201124721 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於分子探針晶片(molecular probe chips)，特別是 一種分子探針晶片，其金屬基板(substrate)上共價鍵結(covalent bonding)有機電導（organoconducting)定錨化合物（anchoring compound)，可增加了晶片基板表面固定化探針(immobilized probe) 的穩定性及電子傳導之能力，可快速靈敏進行樣本檢測之分子探針 | 晶片。 【先前技術】 利用定錯化合物(anchoring compound)將選定的分子探針 (molecular probe)固定化(immobilization)在具有伸展表面的基板 (substrate)上，可以製成分子探針晶片(molecular probe chips)。針對 特定標的物(target)的檢測感測用途，所設計製作的分子探針晶片 φ 具有廣泛用途。例如，在基礎醫學及臨床醫學的領域之中，一般 習知為生物晶片(biochip)或生物感測晶片(biological sensor chips) 的分子探針晶片，可以快速地進行生物醫學樣本(biological sample) 的檢測定性與偵測（characterization and detection)。在醫療用途 中，進行檢測判斷的目標物(target)可能是存在於樣本中的生物分 子，病毒，細菌或細胞。在其他非醫學領域的產業用途之中，所 牽涉到的則可能是諸如食品或環境取樣等的工業檢測定性定量之 201124721 在生物晶片(biochip)或生物感測晶片biosensor chips)的用途之 中，固定化在基板表面的探針分子(probe),可與檢測樣本溶液中 的目標物(target)進行親合作用(affinity reaction)。根據反應的結果 可以偵測特定存在的生物分子。基板表面固定化的探針可以是寡 核甘酸(oligonucleic acid)、多胜脸(polypeptide)、蛋白質(protein)、 抗體(antibody)、抗原(antigen) 或其他可以和待測目標物(target)發生親合(affinity)反應或催化 • 作用的病毒，細胞或組織表面生物分子。此種利用基板表面聯結固 定化分子作為探針(probe)，以便與生物醫學樣本中的生物分子(即 待分析目標物(target))發生親合作用，藉由檢測兩者之間相互作用 的結合量(binding concentration)或結合常數(binding constant)便可 以提供一種基本的數據化診斷與實驗參數。兩者之間的高親合性 (high affinity)、高結合容量(binding capacity)與生物穩定度，在生 物晶片的檢測應用上是非常重要的特性。 • 目前有多種生物鑑定的作法需要將生物分子如DNA或蛋白質 直接固定化在基板上。例如，西方點漬(western blotting)係將蛋白 質吸附在聚活化亞乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)或硝化纖維 素(nitrocellulose)薄膜基板上當作探針，可與抗體或抗原蛋白質上 的表面各官能基互相作用，以測量樣品中是否含有此種蛋白質。 此外南方及北方點漬(southern and northern blotting)亦分別利用類 似的方式將單股DNA和RNA各自吸附在硝化纖維素基板上，用 201124721 以探測和探針具有互補性序列的單股DNA和RNA。另一個例子 是酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immuno-sorbent assay， ELISA),其係將特定抗體(或抗原)先吸附在聚苯乙烯(polystyrene) 基板上，再將基板暴露在檢體中。若此檢體含有對該些抗體(或抗 原)具高親和性的特定抗原(或抗體)，便會與之結合而被光輸出偵 測出來。 例如，頒予 Fodor 等人的 U. S. Pat. No. 5,445,934, "Array of _ oligonucleotides on a solid substrate"中揭示了在基板上直接合成聚 核甘酸(polynucleotide)的方法。其係在玻璃載片上先進行衍生化 (derivatization)，以使其表面具有光保護基(photoprotective group) 化學物質，再利用光罩在適當位置進行去保護，然後才與含有光 保護基的核甘酸單體進行反應。整個的製備過程必須重覆進行光 對準(alignment)、去保護(deprotection)和聯結反應(coupling)步騾， 直至得到所需的聚核甘酸序列為止。另外，亦可以事先合成聚核甘 • 酸，之後再利用諸如微點列(robotic printing)或噴墨(ink-jet printing) 等技術，經由物理吸附作用，光反應連結，或其他鍵結將其佈置 於基板上。上述將生物分子如DNA或蛋白質間接或直接固定化在 基板上的方法，其步驟複雜費時，而且常需使用昂貴的設備。此 外，生物分子大部份係以微弱的物理吸附方式和基板連結，其穩 定性低。此種作法造成晶片的清洗與處理繁瑣費時，並且其再現 性也低。 6 201124721
Ishii 等人之 U.S. Pat. No. 5,474,895, ”Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor”中提出利用三 明治雜交分析(sandwich hybridization analysis)來取代蜜光偵測。基 板經適當的官能基修飾或連結以使其帶有活性基，即諸如醇基、 羰基、胺基、醛基、環氧基或硫醇基等的官能基。其表面可以和 聚核甘酸形成共價或非共價連結。又如，Van Ness等人之U.S. Pat. _ No. 5,514,785 "Solid support for nucleic acid hybridization assays”案 中提出利用共價鏈結將聚核甘酸連結在尼隆(nylon)支撐物上。再 如 Rampal 於 U.S. Pat. No. 6,013,789，"Covalent attachment of biomolecules to derivatized polypropylene supports”案中揭示，聚丙 烯薄膜先經過氨化，之後再與其末端含有磷咪唑烷 (phosphorimidazolide)的聚核甘酸反應，如此，聚核甘酸便可經由 磷咪唑烷(phosphoramidate)鏈結而與聚丙烯產生共價連結。 • 另外，利用在氧化銦錫(indium tin oxide, ITO)表面上進行分子 的自組裝而形成單層薄膜(self-assembled monolayers),亦可以提供 一種新的界面，可用以探討某些生物分子特殊的氧化還原反應。 有機矽可以和表面具有氫氧基的基板反應(例如二氧化矽> 形成單 層或雙層的有機砂薄膜。例如，Chrisey等人於U.S. Pat. No.5,688,642 號”Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces”案中提出具有兩個活性基的有機 201124721 矽化合物，利用一端的活性基和基板表面的氫氧基產生連結，再 由另一端的活性基連結生物分子，以使生物分子得以被固定化在 基板上。 這些方法雖然已有廣泛應用，但卻有分子探針製備繁瑣費時不 導電及光輸出性差不穩定等缺點，及商業大量製備(commercial mass production)上的限制。這些分子探針製備常是使用院基長鏈 化合物兩端來鏈結基板與探針，其難於進行π共軛系統 • (π-conjugated system)電子傳遞與導電等性質，難於應用在電學生 物感測技術上。並且，由於要在諸如PVDF，硝化纖維素或顯微玻 璃(microscopic glass)等常見較適用的基板上固定化生物探針分 子，通常所依賴的物理吸附(physical adsorption)作用乃是一種不穩 定而且耗時的過程。整個固定化處理程序通常需要至少六至八小 時的安置(incubation)時間。其典型的處理方法，係先將分子探針加 至晶片基板上並靜置晶片。待分子探針與基材之間進行一定長時 • 間(通長約三至四小時)的物理吸附反應之後，連續操作數次的清洗 程序。清洗之後再加入填補物(blocking reagent)，並再靜置一段長 時間(通常約三至四小時)後，此晶片才得以作為分子探針晶片使 用。 【發明内容】 因此有需要提供一種分子探針晶片(molecular probe chip>具有 共價鍵結有機電導（電子傳導）定錨化合物(organo-conducting【 201124721 anchoring compounds)之分子探針晶片，具有π共轭系統 (π-conjugated system)電子傳遞之能力，其製備簡單且快速，適於 低成本大量生產。 另亦有需要提供一種分子探針晶片，具有共價鍵結定錨化合 物，具有儲存及使用上之高穩定性及電靈敏度與專一性，並可快速 準確進行電學樣本之檢測。 為達成前述及其他目的，本發明提供一種分子探針晶片，具有 # 共價鍵結有機電導定錨化合物，其包括有.· 一基板，該基板一表 面上佈覆有一金屬薄膜層；與複數個的有機電導定錨化合物，大 致具有π共軛系統電子傳遞能力之環狀鏈分子結構，主要爲寡苯 (oligobenzene)及寡噻吩(oligothiophene)環狀鏈分子結構，每一個 該些有機電導定錨化合物，各係以環狀鏈分子結構之一第一端直接 共價鍵結於該金屬薄膜層上，或透過聯結分子間接共價鍵結於該 金屬薄膜層上；與單數個的探針分子，每一個該探針分子各係共 • 價鍵結於該些定錨化合物中對應一定錨化合物反對於環狀鏈分子 •結構之該第一端之一第二端。 本發明並提供分子探針晶片之一種無探針半成品晶片基板，可 預先儲存以在需要時聯結該分子探針晶片進行檢測感測所需之探 針分子，該無探針半成品晶片基板包括有：一基板，該基板一表 面上佈覆有一金屬薄膜層；與複數個的有機電導定錨化合物分 子，大致具有π共軛系統電子傳遞能力之環狀鏈分子結構，每一個 201124721 該些定錨化合物分子各係以其環狀鏈分子之一第一端直接共價鍵 結於該金屬薄膜層上，或透過聯結分子間接共價鍵結於該金屬薄 膜層上；且其反對於該環狀鏈分子構形之該第一端之一第二端， 可於該需要情況下與該探針分子共價鍵結，以完整形成該分子探 針晶片。 本發明並提供一種分子探針晶片之製作方法，其步驟包括有先 於一基板之一表面上佈覆一金屬薄膜層；再將複數個大致具有延 • 伸且實質為環狀鏈分子之有機電導定錨化合物，其各自環狀鏈形 結構之一第一端直接共價鍵結於該金屬薄膜層上，或透過聯結分 子間接共價鍵結於該金屬薄膜層上。本發明之方法亦可再於每一 個該些定錨化合物對應於該第一端之第二端分別共價鏈結一探針 分子。 【實施方式】 本發明具有共價鏈結定錨化合物之分子探針晶片，其晶片之基 材(substrate)係可使用一般的砂(Si，silicon),氮化砂(Si02，silicon nkride)，石英(quartz，氧化砂成份)，玻璃(glass,砂酸鹽類)或雲母 (含KAlSi04)的平板材料。基材表面上佈覆一層金屬，其最佳係利 用，例如，熱蒸鑛(thermal evaporation)或電子束蒸鍍(e_ beam evaporation)的方式進行單層或複數層金屬薄膜層的佈覆。適用的 金屬包含金(Au(III)，銀(Ag)，銅(Cu)，鉑(Pt),鎳(Ni)，鋅(Zn),鍺 (Ge),汞(Hg),鈀斤(1)等。以生物分子探針晶片之用途為例，較佳 10 201124721 之金屬為金或銀。一般採用金是由於Au晶格排列中以AU(III)之 表面能量最低且較易製備。 本發明之探針晶片若作為感測晶片之用途，可適用於諸如電學 感測分析方式的偵測，例如，作為電學電流(current)感測晶片及電 學阻抗(impedance)感測晶片之用途。也作為電化學電容 (capacitance)及法拉第生物感測器(faradaic biosensor)之用途> 於另 一種用途之中，本發明之探針晶片係被當作場效電晶體(field effect 籲 transistor)晶片使用，可應用於諸如生物場效電晶體感測分析方式 的偵測。在另一種用途之中，本發明之探針晶片係被當作振盪晶 片使用，可應用於諸如壓電（piezoelectric)生物感測分析方式的偵 測，例如，石英振盪微質坪(quartz crystal microbalance)0在又另一 種應用之中，本發明之探針晶片係被當作表面電漿共振(surface plasmon resonance)晶片使用，適用於諸如光學生物感測分析方式 的偵測。本發明之最佳實施例，係使用電學生物感測分析方式的偵 • 測，作為電學電流感測晶片及電學阻抗感測晶片之用途。 依據本發明，晶片基板上所佈覆之金屬薄膜層若依特別設計並 經特定製程處理之倦可以成為依特定陣列(array)方式排列的微陣 列金屬基板。此種具陣列金屬薄膜電極排列之金屬佈覆電感測元 件，可使用於應用電感測原理的生物感測系統上。 依據本發明，晶片基材(substrate)上所佈覆之金屬薄膜層(metal film)，其化學修飾係採用具sp3(金與硫原子)或sp(銀與硫原子)混 201124721 成軌域共價鍵結(covalent bonding)的形式，因此增加了分子探針晶 片基材表面上，被固定化的生物分子探針的穩定性。在生物晶片的 應用用途之中，生物分子探針可爲胜肽(polypeptides)或蛋白質 (proteins)等生物巨分子，例如抗體分子(antibody molecules)或是活 性抗體分子片斷分子(antigen-binding fragment，Fab )。或是單股 DNA 及 RNA 等核酸分子(single strand of nucleic acids)。在生物晶 片的應用用途之中，本發明共價鍵結所達成的探針固定化，可在 φ 晶片以緩衝液(buffer)進行處理，於晶片表面上探針(probe)與檢體 中的標的物(target)間進行相互作用過程中的結合(association)，平 衡(equilibrium),解離(dissociation)，與再生(regeneration)步驟時， 晶片上以共價鍵結方式所固定化的生物分子探針，即不致因強酸 緩衝液的沖洗而脫落流失。 依據本發明，晶片基材上所佈覆之金屬薄膜層，其化學鍵結方 式提供一種新的形式，可將分子探針迅速地固定化於晶片基板表 • 面上，縮短探針的固定化所需時間。本發明係具有共價鍵結有有 機電導(電子傳導)定錨化合物之分子探針晶片，定錨化合物大致具 有π共轭系統電子傳遞能力之環狀鏈分子結構，在某些生物晶片的 應用用途之中，生物分子探針的固定化所需時間，可從習知技術 依賴傳統物理吸附(physical adsorption)作用進行處理所需的三至 六小時，大幅縮減到三至五分鐘的程度。 本發明之有機電導分子探針晶片，典型係可適用於生物晶片及 201124721 即時感測晶片之用途。依據本發明之方法所製備之分子探針晶片 能專一性地與受檢分子，例如胜肽、蛋白質、病毒表面抗原、核 酸分子中的某些特定官能基進行親合性結合，形成具有導電能力 專一性的生物探針。利用此等具導電能力之專一性生物探針，可 針對特定的生物醫學檢測樣品進行專一性快速電性感測與量測。 依據本發明一較佳實施例，分子探針晶片基材可以是微機電 (microelectronic mechanic system, MEMS)製程所使用的玻璃晶圓 鲁 （glass wafer)或一般光學儀器所使用的載玻片，其上覆佈蒸鍍諸如 金，銀，銅，鈷，鎳，鋅，鍺，汞或鈀等之一層金屬薄層。此種塗佈有金屬的 分子探針晶片基板，本身可以當作電極片使用。由於晶片基板材 質屬於導電元件，因此可以應用於一般以電學檢測原理為基礎的 偵測儀器上。例如，適用於電學，電化學電極，及電晶體電極分析形 式的偵測。 依據本發明之方法，分子探針晶片基板上的有機電導定錨化合 • 物，係以共價鏈結的形式聯結基板及探針並具有電子傳導之能力， 因此增加了晶片基板表面固定化探針的穩定性及電導性。因探針 的穩定性及電導性，進行樣品檢測時，晶片上未經結合的分子可利 用緩衝液沖洗移除，降低雜質對檢測結果的干擾，以提高探針和 生物醫學檢測樣品(血液、尿液、體液、精液、鼻液、喉液檢體) 中之標的物(target)兩者間之親合性(affinity)與結合容量(binding capacity)，，並應用在與電感測相關的分子探針晶片上。 201124721 依據本發明，要在分子探針晶片上聯結固定化的生物分子探 針，首先須令選定的有機電導定錨化合物和晶片基板上的金屬， 兩者之間生成共價鍵結，直接連接於該金屬薄膜層上，或透過聯結 分子間接共價鍵結於該金屬薄膜層上。有機電導定錨化合物另外 必須預留一官能基，其可以和欲連結的生物分子探針進行化學共 價鍵結反應。 例如，依據本發明之數種較佳實施例，於塗佈有金或銀的晶片基 板上，可以採用有機硫化物(R-SH)作為主要的定錨化合物。這是 由於硫原子極易與金或銀等過渡金屬表面形成強的親合力。其中， 有機硫化物可爲(1)烷基(alkyl)硫化物、（2)寡苯(oligobenzene)硫化 物及⑶寡噻吩(oligothiophenes)硫化物。在本發明中，後兩者又爲 有機電導定錨化合物之兩種較佳賨施例，其主要爲具有π共軛系統 電子傳導能力之環狀鏈分子結構，主要爲寡苯(oligobenzene)及寡 噻吩(oligothiophene)環狀鏈分子結構。 在本發明之一較佳實施例之中，首先可在基板上放置烷基硫化 物當作聯結分子間接將有機電臺定錨化合物連結到該金屬薄膜層 上。例如，以直鏈垸基爲主幹的氫硫基焼胺(mercaptoalkylamine)， 其分子結構為[HS(CH2)nNH2]，其中n=2〜16。其中做爲錨基(anchor group)的硫原子會與金金屬表面形成類似sp3的鍵結形態。而硫原 子會與銀金屬表面形成類似sp的鍵結。而有機分子末端的胺基 (-NH2)則可保留，作為親核劑以利於進行有機電導定錨化合物的鍵 201124721 結，進而進行生物分子探針的衍生鍵結。 利用則述以金或銀金屬塗佈為基礎的生物分子探針感測晶 片，進行檢測時，由於晶片是固態而待檢測物則為液態(諸如血液 尿液，體液，唾液，喉液，或陰道液等)，因此偵測的靈敏度和極限係依 晶片上固定化探針分子的立體障礙性(steric hindrance)與自由度而 定。定錨化合物原子間除需保持良好的自由度之外，定錨化合物 和探針兩者之間亦必須維持一良好的自由度，以模擬探針分子與 • 待測物在液-液相中的真實相互作用。 另外，利用前述以有機電導定錨化合物為基礎的生物分子探針 感測晶片進行檢測時，因定錨化合物具有π共鈮系統電子傳導能力 之環狀鏈分子結構，因此偵測的電訊號(電流或阻抗値)靈敏度和極 限，係依金屬薄膜上電導定錨化合物及固定化探針分子的導電性 (electrical conductivity)而定。定鋪化合物各個碳原子Ρζ車九域需重 疊以進行線性電子傳導外，生物探針巨分子，例如，抗體分子免疫 ® 球蛋白G分子(immunoglobulin Q IgG)亦需被電子工程化，以便形 成一條從底層金屬薄膜直串至探針分子(IgG)的頂層抗原結合部位 (antigen-binding site)的整條線性垂直導電電極，以便應用在電訊 號的分子探針感測晶片裡。 可聯結生物探針之基本有機電導分子金屬基板之製借
15 201124721 圖1，2及3之化學反應分別顯示依據本發明數種較佳實施例， 於蒸鍍覆佈有金(Au)，銀(Ag)或銅(Cn)，鉑(Pt)，鎳(Ni)的金屬薄膜基 板(substrate)表面上，逐步利用化學修飾處理可固定化之基本有機 電導分子。 在本發明有關第一種使用有機電導定錨分子較佳實施例裡，圖 1之化學反應所得結果，為可聯結各式生物探針之基本有機電導 晶片基板101。其可供連結用來偵測各種特定物(target)所需用之生 _ 物探針分子(probe),以進行相關生物，醫學，食品或環境樣本之檢 測。在本發明一較佳實施例之中，如圖1之化學反應所顯示的， 先在覆佈蒸鍍金(Au)金屬薄膜層120之晶片基板110上，固定有機 電導分子噻吩(thiophene)硫化物：5’ -(甲基)硫醇基-5-醛基-2,2’ -二噻吩。此可以利用將蒸鍍有金或銀之晶片基板浸入濃度約為10 mM的5’ -(甲基)硫醇基-5-醛基-2,2’ -二噻吩水溶液，或者浸入含 有約10 mM的5’ -(甲基)硫醇基-5-醛基-2,2’ -二噻吩的中性磷酸 • 鹽緩衝溶液(PBS，pH=7.2)之中，均勻震盪反應大約二小時。使晶 片上的金與5’ -(甲基)硫醇基-5-醛基-2,2’ -二噻吩產生自我組裝 之排列。之後，利用諸如乙醇(ethanol)和蒸鋪水(distilled water)清 洗基板，即可得到具有5’ -(甲基)-5-酵基-2,2’ -二噻吩表面修飾的 有機電導基板基板。 在本發明有關在第二種使用有機電導定錨分子較佳實施例裡， 圖2之一步化學反應所得結果，為可聯結各式生物探針之基本有 201124721 機電導晶片基板102〇其可供連結用來偵測各種特定物(target)所需 用之生物探針分子(probe)，以進行相關生物醫學，食品或環境樣本 之檢測。在本發明一較佳實施例之中，如圖2之化學反應所顯示 的，先在覆佈蒸鍍金(Au)金屬薄膜層120之晶片基板110上固定 有機電導分子寡苯(oligophenyl)硫化物：；>4’ -硫醇基-4-醛基-1,1-二苯。此可以利用將蒸鍍有金或銀之晶片基板浸入濃度約為10 mM的/>4’ ·硫醇基-4-醛基-1，1-二苯在四氫呋喃(tetrahydrofuran)溶 φ 液裡，均勻震盪反應大約二小時。使晶片上的金與〆硫醇基-4- 醒基-1，1-二苯產生自我組裝之排列。之後，利用諸如乙醇(ethanol) 和蒸飽水(distilled water)清洗基板，即可得到具有/>4-硫醇基-4-醒 基-1,1-二苯表面修飾的有機電導基板。 在本發明有關在第三，四種使用有機電導定錨分子較佳實施例 裡，圖3之逐步化學反應所得結果(圖3B與圖3C)，為可聯結各式 生物探針之基本有機電導晶片基板。其可供連結用來偵測各種特 φ 定物(target)所需用之生物探針分子(probe)，以進行相關生物醫學， 食品或環境樣本之檢測。 首先，在本發明一較佳實施例之中，如圖3A之化學反應所顯 示的，先在覆佈蒸鑛金或銀金屬薄膜層120之晶片基板110上，固 定病基(&吻1)硫化物:2-硫基乙胺(2-仙0^110110以111丨116))。此可以利 用將蒸鍍有金或銀之晶片基板浸入濃度約為1〇〇 mM的2-硫基乙 胺水溶液，或者浸入含有約1〇〇 mM的2-硫基乙胺的中性磷酸鹽 17 201124721 緩衝溶液(PBS) (pH=7.2)之中，均勻震盪反應大約二小時。使晶片 上的金與Cysteamine產生自我組裝(self assembly)之排列。之後， 利用諸如乙醇(ethanol)和蒸館水(distilled water)清洗基板103，即可 得到具有2-硫基乙胺表面修飾的基板103。 接著，在本發明有關第三種使用有機電導定錨分子較佳實施例 裡，圖3B之晶片化學反應顯示，圖3A修飾反應所得基板103, 與本發明第一種有機電導分子噻吩(oligothiophene)硫化物衍生物: _ 5”- 醛基 -5- 羧基 -2,2’,5’，2”- 三噻吩 (5”-aldehyde-5-carboxyl-2,2’,5’，2”-trithiophene，簡稱 AC-TTP，結構 為CHO(C4H2S)2COOH)水溶液(100 mM)，震盪均勻反應2小時 後，如此便可獲得如圖3B中所顯示反應結果之基板104。AC-TTP 其一末端的醛基(-CHO)可與基板上一級胺基(-NH2)進行偶合反 應，另一末端的竣基(-C00H)可預留作為親和劑，保留供反應後進 行生物分子探針的衍生。之後，分別各以二氯甲烷與離子水清洗 • 晶片10分鐘，以便除去晶片表面多餘的AC-TTP分子。 接著，在本發明有關第四種使用有機電導定錨分子較佳實施例 裡，圖3C之晶片化學反應顯示，圖3A修飾反應所得基板103, 與本發明第二種有機電導分子寡苯(oligobenzene)硫化物衍生物: 4'-醒基-4-竣基二聯苯(4'-aldehyde-4-carboxyl dibenzene，簡稱 AC-DBZ，結構為 CHO(C6H6)2COOH)7jC溶液(100 mM)，震盪均勻 反應2小時後，如此便可獲得如圖3C中所顯示反應結果之基板 201124721 105。AC-DBZ其一末端的醛基(-CHO)可與基板上一級胺基(·ΝΗ2) 進行偶合反應，另一末端的竣基(-COOH)可預留作為親和劑，保留 供反應後進行生物分子探針的衍生。之後，分別各以二氯甲烷與 離子水清洗晶片10分鐘，以便除去晶片表面多餘的AC-DBZ分 子。 注意到圖3A中之基板103係屬分子探針晶片之一種半成品晶 片。以圖3B與圖3C中之有機電導定錨化合物而言，其係為末端 • 為羧基[-COOH]的一種衍生化合物，亦即，其環狀鏈形分子構形遠 離基板110之金屬佈覆層120之末端是為一羧基。依據本發明， 基板104及105係為分子探針晶片的一種半成品。這是由於此基 板104及105上的每一定錨化合物分子的羧基，尚未聯結任何感測 用途所需的生物分子探針(probe)。此種半成品基板104及105可 以在適當的條件之下儲存一段長時間。典型可達至少三個月之 久。當有需要時，半成品基板104及105便可以進一步快速地進 • 行處理，聯結適合與羧基共價鍵結的多種分子探針中的任何一 種，以應用於特定的偵測用途。 依據本發明，半成品基板聯結分子探針所需的共價鏈結處理 可以極為快速。典型的處理可以快至約三分鐘的共價鏈結反應時 間的範圍。在醫學用途之中，當如新型流感(H1N1)類型的疫病爆 發時，依據本發明之分子探針設計觀念，諸如圖3B與圖3C中所 顯示之半成品基板104及105即可由庫存之中取出，快速進行探 201124721 針聯結處理，以便快速而大量地產出電學檢測生物晶片，應用於 疫病病毒的即時追蹤。 例1: 圖4之化學反應顯禾係為可適於連結各式生物探針之基本有 機電導基板101,可供連結至各種特定分子(target)檢測所需用之生 物分子探針(probe)，以進行相關生物醫學樣本(血液、尿液、體液、 • 精液、唾液、喉液檢體)中之標的物(target)檢測。 圖4之化學反應即顯示，在本發明一實施例之中，圖1之基本 生物晶片基板101表面，固定有有機電導分子寡噻吩(thiophene) 硫化物：5’ -(甲基）硫醇基-5-醛基-2,2’ -二噻吩 (5”-mercaptomethyl-5-aldehyde-2,2’-dithiophene，簡稱 MMAD)。此 有機電導分子之醒基[-CH0]可與生物分子探針(probe)，諸如蛋白 質(proteins)、胜肽(polypeptides)、核酸(nucleic acids)、醣類 鲁 （carbohydrates)、脂類(lipids)上的胺基[-NH2]進彳了亞胺鍵鍵結 (imine bonding, shiff base)反應，以便將生物分子探針共價鍵結到 有機電導基板1〇1上。之後，形成具有與標的物(tarSet)專一性結合 的能力的電感測晶片基板111。 a.以 HBS 緩衝液(10mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005% surfactant P20)'|旦定流速(5微升/分鐘)進入流道，流經 含有噻吩硫化物MMAD的晶片基板1〇1，清洗晶片基板】〇5。 20 201124721 b. 將50微升濃度約為200微克/毫升具有胺基的生物探針分 子溶液，注射進入流道，流經晶片基板1〇1，使其與醛基[-CHO] 進行亞胺鍵鍵結(imine bonding，shiff base)反應，形成共價鍵結 (-CH=N-)。將生物分子探針(probe)共價鍵結到有機電導基板101 上 c. 反應完成後，使用HBS緩衝液恒流清洗平衡基板111，以便 將未反應的生物分子探針流出晶片基板。此時即可獲得圖4中所 • 顯示末端共價鍵結有生物分子探針(biomdecules)衍生化合物的基 板m〇 此類型的生物感測晶片，其定錨有機電導分子末端所聯結之生 物分子探針(probe)，諸如蛋白質(proteins)、胜肽(polypeptides)、核 酸(nucleic acids)、醣类頁(carbohydrates)、月旨類(lipids)，具有與標的 物(target)專一性結合的能力，利於日後電學感測相關之生物醫學 檢驗。 例2: 圖5之化學反應顯示，係為可適於連結各式生物探針之基本有 機電導基板102,可供連結至各種特定分子(target)檢測所需用之生 物分子探針(probe),以進行相關生物醫學樣本(血液、尿液、體液、 精液、唾液、喉液檢體)中之標的物(target)檢測。 圖5之化學反應即顯示，在本發明一實施例之中，圖2之基本 201124721 生物晶片基板102表面，固定有有機電導分子寡苯(phenyl)硫化物: />4’ -硫醇基-4-醒基-1，1-二苯(p-^-mercapto-taldehyde dibenzene, 簡稱MA-DBZ，結構為CHO(C6H6)2COOH)。此有機電導分子之醛 基[-CHO]可與生物分子探針(probe)，諸如蛋白質(proteins)、胜肽 (polypeptides)* 核酸(nucleic acids)» 醣類(carbohydrates)* 脂類(lipids) 上的胺基[-NH2]進行亞胺鍵鍵結(iminebonding，shiffbase)反應，以 便將生物分子探針共價鍵結到有機電導基板102上。之後，形成具 # 有與標的物(target)專一性結合的能力的電感測晶片基板112。 a. 以 HBS 緩衝液(10mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl，3.4mM EDTA, 0.005% surfactant P20)恒定流速(5微升/分鐘)進入流道，流經 含有噻吩硫化物MMAD的晶片基板102,清洗晶片基板102。 b. 將50微升濃度約為200微克/毫升具有胺基的生物探針分 子溶液，注射進入流道，流經晶片基板102,使其與醛基[-CHO] 進行亞胺鍵鍵結(imine bonding，shiff base)反應，形成共價鍵結 • (-CH=N-)。將生物分子探針(probe)共價鍵結到有機電導基板102 上 c.反應完成後，使用HBS緩衝液恒流清洗平衡基板112以便 將未反應的生物分子探針流出晶片基板。此時即可獲得圖5中所 顯示末端共價鍵結有生物分子探針(biomolecules)衍生化合物的基 板 112。 此類型的生物感測晶片，其定錨有機電導分子末端所聯結之生 22 201124721 物分子探針(probe)，諸如蛋白質(pr〇teins)、胜肽(polypeptides)、核 酸(nucleic acids)、醣類(carbohydrates)、月旨類(lipids),具有與標的 物(target)專一性結合的能力，利於日後電學感測相關之生物醫學 檢驗。 .例3: 圖6之化學反應顯示，係為可適於連結各式生物探針之基本有 • 機電導基板1〇3,可供連結至各種特定分子(target)檢測所需用之生 物分子探針(probe)，以進行相關生物醫學樣本(血液、尿液、體液、 精液、唾液、喉液檢體)中之標的物(target)檢測。 圖6之化學反應即顯示，在本發明一實施例之中，圖3B之基 本晶片基板104表面具有有機電導寡噻吩(oligothiophene)硫化物: 5”_ 醛基 -5- 羧基 -2,2’，5’，2”- 三噻吩 (5”-aldehyde-5-carboxyl-2,2’，5’，2”-trithiophene，簡稱 AC-TTP，結構 ^ 為CHO(C4H2S)2COOH)所構成之有機電導分子，在圖6之化學 反應裡，利用H3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 (N-ethyl-N’-(dimethylaminopropyl)carbodiimide，簡稱 E-DAPC)，與 N·徑基號拍亞胺（N-hydroxysuccinimide，簡稱 HIS)， [HO-N-(CO)2(CH2)2)]對定錨有機電導分子之羧酸基[-C00H]進行 醯胺化(amidation)反應，以便將生物分子探針(probe)共價鍵結到有 機電導基板104上。HIS與E-DAPC之分子結構係分別如圖6之 23 201124721 反應式中所顯示。此HIS/E-DAPC混合物將先活化有機電導分子 之羧酸基[-COOH]，之後再與具有胺基的生物分子 (bio-macromolecules)，諸如蛋白質(proteins)、胜肽(polypeptides)、 核酸(nucleic acids)、醣類(carbohydrates)、脂類(lipids)等結合： a. 以 HBS 緩衝液(10mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl，3.4mM E：DTA, 0.005¼ surfactant P20戚PBS緩衝液恒定流速(5微升/分鐘) 進入流道，流經含有噻吩硫化物AC-TTP的晶片基板104,清洗晶 • 片基板1〇4〇 b. 將50微升的0.1 M HIS/0.4M E-DAPC (kl)混合溶注射 進入流道，流經晶片基板104,使其活化AC-TTP之羧酸基。 c. 將50微升濃度約為200微克/毫升具有胺基的生物分子溶 液，注射進入流道，流經晶片基板104,使其與羧基的活化基 (-CO-0-C4〇2H4N)進行醯胺化(amidation)反應，形成共價鍵結 (-CONH-)。將生物分子探針(probe)共價鍵結到有機電導基板104 • 上。 d.反應完成後，使用HBS緩衝液恒流清洗基板，之後使用50 微升濃度約為 1M 的乙醇胺(ethanolamine hydrochloride pH 8.5)溶 液，注射進入流道，流經晶片基板114,以便將未反應的活化基 (-CO-O-C4O2H4N)完全醯胺化(amidation)。此時即可獲得圖6中所 顯示末端共價鍵結有生物分子(biomolecules)衍生化合物的基板 114。 24 201124721 此類型的生物感測晶片，其定錨有機電導分子末端所聯結之生 物分子探針(probe)，諸如蛋白質(proteins)、胜肽(polypeptides)、核 酸(nucleic acids)、醣類(carbohydrates)、月旨類(lipids)，.具有與標的 物(target)專一性結合的能力，利於日後電學感測相關之生物醫學 檢驗。 例4: • 圖7之化學反應顯示，係為可適於連結各式生物探針之基本有 機電導基板105,可供連結至各種特定分子(target)檢測所需用之生 物分子探針(probe)，以進行相關生物醫學樣本(血液、尿液、體液、 精液、唾液、喉液檢體)中之標的物(target)檢測。圖7之化學反應 即顯示，在本發明一較佳實施例之中，圖3C之基本生物晶片基板 105表面，具有寡苯(phenyl)硫化物：4'-醛基-4-羧基二聯苯 (4,-aldehyde-4-carboxyl dibenzene,簡稱 AC-DBZ,結構為 • CHO(C6H6)2COOH)所構成之有機電導分子，在圖7之化學反應裡， 利用1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 N-ethyl-N，-(dimethylaminopropyl)carbodiimide，簡稱 E-DAPC，與 N-徑基號拍亞胺（N-hydroxysuccinimide),簡稱 HSI， [HO-N-(CO)2(CH2)2)]對定錨有機電導分子AC-DBZ之羧酸基 [-COOPi]進行醯胺化(amidation)反應，以便將生物分子探針(probe) 共價鍵結到有機電導基板105上。HSI與E-DAPC之分子結構係
i S 25 201124721 分別如圖7之反應式中所顯示。此HSI/E-DAPC混合物將先活化 有機電導分子AC-DBZ之羧酸基[-COOH]，之後再與具有胺基的 生物分子(bio-macromolecules)，諸如蛋白質(proteins)、胜肽 (polypeptides> 核酸(nucleic acids}醣類(carbohydrates)» 脂類(lipids) 等結合： a. 以 HBS 緩衝液(10mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% surfactant P20)或PBS緩衝液恒定流速(5微升/分鐘） 進入流道，流經含有寡苯硫化物AC-DBZ的晶片基板105,清洗晶 片基板105。 b. 將50微升的0.1 M HIS/0.4M E-DAPC (1:1)混合溶液，注射 進入流道，流經晶片基板105,使其活化AC-DBZ之羧酸基。 c. 將50微升濃度約為200微克/毫升具有胺基的生物分子溶 液，注射進入流道，流經晶片基板105,使其與羧基的活化基 (-CO-O-C4O2H4N)進行醯胺化(amidation)反應，形成共價鍵結 (-CONH-)。將生物分子探針(probe)共價鍵結到有機電導基板1〇5 上。 d. 反應完成後，使用HBS緩衝液恒流清洗基板，之後使用50 微升濃度約為 1M 的乙醇胺(ethanolamine hydrochloride pH 8.5)溶 液，注射進入流道，流經晶片基板115,以便將未反應的活化基 (-CO-0-C4〇2H4N)完全醯胺化(amidation)。此時即可獲得圖7中所 顯示末端共價鍵結有生物分子(biomolecules)衍生化合物的基板 Γ 26 201124721 115〇 此類型的生物感測晶片，其定錨有機電導分子末端所聯結之生 物分子探針(probe)，諸如蛋白質(proteins)、胜肽(polypeptides)、核 酸(nucleic acids)、醣類(carbohydrates)、月旨類(lipids),具有與標的 物(target)專一性結合的能力，利於日後電學感測相關之生物醫學 檢驗。 雖然本發明已配合圖式以較佳實施例揭示如上，然其並非用以 _ 限定本發明。例如，本發明之說明雖然係以電感測生物晶片為例 進行詳細說明，但本發明具有共價鍵結有機電導定錨化合物之生 物分子探針晶片，如同可以理解的，同樣亦可適用於其他使用了 金，銀，銅，鉑，鎳，鋅，鍺，汞或鈀當作生物晶片上感測薄膜之不同用途 的處理。其應用係例如電學感測晶片，電化學感測晶片，場效電晶 體感測晶片，壓電感測晶片及光學感測晶片等。因此，任何熟習此 技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍之情況下，當可進行此類 • 更動與變化，因此本發明之保護範圍當以後附之申請專利範圍所 界定者為準。 【圖式簡單說明】 圖1，2及3之化學反應分別顯示依據本發明一較佳實施例， 於塗佈有金或銀的基板表面上利用化學修飾(chemical modification) 處理之後，將特定長度之環狀有機電導寡噻吩及寡苯分子固定 化以供連結需用之生物探針(bioprobe)之基本分子探針晶片基板。（s} 27 201124721 圖1之化學反應顯示，在覆佈蒸鍍金(Au)金屬薄膜層之晶片基 板上，其化學修飾係採用具sp3(金與硫原子)混成軌域共價鍵結的 形式將有機電導分子寡噻吩(oligothiophene)硫化物：例如5’ -(甲基） 硫醇基-5·醒基-2,2’ -二噻吩，固定到金屬薄膜上。 圖2之化學反應顯示，在覆佈蒸鍍金金屬薄膜層之晶片基板上， 其化學修飾係採用具sp3(金與硫原子)混成軌域共價鏈結的形式將 有機電導分子寡苯(oligophenyl)硫化物：例如；>4,-硫醇基-4-醛基 -1,1-二苯。，固定到金屬薄膜上。 圖3A之化學反應顯示，在覆佈蒸鍍金或銀金屬薄膜層之晶片 基板上，固定焼基(alkyl)硫化物:2-硫基乙胺(2-thiol-ethanolamine)〇 圖3B之晶片化學反應顯示，在圖3A之分子探針晶片基板表 面，利用有機電導分子噻吩(oligothiophene)硫化物衍生物:5”-醛基 -5- 羧 基 -2,2’，5’，2”- 三噻吩 (5”-aldehyde-5-carboxyl-2,2’，5’,2”-trithiophene)，其一末端的醛基 (-CHO)可與基板上一級胺基(-ΝΉ2)進行偶合反應，另一末端的羧 基(-COOH)可預留作為親和齊!I保留供反應後進行生物分子探針的 衍生。 圖3C之晶片化學反應顯示，在圖3A之分子探針晶片基板表 面，利用有機電導分子寡苯硫化物衍生物：4'-醛基-4-羧基二聯苯 (4'-aldehyde-4-carboxyl dibenzene)，其一末端的醛基(-CH0)可與基 板上一級胺基(-NH2)進彳丁偶合反應，另一末知的竣基(-C00H)可預 [S3 28 201124721 留作為親和劑，保留供反應後進行生物分子探針的衍生。 圖4之化學反應即顯示，在圖1之基本生物晶片基板表面，固 定有有機電導分子寡噻吩(oligothiophene)硫化物衍生物。此有機電 導分子之醛基[-CHO]可與生物分子探針(probe)上的胺基[-NH2]進 行亞胺鍵鍵結(imine bonding, shiff base)反應，以便將生物分子探 針共價鍵結到有機電導基板上。 圖5之化學反應即顯示，在圖2之基本生物晶片基板表面，固 • 定有有機電導分子寡苯(oligophenyl)硫化物衍生物。此有機電導分 子之醛基[-CHO]可與生物分子探針(probe)上的胺基[-NH2]進行亞 胺鍵鍵結(imine bonding，shiff base)反應，以便將生物分子探針共 價鍵結到有機電導基板上。 圖6之化學反應即顯示，在圖3B之基本生物晶片基板表面， 固定有有機電導分子寡噻吩(olig〇thi〇Phene)硫化物衍生物。此有機 電導分子之羧酸基[-COOH]可與生物分子探針(probe)上的胺基 # 進行醯胺化(amidation)反應，以便將生物分子探針(probe)共 價鍵結到有機電導基板上。 圖7之化學反應即顯示，在圖3C之基本生物晶片基板表面， 固定有有機電導分子寡苯(oligobenzene)硫化物衍生物。此有機電 導分子之羧酸基[-COOH]可與生物分子探針(probe)上的胺基 [-NH2]，進行醯胺化(amidation)反應，以便將生物分子探針(Probe)共 價鍵結到有機電導基板上。 29