WO2013176289A1 - 生体分子検出装置、及び、生体分子検出方法 - Google Patents

生体分子検出装置、及び、生体分子検出方法 Download PDF

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WO2013176289A1
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electrode
biomolecule detection
probe
detection unit
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宮原　裕二
達郎 合田
康弘 前田
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国立大学法人東京医科歯科大学
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
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    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

Definitions

  • the present invention relates to a biomolecule detection apparatus and a biomolecule detection method.
  • a current detection type DNA chip using a redox label has been reported.
  • one end of a molecule called a molecular wire is immobilized on a metal electrode, a DNA probe is bound to the other end of the molecule, and a redox label based on hybridization with a target gene, and transfer of electrons from the metal electrode Is detected as a current change to detect a target gene (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • a DNA probe is immobilized on the surface of the floating electrode connected to the gate electrode of the field effect transistor, and hybridization is performed on the surface of the floating electrode with the target gene.
  • a method for detecting the change of the above using the field effect is disclosed (for example, see Patent Document 1).
  • Patent Document 2 a method of performing biomolecule detection by a surface plasmon resonance (SPR) method or a quartz crystal microbalance (QCM) method instead of a field effect transistor is also disclosed (for example, Patent Document 2).
  • SPR surface plasmon resonance
  • QCM quartz crystal microbalance
  • the devices used for detecting biomolecules detect different physical property values based on their own detection principles. Therefore, in individual measurement alone, accurate biomolecule detection could not be performed depending on the concentration and molecular weight of the biomolecule contained in the biomolecule aqueous solution to be measured. On the other hand, even when measuring by combining a plurality of devices, since the detection unit is not shared, the same phenomenon cannot be measured simultaneously.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances. Under the circumstances described above, there is a need for a biomolecule detection device that simultaneously and accurately detects physical properties of biomolecules and a biomolecule detection method that simultaneously and simultaneously detects physical properties of biomolecules. ing.
  • 1st this invention has the 1st biomolecule detection part which has a 1st electrode, and the 2nd biomolecule detection part which has a 2nd electrode,
  • the second electrode is a biomolecule detection apparatus in which the second electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized.
  • a first biomolecule detection unit having an electrode having a biomolecule probe-immobilized material on which a biomolecule probe is immobilized, and a second electrode sharing the first electrode as a second electrode.
  • This biomolecule detection apparatus has a biomolecule detection unit and a reference electrode.
  • this invention has a 1st biomolecule detection part which has a 1st electrode, and a 2nd biomolecule detection part which has a 2nd electrode,
  • the said 1st electrode or the said Using a biomolecule detection device in which the second electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized, the first electrode and the second electrode of the biomolecule detection device are At the same time, a solution contact step for contacting a solution containing at least one biomolecule, a signal at the solid-liquid interface between the first electrode and the solution, and a solid-liquid interface between the second electrode and the solution And a detection method for detecting each signal.
  • a first biomolecule detection unit having an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized, and a second electrode sharing the first electrode as a second electrode.
  • a biomolecule detection device having a biomolecule detection unit and a reference electrode is used, and the first electrode and the second electrode of the biomolecule detection device are simultaneously made into a solution containing at least one biomolecule. It is a biomolecule detection method which has a solution contact process to contact and a detection process to detect a signal at a solid-liquid interface between the first electrode (second electrode) and the solution.
  • the biomolecule detection apparatus which detects simultaneously the physical property which a biomolecule has in many aspects with sufficient precision is provided. Also, ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the biomolecule detection method which detects simultaneously the physical property which a biomolecule has with multifaceted precision is provided.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the structural example of a field effect transistor biomolecule detection part. It is a schematic diagram which shows the structural example of a crystal oscillator microbalance biomolecule detection part. It is a schematic diagram which shows the structural example of a surface plasmon resonance biomolecule detection part.
  • (A) is a schematic side view showing a configuration example of a field effect transistor
  • (B) is a schematic top view showing a configuration example of a field effect transistor.
  • A) is a schematic side view illustrating a configuration example of a transistor
  • (B) is a schematic top view illustrating a configuration example of a field effect transistor.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of a probe fixed electrode interface for explaining various layer formation processes when a protein having a small molecular weight is adsorbed to the probe fixed electrode, (A) is a monolayer formation process, (B) is a concentrated layer formation process. , (C) is a schematic diagram showing a stacking process. It is a schematic diagram of a probe fixed electrode interface for explaining various layer formation processes when a protein having a large molecular weight is adsorbed to the probe fixed electrode, (A) is a single layer formation process, (B) is a stack formation process, (C) is a schematic diagram which shows a concentrated layer formation process, respectively. It is a schematic diagram of the probe fixed electrode interface for demonstrating the sensing depth which a biomolecule detection part can measure.
  • the amount of adsorption ( ⁇ SRP ) of the protein (BSA) measured by the SPR biomolecule detection device used in the comparative example to the probe immobilization electrode of the protein (BSA) measured by the FET biomolecule detection device is a graph showing the relationship between adsorption amount (gamma FET) of.
  • the first invention has a first biomolecule detection unit having a first electrode and a second biomolecule detection unit having a second electrode
  • the first electrode or the second electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized
  • the second invention is an arrangement in which the biomolecule probe is immobilized.
  • a first biomolecule detection unit having an electrode having a biomolecule probe immobilization material, a second biomolecule detection unit sharing the first electrode as a second electrode, and a reference electrode is there.
  • Both the first invention and the second invention have one “electrode having a biomolecule probe-immobilized material on which a biomolecule probe is immobilized” per one biomolecule detection device, and at least two kinds It is common to have different biomolecule detection units.
  • the biomolecule detection apparatus of the present invention uses the first electrode and the second electrode simultaneously with at least one kind of living body. While contacting the aqueous solution containing molecules, each biomolecule detection unit detects a signal at the solid-liquid interface between each electrode and the aqueous solution. Thereby, the behavior of biomolecules generated in one system can be simultaneously captured from the viewpoint of two types of biomolecule detection units.
  • an aqueous solution containing at least one kind of biomolecule is also referred to as “biomolecule aqueous solution”.
  • the biomolecule detection unit which will be described in detail later, has an electrode as one of the components, and detects signals such as potential, vibration, and dielectric constant that change when the electrode contacts the aqueous biomolecule solution.
  • a biomolecule detection device that can be used.
  • a field effect transistor biomolecule detection unit using a field effect transistor (FET) a quartz crystal microbalance biomolecule detection unit using a quartz crystal microbalance (QCM) method
  • QCM quartz crystal microbalance
  • SPR surface plasmon resonance biomolecule detection unit using a surface plasmon resonance
  • field effect transistor biomolecule detector is referred to as “FET biomolecule detector”
  • quartz crystal microbalance biomolecule detector is referred to as “QCM biomolecule detector”
  • SPR biomolecule detector is referred to as “SPR biomolecule detector”. Is also referred to.
  • an electrode having a biomolecular probe immobilization material on which a biomolecular probe is immobilized is also referred to as a “probe immobilization electrode”.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 disclose a biomolecule detection apparatus having a biomolecule detection unit including a probe-fixed electrode having a biomolecule probe capable of capturing a biomolecule. ing.
  • the biomolecule detection device referred to as biomolecule detection device a
  • biomolecule detection unit a the biomolecule detection unit a
  • the information that can be detected by the biomolecule detection apparatus is only the information detected by the biomolecule detection unit a.
  • the biomolecule detection device usually has a detection limit range in which measurement is difficult depending on the concentration of the biomolecule aqueous solution, the molecular weight of the biomolecule, and the like, and information on the target concentration and molecular weight cannot be obtained. There are many things.
  • a biomolecule detection apparatus b having a biomolecule detection unit b which is another biomolecule detection device capable of measuring even in a concentration range, a molecular weight range, or the like that cannot be measured by the biomolecule detection unit a.
  • the measurement in a range that could not be measured by the biomolecule detection apparatus a is complemented.
  • the method of separately measuring one aqueous solution of biomolecules using the biomolecule detection device a and the biomolecule detection device b does not accurately capture the behavior of the biomolecules. The accuracy is not good.
  • the biomolecule detection device a having the biomolecule detection unit a and the biomolecule detection device b having the biomolecule detection unit b into contact with one aqueous biomolecule solution.
  • both electrodes are probe fixed electrodes. Therefore, each biomolecule detection part only detects the behavior of the biomolecule generated on each electrode. That is, the behavior of the biomolecule detected by the biomolecule detection device a is the behavior of the biomolecule generated on the electrode of the biomolecule detection unit a, and occurs on the electrode of the biomolecule detection unit b. It is not the behavior of biomolecules.
  • biomolecule detection apparatus b Therefore, even if a biomolecule detection device b different from the biomolecule detection device a is incorporated into one biomolecule aqueous solution, biomolecule detection in a concentration range, molecular weight range, etc. that cannot be measured by the biomolecule detection unit a It does not supplement the detection of the behavior of biomolecules generated on the electrode of the part a.
  • the behavior of biomolecules generated on one electrode can be measured simultaneously by two different biomolecule detectors. Detection of biomolecules in a concentration range, molecular weight range, viscosity range, or the like, which is difficult to measure with one biomolecule detection unit, can be measured with another biomolecule detection unit.
  • the behavior of biomolecules in a concentration range, molecular weight range, viscosity range, etc. that can be measured with each other can be measured from at least two viewpoints. This is considered to be due to the following reason.
  • the first invention has a first biomolecule detection unit having a first electrode and a second biomolecule detection unit having a second electrode, wherein the first biomolecule detection unit has the first electrode.
  • the electrode or the second electrode is a biomolecule detection device in which the biomolecule probe is immobilized on a biomolecule probe immobilization material (probe immobilization electrode). That is, only one of the first electrode and the second electrode is a probe fixing electrode, and the other serves as a reference electrode.
  • the probe fixing electrode is, for example, a QCM biomolecule detection unit and the reference electrode is, for example, an FET biomolecule detection unit
  • the QCM biomolecule detection unit is configured so that the biomolecule is a biomolecule on the probe fixing electrode.
  • the QCM biomolecule detection unit and the FET biomolecule detection unit can determine the behavior of the biomolecule generated on the probe fixed electrode by the QCM biomolecule detection unit and the FET biomolecule detection unit. Can be grasped from the viewpoint.
  • the FET biomolecule detection unit can compensate and detect the behavior of the biomolecule.
  • a first biomolecule detection unit having an electrode (probe fixing electrode) having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized, and the first electrode as a second electrode.
  • It is a biomolecule detection apparatus having a shared second biomolecule detection unit and a reference electrode. That is, the first biomolecule detection unit and the second biomolecule detection unit share an electrode that is a probe fixed electrode. That is, this means that the first biomolecule detection unit and the second biomolecule detection unit are integrated through the probe fixing electrode.
  • the biomolecule is captured by the biomolecule probe while the QCM biomolecule detection unit detects vibration of the electrode caused by the biomolecule captured on the probe fixed electrode.
  • the FET biomolecule detection unit detects a change in potential caused by this.
  • the QCM biomolecule detection unit and the FET biomolecule detection unit grasp the behavior of the biomolecule generated on the probe fixed electrode from the viewpoint of the QCM biomolecule detection unit and the FET biomolecule detection unit. Can do.
  • the FET biomolecule detection unit can compensate and detect the behavior of the biomolecule.
  • the protein adsorption / desorption mechanism on the electrode surface can be monitored in real time using the adsorption mass (QCM) and electrochemical characteristics (charge and dielectric constant) (FET) as indices.
  • QCM adsorption mass
  • FET electrochemical characteristics
  • the same phenomenon occurring at the same electrode is monitored simultaneously, it becomes possible to perform kinetic comparative analysis of data having different measurement principles. Therefore, according to the present invention, physical properties possessed by biomolecules can be detected simultaneously in a multifaceted manner with high accuracy.
  • biomolecule detection apparatus and biomolecule detection method of the present invention will be described in detail.
  • a biomolecule detection apparatus includes a first biomolecule detection unit having a first electrode, and a second biomolecule detection unit having a second electrode, wherein the first biomolecule detection unit has the first electrode.
  • the electrode or the second electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized.
  • a biomolecule detection apparatus includes a first biomolecule detection unit having an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized, and the first electrode as a second electrode.
  • the second biomolecule detection unit sharing the reference and a reference electrode.
  • the biomolecule detection unit provided in the biomolecule detection device of the present invention has an electrode as one of the components, and detects a signal such as a potential or a resonance vibration that changes when the electrode comes into contact with the aqueous biomolecule solution.
  • a biomolecule detection device capable of For example, a field effect transistor biomolecule detection unit (FET biomolecule detection unit) using a field effect transistor (FET), and a crystal resonator micro using a Quartz Crystal Microbalance (QCM) method Examples thereof include a balanced biomolecule detection unit (QCM biomolecule detection unit) and a surface plasmon resonance biomolecule detection unit using a surface plasmon resonance (SPR) method.
  • the FET biomolecule detection unit is a biomolecule detection device that detects a biomolecule based on a potential that varies depending on the charge of the biomolecule. Specifically, the FET biomolecule detection unit can measure a small potential change in an aqueous biomolecule solution caused by a biomolecule captured by a biomolecule probe or adsorbed to an electrode.
  • an electrode probe-fixed electrode
  • a biomolecule probe capable of capturing a target biomolecule is immobilized is immersed in a biomolecule aqueous solution. Captures a biomolecule and captures the electrical signal of the captured biomolecule by a change in potential.
  • the electric potential method in which the electric signal of the captured biomolecule is captured by a change in electric potential is a solid / liquid interface (solid state) between the electrode (solid) and the solution (liquid) generated when the biomolecule probe captures the charged biomolecule. Change in potential (change in surface charge density) is also detected.
  • a current method is also known in which an electric signal of a captured biomolecule is captured by a change in current.
  • a technique using an oxidation-reduction reaction on an electrode is usually employed.
  • an oxidizing substance or a reducing substance for example, ascorbic acid
  • an electric current based on oxidation or reduction flows, thereby preventing detection of the biomolecule. Therefore, the detection accuracy may be deteriorated.
  • an electrode reaction advances on an electrode with current measurement. The electrode reaction is irreversible and non-equilibrium reaction. As a result, corrosion of the electrode, generation of gas, and the like occur, and the stability of current measurement is impaired. In particular, the detection accuracy may be deteriorated when repeatedly measuring. Therefore, it is preferable to capture the electrical signal of the biomolecule captured by the biomolecule probe by the change in potential.
  • the FET biomolecule detection unit is not particularly limited as long as it is a field effect transistor (FET) having an electrode, and a known field effect transistor can be used.
  • FET field effect transistor
  • a configuration example of the FET biomolecule detection unit will be described with reference to FIG.
  • FIG. 1 shows an FET biomolecule detection unit 52 that has a gate electrode G on a source S and a drain D that are provided apart from each other, and an electrode 30F connected to the gate electrode G.
  • the electrode 30F is not a probe fixing electrode
  • the electrode 30F is composed only of an electrode substrate.
  • the electrode 30F is a probe fixing electrode
  • the electrode 30F includes the electrode substrate, the biomolecule probe immobilization material, and the biomolecule. And a probe.
  • the electrode 30F is in contact with the biomolecule aqueous solution.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of a floating gate type FET
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of an extended type FET. 4A and 4B
  • FIG. 4A is a cross-sectional view
  • FIG. 5B is a top view.
  • FIG. 4A shows a floating gate type FET (hereinafter referred to as “F-FET”).
  • F-FET floating gate type FET
  • the F-FET is provided on the silicon substrate 12, the drain 14D and the source 14S provided on the silicon substrate 12, and the silicon substrate 12, the drain 14D, and the source 14S.
  • a gate insulating film 16 that is a silicon oxide layer, a gate insulating film 17 that is a silicon nitride layer, and a floating electrode 18 are provided.
  • a floating electrode 18 is formed on a channel region between the drain 14D and the source 14S, and the potential is detected by the floating electrode 18. Therefore, in the F-FET, as shown in FIG. 4B, a channel region between the drain 14D and the source 14S is located in a region vertically below the floating electrode 18.
  • FIG. 5A shows an extended FET (hereinafter referred to as “E-FET”).
  • E-FET extended FET
  • the E-FET is provided on the silicon substrate 12, the drain 14D and the source 14S which are provided on the silicon substrate 12, and on the silicon substrate 12, the drain 14D and the source 14S.
  • the gate insulating film 16, the gate insulating film 17, and the floating electrode 18 are provided.
  • a gate electrode 15 is provided inside the insulating film 16.
  • the channel region between the drain 14D and the source 14S is not positioned in the region vertically below the floating electrode 18, but in the region vertically below the floating electrode 18.
  • One end of the gate electrode 15 is located.
  • a channel region between the drain 14D and the source 14S is located in a region vertically below the other end of the gate electrode 15.
  • the gate insulating film 16 includes silicon oxide (SiO 2 ), silicon nitride (SiN), aluminum oxide (Al 2 O 3 ), Materials such as tantalum oxide (Ta 2 O 5 ) are used alone or in combination.
  • silicon oxide (SiO 2 ) silicon nitride (SiN), aluminum oxide (Al 2 O 3 ), or tantalum oxide (Ta 2 O 5 ) is stacked on silicon oxide (SiO 2 ) is used. .
  • the gate electrode 15 is preferably polysilicon (Poly-Si), and has good consistency with a so-called self-alignment process in which the source 14S and the drain 14D are formed by ion implantation through the polysilicon gate.
  • the floating electrode 18 is preferably made of a material having a high affinity with the electrode substrate, and a noble metal such as gold, platinum, silver, or palladium, or a conductive substance such as a carbon material can be used.
  • the carbon material include conductive carbon materials such as glassy carbon, graphite, graphene, and carbon nanotubes.
  • the gate electrode 15 is used as a wiring, a material with low resistance and good workability such as etching is preferable.
  • a material with low resistance and good workability such as etching is preferable.
  • the material polysilicon (Poly-Si), aluminum, molybdenum, or the like can be used.
  • the gate electrode 15 and the floating electrode 18 can be formed of the same material such as gold.
  • the QCM biomolecule detection unit includes at least an electrode, a crystal resonator, and an oscillation circuit that detects vibration of the crystal resonator, and detects a biomolecule based on the crystal resonator microbalance method. It is a molecular detection instrument.
  • the quartz crystal microbalance method uses a laminate in which electrodes are attached to both sides of a thin plate-shaped quartz crystal, and it vibrates at a constant frequency (resonance frequency) when an AC electric field is applied to each electrode. This is a technique for measuring the mass of a substance attached to an electrode.
  • the QCM biomolecule detection unit when a biomolecule adheres to the electrode adjacent to the crystal resonator, the change in the resonance frequency according to the mass of the biomolecule is utilized to measure the mass change of the biomolecule. Detect biomolecules.
  • a configuration example of the QCM biomolecule detection unit will be described with reference to FIG.
  • FIG. 2 shows a QCM biomolecule detection unit 54 in which an electrode 22, a crystal resonator (crystal plate) 24, and an electrode 30Q are stacked in this order.
  • An oscillation circuit (not shown) is connected to the electrode 22 and the electrode 30Q by a conductive wire.
  • the electrode 22 and the electrode 30Q are not particularly distinguished, and either may be a probe fixing electrode, or both the electrode 22 and the electrode 30Q may be a probe fixing electrode.
  • the electrode 22 and the electrode 30Q are configured only by an electrode substrate.
  • the electrode 22 and the electrode 30Q are probe fixing electrodes
  • the electrode 22 and the electrode 30Q are configured to include an electrode substrate, a biomolecule probe fixing material, and a biomolecule probe.
  • a biomolecular probe-immobilized material on which a biomolecular probe is immobilized is provided on the surface opposite to the side where the crystal resonator 24 is present.
  • the electrode 22 and the electrode 30F is in contact with the biomolecule aqueous solution.
  • the electrode of the QCM biomolecule detection unit is a probe fixed electrode
  • the case where the electrode 30F is a probe fixed electrode will be described as an example.
  • the SPR biomolecule detection unit includes at least an electrode, a glass substrate, a light irradiation device, and a light receiving device that receives reflected light and detects reflectance, and is based on the surface plasmon resonance method, It is a biomolecule detection device for detecting.
  • the surface plasmon resonance method means that near-field light that penetrates into and out of the electrode out of the light incident on the electrode through the glass substrate is absorbed by the surface plasmon induced on the electrode. This is a method for detecting a substance attached to an electrode by utilizing a phenomenon that an absorption peak corresponding to this appears in reflected light.
  • FIG. 3 shows the SPR biomolecule detection unit 56 in which the glass substrate 28 and the electrode 30SP are stacked in this order.
  • light (h ⁇ ) is irradiated onto the glass substrate 28 at an incident angle ⁇ from a light irradiation device (not shown), is reflected by the electrode 30, and receives reflected light by a light receiving device (not shown).
  • the bioelectron attached to the electrode 30 is detected.
  • a CCD (Charge Coupled Device) camera or the like may be used as the light receiving device.
  • the electrode 30SP When the electrode 30SP is not a probe fixed electrode, the electrode 30SP is composed only of an electrode substrate.
  • the electrode 30SP is a probe fixing electrode, the electrode 30SP includes an electrode substrate, a biomolecule probe fixing material, and a biomolecule probe.
  • the electrode when the electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material (probe immobilization electrode) on which the biomolecule probe is immobilized will be described, and then the electrode when the electrode is not a probe immobilization electrode will be described. To do.
  • An electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized includes an electrode substrate, a biomolecule probe immobilization material, and a biomolecule probe. More specifically, a layer of a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized is laminated on an electrode substrate.
  • the electrode substrate is not particularly limited as long as it is a substrate containing a conductive substance.
  • the electrode substrate may include a metal, the carbon material described above, or the like.
  • the metal itself may be an electrode substrate, and such an electrode substrate (metal electrode substrate) may be a single metal or an alloy. Examples thereof include gold, silver, platinum, tantalum, aluminum, titanium, magnesium, zinc, silicon, and tin. Among them, a metal having a good affinity with a biomolecular probe immobilization material described later is preferable.
  • an alkanethiol when used as the biomolecular probe immobilization material, it is preferably a metal having good affinity with a sulfur atom, specifically, silver, platinum, or zinc is preferable. More preferably, it is gold.
  • the shape of the electrode substrate is not particularly limited as long as it is a thin film, and the shape of the top view may be a circle, an ellipse, a rectangle, a triangle, a polygon, It may be indefinite.
  • the electrode substrate may be partially or entirely covered with at least one of a metal salt and a metal oxide. That is, an inorganic layer containing at least one of a metal salt and a metal oxide may be laminated adjacent to the electrode substrate surface.
  • the FET biomolecule detection unit is used as the biomolecule detection unit, part or all of the surface of the electrode substrate is coated with at least one of a metal salt and a metal oxide, and the coating portion is in contact with the aqueous biomolecule solution. Therefore, the stability of the potential at the solid-liquid interface between the aqueous solution and the electrode is excellent.
  • a metal electrode substrate made of gold is used as the electrode substrate because it is not corroded by an aqueous biomolecule solution.
  • gold is polarized, the electric potential at the solid-liquid interface becomes unstable.
  • Potential drift may also be caused by an increase or decrease in the concentration of ions in the aqueous biomolecule solution in which the metal electrode is immersed. Since the FET biomolecule detection unit performs biomolecule detection by the potential method, the accuracy of biomolecule detection can be increased by suppressing the potential drift.
  • Part or all of the surface of the metal electrode substrate is coated with at least one of a metal salt and a metal oxide, and the coated portion is exposed so as to be in contact with the aqueous biomolecule solution, thereby causing the polarization of the metal. It is difficult to suppress potential drift. This is thought to be due to the following reason.
  • the metal salt is represented as MX
  • the metal salt is dissociated into a metal ion (M + ) and a salt ion (X ⁇ ) in an aqueous solution, and is in an equilibrium state as represented by the following formula (1).
  • the metal oxide is also dissociated in an aqueous solution to reach an equilibrium state. That is, when the metal oxide is represented by MO, the metal oxide ion MO ⁇ is in equilibrium with the hydroxide (MOH) in the aqueous solution, and further, depending on the liquidity (pH) of the aqueous solution, MOH 2 + and Become. MO ⁇ , MOH, and MOH 2 + are considered to be in an equilibrium state as shown in the following equation (2).
  • the metal electrode substrate when coated with a metal salt, it is immersed in an aqueous biomolecule solution containing X ⁇ ions, and when coated with a metal oxide, it is immersed in an aqueous biomolecule solution containing H + ions.
  • the ions are in an equilibrium state, and the potential at the solid-liquid interface between the electrode and the aqueous biomolecule solution is considered to be stable. That is, it is considered that potential drift hardly occurs.
  • metal salts and metal oxides that serve as electrode materials do not cause polarization, and from this point of view, it is considered that potential drift is unlikely to occur.
  • the FET biomolecule detection unit when used as the biomolecule detection unit, part or all of the surface of the electrode substrate is coated with at least one of a metal salt and a metal oxide, and the coating portion is a biomolecule aqueous solution. It is considered that more accurate biomolecule detection can be performed by using an electrode substrate that is exposed so as to be in contact with the substrate.
  • the metal salt is not particularly limited.
  • silver chloride, calcium chloride, barium chloride, magnesium chloride, zinc chloride, aluminum chloride, calcium nitrate, aluminum sulfate, silver sulfide, silver bromide, silver iodide, platinum chloride, etc. Is mentioned.
  • Only one type of metal salt may be used, or two or more types may be used.
  • the metal salt is preferably a metal chloride.
  • the metal constituting the metal salt is preferably one having good affinity with the biomolecular probe immobilization material described later.
  • the metal constituting the metal salt is preferably a metal having a good affinity for a sulfur atom.
  • a metal having a good affinity for a sulfur atom Specifically, silver, platinum, Or it is preferable that it is zinc and it is more preferable that it is silver.
  • the metal oxide is not particularly limited.
  • the metal constituting the metal salt has good affinity with the biomolecular probe immobilization material described later.
  • the metal constituting the metal salt is preferably a metal having a good affinity for sulfur atoms.
  • tantalum (Ta) Platinum, gold, or titanium is preferable, and tantalum is more preferable.
  • the inorganic layer composed of a metal salt or metal oxide is formed as a salt (metal salt) or oxide (metal oxide) of a metal electrode substrate by a surface treatment described later, or is separately provided on the electrode substrate. Or the method of adhere
  • an adhesive such as an epoxy compound is applied to the electrode substrate or metal salt or metal oxide, and the electrode substrate and the metal salt or metal oxide are bonded.
  • Examples thereof include a method of bonding with an oxide, a method of depositing a metal salt or metal oxide on an electrode substrate using an electron beam or the like, and a method of forming by sputtering.
  • Examples of the method for surface-treating the surface of the metal electrode substrate include a method of applying a solution such as a chelating agent solution containing hydrochloric acid, nitric acid, or salt ions, or a gas such as oxygen gas or ozone gas to the surface of the metal electrode substrate.
  • a solution such as a chelating agent solution containing hydrochloric acid, nitric acid, or salt ions, or a gas such as oxygen gas or ozone gas
  • a metal electrode substrate is used as the electrode substrate, and the surface of the metal surface of the electrode substrate is treated with a solution that can be used as a target metal salt. Good.
  • a chelating agent for example, PDTA; 1,3-Propanediamine Tetraacetic Acid
  • Fe 3+ as a ligand
  • a chelating agent for example, PDTA; 1,3-Propanediamine Tetraacetic Acid
  • the surface of the metal electrode substrate may be oxidized.
  • the metal electrode substrate may be oxidized by applying a solution containing an oxidizing agent such as hydrogen peroxide to the surface of the metal electrode substrate or spraying oxygen gas, ozone gas, or the like.
  • the layer thickness of the inorganic layer comprising a metal salt or metal oxide is preferably 1 nm to 100 nm, and more preferably 1 nm to 10 nm.
  • an inorganic layer composed of a metal salt or a metal oxide on the electrode substrate means that, for example, the surface of the electrode substrate is subjected to AFM (Atomic Force Microscope), TEM (Transmission Electron Microscope). It can be confirmed by photo observation using a microscope such as Transmission (Electron Microscope).
  • AFM Atomic Force Microscope
  • TEM Transmission Electron Microscope
  • the metal electrode substrate is a reference electrode.
  • the metal electrode substrate is the same as the metal electrode substrate in the case where the metal electrode is a probe fixing electrode, and may be a metal simple substance or an alloy metal plate, or a part or all of the surface may be a metal chloride or metal It may be a metal plate coated with an oxide.
  • the probe fixing electrode has a biomolecular probe immobilization material on which a biomolecular probe is immobilized on a metal electrode substrate.
  • Biomolecular probes include nucleic acids, polynucleotides, synthetic oligonucleotides, antibodies, antigens, aptamers, glycoproteins or sugar chains. These may be fragments or the like.
  • oligonucleotides, cDNA fragments and the like are usually composed of 300 or less bases. When an oligonucleotide is used, it is preferably a nucleic acid fragment having a base length of 80 or less.
  • biomolecule probe is bound (immobilized) to the biomolecule probe immobilization material, and specifically binds or reacts with the biomolecule in the aqueous solution containing the biomolecule.
  • the biomolecular probe is a single-stranded probe (for example, single-stranded DNA), and after complementary strand binding with the target DNA, a single-base extension reaction that reacts complementarily with the base of the target DNA is used. Specific biomolecules can also be detected with high accuracy. Details of the biomolecule detection method will be described later.
  • the biomolecular probe immobilization material is a material for immobilizing the biomolecular probe on the electrode. In order for the electrode to accurately detect the charge of the biomolecule, it is important that the biomolecule probe that captures the biomolecule and the metal electrode substrate are bound (immobilized). .
  • biomolecular probe immobilization material examples include a sulfur-containing compound, a silyl group-containing compound, streptavidin (hereinafter also simply referred to as “avidin”), and the like.
  • the sulfur-containing compound examples include thiol group-containing compounds typified by alkanethiol having an alkyl chain and alkane disulfides.
  • the silyl group-containing compound examples include alkyl alkoxysilanes having an alkyl chain. Both the sulfur-containing compound and the silyl group-containing compound may be a sulfur-containing compound or a silyl group-containing compound having a polymer chain represented by polyethylene glycol (PEG) instead of the alkyl chain.
  • PEG polyethylene glycol
  • the binding property to the metal electrode substrate when a thiol group-containing compound is used as the biomolecular probe immobilization material will be described.
  • Sulfur has a high affinity with noble metals such as gold, silver and platinum.
  • noble metal plate or metal thin film is used as the metal electrode substrate, sulfur of the thiol group-containing compound and metal (for example, gold) act to bond sulfur and metal.
  • the metal electrode substrate when the whole or part of the surface of the metal electrode substrate is covered with an inorganic layer composed of at least one of a metal salt and a metal oxide, a layer of a biomolecular probe immobilization material is provided on the inorganic layer.
  • the metal electrode substrate and the sulfur-containing compound are bonded by the following mechanism.
  • the inorganic layer is a metal salt
  • salt ions of the metal salt (Cl ⁇ in the case of AgCl) are exposed on the metal electrode substrate
  • the inorganic layer is a metal oxide
  • the metal oxide oxygen ions (O ⁇ ) are exposed.
  • the silyl (Si) group has a high affinity with oxygen ions.
  • oxygen ions (O ⁇ ) of the metal oxide are exposed on the surface of the metal electrode.
  • oxygen ions (O ⁇ ) and sulfur atoms are bonded.
  • a thiol group-containing compound when a thiol group-containing compound is first allowed to act on the metal electrode surface, sulfur is bonded to the metal surface and the thiol group-containing compound is immobilized. Thereafter, when the surface of the metal electrode is brought into contact with a reaction solution such as PDTA, a metal salt such as silver chloride is formed on the surface of the metal electrode where the thiol group-containing compound is not formed.
  • concentration of the thiol group-containing compound By adjusting the concentration of the thiol group-containing compound, the density of sulfur atoms bonded to the metal surface, that is, the density of the thiol group-containing compound can be adjusted.
  • the thickness of the metal salt (silver chloride) layer can be controlled by adjusting the contact time with a reaction solution such as PDTA.
  • a reaction solution such as PDTA.
  • the size of the thiol-containing compound for example, the length of the alkyl group, the relative position, distance, and functional group (amino group, carboxyl group, aldehyde group, etc.) of the thiol-containing compound and the metal salt surface, The flexibility of the thiol group-containing compound can be controlled and optimized.
  • Avidin may be immobilized on the electrode by modifying a part of the molecule with a sulfur-containing compound such as alkanethiol or a silyl group-containing compound such as alkylalkoxysilane.
  • a sulfur-containing compound such as alkanethiol or a silyl group-containing compound such as alkylalkoxysilane.
  • the binding (immobilization) of the biomolecule probe immobilization material and the biomolecule probe is performed by, for example, modifying either one end of the biomolecule probe or one end of the biomolecule probe immobilization material with an amino group, Is modified with a carboxy group, and the two may be bound by an amide bond or the like.
  • the amino group or carboxy group need not be modified.
  • the one end may be modified with an aldehyde group and bonded to an amino group.
  • biomolecular probe immobilization material is avidin
  • biotin having high affinity with avidin Avidin is composed of four subunits, each having a biotin binding site, and thus can bind to four biotins per molecule. Therefore, by modifying biotin at one end of the biomolecule probe, the biomolecule probe immobilization material and the biomolecule probe can be bound (immobilized) using the avidin-biotin bond.
  • the biomolecular probe immobilization material is preferably a sulfur-containing compound, and more preferably a thiol group-containing compound.
  • the sulfur-containing compound functions as a self-assembled membrane (SAM).
  • SAM self-assembled film
  • Sulfur-containing compounds such as alkanethiols and alkane disulfides are adsorbed spontaneously on substrates containing noble metals such as noble metals such as gold and silver, metal salts composed of noble metals, and oxides composed of noble metals.
  • a monomolecular-sized thin film is given. Therefore, the biomolecule probe can be immobilized on the electrode at a high density, and the detection accuracy of the biomolecule can be further increased.
  • a biomolecule probe immobilization material solution in which the biomolecule probe immobilization material is dissolved It may be applied directly to the electrode substrate or on a layer composed of a metal salt or metal oxide and dried.
  • the biomolecule probe may be bonded to the biomolecule probe immobilization material after forming the biomolecule probe immobilization layer.
  • the biomolecule probe immobilization material to which the biomolecule probe is bonded is dissolved in a solvent, and the solution is used as a metal electrode substrate or a metal salt or metal. You may provide on the layer comprised with an oxide.
  • a method for applying a solution onto a metal electrode substrate or an inorganic layer composed of a metal salt or metal oxide spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, or the like can be used. Examples thereof include a method of applying a solution, and a method of applying by a dropping method, a spray method, a vapor deposition method, a casting method, an immersion method, and the like.
  • a solution in which a biomolecule probe immobilization material or a biomolecule probe immobilization material bound to a biomolecule probe is dissolved is randomly deposited on a metal electrode substrate or an inorganic layer composed of a metal salt or metal oxide. It may be applied in the form of an array, may be provided in an array, or may be applied in a lump in the form of a domain. Moreover, you may provide in pattern form.
  • a solvent for dissolving the biomolecule probe immobilization material or the biomolecule probe immobilization material to which the biomolecule probe is bound water, alcohol, or a mixed solvent thereof is used.
  • a water-insoluble organic solvent may be used, but when the biomolecule probe immobilization material to which the biomolecule probe is bound is dissolved, from the viewpoint of handling the biomolecule.
  • Water, a water-soluble solvent such as alcohol, or a mixed solvent thereof is used. Among these, water, ethanol, or a mixed solvent thereof is preferable.
  • the biomolecular probe immobilization material is immobilized on the electrode substrate is, for example, that the X-ray photoelectron such as XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy) or ESCA (Electron Spectroscopy for Chemical Analysis) is applied to the surface of the metal electrode substrate.
  • XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy
  • ESCA Electron Spectroscopy for Chemical Analysis
  • spectroscopic analysis For example, when alkanethiol is used as the biomolecular probe immobilization material, a peak derived from a sulfur atom is detected when the alkanethiol is immobilized on the metal electrode substrate.
  • the biomolecule probe is immobilized on the biomolecule probe immobilization material, for example, by labeling the biomolecule with a fluorescent molecule and performing fluorescence detection.
  • FIG. 6 shows a metal electrode substrate 32a, a biomolecule probe immobilization layer 36a formed using a biomolecule probe immobilization material on the surface of the metal electrode substrate 32a, and a biomolecule probe immobilization layer 36a.
  • a metal electrode (probe fixed electrode) 30a having a biomolecular probe 38a is shown.
  • the entire surface of the electrode substrate 32a may be covered with a biomolecule probe immobilization layer 36a on which a biomolecule probe 38a is immobilized.
  • the probe 38a may be covered with an immobilized biomolecule probe immobilization layer 36a.
  • FIG. 7 a configuration example of the probe fixing electrode in the case where all or part of the surface of the metal electrode substrate is covered with an inorganic layer composed of at least one of a metal salt and a metal oxide will be described with reference to FIG. To do.
  • the metal electrode substrate 32 b and the inorganic layer 34 b that is located on the metal electrode substrate 32 b and configured by at least one of a metal salt and a metal oxide, are similarly located on the metal electrode substrate 32 b
  • a metal electrode (probe fixing electrode) 30b having a biomolecular probe immobilizing layer 36b configured using a biomolecular probe immobilizing material and a biomolecular probe 38b immobilized on the biomolecular probe immobilizing layer 36b is shown. ing.
  • the metal electrode substrate 32b shown in FIG. 7 is a silver thin film, and the entire surface of the metal electrode substrate 32b is once covered with an inorganic layer 34b made of silver chloride (AgCl) by surface treatment. Thereafter, a biomolecular probe immobilization material composed of alkanethiol is applied to a part of the surface of the inorganic layer 34b, so that sulfur (S) of alkanethiol is substituted with chloride ions (Cl) of silver chloride. Thus, sulfur (S) of alkanethiol is bonded to the metal (Ag) of the metal electrode substrate, and the biomolecular probe immobilization layer 36b is formed on the metal electrode substrate 32b.
  • the biomolecule probe 38b may be combined with the biomolecule probe immobilization material in advance before the biomolecule probe immobilization material is allowed to act on the inorganic layer.
  • the inorganic layer unit 34b is placed on the surface of the metal electrode substrate 32b so as to be in contact with the biomolecule aqueous solution for potential stability. It is preferable to leave it in the part.
  • a biomolecule detection apparatus includes a first biomolecule detection unit having a first electrode, and a second biomolecule detection unit having a second electrode, wherein the first biomolecule detection unit has the first electrode.
  • the electrode or the second electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized.
  • FIG. 1 A configuration example of the biomolecule detection apparatus according to the first invention of the present invention is shown in FIG.
  • FIG. 8 shows a biomolecule detection apparatus 102FQ using an FET biomolecule detection unit 82F as a first biomolecule detection unit and a QCM biomolecule detection unit 84Q as a second biomolecule detection unit.
  • the FET biomolecule detection unit 82F has a source S, a drain D, and a gate electrode G, and the gate electrode G is connected to the electrode 30F by a lead wire.
  • the electrode 30F is composed only of a metal electrode substrate in which a silver plate is coated with silver chloride. The electrode 30F is in contact with the biomolecule aqueous solution 70 and is in a state in which a change in potential in the biomolecule aqueous solution 70 can be read.
  • the QCM biomolecule detection unit 84Q includes the electrode 22, the crystal resonator 24, and the electrode 30Q in this order.
  • the electrode 30Q includes a metal electrode substrate 32q, a biomolecule probe immobilization layer 36q located on the metal electrode substrate 32q, and a biomolecule probe 38q located on the biomolecule probe immobilization layer 36q.
  • the biomolecule probe 38q is schematically drawn as one layer, it is as if only the biomolecule probe 38q is in contact with the biomolecule aqueous solution 70 in the QCM biomolecule detection unit 84Q. appear.
  • the electrode 30Q has a structure like the metal electrode 30a or 30b shown in FIGS. Therefore, the metal electrode substrate 32q and the biomolecule probe immobilization layer 36q can also come into contact with the biomolecule aqueous solution 70.
  • the electrode 22 is composed only of a metal electrode substrate, and the electrode substrate 32q and the electrode 22 are both gold thin films. Further, the electrode substrate 32q and the electrode 22 are connected to the oscillation circuit 26 through a lead wire, and the oscillation circuit 26 senses vibration generated by capturing the biomolecule with the biomolecule probe 38q. The electrode substrate 32q is connected to the ground.
  • the FET biomolecule detection unit 82F which is the first biomolecule detection unit, functions as a reference electrode, and the QCM biomolecule detection, which is the second biomolecule detection unit.
  • the metal electrode 30Q included in the portion 84Q is a probe fixing electrode. Therefore, when a biomolecule in the biomolecule aqueous solution 70 is captured by the biomolecule probe 38q on the electrode 30Q, the QCM biomolecule detection unit 84Q detects the mass of the biomolecule through the vibration of the crystal resonator. At the same time, the FET biomolecule detection unit senses a change in potential caused by the biomolecule probe 38q capturing the biomolecule through the biomolecule aqueous solution 70 and detects the biomolecule.
  • FIG. 8 shows a biomolecule detection apparatus using a QCM biomolecule detection unit as a biomolecule detection unit having a probe-fixed electrode and using an FET biomolecule detection unit as a biomolecule detection unit functioning as a reference electrode.
  • an SPR biomolecule detection unit may be used as a biomolecule detection unit having a probe-fixed electrode.
  • a biomolecule detection apparatus includes a first biomolecule detection unit having an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized, and the first electrode as a second electrode.
  • the second biomolecule detection unit sharing the reference and the reference electrode.
  • FIG. 1 A configuration example of the biomolecule detection apparatus according to the second invention of the present invention is shown in FIG.
  • FIG. 9 shows a biomolecule detection device 104FQ using the FET biomolecule detection unit 86F as the first biomolecule detection unit, the QCM biomolecule detection unit 88Q as the second biomolecule detection unit, and further using the reference electrode 60. It is shown.
  • the FET biomolecule detection unit 86F includes a source S, a drain D, and a gate electrode G, and the gate electrode G is connected to the electrode 30FQ by a lead wire.
  • the electrode 30FQ includes an electrode substrate 32fq, a biomolecule probe immobilization layer 36fq located on the electrode substrate 32fq, and a biomolecule probe 38fq located on the biomolecule probe immobilization layer 36fq. Therefore, the electrode 30FQ is a probe fixing electrode.
  • the electrode 22 is composed only of a metal electrode substrate, and both the electrode substrate 32fq and the electrode 22 are gold thin films. Further, the electrode substrate 32fq and the electrode 22 are connected to the oscillation circuit 26 through a lead wire, and the oscillation circuit 26 senses vibration generated by capturing the biomolecule with the biomolecule probe 38fq. The electrode 22 is connected to the ground.
  • the QCM biomolecule detection unit 88Q is configured to include the electrode 22, the crystal resonator 24, and the electrode 30FQ in this order. That is, the FET biomolecule detection unit 86F and the QCM biomolecule detection unit 88Q share the electrode 30FQ that is a probe fixed electrode.
  • the electrode 30FQ is in contact with the biomolecule aqueous solution 70, and the reference electrode 60 is in contact with the biomolecule aqueous solution 70 separately.
  • the biomolecule probe 38fq is schematically drawn as one layer, only the biomolecule probe 38fq contacts the biomolecule aqueous solution 70 in the FET biomolecule detection 86F and the QCM biomolecule detection unit 88Q. Looks like it is.
  • the electrode 30FQ has a structure like the electrode 30a or 30b shown in FIG. 6 or FIG. Therefore, the electrode substrate 32 fq and the biomolecule probe immobilization layer 36 fq can also come into contact with the biomolecule aqueous solution 70.
  • the FET biomolecule detection unit 86F that is the first biomolecule detection unit and the QCM biomolecule detection unit 88Q that is the second biomolecule detection unit,
  • One common electrode 30FQ is shared, and the electrode 30FQ is a probe fixing electrode.
  • the FET biomolecule detection unit 86F also detects a signal sensed by the electrode in the same manner as the QCM biomolecule detection unit 88Q. Therefore, the biomolecule detection apparatus 104FQ uses the reference electrode 60 as a standard for biomolecule detection.
  • the reference electrode 60 may be a metal plate similar to the electrode substrate 32fq or a metal plate whose entire surface or part is coated with at least one of a metal salt and a metal oxide.
  • FIG. 9 shows a biomolecule detection apparatus using a QCM biomolecule detection unit and an FET biomolecule detection unit as a biomolecule detection unit having a probe-fixed electrode
  • an FET biomolecule detection unit or a QCM biomolecule detection unit instead of this, an SPR biomolecule detection unit may be used.
  • an FET biomolecule detection unit in which the electrode is formed of a metal electrode substrate is used as the reference electrode.
  • Embodiments are also conceivable.
  • the biomolecule detection apparatus shares the probe fixing electrode. Therefore, for example, in the aspect of the biomolecule detection device 104FQ of the aspect shown in FIG. 9, the FET biomolecule detection unit may pick up vibrations when the biomolecule is captured by the biomolecule probe as noise. .
  • the QCM biomolecule detection unit when used as a biomolecule detection unit having a probe-fixed electrode, the FET biomolecule detection unit does not share the probe-fixed electrode and detects a biomolecule that functions as a reference electrode. It is preferably used as a part (that is, configured as the biomolecule detection apparatus according to the first invention of the present invention). Since the FET biomolecule detection unit is located away from the probe fixed electrode, it is difficult to pick up vibration when the biomolecule is captured by the biomolecule probe as noise, and more accurate biomolecule detection can be performed. .
  • the biomolecule detection method of the present invention uses the biomolecule detection apparatus of the present invention, and simultaneously converts the first electrode and the second electrode of the biomolecule detection apparatus into an aqueous solution containing at least one kind of biomolecule.
  • the biomolecule detection method of the present invention is the biomolecule detection device of the present invention described above (the biomolecule detection device of the first invention of the present invention or the biomolecule detection device of the second invention of the present invention). Is configured to include an aqueous solution contact step for contacting an aqueous biomolecule solution and a detection step for detecting a signal at the solid-liquid interface of the electrode.
  • the biomolecule detection device of the present invention is brought into contact with an aqueous solution (biomolecule aqueous solution) containing at least one kind of biomolecule.
  • the method for contacting the aqueous biomolecule solution may be a method in which the electrodes of the first biomolecule detection unit and the second biomolecule detection unit provided in the biomolecule detection device can simultaneously contact the biomolecule aqueous solution.
  • the surface of the metal electrode may be immersed in a biomolecule aqueous solution, the biomolecule aqueous solution may be dropped on the metal electrode surface, or the biomolecule detection device may be immersed in the biomolecule aqueous solution.
  • At least the metal electrode of the first biomolecule detection unit and at least the electrode of the second biomolecule detection unit are arranged in a tube such as a flow path, and a biomolecule aqueous solution is allowed to flow in the tube, thereby It can also be contacted with an aqueous biomolecule solution. According to this method, it is possible to continuously detect a biomolecule in a desired amount of the biomolecule aqueous solution.
  • the biomolecule probe immobilized on the biomolecule probe immobilization material on the probe immobilization electrode of the biomolecule detection apparatus of the present invention captures the biomolecule in the aqueous solution and is generated by the capture of the biomolecule. It detects changes in the signal at the solid-liquid interface. Thereby, the presence of a biomolecule can be detected quantitatively.
  • the biomolecule probe is a DNA probe having a base sequence complementary to the target gene
  • an appropriate reaction condition is applied.
  • the target gene and the DNA probe form a complementary complex [Hybridization].
  • the biomolecule probe captures the biomolecule.
  • the detection step signals at the solid-liquid interface between the first electrode, the second electrode, and the aqueous solution in the biomolecule detection apparatus are detected.
  • the signal at the solid-liquid interface is a change in potential in the FET biomolecule detection unit, and in the QCM biomolecule detection unit, it is a change in resonance frequency based on the vibration of the crystal resonator. In the portion, the surface plasmon resonance angle change of light.
  • the first biomolecule detection unit and the second biomolecule detection unit share the first electrode.
  • Biomolecules in the aqueous biomolecule solution are positively charged or negatively charged.
  • the aqueous biomolecule solution is generally prepared in a buffer solution (buffer solution) having a pH of 7-8. Under such a pH environment, the phosphate chain of DNA is negatively charged.
  • the charged nucleic acid forms a complex by hybridization with the DNA probe, which is a biomolecule probe, so that the charge density changes at the solid-liquid interface between the electrode and the biomolecule aqueous solution, and the surface potential changes. To do.
  • a cleaning step of cleaning the biomolecule detection device with a cleaning liquid may be provided before the inspection step.
  • the cleaning liquid is not particularly limited as long as it is a liquid that can remove the biological component aqueous solution non-specifically attached to the biomolecule detection apparatus.
  • the cleaning liquid include water, phosphate buffer, NaCl aqueous solution, and physiological saline.
  • the biomolecule detection device of the present invention After bringing the biomolecule detection device of the present invention into contact with the biomolecule aqueous solution, the biomolecule detection device is washed with a cleaning solution to remove other biomolecules adsorbed to the probe fixed electrode other than the target and interfering components. Thus, highly accurate measurement can be performed.
  • a solution (detection solution) for detecting a potential change at the solid-liquid interface of the electrode is introduced onto the surface of the probe-fixed electrode.
  • An electric double layer is formed at the solid-liquid interface, and the potential change at the solid-liquid interface depends on the electric double layer.
  • the width (thickness) of the electric double layer is called a Debye length, which is a function of ionic strength.
  • the Debye length is small in a solution with a high salt concentration, for example, about 1 nm in a NaCl solution of 100 mmol / L (hereinafter also referred to as mmol / L).
  • the Debye length increases in the diluted solution, for example, about 10 nm in a 1 mmol / L NaCl solution.
  • the Debye length is long. After washing and removing the aqueous solution of biological components adhering to the biomolecule detection device, it is replaced with a detection solution with an optimized concentration, and the solid-liquid interface It is desirable to measure the change in potential.
  • the inorganic layer composed of at least one of metal / metal salt and metal / metal oxide is coated on the electrode substrate surface
  • detection a phosphate buffer solution having a concentration of 1 mmol / L to 10 mmol / L can be used.
  • a sodium chloride aqueous solution or a potassium chloride aqueous solution having a concentration of 1 mmol / L to 10 mmol / L can be used.
  • Such a change in potential can be measured by an FET connected to an electrode.
  • the change in the potential on the electrode surface has the same effect as the change in the gate voltage of the FET, changing the conductivity of the channel.
  • As a change in the drain current flowing between the source and the drain the formation of a complex by hybridization, that is, the presence of the target gene can be detected.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of a reaction showing an example of a single-base extension reaction of a nucleic acid in the biomolecule detection method of the present invention.
  • 10A to 10E show an electrode substrate 432, an oligonucleotide probe 437 that is a single-stranded DNA probe immobilized on the electrode substrate 432, and a target DNA 440 that is a target for detecting a gene sequence. It is shown.
  • Oligonucleotide probe 437 which is a single-stranded DNA probe immobilized on electrode substrate 432, is immersed in a biomolecule aqueous solution (nucleic acid aqueous solution) containing nucleic acid, and target DNA 440 is contained in the nucleic acid aqueous solution. It is a nucleic acid.
  • the electrode substrate 432 is a part of the above-described biomolecule detection apparatus of the present invention, and a layer (inorganic layer) composed of a metal salt or metal oxide is also formed on the surface of the electrode substrate 432.
  • the configurations other than the electrode substrate 432 and the oligonucleotide probe 437 are not shown in FIGS. 10 (A) to 10 (E).
  • the oligonucleotide probe 437 captures the target DNA 440, and a part of the target DNA 440 and the oligonucleotide probe 437 form a complex by hybridization. That is, a part of the base of the target DNA 440 and the base of the oligonucleotide probe 437 are complementarily bonded.
  • the base sequence (target base sequence) 440a that does not form a complex with the oligonucleotide probe 437 can be grasped by a single base extension reaction of DNA.
  • bases such as adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C) possessed by nucleic acids react with a specific base in a complementary manner and form a pair.
  • A adenine
  • T thymine
  • G guanine
  • C cytosine
  • Target DNA 440 TCTATATGCACGGTCCACCTC Oligonucleotide probe 437: AGATATACCGTG
  • the electrode substrate 432 side to TCTATATGGCAC form a complex, and the base of the base sequence consisting of GGTCCACCTC (target base sequence 440a) is not paired.
  • a base that forms a complex by hybridization in the target base sequence 440a.
  • dATP deoxyadenosine 5'-triphosphate
  • base G that reacts complementarily with base C DGTP (deoxyguanosine 5′-triphosphate) which can be introduced into nucleic acid
  • dTTP deoxythymidine 5′-triphosphate which can introduce base T which reacts in a complementary manner with base A into nucleic acid
  • deoxythymidine 5'-triphosphate deoxythymidine 5'-triphosphate
  • DNA has a negative charge, and a negative charge is detected each time one base pair is formed. Therefore, it is possible to determine the number of complementary reactions, that is, the number of bases that have formed a complex by hybridization, from the magnitude of the detected change in surface potential. Since base G exhibits a complementary reaction only with base C, dATP, dGTP, dTTP, etc., which are deoxynucleotides other than dCTP, are introduced into the aqueous nucleic acid solution under the situation shown in FIG. 10 (A). However, no single base extension reaction occurs. Therefore, under the situation shown in FIG. 10A, hybridization occurs only when dCTP is input, and the surface potential of the electrode changes. Therefore, the number and types of bases in the target base sequence 440a can be detected from the amount of change in surface potential and the type of deoxynucleotide that causes a change in surface potential.
  • the base adjacent to the base (base G) in the target base sequence forming a complex by hybridization is base T. Therefore, under the situation shown in FIG. 10B, the surface potential of the electrode changes only when dATP is introduced into the aqueous nucleic acid solution. From the potential change amount, the number of bases T can be grasped. As shown in FIG. 10C, only one base pair is generated by the introduction of dATP.
  • a plurality of types of deoxynucleotides may be mixed and prevent quantitative detection. Therefore, rather than putting DNA polymerase and deoxynucleotide into an aqueous nucleic acid solution in which a biomolecule detection device comprising an electrode substrate 432 and an oligonucleotide probe 437 is immersed, the electrode substrate is immersed in an aqueous solution containing DNA polymerase and deoxynucleotide. It is preferable to immerse the biomolecule detection apparatus including 432 and the oligonucleotide probe 437.
  • the aqueous solution containing other DNA polymerase and deoxynucleotide containing different types Before soaking, it is preferable to soak at least the electrode of the biomolecule detection apparatus after washing with water, a buffer solution or the like.
  • the metal electrode substrate of the metal electrode serving as the probe fixing electrode is coated with an inorganic layer composed of at least one of a metal salt and a metal oxide
  • the metal electrode having the metal oxide as a surface is described above. Since the dissociation equilibrium of the metal oxide shown in the formula (2) moves according to the hydrogen ion concentration, and the electrode potential changes accordingly, it becomes a good pH sensor. Therefore, a metal electrode having a metal oxide on its surface is an effective configuration for detecting hydrogen ions released as a result of the elongation reaction.
  • the oligonucleotide probe 437 which is a single-stranded nucleic acid, is extended by one base, A complex is sequentially formed with the target DNA 440, which is the target nucleic acid. If the surface potential of the electrode does not change regardless of which DNA polymerase is inserted, this means that the base sequence of the target DNA has been analyzed, and the analysis is completed.
  • the behavior of biomolecules in an aqueous biomolecule solution can be measured from the viewpoint of at least two types of biomolecule detection units. Furthermore, by arranging the electrodes of each biomolecule detection unit in, for example, a flow path, it is possible to detect in real time the process in which the biomolecules are adsorbed to the probe fixing electrode. In this case, the biomolecule is detected by flowing an aqueous biomolecule solution or gradually increasing the concentration of the biomolecule in the aqueous biomolecule solution with an electrode arranged in the flow path. In addition, as described above, by using two or more types of biomolecule detection units, one biomolecule detection unit has a concentration range or molecular weight range that is not suitable for biomolecule detection, and the other biomolecule detection unit has a biomolecule. Can be supplemented.
  • FIG. 11 and FIG. 12 are schematic views showing the process of forming a protein layer that is a biomolecule.
  • 11 and 12 show a probe fixing electrode having a biomolecular probe immobilization material 37 on which a biomolecular probe is immobilized on a metal electrode substrate 32.
  • Protein 72 72a to 72c
  • protein 74 74a to 74c
  • FIG. 11 and FIG. 12 both show that the protein concentration in the aqueous biomolecule solution increases in the order of (A), (B), and (C).
  • the protein adsorbed on the solid surface forms a complex as the protein concentration in the aqueous solution increases and the weight average molecular weight (Mw; hereinafter, also simply referred to as molecular weight) of the protein increases.
  • Mw weight average molecular weight
  • the molecular weight and shape differ from protein to protein.
  • Myoglobin which is a protein having a small molecular weight, has a spherical shape as shown in FIGS. 11A to 11C, whereas Fibrinogen having a large molecular weight is shown in FIG. It is like a stick.
  • FIG. 11A shows a monolayer formation process of a protein having a low molecular weight.
  • the protein forms a monolayer on the probe-fixed electrode while the protein concentration in the aqueous biomolecule solution is low. As the concentration of the protein increases, the spherical aggregates snuggle up to form a concentrated layer as shown in FIG. Furthermore, as the protein concentration increases, the protein layer tends to be laminated as shown in FIG.
  • FIGS. 11 (A) to 11 (C) and FIGS. 12 (A) to 12 (C) the region (FET-sensitive zone) that the FET biomolecule detection unit is good at is shown in FIG. 11 (B), FIG. 12 (A), and FIG. 12 (C), and the region (QCM-sensitive zone) that the QCM biomolecule detection unit is good at is shown in FIG. 11 (A) and FIG. C) and each region in FIG.
  • the region (FET-sensitive zone) that the FET biomolecule detection unit is good at is shown in FIG. 11 (B), FIG. 12 (A), and FIG. 12 (C)
  • the region (QCM-sensitive zone) that the QCM biomolecule detection unit is good at is shown in FIG. 11 (A) and FIG. C) and each region in FIG.
  • the biomolecule detection device of the present invention two or more types of biomolecule detection units are used. Such problems are unlikely to occur because they are used. It is possible to grasp the behavior of biomolecules throughout the entire area.
  • Each of the biomolecule detection units in the biomolecule detection apparatus of the present invention senses a signal change at the solid-liquid interface between the electrode and the biomolecule aqueous solution, and quantifies the amount of biomolecule adsorbed on the probe fixed electrode.
  • the amount of information that can be grasped differs depending on the type of biomolecule detection unit.
  • FIG. 13 shows a probe fixing electrode having a biomolecule probe fixing material 37 on which a biomolecular probe is fixed on a metal electrode substrate 32.
  • the biomolecule 76 is adsorbed on the probe fixing electrode.
  • a schematic diagram is shown. “The distance (SD) from the surface of the metal electrode substrate 32 of the probe fixed electrode to the biomolecule” that can be grasped by the biomolecule detection unit is referred to as “sensing depth”.
  • the sensing depth is about 10 nm, but when the biomolecule detection unit provided with the probe fixed electrode is a QCM biomolecule detection unit, sensing is performed.
  • the depth ranges from 100 nm to 300 nm.
  • the sensing depth of each biomolecule detection part also changes with the density
  • biomolecule detection apparatus and biomolecule detection method of the present invention will be described.
  • a second biomolecule detection that shares the first electrode as a second electrode with a first biomolecule detection unit having an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which the biomolecule probe is immobilized And a reference electrode.
  • the first biomolecule detection unit and the second biomolecule detection unit are each independently a field effect transistor biomolecule detection unit, a quartz crystal microbalance biomolecule detection unit, and a surface plasmon resonance biological body. Any one biomolecule detection unit selected from a molecule detection unit, wherein the second biomolecule detection unit is different from the first biomolecule detection unit according to ⁇ 1> or ⁇ 2>. This is a biomolecule detection apparatus.
  • the first biomolecule detection unit is a quartz crystal microbalance biomolecule detection unit, and the first electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized. It is a biomolecule detection apparatus as described in said ⁇ 3>.
  • the first biomolecule detection unit is a surface plasmon resonance biomolecule detection unit
  • the first electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized.
  • ⁇ 6> The biomolecule detection device according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the electrode includes gold, silver, tantalum, or a carbon material.
  • biomolecule probe according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the biomolecular probe is a nucleic acid, a polynucleotide, a synthetic oligonucleotide, an antibody, an antigen, an aptamer, a glycoprotein, or a sugar chain. It is a biomolecule detection apparatus.
  • a first biomolecule detection unit having a first electrode and a second biomolecule detection unit having a second electrode wherein the first electrode or the second electrode Is a biomolecule detection device that is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized, and the first and second electrodes of the biomolecule detection device are simultaneously provided with at least one
  • a solution contact step for contacting a solution containing a biomolecule of a species, a signal at a solid-liquid interface between the first electrode and the solution, and a signal at a solid-liquid interface between the second electrode and the solution are detected.
  • a detection step of detecting a biomolecule are detected.
  • a first biomolecule detection unit having an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized, and a second biomolecule detection sharing the first electrode as a second electrode Solution contact using a biomolecule detection device having a reference portion and a reference electrode, and simultaneously contacting the first electrode and the second electrode of the biomolecule detection device with a solution containing at least one kind of biomolecule And a detection step of detecting a signal at a solid-liquid interface between the first electrode (second electrode) and the solution.
  • the first biomolecule detection unit and the second biomolecule detection unit are each independently a field effect transistor biomolecule detection unit, a quartz crystal microbalance biomolecule detection unit, and a surface plasmon resonance biological body. Any one biomolecule detection unit selected from a molecule detection unit, wherein the second biomolecule detection unit is different from the first biomolecule detection unit in ⁇ 8> or ⁇ 9> This is a biomolecule detection method.
  • the first biomolecule detection unit is a quartz crystal microbalance biomolecule detection unit, and the first electrode is an electrode having a biomolecule probe immobilization material on which a biomolecule probe is immobilized.
  • ⁇ 12> The biomolecule detection method according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 11>, wherein the electrode includes gold, silver, tantalum, a carbon material, or a conductive substance.
  • biomolecule probe according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 12>, wherein the biomolecular probe is a nucleic acid, a polynucleotide, a synthetic oligonucleotide, an antigen, an antibody, an aptamer, a glycoprotein, or a sugar chain. This is a biomolecule detection method.
  • the aqueous solution contact step uses a single-stranded nucleic acid as the biomolecule probe, and forms a complementary complex of the biomolecule probe and the nucleic acid that is the biomolecule in the aqueous solution.
  • the biomolecule detection method according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 13>, which is a step of forming an antigen-antibody reaction.
  • each biomolecule detection unit biomolecule detection device
  • the FET biomolecule detection unit the QCM biomolecule detection unit
  • the SPR biomolecule detection unit the following were used as each biomolecule detection unit (biomolecule detection device) of the FET biomolecule detection unit, the QCM biomolecule detection unit, and the SPR biomolecule detection unit.
  • Electrode substrate a silver (Ag) plate having a thickness of 90 nm and a surface dimension of 5 mm ⁇ 5 mm was prepared.
  • a quartz or glass substrate having a thickness of 1 mm and the same surface dimensions as the electrode substrate was prepared.
  • a titanium (Ti) plate having a thickness of 10 nm and the same surface dimensions as the electrode substrate was prepared. The prepared silver plate, titanium plate, and glass substrate were laminated in this order and bonded to produce an electrode substrate laminate A for FET.
  • 1,3-diaminopropanetetraacetic acid / iron / ammonium / monohydrate [PDTA / Fe (III)] and sodium chloride (NaCl) were mixed with each using 100 mmol / L, and the chelate solution was mixed.
  • the FET electrode substrate laminate A was immersed in a chelate solution for 180 to 300 seconds to obtain an FET metal electrode substrate whose silver plate surface was coated with silver chloride.
  • the obtained metal electrode substrate for FET was connected to a gate electrode of a commercially available FET with a lead wire, and an FET biomolecule detection unit used as a reference electrode was manufactured.
  • the prescription in which a layer of a biomolecule probe-immobilized material in which a biomolecule probe is immobilized on a metal electrode substrate for FET will be described later.
  • QCM biomolecule detector As the QCM biomolecule detection unit, “NaPiCOS” manufactured by Nippon Denpa Kogyo Co., Ltd. whose metal electrode substrate is gold (Au) was used. A prescription for providing a layer of a biomolecular probe immobilization material on which a biomolecular probe is immobilized on a metal electrode substrate will be described later.
  • SPR biomolecule detector As the SPR biomolecule detection unit, “SPR-670M” manufactured by Moritex Precision Co., Ltd. whose metal electrode substrate is gold (Au) was used. A prescription for providing a layer of a biomolecular probe immobilization material on which a biomolecular probe is immobilized on a metal electrode substrate will be described later.
  • a solution containing an oligonucleotide having a thiol group at the 5 ′ end (10 ⁇ mol / L) and an arbitrary alkanethiol (10 to 100 ⁇ mol / L) in a predetermined ratio (1: 1 to 1:10) is used as a metal electrode substrate.
  • the biomolecular probe was immobilized and the SAM was formed at the same time by direct action.
  • the biomolecule used in the experiment is a protein shown in Table 1 below.
  • Table 1 shows the weight average molecular weight (Mw), size (Size), isoelectric point (pI), and charge amount (Q0) in the liquidity (pH 7.4) in the aqueous biomolecule solution of each protein.
  • Mw weight average molecular weight
  • Size size
  • pI isoelectric point
  • Q0 charge amount in the liquidity in the aqueous biomolecule solution of each protein.
  • Mw weight average molecular weight
  • Size size
  • pI isoelectric point
  • Q0 charge amount in the liquidity in the aqueous biomolecule solution of each protein.
  • the mass (end-on) is shown for reference.
  • each protein shown in Table 1 and a DPBS dilution buffer (pH 7.4, Dulbecco's phosphate buffered saline) were mixed to prepare aqueous biomolecule solutions at pH 7.4.
  • a DPBS dilution buffer pH 7.4, Dulbecco's phosphate buffered saline
  • FIG. 14 shows an FET biological body in which the probe fixed electrode 530 and the reference electrode 560 of the FET biomolecule detection unit manufactured by the method described above are arranged so as to be in contact with the aqueous biomolecule solution 570 containing each protein shown in Table 1.
  • numerator detection apparatus 500F is shown.
  • the surface potential (V out ) of the biomolecule is gradually increased by increasing the concentration of the protein (BSA in FIG. 15) from the stage of only the buffer solution not containing the protein. It was measured.
  • the difference between the surface potential (V out ) obtained from the probe-fixed electrode thus measured and the surface potential in a buffer solution not containing protein was defined as the surface potential difference ( ⁇ V out ) derived from protein adsorption.
  • FIGS. 16 to 21 are graphs relating to BSA, Fibrinogen, IgG, Myoglobin, ⁇ -casein, and Lysozyme, respectively.
  • the plot of 1.5 mM, 15 mM, and 150 mM shown in each figure shows the phosphate concentration of phosphate buffered saline.
  • “mM” means “mMmmol / L”.
  • the surface potential difference ( ⁇ V out ) measured by the FET biomolecule detection device is substantially proportional to the protein adsorption amount ( ⁇ FET ) adsorbed on the probe fixed electrode of the FET biomolecule detection unit ( ⁇ FET ⁇ V out). ), Corresponding to protein dry mass (non-hydrous weight).
  • a crystal resonator 920 is sandwiched between a probe fixing electrode 930 and a metal electrode (gold thin film) 910 of the QCM biomolecule detection unit produced by the method described above, and the probe fixing electrode 930 and the metal electrode (gold thin film) )
  • sucks to the probe fixed electrode of a QCM biomolecule detection apparatus is shown typically.
  • FIGS. 23 to 28 all show changes in the resonance frequency difference ( ⁇ f) with respect to the protein concentration (horizontal axis).
  • the resonance frequency difference ( ⁇ f) represents the difference between the resonance frequency detected by the probe fixing electrode in the buffer solution not containing protein and the resonance frequency detected by the probe fixing electrode in the buffer solution containing protein.
  • . 23 to 28 are graphs relating to BSA, Fibrinogen, IgG, Myoglobin, ⁇ -casein, and Lysozyme, respectively.
  • shaded area shown in FIGS. 23 to 28 represents a monolayer adsorption amount area estimated from the sizes of various proteins shown in Table 1.
  • the negative value of the resonance frequency difference ( ⁇ f) measured by the QCM biomolecule detection apparatus is substantially proportional to the amount of protein adsorbed on the probe fixing electrode of the QCM biomolecule detection unit ( ⁇ QCM ) ( ⁇ QCM ⁇ f), which corresponds to the wet mass of the protein.
  • the amount of protein adsorbed ( ⁇ SPR ) in the buffer solution containing the protein was measured by the SPR biomolecule detection apparatus using the probe-fixed electrode of the SPR biomolecule detection unit prepared by the method described above.
  • the amount of protein adsorption ( ⁇ SPR ) corresponds to dry mass (non-hydrous weight).
  • the horizontal axis represents the potential difference ( ⁇ Vout) obtained by the measurement using the FET biomolecule detection device.
  • the vertical axis represents the negative value ( ⁇ f) of the resonance frequency difference ( ⁇ f) obtained by the measurement by the QCM biomolecule detection apparatus, and is shown in one graph.
  • 30 to 35 show graphs relating to BSA, Fibrinogen, IgG, Myoglobin, ⁇ -casein, and Lysozyme, respectively.
  • 1.5 mM (mmol / L) and 150 mM (mmol / L) shown in the figure are phosphate concentrations of phosphate buffered saline.
  • each of the square frame indicated by F and the square frame indicated by Q shown in FIGS. 31 to 34 is the “FET-sensitive zone” and “QCM-sensitive zone” described above, respectively.
  • the slope (K1 to K3) of the regression line obtained from each plot and the coefficient of determination (R 2 ) are shown.
  • the FET biomolecule detection device used in the reference example is used as an FET biomolecule detection unit, and a biomolecule detection device using the QCM biomolecule detection device as a QCM biomolecule detection is assembled, and two types of proteins (BSA and Fibrinogen) was measured.
  • the FET biomolecule detector is used as a reference electrode.
  • the biomolecule detection apparatus used in the example has the configuration of the biomolecule detection apparatus according to the first invention of the present invention described with reference to FIG. 6, and specifically, the configuration shown in FIG. is doing.
  • FIG. 36 shows a schematic diagram of a biomolecule detection apparatus in an embodiment having an FET biomolecule detection unit and a QCM biomolecule detection unit.
  • the metal electrode of the FET biomolecule detection unit is in contact with the biomolecule aqueous solution 770 as the reference electrode 760.
  • the QCM biomolecule detection unit includes an electrode (gold thin film) 710, a crystal resonator 720, and a probe fixed electrode 730, and the electrode (gold thin film) 710 and the probe fixed electrode 730 are connected to an oscillation circuit.
  • the probe fixing electrode 730 is in contact with the biomolecule aqueous solution 770 and is connected to the ground.
  • the reference electrode 760 and the probe fixing electrode 730 are arranged in the flow path, and the protein in the biomolecule aqueous solution 770 flowing in the flow path was measured.
  • the measurement conditions are as follows.
  • Buffer DPBS dilution buffer (150 mmol / L, pH 7.4) ⁇ Temperature: 25 °C ⁇ Flow rate of aqueous biomolecule solution ⁇ ⁇ 3mL / h ⁇ Protein concentration: 1mg / mL ⁇ Reference electrode (FET): Ag / AgCl
  • the measurement result of BSA is shown in FIG. 37, and the measurement result of fibrinogen is shown in FIG.
  • a curve indicated by a solid line (-) indicates a change in the surface potential difference ( ⁇ V) detected by the FET biomolecule detection unit, and the vertical axis on the right side of the figure is referred to.
  • Curves indicated by a broken line (---) and an alternate long and short dash line (-----) indicate changes in the resonance frequency difference ( ⁇ f) detected by the QCM biomolecule detection unit, and refer to the vertical axis on the left side of the figure.
  • Measurement is performed by flowing only the buffer solution through the flow path in advance and then switching to the biomolecule aqueous solution.
  • 37 and 38 show the measurement results for 100 seconds before switching to the biomolecule aqueous solution by flowing only the buffer solution in advance and 600 seconds after the switching. That is, 0 second in FIGS. 37 and 38 is a switching time point from the buffer solution to the biomolecule aqueous solution, and both curves are bent at 0 second. Note that the time when the aqueous biomolecule solution contacts the electrode is only from 0 second to 240 seconds, and the buffer solution flows after 240 seconds.
  • the adsorption mass (QCM) and electrochemical characteristics (FET) show different changes over time in the non-specific adsorption phenomenon of proteins.
  • the adsorption mass is rapidly stabilizing, while the electrochemical properties are changing slowly.
  • the surface potential difference ( ⁇ V) curve measured by the FET biomolecule detection unit changes from decrease to increase around 300 seconds.
  • the resonance frequency difference ( ⁇ f) curve measured by the QCM biomolecule detection unit shown in FIGS. 37 and 38 also starts to decrease and increases after a certain point in time. This is due to the rinsing process in which the liquid fed into the flow path changes from the biomolecule aqueous solution to the buffer solution, and the weakly bound biomolecule is desorbed from the probe-fixed electrode and flowed away. It is thought that the difference has changed.
  • FIGS. 37 and 38 are real-time measurements for measuring changes in biomolecules over time. Based on this result, an adsorption kinetic analysis of biomolecules can be performed. Furthermore, FIG. 30 and FIG. 31 are diagrams in which the measurement results of the signal intensity associated with the concentration change of each biomolecule aqueous solution are combined. By detecting the physical properties of biomolecules in many ways, detailed studies on the mechanism of the biomolecule adsorption phenomenon can be made.
  • BSA and fibrinogen showed similar adsorption mass change patterns, but electrochemical characteristics showed different temporal patterns. These results suggest that physicochemical changes within and between proteins, such as protein structural denaturation and protein membrane layering, are induced after a rapid nonspecific adsorption process. Such considerations became possible only by simultaneously monitoring the same phenomenon that occurred at the same electrode.
  • a single aqueous solution of biomolecules can be measured simultaneously from the viewpoint of a plurality of biomolecule detection units, and the behavior of the protein. Can be examined in more detail.

Abstract

　第１の電極３０Ｆを有する第１の生体分子検出部８２Ｆと、第２の電極３０Ｑを有する第２の生体分子検出部８４Ｑとを有し、前記第１の電極３０Ｆ、または、前記第２の電極３０Ｑが、生体分子プローブ３８ｑが固定化された生体分子プローブ固定化材料３６ｑを有する電極３２ｑである生体分子検出装置１０２ＦＱである。前記生体分子検出装置１０２ＦＱが有する第１の電極３０Ｆおよび第２の電極３０Ｑを、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する水溶液７０に接触して、前記電極３０Ｆ、３０Ｑの固液界面における信号を検出する。

Description

生体分子検出装置、及び、生体分子検出方法
　本発明は、生体分子検出装置、及び、生体分子検出方法に関する。
　近年、ヒトゲノムをはじめ各種生物のゲノム塩基配列の解読が急速に進展し、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。生体中の遺伝子の機能を明らかにすることにより、各種疾病の診断、医薬品の開発、農作物の品種改良など、広範囲な分野で、遺伝子関連技術の開発が飛躍的に進むことが期待されている。このような遺伝子関連技術の開発においては、塩基配列情報ならびに遺伝子の発現および機能情報を、高精度で解析することが重要である。
　遺伝子の機能及び発現解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる技術は、既に、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイとして、市販されている。しかし、現状のＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイの多くは、蛍光物質などの標識分子を用いて、光学的に生体分子を検出する蛍光検出を基本原理としている。そのため、レーザや複雑な光学系が必要となり、システムが大型化し高価である。
　かかる問題を解決するために、酸化還元標識を用いた電流検出方式のＤＮＡチップが報告されている。例えば、分子ワイヤーと称する分子の一端を金属電極上に固定化し、前記分子の他端にＤＮＡプローブを結合して、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼ－ションに基づく酸化還元標識と、金属電極の電子の授受と、を電流変化として検出することにより、ターゲット遺伝子を検出する方式が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
　また、医療診断の分野、すなわち遺伝子診断の分野では、高い精度および定量性が求められる。かかる要求に対して、例えば、電界効果トランジスタのゲート電極に接続されたフローティング電極の表面にＤＮＡプローブを固定化し、ターゲット遺伝子とフローティング電極の表面でハイブリダイゼーションを行わせ、その際に生ずる表面電荷密度の変化を、電界効果を利用して検出する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
　さらに、生体分子検出を、電界効果トランジスタに代えて、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance;SPR）法または水晶振動子マイクロバランス（Quartz Crystal Microbalance;QCM）法によって行う方法も開示されている（例えば、特許文献２参照）。
特開２００５－０７７２１０号公報 特開２０１０－１０７４９６号公報
Nature Biotechnology,vol.16,(1998)p27,p40
　上記装置の性能向上のためには、基板と生体分子との相互作用を明らかにすることが重要である。しかしながら、生体分子検出に用いる装置は、それぞれ固有の検出原理に基づき、それぞれ異なる物性値を検出するものである。そのため、個々単独での測定においては、測定対象である生体分子水溶液に含まれる生体分子の濃度や、分子量によっては正確な生体分子検出をすることができなかった。一方で、複数装置を組み合わせて測定する場合でも、検出部を共有していないため、真に同一の現象を同時に測定していることにはならなかった。
　本発明は、上記事情に鑑みたものである。上記した状況の下、生体分子の有する物性を多面的に、精度良く同時に検出する生体分子検出装置、及び、生体分子の有する物性を多面的に精度良く同時に検出する生体分子検出方法が必要とされている。
　前記課題を達成するための具体的手段は、以下の通りである。
　第１の本発明は、第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である生体分子検出装置である。
　第２の本発明は、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極とを有する生体分子検出装置である。
　第３の本発明は、第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である生体分子検出装置を用い、前記生体分子検出装置が有する第１の電極および第２の電極を、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する溶液に接触する溶液接触工程と、前記第１の電極と前記溶液との固液界面における信号および前記第２の電極と前記溶液との固液界面における信号をそれぞれ検出する検出工程とを有する生体分子検出方法である。
　第４の本発明は、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極とを有する生体分子検出装置を用い、前記生体分子検出装置が有する第１の電極および第２の電極を、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する溶液に接触する溶液接触工程と、前記第１の電極（第２の電極）と前記溶液との固液界面における信号を検出する検出工程とを有する生体分子検出方法である。
　本発明によれば、生体分子の有する物性を多面的に、精度良く同時に検出する生体分子検出装置が提供される。また、
　本発明によれば、生体分子の有する物性を多面的に精度良く同時に検出する生体分子検出方法が提供される。
電界効果トランジスタ生体分子検出部の構成例を示す模式図である。 水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部の構成例を示す模式図である。 表面プラズモン共鳴生体分子検出部の構成例を示す模式図である。 （Ａ）は、電界効果トランジスタの構成例を示す側面模式図であり、（Ｂ）は、電界効果トランジスタの構成例を示す上面模式図である。 （Ａ）は、トランジスタの構成例を示す側面模式図であり、（Ｂ）は、電界効果トランジスタの構成例を示す上面模式図である。 生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極の構成例を示す模式図である。 生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極の他の構成例を示す模式図である。 本発明の第１の発明に係る生体分子検出装置の構成例を示す模式図である。 本発明の第２の発明に係る生体分子検出装置の構成例を示す模式図である。 本発明の生体分子検出方法における核酸の一塩基伸長反応の概略図である。 分子量が小さいタンパク質がプローブ固定電極に吸着する際の各種の層形成過程を説明するためのプローブ固定電極界面の模式図であり、（Ａ）は単層形成過程、（Ｂ）は濃縮層形成過程、（Ｃ）は積層形成過程をそれぞれ示す模式図である。 分子量が大きいタンパク質がプローブ固定電極に吸着する際の各種の層形成過程を説明するためのプローブ固定電極界面の模式図であり、（Ａ）は単層形成過程、（Ｂ）は積層形成過程、（Ｃ）は濃縮層形成過程をそれぞれ示す模式図である。 生体分子検出部が測定し得るセンシング深さを説明するためのプローブ固定電極界面の模式図である。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置の構成を示す模式図である。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）の、計測時間に対する表面電位（Ｖｏｕｔ）および計測時間に対する濃度の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）の、タンパク質濃度に対する表面電位差（ΔＶｏｕｔ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）の、タンパク質濃度に対する表面電位差（ΔＶｏｕｔ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＩｇＧ）の、タンパク質濃度に対する表面電位差（ΔＶｏｕｔ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）の、タンパク質濃度に対する表面電位差（ΔＶｏｕｔ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（β－ｃａｓｅｉｎ）の、タンパク質濃度に対する表面電位差（ΔＶｏｕｔ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）の、タンパク質濃度に対する表面電位差（ΔＶｏｕｔ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＱＣＭ生体分子検出装置の構成を示す模式図である。 比較例で用いたＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）の、タンパク質濃度に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）の、タンパク質濃度に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＩｇＧ）の、タンパク質濃度に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）の、タンパク質濃度に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（β－ｃａｓｅｉｎ）の、タンパク質濃度に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）の、タンパク質濃度に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。 比較例で用いたＳＰＲ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）のプローブ固定電極への吸着量（ΓＳＲＰ）と、ＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）のプローブ固定電極への吸着量（ΓＦＥＴ）との関係を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）の表面電位差（ΔＶｏｕｔ）と、ＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）の共振周波数差（Δｆ）との関係を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）の表面電位差（ΔＶｏｕｔ）と、ＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）の共振周波数差（Δｆ）との関係を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＩｇＧ）の表面電位差（ΔＶｏｕｔ）と、ＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＩｇＧ）の共振周波数差（Δｆ）との関係を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）の表面電位差（ΔＶｏｕｔ）と、ＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）の共振周波数差（Δｆ）との関係を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（β－ｃａｓｅｉｎ）の表面電位差（ΔＶｏｕｔ）と、ＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（β－ｃａｓｅｉｎ）の共振周波数差（Δｆ）との関係を示すグラフである。 比較例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）の表面電位差（ΔＶｏｕｔ）と、ＱＣＭ生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）の共振周波数差（Δｆ）との関係を示すグラフである。 実施例で用いた生体分子検出装置の構成を示す模式図である。 実施例で用いた生体分子検出装置で測定されたタンパク質（ＢＳＡ）の、計測時間に対する表面電位差（ΔＶ）および計測時間に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。 実施例で用いた生体分子検出装置で測定されたタンパク質（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）の、計測時間に対する表面電位差（ΔＶ）および計測時間に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を示すグラフである。
　本発明の生体分子検出装置は、第１の発明が、第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である構成であり、第２の発明が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極とを有する構成である。
　第１の発明も第２の発明も、生体分子検出装置１つにつき、１つの「生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極」を有し、かつ、少なくとも２種の異なる生体分子検出部を有することで共通する。
　本発明の生体分子検出装置を用いた生体分子検出方法の詳細については後述するが、本発明の生体分子検出装置は、第１の電極と第２の電極とを、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する水溶液に接触すると共に、各生体分子検出部において、各電極と水溶液との固液界面における信号を検出する。これにより、１つの系内で生じる生体分子の挙動が、２種の生体分子検出部の観点で、同時に捉えられる。
　以下、少なくとも１種の生体分子を含有する水溶液を、「生体分子水溶液」とも称する。
　また、生体分子検出部とは、詳細は後述するが、構成要素の１つに電極を有し、電極が生体分子水溶液と接触することで変化する電位や振動や誘電率等の信号を、検出することができる生体分子検出機器をいう。例えば、電界効果トランジスタ（Field effect transistor；ＦＥＴ）を利用した電界効果トランジスタ生体分子検出部、水晶振動子マイクロバランス（Quartz Crystal Microbalance；ＱＣＭ）法を利用した水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；ＳＰＲ）法を利用した表面プラズモン共鳴生体分子検出部等が挙げられる。
　以下、電界効果トランジスタ生体分子検出部を「ＦＥＴ生体分子検出部」、水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部を「ＱＣＭ生体分子検出部」、表面プラズモン共鳴生体分子検出部を「ＳＰＲ生体分子検出部」とも称する。
　さらに、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を「プローブ固定電極」とも称する。
　特許文献１及び２、ならびに非特許文献１には、既述のように、生体分子を捕捉可能な生体分子プローブを有するプローブ固定電極を備えた生体分子検出部を有する生体分子検出装置が開示されている。
　特許文献１及び２、ならびに非特許文献１で開示されている方法は、生体分子検出装置（生体分子検出装置ａとする）が、１つの生体分子検出部（生体分子検出部ａとする）のみを有するため、当該生体分子検出装置で検出し得る情報は、生体分子検出部ａが検出する情報のみである。また、通常、生体分子検出機器は、生体分子水溶液の濃度や生体分子の分子量等によっては測定が困難となる検出限界域を有し、目的とする濃度や、分子量での情報を得ることができないことも多い。
　このような場合、当該生体分子検出部ａでは測定することができない濃度域、分子量域等でも測定が可能な他の生体分子検出機器である生体分子検出部ｂを有する生体分子検出装置ｂを用いて、別途、当該生体分子水溶液を測定することにより、生体分子検出装置ａでは測定できなかった範囲の測定を補完することが行われる。
　しかし、例え、生体分子検出装置ａおよび生体分子検出装置ｂの測定対象が同じ生体分子水溶液であったとしても、生体分子検出部ａが有する電極上で生じた生体分子の挙動と、生体分子検出部ｂが有する電極上で生じた生体分子の挙動とが同じであるとはいえない。
　その点で、１つの生体分子水溶液を、生体分子検出装置ａと、生体分子検出装置ｂとで、別々に測定する手法は、生体分子の挙動を正確にとらえたものではなく、生体分子検出の精度が良いとはいえない。
　そこで、生体分子検出部ａを有する生体分子検出装置ａと、生体分子検出部ｂを有する生体分子検出装置ｂと、を１つの生体分子水溶液に、同時に接触させることが考えられる。
　この場合、生体分子検出部ａが有する電極と、生体分子検出部ｂが有する電極と、が接触する水溶液は同一であるものの、どちらの電極もプローブ固定電極である。そのため、各生体分子検出部は、各々の電極上で生じている生体分子の挙動をそれぞれ検出しているに過ぎない。つまり、生体分子検出装置ａが検出している生体分子の挙動は、生体分子検出部ａが有する電極上で生じている生体分子の挙動であり、生体分子検出部ｂが有する電極上で生じている生体分子の挙動ではない。このことは、生体分子検出装置ｂについても当てはまる。
　従って、１つの生体分子水溶液に、生体分子検出装置ａとは異なる生体分子検出装置ｂを取り入れても、生体分子検出部ａでは測定することができない濃度域、分子量域等での、生体分子検出部ａが有する電極上で生じた生体分子の挙動検出を補完することにはならない。
　それに対し、本発明である第１の発明および第２の発明によれば、１つの電極上で生じた生体分子の挙動を、２つの異なる生体分子検出部により、同時に測定することができ、１つの生体分子検出部では測定しにくい濃度域、分子量域、粘度域等での生体分子の検出を、他の生体分子検出部により測定することができる。また、互いに測定することができる濃度域、分子量域、粘度域等での生体分子の挙動については、少なくとも２つの観点から測定することができる。
　これは、次の理由によると考えられる。
　本発明ののうち、第１の発明は、第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極（プローブ固定電極）である生体分子検出装置である。すなわち、第１の電極と第２の電極のどちらか一方のみが、プローブ固定電極であり、他方は参照電極として働く。
　このとき、プローブ固定電極が、例えば、ＱＣＭ生体分子検出部であり、参照電極が、例えば、ＦＥＴ生体分子検出部であるとき、ＱＣＭ生体分子検出部が、プローブ固定電極上で生体分子が生体分子プローブに捕捉されることにより生じる電極の振動を検出し、ＦＥＴ生体分子検出部が、参照電極として働きつつ、プローブ固定電極上で生体分子が生体分子プローブに捕捉されることにより生じる電位変化を、生体分子水溶液を通じて測定する。
　生体分子検出装置が上記の構成であることにより、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部は、プローブ固定電極上で生じる生体分子の挙動を、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部との観点から把握することができる。また、ＱＣＭ生体分子検出部では検出できない濃度域等では、ＦＥＴ生体分子検出部が補って生体分子の挙動を検出することができる。また、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部とが共通して検出し得る領域では、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部との異なる観点で、生体分子の同じ挙動を把握することができる。
　第２の発明は、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極（プローブ固定電極）を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極とを有する生体分子検出装置である。すなわち、第１の生体分子検出部と、第２の生体分子検出部と、はプローブ固定電極である電極を共有している。つまり、このことは、プローブ固定電極を通じて第１の生体分子検出部と、第２の生体分子検出部と、が一体となっていることを意味する。
　このとき、参照電極を基準に、プローブ固定電極上で生体分子が生体分子プローブに捕捉されることにより生じる当該電極の振動をＱＣＭ生体分子検出部が検出しつつ、生体分子が生体分子プローブに捕捉されることにより生じる電位の変化をＦＥＴ生体分子検出部が検出する。
　第２の発明においても、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部は、プローブ固定電極上で生じる生体分子の挙動を、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部との観点から把握することができる。また、ＱＣＭ生体分子検出部では検出できない濃度域等では、ＦＥＴ生体分子検出部が補って生体分子の挙動を検出することができる。また、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部とが共通して検出し得る領域では、ＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部との異なる観点で、生体分子の同じ挙動を把握することができる。
　このように、電極表面へのタンパク質吸脱着機構を吸着質量（ＱＣＭ）及び電気化学特性（電荷および誘電率）（ＦＥＴ）を指標としてリアルタイムモニタリングすることができる。また、同一の電極で生じる同一の現象を同時にモニタリングするため、測定原理の異なるデータを速度論的に比較解析することが可能となる。
　したがって、本発明によれば、生体分子の有する物性を多面的に精度良く同時に検出することができる。
　以下、本発明の生体分子検出装置、および生体分子検出方法について詳細に説明する。
＜生体分子検出装置＞
　第１の発明に係る生体分子検出装置は、第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である構成である。
　第２の発明に係る生体分子検出装置は、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極とを有する構成である。
　まず、第１の発明に係る生体分子検出装置および第２の発明に係る生体分子検出装置に用い得る各生体分子検出部について、説明する。
〔生体分子検出部〕
　本発明の生体分子検出装置が備える生体分子検出部は、構成要素の１つに電極を有し、電極が生体分子水溶液と接触することで変化する電位や共鳴振動等の信号を、検出することができる生体分子検出機器をいう。
　例えば、電界効果トランジスタ（Field effect transistor；ＦＥＴ）を利用した電界効果トランジスタ生体分子検出部（ＦＥＴ生体分子検出部）、水晶振動子マイクロバランス（Quartz Crystal Microbalance；ＱＣＭ）法を利用した水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部（ＱＣＭ生体分子検出部）、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；ＳＰＲ）法を利用した表面プラズモン共鳴生体分子検出部等が挙げられる。
－電界効果トランジスタ生体分子検出部（ＦＥＴ生体分子検出部）－
　ＦＥＴ生体分子検出部は、生体分子が有する電荷によって変化する電位に基づいて生体分子を検出する生体分子検出機器である。ＦＥＴ生体分子検出部は、具体的には、生体分子が生体分子プローブに捕捉されたり、電極に吸着することにより生じる生体分子水溶液中の細かな電位変化を測定することができる。
　電界効果トランジスタを用いた生体分子の検出については、目的とする生体分子を捕捉可能な生体分子プローブが固定化された電極（プローブ固定電極）を、生体分子水溶液中に浸すことで、生体分子プローブが生体分子を捕捉し、捕捉した生体分子の電気信号を電位の変化で捕らえる。
　捕捉した生体分子の電気信号を電位の変化で捕らえる電位方式は、生体分子プローブが、電荷を有する生体分子を捕捉することにより生じる電極（固体）と溶液（液体）との固／液界面（固液界面とも称する）の電位の変化（表面電荷密度の変化）を検出するものである。
　生体分子検出においては、捕捉した生体分子の電気信号を電流の変化で捕らえる電流方式も知られている。
　電流方式では、通常、電極上での酸化還元反応を利用する手法がとられる。しかしながら、生体分子を含む溶液中に、酸化物質または還元物質（例えば、アスコルビン酸）が存在すると、酸化または還元に基づく電流が流れ、生体分子の検出が妨げられる。そのため、検出精度が劣化することがあった。また、電流計測に伴い、電極上で電極反応が進行する。電極反応は不可逆で非平衡反応である。そのため、電極の腐食、ガスの生成等が生じ、電流測定の安定性が損なわれ、特に繰返し測定する場合に検出精度が劣化することがあった。
　従って、生体分子プローブが捕捉した生体分子の電気信号は、電位の変化で捕らえることが好ましい。
　ＦＥＴ生体分子検出部は、電極を有する電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であれば、特に制限されず、公知の電界効果トランジスタを用いることができる。ＦＥＴ生体分子検出部の構成例を、図１を用いて説明する。
　図１には、離間して設けられているソースＳおよびドレインＤ上にゲート電極Ｇを有し、ゲート電極Ｇに電極３０Ｆが連結しているＦＥＴ生体分子検出部５２が示されている。
電極３０Ｆがプローブ固定電極ではないときは、電極３０Ｆは電極基板のみで構成され、電極３０Ｆがプローブ固定電極であるときは、電極３０Ｆは、電極基板と、生体分子プローブ固定化材料と、生体分子プローブとを有して構成される。
　ＦＥＴ生体分子検出部においては、電極３０Ｆが、生体分子水溶液と接触する。
　ソースＳ、ドレインＤ、およびゲート電極Ｇを有して構成されるＦＥＴの構造について、より詳細に説明する。
　ＦＥＴとしては、例えば、Ｆｌｏａｔｉｎｇゲート型、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ型などが挙げられる。これらのＦＥＴの構造の一構成例を、図４および図５を用いて説明する。
　図４には、Ｆｌｏａｔｉｎｇゲート型ＦＥＴの模式図が示してあり、図５には、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ型ＦＥＴの模式図が示してある。図４および図５とも（Ａ）が断面図、（Ｂ）が上面図である。
　図４（Ａ）には、Ｆｌｏａｔｉｎｇゲート型のＦＥＴ（以下、「Ｆ－ＦＥＴ」と称する）が示されている。図４（Ａ）において、Ｆ－ＦＥＴは、シリコン基板１２と、シリコン基板１２上に、離間して設けられているドレイン１４Ｄおよびソース１４Ｓと、シリコン基板１２、ドレイン１４Ｄおよびソース１４Ｓの上に設けられた酸化シリコン層であるゲート絶縁膜１６と、窒化シリコン層であるゲート絶縁膜１７と、フローティング電極１８とを備えている。
　トランジスタにおいては、一般に、ドレイン１４Ｄ－ソース１４Ｓ間のチャネル領域上にフローティング電極１８を形成し、フローティング電極１８によって電位を検出する。従って、Ｆ－ＦＥＴでは、図４（Ｂ）に示すように、フローティング電極１８の垂直下方の領域に、ドレイン１４Ｄおよびソース１４Ｓの間のチャネル領域が位置している。
　一方、図５（Ａ）には、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ型のＦＥＴ（以下、「Ｅ－ＦＥＴ」と称する）が示されている。図５（Ａ）において、Ｅ－ＦＥＴは、シリコン基板１２と、シリコン基板１２上に、離間して設けられているドレイン１４Ｄおよびソース１４Ｓと、シリコン基板１２、ドレイン１４Ｄおよびソース１４Ｓの上に設けられているゲート絶縁膜１６と、ゲート絶縁膜１７と、フローティング電極１８とを備えている。また、絶縁膜１６の内部に、ゲート電極１５を備えている。
　このように、ゲート電極１５を備えることで、ドレイン１４Ｄおよびソース１４Ｓの間のチャネル領域を、フローティング電極１８の垂直下方の領域に位置づける必要がなく、フローティング電極１８を、位置にとらわれず自由に形成することができる。
　Ｅ－ＦＥＴでは、図４（Ｂ）に示すように、フローティング電極１８の垂直下方の領域に、ドレイン１４Ｄ－ソース１４Ｓ間のチャネル領域が位置しておらず、フローティング電極１８の垂直下方の領域に、ゲート電極１５の一端が位置している。またゲート電極１５の他端の垂直下方の領域にドレイン１４Ｄ－ソース１４Ｓ間のチャネル領域が位置している。
　Ｆｌｏａｔｉｎｇゲート型のＦＥＴ（Ｆ－ＦＥＴ）及びＥｘｔｅｎｄｅｄ型のＦＥＴ（Ｅ－ＦＥＴ）において、ゲート絶縁膜１６は、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）などの材料が単独または組み合わせて用いられる。通常はトランジスタ動作を良好に保つため、酸化シリコン（ＳｉＯ２）の上に窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）あるいは酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）を積層した二層構造とする。
　ゲート電極１５は、ポリシリコン（Ｐｏｌｙ－Ｓｉ）が望ましく、ポリシリコンゲートを通してイオン注入によるソース１４Ｓ、ドレイン１４Ｄを形成する、いわゆるセルフアラインプロセスとの整合性がよい。
　フローティング電極１８は、電極基板との親和性の高い材料が望ましく、金、白金、銀、パラジウムなどの貴金属、あるいは、カーボン材料などの導電性物質を用いることができる。
　なお、カーボン材料としては、具体的には、例えば、グラッシーカーボン、グラファイト、グラフェン、カーボンナノチューブなどのような導電性カーボン材料が挙げられる。
　Ｅｘｔｅｎｄｅｄ型のＦＥＴにおいて、ゲート電極１５は、配線として用いるため、低抵抗でエッチングなど加工性の良い材料が好ましい。その材料としては、ポリシリコン（Ｐｏｌｙ－Ｓｉ）、アルミニウム、モリブデンなどを用いることができる。
　また、リフトオフ法などフローティング電極１８のパターン形成方法を用いることにより、ゲート電極１５とフローティング電極１８とを、例えば金のような同じ材料で形成することもできる。
－水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部（ＱＣＭ生体分子検出部）－
　ＱＣＭ生体分子検出部は、少なくとも、電極と、水晶振動子と、水晶振動子の振動を検出する発振回路とを有して構成され、水晶振動子マイクロバランス法に基づき、生体分子を検出する生体分子検出機器である。
　ここで、水晶振動子マイクロバランス法とは、薄い板状の水晶の両面に電極を取り付けた積層体を用い、各電極に交流電場を印加すると、一定の周波数（共振周波数）で振動する性質を利用して、電極に付着した物質の質量を測定する手法である。
　したがって、ＱＣＭ生体分子検出部では、水晶振動子に隣接する電極に生体分子が付着すると、生体分子の質量に応じて共振周波数が変動する性質を利用し、生体分子の質量変化を計測することで、生体分子を検出する。
　ＱＣＭ生体分子検出部の構成例を、図２を用いて説明する。
　図２には、電極２２と、水晶振動子（水晶板）２４と、電極３０Ｑとが、この順に積層されたＱＣＭ生体分子検出部５４が示されている。電極２２と電極３０Ｑには、図示しない発振回路が導線により繋がっている。
　電極２２と、電極３０Ｑとは、特に区別されず、どちらがプローブ固定電極になってもよいし、電極２２と、電極３０Ｑとの両方がプローブ固定電極になってもよい。
　電極２２および電極３０Ｑがプローブ固定電極ではないときは、電極２２および電極３０Ｑは電極基板のみで構成される。電極２２および電極３０Ｑがプローブ固定電極であるときは、電極２２および電極３０Ｑは、電極基板と、生体分子プローブ固定化材料と、生体分子プローブとを有して構成される。
　なお、電極２２も、電極３０Ｑも、プローブ固定電極であるときは、水晶振動子２４がある側とは反対の表面に、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する。
　ＱＣＭ生体分子検出部においては、電極２２および電極３０Ｆの少なくとも一方が、生体分子水溶液と接触する。
　なお、以下、本明細書においては、ＱＣＭ生体分子検出部が有する電極がプローブ固定電極となる場合は、電極３０Ｆがプローブ固定電極である場合を例に、説明する。
－表面プラズモン共鳴生体分子検出部（ＳＰＲ生体分子検出部）－
　ＳＰＲ生体分子検出部は、少なくとも、電極と、ガラス基板と、光照射装置と、反射光を受光し反射率を検出する受光装置とを有して構成され、表面プラズモン共鳴法に基づき、生体分子を検出する生体分子検出機器である。
　ここで、表面プラズモン共鳴法とは、ガラス基板を通じて電極に全反射条件で入射させた光のうち、電極中及びその外側まで染み出す近接場光が、電極上に誘起される表面プラズモンに吸収されることにより、反射光中にこれに対応した吸収ピークが出現する現象を利用し、電極に付着した物質を検出する手法である。
　電極上に生体分子が付着すると、周辺の場の誘電率が変化する。この結果、表面プラズモンを励起できる光の波数ベクトルがずれ、反射光中に現れる吸収ピークの反射角度のシフト又は一定反射角度における反射光量の変化が生じることになる。これを受光装置で測定して求めることにより、電極表面近傍に起こる生体分子の吸着及び脱着を検知することができる。これにより、生体分子プローブと、生体分子と、の検体物質間の特異的な相互作用（ハブリダイゼーション等）を高感度に検出するができる。
　ＳＰＲ生体分子検出部の構成例を、図３を用いて説明する。
　図３には、ガラス基板２８と、電極３０ＳＰとが、この順に積層されたＳＰＲ生体分子検出部５６が示されている。
　ＳＰＲ生体分子検出部５６では、図示しない光照射装置から、ガラス基板２８に入射角θで光（ｈν）が照射され、電極３０で反射すると共に、図示しない受光装置で反射光を受光することにより、電極３０に付着した生体電子を検出する。受光装置としては、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラなどを用いてもよい。
　電極３０ＳＰがプローブ固定電極ではないときは、電極３０ＳＰは電極基板のみで構成される。電極３０ＳＰがプローブ固定電極であるときは、電極３０ＳＰは、電極基板と、生体分子プローブ固定化材料と、生体分子プローブと、を有して構成される。
　次に、電極の詳細について説明する。
　まず、電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極（プローブ固定電極）である場合の電極について説明し、ついで、電極がプローブ固定電極でない場合の電極について、説明する。
〔電極〕
　生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極（プローブ固定電極）は、電極基板と、生体分子プローブ固定化材料と、生体分子プローブと、を有して構成される。より具体的には、電極基板上に、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料の層が積層されている構成である。
－電極基板－
　電極基板としては、導電性物質を含む基板であれば、特に制限されず、例えば、金属や既述のカーボン材料等を含んで構成すればよい。金属それ自体を電極基板としてもよく、このような電極基板（金属電極基板）は、金属単体でも、合金でもよい。例えば、金、銀、白金、タンタル、アルミニウム、チタン、マグネシウム、亜鉛、珪素、錫等が挙げられる。中でも、後述する生体分子プローブ固定化材料との親和性が良い金属が好ましい。生体分子プローブ固定化材料として、例えば、アルカンチオールを用いる場合には、硫黄原子との親和性が良い金属であることが好ましく、具体的には、銀、白金、または亜鉛であることが好ましく、金であることがより好ましい。
　また、電極基板の形状は、薄膜であれば特に制限されず、上面視の形状は、円形でもよいし、楕円形でもよいし、矩形でもよいし、三角形でもよいし、多角形でもよいし、不定形でもよい。
　電極基板は、表面の一部または全部が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で被覆されていてもよい。すなわち、電極基板表面に、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方を含有する無機層が、隣接して積層されていてもよい。
　生体分子検出部として、ＦＥＴ生体分子検出部を用いるとき、電極基板の表面の一部または全部が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で被覆され、当該被覆部分が生体分子水溶液と接触していることで、水溶液と電極との固液界面における電位の安定性に優れる。
　電極基板は、生体分子水溶液による腐食が生じないとの理由から、一般に、金で構成された金属電極基板が用いられるが、金は分極を起こすため、固液界面の電位が不安定になること（「電位ドリフト」とも称する）がある。電位ドリフトは金属電極が浸されている生体分子水溶液中のイオン濃度が増減することによっても生ずることがある。
　ＦＥＴ生体分子検出部では、電位方式で生体分子検出を行うために、電位ドリフトを抑制すことで、生体分子検出の精度を高くすることができる。金属電極基板の表面の一部または全部が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で被覆され、当該被覆部分が生体分子水溶液と接触可能なように露出していることで、金属の分極を起こし難く、電位ドリフトを抑制することができる。これは次の理由によるものと考えられる。
　金属塩をＭＸと表すと、金属塩は、水溶液中で、金属イオン（Ｍ＋）と塩イオン（Ｘ－）とに解離し、下記式（１）に示す式のごとく平衡状態になる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 
　また、金属酸化物も水溶液中で解離し、平衡状態になると考えられる。すなわち、金属酸化物をＭＯと表すと、金属酸化物イオンＭＯ－は、水溶液中で水酸化物（ＭＯＨ）と平衡状態となり、さらに、水溶液の液性（ｐＨ）に応じて、ＭＯＨ２ ＋となる。ＭＯ－と、ＭＯＨと、ＭＯＨ２ ＋とは、下記式（２）に示す式の如く、平衡状態になると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 
　従って、金属電極基板が金属塩で被覆されている場合は、Ｘ－イオンを含む生体分子水溶液、金属酸化物で被覆されている場合はＨ＋イオンを含む生体分子水溶液中に浸されることで、イオンが平衡状態となり、電極と生体分子水溶液との固液界面での電位が安定すると考えられる。すなわち、電位ドリフトが生じ難いと考えられる。また、電極材料となる金属塩および金属酸化物は、金と異なり、分極を生じないため、かかる観点からも、電位ドリフトが生じ難いと考えられる。
　以上より、生体分子検出部としてＦＥＴ生体分子検出部を用いる場合は、電極基板として、表面の一部または全部が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で被覆され、当該被覆部分が生体分子水溶液と接触可能なように露出している電極基板を用いることで、より精度の高い生体分子検出を行うことができると考えられる。
　金属塩としては、特に制限されず、例えば、塩化銀、塩化カルシウム、塩化バリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、硝酸カルシウム、硫酸アルミニウム、硫化銀、臭化銀、ヨウ化銀、塩化白金等が挙げられる。金属塩は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。
　以上の中でも、血清等の生体分子を含有する水溶液は、塩化物イオンを多く含むことから、金属塩は、金属塩化物であることが好ましい。また、金属塩を構成する金属は、後述する生体分子プローブ固定化材料との親和性が良いものが好ましい。生体分子プローブ固定化材料として、例えば、アルカンチオールを用いる場合には、金属塩を構成する金属が、硫黄原子との親和性が良い金属であることが好ましく、具体的には、銀、白金、または亜鉛であることが好ましく、銀であることがより好ましい。
　金属酸化物としては、特に制限されず、例えば、タンタル酸化物（Ｔａ２Ｏ５）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化マグネシウム（ＭｇＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ２）、酸化シリコン、酸化錫、酸化白金、酸化金等が挙げられる。金属酸化物は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。
　以上の中でも、金属塩を構成する金属が、後述する生体分子プローブ固定化材料との親和性が良いものが好ましい。生体分子プローブ固定化材料として、例えば、アルカンチオールを用いる場合には、金属塩を構成する金属が、硫黄原子との親和性が良い金属であることが好ましく、具体的には、タンタル（Ｔａ）、白金、金、またはチタンであることが好ましく、タンタルであることがより好ましい。
　金属塩ないし金属酸化物で構成される無機層は、後述する表面処理により、金属電極基板の塩（金属塩）または酸化物（金属酸化物）として形成したり、電極基板に、別途、金属塩ないし金属酸化物を接着する方法が挙げられる。
　電極基板上に、別途用意した金属塩ないし金属酸化物を接着する方法としては、電極基板または金属塩ないし金属酸化物に、エポキシ化合物等の接着剤を付与して、電極基板と金属塩ないし金属酸化物とを張り合わせる方法や、金属塩ないし金属酸化物を、電子ビーム等を用いて電極基板上に蒸着する方法やスパッタリングにより形成する方法が挙げられる。
　金属電極基板の表面を表面処理する方法としては、金属電極基板の表面に塩酸、硝酸、塩イオンを含むキレート剤溶液等の溶液や、酸素ガス、オゾンガス等の気体を付与する方法が挙げられる。
　電極基板の表面に、金属塩で構成される無機層を形成するためには、電極基板として金属電極基板を用い、電極基板の金属表面を、目的の金属塩とし得る溶液等で表面処理すればよい。例えば、銀板表面に塩化銀で構成された層を形成するには、銀板表面に、Ｆｅ３＋を配位子とするキレート剤（例えば、ＰＤＴＡ；1,3-Propanediamine Tetraacetic Acid）に塩化ナトリウムを溶解したキレート溶液を付与すればよい。キレート溶液中の塩化ナトリウムの濃度を調整したり、キレート溶液と銀板との接触時間を調整することにより、無機層たる塩化銀層の層厚を制御することができる。
　金属電極基板の表面に、金属酸化物で形成された無機層を形成するためには、金属電極基板の表面を酸化すればよい。例えば、金属電極基板表面に、過酸化水素等の酸化剤を含有する溶液を付与したり、酸素ガス、オゾンガス等を吹き付ける等して、金属電極基板を酸化すればよい。
　金属塩ないし金属酸化物を含んで構成される無機層の層厚は、１ｎｍ～１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ～１０ｎｍであることがより好ましい。
　電極基板上に、金属塩ないし金属酸化物で構成された無機層が存在していることは、例えば、電極基板表面を、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡；Atomic Force Microscope）、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡；Transmission Electron Microscope）等の顕微鏡を用いた写真観察等によって確認することができる。
　金属電極がプローブ固定電極ではないとき、金属電極基板が参照電極となる。
　金属電極基板としては、金属電極がプローブ固定電極である場合の金属電極基板と同様であり、金属単体または合金の金属板であってもよいし、表面の一部または全部が金属塩化物もしくは金属酸化物で被覆されている金属板であってもよい。
－生体分子プローブ、生体分子プローブ固定化材料－
　プローブ固定電極は、金属電極基板上に、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する。
　生体分子プローブとしては、核酸、ポリヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、抗体、抗原、アプタマー、糖タンパク質または糖鎖が挙げられる。これらは、断片等であってもよい。例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡの断片等は、通常、３００個以下の塩基から構成されている。オリゴヌクレオチドを用いる場合は、８０個以下の塩基長の核酸断片であることが望ましい。
　生体分子プローブは、一端が生体分子プローブ固定化材料に結合（固定化）し、生体分子を含有する水溶液中の生体分子と特異的に結合、または反応する。また、生体分子プローブを、一本鎖プローブ（例えば、一本鎖ＤＮＡ）とし、ターゲットＤＮＡと相補鎖結合させた後、そのターゲットＤＮＡの塩基と相補的に反応する一塩基伸長反応を用いて、特定の生体分子を精度良く検出することもできる。生体分子の検出方法の詳細については後述する。
　生体分子プローブ固定化材料は、電極に生体分子プローブを固定化するための材料である。電極が、生体分子が有する電荷を正確に検出するためには、生体分子を捕捉する生体分子プローブと、金属電極基板と、が結合していること（固定化されていること）が重要である。
　生体分子プローブ固定化材料としては、含硫黄化合物、シリル基含有化合物、ストレプトアビジン（以下、単に「アビジン」とも称する）等が挙げられる。
　含硫黄化合物としては、アルキル鎖を有するアルカンチオール等に代表されるチオール基含有化合物やアルカンジスルフィド類などが挙げられる。
　シリル基含有化合物としては、アルキル鎖を有するアルキルアルコキシシランなどが挙げられる。
　含硫黄化合物、シリル基含有化合物はいずれも、アルキル鎖に代えて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に代表されるポリマー鎖を有する含硫黄化合物またはシリル基含有化合物であってもよい。
　生体分子プローブ固定化材料として、チオール基含有化合物を用いる場合の、金属電極基板との結合性について説明する。
　硫黄は、金、銀、白金等の貴金属との親和性が高い。
　例えば、金属電極基板として、貴金属の金属板または金属薄膜を用いるとき、チオール基含有化合物の硫黄と、金属（例えば、金）と、が作用し、硫黄と金属とが結合する。
　また、金属電極基板の表面の全部または一部を、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で構成される無機層で被覆したときに、当該無機層上に生体分子プローブ固定化材料の層を設けるときは、次のようなメカニズムで、金属電極基板と含硫黄化合物とが結合する。
　無機層が金属塩であるとき、金属電極基板には、金属塩の塩イオン（ＡｇＣｌの場合、Ｃｌ－）が露出しており、無機層が金属酸化物であるとき、金属電極基板には、金属酸化物の酸素イオン（Ｏ－）が露出している。このような状況下、電極の金属塩ないし金属酸化物に対して、含硫黄化合物を作用させると、金属電極基板の表面に金属塩が存在する場合は、塩イオン（例えばＣｌ－）が硫黄と置換し、また、金属電極基板の表面に金属酸化物が存在する場合は、酸素イオン（Ｏ－）が硫黄と置換して、金属と硫黄とが結合する。
　次に、生体分子プローブ固定化材料としてシリル基含有化合物を用いる場合の、生体分子プローブ固定化材料（シリル基含有化合物）と金属電極基板との結合性について、説明する。
　シリル（Ｓｉ）基は、酸素イオンとの親和性が高い。金属電極基板の表面にガラスや金属酸化物などの酸化物が存在するとき、金属電極表面には、金属酸化物の酸素イオン（Ｏ－）が露出している。このような状況下、金属電極基板上の酸化物に対して、シリル基含有化合物を作用させると、酸素イオン（Ｏ－）と硫黄原子とが結合する。
　また、金属電極表面にまずチオール基含有化合物を作用させると、金属表面に硫黄が結合してチオール基含有化合物が固定化される。その後、金属電極表面を、例えばＰＤＴＡのような反応溶液と接触させると、チオール基含有化合物が形成されていない金属電極表面に塩化銀のような金属塩が形成される。チオール基含有化合物の濃度を調節することにより、金属表面に結合する硫黄原子の密度、すなわちチオール基含有化合物の密度を調節できる。これにより、電極表面において、金属塩の占める面積とチオール基含有化合物が固定化される面積の割合を制御して変えることができる。この方法において、ＰＤＴＡのような反応溶液との接触時間を調節することにより、金属塩（塩化銀）の層の厚さを制御することができる。また、チオール含有化合物の大きさ、例えばアルキル基の長さを調節することにより、チオール基含有化合物の官能基（アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基など）と金属塩表面との相対位置、距離、チオール基含有化合物の柔軟性を制御し、最適化することができる。
　アビジンは、分子の一部を、アルカンチオール等の含硫黄化合物、または、アルキルアルコキシシランなどのシリル基含有化合物で修飾することにより、電極にアビジンを固定化すればよい。
　一方、生体分子プローブ固定化材料と、生体分子プローブとの結合（固定化）は、例えば、生体分子プローブの一端および生体分子プローブ固定化材料の一端のいずれか一方をアミノ基で修飾し、他方をカルボキシ基で修飾して、両者をアミド結合等により結合することが考えられる。なお、分子内に、既に、アミノ基またはカルボキシ基を有する場合には、アミノ基またはカルボキシ基の修飾を行なわなくてもよい。また、カルボキシ基による修飾に代えて、前記一端をアルデヒド基で修飾し、アミノ基と結合させてもよい。
　生体分子プローブ固定化材料がアビジンである場合には、アビジンとの親和性の高いビオチンを用いることが考えられる。アビジンは、４つのサブユニットから構成されており、それぞれにビオチン結合部位を有するため、１分子あたり４つのビオチンと結合することができる。従って、ビオチンを生体分子プローブの一端に修飾することで、アビジン－ビオチン結合を利用して、生体分子プローブ固定化材料と生体分子プローブとを結合（固定化）することができる。
　生体分子プローブ固定化材料は、上記の中でも、含硫黄化合物が好ましく、チオール基含有化合物がより好ましい。
　含硫黄化合物は、自己組織化膜（ＳＡＭ；Self-Assembled Membrane）として機能する。自己組織化膜（ＳＡＭ）とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった薄膜のことをいう。この自己組織化により、非平衡の状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。アルカンチオールやアルカンジスルフィド類などの含硫黄化合物は、金、銀等の貴金属、貴金属で構成される金属塩、または貴金属で構成される酸化物等、貴金属を含む基板上に、自発的に吸着し単分子サイズの薄膜を与える。従って、電極に高密度で生体分子プローブを固定化することができ、生体分子の検出の精度をより高くすることができる。
　生体分子プローブ固定化材料を用いて構成される層（生体分子プローブ固定化層）を、電極に形成する場合は、生体分子プローブ固定化材料が溶解している生体分子プローブ固定化材料溶液を、電極基板に直接、または、金属塩ないし金属酸化物で構成される層上に付与し、乾燥すればよい。
　生体分子プローブは、生体分子プローブ固定化層を形成した後に、生体分子プローブ固定化材料に結合すればよい。また、生体分子プローブと生体分子プローブ固定化材料とを予め結合してから、生体分子プローブが結合した生体分子プローブ固定化材料を溶媒に溶かし、溶液として、金属電極基板、または、金属塩ないし金属酸化物で構成される層の上に付与してもよい。
　金属電極基板、または、金属塩ないし金属酸化物で構成される無機層の上への溶液の付与方法としては、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布等の塗布により溶液を付与する方法、さらには、滴下法、スプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等により付与する方法が挙げられる。
　生体分子プローブ固定化材料、または、生体分子プローブが結合した生体分子プローブ固定化材料を溶解した溶液は、金属電極基板上、または、金属塩ないし金属酸化物で構成される無機層上に、ランダム状に付与してもよいし、アレイ状に配列させて付与してもよいし、ドメイン状に一塊に付与してもよい。また、パターン状に付与してもよい。
　生体分子プローブ固定化材料、または、生体分子プローブが結合した生体分子プローブ固定化材料を溶解する溶媒としては、水、アルコール、または、これらの混合溶媒が用いられる。生体分子プローブ固定化材料のみを溶解する場合は、非水溶性有機溶媒を用いてもよいが、生体分子プローブが結合した生体分子プローブ固定化材料を溶解する場合は、生体分子を扱う観点から、水、アルコール等の水溶性溶媒、または、これらの混合溶媒が用いられる。中でも、水、エタノール、または、これらの混合溶媒が好ましい。
　電極基板上に、生体分子プローブ固定化材料が固定化されていることは、例えば、金属電極基板表面について、ＸＰＳ（X-ray Photoelectron Spectroscopy)、ＥＳＣＡ(Electron Spectroscopy for Chemical Analysis）等のＸ線光電子分光分析を行うことで確認することができる。例えば、生体分子プローブ固定化材料としてアルカンチオールを用いた場合、アルカンチオールが金属電極基板上に固定化されているときは、硫黄原子に由来するピークが検出される。
　また、生体分子プローブが、生体分子プローブ固定化材料に固定化されていることは、例えば、螢光分子で生体分子を標識し、螢光検出を行なうことで確認することができる。
　電極基板が金属薄膜であるプローブ固定電極の構成例を、図６を用いて説明する。
　図６には、金属電極基板３２ａと、金属電極基板３２ａの表面に生体分子プローブ固定化材料を用いて構成される生体分子プローブ固定化層３６ａと、生体分子プローブ固定化層３６ａに固定化された生体分子プローブ３８ａとを有する金属電極（プローブ固定電極）３０ａが示されている。
　電極基板３２ａは、表面の全部が、生体分子プローブ３８ａが固定化された生体分子プローブ固定化層３６ａで被覆されていてもよいし、図６に示すように、表面の一部が、生体分子プローブ３８ａが固定化された生体分子プローブ固定化層３６ａで被覆されていてもよい。
　次に、金属電極基板表面の全部または一部が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で構成される無機層で被覆されている場合のプローブ固定電極の構成例を、図７を用いて説明する。
　図７には、金属電極基板３２ｂと、金属電極基板３２ｂ上に位置し、金属塩及び金属酸化物の少なくとも一方で構成された無機層３４ｂと、同様に、金属電極基板３２ｂ上に位置し、生体分子プローブ固定化材料を用いて構成される生体分子プローブ固定化層３６ｂおよび生体分子プローブ固定化層３６ｂに固定化された生体分子プローブ３８ｂとを有する金属電極（プローブ固定電極）３０ｂが示されている。
　図７に示す金属電極基板３２ｂは銀薄膜であり、表面処理により、一旦、金属電極基板３２ｂの表面の全てが、塩化銀（ＡｇＣｌ）で構成される無機層３４ｂで被覆されている。その後に、無機層３４ｂ表面の一部に、アルカンチオールで構成される生体分子プローブ固定化材料を作用することにより、アルカンチオールの硫黄（Ｓ）が塩化銀の塩化物イオン（Ｃｌ）と置換して、アルカンチオールの硫黄（Ｓ）が金属電極基板の金属（Ａｇ）と結合し、金属電極基板３２ｂ上に生体分子プローブ固定化層３６ｂが形成されている。
　生体分子プローブ３８ｂは、生体分子プローブ固定化材料を無機層に作用させる前に、予め生体分子プローブ固定化材料と作用させ、結合しておけばよい。
　既述のように、生体分子検出部としてＦＥＴ生体分子検出部を用いる場合は、電位安定性のため、生体分子水溶液と接触可能なように、無機層部３４ｂを、金属電極基板３２ｂ表面の一部に残しておくことが好ましい。
　次に、既述の生体分子検出部を用いた生体分子検出装置の構成について説明する。
〔第１の発明に係る生体分子検出装置〕
　第１の発明に係る生体分子検出装置は、第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である構成である。
　本発明の第１の発明に係る生体分子検出装置の構成例を、図８に示す。
　図８は、第１の生体分子検出部としてＦＥＴ生体分子検出部８２Ｆを用い、第２の生体分子検出部としてＱＣＭ生体分子検出部８４Ｑを用いた生体分子検出装置１０２ＦＱが示されている。
　ＦＥＴ生体分子検出部８２Ｆは、ソースＳ、ドレインＤ及びゲート電極Ｇを有し、ゲート電極Ｇが電極３０Ｆとリード線でつながれている。電極３０Ｆは、銀板に塩化銀が被覆した金属電極基板のみで構成されている。また、電極３０Ｆは、生体分子水溶液７０と接触しており、生体分子水溶液７０中での電位の変化を読み取ることができる状態になっている。
　一方、ＱＣＭ生体分子検出部８４Ｑは、電極２２と、水晶振動子２４と、電極３０Ｑとをこの順に有する構成となっている。
　電極３０Ｑは、金属電極基板３２ｑと、金属電極基板３２ｑ上に位置する生体分子プローブ固定化層３６ｑと、生体分子プローブ固定化層３６ｑ上に位置する生体分子プローブ３８ｑとを有する。
　図８では、生体分子プローブ３８ｑを模式的に、１つの層として描いているため、ＱＣＭ生体分子検出部８４Ｑにおいて、生体分子水溶液７０に接触するのが生体分子プローブ３８ｑのみであるかのように見える。しかし、実際には、電極３０Ｑは、図６や図７に示す金属電極３０ａまたは３０ｂのごとき構造である。そのため、金属電極基板３２ｑや、生体分子プローブ固定化層３６ｑも生体分子水溶液７０と接触し得る。
　電極２２は金属電極基板のみで構成されており、電極基板３２ｑと電極２２は、共に金薄膜である。また、電極基板３２ｑと電極２２は発振回路２６とリード線を通じて繋がっており、発振回路２６は、生体分子プローブ３８ｑで生体分子が捕捉されることにより生じる振動を感知する。なお、電極基板３２ｑは、アースに連結している。
　このように、図８に示す生体分子検出装置１０２ＦＱでは、第１の生体分子検出部であるＦＥＴ生体分子検出部８２Ｆが参照電極として機能し、第２の生体分子検出部であるＱＣＭ生体分子検出部８４Ｑが備える金属電極３０Ｑがプローブ固定電極となっている。
　従って、電極３０Ｑ上の生体分子プローブ３８ｑによって、生体分子水溶液７０中の生体分子が捕捉されると、ＱＣＭ生体分子検出部８４Ｑが、水晶振動子の振動を通じて生体分子の質量を検出する。同時に、ＦＥＴ生体分子検出部は、生体分子水溶液７０を通じて、生体分子プローブ３８ｑに生体分子が捕捉されたことで生じる電位の変化を感知し、生体分子を検出する。
　図８では、プローブ固定電極を有する生体分子検出部としてＱＣＭ生体分子検出部を用い、参照電極として機能する生体分子検出部としてＦＥＴ生体分子検出部を用いた生体分子検出装置を示したが、例えば、ＱＣＭ生体分子検出部に代えて、ＳＰＲ生体分子検出部を、プローブ固定電極を有する生体分子検出部として用いてもよい。
　次に、本発明の第２の発明に係る生体分子検出装置について、説明する。
〔第２の発明に係る生体分子検出装置〕
　第２の発明に係る生体分子検出装置は、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極と、を有する構成である。
　本発明の第２の発明に係る生体分子検出装置の構成例を、図９に示す。
　図９は、第１の生体分子検出部としてＦＥＴ生体分子検出部８６Ｆを用い、第２の生体分子検出部としてＱＣＭ生体分子検出部８８Ｑを用い、更に参照電極６０を用いた生体分子検出装置１０４ＦＱが示されている。
　ＦＥＴ生体分子検出部８６Ｆは、ソースＳ、ドレインＤ及びゲート電極Ｇを有し、ゲート電極Ｇが電極３０ＦＱとリード線でつながれている。
　電極３０ＦＱは、電極基板３２ｆｑと、電極基板３２ｆｑ上に位置する生体分子プローブ固定化層３６ｆｑと、生体分子プローブ固定化層３６ｆｑ上に位置する生体分子プローブ３８ｆｑとを有する。従って、電極３０ＦＱはプローブ固定電極である。
　なお、図９においては、電極２２は金属電極基板のみで構成されており、電極基板３２ｆｑと電極２２は、共に金薄膜である。また、電極基板３２ｆｑと電極２２は発振回路２６とリード線を通じて繋がっており、発振回路２６は、生体分子プローブ３８ｆｑで生体分子が捕捉されることにより生じる振動を感知する。なお、電極２２は、アースに連結している。
　ＱＣＭ生体分子検出部８８Ｑは、電極２２と、水晶振動子２４と、電極３０ＦＱとをこの順に有する構成となっている。
　つまり、ＦＥＴ生体分子検出部８６Ｆと、ＱＣＭ生体分子検出部８８Ｑとは、プローブ固定電極である電極３０ＦＱを共有している。
　電極３０ＦＱは、生体分子水溶液７０に接触し、別途、参照電極６０が生体分子水溶液７０に接触している。
　図９では、生体分子プローブ３８ｆｑを模式的に、１つの層として描いているため、ＦＥＴ生体分子検出８６ＦおよびＱＣＭ生体分子検出部８８Ｑにおいて、生体分子水溶液７０に接触するのは生体分子プローブ３８ｆｑのみであるかのように見える。しかし、実際には、電極３０ＦＱは、図６や図７に示す電極３０ａまたは３０ｂのごとき構造である。そのため、電極基板３２ｆｑや、生体分子プローブ固定化層３６ｆｑも生体分子水溶液７０と接触し得る。
　このように、図９に示す生体分子検出装置１０４ＦＱでは、第１の生体分子検出部であるＦＥＴ生体分子検出部８６Ｆと、第２の生体分子検出部であるＱＣＭ生体分子検出部８８Ｑとが、１つの共通する電極３０ＦＱを共有し、電極３０ＦＱがプローブ固定電極となっている。生体分子検出装置１０４ＦＱでは、ＦＥＴ生体分子検出部８６Ｆも、ＱＣＭ生体分子検出部８８Ｑと同様に電極が感知する信号を検出する。そのため、生体分子検出装置１０４ＦＱには、参照電極６０を用いて、生体分子検出の基準としている。
　なお、参照電極６０には、電極基板３２ｆｑと同様の金属板または、表面の全部もしくは一部が金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で被覆された金属板を用いることができる。
　図９では、プローブ固定電極を有する生体分子検出部としてＱＣＭ生体分子検出部とＦＥＴ生体分子検出部を用いた生体分子検出装置を示したが、例えば、ＦＥＴ生体分子検出部またはＱＣＭ生体分子検出部に代えて、ＳＰＲ生体分子検出部を用いてもよい。また、プローブ固定電極を共有する生体分子検出部としてＱＣＭ生体分子検出部およびＳＰＲ生体分子検出部を用いる場合には、参照電極として、電極が金属電極基板で構成されたＦＥＴ生体分子検出部を用いる態様も考えられる。
　なお、第２の発明に係る生体分子検出装置は、プローブ固定電極を共有している。そのために、例えば、図９に示す態様の生体分子検出装置１０４ＦＱの態様においては、ＦＥＴ生体分子検出部が、生体分子プローブに生体分子が捕捉されるときの振動をノイズとして拾ってしまうことがある。かかる観点から言えば、プローブ固定電極を有する生体分子検出部としてＱＣＭ生体分子検出部を用いるときは、ＦＥＴ生体分子検出部は、プローブ固定電極を共有せずに、参照電極として機能する生体分子検出部として用いること（すなわち、本発明の第１の発明に係る生体分子検出装置の構成とすること）が好ましい。ＦＥＴ生体分子検出部がプローブ固定電極から離れて位置していることで、生体分子プローブに生体分子が捕捉されたときの振動をノイズとして拾い難く、より精度の高い生体分子検出を行うことができる。
＜生体分子検出方法＞
　本発明の生体分子検出方法は、本発明の生体分子検出装置を用い、前記生体分子検出装置が有する第１の電極および第２の電極を、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する水溶液に接触する水溶液接触工程と、前記第１の電極と前記水溶液との固液界面における信号および前記第２の電極と前記水溶液との固液界面における信号をそれぞれ検出する検出工程とを有して構成される。
　すなわち、本発明の生体分子検出方法は、既述の本発明の生体分子検出装置（本発明の第１の発明に係る生体分子検出装置または本発明の第２の発明に係る生体分子検出装置）を、生体分子水溶液に接触する水溶液接触工程と、前記電極の固液界面における信号を検出する検出工程とを有して構成される。
〔水溶液接触工程〕
　水溶液接触工程では、本発明の生体分子検出装置を、少なくとも１種の生体分子を含有する水溶液（生体分子水溶液）に接触する。
　生体分子水溶液の接触方法としては、生体分子検出装置に備えられた第１の生体分子検出部および第２の生体分子検出部がそれぞれ有する電極が、同時に、生体分子水溶液に接触し得る方法であれば特に制限されない。例えば、金属電極表面を生体分子水溶液に浸したり、金属電極表面に生体分子水溶液を滴下したり、生体分子水溶液中に生体分子検出装置を浸漬すればよい。
　また、第１の生体分子検出部の少なくとも金属電極と、第２の生体分子検出部の少なくとも電極と、を流路等の管内に配置し、生体分子水溶液を管内に流すことで、各電極と生体分子水溶液とを接触することもできる。かかる方法によれば、所望の量の生体分子水溶液について、継続的に生体分子の検出を行うことができる。
　かかる工程により、本発明の生体分子検出装置が有するプローブ固定電極上の生体分子プローブ固定化材料に固定化された生体分子プローブが、水溶液中の生体分子を捕捉すると共に、生体分子の捕捉により生じた固液界面の信号の変化を検出する。これにより、生体分子の存在を定量的に検出することができる。
　生体分子水溶液中に、例えば、測定すべきターゲット遺伝子を含む多数の遺伝子が存在し、生体分子プローブが、ターゲット遺伝子と相補的塩基配列を有するＤＮＡプローブである場合には、適切な反応条件の下で、ターゲット遺伝子とＤＮＡプローブとが、相補的な複合体を形成する〔ハイブリダイゼーション（Hybridization）〕。かかる複合体を形成することで、生体分子プローブが、生体分子を捕捉する。
〔検出工程〕
　検出工程では、生体分子検出装置における、第１の電極および第２の電極と、水溶液と、の固液界面における信号をそれぞれ検出する。
　ここで、固液界面における信号とは、ＦＥＴ生体分子検出部においては、電位の変化であり、ＱＣＭ生体分子検出部においては、水晶振動子の振動に基づく共振周波数変化であり、ＳＰＲ生体分子検出部においては、光の表面プラズモン共鳴角変化である。
　なお、第２の発明の生体分子検出装置を用いる場合には、第１の生体分子検出部と第２の生体分子検出部とで、第１の電極を共有するため、「第１の電極と前記水溶液との固液界面における信号および第２の電極と前記水溶液との固液界面における信号をそれぞれ検出する」とは、第１の電極と水溶液との固液界面における信号を、第１の生体分子検出部と第２の生体分子検出部とで、それぞれ検出することを意味する。
　ＦＥＴ生体分子検出部を例に、詳細に説明する。
　生体分子水溶液中の生体分子は、正の電荷または負の電荷を帯びている。例えば、生体分子として核酸を検出するとき、生体分子水溶液は、一般に、ｐＨ７～８の緩衝溶液（バッファ溶液）に調製する。かかるｐＨ環境下では、ＤＮＡのリン酸エステル鎖は負の電荷を帯びている。このように電荷を帯びた核酸が、生体分子プローブであるＤＮＡプローブとハイブリダイズによる複合体を形成することにより、電極と生体分子水溶液との固液界面で電荷密度が変化し、表面電位が変化する。
〔洗浄工程〕
　本発明の生体分子検出方法では、検査工程の前に、生体分子検出装置を洗浄液により洗浄する洗浄工程を設けてもよい。洗浄液は、生体分子検出装置に非特異的に付着した生体成分水溶液を除去し得る液体であれば、特に制限されない。洗浄液としては、例えば、水、リン酸緩衝液、ＮａＣｌ水溶液、生理食塩水等が挙げられる。
　本発明の生体分子検出装置と生体分子水溶液を接触させた後、洗浄液により生体分子検出装置を洗浄し、ターゲット以外の非特異的にプローブ固定電極に吸着した他の生体分子や妨害成分を除去することにより、高精度の測定を行うことができる。生体分子検出装置の洗浄後、電極の固液界面の電位変化を検出するための溶液（検出溶液）をプローブ固定電極表面に導入する。固液界面には電気二重層が形成されていて、固液界面の電位変化は電気二重層に依存する。電気二重層の幅（厚さ）をデバイ（Ｄｅｂｙｅ）長といい、イオン強度の関数である。
　塩濃度の高い溶液中ではデバイ長が小さく、例えば１００ｍｍｏｌ／Ｌ（以下、ｍｍｏｌ／Ｌとも表す）のＮａＣｌ溶液中では約１ｎｍである。一方、希釈溶液中ではデバイ長が大きくなり、例えば、１ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液中では約１０ｎｍとなる。高感度測定を行うためには、デバイ長は長い方が好ましく、生体分子検出装置に付着した生体成分水溶液を洗浄して取り除いた後、最適化された濃度の検出溶液に置き換えて、固液界面の電位変化を測定することが望ましい。
　電極基板表面に金属／金属塩および金属／金属酸化物の少なくとも一方で構成される無機層が被覆されているプローブ固定電極においては、例えば、無機層が金属酸化物層である場合には、検出溶液として、１ｍｍｏｌ／Ｌから１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度のリン酸緩衝液を用いることができる。また、無機層が塩化銀層である場合には、１ｍｍｏｌ／Ｌから１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム水溶液あるいは塩化カリウム水溶液を用いることができる。
　かかる電位の変化は、電極と連結したＦＥＴによって測定することができる。電極表面の電位の変化が、ＦＥＴのゲート電圧変化と同等の作用となり、チャネルの導電率を変化させる。ソース－ドレイン間を流れるドレイン電流変化として、ハイブリダイゼーションによる複合体の形成、すなわち、ターゲット遺伝子の存在を検出することができる。
　さらに、生体分子検出方法の他の態様について説明する。
　本発明の生体分子検出方法では、ＤＮＡの一塩基伸長反応を利用することにより、特定の遺伝子配列のＤＮＡを、精度良く検出することができる。
　図１０に、本発明の生体分子検出方法における核酸の一塩基伸長反応の一例を示す反応の概略図を示す。
　図１０（Ａ）～（Ｅ）には、電極基板４３２と、電極基板４３２に固定化された一本鎖のＤＮＡプローブであるオリゴヌクレオチドプローブ４３７と、遺伝子配列を検出したいターゲットとなるターゲットＤＮＡ４４０が示されている。電極基板４３２に固定化された一本鎖のＤＮＡプローブであるオリゴヌクレオチドプローブ４３７は、核酸を含有する生体分子水溶液（核酸水溶液）中に浸されており、ターゲットＤＮＡ４４０は、当該核酸水溶液に含まれる核酸である。
　電極基板４３２は、既述の本発明の生体分子検出装置の一部であり、電極基板４３２の表面には、金属塩ないし金属酸化物で構成される層（無機層）も形成されているが、電極基板４３２およびオリゴヌクレオチドプローブ４３７以外の構成は、図１０（Ａ）～（Ｅ）には、図示していない。
　図１０（Ａ）において、オリゴヌクレオチドプローブ４３７は、ターゲットＤＮＡ４４０を捕捉し、ターゲットＤＮＡ４４０の一部と、オリゴヌクレオチドプローブ４３７とが、ハイブリダイゼーションにより複合体を形成している。すなわち、ターゲットＤＮＡ４４０の一部の塩基と、オリゴヌクレオチドプローブ４３７の塩基とが、相補的に結合している。
　ターゲットＤＮＡ４４０が有する塩基配列のうち、オリゴヌクレオチドプローブ４３７と複合体を形成していない塩基配列（ターゲット塩基配列）４４０ａを、ＤＮＡの一塩基伸長反応により把握することができる。
　核酸が有するアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）等の塩基は、特定の塩基と相補的に反応し、対をなす性質があることが知られている。かかる性質を利用し、解析すべきターゲット塩基配列４４０ａに含まれる塩基を、端から１つずつ検出することで、ターゲット塩基配列４４０ａの詳細を把握することができる。
　図１０（Ａ）では、ターゲットＤＮＡ４４０およびオリゴヌクレオチドプローブ４３７の各塩基は、電極基板４３２側から順に、下記配列で並んでいる。
　　　　　ターゲットＤＮＡ４４０：ＴＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣ
オリゴヌクレオチドプローブ４３７：ＡＧＡＴＡＴＡＣＧＴＧ
　ターゲットＤＮＡ４４０の塩基配列のうち、電極基板４３２側から、ＴＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣまでが複合体を形成し、ＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣからなる塩基配列（ターゲット塩基配列４４０ａ）の塩基は対をなしていない。
　かかる状況下において、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸；deoxycytidine 5'-triphosphate）を核酸水溶液に投入すると、ターゲット塩基配列４４０ａのうち、ハイブリダイゼーションにより複合体を形成している塩基（塩基Ｃ）に隣接する塩基Ｇと相補的に反応する塩基Ｃを、オリゴヌクレオチドプローブ４３７の末端に導入することができる。
　デオキシヌクレオチドとしては、塩基Ｔと相補的に反応する塩基Ａを核酸に導入可能なｄＡＴＰ（デオキシアデノシン5'-三リン酸；deoxyadenosine 5'-triphosphate）、塩基Ｃと相補的に反応する塩基Ｇを核酸に導入可能なｄＧＴＰ（デオキシグアノシン5'-三リン酸；deoxyguanosine 5'-triphosphate ）、塩基Ａと相補的に反応する塩基Ｔを核酸に導入可能なｄＴＴＰ（デオキシチミジン5'-三リン酸；deoxythymidine 5'-triphosphate）等がある。
　図１０（Ａ）に示す状況下において、ターゲットＤＮＡ４４０の塩基配列のうち、ハイブリダイゼーションにより複合体を形成している塩基（塩基Ｃ）に近い塩基Ｇは、２つある。従って、核酸水溶液にｄＣＴＰを投入することにより、図１０（Ｂ）に示すように、オリゴヌクレオチドプローブ４３７の末端に塩基Ｃが２つ導入される。オリゴヌクレオチドプローブ４３７の末端に導入された塩基Ｃは、ターゲット塩基配列４４０ａの末端の塩基Ｇと相補的に反応し、結合して複合体となる。
　また、既述のように、ＤＮＡは負の電荷を有しており、塩基対を１つ形成するごとに、負電荷が検出される。従って、検出される表面電位の変化量の大きさから、相補的反応を起こした数、すなわち、ハイブリダイゼーションにより複合体を形成した塩基の数を把握することができる。
　なお、塩基Ｇは、塩基Ｃとのみ相補的な反応を示すため、図１０（Ａ）に示す状況下において、ｄＣＴＰ以外のデオキシヌクレオチドであるｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ等を核酸水溶液中に投入しても、一塩基伸長反応は起こらない。
　従って、図１０（Ａ）に示す状況下においては、ｄＣＴＰを投入した場合にのみハイブリダイゼーションが生じ、電極の表面電位が変化する。そのため、表面電位の変化量と、表面電位の変化をもたらすデオキシヌクレオチドの種類と、からターゲット塩基配列４４０ａの塩基の数および種類を検出することができる。
　図１０（Ｂ）において、ハイブリダイゼーションによる複合体を形成しているターゲット塩基配列における塩基（塩基Ｇ）に隣接している塩基は塩基Ｔである。従って、図１０（Ｂ）に示す状況下においては、核酸水溶液に、ｄＡＴＰを投入した場合にのみ、電極の表面電位が変化する。その電位変化量から、塩基Ｔの数を把握することができる。図１０（Ｃ）に示すように、ｄＡＴＰの投入により生じた塩基対は、１つのみである。
　なお、図１０（Ａ）に示す状況下から、各種デオキシヌクレオチドを順次、核酸水溶液に投入すると、複数種のデオキシヌクレオチドが混合され、定量的検出を妨げる恐れがある。従って、電極基板４３２およびオリゴヌクレオチドプローブ４３７を備える生体分子検出装置が浸っている核酸水溶液に、ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチドを投入することよりも、ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチドを含有する水溶液中に、電極基板４３２およびオリゴヌクレオチドプローブ４３７を備える生体分子検出装置を浸すことが好ましい。また、ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチド含有水溶液に浸した生体分子検出装置を、種類の異なる他のＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチド含有水溶液に浸し直す場合は、当該種類の異なる他のＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチド含有水溶液に浸し直す前に、生体分子検出装置の、少なくとも電極を、水、緩衝溶液等で洗浄してから浸すことが好ましい。
　ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオチドを金属電極表面に導入して伸長反応を行わせる際、導入するデオキシヌクレオチドがターゲットＤＮＡの塩基と相補的な場合、ターゲットＤＮＡ上で塩基が合成され、塩基長が伸長して負電荷が増加すると同時に、ピロリン酸が生成され、水素イオンが放出される。伸長する塩基の数の分だけ水素イオンが放出される。したがって、伸長反応の場となる金属電極表面近傍の水素イオン濃度、すなわちｐＨが変化する。プローブ固定電極となる金属電極が有する金属電極基板が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で構成される無機層で被覆されている場合、金属酸化物を表面とする金属電極は、既述の式（２）に示した金属酸化物の解離平衡が水素イオン濃度に応じて移動し、それに応じて電極電位が変化するため良いｐＨセンサとなる。したがって、伸長反応の結果放出される水素イオンを検出する上で金属酸化物を表面に有する金属電極は効果的な構成である。
　以上の要領で、図１０（Ｄ）及び図１０（Ｅ）に示すように、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを順次反応させることにより、一本鎖の核酸であるオリゴヌクレオチドプローブ４３７は、一塩基ずつ伸長し、ターゲットの核酸であるターゲットＤＮＡ４４０と、順次複合体を形成する。そして、どのＤＮＡポリメラーゼを投入しても、電極の表面電位が変化しないときは、ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析し終わったことを意味し、解析が終了する。
　以上示したように、本発明の生体分子検出装置を用いれば、生体分子水溶液中の生体分子の挙動を、少なくとも２種の生体分子検出部の観点から測定することができる。さらに、各生体分子検出部が有する電極を、例えば、流路内に配置することで、生体分子がプローブ固定電極に吸着していく過程をリアルタイムで検出することも可能となる。この場合、生体分子は、流路内に配置された電極によって、生体分子水溶液を流しながら、あるいは生体分子水溶液中の生体分子濃度を徐々に濃くしながら検出される。
　また、既述のように、２種以上の生体分子検出部を用いることで、一方の生体分子検出部では生体分子検出に適さない濃度域や分子量域を、他方の生体分子検出部が生体分子の検出を補完することができる。
　生体分子の１種であるタンパク質は、プローブ固定電極に吸着するとき、濃度や分子量の大きさに応じて、種々の層を形成することが知られている。
　図１１と図１２に、生体分子であるタンパク質の層形成の過程を表した模式図を示す。
　図１１及び図１２には、金属電極基板３２上に、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料３７を有するプローブ固定電極が示されており、プローブ固定電極上に、図１１では、タンパク質７２（７２ａ～７２ｃ）が吸着し、図１２では、タンパク質７４（７４ａ～７４ｃ）が吸着している。
　図１１および図１２は、共に、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の順に、生体分子水溶液中のタンパク質の濃度が濃くなることを示す。
　固体表面に吸着したタンパク質は、水溶液中のタンパク質濃度が高まり、またタンパク質の重量平均分子量（Ｍｗ；以下、単に分子量ともいう）が大きくなるにつれて、複合体を形成する。分子量と形状はタンパク質ごとに異なり、例えば、分子量が小さいタンパク質であるMyoglobinは、図１１（Ａ）～（Ｃ）に示されるような球状であるが、分子量が大きいFibrinogenは、図１２に示されるような棒状である。
　まず、図１１（Ａ）は、分子量の小さいタンパク質の単層形成過程を示し、生体分子水溶液中のタンパク質濃度が低いうちは、タンパク質がプローブ固定電極上に単層を形成している。タンパク質の濃度が大きくなるにつれ、球状の集合体が寄り添い、図１１（Ｂ）に示すような濃縮層を形成する。さらに、タンパク質の濃度が大きくなると、図１１（Ｃ）に示すように、タンパク質の層が積層化する傾向にある。
　一方、分子量が大きいタンパク質の場合は、生体分子水溶液中のタンパク質の濃度が低いときは、図１２（Ａ）に示すように、プローブ固定電極上に単層を形成する。分子量の大きなタンパク質の濃度を濃くしていくと、図１２（Ｂ）に示されるように、まずタンパク質が積層化し、さらに濃度を濃くすると、図１２（Ｃ）に示すような濃縮層を形成する傾向にある。
　以上の図１１（Ａ）～（Ｃ）および図１２（Ａ）～（Ｃ）の６つの濃度領域および分子量領域において、ＦＥＴ生体分子検出部が得意とする領域（ＦＥＴ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｚｏｎｅ）は、図１１（Ｂ）、図１２（Ａ）、及び図１２（Ｃ）の各領域であり、ＱＣＭ生体分子検出部が得意とする領域（ＱＣＭ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｚｏｎｅ）は、図１１（Ａ）、図１１（Ｃ）、及び図１２（Ｂ）の各領域である。
　このように、生体分子検出部の種類によっては、生体分子検出の使用に適している領域と適していない領域があるが、本発明の生体分子検出装置では、２種以上の生体分子検出部を用いるため、そのような問題も生じにくい。全領域を通じて生体分子の挙動を把握することができる。
　本発明の生体分子検出装置における生体分子検出部は、いずれも、電極と生体分子水溶液との固液界面における信号の変化を感知し、プローブ固定電極に吸着した生体分子の吸着量等を定量し得るものであるが、生体分子検出部の種類によっては、把握し得る情報の量が異なる。
　図１３に、金属電極基板３２上に、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料３７を有するプローブ固定電極が示されており、プローブ固定電極上に、生体分子７６が吸着している模式図を示す。
　生体分子検出部が把握し得る「プローブ固定電極の金属電極基板３２表面から、生体分子までの距離（ＳＤ）を、「センシング深さ」と称する。
　プローブ固定電極を備える生体分子検出部がＦＥＴ生体分子検出部であるとき、センシング深さは１０ｎｍ程度であるが、プローブ固定電極を備える生体分子検出部がＱＣＭ生体分子検出部であるときは、センシング深さは１００ｎｍ～３００ｎｍにまで及ぶ。
　なお、各生体分子検出部のセンシング深さは、生体分子水溶液中の緩衝液の濃度によっても異なる。
　従って、本発明の生体分子検出装置および生体分子検出方法では、センシング深さの異なる生体分子検出部を組み合わせて測定することによっても興味深い測定結果を得ることができる。
　以下、本発明の生体分子検出装置及び生体分子検出方法、並びにこれらの好ましい態様について示す。
　＜１＞　第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である生体分子検出装置である。
　＜２＞　生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極とを有する生体分子検出装置である。
　＜３＞　前記第１の生体分子検出部および前記第２の生体分子検出部は、各々独立に、電界効果トランジスタ生体分子検出部、水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部、及び、表面プラズモン共鳴生体分子検出部から選択されるいずれか１つの生体分子検出部であり、前記第２の生体分子検出部は、前記第１の生体分子検出部とは異なる前記＜１＞または前記＜２＞に記載の生体分子検出装置である。
　＜４＞　前記第１の生体分子検出部が水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部であり、前記第１の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である前記＜３＞に記載の生体分子検出装置である。
　＜５＞　前記第１の生体分子検出部が表面プラズモン共鳴生体分子検出部であり、前記第１の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である前記＜３＞に記載の生体分子検出装置である。
　＜６＞　前記電極が、金、銀、タンタル、または、カーボン材料を含む前記＜１＞～前記＜５＞のいずれか１つに記載の生体分子検出装置である。
　＜７＞　前記生体分子プローブが、核酸、ポリヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、抗体、抗原、アプタマー、糖タンパク質、または、糖鎖である前記＜１＞～前記＜６＞のいずれか１つに記載の生体分子検出装置である。
　＜８＞　第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である生体分子検出装置を用い、前記生体分子検出装置が有する第１の電極および第２の電極を、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する溶液に接触する溶液接触工程と、前記第１の電極と前記溶液との固液界面における信号および前記第２の電極と前記溶液との固液界面における信号をそれぞれ検出する検出工程とを有する生体分子検出方法である。
　＜９＞　生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、参照電極とを有する生体分子検出装置を用い、前記生体分子検出装置が有する第１の電極および第２の電極を、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する溶液に接触する溶液接触工程と、前記第１の電極（第２の電極）と前記溶液との固液界面における信号を検出する検出工程とを有する生体分子検出方法である。
　＜１０＞　前記第１の生体分子検出部および前記第２の生体分子検出部は、各々独立に、電界効果トランジスタ生体分子検出部、水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部、及び、表面プラズモン共鳴生体分子検出部から選択されるいずれか１つの生体分子検出部であり、前記第２の生体分子検出部は、前記第１の生体分子検出部とは異なる前記＜８＞または前記＜９＞に記載の生体分子検出方法である。
　＜１１＞　前記第１の生体分子検出部が水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部であり、前記第１の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である前記＜１０＞に記載の生体分子検出方法である
　＜１２＞　前記電極が、金、銀、タンタル、カーボン材料、または、導電性物質を含む前記＜８＞～前記＜１１＞のいずれか１つに記載の生体分子検出方法である。
　＜１３＞　前記生体分子プローブが、核酸、ポリヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、抗原、抗体、アプタマー、糖タンパク質、または、糖鎖である前記＜８＞～前記＜１２＞のいずれか１つに記載の生体分子検出方法である。
　＜１４＞　前記水溶液接触工程は、１本鎖である核酸を前記生体分子プローブとして用い、前記生体分子プローブと前記水溶液中の前記生体分子である核酸との相補的な複合体を形成する工程、または、抗原－抗体反応を形成する工程である前記＜８＞～前記＜１３＞のいずれか１つに記載の生体分子検出方法である。
　以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」及び「部」は質量基準である。
＜各生体分子検出部の用意＞
　ＦＥＴ生体分子検出部、ＱＣＭ生体分子検出部、及びＳＰＲ生体分子検出部の各生体分子検出部（生体分子検出機器）は、次のものを用いた。
〔ＦＥＴ生体分子検出部〕
　電極基板として、厚さ９０ｎｍ、表面寸法５ｍｍ×５ｍｍの銀（Ａｇ）板を用意した。電極基板を支える基板として、厚さ１ｍｍであり、電極基板と同じ表面寸法の石英あるいはガラス基板を用意した。電極基板とガラス基板との接着性を高めるため、厚さ１０ｎｍであり、電極基板と同じ表面寸法のチタン（Ｔｉ）板を用意した。
　用意した銀板とチタン板とガラス基板とを、この順に積層し、接着して、ＦＥＴ用電極基板積層体Ａを作製した。
　次に、１，３－ジアミノプロパン四酢酸・鉄・アンモニウム・一水塩〔ＰＤＴＡ・Ｆｅ（III）〕と、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）とを、それぞれ１００ｍｍｏｌ／Ｌずつ用いて、混合し、キレート溶液を調製した。
　ＦＥＴ用電極基板積層体Ａを、キレート溶液に１８０～３００秒間浸漬して、銀板表面が塩化銀で被覆されたＦＥＴ用金属電極基板を得た。
　得られたＦＥＴ用金属電極基板をリード線で市販のＦＥＴのゲート電極とつなぎ、参照電極として用いるＦＥＴ生体分子検出部を製造した。
　ＦＥＴ用金属電極基板に生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料の層を設ける処方については後述する。
〔ＱＣＭ生体分子検出部〕
　ＱＣＭ生体分子検出部としては、金属電極基板が金（Ａｕ）である株式会社日本電波工業社製の「ＮａＰｉＣＯＳ」を用いた。
　金属電極基板に生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料の層を設ける処方については後述する。
〔ＳＰＲ生体分子検出部〕
　ＳＰＲ生体分子検出部としては、金属電極基板が金（Ａｕ）である株式会社モリテックス・プレシジョン社製の「ＳＰＲ－６７０Ｍ」を用いた。
　金属電極基板に生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料の層を設ける処方については後述する。
〔プローブ固定電極の作製〕
－自己組織化膜ＳＡＭの形成と生体分子プローブの固定化－
　まず、生体分子プローブ固体化材料として、１０－Ｃａｒｂｏｘｙ－１－ｄｅｃａｎｔｈｉｏｌ（１０μｍｏｌ／Ｌ）を、溶媒としてエタノールを用い、これらを混合して、ＳＡＭ形成用溶液を調製した。得られたＳＡＭ形成用溶液を、各生体分子検出部の金属電極基板に塗布して、各金属電極基板にＳＡＭを形成した。上記のようにして作製した自己組織化膜ＳＡＭのカルボキシル基に、生体分子プローブである５’端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド作用させ、アミド結合形成することにより、生体分子プローブを固定化した。
　あるいは、５’端にチオール基を有するオリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／Ｌ）と任意のアルカンチオール（１０～１００μｍｏｌ／Ｌ）を所定の割合（１:１～１：１０）で含む溶液を、金属電極基板に直接作用させることにより、生体分子プローブの固定化とSAM形成を同時におこなった。
＜生体分子＞
　実験に用いた生体分子は、下記表１に示すタンパク質である。
　また、表１には、各タンパク質の重量平均分子量（Ｍｗ）、寸法（Ｓｉｚｅ）、等電点（ｐＩ）、生体分子水溶液中の液性（ｐＨ７．４）における電荷量（Ｑ０）を示す。また、「Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ」欄には、棒状のタンパク質が、図１２（Ａ）に示すような単層をプローブ固定電極上に形成したときに、棒状タンパク質が、面積の大きい面で電極に吸着した場合にＱＣＭ生体分子検出部で測定される単位面積当たりの質量（ｓｉｄｅ－ｏｎ）および、棒状タンパク質が、面積の小さい面で電極に吸着した場合にＱＣＭ生体分子検出部で測定される単位面積当たりの質量（ｅｎｄ－ｏｎ）を参考までに示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ついで、表１に示す各タンパク質と、ＤＰＢＳ希釈緩衝液（ｐＨ７．４、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）とを混合してｐＨ７．４の生体分子水溶液をそれぞれ調製した。
　なお、測定に当たっては、リン酸緩衝生理食塩水のリン酸濃度を１．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ、及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌに変えたものを用いて測定したものもある。行った測定によって用いた緩衝液の濃度が異なるため、緩衝液の濃度は測定ごとに示す。
＜比較例＞
　まず、ＦＥＴ生体分子検出部、ＱＣＭ生体分子検出部、及びＳＰＲ生体分子検出部をそれぞれ、単独で用いた場合のタンパク質の吸着量を示す。
〔ＦＥＴ生体分子検出部によるタンパク質吸着の定量；ΔＶｏｕｔ〕
　図１４に、既述の方法で作製したＦＥＴ生体分子検出部のプローブ固定電極５３０と、参照電極５６０を、表１に示す各タンパク質を含有する生体分子水溶液５７０に接触するように配置したＦＥＴ生体分子検出装置５００Ｆを示す。
　定量にあたっては、図１５のグラフに示すように、タンパク質を含まない緩衝液のみの段階から、徐々に、タンパク質（図１５ではＢＳＡ）の濃度を高めることにより生体分子の表面電位（Ｖｏｕｔ）を測定した。このように測定されたプローブ固定電極から得られる表面電位（Ｖｏｕｔ）と、タンパク質を含まない緩衝液中での表面電位と、の差をタンパク質吸着に由来する表面電位差（ΔＶｏｕｔ）とした。
　タンパク質の濃度（横軸）に対する各表面電位差（縦軸）の変化を表すグラフを、図１６～図２１に示す。図１６～図２１は、それぞれ、ＢＳＡ、Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ、ＩｇＧ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、β－ｃａｓｅｉｎ、及びＬｙｓｏｚｙｍｅに関するグラフである。
　なお、各図に示す１．５ｍＭ、１５ｍＭ、および１５０ｍＭのプロットは、リン酸緩衝生理食塩水のリン酸濃度を示す。なお、各図において「ｍＭ」は「ｍＭｍｍｏｌ／Ｌ」を意味する。
　ＦＥＴ生体分子検出装置により測定される表面電位差（ΔＶｏｕｔ）は、ＦＥＴ生体分子検出部のプローブ固定電極に吸着したタンパク質の吸着量（ΓＦＥＴ）に、ほぼ比例しており（ΓＦＥＴ∝ΔＶｏｕｔ）、タンパク質のｄｒｙ　ｍａｓｓ（非含水重量）に対応している。
〔ＱＣＭ生体分子検出部によるタンパク質吸着の定量；－Δｆ〕
　図２２に、水晶振動子９２０を、既述の方法で作製したＱＣＭ生体分子検出部のプローブ固定電極９３０と、金属電極（金薄膜）９１０とで挟み、プローブ固定電極９３０および金属電極（金薄膜）９１０を発振回路９６０につなげることにより、ＱＣＭの共鳴振動に由来して水溶液中に伝達する振動波９５０によって吸着分子の重量を測定するＱＣＭ生体分子検出装置を示す。ＱＣＭ生体分子検出装置のプローブ固定電極にタンパク質９４０が吸着している様子を模式的に示している。
　ＱＣＭ生体分子検出装置を用いて、表１に示す各タンパク質を含む生体分子水溶液について、タンパク質の吸着を測定し、図２３～図２８に示されるグラフを得た。図２３～図２８は、いずれも、タンパク質の濃度（横軸）に対する共振周波数差（Δｆ）の変化を表す。
　なお、共振周波数差（Δｆ）は、タンパク質を含まない緩衝液中でのプローブ固定電極が検出する共振周波数と、タンパク質を含む緩衝液中でのプローブ固定電極が検出する共振周波数との差を表す。
　図２３～図２８は、それぞれ、ＢＳＡ、Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ、ＩｇＧ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、β－ｃａｓｅｉｎ、及びＬｙｓｏｚｙｍｅに関するグラフである。
　なお、図２３～図２８に示される斜線部の領域は、表１で示される各種タンパク質のサイズから見積もられる単層吸着量領域を表す。
　ＱＣＭ生体分子検出装置により測定される共振周波数差（Δｆ）のマイナス値は、ＱＣＭ生体分子検出部のプローブ固定電極に吸着したタンパク質の吸着量（ΓＱＣＭ）に、ほぼ比例しており（ΓＱＣＭ∝－Δｆ）、タンパク質のｗｅｔ　ｍａｓｓに対応している。
〔ＳＰＲ生体分子検出部によるタンパク質吸着の定量〕
　既述の方法で作製したＳＰＲ生体分子検出部のプローブ固定電極を用いたＳＰＲ生体分子検出装置により、タンパク質を含む緩衝液中でのタンパク質の吸着量（ΓＳＰＲ）を測定した。タンパク質の吸着量（ΓＳＰＲ）はｄｒｙ　ｍａｓｓ（非含水重量）に対応している。得られた吸着量（ΓＳＰＲ）と、同じタンパク質についてのＦＥＴ生体分子検出装置による吸着量（ΓＦＥＴ）とを比較したところ、図２９に示される直線が得られた。なお、図２９に示す１．５ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）と、１５０ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）は、リン酸緩衝生理食塩水のリン酸濃度である。
　１５０ｍｍｏｌ／Ｌのプロットから得られた回帰直線は、縦軸をｙ、横軸をｘとした場合、ｙ＝０．９７ｘ－１８．５２（決定定数Ｒ２＝０．９７）と表すことができ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌのプロットから得られた回帰直線は、縦軸をｙ、横軸をｘとした場合、ｙ＝０．６２ｘ－１９．２８（決定係数Ｒ２＝０．９９）と表すことができる。
〔ＦＥＴ生体分子検出装置のデータと、ＱＣＭ生体分子検出装置のデータとの組み合わせ〕
　既述のＦＥＴ生体分子検出装置を用いて得られたデータと、ＱＣＭ生体分子検出装置を用いて得られたデータとを用い、横軸にＦＥＴ生体分子検出装置による測定で得られた電位差（ΔＶｏｕｔ）、縦軸にＱＣＭ生体分子検出装置による測定で得られた共振周波数差（Δｆ）のマイナス値（－Δｆ）をとり、重ねて、１つのグラフで示した。
　図３０～図３５に、それぞれ、ＢＳＡ、Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ、ＩｇＧ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、β－ｃａｓｅｉｎ、及びＬｙｓｏｚｙｍｅに関するグラフを示した。
　なお、図中に示す１．５ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）と、１５０ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）は、リン酸緩衝生理食塩水のリン酸濃度である。
　また、図３１～図３４に示すＦで示される四角枠、及び、Ｑで示される四角枠の各領域は、それぞれ、既述の「ＦＥＴ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｚｏｎｅ」および「ＱＣＭ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｚｏｎｅ」である。
　さらに、図中には、各プロットから得られた回帰直線の傾き（Ｋ１～Ｋ３）および、決定係数（Ｒ２）を示した。
＜実施例＞
　次に、参考例で用いたＦＥＴ生体分子検出装置を、ＦＥＴ生体分子検出部として用い、ＱＣＭ生体分子検出装置をＱＣＭ生体分子検出として用いた生体分子検出装置を組み立て、２種のタンパク質（ＢＳＡおよびフィブリノゲン）について、測定した。なお、ＦＥＴ生体分子検出部は、参照電極として用いている。実施例で用いた生体分子検出装置は、図６を用いて説明した本発明の第１の発明に係る生体分子検出装置の構成をとっており、具体的には、図３６に示す構成を成している。
　図３６に、ＦＥＴ生体分子検出部とＱＣＭ生体分子検出部とを有する実施例における生体分子検出装置の模式図を示す。
　ＦＥＴ生体分子検出部の金属電極は、参照電極７６０として、生体分子水溶液７７０と接触している。ＱＣＭ生体分子検出部は、電極（金薄膜）７１０と、水晶振動子７２０と、プローブ固定電極７３０とを有し、電極（金薄膜）７１０及びプローブ固定電極７３０は発振回路と繋がっている。また、プローブ固定電極７３０は、生体分子水溶液７７０に接触し、また、アースにつなげられている。
　参照電極７６０と、プローブ固定電極７３０は、流路内に配置されており、流路に流される生体分子水溶液７７０中のタンパク質を測定した。
　測定条件は次の通りである。
・緩衝液・・・・・・・・・ＤＰＢＳ希釈緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）
・温度・・・・・・・・・・２５℃
・生体分子水溶液の流速・・３ｍＬ／ｈ
・タンパク質濃度・・・・・１ｍｇ／ｍＬ
・参照電極（ＦＥＴ）・・・Ａｇ／ＡｇＣｌ
　ＢＳＡの測定結果については図３７に、フィブリノゲンの測定結果については図３８に、それぞれ示した。
　実線（－）で示す曲線は、ＦＥＴ生体分子検出部が検出した表面電位差（ΔＶ）の変化を示し、図の右側の縦軸を参照する。破線（－－－）および一点鎖線（－・－・－）で示す曲線は、ＱＣＭ生体分子検出部が検出した共振周波数差（Δｆ）の変化を示し、図の左側の縦軸を参照する。
　測定は、流路に、予め緩衝液のみを流しておいてから、生体分子水溶液に切り替えている。図３７および図３８では、予め緩衝液のみを流し、生体分子水溶液に切り替える前の１００秒間と、当該切り替えから６００秒後までの測定結果を示している。すなわち、図３７および図３８における０秒が、緩衝液から生体分子水溶液への切り替え時点であり、いずれの曲線も、０秒を境に屈曲している。なお、生体分子水溶液が電極に接触する時間は０秒から２４０秒の間のみであり、２４０秒以降は緩衝液が流れる仕組みとなっている。
　図３７および図３８に示す通り、タンパク質の非特異吸着現象において吸着質量（ＱＣＭ）および電気化学特性（ＦＥＴ）は異なる経時変化を示す。吸着質量は迅速に安定化している一方、電気化学特性はゆっくりと変化している。
　図３８において、ＦＥＴ生体分子検出部が測定した表面電位差（ΔＶ）曲線が、３００秒付近を境に減少から増大に変化している。また、図３７及び図３８に示すＱＣＭ生体分子検出部が測定した共振周波数差（Δｆ）曲線も、わずかではあるが、ある時点を境に減少から増大に転じている。
　これは、流路内に送液される液体が生体分子水溶液から緩衝液に変わるリンス過程によるものであり、弱く結合した生体分子が、プローブ固定電極から脱離し流されたために、電位差や共振周波数差が変化したものと考えられる。
　また、図３７および図３８に示される曲線は生体分子の経時的な変化を測定するリアルタイム測定である。この結果を基にして、生体分子の吸着速度論的解析を行うことができる。
　さらに、図３０および図３１は、それぞれの生体分子水溶液の濃度変化に伴う信号強度の測定結果を組み合わせた図である。生体分子の物性を多面的に検出することにより、生体分子の吸着現象のメカニズムについての詳細な検討が行える。
　図３７および図３８からわかるように、ＢＳＡとｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎは同様の吸着質量変化パターンを示したが、電気化学特性は異なる経時パターンを示した。
　以上の結果は、迅速な非特異吸着過程の後に、タンパク質の構造変性およびタンパク質膜の層状化などのタンパク質内およびタンパク質間での物理化学変化が誘起していることを示唆している。
　このような考察は、同一電極で発生した同一現象を同時にモニタリングすることにより初めて可能となった。
　以上からわかるように、本発明の生体分子検出装置を用い、タンパク質について測定すると、１つの生体分子水溶液の系を、複数の生体分子検出部の観点から、同時に測定することができ、タンパク質の挙動をより詳細に調べることができる。
　日本出願２０１２－１２０２８６の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (9)

  1. 　第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、第２の電極を有する第２の生体分子検出部と、を有し、
    　前記第１の電極、または、前記第２の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である生体分子検出装置。
  2. 　生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する第１の電極を有する第１の生体分子検出部と、
    　第２の電極として前記第１の電極を共有する第２の生体分子検出部と、
    　参照電極と、
    を有する生体分子検出装置。
  3. 　前記第１の生体分子検出部および前記第２の生体分子検出部は、各々独立に、電界効果トランジスタ生体分子検出部、水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部、及び、表面プラズモン共鳴生体分子検出部から選択されるいずれか１つの生体分子検出部であり、前記第２の生体分子検出部は、前記第１の生体分子検出部とは異なる請求項１または請求項２に記載の生体分子検出装置。
  4. 　前記第１の生体分子検出部が水晶振動子マイクロバランス生体分子検出部であり、前記第１の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である請求項３に記載の生体分子検出装置。
  5. 　前記第１の生体分子検出部が表面プラズモン共鳴生体分子検出部であり、前記第１の電極が、生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定化材料を有する電極である請求項３に記載の生体分子検出装置。
  6. 　前記電極が、金、銀、タンタル、または、カーボン材料を含む請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
  7. 　前記生体分子プローブが、核酸、ポリヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、抗体、抗原、アプタマー、糖タンパク質、または、糖鎖である請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
  8. 　請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の生体分子検出装置を用い、前記生体分子検出装置が有する第１の電極および第２の電極を、同時に、少なくとも１種の生体分子を含有する水溶液に接触する水溶液接触工程と、
    　前記第１の電極と前記水溶液との固液界面における信号および前記第２の電極と前記水溶液との固液界面における信号をそれぞれ検出する検出工程と、
    　を有する生体分子検出方法。
  9. 　前記水溶液接触工程は、１本鎖である核酸を前記生体分子プローブとして用い、前記生体分子プローブと前記水溶液中の前記生体分子である核酸との相補的な複合体を形成する工程、抗原－抗体反応、アプタマー分子認識反応、リガンド－レセプター反応、または、糖鎖認識反応を形成する工程である請求項８に記載の生体分子検出方法。
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