__或多種_醇，及至少一 或多種選自由表皮生長因子（EGF)、纖維母細胞生長因子 (FGF)、類胰島素生長因子（IGF)、胰島素、血小板衍生生 ^因子（PDGF)、IL_6、及血小板生成素（τρ〇)所組成群板 中生長因子之培養基中。 201231663 .另方面’本發明提供—組合物，其包含包埋於褐藻膠 (alginate)中的本發明之富集化之多能性人類紙代^群二 又另-方面，本發明提供一用於幹細胞培養之供養細胞層 (feeder cell layer)，其包含本發明之富集化之多能性人類 MCPCs 群。 再另一方面，本發明提供一種幹細胞小生境（stem cdl niche)，其包含一支架（scaff〇M)及種植於該支架上之本發明 之富集化之多能性人類MCPCs群。 【實施方式】 本文所使用之「一」意指一個或一個以上（亦即至少一者） 文意所指之物件’除非於文章中另有清楚指出其特定用法僅為 單數形式。 本文所使用之「皮質類固醇」為一群類固醇荷爾蒙。皮質 類固醇之實例包括但不限於A群皮質類固醇（例如，氫化皮 質酮、乙酸皮質醇、及乙酸皮質酮）、B群皮質類固醇（例如， 曲安奈德（triamcinolone acetonide)、曲安西龍醇（triamcin〇1〇ne alcohol)及摩米塔松（mometasone ))、C群皮質類固醇（例如， 貝皮質醇（betamethasone)、貝皮質醇磷酸鈉（betamethas〇ne sodium phosphate)、及地塞米松（dexamethasone))及 D 群皮 質類固醇（例如’氫皮質酮-17-戊酸酯 (hydrocortisone-17_valerat?)、阿氯米松二丙酸酯 (aclometasone dipropionate )及氫皮質酮 7· 丁酸酯 (hydrocortisone-17-butyrate ))。 根據本發明，吾人無預期地發現一群前驅細胞，其係從人 類體細胞組織中分離’且該等細胞被鑑別為間葉基質幹/先驅 細胞，其至少會表現0〇14、€〇34、€〇117、〇〇133(八(：133；)、 CD2(n、Nestin、SSEA3、SSEA4 及 GloboH (該鈿胞稱為 MCPCs)。該MCPCs可以下列方法取得，包含之步驟：藉由 系統性筛選人類間葉基質幹/先驅細胞從人類體細胞組織中 201231663
分離’接著以選自由 CD34、CD117、CD133、CD201 及 GloboH 所組成群組之細胞抗原進行細胞分選，以及將該分選之細胞培 養於添加有至少一或多種類固醇，及一或多種生長因子之培養 基中；、其中該類固醇係選自由皮質類固醇、膽固醇、及其組合 所組成之群組；該生長因子係選自由表皮生長因子（EGF)、 纖維母細胞生長因子（FGF)、類胰島素生長因子（〗GF)、胰 島素、血小板衍生生長因子（PDGF)、IL-6、血小板生成素 (TPO)及其組合所組成之群組。本發明iMCpCs會依附於 組織培養表面，此點與Edinger等人（US 2008/0206343 A1) 所揭露之CD34+、CD45-胎盤幹細胞不同。 本發明之MCPCs可從人類體細胞組織中分離，該體細胞 組織包含但不限於新生兒胎盤（例如，羊膜、絨毛膜及臍帶）、 子宮内膜、齒齦、骨髓及脂肪。較佳地，該McpCs係從胎盤、 子宮内膜及齒齦分離。更佳地，該MCPCs係從胎盤羊膜組織 分離。根據本發明，從胎盤羊膜組織分離之McpCs被稱為 AM-MSCS-CD34+細胞；從子宮内膜所分離之MCpCs被稱為 EnMSCs-CD34+細胞；從齒齦所分離之MCpCs被稱為 GMSCS-CD34+細胞。具體而言，am-mscs-cdw細胞、 EnMSCs-CD34+細胞及GMSCs-CD34+細胞之細胞表面標記具 有一致之表現圖譜。於本發明中，該MCpCs於初代時具有球 狀之細胞聚落生成，且於活體外表現出多能性類胚胎幹細胞 (ESCs)之特徵。型態上，本發明之厘口^較^^爭MSCs 短小。具體而言，相較於CD34_MSCs或未分選之MSCs，本 發明之MCPCs具有較高之生長速度，意指本發明之MCpCs 較具增生性及較為年輕。 根據本發明’該MCPCs均質地表現胚胎的（例如，〇ct_4、
Nanog、Rex-1、Sox-2)、幹細胞性（例如，CD117、CD34、
CD44 )表面抗原，且亦會表現多種不同細胞系標記，包含MSC (例如 ’ CD29、CD90、CD73、CD105、CD106)、血液血管 生成的（hem-angi〇genic)(例如，AC133、CD34)、肌神經生 7 201231663 成的（myo-nurogenic)(例如 ’ CD54、Nestin、NS^。再者， 本發明之MCPCs為長時間自我更新的（pr〇1〇nged seif-renewai)。根據本發明之部分具體實施例，該MCpCs (例 如’ AM_MSCs_CD34細胞）可㈣住狀細捕記的表 CD34、CD54、CD117及AC133陽性，且該等細胞之Msc桿 記之表現甚至可維持超過20代。 〃 因此，在一方面，本發明提供富集化之多能性人類間葉共 同先驅細胞群（MCPCs) ’其被鑑別為間葉基質幹，先驅細 胞’其至少具有以下特徵：CD14+、CD34+、CD117+、CD1；3；3+ (AC133 )、CD201+、Nestin+、SSEA3+、SSEA4+及 GloboH+。
根據本發明之較佳具體實施例，該MCpCs進一步具有下 列特徵中至少一者：CD44+、CD54+、CD56+、cm〇5+、CD 或 PDGFR+。 根據本發％ ’該MCPCs具^分化為外胚層纟、中胚層系 及内胚層系之細胞或組織之潛能。在本發明一具體實施例中: 檢驗AM_MSCs.CD34+細胞並發現其為多能性，可分化為多種 不同之體細胞麵’包轴胚層、+崎或外胚層細胞。 在本發明之較佳具體實施例中，該McpCs具有脂肪生成 的分化潛能、成骨生成的分化潛能、軟骨生成的分化潛能、神 經生成的分化潛能、心肌生成的分化潛能、内皮生成的分化 能及肝分化潛能。 另一方面，本發明提供用以製備富集化之多能性人類 MCPCs群之方法’其包含藉由纟紐魄人朗葉基質幹/ 先驅細胞從人㈣峨中分離，並藉由細胞抗原進行細胞分 選，該細胞抗原係選自由CD34、Nestin、CDm、CD133及 其組合所組成之群組，以及將該分選細胞培養於添加至少一或 多種類固醇及—或多種選自由表皮生長因子（EGF)、纖維母 細胞生長因子（FGF)、類姨島素生長因子（IGF)、姨島素、 血小板衍生生長因子（PDGF)、瓦_6、血 及其組合所組成之群組之生長因子之培養基卜齡 201231663 根據本發明之部分具體實施例，該培養基可進一步添加一 或多種選自於由維生素A、維生素B群、維生素e、生物素、 P·氨基苯酸及維生素K3所組成之群組之維生素，以及一或多 種選自於由尿嘧啶、醋酸鈉、核糖、鳥嘌呤鹽酸（Guanine HC1)、去氧核糖、腺[核]苷酸、硫酸腺嘌吟、確酸鐵所组成之 群組之化合物。 ’ 在本發明之較佳具體實施例中，該細胞分選係藉由螢光活 ^匕細胞分選（FACS)流式細胞儀進行。較佳地，該細胞分選 係為 CD34、CD117、CD133、CD201 或 GloboH 細胞抗原 FACS。 又另一方面’本發明提供一組合物，其包含包埋於褐藻膠 中的本發明之細胞。 再-方面，本發明提供-種用於幹細胞培養之供養細胞 層。該供養細胞層包含本發明之富集化多能性人類McpCs群。 因此，相較於習知來源，如ESCs，本 生成的類ESC幹細胞的較佳來源，其係衍生自=== 或成體組織，且具分化為多種不同細胞型態之多能性。 ^ICPCs被發現具有增生能力及分化潛能。該Mcpcs ^ ，佳潛力可供臨床再生療法麵。本發_由町 _ 實施例以進一步說明。 利汪 用於以下實施例之人類組織之取得方式，係使用國泰 驗委貞會及台北1學大學人體試驗委貞會所認可之方 實施例1 : AM-MSCs-CD34+細胞之製備及特徵化 羊膜的間葉細胞之分離 (1) 羊膜之分離： ,將羊膜（約3〇〇cm2、n = 9)從絨毛臈上剝落，並以卜 緩衝液150 ml沖洗三次以清除血液。 s (2) 移除羊膜表皮細胞： 為了將羊膜表皮細胞（Am-EpCs)去除， 2 膜而言，將洗好之羊膜切成2_3 ^之片段，並二置‘^ 201231663 lx Hanks 平衡鹽類溶液（Gibco; CAT# 14185-052; Grand Island， NY)之 100 ml 0.1%胰蛋白梅_EDTA (Sigma; st L〇uis，M〇) 中進行培養’並於37°C水浴中進行四次反應，每次15分鐘。 (3) 收集細胞群落生成的的羊膜間葉基質細胞 (AM-MSCs): 為了分離羊膜間葉基質細胞（AM-MSCs )，將去除 Am-EpCs的羊膜以Hank’s緩衝液洗滌一次，並以膠原蛋白梅 1A，於37°C進行消化45-60分鐘。以適當體積之Hank，s緩衝 液及40μιη尼龍細胞過濾器收集細胞群落生成的。 (4) 培養AM-MSCs : 經170g離心後，將AM-MSCs以每平方公分5 X 1〇4細胞 數目置於CELL-BIND T75角瓶中，並於5% C02、37°C進行 培養。將收集之AM-MSCs以添加胎牛血清（FBS)、表皮生 長因子（EGF)、及氫化皮質_之培養基199 (M199調整培養 基）（Lonza CAT# 12-118F; Switzerland)進行培養。於純化培 養過程中’每3〜4天更換新鮮培養基，於第7天時，細胞可 增殖至80%細胞稠度。以0.1%胰蛋白腾_EDTA收獲貼附的培 養細胞’並將之以每T75角瓶lxl05細胞數目分殖，以進行新 一代細胞培養。 或者，將收集的CM-MSCs於添加胎牛血清(FBS) (10%)、 丙酮酸鈉(0.1 mM)、驗性纖維母細胞生長因子(bFGF)、及EGF (10 ng/ml)之 RPMI-1640 (GIBCO; Grand Island，NY)進行培養。 當細胞達到70〜80%之細胞稠度時進行分殖，且每隔3〜4天更 換培養基。 流式細胞分析 為了進行FACS分析，將新鮮收獲之AM-MSCs進行胰蛋 白晦化，並將之與等分量之螢光(FITC或PE)結合之單株抗體 (mAbs)進行培養，根據製造商之建議，於1〇〇 μΐ碟酸緩衝液、 4°C作用30分鐘。用以分析之細胞標記包含間葉幹細胞(MSC) 系(CD29、CD90、CD73、CD105、CD106、間絲蛋白(Vimentin))、 201231663 幹細胞性（CD34、CD44、CD117)、血液-血管生成的 (hem-angiogenic) (AC133、CD34)、肌-神經生成的 (myo-neurogenic)(CD54、巢蛋白(Nestin))、及纖維母細胞標記 (間絲蛋白、α平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin))。並 以 FACSCanto 流式細胞儀系統(BD Bioscience，San Jose，CA) 分析該等細胞。該流式細胞分析資料遂以FCS Express V3軟體 (De Novo; Canada)處理。 流式細胞儀分選 將培養至2〜3代之增殖的初代AM-MSCs以CD34抗體標 記，以分離CD34+AM-MSCS亞群。根據製造商之操作方式， 以 FACS Aria 流式細胞儀(BD Bioscience，San Jose，CA)進行細 胞分選，可分選出高達3 χ 106之細胞。再將CD34陽性(CD34+) 及CD34陰性(CD34·)之細胞進行分析、分選及收集。 簡言之’將收獲之3-4 X 106第三代AM-MSCs以胰蛋白晦 處理，將之以PE —結合之CD34進行標記(根據製造商建議方 式）’於100 μΐ磷酸緩衝液中、室溫下反應15分鐘。接著，將 細胞以40 μπι之尼龍細胞過滤器（Becton, Dickinson and Company CAT# 352235)進行過濾，並以 BD FACS Aria 分選出 AM-MSCs-CD34+及AM-MSCs-CD34_之細胞群。經過分選後， 該AM-MSCS-CD34+及AM-MSCs-CD34·之細胞群會進行再分 析，以分析出陽性部分，並將之於前述M199調整培養基或 RPMI調整的培養基中進行增殖。AM-MSCs(第三代)之細胞型 態顯示於第一圖，其中AM-MSCS-CD34+細胞形狀(第一 A圖） 較AM_MSCs-CD34·細胞(第一 B圖)短小，且兩者於後幾代中 都顯示相當穩定。AM-MSCS-CD34-細胞之起始倍增時間約為 42小時’其較AM-MSCs-CD34+細胞的34小時來得長。接下 來，每5代確認AM-MSCs之CD34表現。經過CD34+分選20 代後，CD34+ AM-MSC仍可維持其特定之細胞標記表現，如
CD34、CD54、CD117、及 CD133 (AC133)陽性，及其 MSC 標記表現。吾人發現，於該細胞之每一代中除了 CD34之外之 11 201231663 每一個CD及基因標記都高度表現，而第一代細胞之CD34表 現(50〜60%)則低於其於第三代或第九代(約100%)。CD34+及 CD34-分選之 AM-MSC 均表現 CD29、CD44、CD73、CD90、 CD 105、EGFR 為陽性，且 CD31 為陰性。然而，CD34+AM-MSC 較CD34· AM-MSC表現更多之CD56及PDGFR。參見第二A 圖。再者，CD34+ AM-MSC較CD34_ AM-MSC表現更多之 CD117、CD133、SSEAl、SSEA3、SSEA4、GloboH&CD201^ 二B圖）。亦藉由rt-PCR分析特定基因之表現(資料未呈現）。 結果顯示AM-MSCS-CD34+細胞會表現「早期基因」包含 Sox-2、Oct-4、Rex-Ι及Nanog，外胚層系基因，例如，包括 巢蛋白(Nestin)、NSE、NFM、NCAM、MAP2之神經分化標 記’中胚層系基因，例如，包括My〇D、GATA_4及MLC-2a 之心肌生成分化標記，及内胚層系基因，例如，包括白蛋白及 HGF之肝分化標記。 實施例2:分化之誘導 (1) 血管生成分化 使用第5代、細胞數目為2xl〇5之AM-MSCS-CD34+細胞 進行血管生成分化之誘導。收獲之細胞以EGM_2培養基 (Cambrex)培養，進行 7 天誘導。以 Matrigel (BD Biosciences) 進行微血管形成之分析。具體地，經過綉導培養後，以胰蛋白 晦處理AM-MSCS-CD34+，並以每孔1〇5細胞之細胞密度置於 Matrigel塗佈的24孔盤上(Matrigel: M199 = 1:1)。在接下來三 天’於2、4、24及48小時後，以光學顯微鏡觀察到微血管狀 之結構。 (2) 心肌生成分化 收獲第4-6代之經分選的AM-MSCS-CD34+細胞，用以誘 導心肌生成分化。該AM-MSCS-CD34+細胞以生長培養基[添加 10%FBS、及 MEM 非必須胺基酸(1X) (GIBCO)之 EGM-2: Ml 99 (v : v = 1 : 3)]進行整夜培養。次日早上，將細胞以每平方公分 1〇4個細胞之細胞數目移至心肌生成分化培養基[添加2%馬血 12 201231663 清(GIBCO)、lx MEM非必須胺基酸、lx胰島素_轉鐵蛋白·硒 (GIBCO)之 imdm (GIBCO):含有 GlutaMAX-1 (GIBCO)之
Ham’s F12營養混合物(v:v = 1:1刀。經過6_8小時後，將心肌 細，分化劑5_氮胞苷(Sigma)加入培養基中，使該分化劑之最 終濃度為5 μΜ。每天將4ul/ml 5·氮胞苷(〇.25碰)之原液加入 該分化培養基中，並於第四天換回無添加5_氮胞苷之分化培養 基。於分化分析之第6天’將抗壞血酸（1〇-4 M) (Sigma)及 TGFfl (1 ng/mi)(peoproTech)加入培養基中。從此時間點之 後，每隔幾天添加抗壞血酸及Ταρ_β1，且每週兩次。根據培 養基之pH變化，每2〜3天更換培養基。當更換培養基時，若 有細胞碎片應以PBS清洗以移除。於28天分化培養後，固定 該心肌生成之AM-MSCS-CD34+細胞以進行組織化學染色。藉 由5-氮胞苷誘導肌生成，cD34+AM-MSCs(P5)可輕易轉分化 為心肌細胞’且會表現MyoD、GATA-4、MLC-2a基因（資料 未呈現）。心肌生成分化28天後以組織化學染色分析，CD34+ 及CD34 AM-MSfs兩者皆會表現肌凝蛋白重鏈(_匸），但僅 有受誘導之CD34 AM-MSCs形成典型的心肌細胞型態，且表 現末端分化標記肌I弓蛋白T (Troponin T)(資料未呈現）。 β)肝分化 肝分化之細胞標記的表現情形，呈現於下表丨中。 表1· AM-MSCs-CD34+細胞(第6代)之肝分化細胞標記的 表現情形 細胞標記 AM-MSCs-CD34+ 對照組 基因 DAPI +++ +++ Cy3(白蛋白） +++ — FITC (細胞角質蛋白） +++ — 蛋白質 GAPDH +++ +++ 白蛋白 +++ HGF - —— ++ — 13 201231663 (4)脂肪生成、成骨生成及軟骨生成分化 藉由實施例1所述方法以取得之AM-MSCS-CD34+細胞， 於增殖5-6代時，可於多細胞系之分化誘導。該脂肪生成、成 骨生成、軟骨生成分化、及神經生成分化可藉由以下之方法進 行。 先將AM-MSCs或AM-MSCS-CD34+細胞置於添加10〇/〇 FBS (Hyclone)之 Dulbecco’s 修改的 Eagle’s 培養基 (DMEM/LQ GIBCO)中進行適應(pre-conditioning)，再以以下 之細胞系分化培養基進行誘導： 1) 脂肪生成(AM):添加10〇/〇FBS、0.5mM異丁基甲基花 黃素钿(^11以1-11^1^1乂〇11仙1祀）、1|11]^地塞米松、1〇(4]^胰島 素、2〇0 μΜ引朵美甲辛(indomethacin)之DMEM/LG培養基。 2) 成骨生成(OM):添加10% FBS、0.1 μΜ地塞米松、50 μΜ抗壞血酸-2-填酸酯、10 mM β-鱗酸甘油酯之DMEM/LG培 養基。 °
3) 軟骨生成(CM):添加1%FBS、6.25 pg/ml胰島素、1〇 ng/mlTGF-βΙ (R&D)、50nM 抗壞血酸_2_磷酸酯之 DMEM/LG 培養基。 4) 神經生成(NM):添加5 pg/ml胰島素、200 μΜ引朵美 曱辛、0.5 mM異丁基甲基花黃素之DMEM^LG培養基。（以 上用於分化之試劑皆來自Sigma; StLouis, MO) 將細胞密度調整為3xl〇4細胞/cm2，以進行脂肪生成、成 骨生成、及神經生成分化。為了進行軟骨生成分化，需以較高 細胞密度1-2χ105/10μ1之細胞用於形成軟骨球體。於所有分化 試驗中，每3至4天更換培養基，且經過14天之脂肪生成、 成骨生成、軟骨生成分化後將細胞固定以進行組織化學染色。 14天後’於油紅0染色（oil-red 0 stain)下可觀察到：細胞内 之油滴生成’以及鈣化之細胞外基質之產生，以及v〇n Kossa 染色為陽性(資料未呈現）。於軟骨分化中，AM_MSCs_CD34+ 細胞於3天可形成軟骨球。將AM_MSCs-CD34+細胞以神經生 201231663 ^分化培養基(Zuk’s方法，P4，第21天)培養可產生神經的型 匕、及表現出神經的標記，包含巢蛋白(Nestin)、NSE、NFM、 .· NCAM、及MPA2 ’然而AM-MSCs-CD34-細胞則不會表現前 述標記(資料未呈現）。 • (5)神經生成分化 步驟1.神經球形成：將細胞以每孔1〇〇〇個細胞之密度 培植於神經球培養基QSJS培養基）中。NS培養基： DMEMa〇/F12 (1：1) + ix B27 + 20 ng/ml EGF + 20 ng/ml FGF2 Mg/mi肝素(Heparin)。活體外第七天，計算大於75叫 之初代神經球(主要選擇為漂浮的神經球)之數量。步驟2 :神 經分化試驗：以胰蛋白酶_EDTA溶液將神經球分離成單細胞， 並以DMEM/F12 + 5% FBS培養該等細胞24小時。將該等細 胞以特定的神經細胞分化培養基處理。用於神經分化之培養基 為添加 2% FBS、10 ng/ml PDGF、50 ng/ml BNDF、及 50 ng/ml GDNF之DMEM/F12。第三A圖為以CD34分選之MSCs進 行神經的及募樹突細胞分化之示意圖。第三B圖為以CD34 刀選之MSCs進行多巴胺神經元分化之示意圖。 經7至9天後，藉由使用免疫螢光染色(GFAp結合FITC、
Hochest33258、及TiJl結合羅丹明(rhodamineX)以評估分化之 能力。待初代神經球形成後，CD34+及CD34.AM-MSC皆會表 現TuJl(神經元專一的標記）。然而’ 〇〇34+ AM-MSC誘發之 神經元的GFAP(神經膠細胞專一的標記)表現則幾乎不可見。 另一方面，部分CD34- AM-MSC所誘發之神經元會表現 GFAP，此暗示一部分受誘導CD34-AM_MSC細胞分化為神經 元’而其中一部分則分化為神經膠細胞。於B27誘導中，CD34+ AM-MSC會表現Gale及TuJl ’但不會表現GFAP。至於多巴 胺神經元分化方面’藉由免疫螢光染色偵測，CD34+AM-MSC 誘發之神經元為TuJl、TH及MAP2陽性，而僅有一小部分之 CD34_ AM-MSC所誘發之神經元也會表現該等標記(第四圖）。 (6) 結論 15 201231663 CD34+AM-MSCs表現早期基因，且顯示其具有多能性之 分化潛能。下表2提供了 CD34+ AM-MSC之特定基因表現情 形。 兔j. CD34+AM-MSCs之篡W表現摘要 CD34+AM-MSCs 早期 基因 外胚層 (神經生成分 化） 中胚層 (心肌生成分 化） 内胚層 (肝分化） Sox-2 + 巢蛋白 (Nestin) + MyoD + 白蛋白 + Oct-4 + NSE + GATA-4 + HGF + Rex-1 + NFM + MLC-2a + ι^__ —— Nanog + NCAM + 一 _ _ — — MAP2 + — — — _ 實施例3 :富集自其他體細胞組織之EnMSCs-CD34+細 胞、GMSCs-CD34+細胞及 CD34+MSCs 初代子宮内膜及齒齦組織，係從台北醫學醫院及Dr. Wells 牙醫診所之捐贈者中，依據IRB規範所收集而來。EnMSCs及 GMSCs分別從子宮内膜及齒齦組織中，藉由前述實施例1中 之相似方法取得。EnMSCs及GMSCs接著進行CD34分選。 以CD34分選之人類子宮内膜衍生的間葉幹細胞(p5)之相 位差影像’如第五圖所示。EnMSCs-CD34+細胞之型態與 AM-MSCs-CD34+十分相似。再者，如下表3所提供者，顯示 AM-MSCS-CD34+細胞、EnMSCs-CD34+細胞及 GMSCs_CD34+ 細胞皆具有相同一致之細胞表面標記表現曲線。具體而言，本 發明之間葉共同先驅細胞(MCPCs)為CD 14+、CD34+、Nestin+、 CD117+、CD133+ (AC133+)、SSEA3+及 SSEA4+。再者，本發 明之 MCPCs 亦具有 CD44+、CD54+、CD105+、CD146+或 PDGFR+之特徵。 201231663 表3. MCPCs及CD34 MSCs之細胞表面標記表現 FACS標記表現百分比：一：〇〜20%、+ : 2〇〜40%、++ : 40〜80%、+++ : 80〜100%。 AM-MSCs (P4) EnMSCs (P4) GMSCs (P4) CD34+ CD34- CD34+ CD34- CD34+ CD34- CD29 +++ +++ +++ +++ +++ +++ CD44 +++ +++ +++ +++ +++ +++ CD73 +++ +++ +++ H--1h +++ +++ CD90 +++ +++ +++ +++ +++ +++ CD 105 +++ +++ +++ +++ +++ +++ EGFR +++ +++ +++ +++ +++ +++ 黏素α2β1 (Integrin α2β1) +++ +++ +++ +++ +++ +++ E-J弓黏素 (E-cadher in) _ — — — — — CD34 +++ — +++ — +++ — CD54 +++ + +++ + +++ + PDGFR ++ + ++ + ++ + 巢蛋白 (Nestin) +++ + +++ + +++ + CD14 +++ _ +++ — +++ _ CD117 +++ — +++ — +++ _ 17 201231663 AC133 +++ CD 146 +++
於細峨及細物時間上的 比較，如下表4所示 表4.細胞型y及細胞倍增時間之比齡 AM-MSC (CD34+/CD34-) 細胞型態 CD34+ :較短小 CD34-:較長且纖細 細胞倍增時間 CD34+ : 34 小時 CD34- : 42 小時
EnMSC (CD34+/CD34-) GMSC (CD34+/CD34-) CD34+ :較短小 CD34-:較長且纖細 CD34+ :較短小 CD34-:較長且纖細 CD34+ : 33 小時 CD34- : 47 小時 CD34+ : 32 小時 CD34- : 45 小時 MCPCs及CD34_ MSCs於内皮分化及軟骨生成分化之潛 能，如下表5所示。 表5内皮分化及軟骨生成分化之潛能 内皮分化 軟骨生成分化 AM-MSCs (CD34+/CD34-) CD34+:CD31+、KDR+、 較多管束形成。 CD34_:CD31+、KDR+、 較少管束形成。 CD34+ :較大之軟骨 球(直徑> 2χ)。 CD34-:較小之軟骨 球(直徑< 100 μπ〇。 EnMSCs (CD34+/CD34-) CD34+:CD31+、KDR+、 較多管束形成。 CD34-:CD31+、KDR+、 較少管束形成。 CD34+ :較大之軟骨 球(直徑> 2χ)。 CD34-:較小之軟骨 球(直徑< 100 μιη” 201231663 GMSCs CD34+: CD31+、KDR+、 CD34+ :較大之軟骨 (CD34+/CD34-) 較多管束形成。 球(直徑> 2χ)。 CD34-:CD31+、KDR+、 CD34-:較小之軟骨 較少管束形成。 球(直控< 100 μπι)。 MCPCs及CD34_ MSCs之胚胎基因表現的比較，如下表6 所示。相較CD34_ MSCs，本發明之MCPCs具有較高之胚胎 基因表現。 ° 表6胚胎基因表現比較 早期基因偵測 AM-MSCs (CD34+/CD34-) CD34+: Sox-2 +++, 〇ct-4 +++, Rex-1 +++, Nanog +++ CD34-: Sox-2 +++, 〇ct-4 ++, Rex-1 ++, Nanog ++ EnMSCs (CD34+/CD34-) CD34+: Sox-2 +++, 〇ct-4 +++, Rex-1 +++, Nanog +++ CD34-: Sox-2 +++, 〇ct-4 ++, Rex-1 +++, Nanog ++ GMSCs (CD34+/CD34-) CD34+: Sox-2 +++, 〇ct-4 +++, Rex-1 +++, Nanog +++ CD34-: Sox-2 +++, 〇ct-4 ++, Rex-1 ++, Nanog ++ MCPCs及CD34- MSCs之神經生成分化及心肌生成分化 潛能，如下表7所示。EnMSCs之心肌生成標記的免疫螢光染 色影像’如第六圖所示。 19 201231663 表7.神經生成分化及心肌生成分化之潛能 AM-MSCs (CD34+/CD34-)
EnMSCs (CD34+/CD34-) GMSC (CD34+/CD34-) 神經生成分化 CD34+ : Nestin+、 TuJl+ ' GFAP- ' 典變 神經元形成〇 CD34- : Nestin+、 TuJl(less+)、GFAP- CD34+ : Nestin+、 TuJl+、GFAP-、類神_ 經球結構。 CD34- : Nestin+、 TuJl+ ' GFAP- CD34+ ： Nestin+ TuJl.、GFAP-、類神-經球結構。 CD34- : Nestin+、 TuJl+、GFAP- 心肌生#化 白重: +、肌鈣蛋白τ+室鏈 CD34-:肌凝蛋白 +、肌鈣蛋白丁_ CD34+:肌凝蛋白重鏈 +、肌鈣蛋白τ+。 CD34-:肌凝蛋白重鏈 +、肌鈣蛋白τ_。 ------- CD34+:肌凝蛋白重鏈 +、肌躬蛋白Τ+。 CD34_:肌凝蛋白重鏈 +、肌詞蛋白T-。 根據本發明之方法，CD34+ MSCs可從許多其他體細胞袓 織中富集。一般而言，僅有2-3%之MSCs為CD34+。經過分 離及虽集化之培養，CD34+ MSCs之百分比介於15°/。至78% 間，此取決於該等細胞是從何種組織所分離，以及其捐贈者(參 閱下表8)。該培養富集之CD34+MSCs可以FACS細胞分選以 進一步富集，以取得一 MSCs群，其為含有99。/。或更高富集化 的 CD34+ MSCs。 表8.人類組織之MSCs的幹/先驅標記及基因表現的富集 20 201231663 化 富集化 標記 組織 %CD34+MSCs 於培養中富集 新生兒之胎盤 40 〜70 ί~55 ) 羊膜 48 〜53 (〜50) 絨毛膜 40 〜62 (〜51) 臍帶 34 〜45(〜40) 成熟的體細胞 20 〜78 卜50) 子宮内膜 45 〜78 (〜61) 齒酿 27 〜35 (〜31) 骨髓 20 〜30 (〜25) 脂肪 15 〜30 (〜23) 實施例4 : MCPCs做為供養細胞 使用本發明之MCPCs製備一基質供養物，用以增殖造血 幹細胞(HSCs)。將基質細胞(MS-5、或MSCs)培養於培養盤上， 並待其長滿以成為供養物。將2〜4xl04 CD34+單核細胞(MNCs) 與供養物共同培養於1 ml之HSC培養基中(X-VIVO10 + 50 ng/ml SCF + 50 ng/ml Flt-3L + (20 ng/ml)10U/ml ΤΡΟ + 10 ng/ml IL_6)。經過7天或14天後，計算懸浮細胞，並進行流 式細胞儀分析（針對CD34+CD38-、CD34+CD133+、 CD34+CXCR4+等）。 結果顯示於第七圖中，相較於鼠的MS-5供養物或 MSCs-CD34·供養物’當與 MCPCs(AM-MSCs_CD34+ 細胞)供 養物一同培養時’可獲得更多移植的CD34+CD38-未分化之 HSCs 〇 雖然本發明以上述具體實施例闡述，但該等具體實施例並 非用以侷限本發明。對於該領域具有通常技藝者十分清晰明瞭 21 201231663 的^ ’可針對本發明架構做之不同修飾及變化而不背離本發明 之範疇及精神。根據上述，意指本發明涵蓋對於本發明之^飾 及變化’當該些修飾及變化落入後述的申請專利範圍及其 物之範圍。 、 【圖式簡單說明】 本發明之發明内容以及實施方式，於閱讀時可搭配所附之 圖不以更佳明瞭。 第一圖顯示人類胎盤羊膜間葉細胞之細胞型態。第一 A 圖為AM-MSCs-CD34+細胞之相位差影像。第一 b圖為 AM-MSCs-CD34·細胞之相位差影像。 第二圖顯示 AM-MSCS-CD34+及 AM-MSCs-CD34-細胞之 細胞表面標記的圖譜；其中第二A圖顯示CD29、CD44、 CD73、CD90、CD105、CD3 卜 CD56、EGFR 及 PDGFR 之表 現；以及第二 B 圖顯示 CD34、CD117、CD133、SSEAhSSEA3、 SSEA4、GloboH 及 CD201 之表現。 第三A圖提供以CD34分選之MSCs進行神經的及寡樹突 細胞分化之示意圖。 第三B圖提供以CD34分選之MSCs進行多巴胺神經元分 化之示意圖。 第四圖顯示，於多巴胺神經元誘導後，CD34+或CD34-AM-MSC之TuJ卜TH及MAP2表現狀況；其中第四a圖提 供CD34+ AM-MSC誘導的神經元之TuJl (上圖）、GFAP (中圖） 及DAPI (下圖)之免疫螢光染色影像；第四B圖提供CD34-AM-MSC誘導的神經元之TuJl (上圖）、GFAP (中圖)及DAPI (下圖)之免疫螢光染色影像；第四C圖提供CD34+ AM-MSC 誘導的神經元之TH(上圖）、MAP2(中圖)及DAPI (下圖)之免 疫螢光染色影像；以及第四D圖提供CD34_ AM-MSC誘導的 神經元之TH (上圖）、MAP2 (中圖)及DAPI (下圖)之免疫螢光 染色影像。 22 201231663 第五圓顯示人類子呂内膜間葉細胞之細胞型態，·其中第五 A圖為EnMSCs-CD34細胞之相位差影像，·以及第五b圖為 EnMSCs-CD34-細胞之相位差影像。 # 第六圖顯示EnMSCs-CD34+之心肌生成分化潛能；其中第 六A圖提供’ CD34 EnMSCs經心肌生成誘導後之肌舞蛋白τ (上圖）、肌凝蛋白重鏈（MHC)(中圖)及DAPI (下圖)免疫營光 染色影像；以及第六B圖提供，CD34-EnMSCs經心肌生成誘 導後之肌鈣蛋白T (上圖）、肌凝蛋白重鏈（MHC)(中圖）及 D API (下圖)免疫螢光染色影像。 第七圖顯示，當與老鼠之MS-5供養物、MSCs-CD34+供 養物或MSCs-CD34·供養物一同培養時，帶有特定表面標記之 增殖的造血幹細胞(HSCs)數目。 【主要元件符號說明】 無。 23

Claims (1)

  1. 201231663 七、申請專利範圍： 1. 一種富集化之多能性人類間葉共同先驅細胞（MCPCS )群， 其被鑑別為具有至少以下特徵：CD14+、CD34+、cml7+、 CD133+ ( AC133+)、CD201+、Nestin+、SSEA3+、SSEA4+ 及Gl^>boH+之間葉基質幹/先驅細胞，。 如申請專利範圍第1項之富集化之細胞群，其中該MCPCs 具有下列特徵中至少一者：CD44+、CD54+、CD56+、 CD1〇5+、CD146^PDGFR+〇 如申請專利範圍第1項之富集化之細胞群，其係從人類體 細胞組織分離。 如申請專利範圍第3項之富集化之細胞群，其中該人類體 細胞組織係選自由羊膜、絨毛膜、臍帶、子宮内膜、齒齦、 骨髓及脂肪所組成之群組。 如申請專利範圍第4項之富集化之細胞群，其中該人類體 細胞組織為羊膜。 =申睛專纖’丨項之富集化之多能性人類群， 其具分化成外胚層細胞、中胚層細胞及内胚層細胞之潛力。 ^申明專利範圍第1項之富集化之多能性人類MCpCs群， 其具有脂肪生成分化、成骨生成分化、軟骨生成分化、神 經生成分化、C肌生成分化、内皮分化及肝分化之潛力。 二種，，如帽專利範㈣丨項之富集化之細 法，包含·· ^由系統性篩選人類間葉基質幹/先驅細胞以從人類 體，、田胞組織中分離，接著以選自由CD34、cdii7、cdi33、 =2〇1及GlGbGH顺鱗組之細胞抗雜行域分選， Μ及 ，錄ίΐΐΐ’:胞培養於添加至少一或多種類固醇及-或 長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子 =生長因子⑽)、胰島素、血小板衍生 )、IL-6、及血小板生成素（τρ〇)所組成 2. 3. 4. 5. 6. 8. 24 201231663 群組之生長因子之培養基中。 9. 10. 11. 12. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該人類體細胞組織係 選自由羊膜、絨毛膜、臍帶、子宮内膜、齒齦、骨髓及脂 肪所組成之群組。 如申請專利範圍第8項之方法，其中該細胞分選為螢光活 化細胞分選（FACS)流式細胞法。 一種組合物’其包含包埋於褐藻膠中之如申請專利範圍 項所述之富集化之細胞群。 種用於幹細胞培養之細胞供養層，其包含如申請專利 圍第1項所述之富集化之細胞群。 25
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