TW201132813A

TW201132813A - Methods for classifying and treating breast cancers

Info

Publication number: TW201132813A
Application number: TW100107087A
Authority: TW
Inventors: Kuo-Jang Kao; Kai-Ming Chang; Andrew Da-Fu Huang
Original assignee: Koo Foundation Sun Yat Sen Cancer Ct
Priority date: 2010-03-03
Filing date: 2011-03-03
Publication date: 2011-10-01
Also published as: US20110217297A1; WO2011109637A1

Description

201132813 六、發明說明：【發明背景】乳癌為最常見之癌症，癌為癌症死亡之第二西方世界巾之婦女中，乳病因。在傳統上’乳癌已被視為種具有共同病因之旅、法，目士疾病具有可影響預後及治療結果之不同特徵。近年爽，旌、4 > ^ 廣泛臨床及生物研究已導致逐漸認識乳癌之獨特次型。秋而，，々人Α 然而迄今為止之臨床試驗尚未能開發用於使治療最佳化之關於乳癌次型的資訊。典型地，此等 :驗已根據少t(例如兩個或三個）生物指標對乳癌進行刀類^而乳癌之間之顯著生物異質性致使基於此少數生物指標之治療對許多個體而言不充分及無效。因此，有需要基於更準確反映乳癌之生物異質性之較大數目的生物指標鑑別乳癌之其他分子次型。此外，有需要確定有效治療特定乳癌次型之療法。【發明概述】在一具體實例中，本發明係關於治療個體中的乳癌之方法，其包含確定該個體中的乳癌之分子次型及向該個體投予有效治療該乳癌之分子次型的療法。在一特定具體實 4 201132813 例中，分子次型係選自由以下者所組成的群組：第i分子次型乳癌、第π分子次型乳癌、第ΠΙ分子次型乳癌、第分子次型乳癌、第V分子次型乳癌及第VI分子次型乳癌。在另一具體實例中，本發明係關於將患有乳癌的個體鑑別為具有治療某/乳癌分子次型的功效的療法的候選者之方法，其包含確定該個體中的乳癌之分子次型及將該個體鐘別為有效治療該分子次型的療法的候選者。在一特定具體貫例中，分子次型係選自由以下者所組成的群組：第I 分子次型乳癌、第Π分子次型乳癌、第ΙΠ分子次型乳癌、第IV分子次型乳癌、第V分子次型乳癌·及第VI分子次型乳癌。在另一具體實例中，本發明係關於選擇用於個體中的乳癌的療法之方法，其包含確定該個體中的乳癌之分子次型及選擇有效治療該分子次型的療法。在一特定具體實例中，分子次型係選自由以下者所組成的群組：第子次型乳癌、第η分子次型乳癌、第m分子次型乳癌、第以分子次型乳癌、第V分子次型乳癌及第…分子次型乳癌。在另一具體實例中，本發明係關於對乳癌進行分類之方法’其包含產生該乳癌之基因表現特徵，比較該乳癌之基因表現特徵與—或多個乳癌分子次型之參考基因徵及根據分子次型斟5丨庙八相士 ^ i對該礼癌刀類。在—特定具體實例中，分子次型係選自由IV T i α e _J_、1 乂下者所組成的群組：帛I分子次型乳癌、第II分子次型朝痗、笸τττ八工A 土孔 A 1礼癌第111分子次型乳癌、第IV分子二人型乳癌、第V分子吹】5席刀于-人型礼癌及第VI分子次型乳癌。 5 201132813 分類之替代性方法及基於於乳癌患者的個別化及最本發明提供用於對乳癌進行患者中的乳癌之分子次型確定用佳化治療的有效方法》【發明詳述】本專利或申明案檔案含有至少】個彩色製作的圖式。具有彩色圖式的本專利或專利申請公開案之複本將在請求並支付必要費用之後由智慧財產局提供。本發明部分基於乳癌之6種分子次型之鑑別及有效治療此等次型中之每一者的最佳化療法。如本文所述，使用來自327名乳癌患者之樣品及最適於將乳癌分類成不同分子次型之基因（表1 )進行基因表現特徵分析（gene expression pr0filing )研究。根據此方法分類之乳癌的不同勿子次型顯示具有獨特臨床特性及生物學且經媒定對治療所起的反應大為不同《此等特徵用於確定可有效用來治療來自不同地理區域及種族群體之乳癌患者之用於各乳癌次型的最佳化療法。定義如本文所用，「分子次型」及「乳癌分子次型」可互換使用且係指由一組（例如複數個）基因之差異表現特性化之乳癌次型（例如乳癌之子組）’其中相對於適合對照組（例如非癌性組織或細胞樣品，參考標準），該組基因中之每一者顯示在乳癌樣品中之表現量升高（例如增加） 201132813 或降低（例如減小）。在乳癌中 /、衣現之基因可為例如或先削已確定在乳癌中差異表現之基因。術語 t型」及「乳癌分子次型」包括本文所述之6種乳癌I子

-人型（如本文定義之第j、第„、第m、第W VI次型）。及第如本文所用，「基因表現」係指基因中編竭之資訊譯成基因產物（例如RNA、蛋白質）。表現之基因包括錄成隨後轉譯成蛋白質之RNA (例如mRNA)的基因，以及轉錄成不轉譯成蛋白質之非編碼RNA分子（例如轉移 RNA(tRNA)、核糖體 RNA(rRNA).、微職酸酶）的基因。核表現里」或「表現強度」係指由既定基因編碼之一或多種基因產物（例如mRNA、蛋白質）在樣品或參考標準中之含5 (例如數量）。 Γ 如本文所用，「差異表現」係指兩個樣品（例如兩個生物樣品）之間或樣品與參考標準之間基因表現量的任何可再現及可㈣差異。較佳地，I因表現量之差異具有統计顯著性（p < G.G5 )。兩個樣品之間之表現差異是否為統計顯著可使用適當t-檢定（例如單樣本t_檢定，雙樣本卜檢定、威ϋ奇氏t.檢定（Weleh，st.tes〇 )或熟習此項技術者已知之其他統計檢定加以確定。「基因表現特徵」《「表現特徵」^旨具有與特定生物活性（例如細胞增殖、細胞週期調控、轉移）、細胞類型、疾病狀態（例如乳癌）、細胞分化狀態或病狀（例如 201132813 乳癌次型）相關+ + 哥之表現罝的一組基因。如本文所用之「失去疋參考基因表現特徵係子次型或正常檨。夕#主ω , 宁、才曰既疋礼癌为如例如典型）基因表現特徵。用時供户* 實f上類似」在關於基因表現特徵使衣見特徵（例如乳癌測試樣口口土因表現特徵及特定乳癌 ^ ^ A刀卞人型之參考基因表現特徵）就各特徵中相對㈣1吊樣°B以統計顯著程度差異表現之基因的一致性而言為一致或至少啊類似^ 術探針組」係指陣列（例如微陣列）上與相同目標基因或基因產物互補之探針。探針組可由一或多個探針組成。如本文所用，「探針寡核芽酸」或「探針寡去氧核苦酸」係指陣列（例如微陣列）上能夠與目標寡核苷酸雜交之寡核苷酸。如本文所用之術語「寡核普酸」係指長度為約5至約 150個核苷酸之核酸分子（例如RNA、dna) ^寡核苷酸可為天然存在之寡核苷酸或合成寡核苦酸。寡核苷酸可藉由胺基麟酸醋法（Beaucage 及 Carruthers，Tetrahedr〇n Lett 22:1859-62, 1981 )、或三酯法（Matteucci 等人，j. Am Chem.

Soc. 103:3185, 1981 )、或此項技術中已知之其他化學方法製備。「目標募核苷酸」或「目標寡去氧核苷酸」係指欲偵測（例如經由雜交）之分子。如本文所用之「可偵測標記」係指能夠直接或間接經 201132813 特異性偵測，因此可用於區分包含可偵測標記之分子與不包含可偵測標記之分子的部分。特異性雜交」一词係指在嚴格條件下兩個互補核苷酸序列（例如DNA、RNA或其組合）以雙鏈體形式進行特異性締合。兩個核酸分子以雙鏈體形式締合是由於互補鹼基對之間的氫鍵結而發生。「嚴格條件」或「嚴格性條件」係指具有至少70%互補性之兩個互補核酸分子可雜交的一組條件 '然而，嚴格條件不允許不互補之兩個核酸分子（具有7〇%以下序列互補性之兩個核酸分子）雜交。如本文所用，「低嚴格性條件」包括例如在約45它下於6x氯化鈉/檸檬酸鈉（ssc)中雜交，隨後在至少5〇它（對於低嚴格性條件而言’洗蘇溫度可增加至55。(：）下於〇·2Χ SSC，0·1% SDS 中洗滌 2 次。「中等嚴格性條件」包括例如在約45t：下於6xssc中雜交，隨後在6CTC下於0.2x SSC，〇 1%⑽中洗務一或多次。如本文所用，「高嚴格性條件」包括例如在約4rc下於6XSSC中雜交’隨後在阶下於〇2xSsc，〇 a·中洗務一或多次。「極向厭格性條件」包括（但不限於）在机下於〇·5 Μ麟酸納，7%SDS中雜交，隨後在价下於〇2xSsc，ι% SDS中洗滌一或多次。如本文所用，術語厂多肽」係指任何長度之胺基酸聚 201132813 合物且涵蓋蛋白質、肽及寡肽。如本文所用，術語「樣品」係指表現某些基因之生物樣品（例如組織樣品、細胞樣品、流體樣品），其中相對於某一特定分子次型之癌細胞（例如乳癌細胞）不存在於樣品中時，當彼次型之癌細胞存在於樣品中時，該等基因顯示差異表現量。「遠處轉移」係指癌細胞已自原始（亦即原發性）腫瘤散佈至遠處器官或遠處淋巴結。如本文所用，「個體」係指人類。適合個體之實例包括（但不限於）患有乳癌或處於發展乳癌之風險中之女性及男性人類患者。如本文所用之術語「預防」意謂降低個體中的乳癌腫瘤形成或進展之機率/可能性或風險，延遲個體與乳癌相關之病狀的發作，減輕個體中的乳癌相關病狀之一或多種症狀的嚴重性或其任何組合。一般而言，預防性攝生法之個體很可能將分類為「處於風險中」，例如個體發展乳癌之風險大於由相關基線群體代表之個體之風險。如本文所使用，術語「治療」意謂在根據臨床上可接文之標準’醫學病狀得以改良（例如個體中的乳癌腫瘤之數目減少及/或尺寸減小）之程度上抵抗醫學病狀（例如與乳癌相關之病狀）。如本文所定義’ 「治療攝生法」為以特定劑量（例如含量、量、數量）且按特定時程及/或以特定間隔（例如數分鐘、數天、數週、數月）向個體投予一或多種治療劑或 10 201132813 預防劑的攝生法。士本文所疋義，「療法」為向個體（例如非人類哺乳動物、人類）投予特定治療劑或預防劑，對該個體產生所要治療或預防益處。如本文所疋義，「治療有效量」為在投藥條件下足以達成所要治療或預防作用之量，諸如足以抑制（亦即降低、阻止）患有乳癌之患者腫瘤形成、腫瘤生長（增生、大小）、腫瘤血管形成及/或腫瘤發展（侵襲、轉移）的量。療法有 =性（例如減小/消除腫瘤及/或阻止腫瘤生長）彳由任何適 S (例如原位免疫組織化學、成像法（超音波、CT -掃描、MRI、NMR)、併入3h_胸皆）測定。本文所用輔助療法」係指通常在主要治療，諸如手術（例如乳癌手術）之後給予的其他治療（例如化學療法、放射線療法），纟中已消除所有可_疾病，但歸因於潛隱性疾病而仍有復發統計風險。典型地，統計證據 =於在決Μ定輔助療法之前評估疾病復發風險。輔助治太之目的在於改良疾病特異性存活及總存活。因為治療基、上針對某_風險，㈣針對可證明之錢，所以公認一助化=接又輔助療法之患者將已由其主要手術治癒。輔長期：Γ 要目標在於控制疾病之全身性復發以改良發。予給予佐劑放射線療法來控制局部及/或區域性復外（例Γ=所用’「輔助化學療法」係指除主要癌症治療外（例如在主要癌症治療之後）又提供之化學療法，諸如 11 201132813 手術或放射療法。如本文所用，「高強度化學療法」係指包含投予高劑量化學治療劑及/或投予更強力化學治療劑之化學療法。「高強度化學療法」亦可意謂劑量更強烈之化學療法。门如本文所用，「劑量密集化學療法」係指相對於標準化學療法治療攝生法，以連續治療之間較短時間間隔連續給予化學治療劑之化學療法攝生法。如本文所用，「劑量強烈化學療法」為包括投予高劑量化學治療劑之劑量密集化學療法攝生法。如本文所用’ 「抗雌激素療法」係指涉及投予—或多種抗雌激素治療劑（例如芳香酶抑制劑、選擇性雌激素受體調節劑（SERM)、雌激素受體下調劑（ERD ))之激素療法。「抗雌激素療法」典型地藉由降低體内激素雌激素之量或藉由阻斷雌激素對乳癌細胞之作用而起作用。除非另外定義’否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與此項技術（例如細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術及生物化學）中之一般技術者通常理解相同的含義。標準技術用於分子、遺傳及生物化學方法（一般參見 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版（1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y.及 Ausube卜等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第 4 版，John Wiley &

Sons公司，其以引用的方式併入本文中）及化學方法。 12 201132813 確定乳癌分子:欠型之方法；根據分子次型對乳癌分類之方法；確定免疫反應計分之方法本文所述之方法可用於確定個Μ 及根據本文鑑別之6種不同分子+丨个丨J刀子-人型之—來對乳癌分類。此專分子次型稱為第！分子次型乳癌、第π分子次型乳癌、第ΙΠ分子次型乳癌 '第1V分子次型乳癌、第V分子次型乳癌及第VI分子次型乳癌。如本文所述，已發現由表1中列出之探針組表示之基因及基因產物的子組在6種新近鏗別之乳癌分子次型中之每-者中差異-表現。因此，對於既定乳癌樣品，可例如藉由相對於適合對照組，分Μ 1中心之所有或-特性子組之基因及/或探針組在乳癌樣品中之表現來確定乳癌分子次型。較佳地，分析表1中列出之所有基因/探針組之表現量以確定乳癌所屬之特定分子次型。若癌症具有未知分子次型及/或相信屬於特定分子次型，或測試多個乳癌樣品，則此方法尤其適用。然而’並非始終必須分析纟i中列出之所有基因/探針組來確定乳癌是為第Γ、第π、第m、第 IV、第V還是為第VI分子次型乳癌。舉例而言，在一些情況下，可藉由分析表i中至少約30%之基因/探針組之表現來確定乳癌分子次S (亦即第Ϊ、帛„、帛ΠΙ、第IV、第 V或第vi分子次型）。舉例而言，在-些情況下，可藉由分析表1中至少約4〇%、至少約50%、至少約60%、至少約、至少約8〇%、至少約9〇%、至少約95%或刚％之基因的表現來確定乳癌分子次型。較佳地，分析表1中至 13 201132813 少約70%、更佳至少約80%、甚至更佳至少約90%之基因的表現來確定乳癌分子次型。表1 :差異表現於一或多種乳癌分子次型（第I-第VI分子次型）中之基因/探針組（指示未指定基因符號）

Affymetrix 探針組ID 基因符號* 代表性公開ID*或RefSeq轉錄物 ID/寄存編號基因藤編號 1554007_at — BC036488 第9組 1555 893一 at — AI918054 第9組 1556221_a_at — BM992214 第7組 1557810_at — BM352108 第5組 1557843_at — BC036114 第9組 1558686_at — BM983749 第7組 1559949_at — T56980 第8組 1560049_at ——— All25337 第13組 1560550_at — BC037972 第7組 1560850_at ——— BC016831 第7組 1561938_at — AL832704 第9組 156282 l_a_at ——— AF401033 第9組 1565595_at — AU144979 第2組 1567101_at —— AF147347 第7組 1567997_x_at — D17262 第9組 217191_x_at — AF042163 第9組 220898_at — NM_024972 第8組 222326_at — AW973834 第4組 224989_at — AI824013 第7組 225123_at — BE883841 第13組 226034_at ――· BE222344 第7組 227762_at — AW244016 第13組 227929_at --- AU151342 第7組 14 201132813 227952—at — AI580142 第12組 228175_at — AL137310 第7組 228273—at — BG165011 第3組 228390_at — AA489100 第7組 228528_at ——— AI927692 第9組 228750_at ——— AI693516 第13組 229072—at BF968097 第7組 229659_s_at — BE501712 第13組 230130_at — AI692523 第13組 23049 l_at --- BF111884 第9組 230570_at — AI702465 第9組 230791_at — AU146924 第1組 231034_s_at — AI871589 第1組 231〇98_at —— BF939996 第10組 231291_at --- AI694139 第9組 232105_at — AU148391 第1組 232210_at 一 AU146384 第9組 232290_at --- BE815259 第7組 232614_at — AU146963 第9組 232850_at AU147577 第9組 232935_at — AA569225 第13組 233059一 at — AK026384 第9組 233273一 at — AU146834 第9組 233388_at — AK022350 第9組 233413_at — AU156421 第9組 233691_at — AK025359 第4組 234785_at — AK025047 第11組 235501_at —— AW961576 第7組 235609_at — BF056791 第3組 235771_at — BF594722 第9組 235786_at — AI806781 第9組 201132813 235856_at — AI660245 第7組 236114—at --- AI798118 第9組 236256一 at --- AW993690 第11組 236307_at — AA085906 第13組 236445—at — AI820661 第9組 237112_at — R59908 第9組 238827_at — BE843544 第13組 239066_at ___ AW364675 第7組 239638_at — AI608696 第7組 239723—at AA588092 第7組 239907_at ___ BF508839 第7組 240247_at — AI653240 第3組 240724_at --- AI668629 第13組 240733_at — W92005 第7組 240788一at --- AI076834 第3組 241310_at — AI685841 第7組 241466_at — AI275776 第9組 241577_at --- AI732794 第9組 241929_at --- AV760302 第13組 242022_at —— 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如本文所用，「第i分子次型乳癌」係指相對於正常樣品（例如非癌性對照組樣品），由表2中列出之基因在乳癌樣品中之差異表現特性化的乳癌。第I分子次型乳.癌典型地具有化學敏感性且可用根據臨床風險使用或不使用甲胺嗓呤（methotrexate)及/或蒽環徽素（anthracyclines)之輔助化學療法治療。表2 :為第I分子次型所特有之差異表現的基因/探針組乳癌第I分子次型特徵基因/特性子組 Affymetrix 探針組ID 基因符號相較於正常乳房組織之表現（「向上」指示上調或表現增加；「向下」指示下調，或表現減少） 1438一at EPHB3 向上 1552283_s—at ZDHHC11 向下 1552473_at GAMT 向下 1553430_a_at EDARADD 向下 1553997—a—at ASPHD1 向上 1554242—a_at COCH 向上 1554576—a_at ETV4 向上 1555310_a_at PAK6 向上 1555497_a_at CYP4B1 向下 1555997—s_at IGFBP5 向下 1556012_at KLHDC7A 向下 1557263_s_at LOC100131731 向下 1558686一 at — 向下 1559028_at C21orfl5 向下 1559280_a—at --- 向下 200831一 s_at SCD 向下 201468_s—at NQOl 向下 201939_at PLK2 向下 202017_at EPHX1 向下 202219—at SLC6A8 向上 202687_s_at TNFSF10 向下 45 201132813 202862_at FAH 向下 202935_s_at SOX9 向上 203032—s—at FH 向上 203426_s_at IGFBP5 向下 203722_at ALDH4A1 向下 203917一at CXADR 向上 204124_at SLC34A2 向上 204268_at S100A2 向上 204365_s_at REEP1 向下 204720_s_at DNAJC6 向上 204836_at GLDC 向上 204885—s_at MSLN 向上 20494 l_s_at ALDH3B2 向下 204942_s_at ALDH3B2 向下 204989_s_at ITGB4 向上 205104—at SNPH 向下 205184_at GNG4 向上 205364一 at ACOX2 向下 205375_at MDFI 向上 205402一x_at PRSS2 向上 205697_at SCGN 向下 206204_at GRB14 向上 206307_s_at FOXD1 向上 206339一 at CARTPT 向下 206378_at SCGB2A2 向下 206463_s_at DHRS2 向下 206582_s_at GPR56 向上 207103_at KCND2 向下 208962—s_at FADS1 向上 209267_s_at SLC39A8 向上 209437_s_at SPON1 向下 20963l_s_at GPR37 向上 209909_s_at TGFB2 向上 209975_at CYP2E1 向下 210130_s_at TM7SF2 向下 210297_s_at MSMB 向下 210328_at GNMT 向下 210576_at CYP4F8 向下 46 201132813 212935—at MCF2L 向下 212938—at COL6A1 向上 213107—at TNIK 向下 213385—at CHN2 向下 213742一 at SFRS11 向上 214079_at DHRS2 向下 214097—at RPS21 向上 214597—at SSTR2 向下 214798—at ATP2C2 向下 215033—at · TM4SF1 向上 215856—at SIGLEC15 向下 216604—s—at SLC7A8 向下 216850_at SNRPN 向下 218309_at CAMK2N1 向下 218704—at . .RNF43 .向下 218745_x_at TMEM161A 向上 218975—at COL5A3 向下 219225一 at PGBD5 向上 219250_s_at FLRT3 向下 219736—at TRIM36 向下 220277 at CXXC4 向下 220407_s—at TGFB2 向上 220467—at -- 向下 220559_at EN1 向上 220979_s_at ST6GALNAC5 向上 221646—s—at ZDHHC11 向下 223218—s_at NFKBIZ 向下 223582—at GPR98 向下 223948 s_at TMPRSS3 向上 225667—s—at FAM84A 向上 226125—at — 向下 226649—at PANK1 向上 226706—at FLJ23867 /// QSOX1 向上 227259—at CD47 向上 227285—at Clorf51 向上 227384_s_at LOC727820 向下 227475—at FOXQ1 向上 228619—x—at TIPRL 向上 47 201132813 228708_at RAB27B 向下 22873 l_at ——— 向下 228790_at FAM110B 向下 228834_at T0B1 向下 228977一at LOC729680 向上 229352—at SPESP1 向下 229927_at LEMD1 向上 230214_at MRVI1 向下 230337_at SOS1 向上 230493_at SHISA2 向下 231173_at PYROXD1 向上 231841_s_at KIAA1462 向下 232067_at C6orfl68 向上 232346_at LOC388692 向下 232370_at LOC254057 向下 232417_x_at ZDHHC11 向下 232478_at — 向上 232573_at — 向上 233907_s_at SERTAD4 向上 235059_at RAB12 向上 235153_at RNF183 向下 235318_at FBN1 向下 235763—at SLC44A5 向下 236417_at —— 向上 236892_s_at — 向下 236947_at — 向下 237395_at CYP4Z1 向下 237452_at --- 向上 239653_at — 向上 239847一 at --- 向下 240052_at ITPR1 向下 242338_at TMEM64 向上 242874_at —— 向下 244022_at — 向上 244536_at —— 向上 33322丄 at SFN 向上 48 201132813 「第II分子次型乳癌」係指相對於正常樣品（例如非癌性對照組樣品），由表3中列出之基因在乳癌樣品中之差異表現特性化的乳癌。第II分子次型乳癌典型地過度表現ERBB2且許多此次型之癌症可用HER2之治療性單株抗體、HER2/EGFR路徑之抑制劑、及/或高強度化學療法治療。第II分子次型乳癌典型地具有發展遠距離轉移之高風險及不良存活預後。表3 :為第II分子次型所特有之差異表現的基因/探針組乳癌第II分子次型特徵基因/特性子組 AfFymetrix 探針組ID 基因符號相較於正常乳房組織之表現（「向上」指示上調或表現增加；「向下」指示下調，或表現減少） 1553946_at DCD 向上 1556190_s_at PRNP 向上 1556527_a—at 向上 201367_s_at ZFP36L2 向上 204348_s_at AK3L1 向上 205197_s_at ATP7A 向上 205872_x_at PDE4DEP 向下 205957_at PLXNB3 向上 206022—at NDP 向下 207126—x_at UGT1A1 ///UGT1A10/// UGT1A4 /// UGT1A6 /// UGT1A8///UGT1A9 向上 208083_s_at ITGB6 向上 208084_at ITGB6 向上 208596_s_at UGT1A1 ///UGT1A10/// UGT1 A3 /// UGT1A4 /// UGT1A5///UGT1A6/// 向上 49 201132813 UGT1A7 /// UGT1A8 /// UGT1A9 210262_at CRISP2 向上 210399_x_at FUT6 向上 211708_s_at SCD 向上 214612一x一at MAGEA6 向上 214624_at UPK1A 向上 215125_s_at UGT1A1 ///UGT1A10/// UGT1A3 /// UGT1A4 /// UGT1A5 /// UGT1A6 /// UGT1A7 /// UGT1A8 /// UGT1A9 向上 217404_s_at COL2A1 向下 219288_at C3orfl4 向上 224189_x_at EHF 向上 22627 l_at GDAP1 向下 227174_at WDR72 向下 227253_at CP 向上 23038 l_at Clorfl86 向下 231951_at GNAOl 向下 234269—at … 向上 235136_at ORMDL3 向上 239010_at FLJ39632 向下 239605一x一 at 向上 239994_at … 向下 242343—x—at 向上 243824_at --- 向下 244508_at 7-Sep 向上「第III分子次型乳癌」係指相對於正常樣品（例如非癌性對照組樣品），由表4中列出之基因在乳癌樣品中之差異表現特性化的乳癌。第ΠΙ分子次型乳癌典型地為ER 陽性，因此可使用當前對ER陽性乳癌有效之療法治療。第 III分子次型乳癌具有中等遠處轉移風險及中等存活預後。 50 201132813 表4 :為第III分子次型所特有之差異表現的基因/探針組乳癌第III分子次型特徵基因/特性子組 Affymetrix 探針組ID 基因符號相較於正常乳房組織之表現（「向上」指示上調或表現增加；「向下」指示下調，或表現減少） 1557803_at — 向下 1567628_at CD74 向上 1569522_at LOC100132767 向上 201654_s_at HSPG2 向上 202498一 s一 at SLC2A3 向上 204174_at ALOX5AP 向上 204596_s_at STC1 向下 204879_at PDPN 向上 204959_at MNDA 向上 205287一 s—at TFAP2C 向下 20548 l_at ADORA1 向下 205825_at PCSK1 向上 205844_at VNN1 向上 205987_at CD1C 向上 205997_at ADAM28 向上 206785一 s一 at KLRC1 ///KLRC2 向上 206983_at CCR6 向上 20990 l_x_at AIF1 向上 209906_at C3AR1 向上 211990一 at HLA-DPA1 向上 212091_s_at COL6A1 向上 212999_x_at HLA-DQB1 向上 213095_x_at AIF1 向上 213537_at HLA-DPA1 向上 213830_at TRD@ 向上 213831_at HLA-DQA1 向上 51 201132813 216005_at TNC 向上 217080—s—at HOMER2 向下 217362_x_at HLA-DRB6 向上 218345_at TMEM176A 向上 219666_at MS4A6A 向上 219759—at ERAP2 向上 219804一at SYNP02L 向下 220532_s_at TMEM176B 向上 221268_s_at SGPP1 向上 221690_s_at NLRP2 向上 222013_x_at FAM86A 向下 223280_x_at MS4A6A 向上 223820_at RBP5 向上 223922_x—at MS4A6A 向上 223952_x_at DHRS9 向上 224009—x—at DHRS9 向上 224356_x_at MS4A6A 向上 22681 l_at FAM46C 向上 227462_at ERAP2 向上 227860_at CPXM1 向上 228367_at ALPK2 向上 229674_at SERTAD4 向下 230064_at 向下 230312_at 向下 231928_at HES2 向上 232024—at GIMAP2 向上 232170_at S100A7A 向上 235102一x 一 at — 向上 235104_at ERAP2 向上 235337_at ——— 向下 235780_at PRKACB 向上 241272_at — 向上 243313_at SYNP02L 向下 243366_s_at --- 向上 52 201132813 「第ιν分子次型乳癌」係指相對於正常樣品（例如非癌性對照組樣品），由表5中列出之基因在乳癌樣品中之差異表現特性化的乳癌。第IV分子次型乳癌典型地為ER 陽性且應該用抗雌激素療法治療。第IV分子次型乳癌不對含有甲胺喋呤之化學療法攝生法（例如CMF )起充分反應，因此應該用含有蒽環黴素之攝生法（例如CAF )治療以獲得較佳全身性控制從而預防遠處轉移且獲得較佳存活。不必要在ERBB2過度表現之第IV次型乳癌中使用Herceptin® 作為第一線治療劑。表5 :為第IV分子次型所特有之差異表現的基因/探針組乳癌第IV分子次型特徵基因/特性子組 Affymetrix 探針組Π) 基因符號相較於正常乳房組織之表現（「向上」指示上調或表現增加；「向下」指示下調，或表現減少） 1554544_a_at MBP 向下 1554819_a_at ITGA11 向上 1556682_s_at --- 向下 1564050_at LOC642808 向上 1564233_at FLJ33534 向上 202203_s_at AMFR 向上 202286_s_at TACSTD2 向下 203424_s_at IGFBP5 向上 203913—s_at HPGD 向下 204933_s_at TNFRSF11B 向下 205 833一s 一 at PARTI 向下 206697_s_at HP 向下 207929_at GRPR 向上 209030—s_at CADM1 向下 53 201132813 210136_at MBP 向下 213280_at GARNL4 向下 213462_at NPAS2 向下 217715_x_at —— 向下 218445_at H2AFY2 向下 219823_at LIN28 向上 219973_at ARSJ 向下 219995_s_at ZNF750 向下 223642_at ZIC2 向上 224840_at FKBP5 向下 226707_at NAPRT1 向上 226884_at LRRN1 向下 228072_at SYT12 向上 228676_at ORAOV1 向上 229546_at LOC653602 向下 230030_at HS6ST2 向下 230563_at RASGEF1A 向下 231849一 at KRT80 向上 232360_at EHF 向下 23236 l_s—at EHF 向下 232567_at ARHGAP8 向上 23433 l_s_at FAM84A 向下 235205_at LOC346887 向下 235419_at --- 向下 236215_at — 向上 236617_at --- 向上 236926_at TBX1 向上 243200_at --- 向下 243454_at … 向下 243546_at --- 向下 244216—at … 向下 39249_at AQP3 向下 39549_at NPAS2 向下 54 201132813 「第v分子次型乳癌」係指相對於正常樣品（例如非癌性對照組樣品），由表6中列出之基因在乳癌樣品中之差異表現特性化的乳癌。第V分子次型乳癌典型地表現高含量雌激素受體（ESR1 )且若疾病處於早期（T〈或=2; 且陽性結節（positive node )數〈或=3 )，則許多此次型之乳癌可用抗雌激素激素療法有效管理，而不使用輔助化學療法。第V分子次型乳癌典型地具有低遠處轉移風險及良好存活預後。表6 :為第V分子次型所特有之差異表現的基因/探針組乳癌第V分子次型特徵基因/特性子組 Affymetrix 探針組ID 基因符號相較於正常乳房組織之表現（「向上」指示上調或表現增加；「向下」指示下調，或表現減少） 1553982_a_at RAB7B 向下 1554726_at ZNF655 向上 1560014_s_at PDXDC1 向上 1564573—at LOC402778 向上 1566764—at MACC1 向上 1566869_at … 向上 1569112_at SLC44A5 向上 201141_at GPNMB 向下 201235_s—at BTG2 向上 201242—s 一 at ATP IB 1 向上 202800_at SLC1A3 向下 202833_s_at SERPINA1 向上 203223_at RABEP1 向上 203423_at RBP1 向下 203747_at AQP3 向上 203889_at SCG5 向下 55 201132813 204007_at FCGR3B 向下 204013_s_at LCMT2 向上 204298—s 一 at LOX 向下 206359_at SOCS3 向下 207718_x_at CYP2A7 向上 210032_s—at SPAG6 向上 210321_at GZMH 向下 211429_s_at SERPINA1 向上 211470—s_at SULT1C2 向下 211655_at IGL@ 向下 212094一at PEG 10 向下 213793_s_at HOMER1 向下 214251_s_at NUMA1 向上 214358_at ACACA 向上 215175_at PCNX 向下 215199_at CALD1 向下 215356_at TDRD12 向下 215777_at IGLV4-60 向下 216430—x_at IGL@ /// IGLV1-44 /// LOC100290557 向下 216573_at IGL@ /// IGLV1-44 /// LOCI 002905 57 向下 217320_at LOCI 00293211 /// LOC646057 向下 218792_s_at BSPRY 向上 220197_at ATP6V0A4 向下 221261_x_at MAGED4 /// MAGED4B 向下 221551_x_at ST6GALNAC4 向上 221560_at MARK4 向上 221618_s_at TAF9B 向上 221926—s_at IL17RC 向上 223217_s_at NFKBIZ 向上 223313_s_at MAGED4 /// MAGED4B 向下 224357_s_at MS4A4A 向下 225974_at TMEM64 向下 226622_at MUC20 向上 56 201132813 227059_at GPC6 向下 227697_at SOCS3 向下 228705_at CAPN12 向下 229026_at … 向下 22963 8_at hog 向上 23005 l_at C10orf47 向上 230318_at SERPINA1 向上 230626_at TSPAN12 向下 230664一at H2BFM /// H2BFXP 向下 231104—at TDRD5 向上 232280_at SLC25A29 向上 233127_at … 向下 235501_at 向上_ 235564_at ZNF117 向上 236439_at 向上 236517_at MEGF10 向上 237054_at ENPP5 向上 238717_at … 向下 238878_at AJRX 向下 238884_at … 向上 240690_at — 向上 240991—at … 向下 242009_at SLC6A4 向上 242546_at FLJ39632 向下 243713_at 向上 244050_at PTPLAD2 向上「第νι分子次型乳癌」係指相對於正常樣品（例如非癌性對照組樣品），由表7中列出之基因在乳癌樣品中之差異表現特性化的乳癌。第VI分子次型乳癌典型地為ER 陽性，因此可使用當前對ER陽性乳癌有效之療法治療。第 VI分子次型乳癌具有中等遠處轉移風險及中等存活預後。 57 201132813 表7 :為第VI分子次型所特有之差異表現的基因/探針組乳癌第VI分子次型特徵基因/特性子組 Affymetrix 探針組ID 基因符號相較於正常乳房組織之表現（「向上」指示上調或表現增加；「向下」指示下調，或表現減少） 1553655_at CDC20B 向上 1569399一at — 向上 200884_at CKB 向下 203946_s_at ARG2 向下 204412_s_at NEFH 向上 204854_at GPR162///LEPREL2 向上 205990一 s一at WNT5A 向上 206326_at GRP 向上 213425_at WNT5A 向上 219659_at ATP8A2 向上 220356_at CORIN 向上 22059 l_s_at EFHC2 向上 222288_at … 向上 224694_at ANTXR1 向上 225275_at EDIL3 向上 226085_at CBX5 向下 229669_at LOC440416 向上 232034_at LOC203274 向上 235371_at GLT8D4 向上· 241864_x_at 向上 33767一at NEFH 向上儘管較佳，但並不始終必須測定分子次型特徵（例如分子次型特性子組）中所有基因之表現量以確定某一乳癌是否應根據特定分子次型進行分類。舉例而言，在一些情況下，乳癌分子次型（例如第I分子次型）可藉由分析特定分子次型特徵中至少約30%的基因之表現確定。舉例而言， 58 201132813 在些情況下’可藉由分析本文所述之分子次型特徵中至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約7〇%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或ι〇〇%的基因的表現來確疋乳癌分子次型。較佳地，分析特定分子次型特徵中至少約70%、更佳至少約8〇%、甚至更佳至少約9〇%的基因之表現來確定乳癌是否屬於特定乳癌分子次型，其中樣品正針對其進行測試。免疫反應§十分（immune response score )」可使用以上對於乳癌之分子次型描述之相同基本方法學，使用表22 中734個「免疫反應相關基因」以及其子組，例如至少約5、 10 ' 25、50、100 ' 200、400、或 600 個基因，或表 22 中 734 個基因之約 1%、5%、1〇0/〇、2〇0/〇、3〇0/〇、4〇0/〇、5〇%、 60%、70%、8 0%、90%、95%或99%者之表現量確定。舉例、而言，在特定具體實例中，由本發明提供之方法包括藉由分析表22中至少約30%之免疫反應相關基因之表現來確定免疫反應計分的步驟。個體之免疫反應計分可藉由平均化如上所述表22中所有免疫反應相關基因或其子組之z計分強度（亦即平均值，經標準偏差正規化）由免疫反應相關基因之表現量確定。用於將個體分類成低或高免疫反應曲線之截斷值可使用此項技術中已知之方法，諸如R〇C分析確定。截斷值可經調整以達成所要特異性（例如至少約 40/〇、50/〇、60%、70%、80%、82%、84% 86%、88%、90%、 92%、94 /〇、96%、98%、99%)及敏感性（例如至少約4〇%、 50%、60%、70%、80% ' 82%、84% 86%、88%、90%、92%、 59 201132813 94%、96%、98%、99% )。在一些具體實例中，例如在具有單一組織來源’諸如乳癌之生檢之單一微陣列上與乳癌之分子次型並行確定個體免疫反應計分。在其他具體實例中’由來自個體之第二組織樣品’即除乳癌生檢以外之樣品測定免疫反應相關基因之表現量。如實施例中所說明，申請人已證明免疫反應計分可分別分類為高計分及低計分’其中高免疫反應計分預示臨床徵象，諸如無轉移存活 (metastasis-free survival )改良。在特定具體實例中，免疫反應計分預示（正相關於）第I型及第π型分子次型之總存活。樣品（例如乳癌）之其他分類可在確定分子次型及/或免疫反應計分之前、與之並行、或之後進行。在一些具體實例中’確定樣品之ERBB2 ( HER2或ERB )狀態（亦即表型）。在某些具體實例中，確定樣品之Er (雌激素受體， ESR1 )、PR (助孕輞（progesterone)受體，pGR)及狀態。在特定具體實例中，ER、PR及ERB狀態經確定及/ 或在確定樣品之分子表型及/或免疫反應計分之前已知。在其他具體實例中，ER、PR及ERB狀態與樣品之分子表型及/或免疫反應計分並行確定。在一些具體實例中只π Y ,在核酸層面上確定（例如藉由微陣列）Er、PR及ERB狀離' 在其他具體貫例中’其在蛋白質層面上確定（例如 V〜如蜡由如例如例證中所述之免疫化學）。基因表現差異（例如增加、減少）可藉由戮·來自個體與來自適合對照組或參考標準之樣品中_啖 4夕個基因之 60 201132813 表現量確定。適合對照組包括何如非贅生性組織樣品（例如來自已自其獲得癌症樣品之相同個體的非贅生性組織樣品）、非癌性細胞、非轉移性癌細胞、非惡性（良性）細胞或其類似物之樣品、或適合已知或經確定之參考標準。參考標準可為表現量在典型、正常或正規化範圍内或特定表現量的蛋白質或RNA (例如表現標準）。標準可包含例如零基因表現量、標準細胞株中之基因表現量、或先前獲得之正常人類對照組群體的平均基因表現量。因此，方法不要求基因/基因產物之表現在對照組樣品中加以評估或與對照組樣品比較。兩個樣品之間或樣品與參考標準之間基因表現量之統计顯著差異（例如增加、減少）可使用若干為熟習此項技術者已知之適當統計檢定確定。在一特定具體實例中，採用t-檢定（例如單樣本t_檢定，雙樣本t_檢定）確定基因表現之差異是否統計顯著。舉例而言，兩個樣品之間基因表現量之統計顯著差異可使用雙樣本t_檢定（例如雙樣本威爾奇氏t-檢定）確定。樣品與參考標準之間基因表現量之統計顯者差異可使用单樣本t-檢定.確定。用於評估基因表現差異之其他適用統計分析包括卡方檢定（Chi-square test )、費雪精確檢定（Fisher，s exact test)及對數秩及威爾卡遜檢定 (log-rank and Wilcoxon tests) 0 热翫此項技術者將瞭解本文揭示之諸如表1 _ 7及表2 2 中之任何基因皆可包括基因名稱及/或參考寄存編號（諸如 GeiielD、mRNA序列寄存編號、蛋白質序列寄存編號及 61 201132813

Affymetrix ID )兩者。此等識別符可用於自諸如ncbi網站之來源擷取尤其公開可用之經註解mRNA或蛋白質序列，該NCBI網站可見於以下一致資源定位器（URL )處： http://www.ncbi^ljQUlill^x。與此等識別符相關之資訊，包括參考序列及其相關註解皆以引用的方式併入本文中。適用於轉換及/或鑑別註解ID或獲得關於基因之其他資訊之工具在此項技術中為已知的且包括例如dAVID、 c1〇ne/GeneID轉換器及SNADe參見Huang等人 /V⑽c. 4(1):44-57 (2009) ; Huang 等人，价々油细. 37(1)1-13 (2009); Alibes 等人，倾C 8:9 (2007)，Sidorov 等人，10:251 (2009)。此等相應識別符及參考序列，包括其註解以引用的方式併入本文中。適〇用於本發明之方法中之樣品包括組織樣品、生物流體樣品、細胞（例如腫瘤細胞）樣品及其類似物。自個體取樣之各種手段（例如藉由組織生檢、抽血、脊椎穿刺、組織抹片或刮片）可用於獲得樣品。目此，樣品可為生檢試樣（例如腫瘤、息肉、塊體（實體、細胞））、抽出物、抹片或血樣。在一較佳具體實例中，樣品為組織樣品（例如乳房組織之生檢）。組織樣品可包括腫瘤（例如癌性贅生物 /

而言，腫瘤生檢可在整 )或部分（切片生檢目標區域移除之切開生檢或腫瘤細胞之 - 個（切除生右 (incisional 62 201132813 (open biopsy)中獲得。或者，腫瘤樣品可經由經皮生檢獲得，經皮生檢為一種用針狀儀器經由小切口或穿刺（有或無成像裝置輔助）進行以獲得個別細胞或細胞聚類（例如細針抽口及（FNA))或組織核心或片段（核心生檢（_ biopsy))之私序。生檢樣品可以細胞學（例如抹片）、組織學（例如冷;東或石㈣片）或使用任何其他適合方法（例如分子診斷方法）來檢查。腫瘤樣品亦可藉由試管内收集所培養之源於個體組織之人類細胞獲得。必要時，可在分析之前藉由在可分析條件中保存樣品之蛋白質及/或核酸的適合儲存手段（諸如快速冷;東或受控冷;東攝生法）來儲存腫瘤樣品。必要時，冷凍可在冷凍保護劑，例如二曱亞砜 (DMSO)、甘油或丙二醇_嚴糖存在下進行。出於分析之目的’可酌情在儲存之前或之後將腫瘤樣品匯合。許多適用於量測樣品中之基因表現之技術為一般技術尤/、己括例如基因表現特徵分析技術、北方墨點刀析、RT-PCR及原位雜交n定具體實例中，本發明之方法包含產生乳癌之基因表現特徵及比較乳癌之基因表料徵與一或多個參考基因表現特徵（例如正常非癌性樣 :之基因表現特徵’·乳癌分子次型之標準或典型基因表現特徵）以確定乳癌之分子次型。可知用用於獲得基因表現特徵之各種熟知方法。舉例 ^言’可建構寡核苦酸於微晶片形式（例如基因晶片、微列）中之文庫以含有對一組基因（例如來自一或多個本文所述之分子次型特徵之基因）具有特異性之一組探針寡 63 201132813 去氧核苷酸。舉例而言，適當長度之探針寡核苷酸可在位置C0經5’-胺修飾且使用市售微陣列系統（例如 GeneMachine 〇mniGrid™ 1〇〇微陣列點樣器及 Amersham

CodeLink™活化載片）轉印。藉由使用經標記引子反轉錄目標RNA來製備對應於目標RNA之經標記cDNA寡聚物。在第一股合成之後，使RNA/DNA雜交體變性以降解RNA模板。接著在雜交條件下，例如25t下6xSSpE/3〇%曱醯胺持續18小時’接著在37t下於〇 75χΤΝΤ中洗滌4〇分鐘使由此製備之經標記目標cDNA與微陣列晶片雜交。在陣列上經固定探針DNA識別樣品中互補目標cDNA之位置處發生雜交。經標記目標cDNA標記陣列上發生結合之精確位置，從而使得可自動偵測及定量。輸出由一列雜交事件組成，指示患者樣品中特定cDNA序列之相對豐度及因此相應基因產物之相對豐度。根據一具體實例，經標記cDna募聚物為自經生物素標記之引子製備的經生物素標記cDna。微陣列接著藉由使用例如抗生蛋白鏈菌素（） -Alexa647結合物直接偵測含生物素轉錄物加以處理，且利用習知掃描方法進行掃描。陣列上各點之影像強度與患者樣品中相應基因產物之豐度成正比。在特定具體實例中，使用AFFYMETRIX™微陣列，諸如外顯子 1.〇 ST、基因 ίο ST、u 95、U133、U133A 2〇或 U1 33 P1US 2.〇微陣列測定基因表現量。在更特定具體實例中’微陣列為 AFFYMETRIX™ U133A 2·〇或 Ul33 plus 2 〇陣列。 64 201132813 使用基因晶片或微陣列’來自個體之樣品個 RNA轉錄物的表現量可藉由油η 、目该個體樣品提取RNA (例如總RNA)，自樣品反轉錄rna g, 〇 0 ^ ^ 生組目標养去氧核苷酉夂且使目才示养去氧核苷酸與基 ..„ .^ '、暴因日日片或微陣列上之探針寡去乳核音酸雜交以產生基因表决制〜± 特徵（亦稱為雜交特徵） ,、疋。土因表現特徵包含由來自樣品之目標寡去氧核苦 :與微陣列上基因特異性探針寡核㈣結的徵可記錄為存在或不存在結合（信號對零信號）：二也，§己錄之特徵包括各雜交之信號強度。可使用適者凟算法（例如統計演算法）田 ^ 异幻5子估基因在陣列或基因晶片上之表現。適用於評估使用微陣的軟體應用在此項技術中為已：：因：片之基因表現量仅何T為已知的。在一特定具體實例中，使用Affymetrix微陣列分#矣杜, 或DNA晶片分析器（dCh析套件（MAS)5.0軟體及/ 現。 W 1P)軟體砰估微陣列上之基因表因表現特徵或雜交特徵充當為樣品狀態所特有才曰，次。亦即乳癌組織可區内，可區八尤门、㈣正常組織，且在乳癌組織 °°刀不同/刀子次型（例如第Ϊ-第VU子次型）。在号癌組織中相對於在正常組別之6種乳癌分子次型中差 j見以及在本文鐵擇用於個體之有效及,二! 的鑑別可用於選 ,有效及/或最佳治療攝生法。舉例而言，可坪估特疋治療攝生法（例 . 確疋化學治療樂物是否起改良寻疋患者中之長期預後較串者揭4 交的作用）。類似地，診斷可藉由比車〜者樣叩與已知表現特徵來進行或確認。此外，此等基 65 201132813 因表現特徵（或個別基因）允許篩檢抑制乳癌表現特使不良預後特徵轉變成較佳預後特徵之藥物候選者。/ 乳癌樣品之基因表現特徵可與對照或參考特徵較以確定測試樣品中的乳癌之分子次型。在— 中，對照或參考特徵為自一或多個正常（例如非癌性'非惡性）樣品，諸如正常乳房組織樣品獲得之基因表現特徵。藉由比較礼癌樣品之基因表現特徵與正常對照樣品之基因表現特徵般技術者可輕易鑑別相對於正常樣品，哪此基因在乳癌樣品中差異表現（例如上調、下調）。―旦別出相對於正常樣品在乳癌樣品中差異表現之基因，即藉由比較乳癌樣品中差異表現之基因與本文（表2_7)所述之一或多個分子次型特徵來確定乳癌之分子次型。最緊密匹配乳癌樣α口中之差異表現之基因的分子次型特徵對應於乳癌樣品之分子次型。在另-具體實例中，對照或參考特徵為自屬於本文所述6種乳癌分子次型之-的一或多個樣品獲得的基因表現 =徵。較佳地’對照或參考特徵為本文所豸6種乳癌分子次型之-的典型或平均基因表現特徵（例如自特定乳癌分子次型之若干代表性樣品獲得之基因表現特徵）。實質上與特定分子次型之對照或參考基因表現特徵類似之乳癌樣品的基因表現特徵指示樣品中之乳癌具有與對照或參考特徵相同之分子㈣。因此，藉自比較乳癌樣品之基因表現特徵與特定分子次型之對照或參考基因表現特徵，一般技奸者可輕易確定樣品中之乳癌是否屬於對照或參考特徵之 66 201132813 分子次型.。用於量測基因在樣品中之表現之其他熟知技術包括例如北方墨點分析、RT_PCR、原位雜交。此等技術亦可用於本發明之方法中來確定乳癌之分子次型。舉例而言，至少一種基因產物之含量可使用北方墨點分析偵測。對於北方墨點刀析，可藉由在核酸提取緩衝液存在下進行均質化，隨後進行離心而自細胞純化總細胞RNA。使核酸沈澱，且藉由用DNase處理及沈澱來移除DNA。RNA分子接著根據標準技術藉由在瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳加以分離，且轉移至硝化纖維素據紙中。RNA接著藉由加熱以在渡紙上。使用與所討論之RNA互補之經適當標記的DNA或RNA 探針偵測及定量特定RNA。參見例如胸⑽— Μ/, j. Sambr〇〇k 等人編，第 2 版，c〇id Spring Harbor Lab〇ratory Press，1989，第 7 章，其整個揭示内容以引用的方式併入本文中。適用於北方墨點雜交之探針包括與RNA (例如mRNA ) 之核苦酸序列及/或CNS之基因之cDNA㈣互補的核酸探針。製備經標記DNA及RNA探針之方法、及該等探針與目標核苦酸序列雜交之條件描述於M〇/」 Μ㈣μ/, Sambr〇〇k 等人編第 2 版，c〇id

Spring Harbor Laboratory press，1989，第 1〇章及第 n 章中，其揭示内容以引用的方式併入本文中。舉例而言，核酸探針可經例如放射性核種，諸如3h、32p、33p、"c戍; 重金屬；或能夠充當經標記配位體（例如生物素、抗生蛋 67 201132813 白（avidin )或抗體）之特定結合對成員之配位體、螢光分子、化學發光分子、酶或其類似物標記。探針可藉由Rigby 等人.（1977)，J.施/.細/. 1 13:237-251 之切口平移（nick translation)法或 Fienberg 等人（1983)，心以扒所 132.6-13之隨機引發（rand〇m priming)法經標記以達到高比活性，以上文獻之整個揭示内容以引用的方式併入本文中。後者為所選用於自單股DNA或自RNA模板合成高比活性之經32P標記探針的方法。舉例而言，藉由根據切口平移法用高度放射性核苷酸置換先前存在之核苷酸，有可能製備比活性大大超過1〇8 cpm//tzg之經3>標記核酸探針。可接著藉由將經雜交濾紙暴露於照相軟片令自動放射線照相偵測雜交。對經雜交濾紙所暴露之照相軟片進行光密度掃描準確量測基因轉錄物含量。使用另—方法，基因轉^ 物含量可由電腦化成像系統，諸如可由購自Amersham Biosciences，PiScataway，NJ 之分子動力學 4〇〇 b 2D 磷光體成像器（Phosphorimager)定量。當用放射性核種標記DNA或RNA探針不實用時，隨機引子法可用於將類似物，例如dTTp類似物三磷酸 5-(N-(N-生物素基-ε _胺基己醯基）·3_胺基烯丙基）去氧尿苷併入探針分子中。經生物素標記之探針寡核苷酸可藉由與偶聯至產生顯色反應之螢光染料或酶之生物素結合蛋白，諸如抗生蛋白、抗生蛋白鏈菌素及抗體（例如抗生物素抗體）反應加以偵測。 RNA轉錄物之含量亦可使用原位雜交技術達成。此技 68 201132813 術需要之細胞少於北方墨點技術，且涉及沈積全部細胞於顯微鏡蓋玻片上及用含有放射性或另外經標記之核酸（例如cDNA或RNA)探針的溶液探測細胞核酸含量❶此技術極其適用於分析個體組織生檢樣品。原位雜交技術之實務更詳細插述於美國專利第5,427,9 16號中，其整個揭示内容以引用的方式併入本文中。適用於既定基因產物之原位雜父之探針可例如自本文所述之CNS基因之RNA產物的核酸序列產生。

個體樣品中核酸（例如mRNA轉錄物）的含量亦可使用任何標準核酸擴增技術，諸如聚合酶鏈反應（PCR )(例如直接PCR、定量即時pCR ( qRT pCR)、反轉錄酶pCR (RT-PCR))、連接酶鏈反應、自持序列複製（“π⑽咖化以 sequence rephcati〇n )、轉錄擴增系統、Q·万複製酶或其類似技術評估，且例如藉由在擴增、暴露於嵌入化合物/染料、探針等期間對核酸進行標記加以觀測。在—特定具體實例中藉由基因轉錄物（例如mRNA )之反轉錄，隨後藉由聚合酶鏈反應（例如RT_PCR)擴增反轉錄產物來敎樣品中土因轉錄物的相對數量。基因轉錄物之含量可相較於内標準’例如存在於同-樣品中之「管家（h_ekeeping )、」基 RNA的含量加以定量。適合用作内標準之「管家」 2包括例如肌凝蛋白或甘油酿_3鱗酸去氫酶（⑺醜）。疋里RT PCR及其變化形式之方法在此項技術♦之技能内。在-特定具體實例中，本文所述之任何55種腫瘤特異性基因之⑽轉錄物的片段（參見圖4)可在個體之血液 69 201132813 (例如血漿）或其他身體流體（例如血液或含有癌細胞之其他體液）中得以鑑別且例如如由Palaci〇s g，等人，〜

乂 A/W. 991-998 (2008)所述，藉由進行反轉錄、pcR 及平行定序加以；t量。任何RNA片段之_致性可藉由將其序=與55種腫瘤特異性基因之序列之_進行匹配來 =定。55種腫瘤特異性基因之咖片段亦可根據在來自樣品之所有定序PCR片段中偵測到具有來自55種腫瘤特異性基因中之特定DNA序列之片段的頻率加以定量。此方法可 :於筛檢及鑑別癌細胞陽性個體。或者，個體血液或生物流體樣品中任何55種腫瘤特異性基因之rna轉錄物片段的-致性可經確定且例如藉由進行舰片段之反轉錄，隨後PCR擴增且使PCR產物與陣列（例如微陣列、基因晶片）雜交來定量。 30 用於量測基因在樣品中之表現之其他技術亦為熟習此項技術者所知，且包括用於量測RNA轉錄及降解速率之各種技術。或者，基因在樣品中之表現量可藉由評估該基因所編碼之蛋白質含量來測定。偵測基因之蛋白質產物之方法包括例如免疫及免疫化學法’諸如流動式細胞測量術（例如 FACS分析）、酶聯免疫吸附檢定（eusa)、化學發光檢疋放射免疫檢疋、免疫墨點（例如西方墨點法）、免疫組織化學（IHC)及質譜。例如，基因之蛋白質產物之抗體可用於直接或例如使用免疫組織化學（IHC )間接確定蛋白質在樣品中之存在及/或表現量。舉例而言，石蠟切片可取 70 201132813 自生檢，固定於載片上且藉由適合方法與一或多種抗體組合0 確定患有乳癌之患者之預後的方法如本文所述’亦已發現某些乳癌分子次型與患者預後 (例如存活、轉移/遠處轉移風險）之間存在關聯（參見例如實施例2 )。詳言之，第π分子次型乳癌與遠處轉移之最高風險及不良存活前景相關，隨後為第IV分子次型乳癌。第III及第VI分子次型乳癌與遠處轉移之中等風險及中等存活前景相關。相反，第ν分子次型乳癌與遠處轉移之低風險及更有利之存活前景相關。因此，患有乳癌的個體之預後可藉由根據本文所述之分子次型之一對乳癌分類加以確定。在特定具體實例中，個體中的乳癌根據由本發明提供之任何方法加以分類且預後係基於乳癌之分類，其中預後係針對選自轉移風險、τ階段、ΤΝΜ階段、無轉移存活及總存活的一或多種臨床指標而言。治療方法在一具體實例中’本發明係關於治療個體中的乳癌之方法’其包含確定該個體中的乳癌之分子次型及向該個體投予有效治療該分子次型乳癌的療法。本文所述用於確定個體中的乳癌之分子次型的方法可用於本文所述之治療方法中。在一特定具體實例中，個體中的乳癌之分子次型為第j 分子次型乳癌且向個體投予有效治療第^分子次型乳癌之 71 201132813 療法。有效治療第i分子次型乳癌之療法包括例如包括至少一種輔助療法的療法。例示性辅助療法尤其包括輔助化學療法（例如他莫昔芬（tamoxifen) '順鉑（cispiatin)、絲裂黴素（mitomycin) 、5-氟尿嘧啶（5_nu〇r〇uracil)、小紅莓（d〇XOrubicin )、索拉非尼（s〇rafenib )、奥曲肽 (octreotide)、達卡巴嗪（DTIC)、順鉑（Cis piatinum)、西咪替丁（cimetidine)、環磷醯胺（cyci〇ph〇phamide))、佐劑放射療法（例如質子束療法）、佐劑激素療法（例如 k雌激素療法、雄激素去除療法（adt)、促黃體激素釋放激素（luteinizing horm〇ne.releasing h〇rm_，lh r幻促效劑、芳香酶抑制劑（AI，諸如安美賴（㈣价❶識）、依西美坦（exemestane)、來曲4(let_ie))、雕激素受體調㈣（例如他莫昔芬、雷諾昔酴（心价咖）、托瑞米芬（⑹―））、及佐劑生物療法。在-特定具體貫例中，輔助療法為輔助化學療法。在臨床低風險患者4 腫瘤尺寸小於或等於T2及陽性結節數小於或等於3之患中用於第1刀子次型乳癌之輔助化學療法較佳在強度面與標準甲胺喋呤化學療法〔rMF )笼分又瘤望"认療法（）專效。在定義為腫、、冋；丁2及陽性結節數高於N2之臨床高風險患者用於第I i子次型乳癌之輔助化學療法較: 商於標準甲胺化學療法。 *強度方面分子實例中，個財的乳癌之分子次型為第η 療：…L癌且向個體投予有效治療第η分子次型療法。有效治療第π分子次型乳癌之療法 ::之 72 201132813 或多種HER2/EGFR信號傳導路徑拮抗劑、高強度化學療法及劑量密集化學療法。適用於第Η分子次型乳癌療法之 HER2/EGFR彳s 5虎傳導路徑拮抗劑包括拉帕替尼（) (Tykerb®)及曲妥珠單抗（trastuzurnab) (Herceptin®)。在特定具體實例中，向個體投予HER2/EGFR信號傳導路徑拮抗劑。在更特定具體實例中，乳癌過度表現HER2。在一些具體實例中，向個體投予辅助化學療法。在更特定具體實例中’辅助化學療法包含曱胺喋呤。在更特定· 具體實例中，在確定乳癌之分子次型之前，個體為接受包含一或多種蒽環黴素之輔助化學療法的候選者（舉例而言，諸如使用用於推薦輔助療法之先前標準準則確定之候選者）且在確定分子次型之後’不投予蒽環黴素。在更特定具體實例中，乳癌確定為第I、第Π、第ΠΙ、第V或第 VI分子次型且在更特定具體實例中，乳癌為第1分子次型。在另一具體實例中，個體中的乳癌之分子次型為第IV 分子次型乳癌且向個體投予有效治療第IV分子次型乳癌之療法。有效治療第IV分子次型乳癌之療法包括例如抗雌激素療法，諸如包含投予至少一種蒽環黴素化合物之輔助化學療法。適用於第IV分子次型乳癌療法之蒽環黴素化合物包括小紅莓（Adriamycin® )、表柔比星（epirubicin ) (Ellence® )、道諾徽素（daunomycin )及黃妒素 (idarubicin )。在一特定具體實例中，第iv分子次型乳癌療法包括包含投予小紅莓（Adriamycin® )之辅助化學療法。第IV分子次型乳癌對含曱胺喋呤化學療法不充分反 73 201132813 應’其不應該用於治療第ιν分子次型乳癌。因此，在—些具體貫例中’在4定乳癌之为子··人型之前，個體為包含投予甲胺喋呤而非蒽環黴素之療法之候選者，但在綠定分子次型之後，個體為接受蒽環黴素之候選者。在其他具體實例中’在確定分子次型之前’個體為接受HER2/EGFR信號傳導路徑拮抗劑之候選者’但在確定分子次型之後，個體不為HER2/EGFR信號傳導路徑拮抗劑之候選者。在更特定具體實例中，乳癌過度表現HER2且在更特定具體實例中在確定乳癌分子次型之前已知其HER2表型。在另一具體實例中’個體中的乳癌之分子次型為第v 分子次型乳癌且向個體投予有效治療第V分子次型乳癌之療法。有效治療第V分子次型乳癌之療法包括例如抗雌激素療法。較佳地’當乳癌為處於早期時（亦即腫瘤尺寸^ 於或等於T2及陽性結節數小於或等於3 )，療法不包括辅助化學療法。適用於治療第V分子次型乳癌之抗雌激素療法包括使體内激素雌激素之量降低之療法（例如投予芳香酶抑制劑）或阻斷雌激素對乳癌細胞之作用之療法（例如投予他莫昔芬）。典型地，用於第V分子次型乳癌療法之抗雌激素療法包括投予一或多種抗雌激素劑。用於本發明之方法之例示性抗雌激素劑包括（但不限於）抗雌激素化合物（例如吲哚衍生物，諸如吲哚并咔唑（ICZ ))、芳香酶抑制劑（例如Arimidex® (化學名稱：安美達錠）' Aromasin® (化學名稱：依西美坦）、Femara⑧（化學名稱：來曲唑））；選擇性雌激素受體調節劑（SERM )(例如 74 201132813 N〇lvadex⑧（化學名稱：他莫昔芬）、⑧（化學名稱. 雷諾昔齡）、化如⑽⑧（化學名稱）：托瑞米芬）.㈣激素受體下調劑（ERD)(例如F —⑧（化學名稱）：氟維司群（fulvestrant))。在另一具體實例中，個體中的乳癌之分子次型為第ΠΙ 刀子-人型或第VI &子次型乳癌且向個體投予有效治療第

111或第VI分子次型乳癌之療法。有效治療第m或第VI 分子次型乳癌之療法包括例如包括抗雌激素療法（諸如本文所述之抗雌激素療法）之療法。 …在某些具體實例中，由本發明提供之治療方法包括確疋個體之免疫反疯辞AA it- 應冲刀的步驟。在更特定具體實例中，個體中的乳癌為第ϊ分子次型啖第11分子次型。在更特定具體貫例中，個體中的穿丨：鹿& 〒的礼癌為第1分子次型或第II分子次创且個體具有低0、痕 Θ\ ^ •免疫反應 < ”。在更特定具體實例巾，個體中的乳癌為第I分子次型哎第生及第II为子次型，個體具有疫反應計分且投予及/戋開呈卩 I、 /、虿低免丁及開具（prescribe )諸如化學療法Γ諾如一或多種苜頊徽去、+从予席次、》t 一滅素）之輔助療法。在其他具體實例中，本發明提供確定個驴且古丄A 例中，免疫反應計分且投予侵襲性較小之》CT療過程的方法。有效用於既定乳癌分子次型之療法典型地包法（例如作為療法要療 ^ ^ 次口療攝生法中之主要治療劑，諸如丰術或放射線瘃沬、.βW居如手療劑與療法或户瘆摄斗本由 U作為種治、、A 。％、攝法中之另一治療劑一起使用，其中 /〇療Μ之組合提供所要户洛· Γ 一所要/〇療，輔助療法」亦稱為「附屬 75 201132813 瀠沄）。在一些具體實例中，有效用於既定乳癌分子次型之療法可包括辅助療法（例如在已給予療法或治療攝生法中之主要治療劑之後給予有需要之個體的治療劑）。適合輔助療法包括（但不限於）化學療法（例如他莫昔芬、順鉑、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、小紅莓、索拉非尼、奥曲肽、達卡巴嗪（DTIC )、順鉑、西咪替丁、環磷醯胺）、放射療法（例如質子束療法）、激素療法（例如抗雌激素療法、谁激素去除療法（ADT)、促黃體激素釋放激素（LH_RH) 促效劑、芳香酶抑制劑（AI，諸如安美達錠依西美坦、來曲坐）、雌激素受體調節劑（例如他莫昔芬、雷諾昔酴、 1瑞米芬））、及生物療法。在癌症治療攝生法期間亦可杈予眾多其他療法以減輕疾病作用及/或癌症治療之副作用該等療法包括控制疼痛（麻醉劑、針灸）、胃不適（抗 ^齊！）'眩暈（抗眩暈藥物）、嗯心、（抗。惡心藥物）、感染、（例如增加紅血球/白血球計數之藥物）之療法及其類似療去’所有該等療法皆易於為熟f此項技術者所瞭解。在本發明之方法中，辅助療法可在主要療法，如放射療=及/或手術切除腫瘤之前、之後或與之並行投予。若採種以上輔助療法（例如化學治療劑及靶向治療劑），並.甫助療法可以獨立調配物或聯合調配物形式同時（例如、、仃）共杈予。或者，輔助療法可以獨立組成物形式在熟練臨床醫師所禮定夕、ώ a …、 _ 適备時間範圍（例如足以允許療法之樂作用f叠之時間）（例如癌症治療時間段/間隔，諸如，5至5小時）内依序投予。輔助療法及/或主要療法可以單 76 201132813 (例如抑制腫之順序及時程次劑$或多次劑量按適於達成所要治療作用瘤生長、抑制血管生成及/或抑制癌症轉移）投予。因此，可以單次或多次劑量投予一或多種治療劑。適合劑量及投藥攝生法τ自熟練自床f師確$且視所選藥劑、醫藥調配物及投藥途徑、以及各種患者因素及其他考慮因素而$。欲投予之治療劑之量（例如治療有效量）可由臨床醫師使用本文提供之導則及此項技術中已知之其他方法確定且取決於若干因素，包括例如所選特定藥劑、個體年齡、敏感性、藥物耐受性及總體健康。舉例而言，小分子之適合劑量可為每次治療每公斤體重約〇〇〇ι至約 1〇〇 mg、約 0·01 mg 至約 100 mg、約 0.01 mg 至約 1() mg、約〇·〇1 mg至約1 mg。抗體之適合劑量可為每次治療每公斤體重約0.01 mg至約300 mg且較佳為每次治療每公斤體重約 0.01 mg 至約 1〇〇 mg、約〇〇1 mg 至約 1〇 mg、約 i mg 至約10 mg。當藥劑為多肽（線性多肽、環狀多肽、擬多肽）時’較佳劑量將產生約〇 j从g/mL至約200从g/niL之肽血梁濃度。確定針對特定藥劑、患者及乳癌之劑量完全在熟習此項技術者之能力範圍内。較佳地，劑量不引起不良副作用或產生極小不良副作用（例如免疫原性反應、噁心、眩軍、反月（gastric upset )、黏性過大症候群（hyperviscosity syndromes )、充灰性心臟衰竭、中風、肺水腫）。在一態樣中，向有需要之個體投予有效用於乳癌分子次型之療法以抑制乳癌腫瘤生長或殺死乳癌腫瘤細胞。舉 77 201132813 例而言’通常以達成最有效治療（例如最佳地殺死腫瘤細胞）之特定給藥時程及給藥量投予直接抑制腫瘤生長之藥劑（例如化學治療劑）。一般而言，在相對較短治療期（例如一至數天）期間投予大約最大耐受劑量，繼之以治療停止（〇ff-therapy)期。在一特定實例中，每隔一天以15〇之最大耐受劑量投予化學治療劑環磷醯胺，共計三次劑量第週期後2 1天給予第二週期。（Browder等人.Caw 心5 60:1878-1886, 2000)。可投予有效用於既定乳癌分子次型之療法，例如在第 -週期中，以一次間隔/劑量或以數次密集間隔（數分鐘、數J時冑天）投予大約最大耐受劑量之治凡適合之治療停止期（例如一或多週)之後投予另一二二 :月：治療劑之適合給藥時程及量可輕易由一般熟練臨床醫師確定。相較於化學治療劑，減小特定乾向治療劑之毒性可使投藥週期之間的時問木 ' 縮紐。备用作輔助療法（例如手術、放射療法、其他主要要療去之輔助療法）時，較佳接孰練臨床醫師所確定之更 ‘·、有效/最有效抑制（降低、阻止）乳癌腫瘤生長之給藥時程捞 ? 才又予h療有效量之治療劑。在另一態樣中，可拍法 % ^ $1 ^ ^ Α 律性，·α藥攝生法投予有效用於既：仏子:人型之療法，# 頻繁地投予較低劑量㈤了又I樂更大对受劑#(MTD)對庫2床刖研究已證明’相較於最功效更㈣，抗血管生生法，規律性攝生法之抗腫瘤如骨髓抑更為：更強力且毒性及副作用“列】、（B〇cci等人，Ca/iar及队 78 201132813 (52.6938-6943，（2002) ’ Bocci，等人，proc. 夕仏 7咐22人/29/7-12922,（2003);及 Bert〇lini，等人，Cancer Res， 63(15):4342-4346,（2003))。規律性化學療法似乎有效克服與化學療法相關之一些缺點。有效用於既定乳癌分子次型之療法可作為抗血管生成療法之一部分以規律性給藥攝生法投予以抑制（降低、阻止）有需要之患者中的血管生成。此抗血管生成療法可藉由阻斷向腫瘤供應維持腫瘤生長及使腫瘤轉移所需之養分的新血管形成而間接影響（抑制、降低）腫瘤生長。以此方式使腫瘤缺乏養分及血液供應可最終導致腫瘤細胞死於壞死及/或細胞凋亡。先前研究已指示當更頻繁地投予較低劑量，從而提供抗血管生成劑之連續血液含量時，涉及阻斷血管生成因子（例如VEGF、bFGF、TGF-a、IL-8、PDGF) 或其信號傳導之癌症療法之臨床結果（抑制内皮細胞介導之腫瘤血管生成及腫瘤生長）更有效。（參見Br〇wder等人 n 60:1878·1886, 2000; F〇lkman ;^ — A〇/· 13:159-167, 2003 )。抗血管生成治療攝生法已與血管生成靶向抑制劑（凝血栓蛋白i (thr〇mb〇sp〇ndin丨）及血 J板生長因子-4 ( TNP-47G ))及化學治療劑環填醯胺一起使用。每6天以低於最大耐受劑量之劑量投予τΝρ_47〇，且以170 mg/kg之劑量投予環磷醯胺（同上）^此治療攝生法使得腫瘤完全消退（同上）。實際上，抗血管生成治療劑在與例如直接抑制腫瘤生長之藥劑（例如化學治療劑）的其他抗癌治療劑共同投予時最有效（同上 79 201132813 多種投藥途徑可用於本發明之方法中採用之治療劑， °玄·#投藥途控包括例如經口、局部、經皮、經直腸、非經腸（例如動脈内、靜脈内、肌肉内、皮下注射、皮内注射）、靜脈内輸注及吸入（例如支氣管内、鼻内或經口吸入、鼻内滴劑）之投藥途徑，視藥劑及欲治療之特定乳癌分子次型而定。若有指示，則投藥可為局部投藥或全身性投藥。較佳投藥模式可視所選特定藥劑而變化。在許多情況下，將較佳投予較大速效劑量（l〇ading 之治療劑，接著歷經治療期投予週期性（例如每週）維持劑量。治療劑亦可由緩釋傳遞系統、I及用於連續輸 =其他已知傳遞系統傳遞。可基於㈣治療劑之藥物動干來改變給藥攝生法以提供該特m療劑之所要循環含，此，將計算劑量以便維持所要治療含量。 (肩^劑量及治療攝生法可由熟練醫師在考慮癌症性質者'或轉移性）、腫瘤數目及尺寸、所用其他療法及況下確定。繁於某些乳癌分子次型危急生命 f ’可採用具有顯著副作用之大劑量。本發明之套組本發明亦涵蓋根據本文之癌分類之奈知 ,^ 從刀于次型之一對次型特徵（亦 8月之套組包括能夠偵測本文所述分 “ P第I分子次型特、第111分子次型特徵、第Iv、第11分子次型特徵特徵、第χα八早A〗子次型特徵、第V分子次? 斤V1刀子次型特徵、因之表現量之探針及免疫反應計分）中多㈣集。（例如複數個探針）。舉例而言 80 201132813 套組可包括能夠福4 則本文所述分子次型特徵中大多數基因，例如本文所述分子次。 4 特財約 55%、6G%、65%、70%、 75% ' 80% ^ 85% > 〇0% > 〇«〇/ ,r 9或1〇〇%的基因之表現量之抓針的集合。在一且牌杳/丨丄所、…A , 具體實例中，套組涵蓋能夠偵測本文所述刀子次型特徵中每個母1因之表現量之探針的隼合。在特定具體實例中，由本發尽發月k供之套組包含能夠偵測表1 中約 30%的基因夕矣^ 里之探針的集合。在更特定具體實例中，套組可另外包含能夠偵測表22中約鄕現量之探針的集合。土衣本發明之套組中接用# _ 乂丄 ^ 輙用之探針包括（但不限於）·核酸探針及抗體因此，在—具體實例巾，套組包含與本文所述分子次型特徵中之基因之腿轉錄物（例如⑽财、 hnRNA)肖異性雜交的核酸探針（例如寡核芽酸探針、聚核苦酸4木針）。此等探針能夠與具有互補序列之目標核酸 .經由一或多種類型之化學鍵，通常經由互補驗基經由形成氫鍵進行配對而结人^+ 、口。C亦即雜父）。如本文所用，核酸探針可包括天然（亦即A、G、U、C或τ)或修飾鹼基（7-去氮鳥苦、肌苦等）。此外，核酸探針中之驗基可由除磷酸二酯鍵以外之鍵聯接’只要該鍵不干擾雜交即可。因此，採針可為組成鹼基由肽鍵而非磷酸二酯鍵聯接的肽核酸。進行雜交反應之導則可見於Current Pr〇t〇c<)Is化

Molecular Biology，john wiley & Sons，N.Y. (1989) 6.3.1-6.3.6中’其相關教示以全文引用之方式併入本文十。產生特異性雜交之適合雜交條件視同源區域長度、區域之 81 201132813 GC含量及雜交體之熔融溫度（％」）而變化。因此，雜交條件可在雜交溶液及洗滌液之鹽含量、酸度及溫度方面變化。探針核酸與目標核酸之間涉及❹錯配之互補雜交可藉由降低雜交介質之嚴格性來調節以達成目標核酸之所要谓測。在一特定具體實例中，本發明之套組中之核酸探針能夠在高嚴格性條件下與RNA (例如mRNA)轉錄交。 ^ ，在另-具體實例中，套組包括能夠與本文所述分子次尘特徵中之基因之RNA轉錄物、或相應a财特異性雜交的數對寡料酸引+。此等引子可在任何標準核酸擴增程序（例如聚合酶鍵反應（PCR)，例如RT_pCR、定量即時 PCR)中使用來測定樣品中之RNA轉錄物之含量。如本文所:，術言吾「引子」係指與模板聚核苷酸序列互補且能夠充當合成引子延長產物之起始點的寡核苷酸。在一具體實例中’引子與聚核㈣序列之有義股互補且充#合成正向延長產物之起始點。在另一具體實例+，引子與聚核苷酸序列之反義股互補且充當合成反向延長產物之起始點。引子可如於經純化限制消化物中天然存在，或合成產生。引子之適當長度視引子之預定用途而定，但典型地在約5至約200 ; @ 5至約100 約5至、約75 ;約5至約50 ;約1〇至約35 ;約18至約22個核苷酸之範圍内。引子無需反映模板之精確序列但必須充分互補以與用於發生引子伸長之模板雜交’亦即引子與模板聚核苷酸序列充分互補以使引子將在允許引子延伸之條件下與模板黏接。 82 201132813 在另一具體實施中，本發明之套組包括特異性結合由本文所述分子次型特徵中之基因編碼之蛋白質的抗體。此等抗體探針可為多株抗體、單株抗體、人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體 '靈長類化抗體、鑲飾（veneered)抗體或單鏈抗體以及抗體片段（例如Fv、Fc、Fd、Fab、Fab1、F(ab，）、 scFv、scFab、dAb)。（參見例如 Harl〇w 等人，心⑽^·^ A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 )。特異性結合由本文所述分子次型特徵中之基因編碼之.蛋白質的抗體可藉由習知方法或其他適合技術（參見例如 Kohler 等人，495-497 (1975)及 /. /關m«o/· 6.. 5 1 1-5 19 (1976); Milstein 等人，心，㈣之认· 550-552 "977厂 Koprowski 等人，美國專利第 4，172，124 號；Harlow, E.及 D. Lane，1988，J 少

Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring ΙΗτ\)〇τ，NY) ’，Current Protocols In Molecular Biology，第 2 卷（增刊 27，’94夏季），入1181^1，[.]\4.等人編，（>1〇1111\^^&

Sons:NewY〇rk，NY)，第 11 章，（i991);Chuntharapai 等人， */· /mmwno/, 152:1783- 1789 (1994) ; Chuntharapai 等人美國專利第5,440,021號））產生、構築、工程改造及/或分離。可使用適於產生或分離具有必需特異性之抗體的其他方法’包括例如自文庫（例如噬菌體呈現文庫）選擇重組抗體或抗體結合片段（例如dAb )之方法或依賴於轉殖基因動物（例如小鼠）之免疫之方法。能夠產生人類抗體譜系之轉殖基因動物在此項技術中為熟知的（例如Xenoniouse® 83 201132813 (Abgenix，Fremont，CA))且可使用適合方法產生（參見例如 Jakobovits 等人 _，/Voc. JcW. 5W. [/U，列·. 2551-2555 (1993) ; Jakobovits 等人·，255-258 (1993) ; Lonberg 等人，美國專利第 5,545,8〇6 號；Surani 等人，美國專利第5,545,807號；Lonberg等人，WO 97/1 3852 )。對由本文所述分子次型特徵中之基因編碼之蛋白質具有特異性的抗體一旦產生，即可輕易使用此項技術中熟知之用於篩檢及分離特異性抗體的方法鑑別。參見例如Paul (編），Fundamental Immunology, Raven press, 1993 ; Getzoff 等人·，Adv. in Immunol. 43:1-98，1988 ; Goding (編）， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic

Press 有限公司，1996 ; Benjamin 等人·，Ann. Rev. Immunol. 2:67-101，1984。多種檢定可用於偵測特異性結合由本文所述CNS基因編碼之蛋白質之抗體。例示性檢定詳細描述於

Antibodies: A Laboratory Manual，Harlow 及 Lane (編），Cold

Spring Harbor Laboratory Press, 1988 中。此等檢定之代表性實例包括：並行免疫電泳、放射免疫檢定、放射免疫沈澱、酶聯免疫吸附檢定（ELIS A )'點潰墨點（dot blot ) 檢疋或西方墨點檢定、抑制檢定或競爭檢定及夾心式 (sandwich )檢定。本發明之套組中之探針可與一或多種標記（例如可债測標記）結合。用於探針之眾多適合可偵測標記在此項技術中為已知的且包括本文所述之任何標記。適用於本發明 84 201132813 之方法中之可偵測標記包衽Γ 匕栝（但不限於）發色團、螢光團、半抗原、放射性核種（例如3Η、125卜⑴卜32ρ、、Μ 丨 4c、51Cl*、36C卜 57C〇、58C 59 、 S、

Fe及 Se)、螢光淬滅劑、酶、酶受質、親和力標t (例如生物素、抗生蛋白、抗生蛋白鏈菌素等）、質量標籤（她⑽）、電泳標籤：由抗體識別之抗原決定基標籤（例如洋地黃毒苷 (dlg〇Xlgenin，DIG )、血球凝集素（，ha )、 myc、FLAG )。在某些具體實例中，標記存在於核酸探針之嘧啶鹼基之5碳位置或嘌呤鹼基之3碳去氮位置上。在一特定具體實例中，與探針結合之標記為螢光團。適合螢光團可以螢光染料形式提供，該等螢光染料包括（但不限於）Alexa Fluor•染料（Alexa Fluor 350、Alexa Flu〇r 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、 Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660 及 Alexa

Fluor 680 )、AMCA、AMCA-S、BODIPY 染料（BODIPY FL、

BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY

530/550 ' BODIPY 558/568 > BODIPY 564/570 > BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665 ) 、CAL 染料、叛基若丹明 6G ( Carboxyrhodamine 6G)、羧基-X-若丹明（ROX)、級聯藍（Cascade Blue)、級聯黃（Cascade Yellow)、花青染料（Cy3、Cy5、Cy3 · 5、 Cy5.5 )、丹續醯（Dansyl)、Dapoxyl、二烧基胺基香豆素 (Dialkylaminocoumarin ) 、4'，5’-二氣- 2'，7'-二甲氧基榮光素、DM-NERF、伊紅（Eosin)、藻紅（Erythrosin)、螢 85 201132813 光素、羧基-螢光素（FAM)、羥香豆素（Hydroxycoumarin)、紅外染料（IRDye ) ( IRD40、IRD 700、IRD 800 )、JOE、麗絲胺若丹明B、港灣藍（Marina Blue)、甲氧基香豆素 (Meth0XyC0umarin )、萘甲醯螢光素（Naphth〇flu〇rescein )、俄勒岡綠488 ( Oregon Green 488 )、俄勒岡綠500 '俄勒岡綠514、玉色染料（〇yster dye)'太平洋藍（pacific Blue) PyMPO、芘（Pyrene )、若丹明6G、若丹明綠若丹明紅對甲氨基紛（Rhodol Green) 、2，，4，，5’，7，-四-演砜_螢光素、四甲基-若丹明（tmr)、羧基四甲基若丹明（tamra)、德克薩斯紅（Texas Red)及德克薩斯紅-Χ。亦可使用諸如152Eu或其他鑭系元素之螢光發射金屬標記探針。可使用金屬螯合基使此等金屬與抗體分子連接，該等金屬螯合基為諸如二伸乙三胺五乙酸（DTpA)、四氮雜-環十二烷_四乙酸（D〇TA)或乙二胺四乙酸（edta)。除以上提及之各種可偵測部分外，本發明之套組中之探針亦可與可直接與核酸探針連接之其他類型的標記，諸如可光譜解析之量子點、金屬奈米粒子或奈米簇等結合。如上文所提及，引貞測部分無需自身可直接偵測。舉例而言，其可作用於經仙之受質，或其可需要修飾以偵測。對於活體内偵測，探針可直接或藉由使用中介官能基與放射性核種結合。常用於使以金屬陽離子形式存在之放射性同位素與抗體結合之中介基團為二伸乙三胺五乙酸 (DTPA)或四氮雜·環十二烷_四乙酸（d〇ta)。以此方： 86 201132813 結合之金屬陽離子之典型實例為"Tc、、⑴In、⑴卜 ”Ru、67Cu、67Ga 及、a。、此外，可用包括順磁性原子之NMR成像劑標記探針。使用NMR成像劑允許使用NMR技術於活體内診斷患者中癌症之存在及程度。以此方式尤其適用之元素為157Gd、 55Mn、162Dy、52Cr 及 56Fe。舉例而5，若可偵測標記為放射性T發射體，則經標記探針之偵測可由閃爍計數器實現；或舉例而言若標記為螢光物質，則由螢光計實現。在酶標記之情況下，偵測可藉由採用該酶之受質的比色法實現。亦可藉由目測比較受質之酶促反應程度與類似製備之標準物的酶促反應程度來偵測》例證材料及方法以下材料及方法用於本文提供之實施例丨_8中。患者及樣品：鑑別在1991年與2003年之間在辜公亮基金會孫逸仙治癌中心（Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Center， KFSYSCC )已經診斷、治療及追蹤乳癌進展且使其新鮮乳癌組織在機構腫瘤庫冷凍於液氮中的患者。排除在 KFSYSCC追賴料到3年之患者，在接受初始治療:後 3年内死亡之患者除外。研究由機構審查委員會核準。隨機選擇存放在腫瘤庫中之樣品。總共447個病例可用。自研 87 201132813 究排除RNA不足（㈣）、RNA品質不良（n=u6)或不可為微陣列接受（則8)之樣品，從而剩餘312個可用隨機樣品（組_ι)。在t 在1999年與2004年之間收集之其 Β個乳腺小葉癌的基、他 U表現特徵亦包括在研究中（組2)。因此，樣品總數為327。組 1 ( n=3 12 )及細〇 , 性概述於表8中。組、4^15)中327名患者之臨床特矣、所有312個樣品皆隨機選擇且补表-般性乳癌群體。組2之… 迈稷選擇且代癌之患者。因此，大多數串去個樣品為組織學診斷有小葉嗣受體（PR)陽性（表8)Γ因者=激素受體⑽及助孕所以組2之i 5名患者中^ 1為乳癌傾向於較佳分化， (表8)。。級患者較少且_陽性較少上二^究中包括之患者之臨床特性

診斷時之年齡 TNM階段陽性淋巴結數目核級 <50歲 >=50 歲在1997之前在1997之後 197 115 125 187 63% 37% 40% 60% 6 9 0 15 40% 60% 0% 100% Ι + Π ιπ + ιν 220 89 71% 29% 11 4 73% 27% 0 1-3 4-9 >=10 131 83 58 35 42% 27% 19% 11% 5 5 3 2 33% 33% 20% 13% I Π ΙΠ 23 68 196 7% 22% 63% 8 7 0 53% 47% 0% 88 201132813 ER狀態* ER+ 190 61% 14 93% ER- 122 39% 1 7% HER2狀態* HER2+ 74 24% 1 7% HER2- 238 76% 14 93% PR狀態* PR+ 244 78% 14 93% PR- 68 22% 1 7% 治療新輔助化學療法 31 10% 0 0% 輔助化學療法 220 71% 12 80% 放射療法 133 11% 8 53% 激素Rx 210 67% 14 93% 無化學療法 50 16% 3 20% :根據微陣列資料確定ER、HER2及PR狀態。 mRNA轉錄物特徵分析研究：根據製造商說明書使用 Trizol®試劑（Invitrogen， Carlsbad, CA )自冷凍新鮮腫瘤組織分離總RNA。使用 RNeasy®小型（Mini)套組（Qiagen, Valencia, CA)進一步純化分離之RNA，且藉由使用 RNA 6000 Nano套組及 Agilent 2100 生物分析儀（Agilent Technologies, Waldbronn， Germany )評估品質。用於基因表現特徵分析之所有RNA 樣品皆具有7.85±0.99 (平均值土SD)之RNA完整性指數 (RIN )。根據陣列製造商之方案（Affymetrix )自總RNA 製備雜交目標且與Affymetrix人類基因組U133 Plus 2.0陣列雜交。U1 33 Plus 2.0陣列含有針對39,000種以上人類基因之54,675個探針組。Affymetrix單循環目標標記套組用於製備經生物素標記之cRNA片段（雜交目標）。簡言之，每個樣品自5 μ g總RNA合成雙股cDNA。經生物素標記之互補RN A ( cRN A )藉由自cDN A模板試管内轉錄產生。在 89 201132813 雜交之前，純化cRNA且用化學方式片段化。根據製造商方案藉由組合特定量之片段化CRNA、探針陣列對照組、牛血清白蛋白及鯡魚精液DNA製備混合物。在45t：丁在m33 Plus 2.0陣列上使cRNA混合物與寡核苷酸探針雜交“小時。雜交後立即使用EukGE-WS2v5方案使經雜交探針陣列在Affymetrix基因晶片流體台45〇中經受自動洗滌及染色。此後，使用Affymetrix基因晶片掃描器3〇〇〇掃描uu3 Plus 2.0 陣列。按比例調整及正規化微陣列資料：各基因之表現強度使用Affymetdx微陣列分析套件 (MAS) 5.0軟體按比例調整至卿之截尾平均值加以確定。將UU3P2.0陣列上所有人類基因之成比例表現強度轉化成以2 $底之對數且使用分位點正規化（4〇 )加以正規化。分位點正規化之參考標準係使用327個乳癌樣品之微陣列資料產生。選擇用於分類乳癌分子次型之探針組：為了根據基因表現特徵分析確定乳癌分子次型，進行以下5步以選擇用於分類之適當探針組。步驟！：文獻中已報導在人類乳癌中起重要作用之基因鑑別為樞軸基因（n=23)(表9) (41-99)。步驟2··選擇Affymetrix探針組來表示各樞軸基因（表 Γ進目^某一樞軸基因具有1個以上探針組，則根據以下兩個準則選擇代表性探針組：1)探針組應表示312㈣品（組 90 201132813 1 )中之較高強度及較寬範圍；及ii )相同探針組應展示與表示相同基因之大多數其他探針組具有良好線性相關性 (圖 la-lc)。表9 :用於鑑別線性或二次相關基因之樞軸基因基因符號探針組參考文獻 BIRC5 202094—at 41-43 BRCA1 20453l_s_at 44-46 CD24 208650_s_at 47-50 CEACAM 6 203757_s_at 51,52 CENPF 207828_s_at 53 CLDN1 218182_s—at 54, 55 EGFR 201984_s_at 56-58 ERBB2 216836_s_at 18, 20, 59-63 ESR1 205225_at 15, 17, 64 FGFR2 203638_s_at 65,66 FOXA1 204667_at 67-70 FOXC1 1553613_s_at 71,72 F0X01 202723_s_at 73, 74 GRB7 210761_s_at 75 HMGA1 206074—s_at 76-78 MAP3K1 225927_at 79, 80 MKI67 212022_s_at 81-85 PGR 208305_at 86, 87 PRC1 218009_s_at 88, 89 PRKAA1 225984_at 90 PTEN 225363_at 91-94 TOP2A 201292_at 95-97 TOX3 214774_x_at 98,99 步驟3 :在組1之所有312個樣品中，在U133 Plus 2.0 陣列上各柩軸基因之代表性探針組與所有其他探針組之間 91 201132813 進行線性及二次相關。鑑別且選擇展示與各枢軸基因之探針組具有良好比例或反線性（JXIO·1。）或非線性二次相關 (p<10·5)之探針組（圖 2a-2h)。步驟4 :根據以下4個準則進一步選擇鑑別出之探針組：1 )在總共3 12個陣列之至少5個陣列中，所選探針組之正規化表現強度必須>512 ; Π)樣品在1〇%分位點與9〇0/〇分位點之間正規化表現強度的變化倍數必須>4 ;丨丨丨）所有 3 1 2個樣品中某一探針組之正規化表現強度的分佈峰度必須小於零（下文詳述峰度之測定）；iv ) 3 12個樣品之密度函數之一階導數上的峰數目應大於丨（下文詳述峰之確定）。此4個準則用於鑑別可區分不同乳癌次型之高度加強探針組。鑑別出滿足此等準則之1i 44個探針組。步驟5·免疫反應有可能在相同分子次型内之不同個體之間變化。包括免疫反應基因用於次型確定（subtyping ) 可進一步分成主要分子次型及複雜分類。為此，免疫反應基因鑑別為表現與CD19 ( b淋巴細胞之主要標記） (Affymetrix 探針組 m 206398_s_at)及 CD3D (T 淋巴細胞之主要標記）（Affymetrix探針組ID 213539_at)之表現強度線性或二次相關之彼等探針組。此等基因可能與B細胞或T細胞免疫反應相關，且自1，144個所選探針組排除。在排除免疫反應基因之後，獲得總共768個探針組。該768個探針組包括來自通過強度濾紙（步驟4 )之23個樞軸基因％ 8個探針組。不滿足步驟4之強度濾紙之剩餘 15個枢軸基因添加回768個基因。可用於分類乳癌之總探 92 201132813 針組之最終數目為783 (表1)。峰度及峰： :度量測尖峰資料或平坦資料如何與常態分佈相關。曰不具有扁平形分佈之厚尾資料，而大峰度指示具銳峰之輕尾資料（1〇〇)。在此定義下之常態分佈的又<，、此，選擇峰度< 〇之基因，因為其具有較寬分师。〜^來自B —如之R統計套裝中之密度函數（内二置）估計樣品中基因表現之密度曲線。藉由高斯奸 (GaUsslan kernel)使曲線平滑。 =料曲線(^，、…、"峰定義為局部最大值。首先，窗口寬度2k+1，其 ()巧；若對於 < (P-k)而言，^為 yj k、yj_…、.、〜 ::最大值，則(Ά)為峰，且Xj位於峰位置。在實踐中j+: :窗：内有若干最大值’則左側之最大值視為局部最大值。由口内之局部最大值僅在其位於窗口中間時此情況下’ k=25e此等準則用於挑取分佈具有之基因。 Μ上峰用於鑑別乳癌分子次型之聚類分析：對於研究，使用783個所述探針組對組丨及組有327個樣品進行分級聚類分析，從而產生6或8 2中所不同之主要乳癌次型（圖3)。接著使用2步法進"種潛在值聚類分析。使用來自Bi〇c〇nduct〇r之R套裝_平均體（V2.6) 93 201132813 中之内建式内定「k平均值（kmeans)」及「hclust」函數實施2步法。設定平均連接及作為距離矩陣之（1_皮爾生相關係數（Pearson correlation coefficient))用於 k 平均值聚類分析。如下進行2步法：步驟1-對於8之既定k在R軟體中進行k平均值聚類。在k平均值聚類分析之後，1至8之整數聚類標記可分配給各乳癌樣品。使用由R套裝指定之隨機初始組中心重複聚類分析2000次。因此，各樣品具有由對於各樣品呈1至8 整數形式之2000個k平均值聚類標記組成的二級資料集。步驟2-327個乳癌樣品基於各樣品之2,〇〇〇個聚類標記進行分級聚類。此步驟之目的在於獲得基於2000個k平均值聚類結果的穩定乳癌樣品聚類。針對327個乳癌樣品產生之系統樹圖（dendrogram )展示於圖3中。該系統樹圖指示視所選用於分類之節點等級（node level)而定有6或8 種不同乳癌分子次型。接著，使用所選783個探針組及327 個樣品進行單因子分級聚類分析。樣品配置保持與圖3中所示之系統樹圖相同。接著應用由Smolkin及Ghosh ( 101 )提出之方法來評估源於圖3中所示之系統樹圖之6及8個乳癌樣品聚類的穩定性。評估藉由使用對327個樣品及由2000次k平均值分析產生之聚類標記的8〇%隨機取樣進行2〇〇次分級聚類分析來進行。相同組中剩餘病例之一致性計算為平均百分比。6及8個次型聚類之平均一致性分別為93 %及9丨％。計算各樣品之關於一致性及穩定性之傑卡德係數（Jaccard coefficient) 〇 94 201132813 確疋雌激素受體（ER)、助孕酮受體（？11)及HER2陽性之分割點值：為了確定可用於決定乳癌樣品是ER、PR或HER2陽性還龙陰生之基因表現分割點值，產生來自組丨之所有3上2 個樣品之密度曲、線（圖4a_4c)。結果展示雙峰式分佈（陰 I·生對陽1± )。接著應用以下統計法來確定分割點值（C ): 假定X為對樣品之標記觀測到的表現。來自陰性群體及陽性群體之病例t事後機率分別纟示為巧似邮。讓 (切，則判定函數為·· 陽性狀態陰性狀態芸 P(+L·) Η~\χ) -> dl 或 > d 否則，中d為常數。在此病例下，d設定為卜亦即若病例處於 %性群體中之機率大於病例處於陰性群體中之機率，則，病例稱為陽性狀態；否則，該病例稱為陰性狀態。 4 根據貝氏規則（Baj^es rule)， P(k|x) = 7rkP(x 丨 k)/p(x) /rvj 少，j 其中k為+或_，且p(x|k)為觀 —^ l7.J ^耳果群體k ) ’冗k為病例來自群體k(7tk++7tk =1)之先驗機率，為觀測X之邊際機率。 p丨因此，娜: .Μ&ίύ 95 201132813 饭定X遵循具有平均# k及方差办2之常態分佈，其中k 為+或·。可導出分割點c以使判定函數等於：陽性狀態陰性狀態

若;t >C 否則亦即若X小於分割點，則判定病例來自陰性群體；否則，病例來自陽性群體。出於計算目的使先參數化為1/[1+exp(-〇]。新因此，若a>0 則 C = 且若a<〇則 r·- b + -Aac _ ^-----若 a<〇 2a 其中 .焱=纪：- c = ~σΙμ^~2σ1σΐ\-ί+Μ~) 在此病例下，β -、以+、σ 2、％+2及,未知且藉由其最大概似估計式（MLE ) %以估計。使用R套裳軟體（ν2 6 〇 ) 中之内定非線性最小化（nlm )函數（牛頓（Newt〇n )型方法）基於組1中之312個病例導出n +、y、^及f之 MLE。主觀選擇nlm函數之初始點以確保合理解決。此外，確定礼癌樣品之ER ' pR及HER2 (第2型表皮 96 201132813 生長因子受體）狀態。ER、PR 及 HER2 分別由探針組 205225_at、208305_at 及 216836, _s_at表示 0 分割點及參數之估算為：分割點 μ- σ- σ+ τ ER 11.61956 9.3574 1.4737 13.3138 0.8059 -0.4281 Her2 13.26387 11.2639 0.8321 14.432 0.569 1.1612 PR 4.141207 2.9724 0.6992 7.3942 1.6947 -1.3304 參數之用於擬合 MLE之初始點 μ- σ- μ+ σ+ r ER 8 1 14 1 -1 Her2 δ 1 14 1 1 PR 2 1 10 1 1 如上所列之確定ER、PR及HER2狀態之分割點值分別為11.62、4.14及13.26。值為表現強度正規化成以2為底之對數。其他獨立資料集中乳癌樣品之分子次型確定：本文中鑑別出之分類基因用於確定其他獨立資料集中乳癌之次型。對應於此等分類基因之基因首先根據基因符號、Unigene ID及/或Affymetrix探針組m在其他獨立資料集中加以鑑別。接著，應用質心分析（⑽tr〇id⑽力仏） (102)以確定獨立乳癌微陣列資料集中乳癌樣品之次型。此藉由計算各樣品與本文所述6種乳癌分子次型之各質心特徵之間的皮爾生相關性達成。樣品接著分配至具有最大 97 201132813 相關係數之質心次型。舉例而言’ 783個探針組中有473個探針組被鑑別可基於Unigene ID映射至來自荷蘭癌症研究所（the Netherlands Cancer Institute，NKI)之資料集。若分類特徵中之一個探針組映射至NKI微陣列資料集上多個Unigene id，則計算多個Unigene ID之平均強度且用作分類特徵中之彼探針組的相應量測結果。各NKI樣品接著根據質心分析（丨〇2 )分配至6種分子次型之一。統計方法：所有統計分析皆使用SAS/STAT軟體（版本9.^)( SAS Institute公司）及來自Bioconduct〇r之R套裝軟體（v2 6 ) 進行。進行費雪精確檢定以確定分子次型與各種臨床表型之間的統計相關性。藉由蒙地卡羅模擬（M〇nte Cari〇 simulation)估計精確尸值。對數等級檢定（L〇grank ) 用於分析不同分子次型或治療組之間的存活差異。實施例1 .將乳癌分類成6種不同分子次型為了獲得將乳癌分類成不同次型之可靠方法，自文獻中選擇已知在乳癌之發展及生物學中起不同重要作用的23 種基因（表9)。此23種基因稱為「枢軸基因（piv〇tal genes )」。接著，進行統計線性及二次相關性研究以選擇與如本文以上所述之23種樞軸基因中之每一者正相關及負相關的探針組》良好或不良線性及二次相關之實例展示於圖2a-2h中。進一步分析所選探針組之密度分佈的峰度及 98 201132813 峰。此方法係基於如下假設：I示與植轴基因具關性之基因可能與樞軸基因相關，且在密度分佈中且、好相之峰度及1個以上峰之基因可較佳區分不同乳癌次型。< 0 別783個探針組（表υ且用於分類乳癌樣品。 ^ 為了分類乳癌，首先使用所選783個探針組對組1及組2之327個樣品進行分級聚類分析。結果表明可能有6 或8種不同乳癌次型（圖3卜接著使用k=8進行^均值聚類分析。分析重複難次以產生k平均值標記特徵：因此’各樣品具有1至8之2〇〇〇個k平均值標記。接著，用分級聚類分析k平均值標記資料集以產生327個乳癌樣品之系統樹圖（圖3)。接著藉由單因子分級聚類分析對所： 327個樣品之783個探針組之表現強度進行分析，其中乳癌樣品聚類之關係保持與圖3中所示相同。如圖3中所示，基於系統樹圖中之聚類，有6或8種主要乳癌次型。在8種不同次型之分類下，注意到第4及第5-人型、及第7及第8次型在相同節點下（圖3)。第4 與第5次型之間、及第7與第8次型之間的基因表現差異較小。此外，此等次型之間之臨床特性（例如無轉移存活、總存活、TNM階段）的比較不揭示任何顯著差異（表丨〇 )。因此，第4及第5次型合併成一組，且第7及第8次型合併成另一組。此外，應用Smolkin及Ghosh方法（101 )以確定6組分類抑或8組分類更穩定。結果顯示分類成6種分子次型比8種次型之分類稍微更穩定（圖5 )。出於此等原因，選擇6種不同分子次型用於乳癌分類。 99 201132813 表10:第4及第5聚類之間、及第7與第8聚類之間無轉移存活、總存活及腫瘤TNM階段的比較臨床表型 P值第4群集對第5群集第7群集對第8群隼無轉移存活* 0.39 0.69 總存活* 0.46 0.60 總TNM階段** 0.66 0.77 * :對數等級檢定； **費雪精確檢定。如圖6a及6b中所示，783個探針組根據分級聚類分析之系統樹圖聚類成13個不同組。吾人使用精巧路徑分析 (Ingenuity Pathway Analysis)分析此13組之探針組以富集某些生物功能。精巧路徑分析結果揭示用於分類之探^ 組與細胞週期、細胞發育/生長/增殖、細胞至細胞信號轉導、分子輸送及代謝有關（圖6a、6b)。實施例2 :乳癌分子次型與臨床特徵相關為了確定實施例1中鑑別出之6種乳癌分子次型 :有任何獨特臨床特徵，進行乳癌分子次型與不同臨：表之間的-系列相關性研究。究中包括之臨床參數為、時之年齡、病理TNM階段（τ:腫瘤尺寸；n:轉腊斷之陽性淋巴結遠處轉移之存在）瘤巴結之數目、核紉礼癌％性淋態、追蹤隨訪期門㈠厂祕、PR狀態、HER2狀移之發展'及存活狀態。 ’間遠處轉 100 201132813 概述於表11中之結果指示6種分子次型在τ階段、總 Τ土ΝΜ階段、核級、ER陽性、her_2陽性、pR陽性及發生遠處轉移方面具有顯著差異。結果顯示第v及第次型患者具有更多尺寸較小（例如T1階段 < 或=2⑽）之乳癌，而第II、第III及第IV次型患者具有更多尺寸較大（例如 T2 I5白·^或T2階段以上）之乳癌。處於第ιν、第v及第人歪之大夕數患者為雌激素受體（ER)及助孕酮受體（pR) 陽性。值得注意的是，第V次型乳癌患者為100%现及pR 陽性及刚％臟2陰性。相反，所有第卜欠型乳癌患者皆為ER陰性。大多數第π次型乳癌患者為陰性（97% ) 及HER2陽性（76.5%)。第m次型乳癌為ER、pR& HER2 陽性或陰性。帛1V次型乳癌亦具有顯著數目之HER2陽性病例（2 7 /〇 )。此外，第π次型具有發展遠處轉移之較大傾向性（47%) ’隨後為第IV(36%)及第VI(24%)次型。第V次型發展遠處轉移之可能性最小（5% )。藉由卡普蘭-麥爾曲線（Kaplan_Myer pl〇t)及對數等級檢疋進一步比較6種次型之間的無轉移存活及總存活。圖 7a及7b中描述之結果揭示第π次型具有最差無轉移存活及總存活，隨後為第Ιν次型。在所有6種次型中，第v次型具有最佳存活。第〗、第及第VI次型具有中等風險。6 種次型之任何兩者之間之無轉移存活及總存活的統計比較結果概述於表12a及12b中且顯示第π分子次型具有最差存活結果，隨後為第IV分子次型。第j、第ΙΠ及第竹次型具有類似之中等存活結果。第v次型具有最佳存活結果 (圖 7a、7b )。 101 201132813 表11 :乳癌分子次型與臨床表型之相關性。費雪精確檢定用於確定分子次型之間關於各臨床特徵之差異第I次型第II次型第III次型第IV次型第V次型第VI次型費雪精確檢定 Ν =37 Ν=34 Ν=41 Ν =81 Ν=41 Ν =93 Ρ值診斷時之年齡 <50 歲 27 73.0% 16 47.1% 30 73.2% 54 66.7% 22 53.7% 54 58.1% >=50 歲 10 27.0% 18 52.9% 11 26.8% 27 33.3% 19 46.3% 39 41.9% 0.08 T階段 1 8 21.6% 4 11.8% 10 24.4% 16 19.8% 22 53.7% 41 44.1% 2 28 75.7% 23 67.6% 20 48.8% 56 69.1% 17 41.5% 44 47.3% 3 1 2.7% 5 14.7% 7 17.1% 5 6.2% 1 2.4% 7 7.5% 4 0 0.0% 2 5.9% 4 9.8% 4 4.9% 1 2.4% 1 1.1% 2.00Ε-05 N階段 0 20 54.1% 7 20.6% 16 39.0% 31 38.3% 20 48.8% 43 46.2% 1 10 27.0% 10 29.4% 8 19.5% 25 30.9% 12 29.3% 22 23.7% 2 4 10.8% 11 32.4% 11 26.8% 14 17.3% 7 17.1% 16 17.2% 3 3 8.1% 6 17.6% 6 14.6% 11 13.6% 2 4.9% 12 12.9% 0.26 陽性淋巴結 0 20 54.1% 6 17.6% 16 39.0% 31 38.3% 20 48.8% 43 46.2% 1-3 10 27.0% 10 29.4% 8 19.5% 26 32.1% 12 29.3% 22 23.7% 4-9 4 10.8% 11 32.4% 10 24.4% 13 16.0% 7 17.1% 16 17.2% >=10 3 8.1% 5 14.7% 6 14.6% 9 11.1% 2 4.9% 12 12.9% 0.30 Μ階段 0 36 97.3% 33 97.1% 40 97.6% 78 96.3% 41 100.0% 91 97.8% 1 1 2.7% 1 2.9% 1 2.4% 3 3.7% 0 0.0% 2 2.2% 0.94 102 201132813 • TNM階段 I π 6 23 16.2% 62.2% 2 13 5.9% 38.2% 10 24.4% 11 26.8% 9 11.1% 12 46 56.8% 18 29.3% 43.9% 28 36 30.1% 38.7% π 6 16.2% 18 52.9% 19 46.3% 23 28.4% 10 24.4% 27 29.0% IV 1 2.7% 1 2.9% 1 2.4% 3 3.7% 丨0 0.0% 2 2.2% 7.60E-04 核級 1 1 2.7% 0 0.0% 2 4.9% 2 2.5% 9 22.0% 17 18.3% 2 3 8.1% 1 2.9% 4 9.8% 11 13.6% 18 43.9% 38 40.9% 3 30 81.1% 28 82.4% 33 80.5% 62 76.5% 10 24.4% 33 35.5% 0 ER 陽性 0 0.0% 1 2.9% 10 24.4% 70 86.4% 41 100.0% 82 88.2% 陰性 37 100.0% 33 97.1% 31 75.6% 11 13.6% 0 0.0% 11 11.8% 6.31E-51 HER2 陽性 4 10.8% 26 76.5% 18 43.9% 22 27.2% 0 0.0% 5 5.4% 陰性 33 89.2% 8 23.5% 23 56.1% 59 72.8% 41 100.0% 88 94.6% 9.09E-20 PR 陽性 19 51.4% 14 41.2% 23 56.1% 73 90.1% 41 100.0% 88 94.6% 陰性 18 48.6% 20 58.8% 18 43.9% 8 9.9% 0 0.0% 5 5.4% 2.26E-18 局部復發否 31 83.8% 27 79.4% 39 95.1% 68 84.0% 34 82.9% 86 92.5% 是 6 16.2% 4 11.8% 1 2.4% 8 9.9% 3 7.3% 6 6.5% 0.29 區域性復發否 32 86.5% 26 76.5% 37 90.2% 67 82.7% 36 87.8% 84 90.3% 是 2 5.4% 5 14.7% 3 7.3% 6 7.4% 1 2.4% 8 8.6% 0.54 遠距離轉移否 31 83.8% 15* 44.1% 33 80.5% 50* 61.7% 39 95.1% 70* 75.3% 是 6 16.2% 16 47.1% 8 19.5% 29 35.8% 2 4.9% 22 23.7% 2.51E-05 103 201132813 表12a及12b:任何2種分子次型之間無轉移存活（12a) 及總存活（1 2b )之對數等級檢定的p值。結果顯示第II分子次型具有最差存活，隨後為第IV次型（圖7a、7b )。第 I、第III及第VI次型具有中等存活結果（圖7a、7b )。第 V次型具有最佳存活結果（圖7a、7b) 。< 0.05之p值用粗體顯示。兰〇·〇5且< 0.10之p值用斜體字顯示。20.10之 ρ值用正常字體顯示。表1 2 a ·無轉移存活比車父分子次型之間對數等級檢定之P值 II III IV V VI I 0.0072 0.7554 0.0467 0.0910 0.4455 II 0.0081 0.1431 6.434E-06 0.0039 III 0.0727 0.0400 0.6582 IV 0.0003 0.0704 V 0.0094 表12b :總存活比較分子次型之間對數等級檢定之ρ值 II III IV V VI I 0.0062 0.9855 0.1702 0.0947 0.8725 II 0.0066 0.0521 1.607E-05 0.0001 III 0.1534 0.0484 0.6917 IV 0.0009 0.0335 V 0.0778 104 201132813 實施例3 :乳癌分子次型具有獨特分子特徵為了進一步證明6種不同乳癌分子次型之獨特性，選擇已知在乳癌之腫瘤形成及生物學中起重要作用的9種基因：ESR1 ( 15、17、64)、GATA3 ( 104)、TTK ( 105)、 TYMS (106、107)、TOP2A( 95-97 )、DHFR( 1〇8)、 CDC2 ( 109)、CAV1 ( 110)及 MME ( CD1〇) ( m )。製備3 2 7個乳癌樣品根據其分子次型之基因表現強度散佈圖（圖8a-8c)。亦包括40個正常乳房樣品用於比較。結果證明此等9個基因在6種乳癌次型中獨特分佈。為了進一步強調獨特性，使用此等9個基因之表現強度對327個樣品進行根據6種分子次型之單因子分級聚類分析。此外，包括40個正常乳房組織之基因表現資料。結果揭示6種乳癌分子次型具有不同細胞週期/增殖活性。第 1'第II及第IV次型具有細胞週期/增殖特徵基因之高活性。第III次型具有中等程度之活性且第V及第νι次型具有細胞週期/增殖特徵基因之低表現。此等結果說明所有6種不同乳癌次型皆具有獨特分子特性。獨特臨床及分子特徵概述於表丨3中。表1 3 . 6種不同乳癌分子次型之獨特表型之概述

乳癌分子次型 II III

表型特性 I ER狀態低 PR狀態中等低 HER2狀態中等低中等低中等低中等低高中等高 IV V VI 中等向中等中等中等中等低低 105 201132813 高高中等高高高中等高中等最差中等最差高中等中等高中等中等

中等低低不良最佳中等不良最佳中耸

核級轉移風險 τ階段 TjNM階段無轉移存活總存活實施例4 :乳癌分子次型對治療反應不同歷經10年以上之時期收集用於此研究中之乳癌樣品。該時期覆蓋約1997年及1998年化學療法攝生法自cmf(環磷，胺-甲胺喋呤-氟尿嘧啶）療法向CAF (環磷醯胺-阿德力黴素（adriamycin) ·氟尿嘧啶）療法的重大轉換。此研究中之各組提供寶貴機會研究不同乳癌分子次型如何對辅助化學療法攝生法之此變化起不同反應。比較各分子次型中用CMF及CAf輔助療法治療之患者的無轉移存活及總存活。結果揭示對於第IV次型乳癌患者而言，CMF與CAF之間之治療結果極其不同（表14 )。第以次型乳癌之兩個治療組之間的存活曲線指示對於第IV次型礼癌患者而言，曱胺喋呤向阿德力黴素之轉換對無轉移存活及總存活具有顯著影響（圖9a及9b )。當比較各次型之此兩個治療組之患者之間的疾病嚴重性（例如TNM階段、轉移性腫瘤陽性淋巴結之數目及核級）時，未注意到顯著差異，但第IV分子次型乳癌中之N階段（p=〇〇47) 除外（表15 a )。然而，CAF組具有更多N階段=丨之患者且CMF組具有更多N階段=〇之患者（表15b )。儘管存在 106 201132813 • N階段有利於CMF組（更多N階段=0之患者）之事實，但由更多N階段=1之患者組成的CAF組的治療結果更加優越 (圖 9a、9b ) 〇表14 :各乳癌分子次型之用CMF及CAF輔助化學療法治療之患者之間的存活差異患者數目對數等級檢定之p值（CAF對CMF ) 乳癌次型 CAF CMF 無轉移存活總存活 I 10 13 0.823 0.823 II 5 6 0.620 0.757 III 16 4 0.576 0.511 IV 22 17 7.00E-05 0.002 V 12 8 0.414 0.963 VI 22 11 0.226 0.062 表 15a : 各分子次型中用CMF及CAF輔助化學療法治療之患者之間選擇用於量度疾病嚴重性的臨床參數之比較（表 14)。費雪精確檢定之P值分子次型 T階段 N階段總TNM階段陽性淋巴結核級 I 0.379 0.169 0.162 0.169 0.479 II 0.455 0.546 0.303 0.546 1.000 III 0.610 0.625 1.000 0.625 0.718 IV 0.612 0.047 0.109 0.067 0.703 V 1.000 0.418 0.666 0.418 0.666 VI 1.000 0.326 0.594 0.546 0.172 107 201132813 藉由費雪精確檢定比較各分子次型中兩個治療組的各臨床參數且P值概述於表中β根據2002 AJCC癌症分期手冊（2002 AJCC Cancer Staging Manual )破定 ΤΝΜ 階段。無患者在診斷時具有遠處轉移。結果指示兩個治療組（cmf 對CAF )乏間的疾病嚴重性十分類似，但第iv分子次型乳癌中之N階段（p=〇.〇47 )除外。表15b :第IV分子次型乳癌患者中用CMF與用CAF治療之患者之間N階段分佈的比較 N階段第IV分子次型總計 CAF CMF 0 9 11 20 1 12 3 15 2 1 2 3 3 0 1 1 總計 22 17 39 如表1 5b中所示，CAF組具有更多N階段=1之患者且 CMF組具有更多N階段=〇之患者。藉由費雪精確檢定之p 值為0_047。儘管N階段有利於CMF組，但CAF組之治療結果更加優越（圖9a ' 9b )。此研究之結果（圖9a、9b ’表14 ' 15a及15b)指示第 IV分子次型乳癌對曱胺喋呤相對不敏感且對阿德力黴素極其敏感。用曱胺喋呤替代阿德力黴素顯著改良無轉移存活與總存活兩者。因此’鑑別第IV分子次型乳癌患者且選擇含阿德力黴素之輔助化學療法攝生法用於其治療至關重要。此研究結果之臨床重要性由多位醫學專家關於蒽環黴素（例如阿德力黴素）治療乳癌之用途的新近評論進一步 108 201132813 強調。專家已由於不具有鑑別 ⑺对3恩％ Μ素之輔助治瘆反應之患者子組的可靠方法而受漏°療起結果所證明，對苜環黴辛起反廊 D由此研究之耵心衣斂素起反應之患者子組為第IV分子次型乳癌且可㈣藉由本文所述之分子次型確定方法鑑別。此研究之結果亦證明對於手術後用CAF或CMF輔助化學療法治療之第Ϊ分子次型乳癌而言，無轉移存活及總存活方面無顯著差異（表14)。所有第r分子次型患者皆具有極佳長期存活。兩個治療組之間之疾病嚴重性無差異（表 15a、15b及16)。如H i〇a中所示，第j次型乳癌大部分為ER及HER2陰性。此表型與已知具有侵襲性臨床過程 (121 )且對化學療法敏感（122、123 )之基底樣乳癌 (basal-like breast cancer ) —致。因此，第I次型乳癌必須用輔助化學療法治療且對CAF及CMF輔助化學療法起同等良好反應。表16 :各分子次型中用及不用輔助化學療法治療之患者之間疾病嚴重性的比較患者數g_費雪精確檢定之p值_ 癌次型無佐劑化學Rx佐劑化學RxT階段N階段總TNM階段陽性淋巴結核級 I 0 0 氺氺 * 氺 * II 4 23 氺 * * * III 3 30 氺 * * * 氺 IV 9 63 0.256 0.874 0.016 0.837 0.122 V 12 28 0.144 0.857 0.267 0.857 0.171 VI 25 56 0.018 0.095 0.034 0.095 0.857 :用於統計分析之患者數目不足 109 201132813 藉由費雪精確檢定進行兩個‘治療組之間的比較且p值概述於表中。根據2002 AJCC癌症分期手冊確定tnm階 & °無患者在診斷時具有遠處轉移。對於第v次型患者而呂，兩組（無輔助化學療法對輔助化學療法）之間的疾病嚴重ϋ十分類似。第V次型患者之更詳細比較概述於表^ 7 中。實施例5 :第IV次型乳癌中曱胺喋呤不敏感性及蒽環黴素敏感性之分子基礎。如實施例4中所論述，第ιν分子次型乳癌對甲胺嗓吟相對不敏感且對蒽環黴素（例如阿德力黴素）敏感。拓撲異構酶2Α ( Top〇isomerase 2Α，ΤΟΡ2Α)為蒽環黴素之已藥物目‘（96、114)。已在文獻中廣泛報導增加之τ〇ρ2a 表現使乳癌對蒽環黴素更敏感（96、n5)。如圖丨丨中所不，在6種分子次型中，第j及第IV次型乳癌具有最高含量之TOP2A，且兩種次型均應對蒽環黴素（例如阿德力黴素）起良好反應。關於對曱胺喋呤之不敏感性，已充分證明多個機制導致甲胺喋呤抗性。此等機制包括：υ將甲胺嗓吟移入細胞 :之轉運體（SLC19A1及FOLR1)之含量減少；2)保持細胞中之甲胺喋呤之葉醯聚麩胺酸（f〇lylp〇lyglutamate )合成，（FPGS)之活性降低，及3)甲胺嗓呤所抑制之二氣葉酸還原酶（DHFR)活性增加（圖12)(參考文獻116)。如圖13a及13b中所示，在第IV次型乳癌中，dhfr之表見幸乂问（圖13a)且SLC19A卜FLOR1及ppGS之組合表現 110 201132813 較低（圖ub)。此等結果幫助說明為何第ιν次型乳對含甲胺4呤之CMF攝生法起充分反應及為何在⑽攝生法中用阿德力黴素替代甲胺喋呤可激底改變治療結果。癌實施例6:分子次型確定鑑別不需要辅助化學療法之乳在此研究中之各組中，選擇顯著數目之患者不接受輔助化學療法。此等患者提供機會確定省略輔助化學療法將會如何影響其根據乳癌分子次型之長期存活。在研究中之 327名患者中，僅第IV、第v及第VI次型具有足夠數目之患者用（η分別=63、28及56)及不用（n分別=9、η及 25)輔助化學療法治療以用於比較研究（表⑹。然而，在用及不用辅助化學療法之患者之間，僅第ν分子次型志者在疾病嚴重性方面無顯著差異（表16)。接著比較第；分子次型乳癌之用及不_助化學療法之患者之間的無轉移存活及總存活。結果顯示此兩個組患者之間就無轉移存活及總存活而言無差異（圖Ma ' Rb )。此兩個組之第V次型患者之間臨床特性的更詳細比較，不於表17中。此兩個組患者之間就測試之所有相關臨床參數而言無顯著差異。值得注意的是此等患者大多數且有疾病之早期階段（TU且陽性結節《州。如以上所指出’第V分子次型為高度選擇性乳癌次型。所有第v次型 f者皆為ER及PR陽性及ERBB2陰性（表u)。遺慽的是，不能依賴此3個標記鑑別第v次型患者，因為其他分子次型('亦即第IV及第VI次型)之患者亦可共有相同、:、 111 201132813 PR及HER2狀態（圖1〇a、⑽ 徵分析（諸如本文#，+. 因此，藉由基因表現特 Μ型^方法）確定分子次型為鑑別此獨 =Γ<所必需，若疾病處於早期（Μ及陽性 :法以達則該等患者僅需要激素療法而無需輔助化學療法以達成長期存活（圖14a、14b及表17)。表17用及^用輔助化學療法治療之第V分子次型乳癌患者之臨床特性的比較

第V分子次型轧痛政^ (11=28)(患者數目）無Rx(n=12)(患者數目）費雪精確檢 T階段 ---〜___ 定之P值 14 50% 8 67% 0.144 14 50% 3 25% 0 0% 0 0% 0 0% 1 8% 13 46% 7 58% 0.857 8 29% 4 33% 5 17% 1 8% 2 8% 0 0% 28 100% 12 100% 13 46% 7 58% 0.857 8 29% 4 33% 5 18% 1 8% 2 7% 0 0% 1 2 3 4 N階段 0 1 2 3 Μ階段 0 陽性淋巴結 0 1-3 4-9 112 >=10 201132813 TNM階段 I 6 25% 6 50% Π 14 57% 4 33% m 7 18% 2 17% 核級 1 4 14% 5 42% 2 13 46% 4 33% 3 8 29% 2 17% 激素療法否 3 11% 2 17% 是 25 89% 10 83% 手術後放射舞法否 .20 71% 9 75% 是 8 29% 3 25% 0.274 0.1706 0.627 0.9999 實施例7 :使用獨立乳癌資料集驗證分子次型確定為了驗證本文所述之分子次型確定方法，分類基因應用於4個獨立乳癌資料集。所有4個資料集町用 (117-120)。此等資料集包括無轉移及/或總存活資料，且各資料集中之樣品數超過此4個資料集之特性概述於表18中。所有患者皆來自不同歐洲國家。本文中鑑別之分類基因及質心分析用於將各資料隼貝卞叶粟之乳癌樣品分類成相同 6種分子次型。首先，來自4個獨立資料隼 -之所有患者之無轉移及總存活根據其乳癌分子次型淮并八仔冷進仃分類。來自所有4個資 113 201132813 料集（包括KFSYSCC)之存活曲線繪示於圖I5a-15h中。結果支持不同地理區域及種族背景患者之6種乳癌分子次型共有相同存活特性。與KFSYSCC乳癌患者類似，在獨立資料集中’第II及第IV分子次型一致地具有較高遠處轉移風險（圖15a-15d)及較短總存活（圖I5e-I5h)。第V分子次型一致地具有低轉移風險及良好總存活❶此外，正如 KFSYSCC乳癌患者一般’獨立資料集中幾乎所有第v次型乳癌患者為ER及PR陽性及HER2陰性（圖1 〇a及！ 0b )。因此，ER高度陽性之第v分子次型患者應對抗雌激素激素療法起反應。第I分子次型患者一致地具有中等轉移風險及中等總存活’但來自荷蘭癌症研究所（NKI )之患者除外。第III及第VI分子次型似乎具有中等至低轉移風險及中等存活。然而，歸因於患者數目較少，資料似乎更可變。如上所論述，不同於來自其他資料集之第！分子次型患者’來自NKI之第I分子次型患者具有較高轉移風險及較不良之存活。此差異之可能原因在於第Ϊ分子次型乳癌類似於已知具有侵襲性過程且為ER及HER2陰性的所謂基底樣乳癌（圖10a)(參考文獻121)。第I分子次型乳癌亦對化學療法高度敏感（122、123 ) 。KFSYSCC之大多數第j 久型礼癌患者（95% )接受化學療法。相反’ nk；[資料集中僅35%第I次型患者接受化學療法。因此，吾人預期nki 資料集中第I次型患者之存活將不會如這般較高。結果強調鑑別第I分子次型乳癌患者之重要性及需要向此等患者投予輔助化學療法以獲得較佳存活結果。 114 201132813 表is :用於獨立驗證之乳癌基因表現資料集之特性。無來自JRH ( Oxf〇rd，υκ)之資料集之總存活資料。無之資料集之無轉移存活資料麵=微陣列平台^^

JRH

1〇1 Affymetrix 1U U133A TRANSBIG 198 ^etrix

Uppsala 251

Affymetrix U133A+B 否是是是是否 295兩色寡陣列是是 _ 診斷错g 年_齡；輔助化學療法 ' (n=40 ) ； TNM ； NO 不可用 n9 (n=61);無患者選擇年齡：< 61歲；TNM:红2 (<5cm)且 N=0 ;無 RX 1980-1998 120 資訊無患者選擇；無TNM及 RX 資訊 1987-1989 118 年齡<52歲；TNM :红2 (<5 cm )且 N=0 (n=l51);手術士放射（n= 144);化學療法（n= 20)，激素Rx (n= 20) ’兩者 (n=20) 臨床資料 1984-1995 117 為了進一步證明來自τ θ小同獨立資料集之相應乳癌次型共有相同分子特性，選裡/ 伟任確定乳癌之化學敏感性及生物學方面具有已知作用的個基因（CAV1、DHFR、TYMS、 VIM、ZEB1 ) ( 1〇6-1〇〇、110、124、125)。此等基因中無一者為本文所述之分$ 只将徵的一部分。當根據預測之分子次型對此等基因之表現％ ή 兄強度作圖時，發現其分佈樣式與分類特徵之基因高度_ ^ 〔圖16a-16e )。此等結果指示來自不同地理區域之乳癌J£ 士有相同分子特性且可根據本文所述之6種不同分子次型八 77類。此等結果亦指示本文鑑別之分類基因可應用於跨越Iπ +同平台技術（例如Affymetrix 115 201132813 ϋΐ 33基因晶片對NKI之兩色微陣列）收集之基因表現資料。此外’已知胸苷酸合成酶（TYMS )為氟尿嘧啶之目標。較高TYMS基因表現與對包括在CMF或CAF輔助化學療法攝生法中之氟尿嘧啶的較高敏感性相關（126、m)。第I 次型乳癌中TYMS表現量最高之研究結果（圖16c)支持如上所論述第I次型乳癌對輔助化學療法具有高敏感性，且強調向此等患者投予辅助化學療法之關鍵重要性。亦採用另一方法來驗證本文所述之乳癌分子次型確定方法。應用次型確定基因來使用質心分析確定3個不同獨立資料集（34、118及12〇)中之乳癌次型。獨立資料集中相同乳癌分子次型是否共有傷口反應（33)、腫瘤基質及應（128) '血管内皮正常化（129、13〇)及細胞週期/增殖之相同基因表現特性藉由分級分析確$以產生熱_ (⑹ map)。基因中無—者用於確^分子次型。如藉由熱圖所謂明’不同乳'癌資料集中所有6種分子次型根據指定分子攻型共有相關特差異基因表現樣式。因此，分類基因可成功區分不同資料集之患者中之6種不同乳癌分子次型。來自不同資料集之相同乳癌分子次型共有相同分子特性。用於：性化細胞週期/增殖1 口反應、腫瘤基質反應及血管正术内皮正常化之基因列於圖j 7a_ j 7h中。中各者在乳癌與正實施例8 :鑑別乳癌第；[_第VI分子次型常乳房組織之間差異表現的基因 οσ 包括327個乳癌及4〇個之微陣列資料用於研究。正常乳房組織之367個乳房樣使用以下兩個準則選擇資訊性 116 201132813 探針組：（a)在367個樣品之至少1()個樣品中表現強度大於9 (以2為底之正規化表現強度對數）之探針組丨及“) 9〇〇/。分位點與10%分位點之間之變化倍數大於2的探針組。所有選擇之探針組皆滿足兩個準則。有5817個滿足兩則之探針組。接著，進行各次型之乳癌樣品與正常乳房樣品之間的雙樣本t檢定以選擇展示顯著差異之探針組。由於比較之數目較大，本傑明及霍赫伯格（Benj.amini & H⑼)法用於調整多重比較之p值。目的在於減小錯誤發現率（舰）。又疋在 < 或-〇 · 〇 1之程度以鑑別在各乳癌次型與正常乳房組織之間顯著不同之探針組。 ,獲得6種乳癌次型中之每一者之差異表現基因。各次型之差異表現基因之數目概述於表19中。然而，許多差異表現基因乳癌次型<間共有。纟消除在不同乳癌分子次型之間共有之探針組之後，鑑別確實差異表現且為各乳癌分子次型所特有之探針組。為各分子次型所特有之探針組之數目概述於表2G中。此等基因之名稱及探針組ID 列於本文之表2-7中。表19:在各乳癌次型與正常乳房組織之間差異表現之探針組之數目

117 201132813 表2〇 :在各乳癌次型與正常乳房組織之間差異及獨特表現之探針組之數目乳癌分子次型

21 探針組之數目 133 35 60 47 75

實施例9:確定為產生可靠乳癌分子次型分類結果所需之探針組的最小數目。在此研究中，評估不同數目之來自表i中所述之783 個分類探針組之隨機選擇探針組以確定為對乳癌樣品之分子次型進行可靠分類所需之探針組的數目。質心分類模型' 留一法（leave-one-〇ut approach)及不同數目之隨機選擇探針組用於根據分子次型分類327乳癌樣品中之每一者及確定錯誤分類率》採用質心模型，因為其限制性較少且易於應用。在此研究中進行以下步驟： 1·隨機選擇不同分數（「！·」）之展示於表1中之783 個分類探針組用於研究。因此，r =隨機選擇之探針組之數目除以7 8 3 (分類探針纟且之總數）。對於此研究，選擇r等於 0.1 、 0.2 、 0.3 、 0.4 、〇·5 、 0.6 、〇·7 、 0.8 或 0.9 。 2.使用質心模型及隨機選擇之探針組進行留一交叉驗證以確定各r之327個乳癌樣品中之每一者的次型及確定各 r之錯誤分類率。 3·重複200次步驟1及步驟2，且獲得各！之200個錯誤分類率。 118 201132813 • 4產咮夂 .王谷r之200個錯誤分類率之密度曲線（參 18)。 ^ 1 rb 之所有783個分類探針組初始用於進行關於327 個樣本中之― 母—者的留一研究。使用所有783個探針組產 44個錯誤分類樣品，或0.13 ( 13%)之錯誤分類率》為了相對於在使用所有7 8 3個探針組時之錯誤分類率比較在久 τ 、 Γ病例下質心模型的錯誤分類率，確定各r之錯誤颈率的經驗90。/。信賴區間（CI ) ^若使用所有783個探針組之錯誤分類率（〇」3)小於或等於特定r在5%分位點 C 9 0 τ 夕。之下限（lower bond))處之錯誤分類率，則模型視為劣於使用所有783個探針組之模型。研究結果概述表21中。 ' 表21 .使用r=〇1至r=〇 9之範圍内之不同數目隨機選擇探針組的5 %及9 5 %分位點處之錯誤分類率錯誤分類率 — 分位點 r=0.1 r=0.2 γ=0·3 r=0.4 r=0.5 r=0.6 r=0.7 r=0.8 Γ=Π 〇 90% CI —--- 5% 0.17 0.13 0.12 0.12 0.11 0.12 0.12 0.12 ——--- 0 12 95% 0.25 0.19 0.17 0.17 0.16 0.15 0.15 0.14 0 14 1—--- -- JjU為隨機選擇用於構建之783個分類探針組的分數丄為信賴區間。結果顯示當r大於或等於〇·3時’錯誤分類率不顯著更差。此外’各特定r下所有200個分類之95%產生不超過 119 201132813 0.17之錯块分類率。因此，783個探針組之3〇%足以對乳癌分子次型進行可靠分類。實施例10 :免疫反應計分預測總存活在使用Affymetrix人類基因晶片將乳癌分類成不同分子-人型之研究期間，觀測到免疫反應相關基因在相同分子次型中差異表現。此研究結果促使吾人研究不同程度之免疫反應基因表現可如何影響不同乳癌分子次型中之存活結果。 10.1 :方法臨床及微陣列資料：研究來自相同327名患者用於發現不同乳癌分子次型之基因表現特徵及臨床資料。為了確認研究結果，亦包括新近檢定之其他180個乳癌樣品之基因表現特徵。選擇免疫反應基因：對於選擇免疫反應相關基因，首先選擇CD3 ( τ淋巴細胞之特異性細胞表面標記） (Affymetrix 探針組 ID: 213539—at)及 CD19(B 淋巴細胞之特異性細胞表面標記Affymetrix探針組id : 206398_s_at)之探針組以分別表示體液及細胞介導之免疫反應的關鍵基因。使327個乳癌樣品中之每一者中各探針組的表現強度分別與相同乳癌樣品之CD3及CD丨9探針組的強度相關。皮爾生相關性用於鑑別與CD3或CD丨9探針組相關之探針組。僅選擇彼等展示〇6及〇6以上之皮爾生相關性之探針組。 120 201132813 藉由選擇彼等已滿足以下兩個準則之探針組來進一步過濾所選探針組。首先，所選探針組應具有在至少1〇個乳癌樣品中大於512之基因表現強度。其次，所選探針組應展示在327個樣品中在第1〇 (頂部）與低第9〇 (底部）百 • 分位數之間的2倍變化。分級聚類分析：對於分級聚類分析，對乳癌樣品及探針組分別使用平均連接函數及完全連接函數。免疫反應計分：計算跨越資料集中所有樣品之探針組強度的z計分^ z計分定義為[(表現強度）_(探針組之平均值）]/(標準偏差）。樣品之免疫計分為此乳癌樣品之所有免疫反應探針組之z計分強度的平均值。獨立資料集之分子次型確定：藉由使用對應於分類探針組之基因及質心分析確定獨立資料集中各乳癌樣品之分子-人型（參見 Calza 專人，「Intrinsic molecular signature of breast cancer in a population-based cohort of 412 patients j 心 eaw Cancer i?a，8:R34 (2006))。使用 327 個乳癌樣品建立質心模型。若一個探針組映射至獨立資料集中多個基因，則計算平均強度且加以應用。驗證：對於研究結果之驗證，對以下5個公開之獨立資料集之乳癌病例應用免疫反應特徵基因，該等資料集包括 TRANSBIG(GSE7390)、MSKCC(GSE2603 ) 'Oxford (GSE2990 )、EMC(GSE2034)&MainZ(GSE11121)。此等資料集可在GEO資料庫上獲得且其因為相同微陣列平台（Affymetrix基因晶片）用於基因表現特徵分析而被選 121 201132813 擇。確定如所述之各病例的免疫反應計分。統計方法：包括分級聚類、產生熱圖、藉由對數等級檢定進行之存活分析及其他統計檢定之所有統計分析皆使用 R2.11.0 軟體進行（http://www.r-proiect.org/ )。 10.2 :結果免疫反應相關探針組。使用如上所述之方法，鑑別與免疫反應相關之734個探針組。所有734個探針組皆由來自 Ingenuity Systems ( Redwood City，California )之精巧路徑分析軟體分析以確認此等探針組之基因涉及於免疫反應中。如圖1 8中所示，所選探針組實際上針對各種免疫功能以高度統計顯著性富集。所選用於評估免疫反應之734個探針組概述於表22中。表22 探針組ID 基因符號探針組ID 基因符號 1405」一 at CCL5 213415一at CLIC2 1552316_a_at GIMAP1 213416_at ITGA4 1552318—at GIMAP1 213475_s_at ITGAL 1552497_a_at SLAMF6 213539一at CD3D 1552584_at IL12RB1 213566_at RNASE6 1552701_a_at CARD16 213603_s_at RAC2 1552703_s_at CARD16/// CASP1 213618_at ARAP2 1553102_a_at CCDC69 213620_s_at ICAM2 1553681_a_at PRF1 213666_at 1553856_s_at P2RY10 213733一at MY01F 1553906_s_at FGD2 213830_at TRD@ 1554208jt MEM 213888_s_at TRAF3IP3 1554240_a_at ITGAL 213915—at NKG7 1555349_a_at ITGB2 213958_at CD6 122 201132813 探針組ID 基因符號探針組ID 基因符號 1555355_a_at ETS1 213975_s_at LYZ 1555526_a_at SEPT6 213982_s_at RABGAP1L 1555613_a_at ZAP70 214032_at ZAP70 1555638—a一 at SAMSN1 214054一at DOK2 1555691_a__at KLRK1 214084_x__at NCF1C 1555759_a_at CCL5 214181—x一 at LST1 1555779_a_at CD79A 214298_x_at 1555852_at — 214339一s_at MAP4K1 1556657_at --- 214369_s_at RASGRP2 1556658_a_at … 214450_at CTSW 1557116一at APOL6 214467—at GPR65 1557632_at … 214470_at KLRB1 1557718_at PPP2R5C 214567_s_at XCL1 ///XCL2 1558111_at MBNL1. 214574—x一 at LST1 1558662_s_at BANK1 214582_at PDE3B 1558972_s_at THEMIS 214617_at PRF1 1559101_at FYN 214669_x_at IGKC 1559263_s_at PPIL4 III ZC3H12D 214677_x_at CYAT1 III IGLV1-44 1559425_at --- 214735一at IPCEF1 1559584_a_at C16orf54 214768一x一 at --- 1560332_at --- 214777—at IGKV4-1 1560396_at KLHL6 214836_x_at IGK@///IGKC 1560706_at -- 214916_x_at IGH@ /// IGHA1 /// IGHA2 III IGHG1 III IGHG3 /// IGHM /// IGHV3-23 III IGHV4-31 III LOC100290375 1562194-at … 214973_x_at IGHD /// LOC100290059 III LOC100292999 1563357一at --- 214995_s_at APOBEC3F /// APOBEC3G 1563473_at — 215051_x_at AIF1 1563674_at FCRL2 215118—s—at IGHA1 1564077_at — 215121—x_at CYAT1 /// IGLV1-44 1564139_at LOC144571 215147 一at — 1565705_x_at — 215176 一x一at IGK@ /// IGKC /// LOC100291464 1565752_at FGD2 215193_x_at -HLA-DRB1 /// HLA-DRB3 /// HLA-DR巳4 1565754_x_at FGD2 215214_at IGL@ 1568943_at INPP5D 215346_at CD40 1569040_s_at FLJ40330 215379_x—at IGLV1-44 1569225一 a 一at SCML4 215565_at LOC100289053 123 201132813

探針組ID 基因符號探針組ID 基因符號 200628_s_at WARS 215633_x_at LST1 200629一at WARS 215806—x一at TARP /// TRGC2 200887_s_at STAT1 215946_x_at IGLL3 200904一at HLA-E 215949_x_at IGHM III LOC652494 200905_x_at HLA-E 215967-S-at LY9 201137一 s一at HLA-DPB1 216033—s—at FYN 201153_s_at MBNL1 216191_s_at TRA@ III TRD@ 201487_at CTSC 216207_x_at IGKV1D-13 201720_s_at LAPTM5 216250_s_at LPXN 201721一s 一 at LAPTM5 216365_x_at IGLV3-19 201858一 s—at SRGN 216401_x_at LOC652493 201859—at SRGN 216412_x_at LOC100290557 202156_s_at CELF2 216430_x_at IGLV1-44 /// LOC100290557 202157_s_at CELF2 216491_x_at IGHM 202269_x_at GBP1 216510」(一 at IGHA1 III IGHG1 III IGHM III IGHV3-23 III IGHV4-31 ///LOC100290375 202270一at GBP1 216542_x一 at IGHA1 /// IGHG1 III IGHM ill LOC100290293 202307_s_at TAP1 216557_x_at IGHA1 /// IGHD III IGHG1 III IGHG3 III IGHM /// IGHV4-31 /// LOC100290320 III LOC100291190 202524_s_at SPOCK2 216560_x_at IGL@ 202531—at IRF1 216576-X一at 1GK@ /// IGKC /// LOC652493 III LOC652694 202625__at LYN 216829_at IGK@ /// IGKC /// LOC652493 III LOC652694 202626_s_at LYN 216853_x_at IGLV3-19 202643_s_at TNFAIP3 216920_s_at TARP /// TRGC2 202644_s_at TNFAIP3 216984_x_at IGLV2-23 /// LOC100293440 202659一at PSMB10 217028_at CXCR4 202663_at WIPF1 217143„s_at TRA@ /// TRD@ 202664_at WIPF1 217147_s_at TRAT1 202665_s_at WIPF1 217148·χ—at LOC100293440 202693_s_at STK17A 217157_x_at IGK@ ill IGKC /// LOC652493 202748_at GBP2 217179 一 x一at … 202803_s_at ITGB2 217227_x_at IGLV1-44 III LOC100290557 202901_x_at CTSS 217235_x_at IGLL5 III IGLV2-23 202902_s_at CTSS 217258_x_at IGLV1-44 /// LOC100290557 202910_s_at CD97 217281一x一at IGH@ /// IGHA1 III IGHA2 III IGHG1 III IGHG2 /// IGHG3 /// IGHM III IGHV4-31 III 124 201132813 探針組m 基因符號探針組ID 基因符號 LOC100126583 Hi LOC100290036 202957一at HCLS1 217360—x一 at IGHA1 /// IGHG1 /// IGHG3 III IGHM III IGHV4-31 III LOC652494 203047一at STK10 217378_x—at LOC100130100///LOC100291464 203110一at PTK2B 217418_x_at MS4A1 203185一 at RASSF2 217436一x—at HLA-J 203332一s 一 at INPP5D 217456—x一 at HLA-E 203385_at DGKA 217478一s一at HLA-DMA 203402一at KCNAB2 217480_x_at LOC100287723 /// LOC642424 III LOC642838 203416_at CD53 217549_at --- 203470_s_at PLEK 217933_s_at LAP3 203471_s_at PLEK 218223_s_at PLEKH01 203508_at TNFRSF1B 218232一at C1QA 203523一at LSP1 218322_s_at ACSL5 203528一 at SEMA4D 218805一at GIMAP5 203547一 at CD4 218870_at ARHGAP15 203741一s一at ADCY7 218999_at TMEM140 203760—s一at SLA 219014 一 at PLAC8 203761一at SLA 219045一at RHOF 203828_s_at IL32 219159_s_at SLAMF7 203845二at. KAT2B 219183_s_at CYTH4 203868-S—at VCAM1 219191_s_at BIN2 203879—at PIK3CD 219243一at GIMAP4 203915一at CXCL9 219279_at DOCK10 203922—s—at CYBB 219282_s_at TRPV2 203923_seat CYBB 219385_at SLAMF8 203932_at HLA-DMB 219386_s_at SLAMF8 204057—at IRF8 219505_at CECR1 204116一 at IL2RG 219528_s_at BCL11B 204118_at CD48 219551—at EAF2 204153_s_at MFNG 219574—at 204192一at CD37 219667—s 一at BANK1 204197一 s 一at RUNX3 219690_at TMEM149 204198—s—at RUNX3 219777_at GIMAP6 204205_at APOBEC3G 219812_at PVRIG 204220一at GMFG 220059_at STAP1 204236_at FLU 220068_at VPREB3 125 201132813

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CD84 209584_x_at APOBEC3C 230499一at --- 209606—at CYTIP 230550_at MS4A6A 209619_at CD74 230753-at PATL2 129 201132813 探針組Π) 基因符號探針組ID 基因符號 209670一at TRAC 230805_at — 209671_x_at TRA@///TRAC 230836_at ST8SIA4 209685一s—at PRKCB 230917_at … 209723一at SERPINB9 230925_at APBB1IP 209732_at CLEC2B 231093-at FCRL3 209734一at NCKAP1L 231124一x 一at LY9 209770一at BTN3A1 231577一s一at GBP1 209795_at CD69 231647_s_at FCRL5 209813—x—at TARP 231776_at EOMES 209827一s一at IL16 232024_at GIMAP2 209829_at FAM65B 232234一at SLA2 209846一s一at BTN3A2 232375_at --- 209879_at SELPLG 232383_at TFEC 209939_x_at CFLAR 232543_x_at ARHGAP9 209969一s 一at STAT1 232583_at --- 209970—x 一at CASP1 232617一at CTSS 209995一s一 at TCL1A 232843一 s一 at DOCK8 210029_at ID01 233302_at — 210031一at CD247 233411一at ™ 210038—at PRKCQ 233500_x__at CLEC2D 210072_at CCL19 233510_s_at PARVG 210105_s_at FYN 234050一at TAGAP 210113_s_at NLRP1 234260—at --- 210116一at SH2D1A 234366_x_at CYAT1 210140_at CST7 234419一x一 at IGH@ /// IGHA1 /// IGHG1 /// IGHG3 /// IGHM /// IGHV4-31 /// LOC100293211 210146_x_at LILRB2 234764-X一at IGLV1-44 210163eat CXCL11 234884_x_at CYAT1 210164_at GZMB 234987_at --- 210260_s_at TNFAIP8 235175一at GBP4 210279—at GPR18 235229_at — 210288_at KLRG1 235276—at EPSTI1 210321一at GZMH 235291_s_at FLJ32255 210356」<_at MS4A1 235306_at GIMAP8 210439一 at ICOS 235372—at FCRLA 210448—s 一 at P2RX5 235385_at 210514一x一at HLA-G 235529_x_at — 130 201132813 探針組ID 基因符號探針組ID 基因符號 210538_s_at 巳 IRC3 235574一at GBP4 210555_s_at NFATC3 235879—at MBNL1 210563_x_at CFLAR 235964_x_at — 210644_s_at LAIR1 236191_at 一 210681_s_at USP15 236198_at --- 210754_s_at LYN 236280_at — 210785_s_at C1orf38 236295_s_at NLRC3 210786_s_at FLI1 236341-at CTLA4 210858_x_at ATM 236539_at PTPN22 210895_s_at CD86 236782一at SAMD3 210915—x一at TRBC1 236921_at --- 210972_x_at TRA@ ///TRAC III TRAJ17///TRAV20 237104_at … 210982_s_at HLA-DRA 237176_at --- 211005一at LAT///SPNS1 237625一s一at --- 211122_s_at CXCL11 237753_at --- 211144_x_at TARP /// TRGC2 238025_at MLKL 211339_s_at ITK 238531一 x一 at — 211366_x_at CASP1 238581_at GBP5 211367_s_at CASP1 238668_at — 211368_s_at CASP1 238725—at IRF1 211430_s_at IGH@///IGHG1 III IGHG2///IGHM/// IGHV4-31 /// LOC100290146/// LOC100294459 239237_at — 211582_x—at LST1 239294_at — 211633—x_at --- 239409—at — 211634_x一 at IGHM III LOC100133862 239629_at CFLAR 211635一 x—at IGH@ III IGHA1 /// IGHA2///IGHD/// IGHG1 III IGHG3 III IGHG4 III IGHM III IGHV4-31 /// LOC100133862/// LOC100290146/// LOC100290528 239979一at — 131 201132813 探針組ID 基因符號探針組ID 基因符號 211637_x_at IGH@ /// IGHA1 /// IGHA2 ///IGHD/// IGHG1 /// IGHG3 /// IGHG4///IGHM/// IGHV3-23/// LOC100126583 III LOC100290146 III LOC652128 240070_at TIGIT 211639_x_at IGH@ ///IGHA1 /// IGHA2 ///IGHD/// IGHG1 /// IGHG3 III IGHG4///IGHM/// IGHV4-31 /// LOC100126583/// LOC652128 240154-at — 211640_x_at IGHG1 ///IGHM/// LOC100133862 240413—at PYHIN1 211641_x一at IGH@ ///IGHA1 /// IGHA2///IGHD/// IGHG1 ///IGHG3/// IGHM /// IGHV4-31 /// LOC100290320 ///LOC100291190 240481_at -- 211643_x_at IGK@ III IGKC /// IGKV3D-15 240665_at --- 211644_x_at IGK@ III IGKC /// IGKV3-20 /// LOC100291682 240890—at LOC643733 211645_x_at … 241435_at 211649一x一 at IGH@ III IGHA1 III IGHG1 /// IGHM 241891_at --- 211650_x_at IGHA1 /// IGHD III IGHG1 III IGHG3 III IGHM///IGHV1-69 /// IGHV3-23 /// IGHV4-31 /// LOC100126583 III LOC100290375 241917_at 211654_x_at HLA-DQB1 242020_s_at ZBP1 211656_x_at HLA-DQB1 III 242268-at CELF2 132 201132813

探針組ID 基因符號探針組ID 基因符號 LOC100294318 211663_x_at PTGDS 242388一x一at TAGAP 211742—s_at EVI2B 242521一at — 211748_x一 at PTGDS 242814_at SERPINB9 211795一 s 一 at FYB 242827一x一at … 211796_s_at TRBC1 242907一at --- 211798—x一at IGLJ3 242943_at ST8SIA4 211822一s一at NLRP1 242946—at — 211824_x_at NLRP1 243006_at — 211868_x_at IGH@ /// IGHA1 /// IGHA2 III IGHD III IGHG1 ///IGHG2/// IGHG3 /// IGHM III IGHV4-31 /// LOC100126583 III LOC100290320 III LOC100291190 243271一at --- 211881_x_at IGLJ3 243366一 s 一 at --- 211902一x—at TRA@ 243527_at — 211908一x一at IGKV3-20 243780一at … 211919一s一at CXCR4 243810_at 211990_at HLA-DPA1 243931—at ™ 211991_s_at HLA-DPA1 243968—x一at FCRL1 212187—x一at PTGDS 243981_at STK4 212311一at SEL1L3 244029一at LOC100131043 212314一 at SEL1L3 244061一at ™ 212413一at 244313_at CR1 212414—s_at GLYR1 ///SEPT6 244352—at CD84 212415_at 244592_at — 212486__s_at FYN 244654_at MY01G 212587_s_at PTPRC 34210_at CD52 212588_at PTPRC 35150一at CD40 212613一at BTN3A2 35974一 at LRMP 212671_s_at HLA-DQA1 /// HLA-DQA2 /// LOC 100294224/// LOC100294317 36030_at IFF01 212672—at ATM 37145_at GNLY 133 201132813 探針組ID 基因符號探針組ID 基因符號 212750一 at PPP1R16B 38149_at ARHGAP25 212827_at IGHM 38241一at BTN3A3 212829_at PIP4K2A 38964_r_at WAS 212873_at HMHA1 39318_at TCL1A 212886_at CCDC69 40420_at STK10 212998_x_at HLA-DQB1 /// LOC100294318 41577_at PPP1R16B 213160_at DOCK2 64064一at GIMAP5 213193_x_at TRBC1 90610_at LRCH4 /// SAP25 213293_s_at TRIM22 AFFX-HUMISGF3A /M97935_3_at STAT1 213309_at PLCL2 AFFX-HUMISGF3A /M97935_MA__at STAT1 鑑別各分子次型中高或低免疫反應的乳癌病例為了瞭解免疫反應基因之差異表現如何與各乳癌分子次型中無轉移存活結果相關，吾人使用所選免疫反應探針組對327個乳癌病例之各分子次型進行分級聚類分析。分級聚類分析鑑別各分子次型中之免疫反應基因表現較高及較低之兩個子組（圖20 )。接著，藉由對數等級檢定比較兩個子組之間的無轉移存活。結果顯示在第I次型癌症患者中，免疫反應基因表現較高之子組具有顯著較佳存活（圖 21 a )。免疫反應探針組之表現較高之子組的較佳存活趨勢亦在第II及第VI次型乳癌中注意到（圖21b及21e)。

為了確認對第II及第IV次型觀測到之趨勢，藉由包括由吾人新近研究之其他1 80名患者來增加樣品數，且進行各分子次型中免疫反應計分與無轉移存活之間的Cox回歸分析。結果概述於表23中。結果說明第I、第II及第III 134 201132813 次型之高免疫反應者具有顯著較佳之無轉移存活，其中各別 p 值為 0.0003、0.0037 及 0.0074(表 23 匯合 KFCC 結果）。表23 :吾人之327名患者（KFCC 327 ) ' 507名患者 (KFCC 327 + 180)及自可獲自GEO資料庫之5個公開資料集[TRANSBIG( GSE7390 )、MSKCC( GSE2603 )、Oxford (GSE2990 )、EMC ( GSE2034 )及 Mainz ( GSE111 2 1 )] (http://www.ncbi_nlm_nih.gov/geo/)匯合之 860 名患者的資料集中各不同乳癌分子次型患者之免疫反應計分與無轉移存活的Cox回歸結果。3個資料集各分子次型患者的數目展示於表24中。 I II III IV V VI 資料集相關係數 P 相關係數 P 相關係數 P 相關係數 P 相關係數 P 相關係數 P KFCC 327 -3.6048 0.0013 -0.5796 0.0902 -1.0613 0.0372 •0.4449 0.1034 0.2309 0.8405 -0.7650 0.0966 KFCC 327+180 -1.6233 0.0003 -0.7752 0.0037 -0.9680 0.0074 -0.2439 0.2420 0.4023 0.6579 -0.1566 0.5969 匿合之5個娜撕集 -0.5310 0.0110 -0.6904 0.0246 -0.3671 0.2782 -0.5722 0.0008 0.4062 0.3332 -0.4065 0.2042 表24:用於表23中所述之Cox回歸研究之各分子次型患者數目分子次型 I II III IV V VI KFCC 327 37 34 41 81 41 93 KFCC 327 + iso 53 56 62 123 55 158 匯合之5個公開資料集 141 64 59 211 138 247 135 201132813 接著，吾人匯合來自5個公開獨立資料集之860個乳癌樣品驗證研究結果。再次，進行免疫反應計分與轉移存活之間的Cox回歸分析。此驗證研究之結果確認對於第I 與第II次型乳癌患者而言，免疫反應相關基因之較高計分均與較佳無轉移存活相關（表23)。免疫反應基因之較高計分與第III及第IV次型中較佳遠處轉移存活之間的關聯未在之匯合資料集與匯合獨立資料集之間加以確認（表 23 )。因此，推斷免疫反應相關基因之計分與第I及第π 分子次型乳癌患者中之遠處轉移的風險相關且可用於一致地預測此等乳癌分子次型中遠處轉移的風險。 10.3 :結論此補充研究之結果證明免疫反應基因之表現可用於鑑別第I及第II分子次型乳癌患者中遠處轉移風險增加的患者。此應用將提供腫瘤學家寶貴資訊來定製乳癌患者之治療，且強調乳癌分子次型確定方法之臨床重要性。舉例而言，第I分子次型乳癌具有化學敏感性且若其免疫反應相關基因之表現計分較高，則可用CMF或CAF輔助化學療法攝生法有效治療以達成極佳長期存活結果。相反，第I分子次型患者中免疫反應基因之表現較低的彼等患者應該用更強烈化學療法攝生法或新穎實驗藥物治療以改良其存活結果。類似地，吾人可鑑別第Π分子次型乳癌患者中HER2過度表現之而風險患者以接受赫赛，;丁 (Herceptin )、酪胺酸激酶受體抑制劑或其他更強烈實驗化學療法。 136 201132813 以下例證補充實施例1 - 9之例證。實施例11 :其他驗證及分析 11.1 :其他統計分析鑑別乳癌分子次型之其他聚類分析：應用由 Sm〇1kin 及 Gh0sh( BMC Bioinformatics 4:36_42, 2003 )提出之方法來評估在不同皮爾生相關值下確定之樣品聚類的穩定性。如下進行第一評估： 3 2 7個樣之8 0 %經隨機抽樣兩次以產生一對次資料集《由如較早所述之k平均值聚類分析針對各樣品產生之 2000個聚類標記用於對各對次資料集分別進行分級聚類分析。樣品根據如上所述之不同皮爾生相關值聚類成不同數目之組（例如g=2、3、4....... U)(參見實施例i之材料及方法）。各數目之組（g=2、3、4......、1 1 )之各對結果之間的類似性藉由計算傑卡德係數（JC)加以量測。jc愈接近1則兩個獨立聚類結果愈類似。此過程重複2〇〇次。各數目之組（g=2至11 )之200組jC的直方圖展示於圖22 中。 _亦進行第二評估來確定在不同高度（l_r)下產生之不同數目之乳癌組的平均穩定性。對於此評估，使用各樣品之2000個k平均值聚類標記進行分級聚類分析以產生327 個樣品的完全系統樹圖。樣品藉由在不同高度程度（I。下切割系統樹圖而聚類成不同數目之組。 137 201132813 接著，使用針料樣品隨機選擇之2_個k平均值聚類標記的80%進行分級聚類分析以產纟327個樣品樹圖。樣。。聚類成不同數目之高度不同。·。的組。此聚類分析重4复20。次。相同組中剩餘病例根據完全系統樹圖的百分比計算為各組之穩定性量測結果。各聚類（樣品組）之穩定性量測結果之平均值視為反映組不可能歸因於偶然之程度的平均組穩定性計分。關於4 至11之不同數目之組的各組穩定性計分展示於表25中。表25 k=8 第1紐第2鉬第3紐第4紐第5組第6鉬第7紐第8紐第9鉬第10鉬第11鉬平均 4組 81 134 37 75 组穩定性 92.5 71.5 100 96.5 0〇 1 5組 81 93 37 75 41 組穩定性， 92.5 98.5 100 96.5 72 91 0 6組 81 93 37 34 41 41 組穩定性 92 98 100 100 96.5 72 93.1 7組 47 93 37 34 41 34 41 組穩定性 75.5 64 100 100 65 66 72 77.5 8組 47 33 37 34 60 41 34 41 組穩定性 58.5 100 100 100 98.5 96.5 100 72 90.7 9組 46 33 37 34 60 41 34 41 1 組穩定性 64.5 97 97 97 95.5 96.5 97 26 45 79.5 10組 46 33 37 34 60 41 34 40 1 1 組穩定性 67.5 98 98 96.5 59 95.5 98 98 59 59 82.9 11組 46 33 37 34 53 41 34 40 7 1 1 — _ 組穩定性 59 95.5 95.5 94 95.5 67 95.5 95.5 86 92.5 69 85.9 138 201132813 基於由 Smolkin 及 Ghosh( BMC Bioinformatics 4:36-42, 2003 )提出之方法獲得的結果，吾人選擇6組用於乳癌分子次型。 11.2使用OncotypeDX及MammaPrint預測器對遠處復發之相對風險計分。對吾人之資料集及EMC及NKI之資料集應用 van’t Veer 等人（Nature 2002，415:530-536 ) ( MammaPrint )及

Paik 等人（New Engl J Med 351:2817-2826，2004 ) (OncotypeDX )之預測模型以確定遠處復發之相對風險。為了計算Oncotype DX之復發計分，涉及與遠處復發相關之1 6種基因之Paik等人的模型直接應用於所有3個資料集。鑑別對應於該16種基因之Affymetrix U133A基因晶片的探針組及NKI DNA微陣列的基因且展示於表26中：

OncotypeDX預測器基因基因符號 Affymetrix 探針組 ID NKI ID BAG1 202387_at DD5227 CD68/EIF4A1 203507—at ED22119 BCL2 203685_at ID22945 ESR1 205225_at ED18904 PGR 208305_at ID630 SCUBE2 219197_s_at ID10658 GSTM1 204550一x 一 at ED22320 GRB7 210761_s_at ID7930 ERBB2 216836—s_at ID6424 CTSL2 210074_at ID22839 MMP11 203878—s—at ED13284 CCNB1 214710_s_at ID14976 MKI67 212023_s_at ID1161 MYBL2 201710_at ID1354 AURKA 208079—s 一 at ID5281 BIRC5 202094_at ID21371 139 201132813

MammaPrint預測器基因基因符號 Affymetrix 探針組 ID NKI ID AKAP2 202759一s一 at DD12009 ALDH4 211552_s_at DD6556 AP2B1 200612一s一 at ID22282 BBC3 211692一s 一 at E512695 CCNE2 205034—at ID8994 CEGP1 219197_s_at ID10658 CENPA 204962_s_at ID 1944 COL4A2DC13 211964_at ID2146 DC13 218447_at ID3476 DCK 203302_at ED23739 DHX58 219364_at ID 18440 DLAPH3 220997—s—at ID22739 ECT2 219787_s_at ID23213 ESM1 208394_x_at ID 10260 EXTI 201995_at: ID18906 FGF18 211029_x_at ID7474 FL111190 219958—at ID 19709 FLT1 204406_at ED22706 GMPS 214431 一 at ED7504 GNAZ 204993_at ID22879 GSTM3 202554_s_at ID24348 HEC 204162_at ID8746 HSA250839 219686_at ED20335 IGFBP5 211959_at ID22447 IGFBP5 211959_at ID12587 K1AA0175 204825_at ID14112 KIAA1067 212248_at ID16531 L2DTL 218585一s一at ID16238 LOC51203 218039_at 1015405 140 201132813 LOC57110 219983_at ED5373 MCM6 201930_at ID13145 MMP9 203936_s_at ID10842 MPI 205273_S_at ID14907 NMU 206023_at ID 13324 ORC6L 219105_x_at ID 10243 OXCT 202780_at ID21365 PECI 218025_s_at ID8797 PECI 218025—s一 at Π39171 PK428 203794_at ED5308 PRC1 218009_s_at ED8523 RAB6B 210127_at ID16966 RFC4 204023_at ED5529 SERF Μ 219982_s_at ID20881 SLC2A3 202499_s_at ID15609 TGFB3 209747_at ID 1846 TSPYL5 213122_at ID 10904 UCH37 219960_s_at E) 17793 WISP1 206796_at ID7524 探針組ID及來自OncotypeDX及MammaPrint預測器之基因用於對遠處復發之風險計分。OncotypeDX預測器中 16種基因可與Affymetrix探針組ID及NKI-ID匹配。70種 MammaPrint預測器基因中之48種可與U133A基因晶片中之Affymetrix探針組ID匹配且用於研究。此1 6種基因之表現強度直接饋入模型中以計算各病例之復發計分。對於NKI資料集，分位點正規化紅色通道資料用於確定基因表現強度。為了使用MammaPrint預測器之基因計算與低遠處復發風險相關之計分，吾人鑑別與 141 201132813

Mammaprim預測器匹配之48個Affymetrix探針組（表 26 )»接著用NKI資料集之平均良好預後特徵確定各樣品的皮爾生相關係數。平均良好預後特徵藉由計算van，t veer 等人之研究中關於預測器中使用之各基因報導的44個低風險病例之平均基因表現強度產生。 Π.3 : KFSYSCC 資料集與來自 EMC、Uppsala 及 TRANSBIG之公開資料集之間差異基因表現樣式之一致性的統計比較。此研究之主要目的在於確定，一 /、 ^ i^rj jj. 、且中之每一者之間在6種乳癌分子次型中與細胞週期/增殖 (A)、傷口反應⑻、基質反應（c)及腫瘤血管内皮正常化（D)相關之4個特徵之差異基因表現樣式的一致性。對於各組，吾人使用各特徵中之基因根據單因子分級聚類分析之結果㈣熱圖（圖17) eKFSYScc組與加山、 EMC及TRANSBIG組中之每一者之間熱圖樣式的—致性經統計量測且如下所述進行測試。對基因表現資料進行分位點正規化。計算各組中各樣品之各基因的Z計分。拯箬

接者確疋各組中各分子次型之Z 計分的平均值。平妁7 & v .4. 句叶为用於繪製各特徵及組之埶圖。根據如圖1 7中關於各细裕s _ 圖W国、各組所展不之各特徵中之基因的系統樹圖，·曰製熱圖。所有熱圖展示於圖23 A-D中。 2個組之間各基因料 ^ 特徵在刀子次型層面上之基因表現樣式的一致性由皮爾生中。 _生相關性確定。相關係數概述於表27 142 201132813 表 27: KFSYSCC 組與 3 個組（EMC、Uppsala 及 TRANSBIG ) 中之每一者之間各特徵的皮爾生相關係數。所有相關係數之p值皆< 1 特徵 Uppsala EMC TRANSBIG 細胞週期/增殖 0.92 0.94 0.87 傷口反應 0.84 0.85 0.78 基質反應 0.91 0.94 0.87 也管正常化 0.86 0.86 0.83 藉由比較相關係數與源於分子次型在樣品層面上之 ιο,οοο種排列之相關係數的經驗零分佈（empirical distribution )來測試各相關係數之顯著性。各基因及分子次型之平均Z計分之熱圖展示於圖23 A-D中。圖23顯示在不同組之間在分子次型層面上之表現樣式類似。KFSYSCC組與其他組之間關於4個不同基因特徵之一致性程度藉由皮爾生相關性加以分析。概述於表π 中之結果顯示吾人之組與3個其他獨立組乏間高度一致。所有係數之P值皆高度顯著（p<1〇-4)。結果驗證用吾人之分類基因確定之分子次型。實施例12 :其他資料表28:用CAF與用CMF.輔助化學療法治療之第I次型患者之間相關臨床參數之統計比較。表28與圖Μ相關 143 201132813 CAF CMF 費雪精確檢定 n=10 n=13 P值診斷時之年齡 <50歲 7 70.0% 9 69.2% 1 >=50 歲 3 30.0% 4 30.8% TNM路徑T 1 2 20.0% 6 46.2% 0.38 2 8 80.0% 7 53.8% TNM路徑N 0 5 50.0% 11 84.6% 0.17 1 5 50.0% 2 15.4% TNM路徑Μ 0 10 100.0% 13 100.0% 陽性淋巴結 0 5 50.0% 11 84.6% 0.17 1-3 5 50.0% 2 15.4% TNM階段 I 1 10.0% 6 46.2% 0.09 Π 9 90.0% 7 53.8% 核級 1 0 0.0% 1 7.7% 0.49 2 1 10.0% 2 15.4% 3 9 90.0% 9 69.2% 激素療法否 7 70.0% 11 84.6% 0.62 是 3 30.0% 2 15.4% 手術後放射否 6 60.0% 10 76.9% 0.65 是 4 40.0% 3 23.1% 參考文獻： 1. 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基因的表現強度之總和的散佈圖。SLC19A卜FL〇R1及FpGS 之表現減小與甲胺喋呤抗性相關。藉由使用AN〇VA檢定確定P值。圖14a :為顯示對於第v分子次型乳癌而言，用及不用輔助化學療法治療之患者之間無顯著差異的無轉移存活曲線。藉由對數等級檢定確定p值。圖14b .為顯示對於第V分子次型乳癌而言，用及不用甫助化千療法&療之患者之間無顯著差異的總存活曲線。 #由對數等級檢定確定！>值。 166 201132813 圖15a-15d :為KFSYCC資料集及3個其他獨立資料集 (NKI、TRANSBIG及JRH)中6種不同乳癌分子次型之無轉移存活曲線。結果顯示第Η及第IV分子次型一致地具有鬲遠處轉移風險，第V分子次型一致地具有低轉移風險，第I分子次型視接受任何辅助化學療法而定一致地具有中等或高遠處轉移風險，且第ΙΠ及第VI分子次型似乎具有中等至低轉移風險且更可變。圖l5a，KFSYSCC :辜公亮基金會孫逸仙治癌中心（臺灣）；圖15b，NKI :荷蘭癌症研究所；圖15c ’ TRANSBIG : TRANSBIG聯盟（比利時布魯塞爾朱爾斯博爾代研究所（jules B0rdet Institute，Brusseis， Belgium)):圖1 5d，JRH :約翰拉德克里夫醫院（John

Radcliffe Hospital) (Oxford，UK)。

圖15e-15h :為KFSYCC資料集及3個其他獨立資料集 (NKI、TRANSBIG及Uppsala)中ό種不同乳癌分子次型之總存活曲線。結果顯示第Π及第IV分子次型一致地具有高較短存活風險，第V分子次型一致地具有良好總存活，第I分子次型視接受任何辅助化學療法而定一致地具有不良總存活’且第III及第VI分子次型似乎更可變。圖15e， KFSYSCC :辜公亮基金會孫逸仙治癌中心（臺灣）；圖1 5f， NKI :荷蘭癌症研究所；圖 15g ’ TRANSBIG : TRANSBIG 聯盟（比利時布魯塞爾朱爾斯博爾代研究所）；圖15h， Uppsala :瑞典 Uppsala。圖16a -16e .為繪不6種乳癌分子次型之在乳癌之化學敏感性及生物學中具有已知作用之5種基因（CAV1、 167 201132813 DHFR、TYMS、VIM及ZEB 1 )之基因表現強度的散佈圖，其中使用 KFSYSCC資料集及3個其他獨立資料集 (TRANSBIG、JRH及Uppsala)。所有4個資料集共有根據6種分子次型之相同分佈樣式，且根據ANOVA檢定，5 種基因之表現強度在6種分子次型之間顯著不同。Y軸指示以2為底之基因表現強度對數。X軸指示使用表1中展示之 7 83個分類探針組確定之乳癌分子次型。圖 16a : CAV1 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、Oxford (JRH)及Uppsala資料集之ANOVA檢定p值分別為9.3x 10·35、2·7χ10·9、l.lxlO·9 及 2.9xl〇-30。圖 16b : DHFR 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、Oxford (JRH)及Uppsala資料集之ANOVA檢定p值分別為8.6x 10-14、8.3xl(T6、4.9xl〇-4 及 2.8xl(Tn。圖 16c : TYMS 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、Oxford 及Uppsala資料集之ANOVA檢定p值分別為8.4x1 Ο·36、1.5 xlO·23、1.3xl〇-10 及 9.8xl〇-30。圖 16d : VIM 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、Oxford 及Uppsala資料集之ANOVA檢定p值分別為ι_8χ10-17, u xl〇-8, 4·8χ10·6 及 3·1χΐ(Τ16。圖 16e : ΖΕΒ1 基因。kfsyscc、TRANSBIG、Oxford 及Uppsala資料集之AN0VA檢定p值分別為2 1χ1〇-ΐ6、 0.05、6·1χ1(Τ3 及 6.7xl〇_7。圖17a-1 7h :為用於特性化6種不同乳癌分子次型之細胞週期/增殖（17a)、基質反應（17b)、傷口反應（17c_17g) 168 201132813 及血管内皮正常化（17h)之基因表現特徵的基因/探針組之系統樹圖。圖18a及18b:為展示在0.1至0.9之範圍内之r水準下錯誤分類率的密度曲線，其中r為隨機選擇且用於構建確定分子次型之質心分類模型之783個分類物探針組的分數。0.13處之垂直灰線對應於使用所有783個探針組之留一研究的錯誤分類率。圖1 9 :概述使用精巧路徑分析對734個探針組進行分析以富集不同典型路徑中涉及的基因。橙色方塊為藉由用既疋路徑構成中之基因總數除吾人之滿足彼路徑中之準則的探針組數目獲得之比率。圖20.概述分級聚類分析之結果，其中與免疫反應相關之734個相關探針組用於鑑別吾人之327個乳癌樣品之不同分子次型中的高及低表現子組。各乳癌分子次型（第Ϊ 至第VI次型）展示在頂部。黑色條表示個體中遠處轉移及死亡之發生。熱圖中之紅色表示高於平均值之高z計分（基因表現増加）’黑色表示平均z計分（平均基因表現）且綠色表示低於平均值之z計分（基因表現減少）。圖21 :展示吾人之327名乳癌患者之不同分子次型中之無轉移存活的卡普蘭-麥爾曲線。低免疫反應組（紅線）與同免疫反應組（黑線）之間的存活差異藉由對數等級檢定評估。圖22 ·展示基於200次配對隨機次取樣之分級聚類分析已知不同數目聚類之傑卡德係數的直方圖。 169 201132813

致性。中關於不同組展示之各特徵中、PR (C)及 HER2 (B)狀態之因表現結果之間的相關性研究。之分割點由紅色虛線指許多病例展示於各圖中。藉由 IHC結果之間有顯著程度之一圖25 ( A-E ):展示根據4個獨立資料集中不同乳癌分子次型之基因表現散佈圖及盒狀圖。用於此研究中之5種基因係由於其在乳癌細胞之藥物敏感性及上皮間葉細胞轉變（epithelial-mesenchymal transition)方面之作用而被選擇。其中無一者為用於分類分子次型之基因之一部分。如此等圖中所示，所有4個不同資料集共有根據6種分子次型之相同微分分佈樣式。根據AN0VA，此等基因之表現強度在6種为子久型之間顯著不同，但EMC資料集中之ZEB1 除外。Y軸為以2為底之基因表現強度對數。4個資料集為資料集（KFSYSCC )、TRANSBIG( Desmedt 等人，C7z„ Cancer 心5·，13:3207-3214(2007))、EMC ( Chang 等人，Prc)c jcac? Scz·, t/以，102:3738-3743 (2005))及 Uppsala( Miller 等 Λ, Proc Natl Acad Sci, USA, 102:13550-13555 (2005))。圖 25 A : CAV1 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、EMC 及Uppsala資料集之ANOVA檢定p值分別為9.3χ10·35、2.7 xlO·9、4·9χ10 — 21 及 2.9xl〇-30 〇 170 201132813

圖 25 B : DHFR 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、EMC 及Uppsala資料集之AN〇VA檢定p值分別為8 6xi〇-14, 8 3 xlO·6, 3·3χ1(Τ4 及 2.8xl〇'n。圖 25 C : TYMS 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、EMC 及Uppsala資料集之an〇va檢定p值分別為8 4χ1〇-36、！ 5 xlO-23、5·Οχ1〇_29 及 9.8xl〇-3〇。圖 25 D : VIM 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、EMC 及

Uppsala資料集之ANOVA檢定p值分別為18χ1〇·ΐ7、13χ 10-8、4.7χ1(Τ15 及 3·1χ1〇·16。

圖 25 Ε : ΖΕΒ1 基因。KFSYSCC、TRANSBIG、EMC 及Uppsala資料集之ANOVA檢定p值分別為2 1χ1 〇-i6、 0.05、0_07 及 6.7xl〇-7。圖26 :概述在本研究之乳癌分子次型之間與上皮-間葉細胞轉.變相關之基因的差異表現。實心色點及條表示平均值土SD。藉由AN0VA確定p值。各基因之表現為以2為底之表現強度對數。圖27 :概述本研究之患者中分類為帕柔-索列 (Perou_S0rlie)管腔A固有類型之第v與第VI次型乳癌患者之間無轉移存活的比較。圖28 :為本申請案中所述之乳癌分子次型之熱圖。783 個分類探針組之系統樹圖展示在左側且聚類成6種分子次型之3 2 7個乳癌樣品顯示在頂部。圖29:展示說明吾人之資料集及其他3個獨立資料集 (Wang 等人 z⑽cei，365:671_679 (2〇〇5)，Miller 等人， 171 201132813 t/a, 102:13550-13555 (2005) ; Desmedt 等人 C/k Cancer Λα., 13:3207-3214(2007))中 6 種不同乳癌分子次型之分子特性的熱圖。使用與細胞週期/增殖、傷口反應（Proc Natl Acad Sci，USA 2005,102:3738-3743 )、基質反應（Nature Med 2008, 14:518-527 )、及腫瘤血管内皮正常化（Cell 2009,136:810-812; Cell 2009,136:839-851 )相關之基因對吾人之資料集中327個樣品進行單因子分級聚類分析以產生基因聚類及系統樹圖。乳癌樣品根據其如在各圖頂部所示之次型排列。特徵基因之系統樹圖展示在左侧。所有4個系統樹圖中之基因之身分列於圓丨7中。用於本研九中之基因中無一者為用於分子次型確定之783個探針組之一部分。吾人之資料集之熱圖係針對各基因表現特徵以頂圖形式加以展示。相同基因聚類用於繪製關於其他3 個獨立資料集之熱圖。使用KFSYSCC、EMC、Uppsala及 TRANSBIG之資料集自頂部至底部產生各特徵之熱圖。在所有4個資料集中，各分子次型共有相同獨特基因表現樣式第I、第II及第IV次型之細胞週期/增殖基因表現升高。類A地第I及第II次型乳癌樣品顯示已知與較不良存活 ^果相關（Nature Med 2008，14:518-527)之基質基因的較面表現。第III及第VI次型具有與血f内皮正常化相關之基因的升高表現。針對皮爾生相關係數分析kfsyscc資料集與其他3個獨立資料集中之每一者之間6種分子次型之特徵基因之差異表現的一致性。藉由與基於各公開資料集在次型層面上之Π)，·種排列（pe_atiGn)的零分佈進 172 201132813 行比較來確定各皮爾生相關係數之p值。所有户值皆 <0.0001。KFSYSCC 與各 EMC、Uppsala 或 TRANSBIG 資料集之間的皮爾生相關係數針對細胞週期/增殖而言為 0.94 0.92或0.87 ’針對傷口反應而言為〇 85、〇或〇，針對基質反應而言為0.94、0.91或〇 87,且針對腫瘤血管内皮正常化而言為0.86' 0.86或0.83。圖30 :概述具有帕柔_索列固有類型之本發明分子次型。頂列展示吾人之資料集中之327個樣品的色標分子次型，且下圖展示如何使用S0r〗ie等人㈣，98:10869-1G874(2GG1)之分類基因將頂部相同病例分類成基底（綠色）.、HER2過度表現（紅色）、管腔a (藍色）及管腔B(棕色）固有型。圖3 1 :經受輔助化學療法之第v分子次型患者與未經受辅助北學療法之患者之間存活結果的比較。比較吾人之資料集（上圖）及NKI資料集（van de 等人心" /M^’347:1999_2009 (2002))(下圖）中患者之存活。相關臨床參數之比較顯示來自吾人之KFSYSCC資料集之兩個⑺療組之間無差異（表17 )。使用此研究中產生之分類物基因及質心分析來鑑別ΝΚΙ資料庫中患有第ν次型乳癌之''"者。選擇所有患有N1階段疾病之ΝΚΙ患者進行比較。兩個治療組之間的腫瘤尺寸分佈及用激素療法治療之患者之刀數不顯著不同，其中使用費雪精確檢定之各別值 1 · 0 及 π 及〇 *' υ·32 °此研究中不包括NKI階段N0之患者，因為壓隹1J性倉令日土未接受輔助化學療法。包括這些患者將會導致疾 173 201132813 病嚴重性之不均勻分佈。結果顯示輔助化學療法不為任一資料集中之早期第v次型乳癌患者提供存活益處。圖32:用CAF與用CMF輔助化學療法治療之第丨次型乳癌患者之間總存活之比較。比較此兩個治療組之間包括診斷時之年齡、TNM階段、陽性淋巴結數目、核級、激素療法及手術後放射的臨床變數。無顯著差異（表28 )。

圖33 :藉由使用〇nc〇type及MammaPrint預測器之基因預測之分子次型與遠處復發風險的相關性。用於此研究中之3個不同資料集包括吾人之資料集（KFS YSCC )、EMC (Lancet 2005, 365:671-679 )及 NKI( New Engl J Med 2002, 347:1999-2009 )。KFSYSCC、EMC 及 NKI 資料集之各次型中之病例數目分別為對於第I次型為37、49及ι〇 ;對於第 II次型為34、24及18 ;對於第III次型為41、24及4 ;對於第IV次型為81、80及52;對於第v次型為41、39及 172，·且對於第VI次型為93、7〇及9。對於由〇nc〇type預測器之基因預測復發風險，較高計分意謂復發風險較高。展示在y軸上由MammaPrint預測器預測之負相關計分表示較高遠處復發風險。<〇之計分可定義為高復發風險且=或>〇之計分定義為低風險。圖34 . 6種不同乳癌分子次型中及^基因之平均表現強度。研究中包括吾人之資料集中之所有患者 (n = 3 27 )。各基因之平均表現展示為平均值士。在將表現強度轉換成以2為底之對數之後在第iv次型與其他次型之間進行史都登t檢定（student t test)。第IV次型之 174 201132813 TOP2A表現顯著高於第II、第III、第V次 0.0001 ( * )。在第IV次型與第I次型之間於FLOR1之表現，第IV次型顯著低於第I 0.0001 (*)。各次型中之樣品數目可在表1 【主要元件符號說明】無型，其中；？值< 無顯著差異。對次型，其中/? < 1中獲得。 175

Claims

201132813 七、申請專利範圍： 1 · 一種治療個體中的乳癌之方法，其包含： a) 確定該個體中的乳癌之分子次型，其中該分子次型係選自由以下者所組成的群組·第I分子次型乳癌、第II分子次型乳癌、第III分子次型乳癌、第IV分子次型乳癌、第V分子次型乳癌及第VI分子次型乳癌；及 b) 向該個體投予有效治療步驟a)中確定的乳癌之分子次型的療法。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該乳癌之分子次型為第I分子次型且向該個體投予包括輔助化學療法的療法。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該輔助化學療沒包含投予曱胺喋呤（methotrexate)。 4. 如申叫專利範圍第3項之方法，其中在確定該個體_ 的乳癌之分子次型之前，該個體為接受包含蒽環黴清 (anthracyciine)的辅助化學療法的候選者且在確定該個谱中的乳癌之分子次型之後，不向該個體投予蒽環黴素。 5·如申請專㈣圍第1項之方法，其巾該乳癌之分子型為第Π分子次型且向該個體投予包括至少一個選自由〇下者所組成的群組的成員的療法：投予腦信號偉導路徑拮抗劑、高強度化學療法及劑量密集化學療法。 6.如申請專利範jf]篦$ 圓弟員之方法，其中該療法包含投子 HER2/EGFR信號傳導路徑拮抗劑。 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中該乳癌過度表璃 176 201132813 HER2。 8.如申請專利範圍第丨項之方法，其中該乳癌為第Ζ分子次型或第11分子次型’且其中該方法進-步包含確定免疫反應計分（immune resp〇nse sc〇re )，其中向具有低免疫反應計分之.個體投予輔助化學療法。 9·如申請專利範圍第8項之方法，其中該乳癌為第^分子次型且該療法包含含有蒽環黴素的輔助化學療法。 1〇·如申請專利範圍第丨項之方法，其中該乳癌之分子人^•係選自由第分子次型及第分子次型所組成的群組且向該個體投予包括至少一種抗雌激素療法的療法。 11. 如申請專利範圍第丨項之方法，其中該乳癌之分子次型為第IV分子次型且向該個體投予包括包含至少一種蒽環黴素'的輔助化學療法的療法。 12. 如申請專利範圍第u項之方法，其中該蒽環黴素為阿德力徽素（adriamycin )。 13. 如申請專利範圍第丨丨項之方法，其中在確定該個體中的乳癌之分子次型之前，該個體為包含投予曱胺喋呤的輔助化學療法的候選者且在確定該個體中的乳癌之分子次型之後’向該個體投予蒽環黴素。 14. 如申6青專利範圍第11項之方法，其中在確定該個體中的乳癌之分子次型之前，該個體為包含投予HpR2/EGFR k號傳導路徑拮抗劑的輔助化學療法的候選者且在確定該個體中的乳癌之分子次型之後’不向該個體投予 HER2/EGFR信號傳導路徑拮抗劑。 177 201132813 15 ·如申請專利範圍第14音固弟M項之方法，其中該乳癌過度表現 HER2。 16.如申請專利範圍第項矛項之方法，其中在確定該乳癌之分子次型之前確定其過度表現HER2。 17·如申請專利範圍第1項 π <乃次，其中該乳癌之分子次型為第V分子次型且向該徊贈土且门忑個體投予包括抗雌激素療法的療法。 18·如申請專㈣圍第17項之方法，其中該抗雌激素療法包含投予至少-種選自由抗雌激素化合物及芳香酶抑制劑所組成的群組的藥劑。 19.如申請專利範圍第I?瑁一祀国弟1/項之方法，其中在確定該個體中的礼癌之刀子次型之前，該個體為辅助化學療法的候選者且在確定該個體令的乳癌之分子次型之後，+向該個體投予輔助化學療法β 20·如申請專利範圍第*山 ^ y項之方法，其中該乳癌為 ER+、PR+及 ERB-。 21 _如申請專利範圍第2〇項㈤示 Θ之方法，其中在確定該乳癌之分子次型之前已知其ER、PMERB狀態。 22. 如申請專利範圍第1項 .,^ 〆币喟之方法，其中在確定該個體中的乳癌之分子次型之前，該彻挪* , "J这個體為辅助化學療法的候選者。 23. 如申請專利範圍第22項只您方去，其中向該個體投予輔助化學療法。 24. 如申請專利範圍第22項之方法，其中不向該個體投 178 201132813 予輔助化學療法。 25.—種將患有乳癌的個體鑑別為具有治療乳癌分子次型的功效的療法的候選者之方法，其包含： )確疋D玄個體中的乳癌之分子次型，纟中該分子次型係選自由以下者所組成的群組：第j分子次型乳癌、第Η分子-人型礼癌、第in分子次型乳癌、第IV分子次型乳癌、第V分子次型乳癌及第…分子次型乳癌；及 b)將該個冑銀別為有效治療步冑〇巾確定的分子次型的療法的候選者。 26·如申請專利範圍第乃項之方法，其中該個體中的乳癌之分子次型為第1分子次型且該個體為包括輔助化學療法的療法的候選者。 27.如申請專利範圍帛25項之方法，其中該個體中的乳癌之分子次型為第Π分子次型且該個體為包括至少一個選自由以下者所組成的群組的成員的療法的候選者：投予 HER2/EGFR信號傳藤致你杰丨 > 得導路仅拮杬劑、高強度化學療法及劑量密集化學療法。 28·如申請專利範圍第25項之方法，其中該乳癌之分子次型係選自由第m分子次型及第VI分子次型所組成的群組且向該個體投予包括至少一種抗雌激素療法的療法。 29.如申請專利議25g之方法，其中該個體中的乳癌之分子次型為第IV分子次型且該個體為包括含有至少— 種蒽環黴素的辅 30.如申請專利範圍第25項之古土 ^ 7 叫布貝之方法，其中該個體中的导 179 201132813 癌之分子次型為第v公早+并〗 -i且该個體為包括抗雌激素療法而無輔助化學療法的療法的候選者。 3K-種選擇用於個體中的乳癌的療法之方法，其包含： a) 確疋4個體中的乳癌之分子次型，其中該分子次型係選自由以下者所組成的群組：第z分子次型乳癌、第时子次型乳癌、第m分子次型乳癌、第1¥分子次型乳癌、第V分子次型乳癌及帛VI&子次型乳癌；及 b) 選擇有效治療步驟a)中確定的分子次型的療法。 32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該乳癌之分子次型為第！分子次型且選擇包括輔助化學療法的療法。 33. 如申請專利範圍第31項之方*，其中該乳癌之分子次型為第„分子次型且選擇包括至少一個選自由以下者所組成的群组的成員的療法：投予贴讀㈣信號傳導路徑括抗劑、高強度化學療法及劑量密集化學療法。 34. 如申凊專利範圍第3丨項之方法其中該乳癌之分子次型係選自由第分子次型及第…分子次型所組成的群組且向該個體投予包括至少-種抗雌激素療法的療法。 35·如申明專利範圍第31項之方法，其中該乳癌之分子聖為第IV为子次型且選擇包括包含至少一種蒽環黴素的輔助化學療法的療法。 a /6.如申請專利範圍第31項之方法，其中該乳癌之分子次型為第V分子次型且選擇包括抗雌激素療法而無輔助化學療法的療法。 37.—種對乳癌進行分類之方法，其包含： 180 201132813 ' a·比較該乳癌之基因表現特徵與一或多個選自由以下者所組成的群組的乳癌分子次型之參考基因表現特徵：第工分子次型乳癌、第II .分子次型乳癌、第1„分子次型乳癌、第IV分子次型乳癌、第V分子次型乳癌及第VI分子次型乳癌；及 b.將該乳癌分類成第I分子次型乳癌 '第„分子次型乳癌、第III分子次型乳癌、第IV分子次型乳癌、第V分子次型乳癌或第VI分子次型乳癌。 38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該基因表現特徵由表Ϊ中至少約30%的基因之表現量產生。 39. 如申請專利範圍第37項之方法，其中同時量測該等表I中至少約30%的基因之表現量。 40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中在核酸層面上量測該等表I中至少約30%的基因之表現量。 41. 如申請專利範圍第40項之方法’其中使用選自Εχ〇η l.〇ST、Genel.〇ST、U95、U133、U13 3A2.〇4U133Plus 2.0的微陣列量測該等表i中至少約3〇%的基因之表現量。 42. 如申睛專利範圍第37項之方法，其中實質上與第I 分子次型參考基因表現特徵類似的該乳癌之基因表現特徵指不第I分子次型乳癌。 43. 如申請專利範圍第37項之方法，其中實質上與第„ 分子次型參考基因表現特徵類似的該乳癌之基因表現特徵指示第Π分子次型乳癌。 44. 如申凊專利範圍第37項之方法其中實質上與第川 181 201132813 分子次型參考基因表現特徵類似的該乳癌之基因表現特徵指示第III分子次型乳癌。 45. 如申請專利範圍第37項之方法，其中實質上與第IV 分子次型參考基因表現特徵類似的該乳癌之基因表現特徵指示第IV分子次型乳癌。 46. 如申凊專利範圍第37項之方法，其中實質上與第v 分子次型參考基因表現特徵類似的該乳癌之基因表現特徵指示第V分子次型乳癌。 47_如申§青專利範圍第37項之方法，其中實質上與第 VI刀子人型參考基因表現特徵類似的該乳癌之基因表現特徵指示第VI分子次型乳癌。 48. —種針對一或多種臨床指標對懷疑患有乳癌的個體提供預後之方法，丨包含#申請專利範圍第.37 #之對乳癌進行分類之方法的步驟，其中該預後係基於該分類步驟（b) 且其中該一或多種臨床指標係選自由以下者所組成的群組：轉移風險、T階段、TNM階段、無轉移存活及總存活。 49. 如申請專利範圍第48項之方法其進一步包含確定 a亥個體之免疫反應計分，其中低免疫反應計分指示無轉移八、圖式： (如次頁） 182