TW201134490A - Small inference RNA molecule of indoleamine 2,3-dioxygenase and applications thereof - Google Patents

Description

201134490 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於吲哚胺2,3-二氧化酶之小分子干擾 RNA ( small interference RNA ; siRNA)分子、其醫藥組合 物及用途。 【先前技術】 吲哚胺 2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase » IDO) 是色胺酸（Tryptophan)代謝路徑 • 之速率決定步驟的代謝酵素，能將色胺酸轉換成犬尿氨 酸（Kynurenine)。目前已知吲哚胺2,3_二氧化酶是一種 負向調控免疫反應的酵素，當樹突細胞（dendritic cells) 有°弓丨°朵胺2,3-二氧化酶表現時，T細胞的免疫反應會受 到抑制。 傳統免疫治療會以大量腫瘤相關抗原（tum〇r associated antigen)來誘發免疫反應’然而，這也會造 成大量抑制性細胞激素產生，而進一步誘發病人自身的 調節性T細胞增生，以長期效應來看，這反而會對免疫 籲 反應造成抑制。此外，由於腫瘤相關抗原是一種自體抗 原，可能會引起自體免疫疾病，而導致預期之外的風險。 另一種現存免疫治療方法是利用免疫調節分子的 配體（ligand )與樹突細胞（dendritic cells )的受體 (receptor)結合後改變樹突細胞的免疫反應，進而誘發 抗腫瘤的免疫力。然而，配體_受體間的交互作用相 雜，/無法確定大量表現配體之後是否會造成不專一二配 體-受體接合，造成其他訊息傳導路徑的活化而引作 用。 田 此外，亦有人使用CD25單株抗體來抑制調 細胞’這雖然能顯著提昇免疫治療的效果，然而單株抗 201134490 會造成幾乎是全身性 體的成本很高，影響的範圍很廣， 的抑制，也有一定的風險存在。、 【發明内容】 胺2 ί解ίΐΪ問題’本發明之—目的係提供—種°弓卜朵 ^ 5 "7 ^ ，之siRNA分子，以降低樹突細胞中。引哚 ，·一氧化酶的表現量，活化淋巴結内的CD8+ 丁細 腫瘤細胞的毒殺活性，進而提昇宿主對抗癌症之免 。siRNA是一種具有高度專一性的核酸，其可 A在細β胞内經Dicer蛋白處理而形成。siRNA分子 月j抑制單一基因表現，故十朵胺2,3_二氧化酶之 分子不易引發副作用，^其易於保存，製備過程 此2蛋白類的抗原來得簡單，能夠大大降低成本。而若 將此siRNA分子送至免疫調控中讀突細胞， 引起的效應將更加顯著。 、 a本發明之又一目的係提供包含前述吲哚胺2,3-二氧 化酶之siRNA分子及其醫藥組合物。 為，達上述目的，本發明提供一種用以抑制吲哚胺 2,3-一氧化酶之SiRNA分子，其包括一目標序列，且該 目標序列係選自吲哚胺2,3_二氧化酶基因。 α在本發明之較佳實施態樣中，前述目標序列係選自 吲0木胺2,3-二氧化酶基因之蝙碼區序列1-1224;更佳 者’前述目標序列係為SEQ ID NO:卜 在本發明之較佳實施態樣中，前述siRNA分子進一 步包含一 Her2/neu之基因序列；更佳者，前述Her2/neu 之基因序列為SEQ ID N〇: 6,亦即人類狀“基因之第 25-650個胺基酸。 在本發明之較佳實施態樣中，前述s i RN A分子是一 種shRNA表現質體；更佳者，前述shRNA表現質體包 201134490 含别述目標序列及其反向互補序列。 在本發明之較佳實施態樣中，前述shRNA表現質 體所包含之目標序列係選自吲哚胺2,3-二氧化酶基因之 編碼區序列M224 ;更佳者，前述shRNA表現質體所 包含之目標序列係為SEQ ID NO: 1。 在本發明之較佳實施態樣中，前述shRNA表現質 體進一步包含一 Her2/neu之基因序列；更佳者，前述 Her2/neu之基因序列為SEQ ID NO: 6。 本發明並提供一種醫藥組合物，其包含如前文所述 之siRNA分子及一醫藥可接受載劑。 在本發明之較佳實施態樣中，前述siRNA分子所包 含之目標序列係選自吲哚胺2,3-二氧化酶基因之編竭區 序列M224 ;更佳者，前述siRNA分子所包含之目標序 列係為 SEQ ID NO: 1。 在本發明之較佳實施態樣中，前述siRNA分子進一 步包含一 Her2/neu之基因序列；更佳者，前述Her2/neu 之基因序列為SEQ ID NO: 6。 在本發明之較佳實施態樣中，前述醫藥可接受载劑 為生理食鹽水、磷酸鹽緩衝液（PBS)或滅菌水。 在本發明之較佳實施態樣中，前述醫藥組合物係藉 由基因搶或肌肉注射的方式來進行遞送。 另外，本發明又提供一種如前述σ弓卜朵胺2,3_二氧化 酶之小分子干擾RNA的用途，其係作為DNA疫苗。 紅上所述，本發明係提供一種吲哚胺2,3_二氧化酶 之s i RN A分子、其核酸構築體及醫藥組合物。相較於傳 統作為疫苗使用的蛋白抗原，本發明之siRNA分子具有 下列優點：尚度專一性，不易引發副作用；製備和保存 比傳統蛋白抗原更加簡便，且易於保存，能夠降低製備 201134490 =;使用方便，每週施打-:欠’就能達到治療效果延 長動物的生存時間與減緩腫瘤的生長。 ’、 二—此外，因為dNA疫苗引發免疫反應的同 調節性τ細胞的增生，而抑制免疫負向調控 二氧化酶就可以達到這個㈣，因此融合了 Hef/_腫瘤相關抗原與+朵胺2,3-二氧化酶的DNA 疫苗，不但能生成針對Her2/neu反應的免疫反應，也不 會因為免疫調控細胞而回饋抑制了免疫反應。 此外，本發明之s i RN A分子在單獨使用時就有對抗 癌症的效果，若再搭配相對應的腫瘤相關抗原的其他 DNA疫苗共同使用，則能更增進DNA疫苗的效率。 【實施方式】 下列實施例僅為最佳實施態樣之例示，非意圖限制 本發明之範圍。所屬領域具有通常知識者可藉由本發明 之揭露’在不背離本發明之精神的範圍内做出適度的變 更和修正。 實施例 細胞培養 本發明共使用兩種細胞株：小鼠膀胱癌細胞株 (MBT-2; mouse bladder tumor cells)與非洲猿猴腎細胞 株（Cos7) ’均係利用DMEM培養液（内含i〇 % FBs 及，1%青黴素-鏈黴素）進行培養。 實驗動物模型 本發明之活體内（v/v<9 )實驗係使用4到6週齡 的C3H/HeN雌性小鼠來進行。 201134490 質體建構與疫苗製備 首先使用pHsU6載體及下表1之目標序列（即SEQ ID NO: 1)來建構IDO之shRNA表現質體，其係分別 以前述目標序列作為正向寡核苷酸（forward oligonucleotide )，再找出其所對應之反向寡核苷酸 (reverse oligonucleotide)(即 SEQ ID NO: 3)，並在正 向及反向募核苷酸之間接入環序列（loop sequence) TTCAAGAGA (SEQ ID NO: 5)，最後將包含正向寡核 苷酸、環序列及反向寡核苷酸的shRNA序列於限制酶 C/αΙ與//zWIII切位接入pHsU6載體。如此得出的pHsU6 shRNA表現質體在下文中稱為pHsU6 IDO shRNA。 表1 質體 正向/反向寡核苷酸 5 - GCACTGCACGACATAGCTA-3’ SEQ ID NO: 1 LUU SilKJNA 5 - TAGCTATGTCGTGCAGTGC -3’ SEQ ID NO: 3 IDO shRNA 5 ’ -GGCC ATCTACCC ATGA AGA-3 ’ SEQ ID NO: 2 亂序shRNA 5’ - TCTTCATGGGTAGATGGCC -5’ SEQ ID NO: 4 另依前述方法製作一以IDO shRNA之亂序shRNA (scramble shRNA)作為正向寡核苷酸之shRNA表現質 體’作為後續實驗的控制組，其中前述亂序shRNA係將 IDO shRNA之序列利用InvivoGen的程式siRNA Wizard™ (參見 http://www.sirnawizard.com/)以亂數方 式重新排序而得之不同序列，其正向寡核苷酸為SEQ ID NO: 2，反向寡核苷酸為SEQ ID NO: 4，如表1所示。 將 pHsU6 IDO shRNA 中的 U6 啟動子與 IDO shRNA 序列、以及IDO shRNA之亂序shRNA中的U6啟動子 及亂序shRNA序列分別利用限制酶切位AvrII與EcoRI 一同接到人類-cyto-N’-neu質體中，得出人類 -cyto-N’-neu-IDO shRNA 及人類-cyt〇-N，-neu-IDO 亂序 201134490 shRNA之融合蛋白質體。前述人類-Cyt〇-N’-neu質體係 將人類基因第25到650個胺基酸（SEQ ID NO: 6) 插入 pRC/CMV 載體（Invitrogen)之 #加1 與 Z/zWIII 切 位上所得之質體。 此外並製備一 IDO-Myc質體，其係將吲哚胺2,3_ 二氧化酶基因之編碼區序列1-1224 (SEQ ID NO: 1)接 入pcDNA3.1載體。此一載體將在後續的活體外實驗中 作為細胞中IDO蛋白的來源。而綠色螢光質體 pEGFP-Nl (Clontech)亦在下列實驗中作為標記載體來 使用。 以上質體係使用Plasmid Mega Kit ( QIAGEN，不含 内毒素(endotoxin))加以純化，純化後的shRNA表現質 體可在後續實驗中作為DNA疫苗使用。 本發明之IDO siRNA分子可在活想外（ι>ι νιϊ/Ό)抑制 IDO的mRNA及蛋白表現 使用 LipofectamineTM 2000(Invitrogen)進行轉染。 首先將以5 : 1比例混合的shRNA質體與Lipofectamine 依說明書指示在室溫下混合20分鐘後送入細胞培養盤 (3χ105 /盤孔）進行轉染，轉染24小時。 以 TRIZOL 套組（Invitrogen Life Technologies)抽 取前述經轉染細胞的RNA，再利用MMLV反轉錄酶 (Promega)轉成cDNA，並以RT-PCR來分析這三組細 胞的 IDO 及 HPRT ( hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，為内部控制組）表現量。其 中所用的IDO引子對為： 5，- TGTGGCTAGAAATCTGCCTGT -3’（ SEQ ID NO: 7) 5，- CTGCGATTTCCACCAATAGAG -3’（ SEQ ID NO: 8 ) 另外，所用的HPRT引子對為： 5,-TGCTCGAGATGTCATGAAGG-3, ( SEQ ID NO: 9) 201134490 5’-AGAGGTCCTTTTCACCAGCA-3,（SEQIDNO: 10) 結果顯不於第^圖A。 第一圖A結果顯示，投予本發明之{)1^1；6 100 shRNA質體之細胞的ido表現明顯較只投予生理食鹽 水的控制組及投予pHsU6 IDO亂序shRNA質體之實驗 組來得低，顯示本發明之IDO shRNA表現質體可以抑 制IDO的mRNA表現，具有相似組成的pHsU6 IDO亂 序shRNA質體並不會抑制IDO的mRNA表現。 另外利用RIPA緩衝液收下前述經轉染細胞的RNA 蛋白質樣本，並依常規方法進行西方墨點分析，其中 9 mO-Myc蛋白的初級抗體係使用Calbiochem，OP10 (Myc)的1:2000稀釋液，二級抗體係使用抗小鼠igG 抗體（Cell signaling)的1 : 5000稀釋液。本實驗的内 部控制組為β-肌動蛋白（β-actin )，其初級抗體係使用抗 β-肌動蛋白抗體（MAB1510, Chemicon)的 1 : 5000 稀 釋液，二級抗體係使用抗小鼠IgG抗體（Cell signaling) 的1 : 5000稀釋液。結果如第一圖B所示。 第一圖Β結果顯示，以IDO-Myc及pHsU6載體比 例1 · 1進行共轉染的實驗組細胞會產生大量的IDO-Myc φ 融合蛋白；而在以IDO-Myc及pHsU6 IDO shRNA質體 進行共轉染的實驗組細胞中，IDO蛋白的表現會受到 IDO shRNA的抑制。 本發明之IDO siRNA分子可在活體内（/λ νι·νί〇抑制IDO 的mRNA及蛋白表現 本發明之IDO shRNA表現質體可在活體内 Wvo)降低淋巴結（lymph nodes)内樹突狀細胞（DCs) 的IDO表現。 本實驗係利用基因搶（Low-pressure Gene Delivery System(GDS-80)，購自WEALTEC)分別在小鼠腹部以 201134490 低壓力（50 psi)施打生理食鹽水（控制組）、或施打溶 於生理食鹽水的綠色螢光質體pEGFP-Nl (購自 Clontech) (GFP)與 10 pg 之 pHsU6 IDO 亂序 shRNA 質體或pHsU6IDOshRNA質體，並在施打48小時後犧 牲小鼠，取出小鼠的腹股溝淋巴結（inguinal lymph nodes)，將淋巴結之細胞均質化打散後，利用CD 11 c (N418) Microbeads (Miltenyi Biotec)分離出 CDllc+的 樹突狀細胞。之後先以流式細胞儀（FACS Calibur flow cytometry，購自BD Bioscience )分離出帶有綠色螢光 (GFP+ )的細胞，結果如第二圖A所示，顯示三組細胞 確實轉染成功；再用小鼠IDO多株抗體（Adipogen)染 色，以定出GFP+細胞的吲哚胺2,3-二氧化酶表現量，結 果如第二圖B所示，其量化結果如第二圖C所示。 第二圖B結果顯示，投予本發明之pHsU6 IDO shRNA質體之小鼠的腹股溝淋巴結内樹突狀細胞（DCs) 的IDO表現明顯較投予pHsU6 IDO亂序shRNA質體之 實驗組來得低，顯示本發明之IDO shRNA表現質體可 以抑制IDO的mRNA表現，具有相似組成的pHsU6 IDO 亂序shRNA質體並不會抑制IDO的mRNA表現。 另外，再以前述方法萃取CD11C+樹突細胞的 RNA，並進行RT-PCR，除前述IDO及HPRT引子對外， 並使用另一組 IDO-2 ( indoleamine 2,3-dioxygenase 2 )引子 對： 5，- GGCTTTCTCCTTCCAAATCC -3,（ SEQ ID NO: 11 ) 5’· TTGTCAGCACCAGGTCAGAG -3,（ SEQ ID NO: 12 ) 結果顯示於第三圖。 第三圖A係顯示IDO、IDO-2及HPRT (内部控制 組）之RT-PCR電泳結果，第三圖B則係IDO及IDO-2 的量以HPRT正規化後的結果，說明本發明之IDO shRNA具有高度專一性，並不會干擾同屬一個家族之 201134490 ID02的RNA表現。由上可知，本發明之pHsU6 IDO shRNA質體可在活體内抑制樹突細胞中吲哚胺2,3-二氧 化酶之mRNA的表現，具有相似組成的pHsU6 ID〇亂 序shRNA質體並不會抑制ID〇的mRNA表現。 由第一圖至第三圖的結果可知，本發明之IDO iRNA在活體外及活體内均可抑制吲哚胺2,3-二氧化酶 的表現。 人類-cyto-N’-neu-IDO shRNA在活體外抑制IDO的表 現 如前文所述方法進行細胞轉染及西方墨點分析，但 其中shRNA表現質體係使用人類_Cyt〇_N’-neu質體、人 類-cyto_N’-neu-IDO shRNA 或人類-cyto-N，-neu-IDO 亂 序shRNA質體。結果如第四圖所示。 第四圖結果顯示，以ID〇-Myc質體進行共轉染的實 驗組細胞會產生IDO-Myc融合蛋白（數據未顯示）；而 在以 IDO-Myc 質體及人類_cyto_N，-neu-IDO shRNA 進行 共轉染的實驗組細胞中，IDO蛋白的表現會受到抑制。 而具有相似組成的人類亂序shRNA質 體並不會抑制IDO的表現。Neu蛋白係用以確認轉染成 功。本實驗的内部控制組為β·肌動蛋白（β-actin)，其初 級抗體係使用抗人類neu抗體（ΑΒ20，購自LabVision) 的1:1000稀釋液’二級抗體係使用抗小鼠IgG抗體（Cell signaling)的1 : 2000稀釋液。結果如第四圖所示。 MBT-2腫瘤治療效果評估 將小鼠膀胱癌細胞株MBT-2細胞的濃度調整成 5χ1〇 個細胞/ml PBS，以皮下注射（subcutaneously; s.c.) 的方式在每隻4到6週齡的C3H/HeN雌性小鼠背部植 11 201134490 入lxio6個小鼠膀胱癌細胞，進行攻毒（chanenge)，此 為第1天。之後分別在第8天開始每隔一週投予疫苗， 持續給予直到小鼠死亡。如前文所述以基因搶給予溶於 PBS 的 10 pg 之 pHsU6 IDO 亂序 shRNA 質體或 pHsU6 IDO shRNA質體，每週進行治療一次。療程如第五圖a 所示。其中控制組係施打生理食鹽水。 在注射MBT-2細胞後於特地時間點測量小鼠背上 的腫瘤大小並記錄存活率，以此作為療效評估，結果如 第五圖B及C所示。其中腫瘤計算公式為：F=a2x0x 0.5236，F為腫瘤體積，α為腫瘤寬’ ό為腫瘤長。 第五圖Β結果顯示，與控制組相較之下，投予本發 # 明之pHsU6 IDO shRNA質體或人類-cyt0_N，-neu質體 (即Her2/neu DNA疫苗）都能夠減緩小鼠背上的癌細 胞生長的能力，但投予人類-cyto-N’-neuqDO shRNA質 體（融合DNA疫苗）的效果更佳。 而第五圖C結果顯示，與控制組相較之下，投予本 發明之pHsU6 IDO shRNA質體或人類-cyto-N’-neu質體 (即Her2/neu DNA疫苗）皆具有增加小鼠存活時間的 效果’但投予人類_cyto-N，-neu-IDO shRNA質體（融合 DNA疫苗）的效果更佳。 鲁 由上可知，本發明的吲哚胺2,3-二氧化酶之小分子 干擾RNA能在活體外與活體内有效抑制mRNA與蛋白 的表現’並可在小鼠體内有效抑制膀胱癌細胞的生長， 延長小鼠存活的時間。而將本發明的吲哚胺2,3-二氧化 酶之小分子干擾RNA與小鼠膀胱癌細胞之腫瘤相關抗 原Her2/neu之基因序列融合後，會顯著更進一步地延長 了小鼠的存活時間，證實此策略的確可以提昇抗腫瘤的 免疫反應。總結來說，將出『2/狀11與吲哚胺2,3-二氧化 酶之小分子干擾RNA融合的確是一種能有效治療癌症 12 201134490 的策略。此外，本發明的吲哚胺2,3_二氧化酶 干擾RNA會誘發對抗癌症的免疫反應，能夠 的免疫佐劑，而與其他的免疫療法合併治療。‘、’、優秀 【圖式簡單說明】 第一圖係顯示本發明之ID〇 siRNA可在活 制細胞中吲哚胺2,3·二氧化酶之mRNA與蛋白表現。P 第二圖係顯示本發明之ID〇 siRNA可在 賴突細胞中㈣胺2,3_二氧化酶之蛋白纽。體内抑 第三圖係顯示本發明之IDO siRNA可在活體内抑 制樹突細胞中，朵胺2,3_二氧化酶之抓财表現體内抑 第四圖係顯示本發明之Neu_ID〇 siRNA疫苗可在 活體外抑制細胞中吲哚胺2,3_二氧化酶之蛋白表現。

第五圖為本發明之吲哚胺2,3-二氧化酶的shRNA 表現質體配合腫瘤抗原疫苗在活體内實驗中的結果，其 中（A)為實驗流程’而該活體内實驗的結果係顯示於第五 圖（B)小鼠之腫瘤大小比較；及(c)小鼠之存活率比較。 * : ρ<0·05，** : ρ<〇·〇1。 【主要元件符號說明】 無 13 201134490 序列表 <110>國立成功大學 <120>吲哚胺2,3-二氧化酶之siRNA分子及其應用 <130> 08P0477 <160> 12 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gcactgcacg acatagcta <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 亂序序列

<400> 2 ggccatctac ccatgaaga <210> 3 <211〉 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 tagctatgtc gtgcagtgc <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220>

<223>亂序序列 <400〉 4 tcttcatggg tagatggcc <210〉 5 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 環序列 <400> 5 ttcaagaga <210> 6 <211> 1878 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gtgtgcaccg gcacagacat gaagctgcgg ctccctgcca gtcccgagac ccacctggac atgctccgcc acctctacca gggctgccag gtggtgcagg gaaacctgga actcacctac 201134490

ctgcccacca atgccagcct gtccttcctg caggatatcc aggaggtgca gggctacgtg 180 ctcatcgctc acaaccaagt gaggcaggtc ccactgcaga ggctgcggat tgtgcgaggc 240 acccagctct ttgaggacaa ctatgccctg gccgtgctag acaatggaga cccgctgaac 300 aataccaccc ctgtcacagg ggcctcccca ggaggcctgc gggagctgca gcttcgaagc 360 ctcacagaga tcttgaaagg aggggtcttg atccagcgga acccccagct ctgctaccag 420 gacacgattt tgtggaagga catcttccac aagaacaacc agctggctct cacactgata 480 gacaccaacc gctctcgggc ctgccacccc tgttctccga tgtgtaaggg ctcccgctgc 540 tggggagaga gttctgagga ttgtcagagc ctgacgcgca ctgtctgtgc cggtggctgt 600 gcccgctgca aggggccact gcccactgac tgctgccatg agcagtgtgc tgccggctgc 660 acgggcccca agcactctga ctgcctggcc tgcctccact tcaaccacag tggcatctgt 720 gagctgcact gcccagccct ggtcacctac aacacagaca cgtttgagtc catgcccaat 780 cccgagggcc ggtatacatt cggcgccagc tgtgtgactg cctgtcccta caactacctt 840 tctacggacg tgggatcctg caccctcgtc tgccccctgc acaaccaaga ggtgacagca 900 gaggatggaa cacagcggtg tgagaagtgc agcaagccct gtgcccgagt gtgctatggt 960 ctgggcatgg agcacttgcg agaggtgagg gcagttacca gtgccaatat ccaggagttt 1020 gctggctgca agaagatctt tgggagcctg gcatttctgc cggagagctt tgatggggac 1080 ccagcctcca acactgcccc gctccagcca gagcagctcc aagtgtttga gactctggaa 1140 gagatcacag gttacctata catctcagca tggccggaca gcctgcctga cctcagcgtc 1200 ttccagaacc tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca atggcgccta ctcgctgacc 1260 ctgcaagggc tgggcatcag ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact gggcagtgga 1320 ctggccctca tccaccataa cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc ctgggaccag 1380 ctctttcgga acccgcacca agctctgctc cacactgcca accggccaga ggacgagtgt 1440 gtgggcgagg gcctggcctg ccaccagctg tgcgcccgag ggcactgctg gggtccaggg 1500 cccacccagt gtgtcaactg cagccagttc cttcggggcc aggagtgcgt ggaggaatgc 1560 cgagtactgc aggggctccc cagggagtat gtgaatgcca ggcactgttt gccgtgccac 1620

cctgagtgtc agccccagaa tggctcagtg acctgttttg gaccggaggc tgaccagtgt 1680 gtggcctgtg cccactataa ggaccctccc ttctgcgtgg cccgctgccc cagcggtgtg 1740 aaacctgacc tctcctacat gcccatctgg aagtttccag atgaggaggg cgcatgccag 1800 ccttgcccca tcaactgcac ccactcctgt gtggacctgg atgacaaggg ctgccccgcc 1860 gagcagagag ccagccct 1878 <210〉 7 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 tgtggctaga aatctgcctg t 21 <210〉 8 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 第2頁 201134490

ctgcgatttc caccaataga g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400〉 9 tgctcgagat gtcatgaagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 agaggtcctt ttcaccagca 20 <210〉 11 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 ggctttctcc ttccaaatcc 20 <210> 12 <211〉 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 ttgtcagcac caggtcagag 20 第3頁

Claims (1)

1. 201134490 七、申請專利範圍： 1. 一種用以抑制吲哚胺2,3-二氧化酶之siRNA分子，其 包括一目標序列，且該目標序列係選自吲哚胺2,3-二 氧化酶基因。 2. 如申請專利範圍第1項所述之siRNA分子，其中前述 目標序列係選自吲哚胺2,3-二氧化酶基因之編碼區序 列 1-1224 。 3. 如申請專利範圍第1項所述之siRNA分子，其中前述 目標序列係為SEQ ID NO: 1。 4. 如申請專利範圍第1項所述之siRNA分子，其進一步 包含一 Her2/neu基因序列。 5. 如申請專利範圍第4項所述之核酸構築體，其中前述 Her2/neu基因序列係為SEQ ID NO: 6。 6. 如申請專利範圍第1項所述之siRNA分子，其中該 siRNA分子是一種shRNA表現質體。 7. 如申請專利範圍第6項所述之siRNA分子，其中前述 該shRNA表現質體包含前述目標序列及其反向互補 序列。 8. 如申請專利範圍第6項所述之siRNA分子，其中前述 目標序列係選自吲哚胺2,3-二氧化酶基因之編碼區序 列 1-1224 。 9. 如申請專利範圍第8項所述之siRNA分子，其中前述 目標序列係為SEQ ID NO:卜 10. 如申請專利範圍第6項所述之siRNA分子，其進一步 包含一 Her2/neu基因序列。 11. 如申請專利範圍第10項所述之siRNA分子，其中前 述Her2/neu基因序列係為SEQ ID NO: 6。 12. —種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項所述 201134490 之siRNA分子及一醫藥可接受載劑。 13. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組合物，其中前 述目標序列係選自吲哚胺2,3-二氧化酶基因之編碼區 序列 1-1224。 14. 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組合物，其中前 述目標序列係為SEQ ID NO: 1。 15. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組合物，其中前 述siRNA分子進一步包含一 Her2/neu之基因序列。 16. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組合物，其中前 • 述Her2/neu之基因序列為SEQ ID NO: 6。 17. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組合物，其中前 述醫藥可接受載劑包含生理食鹽水、磷酸鹽緩衝液 (PBS)或滅菌水。 18. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組合物，其係藉 由基因搶或肌肉注射的方式來進行遞送。 19. 一種如申請專利範圍第1項所述之siRNA分子的用 途，其係作為DNA疫苗。 2