JP2019504071A - がんを処置するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
T細胞がエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するように条件付けるために、エキソビボまたはインビトロで脂肪酸異化作用プロモーターで前処理されたT細胞を対象に投与することを包含する、がんを処置する方法が開示される。さらに他の方法は、(a)腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物;及び(b)腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞及び/または脂肪酸異化作用プロモーターでエキソビボで前処理されたT細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬であって、T細胞が養子細胞移入のためのエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するように条件付ける化合物または試薬を、固形腫瘍によって特徴付けられるがんを有する対象に同時投与することを包含する。両方の方法ともまた、チェックポイント阻害剤の同時投与を使用してもよい。【選択図】図1
Description
電子形式で提出された資料の参照による組み込み
出願人は、これにより、本明細書と共に電子形態で提出された配列表資料を参照により組み込む。このファイルには、「WST161PCT_ST25.txt」と表示され、2017年1月9日付である。
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がん免疫療法の最近の進歩にもかかわらず7、29、14の高度免疫原性腫瘍(例えば、黒色腫)でさえ、治癒は稀なままである。腫瘍の微小環境(TME)は、組織の乱れた血管新生、腫瘍及び間質細胞由来の有毒生成物の存在、ならびに栄養素及び酸素(O2)の欠如に起因して、TILに有意な代謝上の課題を課す2。最近の2つの論文では、グルコースの欠乏が腫瘍浸潤Tリンパ球(TIL)の効果的な機能を損なうことが示されている6、14。腫瘍はグルコースだけでなく酸素も欠く。腫瘍浸潤Tリンパ球(TIL)の機能低下は、固形腫瘍に対する免疫療法の有効性を弱める。これは、持続的な抗原刺激によって引き起こされるそれらの消耗を部分的には反映すると考えられている。エキソビボで増殖されたTILの養子移入は、大きな黒色腫の退縮に影響を与える可能性がある38。それにもかかわらず、このようなT細胞を誘導することを目的とした伝統的なワクチンは、ほとんど効果がなかった9。腫瘍抗原(TA)特異的CD8+T細胞の消耗1、3は、それらの同時阻害剤の発現増強、転写因子T−betのレベル低下、及び慢性腫瘍由来抗原刺激後のエフェクター機能の喪失36によって特徴付けられる22。T細胞の消耗は、固形腫瘍に対する能動免疫療法の失敗の原因となることが示唆されている。
TILは、腫瘍細胞を排除するためにエネルギーを必要とする。活性化の際に、T細胞は解糖によりエネルギー産生を増強する34。解糖は、酸化的リン酸化(OXPHOS)よりも効率的ではないが、バイオマス形成及び細胞増殖の構成要素を提供する。腫瘍細胞はまた、TME内のグルコース(Glu)枯渇を引き起こし得る6、14解糖をも使用する13。T細胞はGluへのアクセスが制限されており、エネルギーを産生するためにOXPHOSに依存しなければならない。脂肪酸(FA)を含む多くの物質はOXPHOSにエネルギーを供給し得るが、これにはO2が必要であり、これは、血液供給不足のせいで腫瘍内で制限され得る19。したがって、TILは、機能的な消耗を生じ、それによってがん免疫療法の有効性を障害する、二重代謝の危険性に直面する。
従って、代謝は、T細胞エフェクター機能の調節において重要な役割を果たす。TILがグルコース及び酸素欠乏を含むTME内の代謝制約にどのように適応し、これらの制約が腫瘍進行と戦うTILの能力にどのように影響を及ぼすかは、依然として十分に理解されていない。
がんの処置及び予防療法を容易にするための新規かつ有効なツール及び方法の必要性が、当技術分野において依然として存在する。
一態様では、がんを治療するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬(「脂肪酸異化作用プロモーター」または「脂肪酸異化促進性化合物」と多様に呼ばれる)を投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体
または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
別の態様では、がんを処置するための方法は、がんを有する対象に、前処理されたT細胞によるエネルギー産生のためにグルコースよりも脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて、エキソビボまたはインビトロで前処理されるかまたは条件付けされているT細胞を投与することを包含する。
別の態様では、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物;及び腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を同時投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
別の態様では、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物;ならびに養子細胞移入の前またはその際にエネルギー産生のために、グルコースではなく脂肪酸を使用するようにT細胞を条件付ける腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボで前処理されるかまたは移入の際に処理される選択されたT細胞を同時投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
別の態様では、がんを処置するための方法は、本明細書において同定された免疫療法組成物、脂肪酸異化作用プロモーター及び選択されたT細胞を同時投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体または低分子の形態でチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
別の態様では、がんを処置するための方法は、T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたT細胞を、がんを有する対象に投与することを包含する。脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬は、エネルギー生産のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにT細胞を条件付ける。この前処理及び条件付けは、T細胞(複数可)が一旦、対象に(すなわち養子療法によって)再投与されると、T細胞(複数可)の免疫機能を高める。別の実施形態では、この方法は、前処置され、条件付けられたT細胞の投与と組み合わせて、または連続して、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。別の態様では、T細胞を改変する方法は、T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてT細胞をエキソビボまたはインビトロで前処理することを包含する。
別の態様では、T細胞、例えば、自己T細胞、キメラ抗原受容体−T細胞、キメラ内分泌腺受容体−T細胞、またはエキソビボで増殖された腫瘍抗原特異的T細胞の生存を増強する方法であって、固形腫瘍を有する対象への養子細胞移入の前または養子細胞移入時に、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて、T細胞(複数可)をエキソビボで処置することを包含する。
さらに別の態様では、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の1日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物の単回用量を投与することを包含する、がんの処置のための治療レジメンが提供される。このレジメンでは、その後、対象は、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を投与される。脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬の第1の用量
は、処置の0、1、2、3、4または5日目のいずれかで始まる。このレジメンにはまた、免疫療法組成物の処置の開始日から処置の7日目〜30日目の間に存在する日まで毎日脂肪酸異化作用促進性の化合物または試薬を投与するステップも包含される。
は、処置の0、1、2、3、4または5日目のいずれかで始まる。このレジメンにはまた、免疫療法組成物の処置の開始日から処置の7日目〜30日目の間に存在する日まで毎日脂肪酸異化作用促進性の化合物または試薬を投与するステップも包含される。
さらに別の態様では、T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたT細胞を含む哺乳動物対象への養子移入のための組成物が提供される。
これらの組成物及び方法の他の態様及び利点は、その好ましい実施形態の以下の詳細な説明においてさらに記載される。
本明細書に開示される方法及び組成物は、エネルギーを得るために、T細胞の代謝をグルコースの使用及び解糖から「がん」の直接または補助的処置のための脂肪酸異化作用の使用に「切り替える」能力に関する。
本発明者らは、本明細書中に提示されるデータを介して、養子免疫伝達またはワクチン誘導性CD8+T細胞による脂肪酸異化を促進してがんの免疫療法の効力を改善する代謝介入、すなわち薬物、化合物または試薬の使用または補足的使用を決定し、支持した。具体的には、本発明は、TME内の代謝ストレスが腫瘍浸潤CD8+TILの機能を低下させるという決定に基づく。TME内のグルコース不足は、CD8+TILを脂肪酸異化に切り替えるように強制する。低O2およびグルコースに曝されたCD8+TILは、ケトン体異化作用によってエネルギーを得る;FA異化作用を増強するように条件付けられたCD8+TILは、改善された抗腫瘍活性を示す。
具体的には、以下の実施例に記載されるように、マウス黒色腫モデルを用いて、TME内の低酸素と組み合わせたグルコース(Glu)の欠乏に起因する代謝的チャレンジは、ワクチン誘導性CD8+TIL機能を損なうことが示された。同時に低血糖及び低酸素状態に曝された場合、CD8+TILは、エフェクター機能を部分的に保存するケトン体を含む脂肪酸(FA)の異化作用を増強する。PD−1発現が同時に増大するが、FA異化作用を増大させるためのCD8+TILの前条件付けは、腫瘍進行を遅らせる能力をさら
に改善する。PD−1シグナル伝達の遮断はまた、ワクチンに誘導されるCD8+TIL機能または代謝に影響を与えられないが、腫瘍の進行を減少または遅延させる。PD−1遮断(すなわち、抗PD−1処置)は、T細胞、特にTILの代謝の再プログラミングと相乗的に作用して、優れた抗腫瘍効果を達成する。したがって、本明細書で提供される方法及び組成物は、代謝介入を使用して、がん免疫療法の有効性を改善する。
に改善する。PD−1シグナル伝達の遮断はまた、ワクチンに誘導されるCD8+TIL機能または代謝に影響を与えられないが、腫瘍の進行を減少または遅延させる。PD−1遮断(すなわち、抗PD−1処置)は、T細胞、特にTILの代謝の再プログラミングと相乗的に作用して、優れた抗腫瘍効果を達成する。したがって、本明細書で提供される方法及び組成物は、代謝介入を使用して、がん免疫療法の有効性を改善する。
本明細書で提供される方法及び組成物は、代謝ストレスによって引き起こされるTIL機能の喪失を遅延させる潜在的な治療的介入を提供する。まず第一に、本明細書において示される支持データによって、ワクチンに誘発されたCD8+TILにおけるT細胞受容体のシグナル伝達の継続が、機能的な枯渇を引き起こす唯一の因子ではないことが示される、なぜなら、この結末はまた、TME内で発現していない抗原に向けられたCD8+TILにも遭遇されるからである。さらなるデータによって、腫瘍進行中にますます重症になるグルコース及び酸素欠乏TME内のTILが代謝ストレスを経験することが示される。固形腫瘍内の低酸素状態によって、CD8+TILが、同時阻害剤リンパ球活性化遺伝子(LAG)−3発現を増強し、T細胞のエフェクター機能を低下させることによりCD8+T細胞の消耗を引き起こす、低酸素誘導因子(HIF)−1αシグナル伝達を増大させるようにさせる。
実施例のデータはさらに、TME内のグルコース不足がPD−1の発現を増強し、CD8+TILの機能を損なうことを示す。これによって、CD8+TILを、インビボで直接的に安定同位体トレース及び液体クロマトグラフィー−質量分光光度法によって実証された脂肪酸(FA)異化作用に切り替えさせる。PPARγアゴニストフェノフィブレートを通じたCD8+TILのFA異化作用の促進は、PD−1発現をわずかに増強するが、それにもかかわらずそれらのエフェクター機能を増強し、それにより腫瘍進行を遅延させることによって臨床利益を達成する。このデータは、低血糖及び低酸素状態が、CD8+TILの代謝の再プログラミング及び機能障害を駆動する上で重要な役割を果たすことを示している。さらに、Glu欠乏TME中のCD8+TILによるFA異化作用を増大させる代謝介入が、がん免疫療法の有効性を改善することが示されている。
したがって、がんを処置するための様々な方法は、がんを有する哺乳動物対象に、前処理されたT細胞によるエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬でエキソビボもしくはインビトロで前処理もしくは条件付けされたT細胞を投与すること、及び/または腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物もしくは試薬(「脂肪酸異化作用プロモーター」または「脂肪酸異化作用促進化合物」と種々呼ばれる)を投与することを包含する。さらなる方法は、腫瘍特異的ワクチン組成物を、前処理したT細胞または脂肪酸異化作用促進性化合物と共に投与することを包含する。T細胞のエネルギー産生代謝の切り替えを利用するこれらの可能な方法の全ては、PD−1遮断のようなチェックポイント阻害と必要に応じて組み合わせてもよい。
これらの方法及び組成物の記載において使用される特定の成分及び定義は、以下に定義される。
本明細書で使用される「患者」または「対象」とは、ヒト、獣医動物または畜産動物、家畜またはペット、及び臨床研究に通常使用される動物を含む哺乳類動物を意味する。より具体的には、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。
本明細書中で使用される場合、「T細胞(複数可)」または「T細胞集団」という用語は、任意のヒトまたは哺乳動物のT細胞(複数可)を意味する。1つの実施形態では、T細胞またはその細胞が活性化される。1つの実施形態において、T細胞は、自己または異
種の、天然に存在するT細胞である。別の実施形態では、T細胞は、組換えまたは合成によって修飾されたT細胞構築物である。いくつかの実施形態において、前処理されるT細胞は、原発性T細胞、CD8(細胞傷害性)T細胞、CD8(細胞傷害性)T細胞、T浸潤リンパ球(TIL)、NK T細胞または別のT細胞である。一実施形態では、T細胞は、末梢血、TMEまたは本明細書に記載の方法によって前処置または条件付けされたT細胞が投与される同じ哺乳動物対象の他の体液から得られる。別の実施形態では、前処理されるT細胞は、初代T細胞、CD8(細胞傷害性)T細胞、またはNK T細胞または対象の骨髄移植適合から得られる他のT細胞である。他の適切なT細胞としては、切除された腫瘍、ポリクローナルまたはモノクローナル腫瘍反応性T細胞から得られたT細胞が挙げられる。一実施形態では、T細胞はアフェレーシスによって得られる。さらに他の実施形態において、T細胞は、異種抗原受容体を発現するように、組換えまたは合成により改変される。一実施形態において、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)またはキメラ内分泌受容体(CER)を発現する。そのようなCARまたはCERは、例えば、Sadelain,M et al,「The basic principles of chimeric antigen receptor(CAR)design」2013
April,Cancer Discov.3(4):388−398;国際特許出願公開WO2013/044255号及びWO2016/054153号、米国特許出願公開第2013/0287748号、ならびにそのようなキメラ構築物の使用に関する他の刊行物に記載される。これらの刊行物は、本明細書に記載の構築物のいくつかの設計に有用な種々の成分に関する情報を提供するために参照によって援用される。このようなCARまたはCER T細胞は、えり抜きの抗原を認識することを可能にするリガンドを発現する遺伝子改変リンパ球である。抗原認識の際に、これらの修飾T細胞は、これらのT細胞を強力な細胞殺傷因子に変換するシグナル伝達ドメインを介して活性化される。内因性T細胞を上回る利点は、それらがMHC制限されていないことであり、これにより、これらのT細胞は、MHC発現を減少させることによって多くの腫瘍細胞で使用される免疫監視逃避法を克服することが可能になる。さらに他の実施形態では、前処置のためのT細胞は、内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である。任意のT細胞は、本明細書で提供される方法及び組成物の目的のために、代謝機能を解糖からFA異化作用に「切り替える」ために、選択された脂肪酸異化作用プロモーターでエキソビボで前処理に供されてもよい。
種の、天然に存在するT細胞である。別の実施形態では、T細胞は、組換えまたは合成によって修飾されたT細胞構築物である。いくつかの実施形態において、前処理されるT細胞は、原発性T細胞、CD8(細胞傷害性)T細胞、CD8(細胞傷害性)T細胞、T浸潤リンパ球(TIL)、NK T細胞または別のT細胞である。一実施形態では、T細胞は、末梢血、TMEまたは本明細書に記載の方法によって前処置または条件付けされたT細胞が投与される同じ哺乳動物対象の他の体液から得られる。別の実施形態では、前処理されるT細胞は、初代T細胞、CD8(細胞傷害性)T細胞、またはNK T細胞または対象の骨髄移植適合から得られる他のT細胞である。他の適切なT細胞としては、切除された腫瘍、ポリクローナルまたはモノクローナル腫瘍反応性T細胞から得られたT細胞が挙げられる。一実施形態では、T細胞はアフェレーシスによって得られる。さらに他の実施形態において、T細胞は、異種抗原受容体を発現するように、組換えまたは合成により改変される。一実施形態において、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)またはキメラ内分泌受容体(CER)を発現する。そのようなCARまたはCERは、例えば、Sadelain,M et al,「The basic principles of chimeric antigen receptor(CAR)design」2013
April,Cancer Discov.3(4):388−398;国際特許出願公開WO2013/044255号及びWO2016/054153号、米国特許出願公開第2013/0287748号、ならびにそのようなキメラ構築物の使用に関する他の刊行物に記載される。これらの刊行物は、本明細書に記載の構築物のいくつかの設計に有用な種々の成分に関する情報を提供するために参照によって援用される。このようなCARまたはCER T細胞は、えり抜きの抗原を認識することを可能にするリガンドを発現する遺伝子改変リンパ球である。抗原認識の際に、これらの修飾T細胞は、これらのT細胞を強力な細胞殺傷因子に変換するシグナル伝達ドメインを介して活性化される。内因性T細胞を上回る利点は、それらがMHC制限されていないことであり、これにより、これらのT細胞は、MHC発現を減少させることによって多くの腫瘍細胞で使用される免疫監視逃避法を克服することが可能になる。さらに他の実施形態では、前処置のためのT細胞は、内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である。任意のT細胞は、本明細書で提供される方法及び組成物の目的のために、代謝機能を解糖からFA異化作用に「切り替える」ために、選択された脂肪酸異化作用プロモーターでエキソビボで前処理に供されてもよい。
本明細書中で使用される場合、「がん」という用語は、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを記述する。より具体的には、本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、固形腫瘍の存在を特徴とする任意のがんを意味する。本明細書に記載の方法による処置のための適切ながんとしては、限定するものではないが、黒色腫、乳癌、脳腫瘍、結腸癌/直腸癌、肺癌、卵巣癌、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、骨肉腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、膣癌、肺癌及び神経内分泌癌が挙げられる。
「腫瘍」という用語は、本明細書において使用される場合、悪性または良性のいずれかの全ての新生物細胞の成長及び増殖、ならびに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。一実施形態では、本方法によって標的化される腫瘍は、低酸素、Tリンパ球による有意な浸潤、及び腫瘍微小環境における低グルコースによって特徴付けられる。
本明細書において使用される場合、腫瘍微環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬(「脂肪酸異化作用プロモーター」または「脂肪酸異化作用促進性化合物」と様々に呼ばれる)としては、限定されるものではないが、フェノフィブレート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラートまたはAMPK活性化因子、例えば5−アミノイミダゾール−4−カ
ルボキサミドリボシドなどの化合物が挙げられる。これらの方法において有用な他の化合物、低分子化合物またはペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、当業者によって同定され得る。
ルボキサミドリボシドなどの化合物が挙げられる。これらの方法において有用な他の化合物、低分子化合物またはペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、当業者によって同定され得る。
本明細書において使用される場合、「チェックポイント阻害剤」という用語は、様々なチェックポイントタンパク質に結合するか、またはそれを阻害する抗体もしくは低分子の形態の組成物を指す。このようなチェックポイントタンパク質としては、限定するものではないが、PD−1、PD−L1、CTLA−4、BTLA及びCD160が挙げられる。例として、公知のチェックポイント阻害剤としては、とりわけ、抗体イピリムマブ(Yervoy(登録商標))、ペムブロリズマブ(pembrolizumab)(Keytruda(登録商標))、及びニボルマブ(nivolumab)(Opdivo(登録商標))が挙げられる。低分子または他のチェックポイント結合抗体または抗体断片として開発された他のチェックポイント阻害剤は、この定義に含まれる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgE(抗体断片を含む)を含む、全てのタイプの免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルであっても、またはポリクローナルであってもよく、そして(例えば)マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラクダもしくはヒトを含む任意の種の由来であってもよいし、またはキメラ抗体であってもよい。例えば、Walker et al,Molec.Immunol.26:403(1989)を参照のこと。抗体は、公知の方法(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,474,893号または第4,816,567号を参照のこと)に従って産生された組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体はまた、公知の方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,676,980号に従って化学的に構築されてもよい。また、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,613,922号も参照のこと。抗体断片は、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ドメイン抗体、二機能性、ダイアボディ;ワクチボディ(vaccibody)、線状抗体;一本鎖抗体分子(scFV);重鎖または軽鎖相補性決定領域、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む抗原結合断片である。このような抗原結合断片は、公知の技術によって生成され得る。
「治療試薬」または「レジメン」とは、化学療法医薬、生物学的反応修飾物質、放射線、食餌、ビタミン療法、ホルモン療法、遺伝子療法、外科的切除などを含むが、これに限定されない、固形腫瘍を伴うかまたは伴わないがんの処置において使用される任意のタイプの処置を意味する。
「腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物」とは、対象の免疫系を刺激するためにがん抗原を標的とするがんワクチンを含む任意の組成物を意味する。そのような免疫療法組成物は、体液性(例えば、抗体)または細胞性(例えば、細胞傷害性T細胞またはTヘルパー)応答を誘発するように、または一実施形態では先天性免疫応答を誘発するように設計され、哺乳動物または動物対象への送達後の免疫原性組成物によって送達される標的遺伝子産物に装着される。一実施形態では、これらの方法において有用な免疫療法組成物は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスなどを介して、またはウイルス様粒子(VLP)を介して対象の免疫系に抗原を提示することを包含する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される免疫療法組成物は、がん抗原を発現するDNAまたはRNA構築物である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される免疫療法組成物は、ペプチドまたはタンパク質としてのがん抗原またはその断片を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される免疫療法組成物は、がん抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片(複数可)である。この組成
物は、公知の組換え及び合成技術を用いて作製される組成物である。例えば、米国特許第9,402,888号及びその図7に詳細に記載されている例示的な黒色腫免疫療法組成物AdC68−gDMelapolyに対する実施例の参照、ならびにその図7の参照を参照のこと。多くの免疫療法的がん「ワクチン」が公知であり、当該分野で記載されており、本明細書に記載の方法において使用され得る。
物は、公知の組換え及び合成技術を用いて作製される組成物である。例えば、米国特許第9,402,888号及びその図7に詳細に記載されている例示的な黒色腫免疫療法組成物AdC68−gDMelapolyに対する実施例の参照、ならびにその図7の参照を参照のこと。多くの免疫療法的がん「ワクチン」が公知であり、当該分野で記載されており、本明細書に記載の方法において使用され得る。
「腫瘍細胞上の抗原またはリガンド」とは、全長の野生型腫瘍特異的抗原または突然変異した腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原を意味する。腫瘍特異的抗原は、選択された特定のがんまたは腫瘍細胞上に見いだされるエピトープ及びタンパク質であり、すべてのがん細胞に見られるわけではない。がん関連抗原は、2つ以上のがんまたは腫瘍細胞型に関連し得る抗原である。例示的ながん特異的抗原としては、限定するものではないが、707−AP、アルファ(a)−フェトプロテイン、ART−4、BAGE;b−カテニン/m、b−カテニン/変異型Bcr−abl、CAMEL、CAP−1、mCASP−8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp−B、MAGE−B2、MAGE−B1、ELF2M、ETV6−AML1、G250、GAGE、GnT−V、Gp100、HAGE、HER−2/neu、HPV−E7、HSP70−2M HST−2、hTERT、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART−1、MC1R、MUC1、MUM−1、−2、−3、P15、p190マイナーbcr−ablが挙げられる。さらに他の適切な腫瘍またはがん遺伝子は、とりわけ、VEGFR1、VEGFR2、MAGE−A1、MUC−1、チモシンβ1、EGFR、Her−2/neu、MAGE−3、Survivin、Heparanase1、Heparanase2及びCEAをコードする。さらに他の適切な抗原は、参考文献に挙げられており、参照により本明細書に組み入れられる抗原である。ScottandRenner,Encyclopedia of life Sciences 2001 Eds.John Wiley & Sons、Ltd.などの適切な抗原を同定するテキストも参照のこと。
「ベクター」とは、異種分子を治療目的またはワクチン目的のいずれかで細胞に送達する実体を意味する。本明細書において使用される場合、ベクターとは、限定するものではないが、裸のDNA、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド、またはウイルスもしくは細菌を含む任意の遺伝的エレメントを包含し得る。ベクターは、実施例に記載される、本明細書で提供される技術及び配列を使用して、当業者に公知の技術と併せて生成される。このような技術としては、Green及びSambrook、Molecular Cloning:A Laboratory Manual.4th
Edit,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012などのテキストに記載の技術のようなcDNAの従来のクローニング技術、サルモネラゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法が挙げられる。
Edit,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012などのテキストに記載の技術のようなcDNAの従来のクローニング技術、サルモネラゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法が挙げられる。
「投与する」または「投与経路」とは、本明細書の方法で使用される免疫療法組成物、または脂肪酸異化作用プロモーター、またはチェックポイント阻害剤または前処置されたT細胞の対象への送達を意味する。以下に詳細に説明するように、これらの方法は、本方法の各構成要素に対して独立している場合がある。各投与方法は、医薬担体または賦形剤の有無にかかわらず、または別の化学療法剤の有無にかかわらず、対象のTME中に行ってもよい。従来の及び薬学的に許容される投与経路としては、限定するものではないが、全身投与、例えば、腹腔内、静脈内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下及び他の非経口投与の経路または腫瘍内もしくは結節内投与が挙げられる。一実施形態では、投与経路は経口である。別の実施形態において、投与経路は、腹腔内である。別の実施形態において、投与経路は血管内である。必要に応じて、投与経路を組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、以下に詳細に説明するように、定期的に繰り返される。
本明細書に記載の組成物及び方法の文脈において、列挙した組成物、化合物または試薬の「1つ以上」、「少なくとも5つ」などへの言及は、列挙したその組成物、試薬または化合物のいずれか1つまたは任意の及び全ての組み合わせを意味する。
「含む、包含する、備える(comprise)」、「含む、包含する、備える(comprises)」及び「含んでいる、包含している、備えている(comprising)」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきであり、すなわち他の特定されていない構成要素または工程段階を包含する。「からなる(consist)」、「からなっている(consisting)」という用語及びその変形は、包括的ではなく、排他的に、すなわち、具体的に列挙されていない構成要素またはステップを除外すると解釈されるべきである。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、特記しない限り、与えられた参考文献からの10%の変動性を意味する。
「1つの、ある(a)」または「1つの、ある(an)」という用語は、1つ以上の、例えば「1つのmiRNA(an mi RNA)」を指し、1つ以上のmiRNAを表すと理解されることに留意されたい。したがって、用語「a」(または「an」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書中で他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び本出願で使用される多くの用語に対する一般的ガイドを当業者に提供する刊行されたテキストを参照して、一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明の1つの態様において、哺乳類対象への養子移入のための組成物は、T細胞によるエネルギー生産のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたT細胞またはT細胞集団を含む。一実施形態において、脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬は、フェノフィブラートである。別の実施形態において、脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬は、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子、または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである。さらに他の代謝性「切り替え」試薬も同じ方式で有用であると予想される。
これらの組成物は、そのような前処理のためのT細胞として、自己または異種の、天然に存在するT細胞または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物を使用してもよい。T細胞または集団は、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られた、ヒトT細胞またはナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)であってもよい。さらに他の実施形態では、T細胞または集団は、ヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる。さらに他の実施形態において、T細胞は、前記前処置の前に、異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体(CAR−T)またはキメラ内分泌受容体(CER−T)を発現するように改変される。さらに他の実施形態では、前処置を予定されるT細胞または集団は、内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である。さらに他の実施形態では、T細胞は、TILまたはCD8+T細胞である。これらの組成物は、付随するチェックポイント阻害剤または腫瘍抗原特異的免疫学的組成物またはワクチンの有無にかかわらず、がんの処置のための養子移入のために調製される。
本明細書に記載される方法の一実施形態において、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免
疫療法組成物;及び腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を同時投与することを包含する。別の実施形態では、この方法はまた、選択されたチェックポイント阻害剤を抗体または低分子の形態で同時投与することも包含する。
疫療法組成物;及び腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を同時投与することを包含する。別の実施形態では、この方法はまた、選択されたチェックポイント阻害剤を抗体または低分子の形態で同時投与することも包含する。
本明細書に記載される方法の別の実施形態において、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物;及びT細胞がエネルギー生産のためグルコースではなく脂肪酸を使用するように、T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボで前処理された選択されたT細胞、例えば、腫瘍抗原特異的T細胞またはCARなどを投与することを包含する。これらの前処理されたT細胞は、養子細胞移入のために使用されてもよい。
本明細書中に記載される方法のさらに別の実施形態において、がんを処置する方法は、がんを有する対象に、エネルギー産生のためにグルコースを使用することから、エネルギー生産のために脂肪酸及びFA異化作用を使用することへ細胞を促進または切り替える化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたT細胞を含む組成物を投与することを包含する。このような前処理のためのT細胞は、上記で同定されたT細胞のリストから選択される。
「選択された脂肪酸異化作用プロモーターによる前処理」とは、選択されたT細胞が、選択された脂肪酸異化作用プロモーター、例えばフェノフィブラートの存在下で約1〜約500μMの間で、エネルギー生産のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにT細胞を条件付けるT細胞増殖の時間の全体または一部で、培養及び増殖されることを意味する。一実施形態では、フェノフィブラート(または類似の脂肪酸異化作用プロモーター)の適切な濃度は、少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490から少なくとも約500μMである。列挙された任意の2つの数字の間の同様に介在する濃度は、「適切な濃度」という用語に包含される。一実施形態におけるT細胞増殖の時間は、数時間から少なくとも数日間に及び得る、インビトロ培養の全時間を意味する。別の実施形態では、T細胞増殖の時間は、最低限24時間のインビトロ培養である。脂肪酸異化作用プロモーターによる前処理のための他の期間は、少なくとも1、5、10、15もしくは20時間以上、または本明細書に記載された特定の時間数の間の任意の介在時間であってもよい。次いで、前処理されたT細胞は、周知の適応細胞移入技術によって対象に投与される。
一実施形態では、前治療したT細胞を投与して、がんを単一療法として処置する。別の実施形態において、この方法は、免疫治療組成物を前処置したT細胞と同時投与することを包含する。さらに他の実施形態では、この方法は、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を、前処理細胞及び/または免疫療法組成物と同時にまたは連続して投与することも包含してもよい。
がんを処置するための方法のさらに別の変形例において、同時投与は、免疫治療組成物、脂肪酸異化作用プロモーター(すなわち、化合物として投与される)及び本明細書で同定された選択された前処理されたT細胞を含む。別の実施形態において、この方法はまた、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
本明細書に記載の任意の方法において、免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたT細胞は、実質的に同時に投与される。別の実施形態では、免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたT細胞は、同じ投与経路または異なる投与経路によって連続的に投与される。選択される投与経路は、組成物の性質に依存する。例えば、脂肪酸異化作用プロモーターがフェノフィブラートまたは他の小さな化学分子である場合、そのような分子は、これらの薬物の他の医薬用途に知られ、かつ受け入れられた用量で経口投与され得る。一実施形態では、免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用プロモーターは、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内または結節内投与によって全身的に独立して投与される。別の実施形態では、組成物(b)を経口投与する。
他の投与プロトコールでは、脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬または前処理されたT細胞は、少なくとも1日〜14日まで1回または反復して投与される。いくつかのプロトコールでは、投与は免疫療法組成物の投与の1〜14日後に行われる。特定の実施形態において、免疫療法組成物は、単回用量で投与される。他の実施形態では、免疫療法組成物は追加免疫用量として投与される。
これらの方法のさらに別の態様では、対象を、前処理されたT細胞を単独で使用して、または免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用プロモーターを使用して、または、免疫治療組成物及び前処理細胞の組み合わせを使用して前治療したT細胞を使用して処置の前、間、または後に他の抗がん療法を使用して処置してもよい。このような処置は、脂肪酸異化作用プロモーターと並行もしくは同時であっても、または改変T細胞養子移入及び/またはチェックポイント阻害剤との重複処置であってもよい。一実施形態では、本方法は、免疫療法組成物及び/または脂肪酸異化作用プロモーターを投与する前に、対象を化学療法で治療することを包含する。さらに別の実施形態では、この方法は、リンパ球の対象を枯渇させること、及び必要に応じて、エネルギー生産のためにグルコースよりも脂肪酸を使用するようにT細胞を条件付けるために、脂肪酸異化作用プロモーターを用いてエキソビボで前処理した選択されたT細胞の養子移入の前に腫瘍を外科的に切除することを包含する。
いくつかの実施形態において、前処理された細胞は、単回用量で投与され、続いてチェックポイント阻害剤が任意に投与される。これらの投与は繰り返してもよい。本方法のさらに他の実施形態において、免疫療法組成物は、ブースターなしで単回投与し、続いて脂肪酸異化作用プロモーター、選択された前処置T細胞、及び/またはチェックポイント阻害剤の少なくとも1つが投与される。さらに別の実施形態では、免疫療法組成物は、脂肪酸異化作用プロモーター、選択された前処置されたT細胞、及び/またはチェックポイント阻害剤の投与後のブースター用量として再投与される。
任意のこれらの治療用組成物及び方法の構成要素は、好ましくは生物学的に適合する溶液または薬学的に許容される送達ビヒクル中に懸濁されて、患者に投与され得る。方法の種々の構成要素は、等張性生理食塩水のような薬学的または生理学的に許容される担体;等張性塩溶液またはこのような投与に熟練した者には明らかであろう他の製剤中に懸濁または溶解させることによって、投与のために調製される。適切な担体は、当業者に明らかであり、大部分は投与経路に依存するであろう。薬学的に許容される担体であり、当業者に周知であることが知られている他の水性及び非水性等張滅菌注射溶液及び水性及び非水性滅菌懸濁液をこの目的のために使用してもよい。
これらの治療用組成物の投与量は、主として、組成物のタイプ(すなわち、選択された前処置されたT細胞、ベクター、核酸構築物またはタンパク質)治療される状態、患者の年齢、体重及び健康状態などの要因に依存し、したがって、患者によって異なる場合があ
る。方法の構成要素の投与のための投薬量は、その成分を投与するのに有用であることが知られている従来の投薬量である。主治医は、以下のようなガイドラインを用いて適切な用量を選択し得る。
る。方法の構成要素の投与のための投薬量は、その成分を投与するのに有用であることが知られている従来の投薬量である。主治医は、以下のようなガイドラインを用いて適切な用量を選択し得る。
一実施形態では、前処置されたT細胞の有用な投与量は、単回注入最大耐量(MTD)であり、これは動物モデルにおける用量漸増試験によって決定され得る。一実施形態では、T細胞の典型的な有効かつ非毒性の用量は、対象の体重1kgあたり約2×104〜5×109細胞である。105または106または107または108のような他の用量も有用であり得る。例えば、WO2016/054153に記載されているような用量決定方法、及び当技術分野の他のCAR刊行物を参照のこと。
一実施形態では、免疫療法組成物の典型的な投与量は、組成物の性質に依存する。例えば、組成物がウイルスベクターで送達される場合、ウイルスベクターの治療的に有効な成体のヒトまたは獣医学的投与量は、一般に、約1×106〜約1×1015個の粒子、約1×1011〜1×1013個の粒子、または約1×109〜1×1012粒子のウイルスという濃度を含有する約100μL〜約100mLの担体という範囲である。
組成物(例えば、免疫療法組成物、脂肪酸異化作用促進性化合物またはチェックポイント阻害剤)が抗体または他のタンパク質として投与される場合、投薬量は、0.01mg〜100mgタンパク質の単位投与量(これは約12.5μg/kg体重と同等である)の範囲であり得る。チェックポイント阻害剤の投薬量は、使用される特定の抗体または低分子の既知の毒性に基づいて調整され得る。
本方法の任意の免疫療法組成物または他の成分が裸のDNAとして投与される場合、投薬量は、滅菌溶液1mLあたり約50μg〜約1mgのDNAの範囲であってもよい。
同様に、脂肪酸異化作用促進性化合物の用量は、同様の化合物の他の用途のため、例えばコレステロール管理または高脂血症のために投与される用量と同様であってもよい。例えば、FFは、成人に対して40mg/日〜120mg/日の投与量で投与され得てもよい。さらに別の実施形態では、養子移入のための前処理されたT細胞の「標準的な」有効かつ非毒性の用量は、約107細胞である。別の例として、養子移入されたT細胞の数は、当業者によって最適化され得る。一実施形態では、そのような投薬量は、対象の体重1kgあたり約105〜約1011細胞の範囲であり得る。他の投薬量は、本明細書に引用された参考文献に教示されており、処置レジメン、患者の体調、治療される腫瘍のタイプ及びステージ及び位置に依存して、ならびに患者を処置するために採用される他の補助的な化学療法を考慮に入れて、当業者によって容易に調整され得る。
さて、別の態様では、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の1日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法成分の単回用量を投与することを包含する、がんの処置のための治療レジメンが提供される。このレジメンでは、その後、対象は、腫瘍の微小環境における腫瘍抗原特異的的なT細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を投与される。試薬の脂肪酸異化作用促進性化合物の第1投与は、処置の0、1、2、3、4または5日目のいずれかで開始する。このレジメンには、免疫療法成分の処置の開始日から処置の第7日〜第30日の間にある日まで毎日、脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬を投与するステップも含まれる。チェックポイント阻害剤は、脂肪酸異化作用促進性化合物の投与と同時に投与されても、またはその後に投与されてもよい。
なお別の状態様では、固形腫を特徴とするがんを有する対象に、処置の1日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物の単回投与を投与することを包含
する、がんの処置のための治療レジメンが提供される。このレジメンでは、その後、対象は、エネルギー生産のためにグルコースではなく脂肪酸を用いるようにT細胞を条件付ける腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボで前処理された選択されたT細胞を養子移入によって投与される。脂肪酸異化作用促進化合物で条件付けされた前処置されたT細胞の養子移入は、免疫療法組成物の投与後0日目〜14日目のいずれで行ってもよい。したがって、特定の実施形態で、養子移入は、免疫療法組成物投与後の0日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日または14日よりさらに後に発生する。インビボで免疫療法組成物がどれくらい長く発現されるかに応じて、他の日付を選択してもよい。この発現は、ワクチンのタイプに依存し、従って、治療レジンでは同時投与のタイミングは、当業者によって調整され得る。チェックポイント阻害剤は、前治療されたT細胞の投与と同時にまたはその後に投与されてもよい。
する、がんの処置のための治療レジメンが提供される。このレジメンでは、その後、対象は、エネルギー生産のためにグルコースではなく脂肪酸を用いるようにT細胞を条件付ける腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボで前処理された選択されたT細胞を養子移入によって投与される。脂肪酸異化作用促進化合物で条件付けされた前処置されたT細胞の養子移入は、免疫療法組成物の投与後0日目〜14日目のいずれで行ってもよい。したがって、特定の実施形態で、養子移入は、免疫療法組成物投与後の0日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日または14日よりさらに後に発生する。インビボで免疫療法組成物がどれくらい長く発現されるかに応じて、他の日付を選択してもよい。この発現は、ワクチンのタイプに依存し、従って、治療レジンでは同時投与のタイミングは、当業者によって調整され得る。チェックポイント阻害剤は、前治療されたT細胞の投与と同時にまたはその後に投与されてもよい。
さらに別の実施形態において、本発明者らの発見はまた、記載されており41、それぞれ参照により組み込まれる、例えば、国際特許出願公開番号WO2012/079000及び国際特許出願番号PCT/US2015/053128号に記載されている方法のような、キメラ抗原受容体−T細胞またはキメラ内分泌細胞受容体−T細胞またはエキソビボ増殖腫瘍抗原特異的T細胞の生存を増強する方法も可能にする。一実施形態において、前処理されたT細胞は、末梢血から得られ、キメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾され、脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬でエキソビボで前処理される。この前処理されたT細胞は、内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である。この前処理されたT細胞は、CD8+T細胞である。この方法では、T細胞(複数可)は、上記で考察される腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬でエキソビボで前処理され、次いで組み込まれた参考文献に記載されているように、養子細胞移入によって固形腫瘍を有する患者に投与される。
これらの方法の理論的根拠は、バイスタンダーCD8+TILがエフェクター機能を失い、同時阻害剤の発現を増大させるというマウス黒色腫モデルにおける発明者の観察に基づいている。このデータは、腫瘍微小環境(TME)内の代謝ストレスが、マウス黒色腫モデルにおけるCD8+TILの分化及びエフェクター機能に影響することを示している。HIF−1αによる低酸素及びグルコース(Glu)不足は、同時阻害剤の発現を増強し、CD8+T細胞機能を損なう。同時に低酸素及び低血糖に曝されると、CD8+T細胞はケトン体を含む脂肪酸(FA)の異化作用を増強する。FA異化作用を増大するように条件付けられたCD8+TILは、PD−1発現を増強させ、エフェクター分子の産生の改善を示す。
次善の新生血管新生または固形腫瘍内の灌流障害により引き起こされる低酸素状態によって、CD8+T細胞が低酸素誘導因子(HIF)−1α及びリンパ球活性化遺伝子(LAG)−3の発現を増大させ、機能を失わせるようになる。ワクチンに誘発されたCD8+TIL及びインビトロで活性化されたポリクローナルCD8+T細胞で示されるように、低酸素誘導因子(HIF)−1αによる低酸素状態は、同時阻害剤LAG−3発現を増大させ、CD8+T細胞機能を損なう。限定されたGlu供給は、PD−1発現を増強し、エフェクター機能を低下させ、低酸素下でさらに増強されるCD8+T細胞のFA異化作用を増大させる。本発明者らは、以下の実施例において、後期段階の腫瘍におけるCD8+TILが、FA取り込み及びトリアシルグリセロール(TG)代謝回転によってあおられるFA異化作用にますます依存し、PD−1発現を増大させるがいくつかのエフェクター機能を維持する、それらのエネルギー需要を満たすことを示した。CD8+TILのFA異化作用を促進することにより、抗腫瘍効果が改善される。さらに、LAG−3の過剰発現及び機能障害は、HIF−1αの遺伝子ノックダウンによって逆転され得る。
グルコースの欠乏は、腫瘍細胞によるその消費に起因してTME内で乏しくなり、CD8+TILの機能を損ない、PD−1の発現を増強し、液体クロマトグラフィー−質量分光光度計及び安定した同位体トレースによって示されるように細胞を脂肪酸異化作用に切り替えさせる。この代謝の嗜好は、低酸素状態でさらに強化される。グルコースではなく脂肪酸酸化によるエネルギー産生は、低酸素下で持続可能ではない可能性がある同等量のATPを生成するためにより多くのO2を必要とする。脂肪酸酸化の副産物であるケトン体は、必要なO2が少ない非常に効率的な燃料である。また、実施例のデータによって支持され、低酸素及び低血糖に曝された神経系の細胞について以前に示されているように、CD8+TILは、一旦腫瘍内の低酸素の領域に入れば、ケトン体異化作用を通じたエネルギー産生へ切り替える。
近年、免疫学的チェックポイントの遮断は、腫瘍抗原特異的免疫応答を増強する最も有望な治療の1つとして進化し、がん患者において耐久性のある臨床応答を達成している。免疫チェックポイント阻害剤を用いた処置は、TIL機能を部分的に救済し、がん患者の有望な結果をもたらしている4。プログラムされた細胞死タンパク質(PD)−1のような免疫抑制剤によるシグナル伝達を阻害する抗体は、T細胞の機能を保持し、慢性の抗原刺激に起因して、消耗に向かって分化すると仮定した。本明細書に提供されるデータは、ワクチン誘導性CD8+腫瘍浸潤T細胞(TIL)におけるT細胞受容体シグナル伝達の継続が、消耗及び機能不全を引き起こす唯一の因子ではないことを示す。なぜなら、TME内では発現されない抗原に向かうCD8+TILもこの運命に遭遇するからである。インビトロで様々な培養条件下で刺激されたCD8+T細胞と比較して、ワクチン誘導TILで得られたさらなるデータは、TILが、腫瘍進行中にますます重症になる、グルコース及び酸素不足TME内の代謝ストレスを経験することを示す。
全体として、実施例に示される全体的なこれらのデータによって、TME内で殺腫瘍機能を維持するために脂肪酸異化作用がCD8+TILにとって必須であることが支持される。脂肪酸酸化を促進する薬物または脂質代謝に影響を及ぼす遺伝的変化を有するマウスを用いたさらなるデータによって、エネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するように活性化中に条件付けされた腫瘍抗原特異的CD8+T細胞が、TME内でより良好な機能保存を示し、腫瘍進行のより長い遅延を達成するが、より高いレベルのPD−1を発現することがさらに示される。
発明の実施形態
本発明の様々な実施形態は、以下を包含する:
a)前処理されたT細胞によるエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理または条件付けされたT細胞またはT細胞集団を、がんを有する対象に投与することを包含する、がんを処置するための方法;
b)がんを有する対象に:対象の腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的する免疫療法組成物と、(i)腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬;及び(ii)養子細胞移入のためのエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにT細胞を条件付けるために(i)を用いてエキソビボで前処理したT細胞のうちの1つ以上とを同時投与することを包含する、がんを処置するための方法;
c)抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を投与することをさらに包含する、上記方法のいずれか;
d)上記チェックポイント阻害剤が抗PD−1抗体または低分子リガンドである、本明細書に記載の任意の方法;
e)がんが固形腫瘍の対象内に存在することを特徴とする、本明細書に記載の任意の方
法;
f)がんが、黒色腫、乳癌、脳腫瘍、結腸癌/直腸癌、肺癌、卵巣癌、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、骨肉腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、胃癌、癌、精巣癌、甲状腺癌、膣癌、神経内分泌癌である、本明細書における任意の方法;
g)T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブレートである、本明細書における任意の方法;
h)T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである、本明細書における任意の方法;
i)T細胞が自己または異種の、天然に存在するT細胞または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物である、本明細書における任意の方法;
j)上記T細胞が、対象から、または対象の骨髄移植適合から得られたヒトT細胞またはナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)である、本明細書における任意の方法;
k)T細胞が、ヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる、本明細書における任意の方法;
l)T細胞が、上記前処理の前に、異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾されている本明細書における任意の方法。
m)T細胞が内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である、本明細書における任意の方法;
n)T細胞がCD8+T細胞である本明細書における任意の方法;
o)上記免疫療法組成物(a)が、がん抗原を発現する組換えウイルスまたはウイルス様粒子、がん抗原を発現するDNA構築物、がん抗原またはその断片をペプチドまたはタンパク質として含む組成物、がん抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片である、本明細書における任意の方法;
p)上記免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたT細胞が実質的に同時に投与される、本明細書における任意の方法;
q)脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬または前処理されたT細胞が、免疫療法用組成物の投与後少なくとも1日〜14日に1回または反復投与される、本明細書における任意の方法;
r)上記免疫療法組成物が単回用量または1回以上の追加用量として投与される、本明細書における任意の方法;
s)各組成物が、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内または結腸内投与によって独立して全身的に投与される、本明細書における任意の方法;
t)腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が経口投与される、本明細書における任意の方法;
u)前処理されたT細胞が1回または反復投与される、本明細書における任意の方法;
v)前処置されたT細胞が単回用量または1回以上の用量として投与される、本明細書における任意の方法;
w)前処置されたT細胞が、静脈内注射または注入によって全身的に投与される、本明細書における任意の方法;
x)他の抗癌療法で対象を治療することをさらに包含する、本明細書における任意の方法;
y)前処理されたT細胞、免疫原性組成物または脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物もしくは試薬を投与する前に、化学療法で対象を治療することをさらに包含する、本明細書における任意の方法;
z)前処理されたT細胞の投与前に、リンパ球の対象を枯渇させること、及び必要に応
じて腫瘍を外科的に切除することをさらに包含する、本明細書における任意の方法;
aa)上記方法により標的とされる腫瘍が、低酸素、Tリンパ球による有意な浸潤、及び腫瘍微小環境における低グルコースによって特徴付けられる、本明細書における任意の方法;
bb)T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてT細胞をエキソビボまたはインビトロで前処理することを包含するT細胞を改変する方法;
cc)キメラ抗原受容体−T細胞またはキメラ内分泌受容体−T細胞またはエキソビボで増殖された腫瘍抗原特異的T細胞の生存を増強する方法であって、T細胞をエキソビボで、固形腫瘍を有する対象への養子細胞移入前の腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて前処理することを包含する、方法;
dd)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブラートである2つの前述の任意の方法。
ee)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子、または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである、本明細書における任意の3つの前述の方法;
ff)上記T細胞が、自己または異種の、天然に存在するT細胞または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物である、本明細書における任意の4つの前述の方法;
gg)上記T細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られたヒトT細胞またはナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)である、本明細書における任意の5つの前述の方法。
hh)上記T細胞が、ヒト末梢血からまたは対象の腫瘍微小環境から得られる、本明細書における任意の6つの前述の方法。
ii)上記T細胞が、前記前処置の前に異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように改変されている、本明細書における任意の前述の方法;T細胞が内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である、請求項28または29のいずれかに記載の方法。
jj)T細胞がCD8+T細胞である、本明細書における任意の前述の方法;
kk)がんの処置のための治療レジメンであって:
1.固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の1日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物の単回投与を投与すること;
2.腫瘍微小環境における腫瘍異種特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を当該対象に投与することであって、脂肪酸異化作用促進性化合物の試薬の上記第一投与が処置の0〜5日目に開始する投与;
3.(2)の処置の開始日から処置の7日〜30日目の間の日まで毎日、脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬を投与すること;
を包含する治療レジメン;
ll)T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬でエキソビボまたはインビトロで前処理されたT細胞を含む哺乳動物対象への養子移入のための組成物;
mm)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブラートである前記組成物;
nn)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである前述の組成物;
oo)T細胞が、自己または異種の、天然に存在するT細胞または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物である、任意の前述の組成物。
pp)T細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られた、ヒトT細胞または
ナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)である、任意の前述の組成物;
qq)T細胞がヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる、任意の前述の組成物;
rr)T細胞が、前記前処置の前に、異種抗原受容体、またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾される、任意の前述の組成物;
ss)T細胞が内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である、任意の前述の組成物;ならびに
tt)T細胞がCD8+T細胞である、任意の前述の組成物。
本発明の様々な実施形態は、以下を包含する:
a)前処理されたT細胞によるエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理または条件付けされたT細胞またはT細胞集団を、がんを有する対象に投与することを包含する、がんを処置するための方法;
b)がんを有する対象に:対象の腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的する免疫療法組成物と、(i)腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬;及び(ii)養子細胞移入のためのエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにT細胞を条件付けるために(i)を用いてエキソビボで前処理したT細胞のうちの1つ以上とを同時投与することを包含する、がんを処置するための方法;
c)抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を投与することをさらに包含する、上記方法のいずれか;
d)上記チェックポイント阻害剤が抗PD−1抗体または低分子リガンドである、本明細書に記載の任意の方法;
e)がんが固形腫瘍の対象内に存在することを特徴とする、本明細書に記載の任意の方
法;
f)がんが、黒色腫、乳癌、脳腫瘍、結腸癌/直腸癌、肺癌、卵巣癌、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、骨肉腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、胃癌、癌、精巣癌、甲状腺癌、膣癌、神経内分泌癌である、本明細書における任意の方法;
g)T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブレートである、本明細書における任意の方法;
h)T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである、本明細書における任意の方法;
i)T細胞が自己または異種の、天然に存在するT細胞または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物である、本明細書における任意の方法;
j)上記T細胞が、対象から、または対象の骨髄移植適合から得られたヒトT細胞またはナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)である、本明細書における任意の方法;
k)T細胞が、ヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる、本明細書における任意の方法;
l)T細胞が、上記前処理の前に、異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾されている本明細書における任意の方法。
m)T細胞が内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である、本明細書における任意の方法;
n)T細胞がCD8+T細胞である本明細書における任意の方法;
o)上記免疫療法組成物(a)が、がん抗原を発現する組換えウイルスまたはウイルス様粒子、がん抗原を発現するDNA構築物、がん抗原またはその断片をペプチドまたはタンパク質として含む組成物、がん抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片である、本明細書における任意の方法;
p)上記免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたT細胞が実質的に同時に投与される、本明細書における任意の方法;
q)脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬または前処理されたT細胞が、免疫療法用組成物の投与後少なくとも1日〜14日に1回または反復投与される、本明細書における任意の方法;
r)上記免疫療法組成物が単回用量または1回以上の追加用量として投与される、本明細書における任意の方法;
s)各組成物が、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内または結腸内投与によって独立して全身的に投与される、本明細書における任意の方法;
t)腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が経口投与される、本明細書における任意の方法;
u)前処理されたT細胞が1回または反復投与される、本明細書における任意の方法;
v)前処置されたT細胞が単回用量または1回以上の用量として投与される、本明細書における任意の方法;
w)前処置されたT細胞が、静脈内注射または注入によって全身的に投与される、本明細書における任意の方法;
x)他の抗癌療法で対象を治療することをさらに包含する、本明細書における任意の方法;
y)前処理されたT細胞、免疫原性組成物または脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物もしくは試薬を投与する前に、化学療法で対象を治療することをさらに包含する、本明細書における任意の方法;
z)前処理されたT細胞の投与前に、リンパ球の対象を枯渇させること、及び必要に応
じて腫瘍を外科的に切除することをさらに包含する、本明細書における任意の方法;
aa)上記方法により標的とされる腫瘍が、低酸素、Tリンパ球による有意な浸潤、及び腫瘍微小環境における低グルコースによって特徴付けられる、本明細書における任意の方法;
bb)T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてT細胞をエキソビボまたはインビトロで前処理することを包含するT細胞を改変する方法;
cc)キメラ抗原受容体−T細胞またはキメラ内分泌受容体−T細胞またはエキソビボで増殖された腫瘍抗原特異的T細胞の生存を増強する方法であって、T細胞をエキソビボで、固形腫瘍を有する対象への養子細胞移入前の腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて前処理することを包含する、方法;
dd)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブラートである2つの前述の任意の方法。
ee)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子、または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである、本明細書における任意の3つの前述の方法;
ff)上記T細胞が、自己または異種の、天然に存在するT細胞または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物である、本明細書における任意の4つの前述の方法;
gg)上記T細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られたヒトT細胞またはナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)である、本明細書における任意の5つの前述の方法。
hh)上記T細胞が、ヒト末梢血からまたは対象の腫瘍微小環境から得られる、本明細書における任意の6つの前述の方法。
ii)上記T細胞が、前記前処置の前に異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように改変されている、本明細書における任意の前述の方法;T細胞が内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である、請求項28または29のいずれかに記載の方法。
jj)T細胞がCD8+T細胞である、本明細書における任意の前述の方法;
kk)がんの処置のための治療レジメンであって:
1.固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の1日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物の単回投与を投与すること;
2.腫瘍微小環境における腫瘍異種特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を当該対象に投与することであって、脂肪酸異化作用促進性化合物の試薬の上記第一投与が処置の0〜5日目に開始する投与;
3.(2)の処置の開始日から処置の7日〜30日目の間の日まで毎日、脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬を投与すること;
を包含する治療レジメン;
ll)T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬でエキソビボまたはインビトロで前処理されたT細胞を含む哺乳動物対象への養子移入のための組成物;
mm)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブラートである前記組成物;
nn)脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである前述の組成物;
oo)T細胞が、自己または異種の、天然に存在するT細胞または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物である、任意の前述の組成物。
pp)T細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られた、ヒトT細胞または
ナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)である、任意の前述の組成物;
qq)T細胞がヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる、任意の前述の組成物;
rr)T細胞が、前記前処置の前に、異種抗原受容体、またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾される、任意の前述の組成物;
ss)T細胞が内因性または異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株である、任意の前述の組成物;ならびに
tt)T細胞がCD8+T細胞である、任意の前述の組成物。
腫瘍微小環境内では、ワクチンに誘発されたCD8+T細胞は、グルコース及びO2の不足に起因する代謝ストレスに遭遇し、その結果、同時阻害剤の発現が増大し、機能が失われる。CD8+腫瘍浸潤T細胞(TIL)は、ケトン体を含む脂肪酸の異化作用を増強することによって反応する。薬物によって誘発される脂肪酸酸化の増大は、CD8+TIL上の同時阻害剤PD−1の発現をさらに増大させるが、T細胞が腫瘍の進行を遅らせる能力を有意に改善する。
Glu及びO2の欠如が、CD8+TILの代謝再プログラミング及び機能的消耗を推進する上で重要な役割を果たすことを確認した。代謝介入ががん免疫療法の有効性を改善することもさらにを示されている。
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のかつ全ての変形を包含すると解釈されるべきである。要約すると、本明細書中に提示されるデータは、マウス黒色腫モデルを用いた能動的がん免疫療法の失敗の根本原因を明らかにする。黒色腫関連抗原(MAA)及び非関連腫瘍抗原(TA)、すなわちヒトパピローマウイルス(HPV)−16のE7に特異的なCD8+T細胞を誘導するワクチンの混合物を用いて黒色腫保有マウスを免疫した。MAA及びバイスタンダーE7特異的CD8+TILの両方とも、同時阻害剤の発現を増大させ、機能を失い、高く持続性の抗原刺激がTIL消耗5の単独の責任であるが、これは、それらの同族抗原に遭遇するCD8+T細胞のエネルギー需要を増大させることにより、寄与し得るという考えに異議を唱える。両方のCD8+TILサブセットとも、腫瘍進行中の制限されたO2及びグルコース供給に起因する代謝ストレスをますます経験する。
実施例1:材料及び方法
細胞株及び組換えアデノウイルス及びレンチベクターの構築。
B16細胞株及びワクチンは、以前に記載されている40、15。B16BrafV600E細胞株(Dr.M Herlyn、Wistar Institute、Philadelphia,PAから贈呈された)は、レンチベクターpLU−EF1a−mCherry発現マウスBrafV600Eを用いた形質導入によってB16.F10細胞から誘導された。HEK 293細胞を用いてワクチンベクターを増殖させた。細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖させた。
細胞株及び組換えアデノウイルス及びレンチベクターの構築。
B16細胞株及びワクチンは、以前に記載されている40、15。B16BrafV600E細胞株(Dr.M Herlyn、Wistar Institute、Philadelphia,PAから贈呈された)は、レンチベクターpLU−EF1a−mCherry発現マウスBrafV600Eを用いた形質導入によってB16.F10細胞から誘導された。HEK 293細胞を用いてワクチンベクターを増殖させた。細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖させた。
AdC68−gDMelapoly及びAdC68−gDE7ベクターの分子構築、レスキュー、精製及び滴定が記載されている40。Melapoly導入遺伝子配列(米国特許第9,402,888号の図7を参照のこと)は、ERシグナル配列(ERss)、続いてパンDRエピトープ(PADRE)、ヒト(h)Trp−2由来の3つのCD4+T細胞エピトープ、及びヒト(h)またはマウス(m)Trp−2、mTrp−1、hgp100及びmBrafV600E(単純ヘルペスウイルス(HSV)糖タンパク質(g
)Dに融合した)由来の8つのCD8+T細胞エピトープから構成される。AdC68−gDMelapolyベクターによって誘発された優勢なCD8+T応答は、Trp−1455エピトープ(MAA特異的CD8+T細胞応答の約90%)に対して向けられる。TRP−1455−四量体+CD8+T細胞を表現型研究について分析し、一方、MAA特異的CD8+T細胞を、図全体を通じて細胞内サイトカイン染色によって機能アッセイについて評価した。
)Dに融合した)由来の8つのCD8+T細胞エピトープから構成される。AdC68−gDMelapolyベクターによって誘発された優勢なCD8+T応答は、Trp−1455エピトープ(MAA特異的CD8+T細胞応答の約90%)に対して向けられる。TRP−1455−四量体+CD8+T細胞を表現型研究について分析し、一方、MAA特異的CD8+T細胞を、図全体を通じて細胞内サイトカイン染色によって機能アッセイについて評価した。
要するに、gDMelapolyまたはgDE7構築物を、I−CeuI及びPI−SceI部位を用いてE1欠損AdC68ウイルス分子クローンに挿入した。構築したプラスミドを用いて、リン酸カルシウム(Invitrogen、Carlsbad、CA)によってHEK293T細胞をトランスフェクトした。プラーク形成の7〜10日後に、アデノウイルスベクターを含む細胞を採取した。ウイルスをさらに連続感染によりHEK293細胞上で増殖させ、3サイクルの凍結融解により回収した。解凍の第3サイクルからの無細胞上清を、塩化セシウム密度超遠心によるウイルス精製に使用した。
レンチベクターの作製のために、HIF−1αまたは対照RNAの異なる領域を標的とする短いヘアピンRNA(shRNA)を含む5つのpLKO.1レンチベクターを、RNAiコンソーシアムから得た。選択マーカーThy1.1をpLKPO−Thy1.1レンチベクター(Addgene)から各shRNAレンチベクターにクローニングした。標準的な手順を用いてレンチベクターを作製した。第2世代のレンチベクターパッケージシステム(Addgene)を使用し、HEK293T細胞を、パッケージングプラスミドPsPAX2、エンベローププラスミドPMD2.G、及びshRNA−Thy1.1発現インサートプラスミドの各々を3:1:1の比で用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後及び72時間後に上清を回収した。レンチベクターは、20,000rpm、4℃で2時間の超遠心分離によって濃縮した。ベクターペレットをPBSで氷上で少なくとも2時間インキュベートした後、再懸濁した。トランスフェクトされた細胞におけるHIF−1α転写物の最も顕著な減少を示したレンチベクターをさらなる研究に使用した。
動物実験
雌性C57Bl/6、B6.SJL−PtprcaPepcb/BoyJ(B6CD45.1+)、B6.PL−Thy1a/CyJ(B6CD90.1+)及びB6;129S4−Pparatm1Gonz/J(B6 PPAR−αKO)マウス(6〜8週)を、National Cancer Institute(NCI)またはJackson Laboratoriesから購入し、Wistar Institute Animal Facilityに収容した。手順は承認されたプロトコールに従って実施した。
雌性C57Bl/6、B6.SJL−PtprcaPepcb/BoyJ(B6CD45.1+)、B6.PL−Thy1a/CyJ(B6CD90.1+)及びB6;129S4−Pparatm1Gonz/J(B6 PPAR−αKO)マウス(6〜8週)を、National Cancer Institute(NCI)またはJackson Laboratoriesから購入し、Wistar Institute Animal Facilityに収容した。手順は承認されたプロトコールに従って実施した。
PBSで希釈したAdC68ベクター(AdC68−gDMelapolyについては1010ウイルス粒子(vp);及びAdC68−gDE7については1011vp)を5〜80匹のC57BL/6マウスの群に、筋肉内に(i.m.)ワクチン接種した。リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で希釈したB16BrafV600E細胞(5×104細胞/マウス)を右脇腹に皮下(s.c.)接種した。腫瘍増殖は、腫瘍の垂直直径を2日ごとに測定することによってモニターした。サイズに依存して、初期の腫瘍はチャレンジの10〜14日後に回収し(2週間と呼ぶ)、一方で、後期の腫瘍は、チャレンジの4〜5週間後に回収した(1ヶ月と呼ぶ)。腫瘍が1〜1.5cmの直径を超えたら、マウスを安楽死させた。
インビボ処置のために、フェノフィブラート(FF;100mg/kg/日、Sigma)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)に最初に希釈し、次いでPBSでさらに希釈
し、経口胃管投与法により3週間毎日与えた。対照マウスには同じ容積の希釈液を与えた。養子移入実験のために、薬物で処理され、1用量あたり5×104個のTrp−1455四量体+CD8+T細胞を含有する、ワクチン接種マウス由来のレンチベクターまたは脾臓細胞を用いて形質転換した、1×107個のインビトロ活性化CD8+T細胞を、レシピエントマウスに静脈内注射した。FF/対照処置脾細胞または野生型/PPAR−αKO脾細胞同時移入実験では、各群由来の105Trp−1455四量体+CD8+T細胞を含む脾細胞を混合し、CD90.1+レシピエントマウスに静脈内で移入した。
し、経口胃管投与法により3週間毎日与えた。対照マウスには同じ容積の希釈液を与えた。養子移入実験のために、薬物で処理され、1用量あたり5×104個のTrp−1455四量体+CD8+T細胞を含有する、ワクチン接種マウス由来のレンチベクターまたは脾臓細胞を用いて形質転換した、1×107個のインビトロ活性化CD8+T細胞を、レシピエントマウスに静脈内注射した。FF/対照処置脾細胞または野生型/PPAR−αKO脾細胞同時移入実験では、各群由来の105Trp−1455四量体+CD8+T細胞を含む脾細胞を混合し、CD90.1+レシピエントマウスに静脈内で移入した。
NSGまたはワクチン接種されていないC57BL/6マウスにおけるPD−1遮断実験では、抗PD−1抗体(クローン29F.1A12)またはアイソタイプ対照抗体(クローン:LTF−2、Bio X Cell)を、腫瘍チャレンジ3日後に開始して与えた。ワクチン接種したC57BL/6マウスでは、ワクチン接種の10日後に抗PD−1またはアイソタイプ対照抗体処置を開始した。抗体は、3日毎に200mg/マウスの用量で腹腔内注射によって与えた。
CD8+T細胞及び薬物処置のインビトロ刺激。
富化されたCD8+T細胞を、CD3(5μg/ml)及びCD28(5μg/mL)(BD Bioscience)に対する抗体でプレコートした6ウェルプレートで4日間活性化した。いくつかの試料では、細胞を最後の16時間低酸素チャンバに移した。相対的に休止しているCD8+T細胞に対する低酸素の影響を研究するために、濃縮したCD8+T細胞を、正常酸素下で48時間刺激した。次いで、細胞をプレートから取り出し、100U/mlのヒトIL−2を含む新鮮な培地で96時間再プレーティングした後、正常酸素または低酸素でIL−2とともにさらに36時間培養してから分析した。Glu(10mM)またはGal(10mM)、10%透析FBS(Life Technologies)、20mM HEPES、2mMグルタマックス、1mMピルビン酸ナトリウム、0.05mMの2−メルカプトエタノール及び1%のペニシリン−ストレプトマイシンを補充したGluなしのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地(life Technologies)中で培養した。低酸素実験は、O2交換用の窒素タンクを備えたThermo Napcoシリーズ8000WJ CO2インキュベーターで行った。O2レベルは、各アッセイで示された期間、CD8+T細胞低酸素培養中、1%で保った。全てのアッセイにおいて、染色前に細胞生存率を評価した。低酸素下でGlu培地で培養した活性化CD8+T細胞は、正常酸素下で培養したもの(芽球の約70〜80%)と比較して、生存細胞の割合が安定していた。正常酸素下でGal培地で培養した活性化CD8+T細胞は、生存率の低下を示した(芽球の約30〜35%)。細胞が低酸素及びGal培地の両方に曝された場合、生存細胞の頻度はわずかに増大した(芽球の約46〜50%)。薬物及び対応するビヒクル対照を、以下のとおり添加した:全培養期間にわたって、2−デオキシ−D−グルコース(2−DG、2mM、Sigma)またはフェノフィブレート(FF、50μM、Sigma);最後48時間はエトモキシール(Eto、200μM、Sigma)。DMSO濃度は、すべての培養条件について0.2%未満に維持した。
富化されたCD8+T細胞を、CD3(5μg/ml)及びCD28(5μg/mL)(BD Bioscience)に対する抗体でプレコートした6ウェルプレートで4日間活性化した。いくつかの試料では、細胞を最後の16時間低酸素チャンバに移した。相対的に休止しているCD8+T細胞に対する低酸素の影響を研究するために、濃縮したCD8+T細胞を、正常酸素下で48時間刺激した。次いで、細胞をプレートから取り出し、100U/mlのヒトIL−2を含む新鮮な培地で96時間再プレーティングした後、正常酸素または低酸素でIL−2とともにさらに36時間培養してから分析した。Glu(10mM)またはGal(10mM)、10%透析FBS(Life Technologies)、20mM HEPES、2mMグルタマックス、1mMピルビン酸ナトリウム、0.05mMの2−メルカプトエタノール及び1%のペニシリン−ストレプトマイシンを補充したGluなしのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地(life Technologies)中で培養した。低酸素実験は、O2交換用の窒素タンクを備えたThermo Napcoシリーズ8000WJ CO2インキュベーターで行った。O2レベルは、各アッセイで示された期間、CD8+T細胞低酸素培養中、1%で保った。全てのアッセイにおいて、染色前に細胞生存率を評価した。低酸素下でGlu培地で培養した活性化CD8+T細胞は、正常酸素下で培養したもの(芽球の約70〜80%)と比較して、生存細胞の割合が安定していた。正常酸素下でGal培地で培養した活性化CD8+T細胞は、生存率の低下を示した(芽球の約30〜35%)。細胞が低酸素及びGal培地の両方に曝された場合、生存細胞の頻度はわずかに増大した(芽球の約46〜50%)。薬物及び対応するビヒクル対照を、以下のとおり添加した:全培養期間にわたって、2−デオキシ−D−グルコース(2−DG、2mM、Sigma)またはフェノフィブレート(FF、50μM、Sigma);最後48時間はエトモキシール(Eto、200μM、Sigma)。DMSO濃度は、すべての培養条件について0.2%未満に維持した。
ナイーブC57Bl/6マウスの脾臓由来のCD8+T細胞を、磁気ビーズ(MACS、STEMCELL Technologies)を用いたネガティブ選択によって精製した。富化したCD8+T細胞を、CD3(5μg/ml)及びCD28(5μg/mL)(BD Bioscience)に対する抗体でプレコートした6ウェルプレートで4日間活性化した。いくつかの試料では、細胞を最後の16時間低酸素チャンバに移した。安静時のCD8+T細胞に対する低酸素の影響を研究するために、精製された富化CD8+T細胞を正常酸素下で48時間刺激した。次いで細胞をプレートから洗い流し、100U/mlのヒトIL−2を含む新鮮な培地に96時間再プレーティングした後、分析前に正常酸素または低酸素中でIL−2とともにさらに36時間培養した。Glu(10mM
)またはGal(10mM)、10%透析FBS(Life Technologies)、20mM HEPES、2mMのGlutamax、1mMピルビン酸ナトリウム、0.05mMの2−メルカプトエタノールおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したGluなしのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地(life Technologies)中で培養した。低酸素実験は、O2交換用の窒素タンクを備えたThermo Napcoシリーズ8000WJ CO2インキュベーターで行った。O2レベルは、各アッセイで示された期間、CD8+T細胞低酸素培養中に1%で保った。薬物及び対応するビヒクル対照を、以下のとおり添加した:全培養期間にわたって2−デオキシ−D−グルコース(2−DG、2mM、Sigma)またはフェノフィブレート(FF、50μM、Sigma);Etomoxir(Eto、200μM、Sigma)、Amidepsine A(AmA、20μM、Santa Cruz)またはOrlistat(OS、100μM、Sigma)で48時間。DMSO濃度は、すべての培養条件について0.2%未満に維持した。
)またはGal(10mM)、10%透析FBS(Life Technologies)、20mM HEPES、2mMのGlutamax、1mMピルビン酸ナトリウム、0.05mMの2−メルカプトエタノールおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したGluなしのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地(life Technologies)中で培養した。低酸素実験は、O2交換用の窒素タンクを備えたThermo Napcoシリーズ8000WJ CO2インキュベーターで行った。O2レベルは、各アッセイで示された期間、CD8+T細胞低酸素培養中に1%で保った。薬物及び対応するビヒクル対照を、以下のとおり添加した:全培養期間にわたって2−デオキシ−D−グルコース(2−DG、2mM、Sigma)またはフェノフィブレート(FF、50μM、Sigma);Etomoxir(Eto、200μM、Sigma)、Amidepsine A(AmA、20μM、Santa Cruz)またはOrlistat(OS、100μM、Sigma)で48時間。DMSO濃度は、すべての培養条件について0.2%未満に維持した。
メタボロミクス(代謝学)
インビトロでのグルコーストレースのために、細胞を、10mMの13C6−グルコースまたは13C6−ガラクトースを含む培地中で4日間、抗CD3/CD28で刺激した。インビトロでのFAトレースのために、細胞を、通常のGluまたはGal培地で4日間刺激し、10%脱脂FBS及び400μM13C16−パルミチン酸塩−BSAを含有する培地に培養の最後の4時間切り替えた。インビボでのトレースは、安楽死の30分前に、2g/kgの[U−13C]グルコースi.p.注射によって、または0.5g/kgの2時間で13C16−パルミチン酸塩を供給し、イントラリピッドに溶解した150mg/kgの13C16−パルミチン酸塩を、20%i.v.で安楽死の1時間前に注射することによって行った。試料をLC−MSにより分析した。
インビトロでのグルコーストレースのために、細胞を、10mMの13C6−グルコースまたは13C6−ガラクトースを含む培地中で4日間、抗CD3/CD28で刺激した。インビトロでのFAトレースのために、細胞を、通常のGluまたはGal培地で4日間刺激し、10%脱脂FBS及び400μM13C16−パルミチン酸塩−BSAを含有する培地に培養の最後の4時間切り替えた。インビボでのトレースは、安楽死の30分前に、2g/kgの[U−13C]グルコースi.p.注射によって、または0.5g/kgの2時間で13C16−パルミチン酸塩を供給し、イントラリピッドに溶解した150mg/kgの13C16−パルミチン酸塩を、20%i.v.で安楽死の1時間前に注射することによって行った。試料をLC−MSにより分析した。
細胞外フラックス分析及び脂肪酸異化作用アッセイ
種々の条件下で刺激されたCD8+T細胞のOCR及びECARを、XF24及びXF96細胞外フラックスアナライザー(Seahorse Bioscience)を用いて製造者の指示に従って測定した。
種々の条件下で刺激されたCD8+T細胞のOCR及びECARを、XF24及びXF96細胞外フラックスアナライザー(Seahorse Bioscience)を用いて製造者の指示に従って測定した。
低酸素試料は、1%O2下で低酸素チャンバで調製した。MACSを用いた死滅細胞除去キットにより死細胞を除去し、生存細胞を100μMの塩化コバルトとともにプレインキュベートした後、低酸素チャンバから取り出し、Seahorse分析装置に入れた。OCRへの脂肪酸酸化(FAO)の寄与を決定するための実験では、Seahorse分析の15分前に200μMのETOを添加した。要するに、基礎の呼吸及び乳酸産生の測定を繰り返した後、1μMのOMを添加してOCRによるATP漏出及びECARによる解糖能を測定した。次に、1.5μMのFCCPを添加して、OCRにより最大呼吸を測定した後、100nMのRotenone及び1μMのAntimycin A(AmA)を添加して、OCRによって予備呼吸容量を決定し、次いで100mMの2−DGを添加してECARによって解糖貯蔵量を決定した。
外因性及び内因性FAの異化作用(酸化)を測定するために、GluまたはGal培地のいずれか中で3日間活性化された細胞を洗浄し、基質制限したGluまたはGal培地に一晩の刺激のために移した。基質制限培地は、0.5mMのGluまたはGal、1mMのGlutaMAX、0.5mMのカルニチン(全てSigma)及び1%の透析FBSを含有した。アッセイの15分前に試料をETOまたは媒体対照のいずれかで処理した。パルミチン酸塩:BSAまたはBSAをアッセイの直前に添加した。
脂肪酸異化作用FAOのOCRへの寄与は、以下のように算出された:外因性FA異化作用/酸化による基礎呼吸=(Basal Palm:BSA−ETO OCR速度−基
礎BSA−ETO OCR速度)−FFAによるアンカップリングに起因するOCR;FFAによるアンカップリング=OM注入後、Palm:BSA−ETO OCR速度−BSA−ETO速度。内因性FA消費に起因する基礎OCR=基礎BSA−ETO OCR速度−基礎BSA+ETO OCR速度。
礎BSA−ETO OCR速度)−FFAによるアンカップリングに起因するOCR;FFAによるアンカップリング=OM注入後、Palm:BSA−ETO OCR速度−BSA−ETO速度。内因性FA消費に起因する基礎OCR=基礎BSA−ETO OCR速度−基礎BSA+ETO OCR速度。
腫瘍間質液中の脂質及びグルコース濃度の測定
腫瘍の間質液を、記載されているように収集した(Wiig et al.,2003)。遊離FA種濃度は、LC−MSによって決定した。Gluの絶対濃度は、内部標準として13C6−Gluを添加した際のLC−MSによって測定した。
CD8+T細胞のレンチベクター形質導入
インビトロ実験のために、4×106個の富化されたCD8+T細胞を、上記のように24〜28時間刺激した。新たに濃縮されたレンチベクターを、ポリブレン(6μg/ml、Santa Cruz)を補充した活性化CD8+T細胞に2000rpm、32℃で2時間スピン−接種した。細胞を、形質導入の20時間後に洗浄し、新しいCD3抗体プレコートプレートに移し、正常酸素下で抗CD28及びヒトIL−2(100U/ml、Roche)を補充した培地中でさらに40時間刺激するか、またはパートタイムの低酸素状態に切り替えた。レンチベクターを形質導入されたCD8+T細胞は、Thy1.1の表面染色、続いてBD LSRIIを用いた分析によって同定された。
インビトロ実験のために、4×106個の富化されたCD8+T細胞を、上記のように24〜28時間刺激した。新たに濃縮されたレンチベクターを、ポリブレン(6μg/ml、Santa Cruz)を補充した活性化CD8+T細胞に2000rpm、32℃で2時間スピン−接種した。細胞を、形質導入の20時間後に洗浄し、新しいCD3抗体プレコートプレートに移し、正常酸素下で抗CD28及びヒトIL−2(100U/ml、Roche)を補充した培地中でさらに40時間刺激するか、またはパートタイムの低酸素状態に切り替えた。レンチベクターを形質導入されたCD8+T細胞は、Thy1.1の表面染色、続いてBD LSRIIを用いた分析によって同定された。
インビボ養子移入実験のために、細胞をレンチベクター形質導入の20時間後に洗浄し、細胞移入前にヒトIL−2(100U/ml)を補充した培地でさらに48時間培養した。レンチベクター−形質導入のCD8+T細胞は、Thy1.1の表面染色によって同定された。レシピエントThy1.2+マウスには、その時点で5日早く腫瘍細胞をチャレンジし、2日早くAdC68−gDMelapolyをワクチン接種した。インビボ実験のために、ナイーブなC57Bl/6マウスの脾臓由来のCD8+T細胞を、磁気ビーズ(MACS、STEMCELL Technologies)を用いたネガティブ選択によって精製した。富化されたCD8+T細胞を、抗CD3/CD28抗体を用いてスピン接種によるレンチベクターの形質導入の前に24時間刺激した。
マウスからのリンパ球の単離
PBMC及び脾細胞を上記のとおり回収した40。要するに、血液試料を、眼窩後穿刺により収集し、PBMCを、Histopaque(Sigma)勾配により単離した。脾臓を回収し、LeibovitzのL15培地中でメッシュスクリーンで細かく刻み、70μmフィルター(Fisher Scientific、Waltham、MA)を通過させることにより単一細胞懸濁液を生成させた。両方の試料について、赤血球を1×RBC溶解緩衝液(eBioscience、San Diego、CA)によって溶解させた。腫瘍浸潤リンパ球を得るために、腫瘍を回収し、小さな断片に切断し、2mg/mlコラゲナーゼP、1mg/ml DNアーゼI(すべてRoche製)及び2%FBS(組織培養生物学)をハンクス平衡塩溶液(HBSS、1X、Thermo Fisher Scientific)中で1時間攪拌して処理した。腫瘍断片をホモジナイズし、70μmのストレーナーで濾過し、リンパ球をPercoll勾配遠心分離によって精製し、10%FBSを補充したDMEMで洗浄した。この処理が試験されたマーカーのいずれにも影響しないことを保証するために、予備実験を行った。
PBMC及び脾細胞を上記のとおり回収した40。要するに、血液試料を、眼窩後穿刺により収集し、PBMCを、Histopaque(Sigma)勾配により単離した。脾臓を回収し、LeibovitzのL15培地中でメッシュスクリーンで細かく刻み、70μmフィルター(Fisher Scientific、Waltham、MA)を通過させることにより単一細胞懸濁液を生成させた。両方の試料について、赤血球を1×RBC溶解緩衝液(eBioscience、San Diego、CA)によって溶解させた。腫瘍浸潤リンパ球を得るために、腫瘍を回収し、小さな断片に切断し、2mg/mlコラゲナーゼP、1mg/ml DNアーゼI(すべてRoche製)及び2%FBS(組織培養生物学)をハンクス平衡塩溶液(HBSS、1X、Thermo Fisher Scientific)中で1時間攪拌して処理した。腫瘍断片をホモジナイズし、70μmのストレーナーで濾過し、リンパ球をPercoll勾配遠心分離によって精製し、10%FBSを補充したDMEMで洗浄した。この処理が試験されたマーカーのいずれにも影響しないことを保証するために、予備実験を行った。
抗体、染色及びフローサイトメトリー
TAPDNLGYMペプチドを有するPE標識Trp−1特異的MHCクラスI(H−2Db)四量体及びRAHYNIVTTFペプチドを有するAlexa647標識HPV−16 E7特異的MHCクラスI(H−2Db)四量体(NIAID Tetrame
r Facilityから得た)を用いて細胞を染色した。リンパ球を、抗CD8−PerCPCy5.5または−Alexa700、CD4−PercpCy5.5、CD44−PacBlue、LAG−3−APCまたは−PercpCy5.5、KLRGI−FITC、PD−1−PE−Cy7または−Brilliant violet(BV)605(全てがBiolegend製)、2B4−FITC(eBioscience)及びAmcyan蛍光反応性染料(Life Technologies)を用いて染色した。
TAPDNLGYMペプチドを有するPE標識Trp−1特異的MHCクラスI(H−2Db)四量体及びRAHYNIVTTFペプチドを有するAlexa647標識HPV−16 E7特異的MHCクラスI(H−2Db)四量体(NIAID Tetrame
r Facilityから得た)を用いて細胞を染色した。リンパ球を、抗CD8−PerCPCy5.5または−Alexa700、CD4−PercpCy5.5、CD44−PacBlue、LAG−3−APCまたは−PercpCy5.5、KLRGI−FITC、PD−1−PE−Cy7または−Brilliant violet(BV)605(全てがBiolegend製)、2B4−FITC(eBioscience)及びAmcyan蛍光反応性染料(Life Technologies)を用いて染色した。
ミトコンドリア代謝マーカー分析のために、正常酸素または低酸素のいずれかの下で37℃で30分間、Mitosox Red(5μM、MROS)及びDioC6(40nM、MMP)(Life Technologies)を用いて細胞を染色した(低酸素下での染色の前に培養したインビトロサンプルについて)。脂肪酸取り込み実験のために、インビトロで異なる条件下で刺激された細胞、または2週齢もしくは1か月齢の腫瘍を有するマウスの脾臓及び腫瘍から単離された細胞を、直ちに1μMのBODIPY FL
C16(Life tech)と共に37℃で30分間インキュベートした。表面染色の前に、冷PBSで細胞を2回洗浄した。Cpt1a染色のために、細胞をまず表面マーカーについて染色し、続いて転写因子緩衝液セット(BD Pharmingen、San Diego、CA)で透過性にした。細胞を、抗Cpt1a抗体またはマウスIgG2bアイソタイプ対照抗体(abcam)を用いて1×prwash中で5μg/mlで45分間4℃で染色した。T−betの染色のために、細胞をまず表面マーカーについて染色し、次いでFoxp3/転写因子染色緩衝液で固定して透過性にし、T−bet−PE−Cy7 Eomes−FTIC(全てeBioscience製)またはFoxO1に対する一次抗体(C29H4、Cell Suignaling Technology)を用いて染色した。総FoxO1は、抗ウサギ二次抗体染色(CST)によってさらに決定された。リン酸化(p)Akt染色のために、細胞をBD Phosflow緩衝液セット及びPhospho−Akt(CST)抗体で染色した。
C16(Life tech)と共に37℃で30分間インキュベートした。表面染色の前に、冷PBSで細胞を2回洗浄した。Cpt1a染色のために、細胞をまず表面マーカーについて染色し、続いて転写因子緩衝液セット(BD Pharmingen、San Diego、CA)で透過性にした。細胞を、抗Cpt1a抗体またはマウスIgG2bアイソタイプ対照抗体(abcam)を用いて1×prwash中で5μg/mlで45分間4℃で染色した。T−betの染色のために、細胞をまず表面マーカーについて染色し、次いでFoxp3/転写因子染色緩衝液で固定して透過性にし、T−bet−PE−Cy7 Eomes−FTIC(全てeBioscience製)またはFoxO1に対する一次抗体(C29H4、Cell Suignaling Technology)を用いて染色した。総FoxO1は、抗ウサギ二次抗体染色(CST)によってさらに決定された。リン酸化(p)Akt染色のために、細胞をBD Phosflow緩衝液セット及びPhospho−Akt(CST)抗体で染色した。
エキソビボリンパ球の細胞内サイトカイン染色(ICS)のために、1試料あたり約106個の細胞を、ペプチドプール(各ペプチドにつき5μg/ml)で6時間、2%FBS及びGolgiplug(Fisher Scientific、1.5μl/ml)を含有するDMEM中で培養し、このペプチドプールには、gD−Melapolyによって発現される全てのCD8+T細胞エピトープ(mTrp−1455−463:TAPDNLGYA、mTrp−1481−489:IAVVAALLL、mTrp−2522−529:YAEDYEEL、hTp−2180−188:SVYDFFVWL、hTrp−2343−357:STFSFRNAL、mTrp−2363−371:SQVMNLHNL、hgp10025−33:KVPRNQDWL、mBraf594−602:FGLANEKSI)またはE7ペプチド:RAHYNIVTTF(Genescript)を含む。狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドを陰性対照として使用した。
インビトロで刺激されたCD8+T細胞を用いて実施したICSについて、約106個の細胞を元の培地中で96ウェルプレートに移し、PMA(500ng/ml)、イオノマイシン(20μg/ml)及びゴルジプラグを用いて4時間、正常酸素または低酸素のいずれかのもとで刺激した。染色は前記のとおり行った14。IFN−γ(APCまたはBV421)、グランザイムB(APC、Life Technologies)及びパーフォリン(PE、eBioscience)に対する抗体を用いて細胞を染色した。細胞を、LSRII(BD Biosciences)により分析した。FlowJo(TreeStar)を用いてデータを分析した。
BRDU増殖アッセイ
マウスに1.5〜2mg/マウスのBrdU溶液を腹腔内注射し、0.8mg/mlの
濃度の水含有BrdUをアッセイの前に24時間与えた。それらを安楽死させ、リンパ球試料を、BrdUの取り込みについて分析した。製造業者の指示(BD Bioscience)に従って細胞をまず表面マーカーについて染色し、次いで細胞内BrdU(1:50希釈)について染色した。
マウスに1.5〜2mg/マウスのBrdU溶液を腹腔内注射し、0.8mg/mlの
濃度の水含有BrdUをアッセイの前に24時間与えた。それらを安楽死させ、リンパ球試料を、BrdUの取り込みについて分析した。製造業者の指示(BD Bioscience)に従って細胞をまず表面マーカーについて染色し、次いで細胞内BrdU(1:50希釈)について染色した。
HIF−1α及びGlut1染色
エキソビボアッセイのために、マウスを、安楽死させた直後にPBS及びヘパリン(10単位/ml)で、次いで、PBSで希釈した1mM塩化コバルト(II)(Cocl2、EMD Millipore)で灌流した。エキソビボ及びインビトロの実験の両方について、リンパ球の単離及び固定前の染色を、200μMのCocl2を含む培地中で行った。染色のために、リンパ球を最初に10%正常ヤギ血清(Life Technology)で室温で30分間ブロックし、次いで抗Glut1一次抗体またはマウスIgG2aアイソタイプ対照抗体(Abcam)を用いて1μg/106細胞で60分間室温で染色した。細胞を洗浄し、PacBlue標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:2000希釈)を用いて他の細胞表面マーカーに対する抗体とともに30分間染色した。細胞を固定し、透過性にし、FoxP3緩衝液セット(eBioscience)を用いて抗HIF−1α−Alexa700抗体(R&D)を用いてHIF−1αについて染色した。
エキソビボアッセイのために、マウスを、安楽死させた直後にPBS及びヘパリン(10単位/ml)で、次いで、PBSで希釈した1mM塩化コバルト(II)(Cocl2、EMD Millipore)で灌流した。エキソビボ及びインビトロの実験の両方について、リンパ球の単離及び固定前の染色を、200μMのCocl2を含む培地中で行った。染色のために、リンパ球を最初に10%正常ヤギ血清(Life Technology)で室温で30分間ブロックし、次いで抗Glut1一次抗体またはマウスIgG2aアイソタイプ対照抗体(Abcam)を用いて1μg/106細胞で60分間室温で染色した。細胞を洗浄し、PacBlue標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:2000希釈)を用いて他の細胞表面マーカーに対する抗体とともに30分間染色した。細胞を固定し、透過性にし、FoxP3緩衝液セット(eBioscience)を用いて抗HIF−1α−Alexa700抗体(R&D)を用いてHIF−1αについて染色した。
腫瘍間質液中のグルコース濃度測定
2週または1か月齢の腫瘍を有するマウスを安楽死させた。腫瘍を除去し、記載のように間質液を採取した37。GluメーターでGlu濃度を決定した。
2週または1か月齢の腫瘍を有するマウスを安楽死させた。腫瘍を除去し、記載のように間質液を採取した37。GluメーターでGlu濃度を決定した。
細胞培養及び同位体標識
インビトロでの13C6−Glu/Galトレースのために、細胞を、10mMのGlu/Gal−13C6(Sigma)を含むGluフリーRPMI培地中でアッセイの開始から4日間培養した。インビトロでの13C16−パルミチン酸塩トレースのために、細胞をGluまたはGal培地中で3日間刺激した。3日目の夜に、一晩の培養のためにいくつかの試料を1%O2に移した。13C16−パルミチン酸塩(Sigma)を200mMの100%エタノールに最初に溶解し、37℃で3〜4時間、超音波処理によってボルテックスすることにより8mM−13C16−パルミチン酸塩−BSAの最終濃度まで5:1のモル比で脂肪酸を含まないBSA(Sigma)にコンジュゲートした。4日目に、試料をペレット化し、10%脱脂FBS(Cocalico Biologicals、Reamstown、PA)及び400μM13C16−パルミチン酸塩−BSAを含む新鮮な培地に再プレーティングした。低酸素試料を1%O2に戻した。すべての試料をさらに4時間培養した。死んだ細胞は、MACSによって除去した。試料を4000rpmで5分間ペレット化した。全ての回収手順は4℃で行った。
インビトロでの13C6−Glu/Galトレースのために、細胞を、10mMのGlu/Gal−13C6(Sigma)を含むGluフリーRPMI培地中でアッセイの開始から4日間培養した。インビトロでの13C16−パルミチン酸塩トレースのために、細胞をGluまたはGal培地中で3日間刺激した。3日目の夜に、一晩の培養のためにいくつかの試料を1%O2に移した。13C16−パルミチン酸塩(Sigma)を200mMの100%エタノールに最初に溶解し、37℃で3〜4時間、超音波処理によってボルテックスすることにより8mM−13C16−パルミチン酸塩−BSAの最終濃度まで5:1のモル比で脂肪酸を含まないBSA(Sigma)にコンジュゲートした。4日目に、試料をペレット化し、10%脱脂FBS(Cocalico Biologicals、Reamstown、PA)及び400μM13C16−パルミチン酸塩−BSAを含む新鮮な培地に再プレーティングした。低酸素試料を1%O2に戻した。すべての試料をさらに4時間培養した。死んだ細胞は、MACSによって除去した。試料を4000rpmで5分間ペレット化した。全ての回収手順は4℃で行った。
各試料の細胞数を測定した。代謝を消失させ、100万個の細胞あたり1mlの−80℃の80:20のメタノール:水を添加することにより代謝産物を抽出した。ドライアイスで20分間インキュベートした後、試料を10000gで5分間遠心分離した。ドライアイス上で1mlの−80℃の80:20のメタノール:水を用いて不溶性ペレットを再抽出した。2回の抽出からの上清を合わせ、N2下で乾燥させ、百万個の細胞あたり1mlの水に再懸濁した。代謝産物を細胞数に対して正規化した。
インビボでの13C6−Gluトレースのために、腫瘍保有マウスを、一晩、16時間絶食させた。13C6−GluをPBSで希釈し、マウスにi.p.で2g/kgで投与した。注射の30分後に脾臓及び腫瘍を採取した。U13C16−パルミチン酸塩トレースマウスを16時間絶食させた後、ポリエチレングリコール300(Hampton Research、Aliso Viejo、CA)に溶解した13C16−パルミチン酸塩を経口胃管投与により0.5g/kgで投与した。1時間後、イントラリピッドに溶解
した13C16−パルミチン酸塩、20%(Sigma)を、i.v.で150mg/kg与えた。i.v.注射の1時間後にマウスを安楽死させ、脾臓及び腫瘍を収集した。組織を処理し、細胞をできるだけ迅速に氷上で単離した。プールされた脾臓及び腫瘍由来のCD8+CD44+T細胞を染色し、4℃で選別し、細胞数を決定した。代謝産物を−80℃の80:20メタノール:水で抽出し、N2下で乾燥し、1mlの水に再懸濁した。代謝産物を細胞数に対して正規化した。TCA回路代謝物への13Cの寄与は、[(m+1)*1+...(m+n)*n]/{[(m+0)+...+(m+n)]*n}*100%として算出し、ここでm+0は、12C形の代謝産物の正規化されたシグナル強度であり、m+nは、13C標識代謝産物の各形態の正規化されたシグナル強度を示し、nは代謝産物中の炭素原子の総数を示す。
した13C16−パルミチン酸塩、20%(Sigma)を、i.v.で150mg/kg与えた。i.v.注射の1時間後にマウスを安楽死させ、脾臓及び腫瘍を収集した。組織を処理し、細胞をできるだけ迅速に氷上で単離した。プールされた脾臓及び腫瘍由来のCD8+CD44+T細胞を染色し、4℃で選別し、細胞数を決定した。代謝産物を−80℃の80:20メタノール:水で抽出し、N2下で乾燥し、1mlの水に再懸濁した。代謝産物を細胞数に対して正規化した。TCA回路代謝物への13Cの寄与は、[(m+1)*1+...(m+n)*n]/{[(m+0)+...+(m+n)]*n}*100%として算出し、ここでm+0は、12C形の代謝産物の正規化されたシグナル強度であり、m+nは、13C標識代謝産物の各形態の正規化されたシグナル強度を示し、nは代謝産物中の炭素原子の総数を示す。
LC−MS計器及び方法開発。
解糖及びTCA代謝産物を、独立型オービトラップ(Thermo)(Lu et al.,2010)でのネガティブモードエレクトロスプレーイオン化高分解能MSと組み合わせた逆相イオン対形成クロマトグラフィーによって分析した。カルニチン種は、Q Exactiveハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計(Thermo)でのポジティブモードエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた逆相イオン対形成クロマトグラフィーによって分析した;液体クロマトグラフィー分離は、Poroshell 120 Bonus−RPカラム(2.1mm×150mm、2.7μm粒径、Agilent)で達成した。全実行時間は、0分から12分までは50μl/分、12分から25分までは200μl/分の流速で25分である。溶媒Aは、98:2の水:アセトニトリル(10mMの酢酸ナトリウム及び0.1%の酢酸を含む)であり;溶媒Bはアセトニトリルである。勾配は12分で0〜70%Bである。全ての同位体標識パターンを、天然の13C存在量に対して補正した。
解糖及びTCA代謝産物を、独立型オービトラップ(Thermo)(Lu et al.,2010)でのネガティブモードエレクトロスプレーイオン化高分解能MSと組み合わせた逆相イオン対形成クロマトグラフィーによって分析した。カルニチン種は、Q Exactiveハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計(Thermo)でのポジティブモードエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた逆相イオン対形成クロマトグラフィーによって分析した;液体クロマトグラフィー分離は、Poroshell 120 Bonus−RPカラム(2.1mm×150mm、2.7μm粒径、Agilent)で達成した。全実行時間は、0分から12分までは50μl/分、12分から25分までは200μl/分の流速で25分である。溶媒Aは、98:2の水:アセトニトリル(10mMの酢酸ナトリウム及び0.1%の酢酸を含む)であり;溶媒Bはアセトニトリルである。勾配は12分で0〜70%Bである。全ての同位体標識パターンを、天然の13C存在量に対して補正した。
遺伝子発現解析
リンパ球は、異なる時点でマウスの脾臓及び腫瘍(腫瘍保有または正常)から単離し、生細胞、CD8+、CD44+及びTrp−1及びE7四量体に対する色素及び抗体で染色した。同時養子移入実験のために、異なる起源のCD8+CD44+Tドナー細胞を、3週間後に抗体染色及び選別によってレシピエントマウスの脾臓及び腫瘍から回収した。細胞を、氷上でTrp−1またはE7tet+CD44+CD8+T細胞にRNA保護細胞試薬(QIAGEN)中にソートした(Mono Astrios、Beckman Coulter)。
リンパ球は、異なる時点でマウスの脾臓及び腫瘍(腫瘍保有または正常)から単離し、生細胞、CD8+、CD44+及びTrp−1及びE7四量体に対する色素及び抗体で染色した。同時養子移入実験のために、異なる起源のCD8+CD44+Tドナー細胞を、3週間後に抗体染色及び選別によってレシピエントマウスの脾臓及び腫瘍から回収した。細胞を、氷上でTrp−1またはE7tet+CD44+CD8+T細胞にRNA保護細胞試薬(QIAGEN)中にソートした(Mono Astrios、Beckman Coulter)。
インビトロで培養した試料について、手動細胞分離カラム及びMini/Midi MACSセパレーター(Miltenyi Biotec)を使用して約106個の細胞/試料を氷上で処理して死細胞を除去した。レンチベクター形質導入アッセイのために、形質導入細胞を、MACSを用いたThy1.1発現に基づいてさらに精製した。RNeasy Miniキット(Qiagen)を用いて、RNAを精製細胞から単離し、RNA濃度を、Nanodrop(Thermo Scientific)を用いて決定した。高容量cDNA逆転写キット(Life Technologies)を用いた逆転写により、cDNAを得た。相対的定量的リアルタイムPCR分析は、7500 Fast Real−Time PCRシステム(Life Technologies)を用いて行った。b−2ミクログロブリンまたはGAPDHを、内部対照として用いた。GAPDHまたはβ−2ミクログロブリンを、内部対照として使用した。表1は、実施例1に記載の遺伝子発現解析のための代謝経路、遺伝子名ならびにフォワード及びリバースプライマーを示す。プライマー設計にはベクターNTIを用いた。
転写産物発現レベルの相違は、ヒートマップで視覚化される。値を対数変換して相違の比を示した。カラースケールは−2(低発現、ディープブルー(藍色))から2(高発現、ディープレッド(深紅))に設定した。
インビボでの同位体標識
腫瘍を有するマウスを16時間絶食させた。PBSで希釈した13C6−Glu(Cambridge)をi.p.でマウスに2g/kgで投与した。30分後に脾臓及び腫瘍を収集した。13C16−パルミチン酸カリウムを、FAフリーBSA(6:1のモル比)にコンジュゲートさせ、経口胃管投与により約0.35g/kgでマウスに与えた。1時間後、13C16−パルミチン酸塩−BSAを、i.v.で125mg/kgで与えた。脾臓及び腫瘍を、30分後に収集し、細胞を氷上で単離した。腫瘍試料を秤量し、液体窒素中で急速凍結した。プールした試料由来のCD8+CD44+T細胞を染色し、4℃で選別した。代謝産物を−80℃の80:20メタノール:水で抽出し、N2下で乾燥させ、100mg組織/mlまたは106細胞/100μlで水に再懸濁した。
腫瘍を有するマウスを16時間絶食させた。PBSで希釈した13C6−Glu(Cambridge)をi.p.でマウスに2g/kgで投与した。30分後に脾臓及び腫瘍を収集した。13C16−パルミチン酸カリウムを、FAフリーBSA(6:1のモル比)にコンジュゲートさせ、経口胃管投与により約0.35g/kgでマウスに与えた。1時間後、13C16−パルミチン酸塩−BSAを、i.v.で125mg/kgで与えた。脾臓及び腫瘍を、30分後に収集し、細胞を氷上で単離した。腫瘍試料を秤量し、液体窒素中で急速凍結した。プールした試料由来のCD8+CD44+T細胞を染色し、4℃で選別した。代謝産物を−80℃の80:20メタノール:水で抽出し、N2下で乾燥させ、100mg組織/mlまたは106細胞/100μlで水に再懸濁した。
統計分析
2つの集団間の差異の有意性は、スチューデントt検定によって計算した;複数の集団間の相違の有意性を、GraphPad Prism 6を用いた一元または二元のANOVAによって計算した。生存の相違は、Log−rank Mantel−Cox検定によって算出した。有意性は、p値が0.05以下と設定した。タイプIの誤差は、ホルムシダック法を用いて複数の比較について補正した。
2つの集団間の差異の有意性は、スチューデントt検定によって計算した;複数の集団間の相違の有意性を、GraphPad Prism 6を用いた一元または二元のANOVAによって計算した。生存の相違は、Log−rank Mantel−Cox検定によって算出した。有意性は、p値が0.05以下と設定した。タイプIの誤差は、ホルムシダック法を用いて複数の比較について補正した。
実施例2:CD8+T細胞は、同族抗原の認識とは独立して、TME内で機能不全になる
CD8+TILの運命が継続的な抗原認識に依存するか否かを試験するために、本発明者らは、移植可能なマウス黒色腫モデルにおいて2種のワクチンを使用した。1つはAdC68gD−Melapoly40と呼ばれ、主にTrp−1455−463エピトープにMAA特異的CD8+T細胞応答を誘発するアデノウイルス(Ad)ベースのポリエピトープワクチンであり;もう一方は、AdC68−gDE715と呼ばれ、CD8+T細胞をE7に刺激する。
CD8+TILの運命が継続的な抗原認識に依存するか否かを試験するために、本発明者らは、移植可能なマウス黒色腫モデルにおいて2種のワクチンを使用した。1つはAdC68gD−Melapoly40と呼ばれ、主にTrp−1455−463エピトープにMAA特異的CD8+T細胞応答を誘発するアデノウイルス(Ad)ベースのポリエピトープワクチンであり;もう一方は、AdC68−gDE715と呼ばれ、CD8+T細胞をE7に刺激する。
本発明者らは、3日齢のB16BrafV600E腫瘍を有するマウス及び正常マウスに、AdC68−gDMelapolyをAdC68−gDE7と混合してワクチン接種
した。ワクチン接種は、腫瘍の進行を遅延させる(図1A)。ワクチン接種の前に腫瘍細胞で3日間(d)チャレンジしたかまたは曝露しなかったマウスの脾臓(Spl)及び腫瘍中の四量体(tet)+Trp−1及びE7特異的CD8+T細胞/106生存細胞の数を示す実験によって(n=7〜10/群)、Trp−1及びE7特異的CD8+T細胞の両方とも、腫瘍内に蓄積し、腫瘍進行中の末梢よりTMEにおいてより急速に収縮することが明らかになった(データは示さず)。
した。ワクチン接種は、腫瘍の進行を遅延させる(図1A)。ワクチン接種の前に腫瘍細胞で3日間(d)チャレンジしたかまたは曝露しなかったマウスの脾臓(Spl)及び腫瘍中の四量体(tet)+Trp−1及びE7特異的CD8+T細胞/106生存細胞の数を示す実験によって(n=7〜10/群)、Trp−1及びE7特異的CD8+T細胞の両方とも、腫瘍内に蓄積し、腫瘍進行中の末梢よりTMEにおいてより急速に収縮することが明らかになった(データは示さず)。
ワクチン接種の3日前にB16細胞をチャレンジしたマウスの脾臓及び腫瘍由来のTrp−1及びE7特異的CD8+T細胞へのブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込みの%を測定した(n=5/時点)。ワクチン接種後9日目、19日目または29日目にBrdUを24時間、安楽死前日に投与した。測定は、10日目、20日目及び1か月に実施した(n=5、2回の実験の代表)。Trp−1特異的CD8+T細胞のみが腫瘍内で増殖する。Trp−1特異的CD8+TILの数は、ワクチン接種後10日〜1ヶ月で90%を超えて減少したが、E7特異的CD8+TILは、約80%未満の低下であった。Trp−1特異的CD8+TIL数のこの顕著な減少は、腫瘍内で増殖しても観察された。それにもかかわらず、Trp−1抗原の存在が継続しているにもかかわらず、それらの増殖は経時的に減少する(図示せず)。
ワクチン接種後2週間(wk)または1か月(mo)で脾臓及び腫瘍から特異的CD8+T細胞上のPD−1及びLAG−3の平均蛍光強度(MFI)及び代表的なヒストグラムを作製した。2週間及びより顕著な程度に1ヶ月の腫瘍からのTrp−1特異的及びバイスタンダーE7特異的CD8+T細胞の両方とも、TME内の枯渇マーカーPD−1及びLAG−3の発現を増大させる(データは示さず)。Trp−1特異的及びバイスタンダーE7特異的CD8+T細胞は、TME内で機能を失う。
これによって、溶菌酵素またはインターフェロン(IFN)−γのような、抗原特異的CD8+TIL産生のエフェクター分子の頻度減少及び減少した多機能性と組み合わせて(図1B)、ワクチン誘導性のTILは、それらのエピトープ特異性にかかわらず、腫瘍の進行中に「消耗」に向かって分化することが示唆される。ワクチン接種に使用されるAdベクターは、低レベルで持続し、したがって完全に機能するエフェクターCD8+T細胞を高頻度で維持する(Tatsis et al.,2007)。
別の実験において、Trp−1特異的CD8+T細胞及びCD44−ナイーブT細胞についての代表的なヒストグラムを有する脾臓及び腫瘍由来の特異的CD8+T細胞中/上中のCD62L、CD127、KLRG1及びEomesのMFIを示すグラフを作成した(図1C)。脾臓及び腫瘍由来のワクチン誘導性CD8+T細胞の上/中の分化マーカーCD62L、CD127、KLRG1及びEomesのレベルは、匹敵したままであった。したがって、慢性抗原曝露以外の因子は、CD8+TIL枯渇に寄与する。
代謝ストレスは、細胞の運命を決定し26、16、23、抗原特異性とは無関係に潜在的にCD8+TILの機能及び生存に影響を及ぼす。腫瘍進行中、Trp−1及びE7特異的CD8+TILは、ATP産生に必須であり、有毒なミトコンドリア活性酸素種(MROS)のレベルを増大させるミトコンドリア膜電位(MMP)を徐々に失う(図2A)。MMPloMROShiTrp−1−及びそれほどではないが、E7特異的CD8+TILは、後期腫瘍において蔓延し(図2B)、一方で、脾臓由来の対応するCD8+T細胞は大部分がMMPhiMROSloのままである。これらのデータによって、CD8+TILが成長する腫瘍内でますます代謝ストレスを経験することが示唆される。
本明細書に示すとおり、継続的な刺激は障害を加速するようである。
実施例3:HIF−1Aを通じた低酸素状態は、LAG−3発現を増大させ、T細胞機能を低下させる
Trp−1及びE7特異的CD8+TILは、低酸素下で安定化する転写因子であるHIF−1α及びその下流標的であるGlut1(Glu摂取を、ワクチン誘導CD8+TIL中/上で1ヶ月から促進する(図2C)。ただし、小さな2週間腫瘍では促進しない)の増強された発現によって示されるように、腫瘍進行中に次第に低酸素状態に曝される(データ示さず)。
Trp−1及びE7特異的CD8+TILは、低酸素下で安定化する転写因子であるHIF−1α及びその下流標的であるGlut1(Glu摂取を、ワクチン誘導CD8+TIL中/上で1ヶ月から促進する(図2C)。ただし、小さな2週間腫瘍では促進しない)の増強された発現によって示されるように、腫瘍進行中に次第に低酸素状態に曝される(データ示さず)。
低酸素状態がCD8+T細胞にどのように影響を及ぼすかを決定するために、本発明者らは、正常酸素(21%O2)下で96時間、または低酸素(1%O2)下で最後の16時間、インビトロで連続的に、富化された、活性化CD8+T細胞を刺激した。低酸素状態は、芽球形成を低減させ(図8A)、HIF−1α及びGlut1の発現を増大させる(図8B)。OXPHOSの尺度であるO2消費速度(OCR)は、低酸素下で減少するが、解糖の尺度である細胞外酸性化速度(ECAR)は増大する(図8C)。T細胞のMMPは減少し、MROSは増大し、末期腫瘍におけるワクチン誘導性TILの代謝プロフィールを想起させるMMPloMROShiCD8+T細胞の割合が上昇する(データは示さず)。低酸素状態は、PD−1を減少させるが、LAG−3発現を増強させ(図8D)、このことは、PD−1が低下し、LAG−3が、HIF−1αシグナリングによって駆動される解糖の増強の際に増大することを示唆する。低酸素下で培養されたCD8+T細胞は、T−bet発現を減少させ(図8D)、エフェクター分子の産生を減少させ、多機能性を失い(図8E)、これによって、低酸素状態がCD8+T細胞機能を損なうことが示される。
休止中のCD8+T細胞に対する低酸素状態の効果を試験する、以前に記載された別のプロトコール(Doedens et al.,2013)を、T細胞を48時間刺激することによって行った。活性化時のCD8+T細胞は、CD3またはCD28刺激に対する抗体を有さないIL−2含有培地に切り替えられ、低酸素状態の前にIL−2中の比較的休止期で維持される。低酸素状態の影響は、IL−2で培養した細胞を、最後の36時間、1%O2に曝すことによって評価した。図8Fは芽球形成を示す;生存IL−2の正規化された%は、このプロトコールを使用して正常酸素(濃い灰色)下で培養されたものと比較して低酸素(白)下で芽球を形成するCD8+T細胞を維持した。このプロトコールは、芽球形成(図8F)またはPD−1に影響を及ぼさないが、LAG−3は増大し(図8G)、T−betが減少する(図8G)。グランザイムB(GzmB)の産生は増大するが、他のエフェクター分子の産生及び多機能性は低下する(図8H)。ワクチンに誘発されたCD8+T細胞は、TMEの低酸素領域に浸潤する前に休止する可能性が低いため、その後の低酸素実験には連続CD8+T細胞活性化プロトコールを使用した。
固形腫瘍は通常O2を欠く。このデータによって、TME内のTrp−1及びE7特異的CD8+TILが、低酸素下で安定化する転写因子であるHIF−1α及び下流標的Glut1(ワクチン誘導性CD8+TILの中/上で後期段階(図2C)から、Glu取り込みを容易にするが、ただし小さな2週目の腫瘍ではGlu取り込みを容易にしない(データ示さず))の増強された発現によって示されるように、腫瘍進行中に低酸素状態をますます経験することが示されている。
低酸素状態の影響を試験するために、本発明者らは、正常酸素(21%O2)下で通常のGlu豊富な培地で4日間CD8+T細胞をインビトロで刺激するか、または培養の最後の16時間に低酸素(1%O2)に曝した。低酸素状態は、芽球形成の減少によって証明されるように、T細胞刺激に影響を及ぼす(図8A)。低酸素下で活性化されたCD8+T細胞は、HIF−1α及びGlut1の発現を増大させる(図8B)。それらは、MMPの減少及びMROSの上昇によって証明されるように代謝的にストレスを受け、後期
腫瘍におけるワクチン誘導TILのミトコンドリア代謝プロファイルを思い起こさせるMMPloMROShiCD8+T細胞(図8C)の割合の増大をもたらす。低酸素状態はPD−1を減少させるが、LAG−3発現を増大させ(図8D)、HIF−1αシグナル伝達の強化などの解糖を促進する条件下でPD−1が低下し、LAG−3が増大することを示唆する。低酸素下で培養されたCD8+T細胞は、T−bet発現を低下させ(図8D)、エフェクター分子の産生を減少させ、多機能性を失う(図8E)。
腫瘍におけるワクチン誘導TILのミトコンドリア代謝プロファイルを思い起こさせるMMPloMROShiCD8+T細胞(図8C)の割合の増大をもたらす。低酸素状態はPD−1を減少させるが、LAG−3発現を増大させ(図8D)、HIF−1αシグナル伝達の強化などの解糖を促進する条件下でPD−1が低下し、LAG−3が増大することを示唆する。低酸素下で培養されたCD8+T細胞は、T−bet発現を低下させ(図8D)、エフェクター分子の産生を減少させ、多機能性を失う(図8E)。
最初の活性化の際に、低酸素状態の前に、CD8+T細胞がIL−2で休止されている、以前に記載された異なるプロトコール10は、芽球形成(図8F)またはPD−1レベルに影響を及ぼさないが、LAG−3発現は増大し(図8G)、T−betレベルが減少する(図8G)。グランザイムB(GzmB)の産生は増大するが、他のエフェクター分子の産生及び多機能性は低下する(図8H)。ワクチンによって誘発されたCD8+T細胞は、浸潤する腫瘍の前に休止する可能性が低いので、その後の低酸素状態実験のために連続CD8+T細胞活性化プロトコールを使用した。
HIF−1αは、低酸素状態に曝されたTILまたはCD8+T細胞上のLAG−3の発現と相関する。HIF−1αがLAG−3発現を直接的に促進するか否か、及びこれがCD8+T細胞機能に影響を及ぼすか否かを決定するために、本発明者らは、HIF−1αをサイレンシングさせる短いヘアピン(sh)RNAまたはコントロール配列を、Thy1.1選択マーカー(データ示さず)と一緒に発現するレンチベクターを使用してCD8+T細胞を形質導入することによって、HIF−1α転写物をノックダウンした。HIF−1αサイレンシング/ノックダウンは、低酸素下でインビトロで刺激されたCD8+T細胞におけるHIF−1αの発現を減少させ(図3A参照)、同時にLAG−3を減少させたが、PD−1は減少させず(図3A参照)、GzmB及びIFN−γの産生を改善する(図3B参照)。HIF−1αは、低酸素状態に曝されたTILまたはCD8+T細胞上のLAG−3の発現と正の相関がある。
HIF−1αがCD8+TILの同時阻害剤発現及び機能喪失に寄与するか否かを研究するために、本発明者らは、インビトロで富化されたCD8+T細胞を活性化した。富化されたCD8+T細胞を、対照またはHIF−1αを標的とするshRNA及びThy1.1を発現するレンチベクター(すなわち、レンチウイルスに基づくベクター)を用いて形質導入した。ウイルスを、5日早く腫瘍細胞をチャレンジし、2日早くAdC68−gDMelapolyをワクチン接種したレシピエントマウス(すなわち、Thy1.2+腫瘍保有、AdC68−gDMelapolyワクチン接種マウス)にi.v.で移入した。
Trp−1特異的Thy1.1+CD8+T細胞は、移入から約2〜3週間後に腫瘍から回収された。同様のサイズの腫瘍を有するマウスからの試料を用いて、約2〜3週間後に、移入されたT細胞を分析した。腫瘍由来の細胞を、単核細胞、シングレット(singlet)、生存細胞及びCD8+T細胞上に最初にゲーティングした。それらは、Thy1.1+細胞及びTrp−1−四量体+CD44+細胞上でさらにゲーティングされた。
HIF−1αをノックダウンすると(図3A)、PD−1に影響することなくLAG−3のTrp−1特異的CD8+TILの発現が減少し(図3A)、MAA特異的CD8+TILの頻度及びエフェクター機能が有意に改善される(図3B)。T細胞の頻度及び機能(図3C)。パーフォリンの産生は、インビボではHIF−1αサイレンシングの際に増大したがインビトロでは増大せず、これは活性化CD8+T細胞に対する低酸素状態の影響に栄養素の供給の違いなどの他の条件が寄与していることを反映し得る。これらのデータは、増大したHIF−1αシグナル伝達による低酸素状態が、LAG−3発現を直接
増強し、CD8+TILのエフェクター機能を減衰させることを支持する。
増強し、CD8+TILのエフェクター機能を減衰させることを支持する。
集合的に、このデータは、HIF−1αによる低酸素状態が活性化CD8+T細胞の機能障害をもたらすことを示す。低酸素誘導のHIF−1αは、同時阻害剤LAG−3の発現を直接駆動し、インビトロで活性化CD8+T細胞のエフェクター機能を損なう。HIF−1aは、グルコース取り込み及び解糖の酵素を増大させる。これはピルビン酸デヒドロゲナーゼを不活性化するPDK1を活性化することにより、TCA回路によるエネルギー産生を減少させる。グルコース不足の環境内で、HIF−1aシグナル伝達の増大は、TAA特異的CD8+T細胞に対して逆効果である。このデータはさらに、解糖に対するHIF−1α駆動の代謝切り替えが、O2及びGlu欠乏TME内のT細胞機能に対して逆効果であることを示唆している。
実施例4:GLU及びO2エンハンサーFA異化作用の両方を失う活性化CD8+T細胞
おそらく腫瘍細胞によるその消費のために、腫瘍進行中にO2だけでなくGluもTME内で低下する。低血糖及び低酸素活性化CD8+T細胞の集団効果を、解糖阻害剤である2−デオキシ−D−グルコース(2−DG)を用いたGlu培地中でインビトロで刺激することによって研究した。あるいは、Gluを、ガラクトース(Gal)で置換した。細胞を正常酸素状態または短期低酸素状態で培養した。解糖の尺度である細胞外酸性化速度(ECAR)は、2−DGまたはGalと培養されたT細胞を減少させる。
おそらく腫瘍細胞によるその消費のために、腫瘍進行中にO2だけでなくGluもTME内で低下する。低血糖及び低酸素活性化CD8+T細胞の集団効果を、解糖阻害剤である2−デオキシ−D−グルコース(2−DG)を用いたGlu培地中でインビトロで刺激することによって研究した。あるいは、Gluを、ガラクトース(Gal)で置換した。細胞を正常酸素状態または短期低酸素状態で培養した。解糖の尺度である細胞外酸性化速度(ECAR)は、2−DGまたはGalと培養されたT細胞を減少させる。
O2消費速度(OCR)は、OXPHOSの尺度であり、2−DGと共に培養されたT細胞において減少するが、Galの存在下で増大する(図9A)。いずれの条件もOCR/ECAR比を増大させ、これによって、PD−1をより多く発現する、Gluで増殖させたものと比較して、2−DGまたはGalと培養したOXPHOS細胞を通じたエネルギー産生の増大が示唆されており、これはOXPHOSの使用が、活性化されたCD8+T細胞での高いPD−1発現とリンクされていることが示唆される(図9B〜9C)。Gluと培養した細胞と比較して、正常酸素状態及び低酸素状態の両方でGluへのアクセス制限で増殖された細胞は、T−bet発現を減少させ(図9D)、機能を失う(図9E)。細胞が低酸素状態に曝された場合、GluにアクセスすることがないCD8+T細胞の多機能は、より良好に保存される(図9D)。これらのデータによって、低酸素状態では、Gluの供給が限られている細胞は、その機能をサポートするために代謝をより調整し得ることが示唆される。
制限されたGlu及びO2供給を伴うCD8+T細胞によって使用される代謝経路を研究するために、本発明者らは定量的リアルタイム(qRT)PCRによって、栄養素消費及びエネルギー産生に関与する因子の転写物を測定した(図15F、図4B及び表2)。
短期低酸素状態では、Gluに富む培地で刺激された細胞と比較して、Gluへのアクセスを制限して刺激されたCD8+T細胞は、解糖の酵素の転写物、トリカルボン酸(TCA)サイクル、ROS解毒、及び電子伝達鎖(ETC)を低下するが、FA取り込みの受容体及び酵素の転写物、トリグリセリドTG代謝回転、ペルオキシソーム及びミトコン
ドリアFA異化作用を増大させる。
ドリアFA異化作用を増大させる。
このパターンは、小さい2週齢の腫瘍由来のものと比較して、1ヶ月の腫瘍由来のTrp−1及びE7特異的CD8+TILによって密接に反映され、このことは、代謝ストレスを受けたCD8+T細胞がますますFA異化作用に依存することを示している。腫瘍進行中の転写産物の変化は、TILをさらに休止期に分化させることによって駆動されない。なぜなら、それらの変化は、ワクチン接種後3か月と2週間で試験したワクチン誘導性脾臓CD8+T細胞の相違とは異なるためである。
CD8+T細胞代謝に対するGlu及びO2欠乏の影響を直接測定するために、脂質クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)によって代謝産物の強度を分析した。FAミトコンドリア輸送及び異化作用に関与する代謝物、すなわちアセチルカルニチン、パルミトイルカルニチン及びケトン体3−ヒドロキシ酪酸は、Gal培地中でインビトロで刺激された細胞において増大し、これは低酸素下でさらに増強される(図10A)。13C6−Glu/Galまたは13C16−パルミチン酸塩の同位体トレースは、Glu培地及び短期低酸素状態で活性化されたCD8+T細胞、または正常酸素下でGlu培地で活性化されたものと比較して正常酸素もしくは低酸素下でGluへのアクセスが制限された培地において活性化されたCD8+T細胞は、炭水化物由来のTCA回路代謝産物を減少させた(図10B)。13C16−パルミチン酸塩由来の炭素は、アセチル−CoA及びTCA回路代謝産物にますます取り込まれている(図10C)。さらに、低酸素下で刺激された細胞は、正常酸素下で同じ培地で培養されたものよりも13C16−パルミチン酸塩由来アセチル−CoAの割合が高く、これによって、低酸素状態が脂肪酸異化作用をさらに増大させることが示唆される。これは、Glu及び/またはO2へのアクセスが限定された、活性化されたCD8+T細胞によるFA取り込みの増大(図10D)ならびに内因性及び外因性FAの酸化の増強(図10E)によっても支持される。これらのデータは、Gluを剥奪された活性化CD8+T細胞がFA異化作用にますます依存して、OXPHOSを通じてエネルギーを生成することを示している。驚くべきことに、OXPHOSはO2を必要とするが、低酸素状態はこの代謝切り替えを増大させる。
本発明者らは次に、安定した同位体トレースによって、活性化されたCD8+T細胞の代謝をインビボで直接研究した。3日の腫瘍を有するマウスに、AdC68−gDMelapoly及びAdC68−gDE7をワクチン接種した。2週間または1ヶ月後、マウスに13C6−Gluをi.p.で与えた。30分後、TILSを単離し、CD8+CD44+細胞を単離し、それらの代謝産物を分析する。解糖代謝物のレベル及びTCA回路中間体への13C取り込みを、脾臓及び腫瘍由来のCD44+CD8+T細胞において分析した。TIL中の解糖中間体グルコース−6−リン酸(G6P)及び3−ホスホグリセリン酸(3PG)の強度は、腫瘍の進行中に低下し(図4C)、これは解糖の減少を示している。TCA回路中間体へのGlu由来炭素の寄与は、CD44+CD8+T細胞を、後期腫瘍から早期腫瘍へ、または腫瘍から脾臓へ比較して低下し(図4D)、TILがGlu異化作用を減少させることが確認された。
本発明者らはさらに、2週間または1ヶ月の腫瘍を有するマウスにおいて13C16−パルミチン酸塩トレースを行った。マウスに、13C18−パルミチン酸塩−BSAを、os/i.v.で投与した。供給後60分及び注射後30分で、TILSを単離し、CD8+CD44+細胞を単離し、代謝産物を分析した。アシルカルニチン種、ケトン体3−ヒドロキシブチラート及びアセトアセテートの強度は、腫瘍進行中のTILにおいて増大する(図4E)。さらに、TCA代謝物に対する13C16−パルミチン酸塩−由来13Cの寄与は、2週間の腫瘍または1か月の脾臓由来の細胞と比較して1か月の腫瘍由来のCD44+CD8+T細胞において高くなり(図4F)、これによって腫瘍の進行中のTILのFA異化作用への依存の増強が支持される。ワクチン接種後の種々の時点で試験し
た脾臓CD44+CD8+T細胞において、TCA回路代謝産物への13C16−パルミチン酸塩由来炭素取り込みは、安定したままであるか、または経時的に減少する。CD62L及びCD127の発現は、CD44+CD8+TILの2週間腫瘍のものと比較して、CD44+CD8+TIL上で顕著に低く(データ示さず)、これによって、後期段階のCD8+TILによるFA異化作用の増強は、記憶へ向かうそれらの分化を反映しないことが確認される。
た脾臓CD44+CD8+T細胞において、TCA回路代謝産物への13C16−パルミチン酸塩由来炭素取り込みは、安定したままであるか、または経時的に減少する。CD62L及びCD127の発現は、CD44+CD8+TILの2週間腫瘍のものと比較して、CD44+CD8+TIL上で顕著に低く(データ示さず)、これによって、後期段階のCD8+TILによるFA異化作用の増強は、記憶へ向かうそれらの分化を反映しないことが確認される。
FA異化作用に対するTILの代謝切り替えは、後期腫瘍由来のワクチン誘導CD8+T細胞における、黒色腫間質液内の種々の遊離のFA種の豊富さ(図4G)、FAの取り込み増強(図4H)及びFA酸化(FAO)律速酵素Cpt1aの発現増大(図4I)により促進される。
後期腫瘍由来のTrp−1及びE7特異的TILは、早期腫瘍由来のTILまたは脾臓由来の対応するT細胞と比較して、FA取り込み(図4H)及び脂肪酸異化作用律速酵素Cpt1aの発現(図4I)を増大させ、このことは、それらの増大がFA異化作用に依存していることを示唆している。FA取り込み及びCpt1aレベルは両方とも低いままで、2週間または1ヶ月前にワクチン接種によって誘導されたCD8+T脾細胞で同等であり、これによって、TILで観察された代謝変化は、より休息性「記憶」段階への分化によるものではないことが示唆される。FA代謝物の比較は、早期段階の腫瘍と比較して、CD44+CD8+TILにおけるアシルカルニチン種及びケトン体アセトアセテートのレベルが高いことを示す(図4E)。13C16−パルミチン酸塩からTCA代謝産物への13Cの寄与は、腫瘍進行中のCD44+CD8+TILの増大をもたらし(図4G)、脂肪酸異化に対するそれらの増強された依存性をさらに支持する。ワクチン接種後の異なる時点で試験した脾臓CD44+CD8+T細胞では、13C16−パルミチン酸塩誘導のクエン酸塩またはリンゴ酸塩への13C組み込みは安定したままであるか、または経時的に低下する(図4F)。
このデータは、後期腫瘍におけるワクチン誘導性CD8+TILが、同時阻害剤PD−1及びLAG−3の発現を増強し、エフェクター機能及び多機能性を失い、代謝ストレスの増強を経験し、グルコース代謝を減少させ、FA異化作用にますます依拠することを示す。
全体として、これらのデータは、Gluを剥奪されたCD44+CD8+T細胞が、FA異化作用に益々依拠して、OXPHOSを通じてエネルギーを産生することを強く示している。驚くべきことに、これはさらに低酸素時に増大するが、OXPHOSはO2を必要とする。
実施例5:FA異化作用に対する依拠の向上は、PD−1発現を増大させ、そして、代謝的にストレス状態の下でCD8+T細胞の機能を維持するために必須である
FA異化作用がCD8+T細胞分化に及ぼす影響をさらに評価するために、本発明者らは、FA異化作用を増強するPPARαのアゴニストであるフェノフィブラート(FF)またはミトコンドリアの脂肪酸異化作用を低下させる、Cpt1の不可逆阻害剤であるエトモキシール(Eto)の存在下で、CD8+T細胞を刺激した(図6A)。希釈処理した細胞と比較して、GluまたはGal培地中で刺激したインビトロFF処理細胞は、FA異化作用(データは示さず)及びFA取り込み増大に関与する因子の転写産物の増強によって示されるように、脂肪酸異化を増大させる(図12A)。GluまたはGal培地のいずれかで刺激されたCD8+T細胞は、Etoの存在下でOCRを減少させ(図12B)、脂肪酸異化作用に対する薬物の阻害効果が確認された。OCRは、GalとEtoと培養された細胞でより多く減少し、細胞が低酸素状態に曝されるとさらに減少し、GluとO2が制限されているときに脂肪酸異化作用に対する細胞の依存が増大することが再
度確認された。低酸素状態の下では、PD−1は、FFの添加と共に増大するが、Etoの存在下で減少する(図12C)。FFは増大するが、Etoは、Glu及びO2への限定されたアクセスで培養されたCD8+T細胞の機能及び多機能性を減少させる。これらの結果、FA異化作用が、代謝的にストレスを受けたCD8+T細胞のPD−1発現及びエフェクター機能を促進することが示される。
FA異化作用がCD8+T細胞分化に及ぼす影響をさらに評価するために、本発明者らは、FA異化作用を増強するPPARαのアゴニストであるフェノフィブラート(FF)またはミトコンドリアの脂肪酸異化作用を低下させる、Cpt1の不可逆阻害剤であるエトモキシール(Eto)の存在下で、CD8+T細胞を刺激した(図6A)。希釈処理した細胞と比較して、GluまたはGal培地中で刺激したインビトロFF処理細胞は、FA異化作用(データは示さず)及びFA取り込み増大に関与する因子の転写産物の増強によって示されるように、脂肪酸異化を増大させる(図12A)。GluまたはGal培地のいずれかで刺激されたCD8+T細胞は、Etoの存在下でOCRを減少させ(図12B)、脂肪酸異化作用に対する薬物の阻害効果が確認された。OCRは、GalとEtoと培養された細胞でより多く減少し、細胞が低酸素状態に曝されるとさらに減少し、GluとO2が制限されているときに脂肪酸異化作用に対する細胞の依存が増大することが再
度確認された。低酸素状態の下では、PD−1は、FFの添加と共に増大するが、Etoの存在下で減少する(図12C)。FFは増大するが、Etoは、Glu及びO2への限定されたアクセスで培養されたCD8+T細胞の機能及び多機能性を減少させる。これらの結果、FA異化作用が、代謝的にストレスを受けたCD8+T細胞のPD−1発現及びエフェクター機能を促進することが示される。
図4Bに示すように、代謝ストレスを経験するT細胞は、TG代謝回転に関与する酵素の転写産物を増大させる。このような条件下でCD8+T細胞がTGを動員して脂肪酸異化作用及びOXPHOSに燃料供給するか否かを評価するために、脂肪分解酵素lipaの阻害剤Orridat(OS)またはTG合成酵素Dgat1及びDgat2の阻害剤であるAmidepsine A(AmA)を、異なる条件で刺激したCD8+T細胞に添加した(図6A)。基礎のOCRは、短期低酸素下でGluまたはGal培地中のいずれかの薬剤で培養されたCD8+T細胞で減少し(データは示さず)、このことは、TG代謝回転がOXPHOSのための燃料供給することを示唆している。低酸素状態下では、PD−1は、他の培養条件及びGal培地へのAmAの添加にかかわらず、OSの添加とともに減少する(図12C)。AmA及びそれより低い程度でOSは、Gal培地で培養し、低酸素状態に曝したT細胞の機能を低下させる。これらのデータは、低酸素下で活性化されたT細胞が、AmAまたはOSの存在下でOCRが減少するにつれて、OXPHOSのTG代謝回転からの基質を使用することを示す。しかし、TGは、CD8+T細胞が同時に低血糖にかからない限り、エフェクター機能にとって必須ではない。
FA異化作用の増大がCD8+TIL機能にどのように影響するかを評価するために、本発明者らは、CD90.2を発現し、かつ及びCD45についてコンジェニックなマウスをワクチン接種し、FF(CD45.1マウス)または希釈剤(CD45.2マウス)で毎日3週間処置した。Trp−1特異的CD8+T細胞が等しい数で存在するように、これらの群からの脾細胞を混合した。この混合物を、腫瘍細胞をチャレンジし、3日後にワクチン接種したCD90.1+レシピエントマウスに移した。ワクチン接種の2日後に細胞を移入した(図5B)。移入の直前に、ドナーマウス由来のFF及び希釈剤で処理したTrp−1及びE7特異的CD8+T細胞は、CD127の同等の表面発現と同様の機能を有し、このことは、FFが、T細胞活性化または記憶形成に影響しないことを示している。移入の前にFF処理したCD8+T細胞は、EtoによってブロックされたOCRを増強し、このことは、FFが、ワクチンによって誘発されたCD8+T細胞を、脂肪酸異化作用を増強するように条件づけることを示す。ドナー由来のワクチン誘導CD8+TILを、移入3週間後に分析した(データ示さず)。対照処置ドナーTILと比較して、FF処置ドナー由来CD44+CD8+TILは、脂質代謝に関与する因子の転写物のレベル向上及びTrp−1特異的細胞にとって有意になるPD−1発現の増大を示す。さらに、FF処置ドナーに由来するTrp−1及びE7特異的CD8+TILの頻度及び機能は、対照ドナーの頻度及び機能を上回る。FFまたは希釈剤処置マウスの脾細胞を、腫瘍保有マウスの別個のコホートに移入すると、前者は腫瘍増殖を有意に遅延させる(図6G)。まとめると、これらのデータによって、増強されたFA異化作用が、その機能を維持しながら、TA特異的TILに対するPD−1発現を増大させることが確認される。
FA異化作用が代謝的にストレスを受けたCD8+T細胞の機能を維持するか否かをさらに研究するために、PPARαKOマウスのCD8+T細胞をインビトロで刺激し、野生型(wt)マウスのものと比較した。TCA回路及び脂質代謝に関与するほとんどの因子の転写産物は、Glu培地及び低酸素下で刺激した場合のwt CD8+T細胞と比較して、PPARαKOにおいてより高い。このプロファイルは、Gal培地及び低O2で培養した細胞では逆転し、このことは、PPARαの不活性化がGluなしで培養したCD8+T細胞のFA異化作用を有意に減少させることを示唆している(データ示さず)。wt CD8+T細胞と比較したPPARαKOは、O2レベルにかかわらずGal培地
で培養した場合、低レベルのPD−1を発現する(図13A)。それらの機能は、同じ条件下で培養されたwt CD8+T細胞の機能と比較して低く(図13B)、FA異化作用は、Gluへのアクセスが制限されているCD8+Tのエフェクター機能を維持するのに必要であることを支持している。
で培養した場合、低レベルのPD−1を発現する(図13A)。それらの機能は、同じ条件下で培養されたwt CD8+T細胞の機能と比較して低く(図13B)、FA異化作用は、Gluへのアクセスが制限されているCD8+Tのエフェクター機能を維持するのに必要であることを支持している。
ワクチン誘導TILに対するFA異化作用の効果をさらに調査するために、本発明者らは、PPARαKO及びwt CD45コンジェニックマウス由来の脾細胞をワクチン接種の3週間後に、腫瘍保有マウス及びワクチン接種したレシピエントマウスに同時移入する養子移入システムを使用した(図7A)。移入直前の3、2及び1因子を産生する細胞の%としてのwt及びPPAR−αKOマウスの脾臓由来のTrp−1及びE7特異的CD8+T細胞の機能を決定した(データ示さず)。移入前に、Trp−1特異的CD8+T細胞の機能及び多機能性は2つの群間で類似しているが、ただしPPARαKOマウスでは、E7特異的CD8+T細胞は、量が少なく多機能性である。CD8+TILSのFA異化作用は、PPAR−αノックアウトによって減少する。これは、E7エピトープについてさらに低いTcRシグナル伝達の強さが、活性化の後どの時点でどの程度まで細胞が脂肪酸異化作用に依存するかに影響を及ぼすかを反映し得る。CD127の発現は、2つのT細胞サブセット間で同等であり、これによって記憶形成に大きな差異がないことが示される(ヒストグラムは示さず)。移入3週後PPAR−αKO及びwtドナーマウス由来のCD44+CD8+TIL(3〜4試料/群)のTCA回路及び脂質代謝酵素の異化酵素の転写産物を比較するヒートマップを再検討し(データ示さず)、移入3週間後にレシピエントマウスから採取したwtドナーと比較して、PPARαKO由来のCD44+CD8+TILは、低酸素状態下でGal培地中でインビトロで培養したCD8+T細胞と類似の転写プロファイルを示す。これは、PPARαKO由来CD8+TILによるFA異化作用の減少を示す。それらは、多機能性を含む頻度及び機能の低下に付随するPD−1発現のレベルの低下を示す(図7B、7C)。集合的に、これらのデータによって、FA異化作用がPD−1発現を促進するが、代謝ストレスに際してCD8+T細胞エフェクター機能を維持することが確認される。
実施例6:抗PD−1による処置は、CD8+TILSの代謝または機能を変化させずに腫瘍進行を遅らせる。
臨床試験において、PD−1に対するモノクローナル抗体(mAb)のようなチェックポイント阻害剤は、腫瘍の進行を遅延し得る(Larkin et al.,2015)。モデルのとおり、CD8+TILが、PD−1発現を経時的に増大するので、抗PD−1mAbでの処置が代謝または機能に影響を及ぼすか否かを試験した。
臨床試験において、PD−1に対するモノクローナル抗体(mAb)のようなチェックポイント阻害剤は、腫瘍の進行を遅延し得る(Larkin et al.,2015)。モデルのとおり、CD8+TILが、PD−1発現を経時的に増大するので、抗PD−1mAbでの処置が代謝または機能に影響を及ぼすか否かを試験した。
マウスに腫瘍細胞をチャレンジし、3日後にワクチン接種し、ワクチン接種の10日後に抗PD−1 mAbまたはアイソタイプ対照で処置を開始した。1ヶ月の腫瘍内で、抗PD−1処置は、分化状態に影響を及ぼさずに(図5B)、PD−1の染色を減少させ、ワクチン誘導CD8+TILの中/上中のpAKtのレベルを増強する(図5A)(Patsoukis et al.,2013)。PD−1遮断は、CD44+CD8+TIL(図5C、5D及び5E)のFAまたはGlu異化作用に劇的に影響を及ぼさず、ワクチン誘導CD8+TILのエフェクター機能も改善しない(図5F)。
ワクチン接種したC57Bl/6マウス、対、ワクチン接種していないC57Bl/6マウス、ならびにT、B及びナチュラルキラー細胞を欠くマウスである、免疫不全NSGマウスの腫瘍増殖のグラフ(図示せず)によって、PD−1遮断がCD8+TILの機能に影響しないが、腫瘍進行を遅らせ、ただしT細胞とは独立していることが示される。これは、ワクチン接種されたマウス、及びワクチン接種されていないかまたはNSGマウスでさえも腫瘍進行を効果的に遅延させ、このことは、PD−1チェックポイント遮断が、T細胞非依存的に腫瘍進行を遅延させることを示唆する。
最近の研究は、抗PD−1処置が、PD−1+黒色腫細胞におけるmTORシグナル伝達を減少させることによって腫瘍進行を低減させることを示している(Kleffel et al.,2015)。mTORシグナル伝達が、T細胞のGlu代謝を増大させるので(Palmer et al.,2015)、抗PD−1 mAbが腫瘍細胞のGlu代謝を低下させ、それによりそれらの増殖を遅延させるか否かを試験した。3つのモデルすべてにおいて、抗PD−1処置は、腫瘍の間質液中のGlu含量を増大させる(図11A)。抗PD−1処置の際のNSGマウスのB16BrafV600E腫瘍由来の細胞は、TCA回路またはプリン合成経路の代謝産物へのGlu由来炭素の取り込みを増大させ、このことは、PD−1遮断が、代謝反応及び同化反応の両方に対して実際にGluの使用を増大させることを示している(図11B、11C)。
抗PD−1は、おそらくは逆方向シグナル伝達の遮断のために、CD8+T細胞の非存在下での腫瘍進行の遅延を引き起こす。腫瘍細胞上のPD−1のPDL1への連結は、アポトーシスまたはT細胞媒介性細胞溶解に対するそれらの耐性を増大させる。(図11D)。
まとめると、PD−1遮断は、おそらくT細胞機能を救済することによってがん患者に臨床上の利益をもたらす。本発明者らのモデルでは、PD−1を低下させる状態、例えば低酸素状態は、T細胞機能を低下させる;しかし、フェノフィブレートは、PD−1発現を増大させるが、T細胞機能の改善をもたらす。PD−1は、解糖に対するT細胞の依存を減少させ、それによってその機能を維持することで、グルコース不足環境において有用であり得る。モデルでは、PD−1シグナル伝達は、CD8+TILの代謝にも機能にも大きな影響を及ぼさない。抗PD−1処置は、T細胞非依存的な様式で腫瘍の進行を減少し得る。
代謝再プログラミングをPD−1遮断と組み合わせることは、有用な処置法の一実施形態である。
実施例7:FA異化作用に対する依拠の増強は、CD8+T細胞の機能維持に必須である
FA異化作用がCD8+T細胞機能に及ぼす影響をさらに評価するために、FA異化作用を増大するPPARαのアゴニストであるフェノフィブラート(FF)またはミトコンドリアのFAOを減少させる、Cpt1の不可逆阻害剤であるエトモキシール(Eto)の存在下でCD8+T細胞を刺激した。希釈処理した細胞と比較してGluまたはGal培地で刺激したインビトロFF処理細胞は、FA異化作用に関与する因子の転写産物の増強により示されるようにFA異化作用を増大させる(PPAR−α、Ehhadh、Acox1−Glu、Cpt1a及びBdh1について強力に増大し、Gluについても増大した;Ehhadh及びCpt1aは強力に増大した−Gal及びPPAR−αについては増大し、Acox1及びBdh−1についても増大した;データは示さず)、そしてFA取り込みを増大した(図12A)。Etoは、GluまたはGal培地のいずれかで刺激されたCD8+T細胞によってOCRを減少させる(図12B)。OCRは、GalとEtoと培養された細胞でより多く減少し、細胞が低酸素状態に曝されるときさらに減少し、ここでもGlu及びO2が制限されている場合に細胞のFAO依存性が高まることが確認される。低酸素状態下では、PD−1の発現はFFの添加により増大するが、Etoの存在下では減少する(図12C)。FFは増大し、一方、Etoは、Glu及びO2へのアクセスの限定下で培養されたCD8+T細胞の機能及び多機能性を減少させる(図12D)。これらの結果、増強されたFA異化作用が、代謝的にストレスを受けたCD8+T細胞のエフェクター機能を促進するが、PD−1発現を増大させることが示される。
FA異化作用がCD8+T細胞機能に及ぼす影響をさらに評価するために、FA異化作用を増大するPPARαのアゴニストであるフェノフィブラート(FF)またはミトコンドリアのFAOを減少させる、Cpt1の不可逆阻害剤であるエトモキシール(Eto)の存在下でCD8+T細胞を刺激した。希釈処理した細胞と比較してGluまたはGal培地で刺激したインビトロFF処理細胞は、FA異化作用に関与する因子の転写産物の増強により示されるようにFA異化作用を増大させる(PPAR−α、Ehhadh、Acox1−Glu、Cpt1a及びBdh1について強力に増大し、Gluについても増大した;Ehhadh及びCpt1aは強力に増大した−Gal及びPPAR−αについては増大し、Acox1及びBdh−1についても増大した;データは示さず)、そしてFA取り込みを増大した(図12A)。Etoは、GluまたはGal培地のいずれかで刺激されたCD8+T細胞によってOCRを減少させる(図12B)。OCRは、GalとEtoと培養された細胞でより多く減少し、細胞が低酸素状態に曝されるときさらに減少し、ここでもGlu及びO2が制限されている場合に細胞のFAO依存性が高まることが確認される。低酸素状態下では、PD−1の発現はFFの添加により増大するが、Etoの存在下では減少する(図12C)。FFは増大し、一方、Etoは、Glu及びO2へのアクセスの限定下で培養されたCD8+T細胞の機能及び多機能性を減少させる(図12D)。これらの結果、増強されたFA異化作用が、代謝的にストレスを受けたCD8+T細胞のエフェクター機能を促進するが、PD−1発現を増大させることが示される。
FA異化作用の増大がCD8+TIL機能にどのように影響するかを評価するために、CD45+にコンジェニックなCD90.2+マウスをワクチン接種し、FF(CD45.1マウス)または希釈剤(CD45.2マウス)で毎日3週間処置した。これらのマウス由来の脾細胞を、2人のドナー由来の1:1比のTrp−1特異的CD8+T細胞と混合し、腫瘍細胞をチャレンジし、3日後にワクチン接種したCD90.1+レシピエントマウスに移入した。ワクチン接種の2日後に細胞を移入した(図6A)。移入の直前に、ドナーマウス由来のFF及び希釈処理されたTrp−1及びE7特異的CD8+T細胞は、CD62L、CD127、KLRG1及びFoxO1の同等の発現を示し、このことは、FFが記憶形成に影響しないことを示した(図6B)。FF処理細胞は、PD−1及びT−betの発現の増大を示し、より高い活性化状態を示唆する。FF処置は、ワクチン誘導性CD8+T細胞の頻度または機能を有意に増強しない(図6C)。移入前にFF処理された脾臓細胞は、OCRが増強され、これはEtoによってブロックされており、これによって、FFは、ワクチン誘導性のCD8+T細胞がFAOを増強するように条件づけることが示されている(図6D)。
ドナー由来のワクチン誘導CD8+TILを、移入3週間後に分析した(データ示さず)。ドナー由来の希釈剤処理TILと比較して、FF処理ドナー由来のCD44+CD8+TILは、FA異化作用に関与する因子に対する転写産物のレベルの上昇を示す(データ示さず)。Trp−1及びE7特異的なFFドナー由来のCD8+TILは両方とも、PD−1発現の増大傾向を示す(図6E)。FF処理したワクチン誘導CD8+TILのドナー起源の頻度及び機能は、対照のものに比べて有意に高い(図6F)。FF−または希釈剤処理したマウス由来の脾細胞を腫瘍保有マウスの別々のコホートに移すと、FFは腫瘍増殖を有意に遅延させる(図6G)。集合的にこれらのデータによって、増強されたFA異化作用がCD8+TILの抗腫瘍機能を改善することが確認される。
FF誘導性PD−1増大がFF処理CD8+TIL機能に影響するか否かを試験するために、ワクチン接種したドナーマウスにFFまたは希釈剤を3週間毎日与え、その後、別々の腫瘍保有マウスへの移入の際に、レシピエントを抗PD−1またはアイソタイプ対照抗体で処置した(図6H)。ドナーのFF処置及びレシピエントの抗PD−1処置の両方とも、腫瘍進行を強力に遅延させる(図6I)。さらに、それらは相乗的に作用し、ワクチン接種したマウスの30%超で腫瘍の成長を一緒になって完全に防止する(図6I及び図示せず)。抗PD−1処置は、ドナー細胞上のPD−1染色を減少させ、これはFFによって影響されない(図6J)。これは、いずれかのセットのドナーマウスから誘導されたMAA特異的CD8+TILの頻度及び機能に微妙な影響しか及ぼさない(データ示さず)。PD−1遮断は、FF処置ドナー由来の単機能性E7特異的CD8+TILの頻度を有意に増大させる。この効果は、MAA特異的CD8+TILのものよりもバイスタンダーT細胞機能をより容易に救済し得る、α−PD−1処置マウスのより小さな腫瘍サイズを部分的に反映し得る。
FA異化作用がCD8+TILの機能にどのように影響するかをさらに研究するために、PPARαKOマウスのCD8+T細胞をインビトロで刺激し、それらを野生型(wt)マウス由来の細胞と比較した。Glu培地中でかつ低酸素状態下で刺激した場合、TCA回路及び脂質代謝に関与するほとんどの因子の転写物(例えば、IDH3a、MDH2、slc27a2、slc27a4、LIPA、Acaa1a、Acox1、Cpt1a及びAcadv1)は、wt CD8+に比較して、PPARαKOが高い;このプロファイルは、Gal培地中及び低O2で培養された細胞において逆転し、これによってPPARα不活性化がGluなしで培養されたCD8+T細胞によるFA異化作用を有意に減少させることが示唆される(データは示さず)。wt CD8+T細胞と比較したPPARαKOは、O2レベルにかかわらずGal培地で培養した場合、より低いレベルのPD−1を発現する(図13A)。それらの機能及び多機能性は、Gal培地中で培養された
wt CD8+T細胞のものと比較して有意に低く(図13B)、このことは、FA異化作用が、Gluへのアクセス限定下で活性化されるCD8+T細胞のエフェクター機能を維持することが必要であることを示唆している。
wt CD8+T細胞のものと比較して有意に低く(図13B)、このことは、FA異化作用が、Gluへのアクセス限定下で活性化されるCD8+T細胞のエフェクター機能を維持することが必要であることを示唆している。
本発明者らは、PPARαKO及びwtマウス由来の脾細胞をワクチン接種の3週間後に収集し、2つのドナー由来のTrp−1特異的CD8+細胞の1:1比で混合し、腫瘍を保有しワクチン接種したレシピエントマウスに同時移入した養子移入システムにおいて、ワクチン誘導性TIL機能に対するPPARα不活性化の効果を調査した(図7A)。移入する前に、MAA特異的CD8+T細胞の機能及び多機能性は、2つの群間で類似していたが、PPARαKOマウスではE7特異的CD8+T細胞があまり豊富でなく多機能性であった(データは示さず)。この相違は、E7エピトープに対してより低いT細胞受容体(TCR)シグナル伝達の強度が、活性化後どの時点で細胞がFA異化作用に切り替わるかに影響を及ぼすかを反映し得る。CD127の発現は、2つのT細胞サブセット間で匹敵するものであり、記憶形成に大きな差異がないことを示している(図7C)。PPARαKO由来のCD44+CD8+TILは、移入3週後にレシピエントマウスから収集したwtドナーと比較して、低酸素状態下でGal培地中でインビトロで培養されたPPARαKO CD8+T細胞と同様の転写プロファイルを示し、このことは、PPARαKO CD8+TILによるFA異化作用の減少を示している(図は示さず;ただしIDH3a、MDH2、slc27a2、slc27a4、LIPA、Acaa1a、Acox1、Cpt1a、Acadv1の発現は、PPAR−αKOマウス由来のT細胞においては、野生型と比較して減少した)。Trp−1及びE7特異的PPARαKO CD8+TILの両方とも、ドナー由来のwt CD8+TILのものと比較して、頻度及び多機能性を含む機能の低下と同時に、PD−1発現のレベルの低下を示す(図7B及び図7C)。まとめると、これらのデータによって、FA異化作用が、PD−1発現レベルにかかわらず代謝的にチャレンジングな条件下でCD8+T細胞エフェクター機能を維持することが確認される。
実施例8:がんの治療における前処理したT細胞の有用性
本発明者らは、OT−1細胞のインビトロ刺激中のフェノフィブラート処理が、T細胞代謝の代謝切り替えを引き起こすことを示した(図15A〜17E)。OT−1マウス由来のCD8+T細胞は、OVA由来ペプチドSIINFEKL配列番号1を認識するTCRを有する。例えば、Clarke、SR et al.,2000 Characterization of the ovalbumin−specific TCR transgenic line OT−I:MHC elements for positive and negative selection.,Immunol.Cell Biol,78(2):110−117を参照のこと。したがって、OT−1細胞は、腫瘍特異抗原ではなく、任意の抗原、この場合はOVA由来ペプチドで刺激することができるT細胞の良好なモデルである。
本発明者らは、OT−1細胞のインビトロ刺激中のフェノフィブラート処理が、T細胞代謝の代謝切り替えを引き起こすことを示した(図15A〜17E)。OT−1マウス由来のCD8+T細胞は、OVA由来ペプチドSIINFEKL配列番号1を認識するTCRを有する。例えば、Clarke、SR et al.,2000 Characterization of the ovalbumin−specific TCR transgenic line OT−I:MHC elements for positive and negative selection.,Immunol.Cell Biol,78(2):110−117を参照のこと。したがって、OT−1細胞は、腫瘍特異抗原ではなく、任意の抗原、この場合はOVA由来ペプチドで刺激することができるT細胞の良好なモデルである。
インビボでの腫瘍増殖に対する、エネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬、すなわち、フェノフィブラートを用いてインビトロで前処理されたT細胞またはT細胞集団の効果を評価するために、以下の実験を実施した。
マウスに、卵白アルブミンSIINFEKL(配列番号1)の免疫優性エピトープを発現するように形質導入された105B16.F10黒色腫細胞を注射した。5日後、マウスには、いかのいずれか、
(a)SIINFEKL(ナイーブOT−1移入)のトランスジェニックT細胞受容体を発現する未処理のOT−1 CD8+T細胞(i.v.)、
(b)SIINFEKLペプチドでインビトロで刺激/活性化され、希釈剤(Ctrl
処理OT−1)で前処理されたOT−1細胞、または
(c)SIINFEKLペプチドでインビトロで刺激/活性化され、25μMのフェノフィブレート(FF)で前処理されたOT−1細胞を与えた。
(a)SIINFEKL(ナイーブOT−1移入)のトランスジェニックT細胞受容体を発現する未処理のOT−1 CD8+T細胞(i.v.)、
(b)SIINFEKLペプチドでインビトロで刺激/活性化され、希釈剤(Ctrl
処理OT−1)で前処理されたOT−1細胞、または
(c)SIINFEKLペプチドでインビトロで刺激/活性化され、25μMのフェノフィブレート(FF)で前処理されたOT−1細胞を与えた。
マウスモデルにおける腫瘍増殖を最大24日間モニターした。その結果を図16のグラフに示しており、ここでは、FF−前処理された活性化T細胞で処置したマウスにおける腫瘍の増殖が、ナイーブな非活性化OT−1細胞または活性化された対照処置T細胞における応答と比較して阻害されたことが示される。
したがって、CAR−T細胞などのような前処理された活性化T細胞集団は、その代謝機能を切り替えることが可能で、腫瘍を有する対象に投与すると、腫瘍増殖を抑制するように働く。そのような効果は、前処置したT細胞のみを、すなわち腫瘍抗原特異的ワクチンのような他の抗癌免疫療法剤なしで投与することによって達成され得る。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、代謝機能を切り替えるために前処置されたT細胞、例えばCAR−T細胞を用いた養子T細胞移入治療処置において有用であり、がん患者の処置の強化をもたらす。
要約すると、本明細書中に提示されるデータは、代謝がT細胞分化及びエフェクター機能に深く影響を及ぼすことを実証する。TME CD8+T細胞内では、低酸素状態を経験し、腫瘍細胞が解糖を促進するために消費する栄養素、特にGluと競合しなければならない。細胞は、FAのような代替栄養素を用いて、解糖からOXPHOSに切り替えることによってGluの欠如を補い得る。最近の研究では、TME内の低血糖がCD8+T細胞機能を損ない、能動免疫療法の有効性を低下させることが報告されている(Chang et al.,2015;Ho et al.,2015)。ここで示される結果により、TME内の代謝チャレンジが、バイスタンダーTILを含むCD8+TILの性能を損なうが、TA特異的CD8+TILはより影響を受ける傾向があることが示される。これは、TA特異的CD8+TILが、それらの増殖によって証明されるように、TME内で刺激シグナルを受け取り続けることを反映する。さらに、栄養素やO2が特に制限されている腫瘍に深く浸透する可能性がある。
固形腫瘍は、TMEの細胞内のHIF−1α経路を活性化する低酸素領域に発症する。HIF−1α発現はまた、T細胞活性化の際に上昇する20。この研究では、HIF−1αはMAA特異的及びバイスタンダーCD8+TILの両方で増大し、低酸素状態を根本原因として指摘している。CD8+T細胞に対する低酸素状態の効果は、議論の余地がある。いくつかの研究では、O2がT細胞エフェクター機能に必要であることが示されている28、30。休止期にCD8+T細胞を低酸素状態に曝したプロトコールを使用している他の研究者らは、低酸素状態が機能を増大させると報告している10、11。このデータは、前者と一致している。なぜなら、前者では、減少したHIF−1αシグナル伝達がCD8+TILの頻度及び機能を改善することを示しており、これによって、Gluが限定的である場合、解糖を促進し、HIF−1αにより、OXPHOSを阻害することが、CD8+TILに有害となることが示されるからである。LAG−3(このデータによれば、HIF−1αによって調節される)は、T細胞の増殖及びエフェクター機能を阻害する(Grosso et al.,2007)。LAG−3遺伝子座は、低酸素状態下でのLAG−3発現に影響を及ぼす可能性のあるいくつかのHIF−1α応答エレメント([A/G]CGTA、(Pescador et al.,2005)を有する。低酸素状態がインビトロで活性化CD8+T細胞のエフェクター機能を弱め、CD8+TILの減少したHIF−1αシグナル伝達は、それらの頻度及び機能を改善することを示す。後者は、GluがTME内に限定される場合、HIF−1αによる解糖の促進及びOXPHOSの阻害が有害になることを反映する可能性が高い。LAG−3(データによればHIF−1αによって調節される)は、T細胞増殖及びエフェクター機能を阻害する12。L
AG−3遺伝子座の配列の分析によって、LAG−3発現に影響し得る、いくつかのHIF−1α応答エレメント([A/G]CGTA)が明らかになる27。
AG−3遺伝子座の配列の分析によって、LAG−3発現に影響し得る、いくつかのHIF−1α応答エレメント([A/G]CGTA)が明らかになる27。
低酸素状態と低血糖は、反対の代謝シグナルを送る。低酸素状態は解糖を促進し、一方で、低血糖は細胞にOXPHOSを使用させ、OXPHOSは様々な栄養素によって供給されるがO2を必要とする。がん細胞は、新生の脂肪生合成を増大させ21、脂肪前駆細胞を補充する39。したがって、このモデルでは、遊離FA種の量は、腫瘍進行中に増大する。このデータは、CD8+TILが、FA取り込み及びFA異化作用を増強して、OXPHOSを通じてエネルギーを獲得することによってGlu及びO2の欠如に対処することを示す。しかし、この代謝切り替えを用いても、CD8+TILは機能低下を示し、これは、FFによる脂質代謝をさらに促進することによって改善され得る。
PD−1の高発現は、CD8+T細胞枯渇及びエフェクター機能の喪失をシグナル伝達すると考えられる。この結果によって、高PD−1発現が、障害されたT細胞機能と必ずしも関連しているとは限らないことが示唆される。活性化されたCD8+T細胞が低酸素状態に曝露されると、その減少したPD−1発現は機能障害を伴う。対照的に、FF処理CD8+T細胞は、PD−1発現の増大傾向を示すが、その機能はPD−1シグナル伝達を改善し、PI3K/Akt/mTOR経路のTCR及びCD28媒介活性化を阻害し、これが次に解糖を低下し(Parry et al.,2005)、脂肪分解及びFAOを促進する(Patsoukis et al.,2015)。本発明者らは、CD8+TILにおける増強されたPD−1シグナル伝達は、Gluの乏しいTME内で代謝切り替えを促進することによって有益であると推測している。このモデルでは、T細胞活性化の初期段階後のPD−1の遮断は、腫瘍内の全体的なGlu濃度は増大するが、TILの機能にも代謝にも影響を及ぼさない。これらの結果は、最初の活性化の間に抗PD−1で処置されたCD8+TILによる解糖及びIFN−γ産生の改善を報告する、マウス肉腫モデルにおける最近の研究の結果とは異なる(Chang et al.,2015)。これらの明らかに反対の結果は、ワクチン接種または腫瘍由来抗原による刺激によって誘導された腫瘍モデルまたはT細胞における本質的な差異を反映する。あるいは、処置のタイミングの違いが結果に影響を与える可能性がある。T細胞活性化の初期段階中のPD−1遮断は、それらがTME内のGluに対してよりよく競合することを可能にし得る;一旦、TILがFA異化作用に切り替わると、それらは、PD−1シグナル伝達にかかわらず、この経路に方向付けられたままとなる。
抗PD−1処置は、モデルにおける腫瘍の進行を遅らせる。いくつかのデータによって、抗PD−1がMAA特異的CD8+T細胞の腫瘍への浸潤を促進し得ることが示唆される(図示せず)。しかし、抗PD−1処置はまた、免疫不全マウスにおける腫瘍進行を遅延させるので、本発明者らは、抗PD−1処置が直接、TME内の腫瘍細胞、腫瘍間質細胞または免疫抑制細胞に作用すると仮定する。最近の研究では、抗PD−1が、mTORシグナル伝達を遮断することによりPD−1+腫瘍細胞の増殖を低減し得ることが示唆されている(Kleffel et al.,2015)。PD−1遮断のこの作用様式は、PD−1+腫瘍細胞にのみ影響する。インビボで増殖した腫瘍から単離された黒色腫細胞は、非常に低いレベルのPD−1を発現するので(データは示さず);それらがPD−1遮断によって直接的に影響されるとは考えにくい。免疫抑制性細胞は、高レベルのPD−1(示さず)を発現し、PD−1遮断は腫瘍形成を促進する能力を損なう可能性がある(Marvel and Gabrilovich、2015)。黒色腫細胞は、PD−L1(示さず)を発現し、このリガンドを通じたバックシグナル伝達は、FasまたはCD8+T細胞媒介性アポトーシスに対する腫瘍細胞の抵抗性を増大させる(Azuma et al.,2008)。したがって、抗PD−1処置は、アポトーシスに対する感受性を増強することによって腫瘍細胞死を促進し得るか、または免疫適格性マウスにおいて、腫瘍細胞の溶菌酵素感受性を増大させることによって間接的にTIL機能を改善し得る
。いずれの機構も腫瘍増殖を遅延させ、それによって、TME内のGluレベルを高める可能性がある。追加のGluは、腫瘍細胞の増殖を促進することができるが、これはそれらの死亡率の増大により相殺され得る。
。いずれの機構も腫瘍増殖を遅延させ、それによって、TME内のGluレベルを高める可能性がある。追加のGluは、腫瘍細胞の増殖を促進することができるが、これはそれらの死亡率の増大により相殺され得る。
解糖ではなくFAOによるエネルギー生産は、相当な犠牲を払って行われる;同等の量のATPを生成するためにはより多くのO2が必要であり、ROS産生が増大する。したがって、低酸素TME内でFAOを通じてエネルギーを生成することは、CD8+TILがその機能を維持する唯一の方法ではない可能性がある。ケトン体は、O2が少なくても済む高効率燃料であり(Veech、2004)、これまでの研究では、低酸素状態及び低血糖に曝された神経系細胞の好ましいエネルギー源として役立つことが示された(Takahashi et al.,2014)。
ケトン体は、他の細胞(Martinez−Outschoorn et al.,2012)によって合成及び分泌される場合もあるし、またはケトン体代謝の重要な酵素であるBdh1の転写産物レベルの増大によって示唆されるように、TILによって直接産生される場合もある。このデータによって、CD8+TILが、腫瘍進行の間、ケトン体アセトアセテート及び3−ヒドロキシブチラートの強度の顕著な増大を示すことが示される。さらに、O2レベルは腫瘍内で異なり、TILは、TME内でランダムに移動する(Mrass et al.,2006)。TILは、エフェクター機能を維持し、それらの生存を拡大するために、周囲のO2レベルに応じてFAO及びケトン体を交互に使用し得る。
この結果で示唆されるとおり、養子細胞移入の前にFA異化作用を通じてエネルギー産生を増大するCD8+T細胞の代謝再プログラミングは、一部のタイプのがん、特に黒色腫のような低Glu含量を特徴とするがんを有する患者の細胞療法の全体的な有効性を高める。同調して、他の研究では、エネルギー産物のためにFAO及びOXPHOSを好む記憶CD8+T細胞が、エフェクター細胞よりも腫瘍進行を遅くする点で優れていることが示される(Crompton et al.,2015;Sukumar et al.,2013)。対照的に、他の研究者らはTILの解糖系利用能を高めることで、それらの抗腫瘍効果が向上すると報告している(Chang et al.,2015)。いずれの代謝操作が、TIL媒介性の腫瘍の退縮を改善するために最も適切になるかは、その腫瘍の性質に依存する可能性が高い。十分なレベルのGluを含む腫瘍は、高解糖能を有するCD8+T細胞から恩恵を受ける可能性があるが、低血糖TMEを有する腫瘍は、FA異化作用を好むCD8+T細胞によって最もよく闘うことができる。
本明細書の結果により、TME内の代謝障害が、CD8+TILに重大な影響を及ぼしていることが示される。これは、ケトン体(部分的にCD8+TILの機能を維持し、それらの生存を改善し得る)の消費を含めて、FA異化作用を通じてCD8+TILがますますエネルギーを獲得するよう強制する。PD−1シグナル伝達遮断と組合せてCD8+TILがFAOを使用する傾向を促進することにより、処置の転帰はさらに改善する。これらの結果、現在の治療戦略に代謝操作を加えることにより、がん免疫療法の転帰が改善できるか否かを評価するためのさらなる検討が招かれる。
データによって、高PD−1発現が、障害されたT細胞機能に必然的に関連しているわけではないことが示唆されている。PD−1は、mTOR経路のT細胞受容体及びCD28媒介性の活性化を阻害し、それによって次には解糖が減少し24、脂肪分解及び脂肪酸異化作用が促進される25。PD−1は、CD8+T細胞をそれらの代謝に調節するように指向させる、環境的合図によって調節され得る。Gluが利用可能な低酸素状態下では、解糖は、PD−1発現の減少を必要とするO2非依存性エネルギーの容易な供給源を提供する。Glu及びO2が制限的である場合、CD8+T細胞は、PD−1発現を増大さ
せ、これがFA代謝を促進する。
せ、これがFA代謝を促進する。
結果によって支持されるとおり、養子細胞移入の前にFA異化作用を通じてエネルギー産生を増大させるCD8+T細胞の代謝再プログラミングは、一部のタイプのがん、特に黒色腫のような低Glu含量を特徴とするいくつかの種類のがんを有する患者の細胞療法の全体的な有効性を高める。同調して、他の研究では、エネルギー産生のために脂肪酸異化作用及びOXPHOSを好む記憶CD8+T細胞が、エフェクター細胞よりも腫瘍進行を遅くすることに優れていることが示されている31、8。対照的に、他の研究者らは、TILの解糖使用能力を増大することは抗腫瘍効果を改善すると報告してる6。いずれの代謝操作がTIL媒介性腫瘍退縮を改善するのために最も適しているかは、腫瘍の性質に依存する。十分なレベルのGluを有する腫瘍は、高解糖能を有するCD8+T細胞から恩恵を受ける場合があるが、低血糖TMEを有する腫瘍は、FA異化作用を好むCD8+T細胞によって最もよく闘うことができる。
したがって、本発明者らは、TME内の代謝ストレスがCD8+TILに大きな影響を有することを示した。これは、ケトン体(CD8+TILの機能を維持し、それらの生存を改善し得る)の消費を含めて、FA異化作用を通じてCD8+TILがますますエネルギーを獲得するよう強制する。したがって、腫瘍浸潤CD8+T細胞のFA代謝を増強することにより、黒色腫などのがんの能動免疫療法の有効性が増大する。免疫療法の転帰は、代謝操作によって改善され得る。
本発明者らは、抗PD−1mAbでの処置が、CD8+TILの代謝または機能を変化させることなく腫瘍の進行を遅らせることを確認した。抗PD−1による処置は、T、B及びナチュラルキラー細胞を欠く、ワクチン接種された、及びワクチン接種されていない、または免疫不全のNSGマウスでも腫瘍進行を効果的に遅延させ、これによって、PD−1チェックポイント遮断が、T細胞非依存性の方式で腫瘍進行を遅延することが示唆される。
抗PD−1処置は、優れた抗腫瘍効果を達成するために、TILの代謝再プログラミングと相乗的に作用する。ドナーのフェノフィブラート処置(FA異化作用を増大させるPPAR−アルファのFF−アゴニスト)及びレシピエントの抗PD−1処置は両方とも、腫瘍の進行を強力に遅延させ、一緒になって相乗的に作用して、ワクチン接種したマウスの30%を超える腫瘍増殖を完全に防止する(図6I〜図6J)。
FA異化作用は、複数の機構を通じてT細胞機能を改善する:エネルギー生産に寄与する。アミノ酸合成及びエフェクター分子の産生に寄与する。サイトゾル中のアセチル−CoAプールに寄与し、GAPDHをアセチル化し、IFN−γ翻訳を増強する。このデータにより、TME内の代謝的制約に最適に対処するために腫瘍関連特異的T細胞を条件付ける代謝操作が、がん治療の全体的な有効性を有意に改善し得ることが実証される。
表3
(配列リストフリーテキスト)
以下の情報が、数字の識別子<223>の下でフリーテキストを含む配列に対して、提供される。
それぞれが、2016年1月15日、2016年11月9日、及び2016年11月10日に出願された、優先権のある米国仮特許出願第62/279252号、第62/419775号及び第62/420271号を含む、各々のかつあらゆる特許、特許出願、ならびにその開示全体を通じて引用され、本明細書に列挙されたウェブサイトを含む、各々のかつあらゆる刊行物、ならびにこの出願に伴う配列表は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態及びバリエーションが当業者によって考案されることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態及び等価なバリエーションを包含する。
引用文献
1.Ahmadzadeh,M.,et al.(2009).Tumor antigen−specific CD8 T cells infiltrating the
tumor express high levels of PD−1 and are functionally impaired.Blood 114:1537−1544.
2.Bailey,K.M.,et al.(2012).Targeting the
metabolic microenvironment of tumors.Adv.Pharmacol.65,63−107.
3.Baitsch,L.(2011).Exhaustion of tumor−specific CD8+T cells in metastases from melanoma patients.J.Clin.Invest.121:2350−60.
4.Brahmer,J.R.,et al.(2012).Safety and Activity of Anti−PD−L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer.N.Engl.J.Med.366,2455−2465.
5.Bucks,C.M.,et al.(2009).Chronic antigen stimulation alone is sufficient to drive CD8+T cell exhaustion.J.Immunol.182,6697−6708.
6.Chang,C.H.,et al.(2015)Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is
a Driver of Cancer Progression.Cell.162,1229−41.
7.Chapman,P.B.,et al.(2015).Rapid eradication of a bulky melanoma with one dose of immunotherapy.N.Engl.J.Med.372,2073−2074.
8.Crompton,J.G.,et al.(2015).Akt inhibition enhances expansion of potent tumor−specific lymphocytes with memory cell characteristics.Cancer.Res.75,296−305.
9.Dalgleish,A.G.(2011).Therapeutic cancer vaccines:Why so few randomized phase III studies reflect the initial optimism of phase II studies.Vaccine.29:8501−8505.
10.Doedens,A.L.,et al.(2013).Hypoxia−inducible factors enhance the effector responses of CD8(+)T cells to persistent antigen.Nat Immunol.14,1173−82.
11.Finlay,D.,et al.(2012).PDK1 regulation of mTOR and hypoxia−inducible factor 1
integrate metabolism and migration of CD8+T cells.J.Exp.Med.209,2441−2453.
12.Grosso,J.F.,et al.(2007).LAG−3 regulates CD8+T cell accumulation and effector
function in murine self−and tuor−tolerance systems.J.Clin.Invest.117,3383−3392.13.Hamanaka,R.B.and Chandel,N.S.(2012).Targeting glucose metabolism for cancer therapy.J.Exp.Med.209,211−215.
14.Ho,P.C.,et al.(2015). Phosphoenolpyruvate is a metabolic checkpoint of anti−tumor T cell response.Cell.162;1217−28.
15.Lasaro,M.O.et al.(2008).Targeting of antigen to the herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses.Nat.Med.14,205−212.
16.Lochner,M.,et al(2015).Fatty acid metabolism in the regulation of T cell function.Trends Immunol.36:472−478.
17.Lu,W.,et al.(2010). Metabolomic analysis via reversed−phase ion−pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.Anal.Chem.82,3212−21.
18.Martinez−Outschoorn,U.E.,et al(2012).Ketone body utilization drives tumor growth and metastasis.Cell Cycle.11,3964−71.
19.Mazzone,M.(2014).Tumor stroma:a compl
exity dictated by the hypoxic tumor microenvironment.Oncogene 33,1743−1754.
20.McNamee,E.N.(2013).Hypoxia and hypoxia−inducible factors as regulators of T cell development,differentiation,and function.Immunol.Res.55,58−70.
21.Mendendez,J.A.and Lupu,R.(2007).Fatty
acid synthase and lipogenic phenotype in cancer pathogenesis.Nat.Rev.Cancer.7,763−777.
22.Mueller,S.N.and Ahmed,R.(2009). High antigen levels are the cause of T cell exhaustion during chronic viral infection.Proc.Natl.Acad.Sci.106,8623−8628.
23.Palmer,C.S.,et al.(2015).Glucose metabolism regulates T cell activation,differentiation,and functions.Frontiers Immunol.6,1−6.
24.Parry,R.V.,et al.(2005).CTLA−4 and PD−1 receptors inhibit T−cell activation by distinct mechanisms.Mol.Cell.Biol.25,9543−53.
25.Patsoukis,N.,et al.(2015).PD−1 alters
T−cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis
and fatty acid oxidation.Nat.Commun.6,6692.
26.Pearce,E.L.(2013).Fueling immunity:insights into metabolism and lymphocyte function.Science.342;1242454.
27.Pescador,N.,et al.(2005).Identification of a functional hypoxia−responsive element that regulates the expression of the egl nine homologue 3(egln3/phd3)gene.Biochem.J.390,189−197.
28.Schlie,K.,et al.(2011).When Cells Suffocate:Autophagy in Cancer and Immune Cells under Low Oxygen.Int J Cell Biol 2011,470597−13.
29.Sharma,P.and Allison,J.P.(2015).Immune checkpoint targeting in cancer therapy:toward combination strategies with curative potential.Cell.161,205−214.
30.Siska,P.J.and Rathmell,J.C.(2015)T cell metabolic fitness in antitumor immunity.Trends Immunol.36,257−64.
31.Sukumar,M.,et al.(2013).Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+T cell memory and antitumor function.J.Clin.Invest.123,4479−88.
32.Takahashi,S.,et al.(2014).Roles and regulation of ketogenesis in cultured astroglia and neurons under hypoxia and hypoglycemia.ASN.Neuro.6,5.
33.Veech,R.L.(2004). The therapeutic implications of ketone bodies:the effects of ketone bodies in pathological conditions:ketosis,ketogenic diet,redox states,insulin resistance,and mitochondrial metabolism.Prostaglandins.Leukot.Essent.Fatty.Acids.70,309−19
34.Wang,R.W.and Green,D.R.(2012).Metabolic checkpoints in activated T cells.Nat.Immunol.13,907−915.
35.Warburg,O.,On respiratory impairment in cancer cells.(1956).Science.124,269−70.
36.Wherry,E.J.T cell exhaustion.(2011).Nat.Immunol.12:492−499.
37.Wiig,H.,et al.(2003).Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method.Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol.284,H416−24.
38.Yang,J.C.(2013).The adoptive transfer
of cultured T cells for patients with metastatic melanoma.Clinics Dermatol.31,209−219.
39.Zhang,Y.,et al.(2012).Stromal progenitor cells from endogenous adipose tissue
contribute to pericytes and adipocytes that populate the tumor microenvironment.Cancer Res.72,5198−208.
40.Zhang,Y.and Ertl,H.C.(2014).The effect of adjuvanting cancer vaccines with herpes simples virus glycoprotein D on melanoma−driven CD8+T cell exhaustion.J.Immunol.193:1836−1846.
41.Kalos,M.et al(2011)T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish Memory in
Patients with Advanced Leukemia. Sci Transl Med.,3(95):73
42.Azuma,T.,et al.,2008.B7−H1 is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells.Blood 111,3635−3643
43.Kleffel,S.,et al.,2015.Melanoma Cell−Intrinsic PD−1 Receptor Functions Promote Tumor Growth.Cell 162,1242−1256.
44.Larkin,J.,et al.,2015.Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Unt
reated Melanoma.N Engl J Med 373,23−34.
45.Marvel,D.,Gabrilovich,D.I.,2015.Myeloid−derived suppressor cells in the tumor
microenvironment:expect the unexpected.J.Clin.Invest.125,3356−3364.
46.Mrass,P.,et al.,2006.Random migration
precedes stable target cell interactions of tumor−infiltrating T cells.Journal of Experimental Medicine 203,2749−2761.
47.Ohta,A.,et al.,2011.In vivo T cell activation in lymphoid tissues is inhibited in the oxygen−poor microenvironment.Front Immunol 2,27.
48.Patsoukis,N.,et al,2013.PD−1 increases PTEN phosphatase activity while decreasing PTEN protein stability by inhibiting casein kinase 2.Mol.Cell.Biol.33,3091−3098.
49.Tatsis,N.,et al.,2007.Adenoviral vectors persist in vivo and maintain activated CD8+T cells:implications for their use as vaccines.Blood 110,1916−1923.
50.Zhang,F.,2012.Dysregulated lipid metabolism in cancer.World Journal of Biological Chemistry 3,167
51.Zou,W.,et al.,2016.PD−L1(B7−H1)and PD−1 pathway blockade for cancer therapy:Mechanisms,response biomarkers,and combinations.Sci Transl Med 8,328rv4−328rv4.
52.Clarke,SR et al,2000 Characterization
of the ovalbumin−specific TCR transgenic line OT−I:MHC elements for positive and negative selection.,Immunol.Cell Biol,78(2):110−117
(配列リストフリーテキスト)
以下の情報が、数字の識別子<223>の下でフリーテキストを含む配列に対して、提供される。
引用文献
1.Ahmadzadeh,M.,et al.(2009).Tumor antigen−specific CD8 T cells infiltrating the
tumor express high levels of PD−1 and are functionally impaired.Blood 114:1537−1544.
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metabolic microenvironment of tumors.Adv.Pharmacol.65,63−107.
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4.Brahmer,J.R.,et al.(2012).Safety and Activity of Anti−PD−L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer.N.Engl.J.Med.366,2455−2465.
5.Bucks,C.M.,et al.(2009).Chronic antigen stimulation alone is sufficient to drive CD8+T cell exhaustion.J.Immunol.182,6697−6708.
6.Chang,C.H.,et al.(2015)Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is
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7.Chapman,P.B.,et al.(2015).Rapid eradication of a bulky melanoma with one dose of immunotherapy.N.Engl.J.Med.372,2073−2074.
8.Crompton,J.G.,et al.(2015).Akt inhibition enhances expansion of potent tumor−specific lymphocytes with memory cell characteristics.Cancer.Res.75,296−305.
9.Dalgleish,A.G.(2011).Therapeutic cancer vaccines:Why so few randomized phase III studies reflect the initial optimism of phase II studies.Vaccine.29:8501−8505.
10.Doedens,A.L.,et al.(2013).Hypoxia−inducible factors enhance the effector responses of CD8(+)T cells to persistent antigen.Nat Immunol.14,1173−82.
11.Finlay,D.,et al.(2012).PDK1 regulation of mTOR and hypoxia−inducible factor 1
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12.Grosso,J.F.,et al.(2007).LAG−3 regulates CD8+T cell accumulation and effector
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14.Ho,P.C.,et al.(2015). Phosphoenolpyruvate is a metabolic checkpoint of anti−tumor T cell response.Cell.162;1217−28.
15.Lasaro,M.O.et al.(2008).Targeting of antigen to the herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses.Nat.Med.14,205−212.
16.Lochner,M.,et al(2015).Fatty acid metabolism in the regulation of T cell function.Trends Immunol.36:472−478.
17.Lu,W.,et al.(2010). Metabolomic analysis via reversed−phase ion−pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.Anal.Chem.82,3212−21.
18.Martinez−Outschoorn,U.E.,et al(2012).Ketone body utilization drives tumor growth and metastasis.Cell Cycle.11,3964−71.
19.Mazzone,M.(2014).Tumor stroma:a compl
exity dictated by the hypoxic tumor microenvironment.Oncogene 33,1743−1754.
20.McNamee,E.N.(2013).Hypoxia and hypoxia−inducible factors as regulators of T cell development,differentiation,and function.Immunol.Res.55,58−70.
21.Mendendez,J.A.and Lupu,R.(2007).Fatty
acid synthase and lipogenic phenotype in cancer pathogenesis.Nat.Rev.Cancer.7,763−777.
22.Mueller,S.N.and Ahmed,R.(2009). High antigen levels are the cause of T cell exhaustion during chronic viral infection.Proc.Natl.Acad.Sci.106,8623−8628.
23.Palmer,C.S.,et al.(2015).Glucose metabolism regulates T cell activation,differentiation,and functions.Frontiers Immunol.6,1−6.
24.Parry,R.V.,et al.(2005).CTLA−4 and PD−1 receptors inhibit T−cell activation by distinct mechanisms.Mol.Cell.Biol.25,9543−53.
25.Patsoukis,N.,et al.(2015).PD−1 alters
T−cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis
and fatty acid oxidation.Nat.Commun.6,6692.
26.Pearce,E.L.(2013).Fueling immunity:insights into metabolism and lymphocyte function.Science.342;1242454.
27.Pescador,N.,et al.(2005).Identification of a functional hypoxia−responsive element that regulates the expression of the egl nine homologue 3(egln3/phd3)gene.Biochem.J.390,189−197.
28.Schlie,K.,et al.(2011).When Cells Suffocate:Autophagy in Cancer and Immune Cells under Low Oxygen.Int J Cell Biol 2011,470597−13.
29.Sharma,P.and Allison,J.P.(2015).Immune checkpoint targeting in cancer therapy:toward combination strategies with curative potential.Cell.161,205−214.
30.Siska,P.J.and Rathmell,J.C.(2015)T cell metabolic fitness in antitumor immunity.Trends Immunol.36,257−64.
31.Sukumar,M.,et al.(2013).Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+T cell memory and antitumor function.J.Clin.Invest.123,4479−88.
32.Takahashi,S.,et al.(2014).Roles and regulation of ketogenesis in cultured astroglia and neurons under hypoxia and hypoglycemia.ASN.Neuro.6,5.
33.Veech,R.L.(2004). The therapeutic implications of ketone bodies:the effects of ketone bodies in pathological conditions:ketosis,ketogenic diet,redox states,insulin resistance,and mitochondrial metabolism.Prostaglandins.Leukot.Essent.Fatty.Acids.70,309−19
34.Wang,R.W.and Green,D.R.(2012).Metabolic checkpoints in activated T cells.Nat.Immunol.13,907−915.
35.Warburg,O.,On respiratory impairment in cancer cells.(1956).Science.124,269−70.
36.Wherry,E.J.T cell exhaustion.(2011).Nat.Immunol.12:492−499.
37.Wiig,H.,et al.(2003).Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method.Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol.284,H416−24.
38.Yang,J.C.(2013).The adoptive transfer
of cultured T cells for patients with metastatic melanoma.Clinics Dermatol.31,209−219.
39.Zhang,Y.,et al.(2012).Stromal progenitor cells from endogenous adipose tissue
contribute to pericytes and adipocytes that populate the tumor microenvironment.Cancer Res.72,5198−208.
40.Zhang,Y.and Ertl,H.C.(2014).The effect of adjuvanting cancer vaccines with herpes simples virus glycoprotein D on melanoma−driven CD8+T cell exhaustion.J.Immunol.193:1836−1846.
41.Kalos,M.et al(2011)T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish Memory in
Patients with Advanced Leukemia. Sci Transl Med.,3(95):73
42.Azuma,T.,et al.,2008.B7−H1 is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells.Blood 111,3635−3643
43.Kleffel,S.,et al.,2015.Melanoma Cell−Intrinsic PD−1 Receptor Functions Promote Tumor Growth.Cell 162,1242−1256.
44.Larkin,J.,et al.,2015.Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Unt
reated Melanoma.N Engl J Med 373,23−34.
45.Marvel,D.,Gabrilovich,D.I.,2015.Myeloid−derived suppressor cells in the tumor
microenvironment:expect the unexpected.J.Clin.Invest.125,3356−3364.
46.Mrass,P.,et al.,2006.Random migration
precedes stable target cell interactions of tumor−infiltrating T cells.Journal of Experimental Medicine 203,2749−2761.
47.Ohta,A.,et al.,2011.In vivo T cell activation in lymphoid tissues is inhibited in the oxygen−poor microenvironment.Front Immunol 2,27.
48.Patsoukis,N.,et al,2013.PD−1 increases PTEN phosphatase activity while decreasing PTEN protein stability by inhibiting casein kinase 2.Mol.Cell.Biol.33,3091−3098.
49.Tatsis,N.,et al.,2007.Adenoviral vectors persist in vivo and maintain activated CD8+T cells:implications for their use as vaccines.Blood 110,1916−1923.
50.Zhang,F.,2012.Dysregulated lipid metabolism in cancer.World Journal of Biological Chemistry 3,167
51.Zou,W.,et al.,2016.PD−L1(B7−H1)and PD−1 pathway blockade for cancer therapy:Mechanisms,response biomarkers,and combinations.Sci Transl Med 8,328rv4−328rv4.
52.Clarke,SR et al,2000 Characterization
of the ovalbumin−specific TCR transgenic line OT−I:MHC elements for positive and negative selection.,Immunol.Cell Biol,78(2):110−117
Claims (17)
- 前処理されたT細胞によるエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて、エキソビボまたはインビトロで前処理または条件付けされるT細胞またはT細胞集団を、がんを有する対象に投与することを包含する、がんを処置する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、がんを有する対象に
(a)対象の腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物;ならびに
(b)1つ以上の
i.腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬;及び
ii.養子細胞移入のためのエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにT細胞を条件付けるために(i)を用いてエキソビボで前処理したT細胞。
を、同時投与することをさらに包含する、方法。 - T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてT細胞をエキソビボまたはインビトロで前処理することを包含する、T細胞を改変する方法。
- キメラ抗原受容体−T細胞またはキメラ内分泌受容体−T細胞またはエキソビボで増殖した腫瘍抗原特異的T細胞の生存を増強するための、請求項3に記載の方法であって、固形腫瘍を有する対象への養子細胞移入の前に、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的T細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボでT細胞を前処理することをさらに包含する、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、がんの治療のための治療レジメンが:
(a)固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の1日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法用組成物の単回用量を投与すること;
(b)腫瘍微小環境において腫瘍抗原特異的T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を、前記対象に投与することであって、試薬の前記脂肪酸異化作用促進性化合物の前記第1の投与量が処置の0〜5日目に開始する投与;
(c)(b)の処置の開始日から処置の第7日〜第30日の間に存在する日まで毎日、脂肪酸異化作用促進性の化合物または試薬を投与すること、を包含する方法。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の方法であって、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を投与することをさらに包含する、方法。
- 前記チェックポイント阻害剤が抗PD−1抗体または低分子リガンドである、請求項6に記載の方法。
- T細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する前記化合物または試薬が、フェノフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法であって、前記T細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られる、自己または異種の、天然に存在するT細胞、または組換えもしくは合成により修飾されたT細胞構築物、またはヒトT細胞もしくはナチュラルキ
ラー(NK)T細胞もしくはT浸潤リンパ球(TIL)、あるいはヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られたT細胞、あるいは、前記前処理の前に、異種抗原受容体、またはキメラ抗原受容体もしくはキメラ内分泌受容体を発現するように改変されたT細胞、あるいは内因性もしくは異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株、あるいはCD8+T細胞である方法。 - 前記免疫療法組成物が、がん抗原を発現する組換えウイルスまたはウイルス様粒子、がん抗原を発現するDNA構築物、がん抗原またはその断片を、ペプチド抗原またはタンパク質として、がん抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片を含む組成物である、請求項2〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法であって:
(a)前記免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたT細胞が、実質的に同時に投与されるか;
(b)前記脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬または前処理されたT細胞が、免疫療法用組成物の投与後少なくとも1日〜14日に1回または繰り返し投与されるか;
(c)前記免疫療法組成物が単回投与または1回以上の追加投与として投与されるか;
(d)前記組成物(a)及び(b)(i)が独立して、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内またはリンパ節内投与によって全身的に投与されるか;または
(e)組成物(b)が経口投与される、方法。 - 前記前処理されたT細胞が1回もしくは反復投与されるか、または前記前処理されたT細胞が単回用量で、もしくは1回以上の量として投与されるか、または前記前処理されたT細胞が静脈内注射または注入により全身的に投与される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法であって、
(a)前記対象を他の抗癌療法で処置すること;及び
(b)前記前処置されたT細胞を投与する前に、化学療法で対象を処置すること、をさらに包含する、方法。 - 前記抗癌療法が、前記前処置されたT細胞の投与前に前記リンパ球の対象を枯渇させること、及び必要に応じて前記腫瘍を外科的に切除することを包含する、請求項13に記載の方法。
- 前記方法によって標的化される前記がんまたは腫瘍が、低酸素、Tリンパ球による有意な浸潤、及び前記腫瘍微小環境における低グルコースによって特徴付けられる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いて、エキソビボまたはインビトロで前処理されたT細胞を含む組成物。
- 請求項16に記載の組成物において、
(a)前記組成物が、哺乳動物対象への養子移入の方法における使用のためであり;
(b)前記脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬が、フェノフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、AMPK活性化因子または5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボシドであるか;または
(c)前記T細胞が、自己もしくは異種の天然に存在するT細胞または組換えもしくは合
成で改変されたT細胞構築物、または対象からもしくは対象の骨髄移植適合から得られたヒトT細胞もしくはナチュラルキラー(NK)T細胞またはT浸潤リンパ球(TIL)、またはヒト末梢血から、もしくは対象の腫瘍微小環境から得られたT細胞、または前記前処理の前に異種抗原受容体、もしくはキメラ抗原受容体もしくはキメラ内分泌受容体を発現するように改変されたT細胞、または内因性もしくは異種のヒトT細胞またはヒトT細胞株、またはCD8+T細胞である、組成物。
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