JP2022518249A - 抗癌剤反応性予測用バイオマーカーおよびその用途 - Google Patents

抗癌剤反応性予測用バイオマーカーおよびその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、免疫治療抗癌剤反応性予測用バイオマーカーおよびその用途に関することとして、より具体的にＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、ＰＤ－１阻害剤であるペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）に対する反応性予測用マーカー組成物、反応性予測用組成物およびキット、並びに反応性予測のための情報提供方法に関する。本発明による遺伝子マーカーは、患者由来ホルマリン固定パラフィン包埋組織を活用して解析するので、別途のサンプル採取が不要で、解析が便利であり、遺伝子発現解析を通じて前記免疫抗癌剤に対する反応性をあらかじめ予測できて、最適な治療法選択のための情報を提供できるので、臨床で有用に用いられるものと期待される。

Description

本発明は、抗癌剤反応性予測用バイオマーカーおよびその用途に関し、より具体的には、ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、ＰＤ－１拮抗剤であるペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）に対する反応性予測用マーカー組成物、反応性予測用組成物およびキット、並びに反応性予測方法に関する。
胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ；ＧＣ）は、全世界的に最も多く発生する悪性腫瘍の１つであり、癌による死亡の３番目の主な原因として知られている。また、多くの胃癌患者が進行性段階にあり、その大部分が予後が非常に良くないことが報告されている。転移性胃癌では、白金を基にする併用化学療法が標準治療法と見なされるが、多くの患者が前記治療法に不応性を有し、反応性を示す患者の場合にも、反応期間が数ヶ月程度と短いことが知られている。胃癌の生存率が低い理由としては、胃癌が治療法に対する攻撃性および反応性が非常に異なる異質性疾患であり、患者それぞれにおいて臨床的結果および予後が報告されたデータと常に一致するわけではないということである。したがって、胃癌患者の抗癌治療において治療薬物に対する反応性および予後をあらかじめ予測することによって、異質性を有する胃癌患者に対して最も適切な治療法を提供して、不要な治療と関連した毒性を避け、究極的に治療効果を高めることができる。
このような必要性によって、最近、患者個人的要因に対する体系化した解析結果に基づいて適切な標的抗癌剤および治療方法を選別できる承認された診断を意味するコンパニオン診断（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に対する研究が活発に行われている。コンパニオン診断は、医師の診断による処方の明確な臨床的根拠を提示でき、患者に適切な治療法を提示できるので、癌治療効率を上げることができると共に、標的抗癌剤の乱用を減らして、国家の健康保険の財政の健全性にも寄与することができる。現在コンパニオン診断の市場は、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、黒色腫等の治療分野において成長しており、特に乳癌および肺癌分野が市場の成長を牽引するものと期待されている。製薬会社の新薬開発費用の削減、標的治療剤に対する需要が高まるにつれて、コンパニオン診断の世界市場は、毎年１８％ずつ成長して、２０１９年には５８億ドルに達することが予想されている。
なお、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）に対する抗体としてＦＤＡ承認を受けたペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）は、マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ；ＭＳＩ）／ＤＮＡ ｄＭＭＲ（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）バイオマーカーを有する後期固形腫瘍患者の治療に使用される。最近、２０個の異なるＰＤ－Ｌ１陽性の後期固形腫瘍のうち１つを有する４７５人の患者で進行されたペムブロリズマブに対する非無作為化、多施設共同、多重コホートバスケット試験の結果、癌の類型によって多様な客観的反応率（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｔｅｓ；ＯＲＲｓ）が現れた。多数の腫瘍類型にかかって抗ＰＤ－１に対する反応性を予測できるバイオマーカーとしては、Ｔ細胞－炎症遺伝子発現プロファイル、ＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）発現、および／または腫瘍突然変異負荷（ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｕｒｄｅｎ；ＴＭＢ）があるが、個別的癌類型内でさらに正確であり、抗ＰＤ－１治療に対する患者選別でこのようなバイオマーカーに対する臨床的有用性を評価するために、さらに大きい規模の研究が必要である。
胃癌において、単一群、多重コホート、ペムブロリズマブ２相試験（ＫＥＹＮＯＴＥ－０５９）は、１１．６％の客観的反応率を示し、患者の２．３％が完全な反応を示し、胃癌患者中、反応群が、非小細胞性肺癌患者よりさらに少ない比率を占めた。非反応群の高い割合と初期反応を示す患者において抵抗性の出現は、癌免疫治療分野において非常に重要な課題である。最近、ペムブロリズマブで治療を受けた転移性胃癌患者の分子的特性に対する研究結果、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）陽性、ＰＤ－Ｌ１－複合陽性スコア（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｃｏｒｅ；ＣＰＳ）、ＴＭＢ、および治療に対する反応性と関連がある治療後６週目に循環性腫瘍ＤＮＡレベルの減少を示した。たとえＴ細胞炎症ＧＥＰは、２０個の多様な固形腫瘍にわたってペムブロリズマブ治療療法の臨床的効能を予測し、ＰＤ－１阻害からベネフィットを受けることができる患者を選別するための潜在的に関連性のあるバイオマーカーを提供したが、転移性胃癌患者では反応性を予測しなかった。
免疫治療療法に対する予測バイオマーカーは、免疫反応および腫瘍生物学の複雑性に起因して標的治療療法に使用される伝統的なバイオマーカーとは異なる。最近では、４５個の免疫チェックポイント遺伝子に基づく免疫予測スコアであるＩＭＰＲＥＳが、黒色腫患者においてＩＣＢに対する反応を予測するために開発された。腫瘍生物学の差異と患者ベネフィットの可能性を最大化するための製剤の選択をガイドするための臨床的等級のバイオマーカーの必要性を考慮して、本発明者らは、ペムブロリズマブに対する反応性を予測するための胃癌特異的遺伝子発現セットを発掘した。
本発明者らは、ＰＤ－１阻害剤の１つであるペムブロリズマブ免疫抗癌剤に対する反応性予測用遺伝子バイオマーカーを発掘するために、ペムブロリズマブ治療を受けた胃癌患者由来ホルマリン固定パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出してナノストリング解析を実施し、前記胃癌患者の反応性によって差次的発現遺伝子を解析した結果、本発明による抗癌剤反応性予測用バイオマーカーを発掘したところ、これに基づいて本発明を完成した。
これより、本発明は、ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、抗癌剤反応性予測用マーカー組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ＡＲＭＣＸ１、ＰＲＫＤ１およびＴＹＫ２よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する製剤を含む、抗癌剤反応性予測用組成物および前記組成物を含む抗癌剤反応性予測用キットを提供することを他の目的とする。
また、本発明は、前記ＡＲＭＣＸ１、ＰＲＫＤ１およびＴＹＫ２よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する段階を含む、抗癌剤反応性予測のための情報提供方法を提供することをさらに他の目的とする。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業者が明確に理解できる。
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、抗癌剤反応性予測用マーカー組成物を提供する。
本発明の一具現例において、前記マーカー組成物は、ＵＣＨＬ１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｌ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００４１８１）遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質をさらに含むことができる。
また、本発明は、ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する製剤を含む、抗癌剤反応性予測用組成物を提供する。
本発明の一具現例において、前記組成物は、ＵＣＨＬ１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｌ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００４１８１）遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する製剤をさらに含むことができる。
また、本発明は、前記組成物を含む、抗癌剤反応性予測用キットを提供する。
本発明の一具現例において、前記抗癌剤は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）拮抗剤でありうる。
本発明の他の具現例において、前記ＰＤ－１拮抗剤は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）でありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記ペムブロリズマブは、胃癌、肺癌、皮膚癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎臓癌および尿路上皮細胞癌よりなる群から選ばれる１つ以上の癌腫の治療に用いられるものでありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する製剤は、遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマー、またはプローブでありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記タンパク質レベルを測定する製剤は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体でありうる。
また、本発明は、ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する段階を含む、抗癌剤反応性予測のための情報提供方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記情報提供方法は、ＵＣＨＬ１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｌ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００４１８１）遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する段階をさらに含むことができる。
本発明の他の具現例において、前記ｍＲＮＡの発現レベルは、ナノストリングエンカウンター解析（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ；ＲＰＡ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、およびノーザンブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）よりなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて測定することができる。
本発明のさらに他の具現例において、前記タンパク質発現レベルは、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、オクタロニー（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、およびタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）よりなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて測定されることができる。
本発明のさらに他の具現例において、前記生物学的試料は、癌患者由来組織でありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記組織は、 パラフィン包埋組織（ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅ）でありうる。
本発明者らは、ペムブロリズマブ免疫抗癌剤治療を受けた胃癌患者由来組織サンプルを用いて前記抗癌剤に対する反応性予測用遺伝子セットを発掘し、アジア癌研究グループ（ＡＣＲＧ）のマイクロアレイデータおよびＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）コホートのＲＮＡ配列解析結果を用いて前記マーカーの有効性を検証したところ、本発明による遺伝子マーカーは、患者由来ホルマリン固定パラフィン包埋組織を活用して解析するので、別途のサンプル採取が不要で、解析が便利であり、前記免疫抗癌剤に対する反応性をあらかじめ予測できて、最適な治療法選択のための情報を提供できるので、臨床のコンパニオン診断分野において有用に用いられるものと期待される。
本発明によるペムブロリズマブに対する反応性予測用遺伝子マーカー発掘のための研究順序を簡略に示す図である。 固形腫瘍における反応評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ；ＲＥＣＩＳＴ）に基づいて分類された反応群（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）および非反応群（Ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅ）間に差次的発現遺伝子解析結果を示すボルケーノプロット結果である。 前記差次的発現遺伝子に対するエンリッチメント解析（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）結果を示す図である。 患者を２つの群に分類するためのＩＭＡＧｉＣスコアのカットオフカーブ、およびペムブロリズマブに対する反応性予測用ＩＭＡＧｉＣスコアのＡＵＣカーブを示す図である。 ＩＭＡＧｉＣモデル、ＲＥＣＩＳＴ群、エプスタイン・バール・ウイルス感染の有無（ＥＢＶ）およびマイクロサテライト不安定性の有無（ＭＳＩ）間の相関関係を解析した結果を示す図である。 ＲＥＣＩＳＴ群（ＣＲ：完全奏効、ＰＲ：部分奏効、ＳＤ：安定、ＰＤ：進行）間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＥＢＶサブタイプ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：ＥＢＶ陽性、Ｎｅｇａｔｉｖｅ：ＥＢＶ陰性）間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＭＳＩサブタイプ（ＭＳＩ：マイクロサテライト不安定、ＭＳＳ：マイクロサテライト安定）間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 突然変異負荷（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌｏａｄ；ＭＬ）（Ｈｉｇｈ ＭＬ，Ｍｏｄ ＭＬ，Ｌｏｗ ＭＬ）間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｃｏｒｅ）状態間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＴＣＧＡコホートにおける突然変異スペクトルを示す結果である。 ＭＳＩサブタイプ間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 腫瘍突然変異負荷を通じて分類された過突然変異グループとＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＡＣＲＧコホートでＩＭＡＧｉＣグループ（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ，Ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）間に全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）および無病生存率（Ｄｉｓｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）の差異を比較した結果である。 それぞれＡＣＲＧサブタイプ（ＭＳＩ、ＥＭＴ、ＭＳＳ／ＴＰ５３＋、ＭＳＳ／ＴＰ５３－）間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＭＳＩサブタイプ間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ｑＲＴ－ＰＣＲプラットフォームを用いてＩＭＡＧｉＣモデルの再現性を検証するためにＩＭＡＧｉＣモデル、ＲＥＣＩＳＴ群、ＥＢＶおよびＭＳＩ間の相関関係を解析した結果を示したのである。 ＲＥＣＩＳＴ群間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＭＳＩサブタイプ間にＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。 ＥＢＶサブタイプ間のＩＭＡＧｉＣスコアを比較したボックスプロット結果である。
本発明者らは、免疫抗癌剤であるペムブロリズマブに対する反応性予測のためのバイオマーカーを発掘するために研究努力した結果、ＡＲＭＣＸ１、ＰＲＫＤ１、ＴＹＫ２およびＵＣＨＬ１遺伝子をバイオマーカーとして発掘したところ、これに基づいて本発明を完成した。
これより、本発明は、ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、抗癌剤反応性予測用マーカー組成物を提供する。
また、本発明は、ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する製剤を含む、抗癌剤反応性予測用組成物、および前記組成物を含む癌患者の抗癌剤反応性予測用キットを提供する。
本発明において、前記癌患者の抗癌剤反応性予測用マーカーとしてＵＣＨＬ１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｌ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００４１８１）遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質をさらに含むことができる。
本発明では、具体的な実施例を通じて前記４種の遺伝子バイオマーカーを発掘し、具体的に、胃癌患者においてペムブロリズマブ治療に対する反応性予測用途として有効性を検証した。
本発明の一実施例では、ペムブロリズマブに対する反応性と関連して２１人の胃癌患者由来胃癌組織から遺伝子発現プロファイリングを解析し、固形腫瘍における反応評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ；ＲＥＣＩＳＴ）に基づいて反応群および非反応群間に有意に差次的発現遺伝子解析を通じて最終４個の遺伝子であるＰＲＫＤ１、ＡＲＭＣＸ１、ＴＹＫ２およびＵＣＨＬ１を発掘した（実施例２参照）。
本発明の他の実施例では、ペムブロリズマブに対する反応性を予測できるモデルを構築するために、前記選別された４個の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを用いて線形回帰解析を実施して、本発明によるペムブロリズマブに対する反応性予測用ＩＭＡＧｉＣモデルを構築した。しかも、前記モデルの敏感度、特異度および正確度を解析し、ペムブロリズマブに対するＩＭＡＧｉＣスコアおよびＲＥＣＩＳＴグループに基づいてＩＭＡＧｉＣグループとして反応群（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）および非反応群（Ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）に分類した。同じコホートでＩＭＡＧｉＣスコアは、ＲＥＣＩＳＴ群（ＣＲ、ＰＲ、ＳＤ、ＰＤ）（Ｐ＝０．００５７）、ＥＢＶ感染状態（Ｐ＝０．０４８）および腫瘍突然変異荷重（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌｏａｄ；ＭＬ）（Ｐ＝０．０２３）と有意な相関関係があることを確認した（実施例３参照）。
本発明のさらに他の実施例では、それぞれＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）コホートのＲＮＡ－シーケンシングデータおよびアジア癌研究グループ（Ａｓｉａ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ；ＡＣＲＧ）コホートのｍＲＮＡ発現アレイ結果を用いて本発明によるＩＭＡＧｉＣモデルの有効性を検証した。より具体的に、ＴＣＧＡコホートでは、ＩＭＡＧｉＣは、ＴＣＧＡ分子サブタイプ（Ｐ＝１．２１Ｅ－０４）、ＭＳＩ（Ｐ＝０．０１）、ＥＢＶ（Ｐ＝０．０９）およびＴＭＢ状態（Ｐ＝１．１９Ｅ－０５）と有意な相関関係があることが示され、ＩＭＡＧｉＣモデルが、無病生存率、ＡＣＲＧ分子サブタイプおよびＭＳＩと関連があることを確認した（実施例４参照）。
本発明のさらに他の実施例では、他の技術的方法であるｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＩＭＡＧｉＣモデルの再現性を評価し、その結果、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＩＭＡＧｉＣグループは、ＲＥＣＩＳＴ群、ＥＢＶおよびＭＳＩとも高い相関関係があることが示された。しかも、ニボルマブに対する臨床コホートを使用してＩＭＡＧｉＣ ｑＲＴ－ＰＣＲの結果を検証した結果、ＩＭＡＧｉＣの正確度が１００％であることが示された（実施例５参照）。
本発明において使用される用語、「抗癌剤」とは、より好ましくは、免疫抗癌剤であり、免疫システムを刺激して抗癌効果を誘導する癌治療剤を意味し、本願発明では、より好ましくは、ＰＤ－１拮抗剤を意味し、さらに好ましくは、前記ＰＤ－１拮抗剤は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ，ｔｒａｄｅ ｎａｍｅ；Ｋｅｙｔｒｕｄａ）でありうる。
本発明において使用される用語、「拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」とは、任意の生体作用物質の受容体結合に拮抗的に作用するが、自分は各受容体を通した生理作用を示さない物質を意味し、本発明のＰＤ－１拮抗剤であるペムブロリズマブは、免疫細胞の表面に発現しているＰＤ－１に結合して、そのリガンドである癌細胞の表面に発現するＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との相互作用を阻害する機能を有する。
前記免疫抗癌剤による免疫治療中、受動免疫治療は、体外で多量で形成された免疫反応成分、例えば、免疫細胞、抗体、サイトカイン等を癌患者に注入して癌細胞を攻撃する治療方法であり、能動的免疫治療は、個人の抗体と免疫細胞を能動的に活性化または生産するようにして、癌細胞を攻撃する治療方法である。本発明は、このような免疫治療に対して癌患者のペムブロリズマブ治療時にこれに対する反応性を予測するためのバイオマーカーおよびその用途に関する。
本発明において、前記ペムブロリズマブは、胃癌、肺癌、皮膚癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎臓癌および尿路上皮細胞癌よりなる群から選ばれる１つ以上の癌腫の治療に用いられるものであり得、より好ましくは、胃癌の治療に用いられるものでありうるが、これらに制限されるものではない。
本発明において「抗癌剤反応性予測」とは、患者が免疫抗癌剤に対して選好的にまたは非選好的に反応するか否かを予測すること、または抗癌剤に対する耐性の危険性を予測すること、免疫治療後に患者の予後、すなわち再発、転移、生存、または無病生存等を予測することを意味する。本発明による治療反応性予測のためのバイオマーカーは、癌患者、より好ましくは、胃癌患者に対する最も適切な免疫治療方式を選択するようにするための情報を提供することができる。
前記抗癌剤反応性予測用マーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する製剤は、ｍＲＮＡに相補的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマー、またはプローブでありうるが、これらに制限されるものではない。
本発明において使用される用語、「プライマー」とは、ＤＮＡ合成の起始点となる短い遺伝子配列であり、診断、ＤＮＡシーケンシング等に用いる目的で合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。前記プライマーは、通常、１５～３０塩基対の長さで合成して使用することができるが、使用目的によって変わることができ、公知の方法でメチル化、キャップ化等で変形させることができる。
本発明において使用される用語、「プローブ」とは、酵素化学的な分離精製または合成過程を経て製作された数塩基～数百塩基の長さのｍＲＮＡと特異的に結合できる核酸を意味する。放射性同位元素、酵素、または蛍光体等を標識して、ｍＲＮＡの存在有無を確認でき、公知の方法でデザインし、変形させて使用することができる。
前記タンパク質レベルを測定する製剤は、遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体でありうるが、これに制限されるものではない。
本発明において使用される用語、「抗体」とは、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体および多クローン（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体を全部含む。また、前記抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）および異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体）のような遺伝工学によって生産された形態を全部含む。
本発明の抗癌剤反応性予測用キットは、解析方法に適合した一種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置で構成することができる。
本発明の他の様態として、本発明は、被検者由来の生物学的試料においてＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２）遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する段階を含む抗癌剤反応性予測のための情報提供方法を提供する。
前記ｍＲＮＡの発現レベルは、当業界に知られた通常の方法によってナノストリングエンカウンター解析（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ；ＲＰＡ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、およびノーザンブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）よりなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて測定できるが、これらに制限されるものではない。
前記タンパク質発現レベルは、当業界に知られた通常の方法によってウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、オクタロニー（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、およびタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）よりなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて測定できるが、これらに制限されるものではない。
前記生物学的試料は、癌患者由来組織であり、より好ましくは、ホルマリン等の固定液で固定して、パラフィンに包埋した組織を含むが、これに制限されるものではない。
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．実験準備および実験方法
１－１．対象胃癌患者の選定
本実施例では、２０１３年から２０１７年までペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）に対する臨床反応を評価するために、予備単一部位、２相臨床試験に登録された６１人の転移性胃癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ；ｍＧＣ）患者を募集した。その中で、原発性腫瘍組織の利用可能性とペムブロリズマブに対する臨床的反応に基づいて２１人の患者ケースを選別した。下記表１にまとめて示したように、選別した患者の平均年齢が５７歳（２６～７８歳）であり、マイクロサテライト不安定性群（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ＭＳＩ）の胃癌患者が４人（１９．０５％）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）陽性胃癌患者が２人（９．５２％）含まれており、人口統計学的特徴および治療結果を含む臨床データは医療記録を検討して得られた。
Figure 2022518249000002
１－２．ＲＮＡ抽出
ホルマリン固定パラフィン包埋組織からトータルＲＮＡを分離するために、各胃癌患者由来組織ブロックを厚さ４μｍの切片に切断した。その後、製造社の指示によってＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＲＮＡを分離した。より詳細には、切断された組織を脱パラフィン化し、タンパク質分解酵素Ｋ処理、カラム上でのＤＮＡｓｅ分解を経てＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを用いてＲＮＡを抽出した。前記方法で分離したトータルＲＮＡサンプルは、使用前まで－８０℃に保管し、ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
１－３．ナノストリング解析を通した遺伝子発現プロファイリング
遺伝子の発現プロファイリングのために、前記実施例１－２によって胃癌組織サンプルから分離したＲＮＡを用いてナノストリング解析（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）を実施した。上記解析のために、本発明者らは、間葉シグニチャーおよび腫瘍免疫の包括的な解析によって確認された宿主免疫反応遺伝子と関連した１６８個の遺伝子に対するプローブを製作した。対照群としては、１１個のハウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝子および１４個の技術的な内部対照群遺伝子を追加した。引き続いて、標準プロトコル「Ｓｅｔｔｉｎｇ ｕｐ １２ ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｓｓａｙｓ（ＭＡＮ－Ｃ０００３－０３，２００８－２０１３）」によってナノストリング解析を行った。１８時間培養してハイブリダイゼーション反応を誘導し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアを用いてデータを解析した。ハウスキーピング遺伝子および内部対照群遺伝子を用いてデータを正規化し、ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ４．０）でｌｏｇ１０スケールに変換した。
１－４．ペムブロリズマブに対する反応によって差次的発現遺伝子解析
ペムブロリズマブに対する反応性を予測できる遺伝子シグニチャーを発掘するために、ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアを用いて差次的発現遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ；ＤＥＧ）解析を実施した。ペムブロリズマブに対する反応性のあるグループと反応性のないグループを比較することによって、差次的発現遺伝子を確認するために、カットオフ値としてＰ値は＜０．０１に設定した。
１－５．ペムブロリズマブに対する反応性予測モデルの開発およびＴＣＧＡとＡＣＲＧコホートにおける有効性検証
ペムブロリズマブに対する予測モデルを構築するために、有意に異なる発現パターンを示す遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルおよび胃癌組織のＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳを線形回帰モデルを使用して解析した。予測モデルは、ＲＯＣ曲線の下面積（ＡＵＣ）で敏感度と特異度を計算することによって評価した。転移性胃癌患者を反応群（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）および非反応群（ｎｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に分類するためのカットオフ値は、ＡＵＣパッケージで正確性機能によって定義された。
しかも、本発明による予測モデルを評価するために、交差検証を１０回行い、各検証結果に対してＲＭＳＥ（ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅｄ ｅｒｒｏｒ）を計算した。また、ＭＳＩ、ＥＢＶ陽性およびＴＭＢが免疫治療に対する反応性と密接な関連があると知られているので、ＴＣＧＡのＲＮＡ配列解析データおよびＡＣＲＧのマイクロアレイデータを用いて本発明の結果を検証した。ＣｏｍＢａｔ関数は、有効性検証データとテストデータが互いに異なるプラットフォームを有するので、ｓｖａパッケージを使用して遺伝子発現データを調整するのに用いた。すべての統計解析および視覚化したプロットは、Ｒプログラム（Ｒバージョン３．４．４）で行われた。総突然変異の割合は、メガベース当たり体細胞非同義単一ヌクレオチド変異体（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔ；ＳＮＶ）突然変異の数で計算され、高い突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｌｏａｄ；ＭＬ）に対する臨界値は上位三分位数に設定された。
１－６．定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いた検証
他の技術的プラットフォームで本発明によるＩＭＡＧｉＣモデルの再現性を評価するために、５μｌ ２Ｘ Ｔａｑｍａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、４μｌ ｃＤＮＡサンプル、および１μｌプライマー／プローブを含む１反応当たり最終１０μｌボリュームの反応溶液で３８４ウェルプレートで７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行う条件を設定した。ＰＣＲ増幅は、下記条件によって行い、同一サンプルをそれぞれ独立的な３個のウェルで増幅されるようにした：５０℃で２分および９４℃で１０分、引き続いて９５℃で１５秒および６０℃で６０秒を４０サイクル反復。
１－７．ＰＤ－Ｌ１に対する免疫組織化学染色法
ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）サンプルの各代表されるセクションを用いて免疫組織化学染色（ＩＨＣ）を実施した。ＰＤ－Ｌ１の染色は、ＦＤＡ承認された単クローンマウス抗体であるＰＤ－Ｌ１ ２２Ｃ３ ｐｈａｒｍＤｘ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して行った。また、熟練した病理学者（ＫＭＫ）を通じてＰＤ－Ｌ１で染色されたＩＨＣスライド結果を解析した：ＣＰＳは、ＰＤ－Ｌ１で染色された細胞（腫瘍細胞、リンパ球、大食細胞）の数を合計し、その結果を全体生存した腫瘍細胞の数で割った後、１００をかけた後、ＰＤ－Ｌ１ ＩＨＣ ２２Ｃ３ ｐｈａｒｍＤｘ使用指針に従って評価した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｃｓ／ｌｉｂｒａｒｙ／ｕｓｅｒｍａｎｕａｌｓ／ｐｕｂｌｉｃ／ ２９２１９＿ｐｄ－ｌ１－ｉｈｃ－２２Ｃ３－ｐｈａｒｍｄｘ－ｇａｓｔｒｉｃ－ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ－ｍａｎｕａｌ＿ｕｓ．ｐｄｆ）。ＰＤ－Ｌ１ ＩＨＣ結果は、スコアが１以上なら陽性であり、１未満なら陰性と解析した。
実施例２．ペムブロリズマブに対する反応によって差次的発現遺伝子の確認
ペムブロリズマブに対する反応性と関連して２１人の胃癌患者由来胃癌組織から遺伝子発現プロファイリングを解析した。固形腫瘍における反応評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ；ＲＥＣＩＳＴ）に基づいてペムブロリズマブに対する反応性によって４個群に分類し、その結果、完全奏効（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＣＲ）が４ケース、部分奏効（ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＰＲ）が４ケース、安定（ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＤ）が５ケース、および進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）が１０ケースに分類された。
ペムブロリズマブに対する反応性予測シグニチャー遺伝子を選別するために、ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアを使用して図２ａに示されたようにＤＥＧ解析を実施した。その後、すべての差次的発現遺伝子（ＤＥＧｓ）を用いてエンリッチメント解析（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った（Ｐ値＜０．０５）。その結果、図２ｂに示されたように、すべてのＤＥＧｓは、抗原処理および提示（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）と自然免疫反応（Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をはじめとしてＥＢＶ感染（ＥＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）および免疫反応（Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）と最も有意に関連があり、これは、ペムブロリズマブに対する反応性を予測するのに最も重要な因子が免疫反応に関連していることを意味することである。
これより、最終的に、図２ａのＤＥＧ解析結果を通じてペムブロリズマブ治療に対して反応群および非反応群間に有意に差次的に発現した４個の遺伝子であるＵＣＨＬ１、ＰＲＫＤ１、ＡＲＭＣＸ１およびＴＹＫ２を選別した（Ｐ＜０．０１）。
実施例３．ペムブロリズマブに対する反応性予測用ＩＭＡＧｉＣモデルの構築
ペムブロリズマブに対する反応性を予測できるモデルを構築するために、ＤＥＧから選別された４個の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを用いて線形回帰解析を実施した。またＰＤ－Ｌ１の発現は、ペムブロリズマブ反応に対する重要なバイオマーカーであるから、ＩＭＡＧｉＣにまたＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳを用いた。しかも、前記方法によって構築されたＩＭＡＧｉＣモデルの性能を評価するために、同じ患者コホートで前記モデルを検証した。その結果、図２ｃに示されたように、すべてのＩＭＡＧｉＣグループは、ペムブロリズマブに対する反応に完ぺきにマッチした。ＩＭＡＧｉＣモデルの敏感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）および正確度（Ａｃｃｕｒａｃｙ）は、ＡＵＣ方法を使用して計算され、全部１００％であることが確認された。しかも、選択されたデータの偏向を減らし、ＩＭＡＧｉＣモデルの性能を向上させるために、１０倍交差検証を行った。２１個のすべてのサンプルを使用してＩＭＡＧｉＣモデルを構築し、各交差検証段階ごとに１０個のグループに分類した；１０個のグループのうち９個がテストに使用され、残りのグループは有効性検査に使用された。平均ＲＭＳＥは１．７５１であった。
ＩＭＡＧｉＣグループは、ペムブロリズマブに対するＩＭＡＧｉＣスコアおよびＲＥＣＩＳＴグループに基づいて開発され、ＩＭＡＧｉＣスコアのカットオフ値は、ＡＵＣパッケージの正確度機能を使用して２．５０６９に設定した。最終的に、転移性胃癌患者は、ＩＭＡＧｉＣに基づいて反応群（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）および非反応群（Ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）に分類された。図３ａに示されたように、ＩＭＡＧｉＣスコアは、ＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳ(ｒ２＝０．６４）、ＲＥＣＩＳＴ群（ｒ２＝０．８３）およびＥＢＶ感染状態（ｒ２＝０．５６）と相関関係があることが示された。また、それぞれ図３ｂ～図３ｆから分かるように、ＩＭＡＧｉＣスコアは、ＲＥＣＩＳＴ群（ＣＲ、ＰＲ、ＳＤ、ＰＤ）（Ｐ＝０．００５７）、ＥＢＶ感染状態（Ｐ＝０．０４８）および腫瘍突然変異荷重（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌｏａｄ；ＭＬ）（Ｐ＝０．０２３）と有意な相関関係があることを確認し、これに対し、ＭＳＩサブタイプ（Ｐ＝０．１４）およびＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳ（Ｐ＝０．０９５）とは有意な関連性がないことが示された。
実施例４．ＴＣＧＡおよびＡＣＲＧコホートでＩＭＡＧｉＣの解析
従来、ＰＤ－１封鎖がＭＳＩおよびＥＢＶ陽性腫瘍だけでなく、高いＭＬを有する腫瘍に対しても効果的であることが報告されたので、本発明者らは、ＴＣＧＡ ＲＮＡ－シーケンシングデータ（ｎ＝２６０）およびＡＣＲＧ ｍＲＮＡ発現アレイ結果（ｎ＝３００）に対してＩＭＡＧｉＣ予測モデルを適用し、その有効性を検証した。
まず、ＴＣＧＡグループに含まれた胃癌サブタイプを解析した結果、図４ａに示されたように、ＭＳＩ胃癌が５９ケース（２２．７％）、ＥＢＶ陽性胃癌が２４ケース（９．２％）、ＴＭＢが高い下位類型の胃癌が６１ケース（２３．５％）含まれており、総突然変異率は、４つの分子サブタイプで区別された。しかも、ＩＭＡＧｉＣとＴＣＧＡコホートに含まれた各サブタイプ胃癌間の相関関係を解析した結果、下記表２に示されたように、ＩＭＡＧｉＣは、ＴＣＧＡ分子サブタイプ（Ｐ＝１．２１Ｅ－０４）、ＭＳＩ（Ｐ＝０．０１）、ＥＢＶ（Ｐ＝０．０９）およびＴＭＢ状態（Ｐ＝１．１９Ｅ－０５）と有意な相関関係があることが示された。すなわち、ＭＳＩまたはＥＢＶ陽性胃癌を有する多くの患者がＩＭＡＧｉＣによって反応群に分類された。また、図４ｂおよび図４ｃから分かるように、ＭＳＩおよびＴＭＢと関連した胃癌においてＩＭＡＧｉＣスコアは、マイクロサテライト安定（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ－ｓｔａｂｌｅ；ＭＳＳ）および非ＴＭＢグループのスコアより有意にさらに高く示されたことを確認した。
Figure 2022518249000003
一方、ＡＣＲＧコホートの場合には、下記表３に示されたように、ＭＳＩ胃癌が６８ケース（２２．７％）、ＥＢＶ陽性胃癌が１８ケース（６．０％）含まれていた。また、ＩＭＡＧｉＣグループである反応群（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）および非反応群（Ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）間の全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）および無病生存率（Ｄｉｓｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）の差異を比較し、ＡＣＲＧ分子サブタイプ（ＭＳＩ、ＥＭＴ、ＭＳＳ／ＴＰ５３＋、ＭＳＳ／ＴＰ５３－）およびＭＳＩ（ＭＳＩ－Ｈ、ＭＳＳ）サブタイプグループにおいてＩＭＡＧｉＣスコアを比較した結果、図５ａ～図５ｃに示されたように、ＩＭＡＧｉＣモデルが無病生存率、ＡＣＲＧ分子サブタイプ（Ｐ＝１．９６Ｅ－０８）およびＭＳＩ（Ｐ＝０．００６）と関連があることを確認した。
Figure 2022518249000004
実施例５．ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたＩＭＡＧｉＣの再現および検証
臨床実務での利用のために、本発明者らは、他の技術的方法でＩＭＡＧｉＣモデルの再現性を評価した。このために、同じコホートで２４人の患者由来ｍＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。その結果、図６ａ～図６ｄに示されたように、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＩＭＡＧｉＣグループは、ＲＥＣＩＳＴ群（ｒ２＝０．８２）、ＥＢＶ（ｒ２＝０．４８）およびＭＳＩ（ｒ２＝０．６６）とも高い相関関係があることが示された。ＩＭＡＧｉＣの再現性に対する正確度は８７．５％であった（正の予測値、８７．５％；負の予測値、１２．５％）であった。
しかも、転移性胃癌を有する他の患者群においてＩＭＡＧｉＣ ｑＲＴ－ＰＣＲの結果を検証するために、本発明者らは、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（Ｏｐｄｉｖｏ，Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．）で進行中の臨床試験で確保された１７個の患者サンプルを用いた。下記表４に示されたように、すべてのケースがＥＢＶ陰性であり、大部分（９４．１％）がＭＳＳおよびＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳ陰性であった。ＭＳＩ、ＥＢＶ陽性および陽性ＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳがペムブロリズマブに対する反応性と関連があるという最近の臨床試験および研究結果と一致するように、大部分のケースが、ＲＥＣＩＳＴ群に基づいてＩＭＡＧｉＣグループにおいて非反応群に分類された。また、ＩＭＡＧｉＣ ｑＲＴ－ＰＣＲモデルが元のものと同じ正確度を有するか否かを調査するために、前記ニボルマブコホートを使用してＩＭＡＧｉＣの正確度を計算し、その結果、正確度が１００％であることが示された（正の予測値、１００％；負の予測値、０％）。
Figure 2022518249000005
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。
本発明において発掘した遺伝子マーカーは、ペムブロリズマブ免疫抗癌剤に対する反応性をあらかじめ予測するのに用いることができて、個別癌患者別に最適な治療法を選択し、これによって、治療効果を高め、副作用を最小化できるところ、前記マーカーは、臨床のコンパニオン診断分野において有用に活用することができる。

Claims (19)

  1. ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、抗癌剤反応性予測用マーカー組成物。
  2. 前記マーカー組成物は、ＵＣＨＬ１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｌ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００４１８１）遺伝子または前記遺伝子によってコードされるタンパク質をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のマーカー組成物。
  3. 前記抗癌剤は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）拮抗剤であることを特徴とする、請求項１に記載のマーカー組成物。
  4. 前記ＰＤ－１拮抗剤は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であることを特徴とする、請求項３に記載のマーカー組成物。
  5. 前記ペムブロリズマブは、胃癌、肺癌、皮膚癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎臓癌および尿路上皮細胞癌よりなる群から選ばれる１つ以上の癌腫の治療に用いられることを特徴とする、請求項４に記載のマーカー組成物。
  6. ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する製剤を含む、抗癌剤反応性予測用組成物。
  7. 前記組成物は、ＵＣＨＬ１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｌ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００４１８１）遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する製剤をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記抗癌剤は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）拮抗剤であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記ＰＤ－１拮抗剤は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記ペムブロリズマブは、胃癌、肺癌、皮膚癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎臓癌および尿路上皮細胞癌よりなる群から選ばれる１つ以上の癌腫の治療に用いられることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する製剤は、遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマー、またはプローブであることを特徴とする、請求項６または７に記載の組成物。
  12. 前記タンパク質レベルを測定する製剤は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体であることを特徴とする、請求項６または７に記載の組成物。
  13. 請求項６または７に記載の組成物を含む、抗癌剤反応性予測用キット。
  14. ＡＲＭＣＸ１（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿０１６６０８）、ＰＲＫＤ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００２７４２）およびＴＹＫ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ２；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００３３３１）よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する段階を含む、抗癌剤反応性予測方法。
  15. 前記情報提供方法は、ＵＣＨＬ１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｌ１；ＮＣＢＩアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号：ＮＭ＿００４１８１）遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質レベルを測定する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の予測方法。
  16. 前記ｍＲＮＡレベルは、ナノストリングエンカウンター解析（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ；ＲＰＡ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、およびノーザンブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）よりなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて測定されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の予測方法。
  17. 前記タンパク質レベルは、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、オクタロニー（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、およびタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）よりなる群から選ばれる１種以上の方法を用いて測定されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の予測方法。
  18. 前記生物学的試料は、癌患者由来組織であることを特徴とする、請求項１４に記載の予測方法。
  19. 前記組織は、 パラフィン包埋組織（ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅ）であることを特徴とする、請求項１８に記載の予測方法。
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