KR20170138955A - 단백질 카이네이즈 d1 저해제를 포함하는 유방암 치료제 조성물 - Google Patents

단백질 카이네이즈 d1 저해제를 포함하는 유방암 치료제 조성물 Download PDF

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Abstract

인간 유방암의 특징 중 하나는 암 줄기세포성인데, 이는 자기개조 능력 및 약물 저항성으로 특징지어진다. 단백질 카이네이즈 D1 (PRKD1)은 많은 세포 과정의주요 조절자로서 기능하며 침윤성 유방암세포에서 저하조절된다. 본 발명은 PRKD1이 약물 저항성 특징이 있는 MCF-7-ADR 인간 유방암 세포에서 상향조절됨을 밝혔다. 또한, 본 발명자들은 miR-34a가 PRKD1 3'-UTR에 결합함으로써 PRKD1 발현이 음의 방향으로 조절됨을 밝혔다. MCF-7-ADR 세포에서 PRKD1 발현은 종양구 형성분석 수행 이후 증가하였다. 본 발명자들은 또 유방암 줄기세포에서 전위 miR-34a발현 또는 PRKD1 siRNA 처리에 의한 PRKD1 감소가 자기개조 능력을 억제함을 밝혔고, 나아가, PRKD1 저해제 CRT0066101이 인산화된 PKD/PKCμ를 감소시켜, GSK3/β-카테닌 신호전달을 통하여 유방암 줄기세포성을 억제함을 확인하였다. MCF-7-ADR 세포에서 PRKD1 저해는 또한 세포자기사멸 개시에 영향을 주었다. miR-34a 또는 CRT0066101로 처리된 누드 마우스의 종양에서는 종양 성장, 증식 및 유도된 세포자기사멸이 억제되었다. 이러한 결과는 새로운 miR-34a의 표적인 PRKD1 조절이 인간유방암에서 암세포 줄기성 및 약물 저항성을 극복하는데 기여할 것임을 입증한다.

Description

단백질 카이네이즈 D1 저해제를 포함하는 유방암 치료제 조성물{Therapeutic compositions for breast cancer containing protein kinase D1}
본 발명은 단백질 카이네이즈 D1(protein kinase D1) 저해제를 포함하는 유방암 줄기세포 억제용 조성물 및 유방암 재발 방지용 항암 보조제에 관한 것이다.
유방암은 가장 일반적인 종양이며 세계적으로 여성의 종양관련 사망 원인 중 1위를 차지한다 [1]. 환자의 생존율을 개선하려는 노력에도 불구하고 종양 전이 및 약물 저항성을 포함하여 유방암 치료 관련 문제들이 여전히 존재한다 [2,3]. 종양은 종양줄기세포 (cancer stem cells; CSCs) 및 종양 덩어리를 형성하는 비-종양형성 세포 (non-tumorigenic cells)로 이루어진다 [4]. 종양줄기세포는 종양, 종양 전이, 약물 저항성 및 종양 재발의 원인으로 생각된다 [5]. 특히, 유방암 종양줄기세포 (BCSC)는 줄기세포의 특성을 나타내며 세포 표면 마커 CD44+/CD24-의 발현으로 특징지어진다 [6]. 인간 유방암 줄기세포의 형성과 조절에는 서로 다른 miRNA들이 관여하며 [7], 선행 연구들에 따르면 miR-34c의 전위 발현 (ectopic expression)이 상피-간엽세포 이행을 억제하고 인간 유방암 줄기세포에서 자기재생능력을 감소시킨다 [8].
세린/트레오닌-단백질 카이네이즈 D1 (PRKD1)은 다이아실글리세롤과 단백질 카이네이즈 C (PKC) 효과인자로 작용하여 자극 활동을 매개한다 [9]. PKD/PKCμ 관련 세포과정은 PKC-의존적 인산화 (Ser744/Ser748) 및 PKC-비의존적 자기인산화 (Ser910)를 통해 두 가지 인산화에 의해 활성화되었다 [10-13]. 그러므로, PRKD1은 NF-kB 신호전달경로, 세포주기 진행 및 DNA 합성, 그리고 다른 병인 조건 (pathogenic condition)의 조절을 포함하는 여러 세포 과정의 주요 조절인자로 생각된다 [14-16].
유방암에서 마이크로RNA는 세포자기사멸, 종양형성 및 혈관형성을 조절한다. 종양 억제의 주요 조절인자인 miR-34는 종양 억제자 p53의 직접적인 전사 표적이며, miR-34a 프로모터 부분은 p53-결합부위를 포함한다 [17]. 유방암 연구에서, miR-34a는 DNA가 손상된 이후 방사선 조사 후 p53을 상향조절함으로써 세포 생존을 억제하는 역할을 수행한다 [18]. 또한, miR-34a는 Bcl-2 및 SIRT1을 표적으로 함으로써 종양세포 자기사멸을 촉진하였다 [19]. 그러므로, miR-34a는 유방암을 유도하는 표적과 관련이 있다.
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본 발명은 좀 더 효과적인 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하려는 것을 목표로 한다.
또한, 본 발명은 좀 더 효과적으로 항암제 내성 유방암의 약물 민감성을 회복시키는 보조제를 제공하려는 것을 목표로 한다.
아울러, 본 발명은 좀 더 효과적으로 유방암 재발 억제용 약학적 조성물을 제공하려는 것을 목표로 한다.
본 발명자들은 MCF-7-ADR 세포에서 과발현된 PRKD1이 miR-34a에 의해 저해됨을 밝혔다. 뿐만 아니라, PRKD1은 글라이코젠 합성효소 카이네이즈 3(GSK3)/β-카테닌 신호전달을 통해 유방암 줄기세포에서 자기재생능력을 활성화하였고, 약물 저항성을 제거하는데 기여하였다. 이러한 결과들은 miR-34a의 새로운 표적으로서 PRKD1이 인간 유방암 치료에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 말해준다.
본 발명은 단백질 카이네이즈 D1(protein kinase D1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 상기 단백질 카이네이즈 D1은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 상기 단백질 카이네이즈 D1은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 유사체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 단백질 카이네이즈 D1 발현 억제제는 단백질 카이네이즈 D1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 miR-34a로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 단백질 카이네이즈 D1 활성 억제제는 단백질 카이네이즈 D1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 CRT0066101로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 상기 암은 암 줄기세포 마커인 CD44+ 및 CD24-로 선별되는 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 상기 암은 유방암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나인 것이 바람직하고, 유방암인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 암세포 재발과 전이를 피하고 암을 완전히 제거하기 위해서는 암세포만을 공격하는 현재의 암치료법이 가지고 있는 한계를 넘어, 줄기세포의 특성을 갖는 암 줄기세포를 표적으로 하여 암 줄기세포를 제거하는 게 필요하며, 본 발명은 상기 암 줄기세포, 특히 유방암 줄기세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하며, 상기 암 줄기세포를 억제하여, 암 재발을 방지할 수 있다.
본 발명은 단백질 카이네이즈 D1(protein kinase D1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 카이네이즈 D1 저해제가 유방암 세포의 줄기성을 저해함을 특징으로 하는 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 단백질 카이네이즈 D1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 재발 방지용 항암 보조제에 관한 것이다.
또한 본 발명의 조성물은 유방암 줄기세포의 성장을 유의적으로 억제하므로, 유방암 재발을 억제할 수 있는 항암 보조제에 관한 것이다.
본 발명은 개체에 단백질 카이네이즈 D1의 발현 또는 활성 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 유방암 줄기세포 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체에서 단백질 카이네이즈 D1(protein kinase D1)의 발현 또는 활성 여부를 확인하여 유방암 재발 여부를 판단하는 단계를 포함하는 유방암 예후 측정방법을 제공한다.
유방암 줄기세포에서 단백질 카이네이즈 D1이 발현되고, 이를 억제할 경우, 유방암 줄기세포 성장이 유의적으로 억제되므로, 단백질 카이네이즈 D1의 발현 또는 활성 억제제는 유방암 줄기세포 억제에 유용하게 사용될 수 있고, 또한 유방암 줄기세포로 인해 유방암이 재발할 위험이 있으므로, 단백질 카이네이즈 D1의 발현 또는 활성 여부 측정을 통해 유방암 예후를 측정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 방사선 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법 등과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 임상 투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
본 발명의 단백질에 대한 억제제가 항체일 경우 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질로 구성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 가용화제 등이 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 복강 내, 흉골내, 경피, 비측 내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 "유효량"은 유방암 증식, 전이, 줄기세포 성장을 억제하는 효과를이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자 또는 단백질의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/㎏~10㎎/㎏, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/㎏~10㎎/㎏, 화합물일 경우 0.1ng/㎏~10㎎/㎏, 상기 단백질에 대한 단일클론 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
아울러, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 PRKD1을 타겟으로 하는 siRNA, 이의 항체 등을 제조하는 것은 하기와 같이 자명한 사항이다.
안티센스 뉴클레오티드
안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포주흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
펩티드 미메틱스(Peptide Minetics )
상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 PRKD1 활성을 이끄는 PRKD1 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J Med chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce chemical co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al. in Peptides; chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al. Biochem Biophys Res commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al. in Peptides: chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.
siRNA 분자
센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 PRKD1 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는 PRKD1 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, PRKD1 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.
항체
PRKD1 항체는 PRKD1 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.
다클론 항체는 상기 PRKD1을 동물에 주사하고, 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.
단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포주 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; cote RJ et al., Proc Natl ACad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 cole SP et al., Mol cell Biol 62:109-120, 1984).
또한, 상기 PRKD1에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).
상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
앱타머( Aptamer )
앱타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346:818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되었다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따르면 PRKD1 발현 및/또는 활성을 억제하면 유방암 세포의 줄기세포화가 억제되었다. 따라서, PRKD1의 발현 또는 활성에 대한 저해제를 이용하면 유방암의 줄기세포화에 의한 증식, 전이 또는 재발을 억제하는 용도로 이용할 수 있고, 유방암의 약물 민감성을 회복시킬 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 PRKD1이 miR-34a의 새로운 표적임을 밝힌다. 도 1a: 다양한 인간 유방암 세포주에서 PRKD1 mRNA 발현과 miR-34a 발현을 qRT-PCR로 정량하였다. 도 1b: miRNA-34 변이체를 트랜스펙션하고 48시간 후 얻은 단백질, mRNA 및 총 RNA이다. 웨스턴 블롯은 세 번의 독립적 실험의 대표값이다. β-액틴은 로딩 대조군으로 이용하였고 PRKD1 mRNA 및 miR-34 변이체 발현을 확인하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였다. miR-34a, b 및 c의 발현 수준은 miR-34a, b 및 c 각각의 전위 발현 이후 탐지하였다. 도 1c: 야생형/돌연변이형 PRKD1 3'-UTR로부터 예측되는 miR-34a 결합부위 및 리포터 구축물. 3'-UTR 리포터 구축물의 활성은 코트랜스펙션된 phRL-Luc 벡터의 활성에 대비해 정상화하였다. 그래프는 세 번의 독립적 실험에서 얻은 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. * p < 0.05; ** p < 0.001; *** p < 0.0001.
도 2는 MCF-7-ADR 세포에서 GSK3/β-카테닌 신호전달을 통해 유방암 줄기세포성에 대한 PKD/PKCμ 저하조절의 효과를 나타낸다. 모든 결과는 다섯 번 이상의 독립적인 실험에서 얻은 것이다. 도 2a와 도 2b: miR-34a 전구체와 PRKD1 siRNAs(15 nM)를 MCF-7-ADR 세포에 트랜스펙션하고 miR-34a와 PRKD1 발현을 qRT-PCR로 확인하였다. GSK3/β-카테닌 신호전달을 웨스턴 블롯 분석하였다. β-액틴은 로딩 대조군으로 이용하였다. 도 2c: 2차원 배양 MCF-7 세포와 비교하여 MCF-7-ADR 세포 유래 종양구에서 PKD/PKCμ의 기본 인산화 및 발현을 나타낸다. 도 2d: 배율 400×으로 Olympus IX71을 이용하여 종양구 형성 공초점 대표 영상을 캡처하였다. 크기 막대는 50 ㎛. 도 2e: MCF-7-ADR 배양세포에서 유방암 줄기세포 마커의 세포 표면 발현을 분석한 것이다. 히스토그램은 다섯 번의 독립적 실험 결과를 나타낸다. 백분율은 각 사분위의 세포수를 나타낸다. 막대는 세 번씩 수행한 각 시료를 나타내며 오차 막대는 ± 표준편차를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.001; *** p < 0.0001.
도 3a 내지 3c는 MCF-7-ADR 세포주에서 GSK3/β-카테닌 신호전달을 통해 유방암 줄기세포성에 미치는 CRT0066101의 영향을 나타낸다. 도 3a: 0.1-10 μM의 CRT0066101 처리 후 GSK3/β-카테닌 신호전달을 웨스턴 블롯 분석하였다. 블롯은 다섯 번의 독립적인 실험을 나타낸다. β-액틴은 로딩 대조군으로 이용하였다. 도 3b: 종양구를 증류수 (대조군) 또는 1 μM 또는 5 μM CRT0066101로 처리하였다. 종양구 형성의 대표적인 공초점 영상은 Olympus IX71을 이용하여 배율 400×으로 촬영하였다. 크기 막대는 50 ㎛를 나타낸다. 그래프는 2000 세포당 종양구의 수를 나타낸다. 도 3c: CRT0066101 처리 후 MCF-7-ADR 세포 표면의 CD44+/CD24- 발현을 분석한 것이다. 히스토그램은 세 번의 독립적 실험결과를 나타낸다. 백분율은 각 사분위의 세포수를 나타낸다. * p < 0.001; ** p < 0.0001; *** p < 0.0001.
도 4a 내지 4e는 MCF-&-ADR 세포 자기사멸에 대한 PKCμ의 저해효과를 나타낸다. 도 4a: 대조군 벡터 또는 PRKD1 siRNA로 MCF-7-ADR 세포를 트랜스펙션한 후 세포 생존율을 탐지하였다. PRKD1 발현을 녹다운한 후 투여량을 달리 하여 독소루비신을 처리하고 세포 생존율을 측정하였다. 도 4b: PRKD1 저하조절 이후 캐스페이즈-3 활성 수준 및 독소루비신 처리 이후 캐스페이즈-3 활성 수준. 도 4c: MCF-7-ADR 세포에서 CRT0066101 70시간 처리 (0.1-5 μM) 후 WST-8 분석 결과. 광학 밀도는 450 nm에서 측정하였다. 도 4d: 1 μM/2 μM CRT0066101 또는 10 μM 독소루비신 처리 후 캐스페이즈-3 활성을 측정하였다. 상대적 캐스페이즈-3 활성은 405 nm에서 측정하였다. 도 4e: 아넥신 V/PI-염색한 세포 사진은 200배 배율로 공초점 현미경으로 촬영하였다. 크기막대: 50 ㎛. 데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. * p < 0.05; ** p < 0.001.
도 5a 내지 도 5g는 이종이식 모델에서 PKCμ 저하조절이 종양형성을 억제함을 나타낸다. 도 5a: 대조군과 miR-34a 과발현 종양에서 PRKD1 mRNA 발현을 qRTPCR로측정하였다. 도 5b: 대조군과 miR-34a 과발현 종양에서 PKCμ 및 PCNA 발현을 탐지하기 위해 면역조직화학을 수행하였다. 배율: 200X; 크기 막대: 10 ㎛. 도 5c: TUNEL 분석 및 DAPI 염색을 수행하였다. 배율: 400×; 크기 막대: 20 ㎛. 도 5d: 누드 마우스에 확립된 종양에 4주간 매일 CRT0066101 (65 mg/kg)을 구강 투여하였다. 대표적인 세 마리의 이종이식 결과이다. 도 5e: 대조군 종양과 비교하여 CRT0066101 처리한 종양의 부피가 감소하였다. 그러나, 마우스 중량에는 변화가 탐지되지 않았다. 도 5f: 인산화된 PRKD1 및 GSK3/β-카테닌 신호전달을 웨스턴 블롯분석하였다. β-액틴은 로딩 대조군으로 이용하였다. 도 5g: 대조군과 CRT0066101처리 종양에서 TUNEL 및 Ki67을 보여주는 면역형광사진이다. 데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. * p < 0.05, ** p < 0.001.
도 6은 본 발명의 가설을 도식화한 것이다. miR-34a는 직접적으로 PRKD1을 억제하고 CRT0066101은 자기 인산화된 PKD/PKCμ를 저해한다. 두 가지 방향은 유방암 줄기세포에서 자기재생 능력의 서로 다른 조절을 나타내며, GSK3/β- 카테닌 신호전달을 통한 MCF-7-ADR 세포에서의 약물 저항성을 나타낸다.
도 7은 miR-34b 또는 miR-34c의 발현과 PRKD1 발현 간에 상관관계가 없음을나타낸다. A, B는 각각 다양한 유방암 세포주에서 miR-34b 및 miR-34c 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 것이다.
도 8은 세 가지 다른 PRKD1 siRNA의 효율을 비교한 것이다.
도 9는 MCF-7 세포에서 억제된 miR-34a 발현의 효과를 나타낸다. A: MCF-7 세포에서 miR-34a 저해제로 트랜스펙션한 다음, miR-34a 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하였다. B: GSK3/β-카테닌 신호전달을 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. β-액틴은 로딩 대조군으로 이용하였다.
도 10은 MCF-7-ADR 세포에서 암세포 줄기성 마커의 발현 수준을 나타낸다. A, B: OCT4와 SOX2 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하였다.
도 11은 MCF-7 세포 및 MCF-7-ADR 유방암 줄기세포에서 miR-34a 및 PRKD1 발현 수준을 나타낸다. A: 구형 상태의 MCF-7 세포에서 miR-34a가 높게 발현되었고, B: MCF-7-ADR 유방암 줄기세포에서 PRKD1이 높게 발현되었다.
도 12는 MCF-7 세포에 CRT0066101 처리시 GSK3/β-카테닌 신호잔달 및 세포 생존율에 변화가 없었음을 나타낸다. A: 웨스턴 블롯 분석 결과, MCF-7 세포에서 CRT0066101의 효과를 나타낸다. B: MCF-7 세포에서 CRT0066101 처리 (0.1-5 μM) 후 WST-8 분석한 결과이다.
도 13은 유방암 환자에서 상향조절된 PRKD1 발현과 불량 예후 (poor prognosis) 간의 상관관계를 나타낸다. A: 다양한 세포주에서 miR-34a와 PRKD1 발현 간에는 상관관계가 없다. B: TCGA 임상 데이터 셋트에서 PRKD1 발현 수준에 따른 전체적인 생존율.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
화학약품과 시약
CRT0066101은 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고; 이 약품은 살균된 증류수에 재현탁하여 인 비보 연구에 이용하였다. CRT0066101을 처리하기 위해, MCF-7-ADR 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 시드하고 0.1-10 μM CRT0066101을 가한 다음 한 시간 동안 배양하였다. WST-8은 Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였다. PRKD1 siRNA와 scrambled siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)는 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 트랜스펙션하였다.
세포배양과 트랜스펙션
인간 유방 선암 (breast adenocarcinoma) MCF7, MCF- 7-ADR 및 MDAMB-231 세포주 (American Type Culture Collection)를 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium; Welgene, Daejeon, South Korea)에서 배양하고 37℃의 습한 배양기 내에서 5% CO2 하에서 10% FBS (Welgene) 및 1% 페니실린, 스트렙토마이신을 보충하였다. RNAi 트랜스펙션을 위하여 10-cm 플레이트 내에 항생제가 들어있지 않은 배지에 MCF-7-ADR 세포를 시드하였다. 24시간 후, Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)를 이용하여 세포를 PRKD1 siRNA로 트랜스펙션하였다. 48시간 후, 세포를 모아 웨스턴 블롯 분석하거나 또는 유방암 줄기세포 (mammosphere) 배지에 재현탁하였다. microRNA 트랜스펙션을 위하여, siPORT NeoFX Transfection Agent(Ambion; Thermo Fisher, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 MCF-7-ADR 세포를 miRNA 전구체 (miR-34a/b/c)와 함께 48시간 동안 시드하였다. miRNA 전구체와 음성 대조군 전구체는 Thermo Fisher에서 구입하였다.
qRT - PCR
qRT-PCR (Quantitative reverse-transcription PCR)은 RG3000 장치(Corbett Robotics, San Francisco, CA, USA)를 이용하여 SYBR Green-기반 방법으로 제조자의 지시에 따라 수행하였다. ABI-7500 장치 (Thermo Fisher)는 다양한 유방암 세포주 내에서 PRKD1 발현을 평가하는데 이용하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNASTAR (Madison, WI, USA)로 디자인하였다. 모든 qRT-PCR 그래프는 상대적 Ct (ΔΔCt) 값을 이용하여 얻었다.
웨스턴 블롯팅과 항체
총 30㎍의 단백질 추출물을 8% SDS-PAGE로 분리하고 단백질은 PVDF 막으로 전기이동하였다. 사용된 1차 항체는 인산화된 PKD/PKCμ (Ser916), GSK3β, 인산화된 GSK3α (Ser21)/β (Ser9), 그리고 β-카테닌이었고, 이 항체들은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, PKD/PKCμ 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. β-액틴 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)을 로딩 대조군으로 사용하였다. 막은 1× PBS/0.1% Tween 20으로 세척하고, 결합된 단백질은 증강된 화학발광시약 (Amersham Pharmacia Biotech, Parsippany, NJ, USA)으로 탐지하였다.
루시퍼레이즈 분석방법
PRKD1의 3′-UTR 리포터 구축물을 pGL3-대조군 벡터에 클론하고 PRKD1의 3′-UTRs를 HEK293T 세포의 게놈 DNA로부터 증폭하였다. PRKD1 w으로부터 miR-34 시드 서열을 PCR-기반 방법으로 돌연변이시키고, 리포터 구축물을 서열분석으로 확인하였다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 HEK293T 세포를 3′- UTR 리포터 구축물 (6웰 플레이트에 각 웰 당 1.5㎍) 및 15 nM의 miR-34 패밀리 전구체 (Ambion)로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 3′-UTR 리포터 구축물의 활성은 코트랜스펙션한 pCMV-hRL (6웰 플레이트에 각 웰 당 40ng, Promega)의 활성으로 표준화하였다. 24시간 배양 후, 세포를 1× 수동 용균 완충액으로 용균하고, 활성은 Dual Luciferase Assay kit (Promega)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다.
종양구 형성 분석법 ( Tumorsphere formation assay; TSA )
종양구 배양을 위해 세포 (2000 cells/ mL)를 1% 페니실린, B27 (1:50; Gibco; Thermo Fisher), 20ng/mL 표피세포 성장인자 (Prospec, East Brunswick, NJ, USA), 5mg/mL 인슐린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 및 0.4% 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich)이 함유된 무혈청 DMEM/ F12 (welGENE)에 현탁하여 배양하였다. 약 10일 후, 플레이트를 분석하여 종양구 형성을 확인하고 현미경 (Olympus IX71; Olympus, Tokyo, Japan)으로 정량하였다. 종양구를 계수하기 위하여, 70 ㎛ 공극의 스트레이너 (BD Biosciences, East Rutherford, NJ, USA)로 MCF-7- ADR 세포를 여과하고 정량하였다. CRT0066101 처리는 배양 6일째와 8일째에 실시하였다.
플로우 사이토메트리를 이용한 표면마커 분석
PRKD1의 RNAi를 이용한 트랜스펙션 또는 CRT0066101 처리 이후 세포를 모아 CD44+/CD24- 표면 마커 발현을 평가하였다. 세포를 2% FBS로 씻고, 2% FBS를 함유한 PBS 내에서 항-CD44 (APC-conjugated; BD Biosciences) 및 항-CD24 (PEconjugated; BD Biosciences)로 염색하고, 30분간 어두운 곳에서 얼음 위에 두었다. 세포를 다시 차가운 PBS 완충액으로 세척한 후 BD CantoII flow cytometer (BD Biosciences) 내에 >10,000의 세포를 로딩한 다음 FACSDiVa 소프트웨어 (BD Biosciences)를 이용하여 플로우 사이토메트리로 분석하였다.
세포생존율 분석
MCF-7-ADR 세포를 24웰 플레이트에 넣고 다양한 농도 (0.1, 0.5, 1, 5, 10 μM)의 CRT0066101과 함께 72시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은 WST-8 분석법 (Sigma-Aldrich)으로 분석하였고, 광학 밀도는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
형광면역조직화학
대조군 또는 miR-32a 과발현 종양 및 담체 또는 CRT0066101 처리 종양을 절단하여 파라핀 처리한 슬라이드를 이용하였다. 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 Histoclear에서 3-4회 재수화한 다음, 농도가 다른 에탄올 (100%, 95%, 80%, 70%)에 순서대로 통과시켰다. 항원 복원은 절편을 0.01M 구연산 용액 (pH 6.0)에 담그고 15분간 마이크로웨이브에서 끓여 수행하였다. TUNEL 분석의 경우에서, 인시투 세포사멸 탐지킷트, 형광물질 (Roche, Indianapolis, USA) 표지된 세포자기사멸 양성세포 및 Ki-67 일차항체 (Vector Lab, USA)를 절편에 적용하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 슬라이드를 DAPI 및 이차 항체와 함께 두 시간 동안 배양하였다. 최종적으로, 마운팅 용액 (Dako)으로 처리하고 사진은 공초점 현미경 (Zeiss)으로 촬영하였다.
유방암 이종이식한 마우스 제조
누드 마우스의 이용을 포함하는 모든 연구는 연세대학교 의과대학의 동물보호 및 이용 위원회의 승인 (2015-0087)을 얻었으며, 특정 병원균이 없는 시설 및 상기 위원회의 가이드라인에 따른 조건 하에서 수행하였다. 마우스는 각 대퇴부 바깥쪽을 150 ㎕의 식염수/zoletil/rompun (7:1:1)으로 마취하고 1.5x106 MCF-7-ADR 세포를 피하주사하였다. 마우스는 무작위로 여섯 마리를 하나의 군으로 하고, 종양 이식 후 10일째부터 처리를 시작하였다. CRT0066101은 종양보유 동물에 구강 처방하였고, 4주 동안, 주당 5회, 매회 1.6mg/kg씩 투여하였다. 만질 수 있는 종양 형성부터 종료할 때까지, 종양 크기를 캘리퍼스를 이용하여 매 3~4일마다 측정하였고, 종양 부피는 길이 X 넓이2 X 0.5236의 식으로 계산하였다. 마우스는 7.5% CO2 챔버에서 희생시키고, 종양을 분리하여 면역조직화학 및 기타 분석에 이용하였다.
결과 1: MCF -7-ADR 세포에서 miR -34a는 PRKD1 을 억제한다.
MCF-10A, MCF-7, ZR-75-1, MCF-7-ADR, SK-BR-3, MDA-MB-231 및 MDAMB-468을 포함하는 유방암 세포주에서 PRKD1 발현을 평가하였다. 그 결과, MCF-7-ADR 세포에서 PRKD1 발현 수준이 증가하였다 (도 1A). 본 발명자들은 microRNA 예측 온라인 데이터베이스 [miRanda (http://www.microrna.org/ microrna/home.do) and TargetScan (http://www.targetscan. org/)]를 이용하여 PRKD1을 조절할 수 있는 miRNA를 결정하였다. miR-34가 후보 조절인자인 점을 고려하여 miR-34a, miR-34b 및 miR-34c의 전위 (ectopic) 발현 후 PRKD1 mRNA 발현 및 단백질 번역 수준을 측정하였다. 비록 miR-34a, miR-34b 및 miR-34c가 동일한 시드 서열을 가지고 있지만, 결과는 PKD/PKCμ가 miR-34a에 의해서만 저하조절되는 것으로 나타났다 (도 1B). miR-34a가 PRKD1 3′-UTR에 결합하는지를 확인하기 위하여 PRKD1 3'-UTR 상의 miR-34a 예상 결합부위를 돌연변이시켜 pGL3-대조군 벡터에 돌연변이 서열을 삽입하였다 (도 1C). 도 1C와 같이, miR-34a 과발현은 PRKD1 야생형 서열의 루시퍼레이즈 활성을 억제하였으나, MCF-7-ADR 세포에서 돌연변이는 그렇지 않았다. 우리는 유방암 세포주에서 miR-34a 발현 수준을 스크린하였고, 그 결과 MCF-7-ADR 세포에서 miR-34a가 저하조절되어 도 1A의 결과와 일치하였다. 이러한 결과는 miR-34a가 PRKD1을 음성적으로 조절함을 말해준다 (도 1A).
MCF-7-ADR 세포에서 miR-34b와 miR-34c의 발현수준도 탐지하였으나, 유의한 저하조절은 관찰되지 않았다 (도 7 A, B). 이러한 결과들은 MCF-7-ADR 세포주에서 PRKD1이 miR-34a에 의해 저하조절됨을 제시한다.
결과 2: PRKD1 GSK3 /β- 카테닌 신호전달을 통해 유방암 줄기성을 촉진한다.
종양줄기세포에서 PRKD1 저해효과를 알아보기 위하여, MCF-7-ADR 세포를 miR-34a 전구체와 PRKD1 siRNAs로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후, 음성 대조군에 비해 miR-34a 발현수준은 증가하고 PKD/PKCμ 수준은 감소하였다 (도 2A). 대조군 siRNA 트랜스펙션 관련하여 관찰한 수준과 비교하여 PRKD1 발현수준 또한 감소하였는데, 이는 PRKD1 siRNA 트랜스펙션에 따른 것이다. 흥미롭게도, PKD/PKCμ 수준도 PRKD1 siRNA 트랜스펙션에 따라 감소하였다 (도 2B). 본 발명자들은 비특이적 효과를 배제하기 위하여 세 가지 다른 PRKD1 siRNAs의 효율을 체크하였고 PRKD1 siRNA #1을 선택하였는데, 이것이 다른 것들에 비하여 PRKD1을 더 잘 억제하였기 때문이다 (도 8).
Thr112/ Thr120에서 β-카테닌의 PRKD1 인산화는 전립선암세포에서 세포-세포 접합에 결정적일 수 있다 [20]. 나아가, CDC42, PAR6 및 PKCζ의 복합체는 GSK3β와 결합하며 Ser9의 인산화를 촉매하여 GSK3β를 저해한다 [21]. PRKD1을 GSK3/β-카테닌 신호전달에 연관시키기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과는 PKD/PKCμ 환원이 β-카테닌 발현과 GSK3α 및 GSKβ 인산화를 억제하는 것으로 나타났다 (도 2A). 이러한 결과들은 대조군과 PRKD1 siRNA-처리 세포에서 확인되었다 (도 2B). 또한, 본 발명자들은 대조군으로서 MCF-7 세포에서 miR-34a로 트랜스펙션한 후 GSK3/β-카테닌 신호전달을 바꿈으로써 miR-34a 발현 수준이 감소함을 확인하였다 (도 9 A, B).
PRKD1 발현과 GSK3/β-카테닌 신호전달은 종양구를 형성하는 MCF-7-ADR 세포에서 상향조절되었다 (도 2C). OCT4 및 SOX2와 같은 종양 줄기성 마커들은 종양구 상태의 MCF-7-ADR 세포에서 많이 발현되었다 (도 10 A, B). 뿐만 아니라, MCF-7 유방암 줄기세포와 비교하여 MCF-7-ADR 유방암 줄기세포에서는 miR-34a의 발현은 낮고 PRKD1 발현은 높음을 관찰하였다 (도 11 A, B). 유방암 세포 줄기성에서 PRKD1 녹다운의 효과를 알아보기 위하여, 종양구 형성 분석법을 수행하였다. miR-34a 전구체에 의한 PRKD1 녹다운 및 PRKD1 siRNA는 대조군과 비교하여 종양구 (>70 μm)의 수를 현저히 감소시켰다 (도 2D). 또한, 유방암 줄기세포 (BCSC) 수를 유방암 줄기세포 마커 CD44+/CD24-를 염색하여 형광-활성 세포 분류법으로 분석하였다. CD44+/CD24- 수 (Q1)도 PRKD1 녹다운에 의해 감소하였다 (도 2E). 종합하면, PRKD1은 MCF-7-ADR 세포에서 GSK3/β-카테닌 신호전달을 바꿈으로써 암세포 줄기성을 조절할 수 있다.
결과 3: PKD / PKC μ 인산화 저해는 유방암 줄기세포 자기재생 능력을 감소시킨다.
PKD/PKCμ 인산화 관련 진행과정은 두 가지 가능한 활성 경로가 있는 것으로 밝혀졌다. 하나는 단백질 카이네이즈 C (PKC)-의존적 인산화(Ser744/Ser748)이고 다른 하나는 자기인산화(autophosphoryation) (Ser916)이다. 충분한 활성화를 위해서는 PKC-의존적 인산화 이후 즉시 자기인산화가 일어나야 한다 [10, 11]. CRT0066101은 PKD 자기인산화를 표적으로 하는 저해제이다 [16]. PKD/PKCμ 자기인산화의 역할을 알아보기 위해, MCF-7- ADR 세포를 1 μM 또는 5μM CRT0066101로 처리하였다. 웨스턴 블롯팅 결과, CRT0066101은 MCF-7-ADR 세포에서 PKD/PKCμ 및 GSK3/β-카테닌의 인산화를 저해하였다 (도 3A). 그러나, MCF-7 세포에서 GSK3/β-카테닌 신호전달은 CRT0066101 처리의 영향을 받지 않았다 (도 12 A).
CRT0066101 처리 (1 μM 또는 5 μM) 후 종양구 (>70 μm)의 수는 대조군에 비해 투여량 의존적으로 감소하였다 (도 3B). 기대했던 대로, CD44+/CD24- 수 (Q1)도 1 μM CRT0066101 처리 후 감소하였다 (도 3C). 이러한 결과들은 유방암 세포 줄기성의 조절에는 GSK3/β-카테닌 신호전달을 통한 PKD/PKCμ자기인산화가 필요함을 말해준다.
결과 4: PRKD1 은 약물 저항성을 회복시킨다.
앞선 연구 결과들은 PKD/PKCμ가 캐스페이즈-3 저해를 통해 세포자기사멸과 관련이 있음을 보고하였다 [22]. 따라서, 본 발명자들은 MCF-7-ADR 세포에서 PRKD1 저해가 세포자기사멸을 활성화하는지를 알아보았다. 그 결과, 유방암 줄기세포에서 환원반응이 더 일어남을 알 수 있었다. 도 4A와 같이, MCF-7-ADR 세포를 독소루비신 (doxorubicin; DOX)에 노출하면 투여량 의존적으로 세포생존율이 감소하였다. 중요하게도, PRKD1 녹다운은 대조군과 비교하여 세포사멸 수준을 더 높였다. 세포생존율 감소치가 세포자기사멸 (apoptosis)에 기인한 것인지를 측정하기 위하여, 캐스페이즈-3 활성화를 측정하였다. PRKD1을 저해한 결과, 대조군에 비하여 더 높은 캐스페이즈-3 활성이 나타났다. 뿐만 아니라, 독소루비신 처리 후 PRKD1을 녹다운하면 독소루비신 처리한 대조군에 비해 캐스페이즈-3 활성이 증대되었다 (도 4B). 또한, MCF-7-ADR 세포에서 0.1-5 μM CRT0066101 처리에 의한 PRKD1 저해는 투여량 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으나 (도 4C), MCF-7 세포에서는 CRT0066101 처리에 비해 세포 생존율이 감소하지 않았다 (도 12 B). CRT0066101-처리와 독소루비신-유도 세포자기사멸을 조합하면 CRT0066101 단독 처리에 비하여 현저하게 세포 생존율이 낮아졌다 (도 4D). 또한, 우리는 PRKD1 녹다운 또는 PKD/PKCμ 인산화 저해가 세포자기사멸을 증대시킴을 확인하기 위하여 아넥신 V 및 프로피디움 아이오다이드 (PI) 염색을 수행하였다. 그 결과, miR-34a 전구체 처리 세포, PRKD1 siRNA 처리 세포 및 독소루비신 처리세포에서 세포자기사멸 개시가 대조군에비하여 증가함을 확인하였다. 흥미롭게도, 독소루비신 처리세포에 CRT0066101을 처리하면 세포자기사멸 수준이 증가하였다 (도 4E). 종합하면, 이러한 데이터들은 MCF-7-ADR 세포에서 PRKD1 저하조절 또는 PKD/PKCμ 자기인산화 저해가 약물 저항성을 회복시킴을 말해준다.
결과 5: 이종이식 모델에서 PKC μ 기능 저해 또는 저하조절은 종양성장을 억제한다.
본 발명자들의 선행 연구에서 본 발명자들은 누드 마우스에서 miR-34a가 NOTCH1 발현을 억제하여 종양 형성을 저해함을 확인하였다 [5]. 본 발명에서는 이종이식 모델에서 miR-34a에 의한 PRKD1 저하조절이 종양 성장을 억제하는지를 연구하였다. 대조군 종양에 비하여 miR-34a 과발현 종양에서 PRKD1 발현 수준은 저하조절되었다 (도 5A). 면역조직화학 (IHC) 염색 결과, miR-34a 과발현 종양에서 PKCμ 및 증식세포 핵 항원 (proliferating cell nuclear antigen; PCNA)은 감소하였다 (도 5B). miR-34a에 의한 PRKD1 억제가 세포자기사멸을 통해 종양 성장을 억제하는지를 알아보기 위하여 본 발명자들은 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) 분석을 수행하였다. 그 결과, miR-34a 과발현 종양은 대조군 종양에 비하여 더 많은 자기사멸성 세포를 보유했다 (도 5C).
PKD/PKCμ의 기능 억제 효과를 좀 더 평가하기 위하여, MCF-7-ADR 세포로 이종이식하여 확립된 종양을 갖는 마우스에 4주 동안 매일 65 mg/kg CRT0066101로 처리하였다. CRT0066101 처리한 마우스에서 종양 크기는 미처리 대조군에 비하여 감소하였다 (도 5D). 기대했던 대로 CRT0066101 처리한 마우스의 종양 무게는 대조군 종양에 비해 감소하였다. 모든 동물에서 CRT0066101 처리는 독성의 현저한 징후 및 체중 감소와 같은 부작용을 일으키지 않았다 (도 5E). 뿐만 아니라, GSK3/β-카테닌 신호전달을 통한 인산화 PKD/PKCμ의 저하조절 또한 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 5F). 마지막으로, 본 발명자들은 CRT0066101이 세포자기사멸을 강화하고 증식을 억제하는지를 확인하기 위하여 TUNEL 분석과 Ki-67 염색을 수행하였다. 그 결과, CRT0066101 처리 종양은 대조군에 비하여 세포자기사멸이 증대되었고, 증식은 감소하였다 (도 5G). 결론적으로, miR-34a 또는 CRT0066101에 의한 PKCμ 저해는 인 비보에서 세포자기사멸 개시를 통해 종양 성장을 감소시키는 역할을 한다.
PRKD1은 세포 증식, 세포자기사멸, 세포 접합, 침윤 및 소포 이동(vesicle trafficking)에 관여한다 [23]. 흥미롭게도, PRKD1 발현은 다양한 종양세포에서 다른 패턴을 나타내며 종양세포 또는 종양 억제제로서 이중의 기능을 수행한다 [24]. PRKD1 발현은 정상 유방 조직과 비교하여 침윤성 인간 유방암에서 저하조절된다 [25]. 유사한 발현 패턴이 마이크로어레이 분석 및 SK-BR-3, T-47D와 MDA-MB-231 같은 침윤성 세포 모델에서 확인되었다 [25, 26]. 나아가, PRKD1 프로모터 메틸화를 복귀하면 유방암세포 침윤과 전이가 차단된다 [27]. 본 발명자들의 실험 결과는 MCF-7-ADR 세포주에서 PRKD1 발현 패턴이 약물 저항성을 증대시킴을 보여주었다. PRKD1은 독소루비신 저항성 MCF-7-ADR 세포, 타목시펜 저항성 LCC2 세포 및 타목시펜과 플루베스트란스 저항성 LCC9 세포를 포함하는 약물 저항성 세포주에서 높게 발현되었다. 따라서, 우리는 PRKD1 발현이 약물 저항성과 관련이 있다고 결론지었다. 본 발명자들은 TCGA 데이터 셋트에서 miR-34a와 PRKD1 발현을 연구하였다 (도 13 A). PRKD1이 약물 저항성 유방암 세포에서 높게 발현되었기 때문에, 우리는 TCGA 데이터베이스에서 miR-34a와 PRKD1 발현 간의 역 상관관계를 발견할 수 없었다. 본 발명자들은 나아가 TCGA 임상 데이터 셋트에서 PRKD1 발현 수준에 따른 전체적인 생존율을 확인해 보았다 (도 13 B). 이 그래프는 PRKD1이 높게 발현되는 환자가 낮게 발현되는 환자에 비하여 생존율이 낮음을 보여준다. 비록 전체 유방암 시료에서 miR-34a와 PRKD1 발현 간의 역 상관관계를 확인할 수는 없었지만, PRKD1 발현과 나쁜 예후를 나타내는 유방암 환자의 관계를 이끌어내었다. 뿐만 아니라, 우리는 저하조절된 PRKD1이 세포자기사멸 신호를 변경함을 확인하였다. 따라서, PRKD1은 유방암 세포에서 약물 민감성을 회복시키는 가능성 있는 선택이 될 수 있음을 제안한다.
microRNA miR-34a는 종양 억제에 중요한 역할을 수행한다. 종래 연구들에서는 전립선암 [28], 췌장암 [29], 수모세포종 (medulloblastomas) [30] 및 교모세포종 (glioblastomas) [31]을 비롯한 다양한 종양에서 miR-34a가 종양 줄기세포를 저해한다고 보고된 바 있다. 이 분자는 또한 세포 주기, 분화 및 세포자기 사멸과 관련이 있는 표적을 억제하는 반면, 종양세포 생존, 종양 줄기성, 전이 및 화학약물 저항성을 저해한다 [17]. 본 발명에서는 MCF-7-ADR 세포에서 miR-34a가 PRKD1을 음으로 조절함을 확인하였다. 또한, PRKD1은 miR-34a의 새로운 표적이며, miR-34a가 PRKD1 3'-UTR에 결합함을 발견하였다. 나아가, 본 발명자들은 유방암 세포주에서 miR-34a-PRKD1 상호작용이 종양 줄기세포성과 약물 저항성을 극복하는데 중요한 역할을 수행함을 밝혔다. 선행 연구들은 PRKD1이 Thr112/Thr120에서 β-카테닌을 인산화하며 PRKD1 과발현이 β-카테닌 매개 전사 활성을 억제함을 보고하였다 [32]. β-카테닌 인산화는 GSK3를 통해 일어나며, GSK3는 Wnt-신호전달 단백질 복합체의 일부분으로서 β-카테닌을 표적으로 한다 [33]. 또한, GSK3β는 Wnt-비의존적 기작을 통해 전립선암 세포성 및 이동에 관여하는 카이네이즈이다 [34]. 본 발명에서는 저하된 PRKD1이 GSK3/β-카테닌 신호전달 변경을 통해 유방암 줄기세포의 자기개조능력을 억제하는 것을 관찰하였다. 그러므로, 이러한 결과들은 PRKD1이 GSK3/β-카테닌 신호전달을 통해 유방암 줄기성을 활성화함을 말해준다.
Harikumar 등은 모든 PKD 아이소폼에 특이적인 저해제로서 CRT0066101을 발견했으며 [16], CRT0066101이 PRKD1 자기인산화를 저해함으로써 췌장암 성장을 차단함을 밝혔다 [16]. 본 발명자들은 유방암 세포주 및 이종이식 동물모델을 CRT0066101 처리하여 PRKD1 활성화를 차단하였다. 이 결과는 CRT0066101이 유방암 환자의 가능성 있는 치료제가 될 수 있음을 말해준다.
본 발명에서, MCF-7-ADR 세포주에서의 PRKD1 과발현은 miR-34a 과발현과 음의 상관관계를 나타내었다. 본 발명자들은 miR-34a가 PRKD1 3'-UTR과 결합하여 GSK3/β-카테닌 신호전달 경로를 통하여 유방암 줄기세포에서 암세포 줄기성을 억제함을 밝혔다. 나아가, 본 발명자들은 PRKD1 저해제로 알려진 CRT0066101이 GSK3/β-카테닌 신호전달 경로를 통하여 유방암 줄기세포의 감소 및 약물 저항성에 영향을 미침을 밝혔다 (도 6). 뿐만 아니라, 우리는 이종이식 모델에서 miR-34a의 전위 (ectopic) 발현 및 CRT0066101 처리가 암 성장을 억제함을 관찰하였다. 결론적으로, PRKD1은 miR-34a에 의해 음의 관계로 조절되어 유방암 세포주에서 암세포 줄기성 및 약물 저항성을 억제하였다. 이러한 결과는 PRKD1이 유방암 줄기세포성 및 약물 저항성을 활성화하는 주요 분자이며, 유방암에서 잠재력 있는 치료 표적으로서 이를 촉진함을 말해준다.
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Claims (10)

  1. 단백질 카이네이즈 D1(protein kinase D1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 카이네이즈 D1은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 카이네이즈 D1 발현 억제제는 단백질 카이네이즈 D1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 miR-34a로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 카이네이즈 D1 활성 억제제는 단백질 카이네이즈 D1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 CRT0066101로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 암은 암 줄기세포 마커인 CD44+ 및 CD24-로 선별되는 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 단백질 카이네이즈 D1 발현 또는 활성 억제제는 β-카테닌 발현을 억제하고, GSK3α 및 GSKβ 인산화을 억제하는 것을 특징 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
  8. 단백질 카이네이즈 D1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 재발 방지용 항암 보조제.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 단백질 카이네이즈 D1은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유방암 재발 방지용 항암 보조제.
  10. 개체에서 분리한 세포 또는 조직에서 단백질 카이네이즈 D1(protein kinase D1)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는 유방암 예후의 정보를 제공하기 위한 단백질 카이네이즈 D1 발현 또는 활성 측정 방법.




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