PL239378B1

PL239378B1 - Czujnik do pomiarów impedancyjnych próbki czynnika biologicznego lub chemicznego oraz sposób wykrywania czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce za pomocą takiego czujnika

Info

Publication number: PL239378B1
Application number: PL424524A
Authority: PL
Inventors: Artur KUPCZUNAS; Artur Kupczunas; Dawid NIDZWORSKI; Dawid Nidzworski; Krzysztof Urbański; Jakub MNICH; Jakub Mnich; Katarzyna PALA; Katarzyna Pala; Tomasz GONDEK; Tomasz Gondek; Elżbieta CZACZYK; Elżbieta Czaczyk; Karolina DZIĄBOWSKA; Karolina Dziąbowska
Original assignee: Sensdx Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2021-11-29
Also published as: LT3749780T; EP3749780B1; JP2021515884A; BR112020015942A2; PL3749780T3; PL424524A1; ES2897668T3; WO2019155366A2; CN111699267A; US20210025876A1; EP3749780A2; JP7330519B2; WO2019155366A3; KR20200117013A

Description

Przedmiotem wynalazku jest czujnik do pomiarów impedancyjnych próbki czynnika biologicznego lub chemicznego w układzie potencjostatu zawierający elektrodę odniesienia RE i elektrodę zliczającą CE, z wyprowadzonymi kontaktami elektrycznymi na krawędź czujnika w formie złącza krawędziowego.

Stan Techniki

W stanie techniki można znaleźć wiele wynalazków, które rozwiązują problem czułych pomiarów czynników w próbkach biologicznych. W zgłoszeniu US2014273549A1 przedstawiono rozwiązanie, które dotyczy wieloelektrodowego sensora biometrycznego (np. do pomiaru glukozy we krwi) jednokanałowego w postaci paska przyłączanego do urządzenia odczytowego za pomocą gniazda. Na pasku znajduje się wiele pól wykonanych z przewodnika, a krawędź paska jest uformowana tak, aby pasować do gniazda odczytowego i jest wyposażona w wiele kontaktów. Opisane urządzenie posiada jeden segment pomiarowy złożony z kilku elektrod. Zgłoszenie WO2013114291A1 dotyczy wielokanałowego sensora temperatury w postaci płytki z wyprowadzonymi ścieżkami przewodzącymi na ukształtowaną w formie złącza krawędziowego do połączenia z gniazdem urządzenia odczytowego. Na płytce znajduje się wiele pól wykonanych z przewodnika, a krawędź jest uformowana tak, żeby pasować do gniazda odczytowego i jest wyposażona w wiele kontaktów (styków na krawędziach). Pomiary wykonywane są równolegle i jednocześnie. W opisanym rozwiązaniu każde z pól pomiarowych stanowi oddzielny układ pomiarowy, a wielokanałowość osiągnięta jest przez zwielokrotnienie układów pomiarowych, liczba linii obwodów jest również zwielokrotniona. Każdy z układów pomiarowych pracuje oddzielnie, przez co pomiar próbki nie odbywa się w takich samych warunkach na każdym kanale. Takie rozłożenie elektrod wydłuża ponadto czas pomiaru i nie daje możliwości wyeliminowania błędów pomiarowych.

Patent US6391558B1 pokazuje system do detekcji sekwencji kwasów nukleinowych, bazujący na metodzie elektrochemicznej. System wykorzystuje elektrodę na podłożu PCB, składającą się z macierzy elektrod pracujących i referencyjnych. Potencjał elektryczny przyłożony do elektrody pracującej jest multipleksowany, co pozwala na detekcję różnych ligandów w jednej próbce. Elektroda sensora połączona jest z analizatorem, który odczytuje pulsy elektryczne i zmiany sygnału spowodowane oddziaływaniem na elektrodzie.

W zgłoszeniu patentowym US20030042150A1 opisano czujnik elektrochemiczny do detekcji parametrów krwi takich jak stężenie glukozy, poziom cholesterolu i innych. System składa się z wielu elektrod, co pozwala na jednoczesny ilościowy pomiar wielu parametrów.

Z kolei w patencie US6391558B1 opisano metodę detekcji kwasów nukleinowych na elektrodach umieszczonych na płytkach drukowanych. Elektroda wykonana może być z węgla lub metali, w tym miedzi, niklu, złota, platyny, palladu i innych. Płytki drukowane są wytwarzane metodą sitodruku, a następnie poddane fotolitografii. W opisie brak jest możliwości pomiaru na wielu elektrodach jednocześnie, bez multipleksowania.

Biosensory oparte o pomiary elektrochemiczne są często stosowane w urządzeniach typu PoC (Point of Care). Ward i wsp. w publikacji PLOS ONE 2014 9 3 e91732. „Detecting P. aeruginosa with a Novel Biosensor”, opisali metodę oznaczania Pseudomonas aeruginosa na elektrodach za pomocą ESI (Elektrochemicznej Spektroskopii Impedacyjnej). Pomiar i analiza wyników polegają na zmianie impedancji po przyłączeniu do biofilmu na powierzchni elektrody mikroorganizmów za pomocą pilii, flagelli lub białek zewnątrzkomórkowych, które powodują transfer ładunku lub poprzez wykrywanie metabolitów wytwarzanych przez mikroorganizmy.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe W O2001083674A1 opisuje metodę wykrywania reagentów za pomocą biosensora elektrochemicznego, zbudowanego z elektrod pokrytych monowarstwą cząsteczek biologicznych, korzystnie biotyną oddziałującą selektywnie ze streptawidyną. Z kolei Moreira i wsp. (Sensors and Actuators B 223 (2016) 927-935) opisują zastosowanie metody sitodruku do wytworzenie sensorów bazujących na elektrodach srebrowych. W sensorze wykorzystano sztuczne przeciwciała rozpoznające biomarkery nowotworowe. Sygnał wykrywania przeciwciał mierzony był różnymi metodami, takimi jak woltamperometria cykliczna (CV), elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna (ESI), woltamperometria fali prostokątnej (SVW).

Dokument DE10332804 ujawnia czujnik zawierający przeciwelektrodę (elektrodę zliczającą), wiele elektrod pracujących i elektrodę odniesienia oddzielająca elektrody pracujące od przeciwelektrody. Dokument ten opisuje klika postaci wykonania, z których przedmiotowemu wynalazkowi najbliższa jest postać przedstawiona na Figurze 4. Jednakże, żaden z ujawnionych w D1 wariantów rozwią

PL 239 378 B1 zania nie ujawnia elektrody zliczającej o mającej brzegi w kształcie wycinków okręgów współśrodkowych z kołami tworzącymi elektrody robocze, ani elektrody odniesienia o kształcie odpowiadającym obrysowi elektrody zliczającej.

Wadą wynalazków opisanych wstanie techniki jest brak możliwości równoczesnego pomiaru wielokanałowego, wszystkich segmentów pomiarowych, co wpływa negatywnie na szybkość pomiaru i jego dokładność. Do wykonania pomiarów wielokanałowych za pomocą opisanych wstanie techniki rozwiązań stosuje jeden układ odczytowy z multipleksacją sygnału, gdzie w danej chwili zasilany i odczytywany jest tylko jeden segment pomiarowy, następnie układ przełącza zasilanie i odczyt do następnego segmentu pomiarowego. W efekcie nie ma możliwości dokonania pomiaru jednoczesnego. Każdy segment pomiarowy ma swój oddzielny zestaw elektrod, generowane błędy pomiarowe stałe i losowe pojawiające się na elektrodach odniesienia nie mogą być w żaden sposób kompensowane z uwagi na to, że każda z elektrod odniesienia jest oddzielnym obwodem elektrycznym (błąd stały każdej elektrody), a z uwagi na to, że pomiary segmentów są wykonywane w różnym czasie, błędy losowe są niedookreślenia.

Nieoczekiwanie okazało się, że prezentowany wynalazek rozwiązuje ten problem.

Istota Wynalazku

Przedmiotem obecnego wynalazku jest czujnik do pomiarów impedancyjnych próbki czynnika biologicznego lub chemicznego w układzie potencjostatu zawierający elektrodę odniesienia RE i elektrodę zliczającą CE, z wyprowadzonymi kontaktami elektrycznymi na krawędź czujnika w formie złącza krawędziowego, który posiada n elektrod roboczych WEn, gdzie n > 2, przy czym elektroda odniesienia RE jest wspólna dla wszystkich elektrod roboczych WEn, a jej fragment znajdujący się obok elektrody roboczej WEn tworzy segment pomiarowy RE-CE-Wen, przy czym elektrody robocze WEn mają kształt jednakowych kół i są położone symetrycznie względem elektrody zliczającej CE, przy czym elektroda odniesienia RE jest położona między elektrodą zliczającą CE a elektrodami roboczymi WEn, charakteryzujący się tym, że brzegi elektrody zliczającej CE mają kształt wycinków okręgów współśrodkowych z kołami tworzącymi elektrody robocze WEn, kształt elektrody odniesienia RE odpowiada obrysowi elektrody zliczającej CE, przy czym korzystnie n jest w zakresie od 2 do 256.

Korzystnie, co najmniej dwie, a korzystniej wszystkie elektrody WEn pokryte są od strony wierzchniej warstwą materiału sensorycznego, to jest materiału, który reaguje tylko z jednym rodzajem czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce.

Korzystnie, co najmniej dwie elektrody WEn pokryte są różnymi materiałami sensorycznymi.

Korzystnie materiał sensoryczny jest materiałem typu biologicznego lub syntetycznego, a zwłaszcza stanowi przeciwciała, fragmenty przeciwciał, peptydy, sekwencje kwasów nukleinowych do wykrywania czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce.

Korzystnie posiada dodatkowe elektrody zwierane i/lub niezwierane do kodowania numeru elektrody roboczej WEn, gdzie n > 2 a korzystnie n jest w zakresie od 2 do 256.

Korzystnie układ elektrod roboczych WEn, elektrody zliczającej CE i elektrody odniesienia RE tworzą powtarzające się segmenty pomiarowe o identycznym kształcie, a w każdym segmencie pomiarowym odległości między elektrodą roboczą WEn, elektrodą zliczającą CE i elektrodą odniesienia RE są takie same, a ponadto pola powierzchni elektrod roboczych WEn, fragmentu elektrody zliczającej CE i fragmentu elektrody odniesienia RE są odpowiednio takie same w każdym segmencie.

Korzystnie układ i kształt elektrod roboczych WEn, elektrody odniesienia RE i elektrody zliczającej CE posiada oś symetrii.

Korzystnie złącze krawędziowe posiada pola stykowe tworzące obwód elektryczny oddzielny od elektrod WEn, RE i CE, przeznaczony do identyfikacji prawidłowego umieszczenia czujnika w gnieździe układu pomiarowego przez zwarcie styków gniazda pomiarowego podczas umieszczania czujnika w tym gnieździe.

Korzystnie złącze krawędziowe jest wtykiem HDMI (ang. High Definition Multimedia Interface, multimedialny interfejs wysokiej rozdzielczości) lub DisplayPort (uniwersalny interfejs cyfrowy).

Przedmiotem obecnego wynalazku jest również sposób wykrywania czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce, charakteryzujący się tym, że próbkę czynnika biologicznego lub chemicznego w postaci elektrolitu lub roztworu umieszcza się w czujniku według wynalazku tak, że wszystkie elektrody robocze WEn, elektrodę zliczającą CE i elektrodę odniesienia RE pokrywa się wspomnianą próbką w postaci zawiesiny lub roztworu, a następnie prowadzi się jednocześnie od 2 do 256 pomiarów próbki, zwłaszcza techniką spektroskopii impedancyjnej lub woltamperometrii i na podstawie wyników tych pomiarów stwierdza się obecność czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce.

PL 239 378 B1

Korzystnie pomiary prowadzi się w konfiguracji odwróconej, w której elektroda odniesienia RE pracuje, jako elektroda zliczająca CE, a elektroda zliczająca CE pracuje jako elektroda odniesienia RE.

Korzystnie, pomiary prowadzi się w konfiguracji odwróconej, w której elektroda robocza WEn pracuje jako elektroda zliczająca CE, a elektroda zliczająca CE pracuje jako elektroda robocza WEn.

Korzystnie czynnikiem biologicznym lub chemicznym są patogeny, zwłaszcza wirusy, bakterie, grzyby białka i ich fragmenty w tym enzymy, przeciwciała, białka budulcowe, fragmenty przeciwciał, peptydy, affibody, kwasy nukleinowe i sekwencje nukleotydowe w tym jedno i dwuniciowe DNA, RNA, aptamery, krótkie sekwencje nukleotydowe kwasy tłuszczowe, cukry, glikolipidy, glikopeptydy, inne organiczne związki chemiczne takie jak pestycydy, antybiotyki, związki nieorganiczne, w tym metale ciężkie.

Korzystne przykłady wykonania wynalazku

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:

fig. 1 Przedstawia czujnik 1 do pomiarów impedancyjnych w układzie potencjostatu zawiera- jący elektrodę odniesienia RE 3 i elektrodę zliczającą CE 4, z wyprowadzonymi kontaktami elektrycznymi 5 na krawędź 6 czujnika 1 w formie złącza krawędziowego. Przedstawiony czujnik 1 posiada elektrody robocze WEn 7, gdzie n = 8 a elektroda odniesienia RE 3 jest wspólna dla wszystkich elektrod roboczych WEn 7 i jej fragment znajdujący się obok elektrody roboczej WEn 7 tworzy segment pomiarowy 8 typu RE-CE-WEn.

fig. 2 Przedstawia krawędź 6 czujnika 1 w formie złącza krawędziowego z polami stykowymi tworzącymi obwód elektryczny oddzielny od elektrod WEn 7, RE 3 i CE 4, przeznaczony do identyfikacji prawidłowego umieszczenia czujnika w gnieździe pomiarowym oraz dodatkowe elektrody 13 zwierane i/lub niezwierane do kodowania numeru elektrody roboczej WEn 7.

fig. 3 Przedstawia schemat ideowy układu do identyfikacji czujnika z zakodowanym numerem „11001”. Możliwa liczba kombinacji, równa 32 (2^ΛΜ dla M = 4).

fig. 4 Przedstawia schemat ideowy układu w wersji uproszczonej, do identyfikacji używany jest podzbiór 3 kontaktów elektrycznych 5, zatem liczba kombinacji wynosi 2ΛΜ = 8.

fig. 5 Badanie oddziaływania sensora z próbką pozytywną w postaci produktu z laktozą.

fig. 6 Badanie oddziaływania sensora z próbką negatywną w postaci produktu bez laktozy.

fig. 7 Oddziaływanie sensora zmodyfikowanego ssDNA z sekwencją komplementarną.

fig. 8 Wynik pomiaru Elektrochemicznej Spektroskopii Impedancyjnej dla elektrody miedzio- wej pokrytej warstwą biologiczną, traktowanej kolejno 0,5 M NaCl, sztuczną śliną z buforem Triton X (1%), wirusem H1N1 w buforze Triton X z dodatkiem 0,5M NaCl.

fig. 9 Widok z góry oraz przekrój poprzeczny czujnika 1 pokrytego materiałem sensorycznym 9 (warstwą biologiczną) oraz naniesioną próbką 2 czynnika biologicznego lub syntetycznego.

W korzystnym przykładzie wykonania elektrody robocze WEn 7 pokryte są materiałem sensorycznym 9 czyli substancją odpowiedzialną za wykrywanie określonych substancji i cząsteczek biologicznych i chemicznych w próbce 2, korzystnie w postaci roztworu lub zawiesiny.

Elektroda robocza RE 3 i zliczająca CE 4 są elektrodami pomocniczymi, współdzielonymi w trakcie pomiaru ze wszystkimi elektrodami WEn 7 i służą do przeprowadzenia pomiarów wielkości elektrycznych zmieniających się w wyniku procesów chemicznych zachodzących w materiale sensorycznym 9 umieszonym na elektrodach WEn 7 pod wpływem czynników biologicznych lub chemicznych, które zamierzamy wykrywać w próbce 2.

Złącze krawędziowe czujnika 1 jest mechanicznie i częściowo elektrycznie zgodne ze standardowym gniazdem HDMI lub DisplayPort. W typowych zastosowaniach gniazda HDMI oraz DisplayPort służą do transmisji danych cyfrowych i zawierają w obudowie 2 rzędy styków zapewniających połączenie elektryczne między gniazdem a umieszczanym w nim wtykiem. Mechaniczna budowa wtyków i gniazd HDMI/DP uniemożliwia odwrotne ich połączenie.

Tymczasem w przedstawionym rozwiązaniu czujnik 1 nie posiada wtyku HDMI/DP ani innych mechanicznych elementów zapewniających podobną funkcjonalność czyli zabezpieczenie przed odwrotnym umieszczeniem czujnika w szczelinie gniazda czytnika. Bez dodatkowych mechanicznych zabezpieczeń możliwe jest zatem odwrotne umieszczenie czujnika 1 w gnieździe pomiarowym, co uniemożliwia przeprowadzenie pomiaru. W takiej sytuacji dodatkowym problemem jest budowa standardo

PL 239 378 B1 wego gniazda HDMI/DP - kontakty umieszczone są naprzemianlegle a nie naprzeciwległe, co w praktyce uniemożliwia zastosowanie istniejących kontaktów elektrycznych 5 na krawędzi 6 złącza krawędziowego do jednoznacznej detekcji faktu odwrotnego umieszczenia czujnika 1 w gnieździe pomiarowym. Wynika to z faktu, iż przy odwrotnym umieszczeniu punkty styku gniazda pomiarowego i środki kontaktów elektrycznych 5 nie pokrywają się - punkt styku zostaje przesunięty na izolowany obszar między kontaktami elektrycznymi 5. W efekcie tego możliwe jest pojawienie się zwarcia sąsiadujących kontaktów elektrycznych 5 przez styk gniazda, jak też pojawienie się połączenia elektrycznego z dowolnym z tych kontaktów elektrycznych 5. Jest to praktycznie nieprzewidywalne i uzyskany wynik może być zupełnie różny dla kolejnych prób umieszczenia czujnika 1 w gnieździe pomiarowym w orientacji odwrotnej. Wynika to wprost z niedopasowania luzów między obudową gniazda a złączem krawędziowym oraz odchyleniu krawędzi 6 złącza krawędziowego od kąta prostego względem osi symetrii gniazda.

Nieoczekiwanie okazało się, że chociaż nie jest możliwe wykluczenie takiej sytuacji, to możliwe jest jednak wykrycie prawidłowej lub błędnej orientacji czujnika 1 w chwili umieszczania go w szczelinie gniazda pomiarowego czytnika bazując wyłącznie na pomiarach elektrycznych. Wymagane jest zaprojektowanie pól stykowych 11 w taki sposób, że część obszaru bliższa krawędzi 6 złącza krawędziowego czujnika 1 stanowi pola stykowe 11 służące do detekcji orientacji czujnika w gnieździe, zaś pozostały obszar złącza krawędziowego zapewnia elektryczny kontakt styków gniazda z kontaktami elektrycznymi 5 podłączonymi do poszczególnych elektrod czujnika. Przykład realizacji przedstawiono na fig. 2. W trakcie wsuwania czujnika 1 do gniazda wystąpi chwilowe zwarcie przez pola stykowe 11 styków 1-2-3-4 i 6-7-8-9 gniazda pomiarowego, bez zwarcia ze stykiem 5. Wynaleziony sposób detekcji orientacji czujnika 1 względem gniazda opiera się w pełni na pomiarach elektrycznych poprzez monitorowanie zwarć między wybranymi grupami styków elektrycznych w trakcie wsuwania czujnika 1 w szczelinę gniazda pomiarowego i nie ogranicza funkcjonalnie lub nie wpływa na działanie czujnika 1 po jego pełnym wsunięciu.

Warianty przedstawionego rozwiązania obejmują wydzielenie pól stykowych 11 na górnej, dolnej lub obu stronach złącza krawędziowego, w różnych konfiguracjach zwieranych styków gniazda pomiarowego.

W korzystnym wariancie czujnik posiada 9 pól stykowych służących do kodowania numeru czujnika.

Dopiero po wykryciu właściwej orientacji czujnika 1 w gnieździe pomiarowym aktywowane są sygnały elektryczne służące identyfikacji typu czujnika 1 oraz wymagane do przeprowadzenia właściwego pomiaru.

P r z y k ł a d 1

Identyfikacja typu czujnika

Uniwersalność czytnika zakłada możliwość użycia go do wykrywania różnych substancji biologicznych lub chemicznych. Czujnik 1 może być wykonany w wielu wersjach różniących się rodzajami materiałów sensorycznych 9 elektrod roboczych WEn 7 wrażliwych na konkretne wybrane patogeny lub inne substancje. Należało w związku z tym zapewnić możliwość jednoznacznej identyfikacji typu czujnika 1 umieszczonego w czytniku, aby na tej podstawie dobrać warunki przeprowadzenia pomiaru takie jak wartości sygnałów pobudzających oraz czas wykonania pomiaru, które mogą różnić się dla poszczególnych typów czujnika 1. Powszechnie spotykane rozwiązania bazują na identyfikacji kolorymetrycznej, zastosowaniu kodów bazujących na optycznej analizie obrazu (np. kody kreskowe, kody QR) czy też wyspecjalizowanych układów elektronicznych służących do przewodowej bądź bezprzewodowej identyfikacji (np. RFID).

Możliwa jest identyfikacja typu czujnika 1 przy użyciu tych samych kontaktów elektrycznych 5, które są stosowanie do przeprowadzania pomiarów elektrod roboczych WEn 7. Kodowanie typu czujnika 1 odbywa się poprzez wyodrębnienie podzbioru N kontaktów elektrycznych 5 spośród M dostępnych, przy czym N < M. Wyodrębniona kombinacja N kontaktów elektrycznych 5 zostaje zwarta do elektrody odniesienia RE 3, lub elektrody zliczającej CE 4, lub elektrody ekranującej GE 14. Układ elektroniczny czytnika wykrywa, które z kontaktów elektrycznych 5 zostały zwarte, zaś zwarte w ten sposób kontakty elektryczne 5 nie są używane na dalszych etapach właściwego pomiaru.

Zgodnie z rysunkiem fig. 3 kontakty elektryczne 5 o numerach 1,2 prowadzące do elektrod roboczych WE1 i WE2 7 oraz kontakt elektryczny 5 o numerze 5 nie zostały elektrycznie zwarte do żadnego z linii kontaktów elektrycznych 5 elektrody CE 4, elektrody RE3, GE 14, zatem za ich pomocą zostanie przeprowadzony pomiar zawartości czynnika biologicznego lub chemicznego. Kontakty elektryczne 5

PL 239 378 B1 o numerach 3 i 4 zostały zwarte do centralnie umieszczonej elektrody GE 14. Wstępna polaryzacja napięciem VPOL w zakresie od 500 mV do 5V wszystkich kontaktów elektrycznych 5 względem GE14 lub RE, CE daje wynik pomiaru napięcia bliski VGE tylko dla kontaktów elektrycznych 5 3 i 4 oraz wynik pomiaru napięcia bliski VPOL dla kontaktów elektrycznych 5 1, 2 i 5. Oznaczając potencjał bliski VGE symbolem '0', a bliski napięciu polaryzującemu VPOL symbolem '1', otrzymujemy kod „11001.

Przedstawione rozwiązanie, w którym wybrany podzbiór kontaktów elektrycznych 5 złącza krawędziowego może być w dowolnej kombinacji zwarty bądź nie z elektrodami GE 14, elektrodami roboczymi RE 3 lub elektrodami zliczającymi CE 4 pozwala zakodować 2^λΝ różnych kombinacji. Dla przykładowego rozwiązania podzbiór kontaktów elektrycznych 5 służących do identyfikacji liczący N = 3 kontakty elektryczne 5 pozwala jednoznacznie zidentyfikować 8 różnych typów czujników 1. Analogicznie, dla N = 8 byłoby to 256 rozróżniaInych typów czujników 1.

Rozwiązanie pozwalające na użycie wszystkich kontaktów elektrycznych 5 do identyfikacji typ czujnika 1, zapewnia większą liczbę kombinacji, równą 32 (2ΛΜ dla M = 4).

Na rysunku fig. 4 przedstawiono układ w wersji uproszczonej, do identyfikacji używany jest podzbiór 3 kontaktów elektrycznych 5, zatem liczba kombinacji wynosi 2ΛΜ = 8.

Działanie czujnika

W przypadku prezentowanego rozwiązania, każdy indywidualny segment pomiarowy 8 złożony z elektrody roboczej WEn7 oraz korespondującego fragmentu elektrody odniesienia RE 3 i elektrody zliczającej CE 4 są identyczne, tj. zachowane są identyczne odległości między tymi elementami i zachowują stałe wielkości pola powierzchni. Potencjał elektrody odniesienia RE 3 jest taki sam w całym układzie, co zapewnia identyczne warunki pomiarowe dla całego układu. Wszystkie inne pary elektrod działają identycznie, a elektroda odniesienia RE 3 wyrównuje potencjał w sąsiedztwie innych elektrod.

Elektrody robocze WEn 7, elektrody odniesienia RE 3, elektroda zliczająca CE 4 wykonane są z materiału o niskiej rezystywności np. miedzi, pomijalnie małej w porównaniu do rezystywności próbki 2 lub materiału sensorycznego 9 reagującego z określonymi substancjami chemicznymi i biologicznymi np. patogenami podlegającymi wykrywaniu.

W systemach wielokanałowych istnieje niekorzystny wpływ gradientu potencjału elektrycznego na wyniki pozyskiwane z poszczególnych kanałów.

W przedstawionym rozwiązaniu czujnika 1 wielokanałowego zastosowano segmenty pomiarowe 8 stanowiące układ elektrody roboczej WEn 7, elektrody odniesienia 3 i elektrody zliczającej 4 taki, że każdy z segmentów pomiarowych 8 zachowuje identyczną geometrię, w szczególności identyczne pola powierzchni poszczególnych elektrod, odległości między nimi oraz kształty elektrod dobrane w taki sposób, aby przebieg elektrody RE odpowiadał pewnemu stałemu potencjałowi w rozkładzie linii sił pola elektrycznego w spolaryzowanym czujniku 1.

Kształt elektrody odniesienia RE uwzględnia rozkład gradientu pola elektrycznego w spolaryzowanym czujniku odwzorowując zasadniczo identyczną wartość potencjału w spolaryzowanym elektrolicie.

Nieoczekiwanie okazało się w przeprowadzonych testach, że tak zaprojektowany układ elektrod nie tylko zapewnia bardzo dobrą powtarzalność wyników niezależnie od analizowanej elektrody WEn 7, ale pozwala na zastosowanie nowych metod pomiaru impedancji.

Metoda pomiarowa N1. W porównaniu do klasycznej spektroskopii impedancyjnej z układem potencjostatu, rolą elektrody odniesienia RE 7 nie jest uzyskanie zadanego potencjału w wyniku zmian wartości potencjału elektrody zliczającej 4 CE, lecz pomiar potencjału w roztworze próbki 2 w postaci elektrolitu, celem skompensowania (wyeliminowania) impedancji elektrolitu z wyniku końcowego będącego wartością impedancji w układzie elektrod CE-WEn.

Metoda N2. W porównaniu z klasyczną metodą pomiaru stosowaną w spektroskopii impedancyjnej z potencjostatem, następuje zamiana ról elektrody roboczej WEn 7 i elektrody zliczającej CE 4 pobudzenia są w takim układzie generowane przez elektrody robocze WEn 7 zamiast elektrody zliczające CE 4. Rolą elektrody roboczej RE 7 podobnie jak metodzie N1 jest pomiar rozkładu potencjału w elektrolicie. Nieoczekiwanie okazało się, że wartości impedancji zmierzone metodą N2 są inne niż mierzone metodą tradycyjną lub metodą N1, zaś cykliczne przełączanie trybu działania układu pomiarowego między N1 i N2 dostarcza dodatkowych informacji o mierzonych próbkach.

Obie metody N1 i N2 charakteryzują się brakiem ograniczeń typowych dla powszechnie wykonywanych pomiarów impedancji w układach potencjostatu, a w szczególności możliwe jest jednoczesne wykonywanie pomiarów dla wszystkich elektrod roboczych WEn 7 jednocześnie.

PL 239 378 B1

Okazało się, że oprócz korzystnego zwiększenia ilości danych o badanej próbce 2 pozyskanych w trakcie przełączania metod N1 i N2 dodatkową korzyścią jest istotne skrócenie czasu pomiaru w porównaniu do pomiarów multipleksowanych w dziedzinie czasu, bazujących na wykonaniu odrębnych pomiarów dla poszczególnych elektrod. Uzysk polegający na skróceniu czasu pomiarów zarówno metodą N1 jak N2 jest wprost proporcjonalny do liczby kanałów, i dla 8 kanałów mierzonych jednocześnie jest 8-krotnie krótszy niż analogiczny pomiar wykonany metodą tradycyjną, t.j. z multipleksowaniem czasowym.

Elektrolit, inaczej jak w przypadku klasycznych pomiarów elektrochemicznych, jest tylko czynnikiem zwilżalnym i pomocniczym do przewodzenia prądu, a geometria elektrod likwiduje wpływ samego elektrolitu na impedancje.

Budowa i wzajemne ułożenie elektrod pozwala także na używanie odwróconego trybu pomiarowego. W klasycznych układach pobudzenie następuje na elektrodzie zliczającej CE 4 a sygnał rejestrowany jest na elektrodzie roboczej WEn 7. W przypadku opisywanego rozwiązania, pomiar może być przeprowadzony w taki sposób, że pobudzenie następuje na elektrodzie roboczej WEn 7, a elektroda zliczająca CE 4 stanowi punkt odniesienia dla całego układu pomiarowego. Odwrócenie kierunku przepływu prądu jonowego przez elektrolit daje wynik różniący się w pewnym zakresie częstotliwości od wyniku uzyskanego metodą tradycyjną, co poprawia czułość urządzenia oraz zwiększa jego możliwości w zakresie automatycznego wykrywania wadliwego działania czujnika 1 lub poszczególnych elektrod.

Odwrócenie konfiguracji elektrod pozwala na uzyskanie różnych wynikowych charakterystyk impedancji elektrod w porównaniu do typowej konfiguracji. Występujące różnice są wynikiem nieliniowości zjawisk występujących w układzie czujnik-warstwa bioczuła-badana próbka. Istotna jest tutaj zarówno możliwość odwrócenia polaryzacji elektrod (a więc kierunku przemieszczania ładunków elektrycznych, w tym jonów w roztworze), jak też zmiana konfiguracji układu pomiarowego (sposobu pomiaru prądów poszczególnych elektrod). W szczególności możliwy jest dzięki temu pomiar nieliniowości charakterystyk impedancji wynikający z występowania złącz typu p-n w mierzonych układach.

P r z y k ł a d 2

Badanie oddziaływania laktozy z elektrodą

Powierzchnia elektrody roboczej WEn 7 została zmodyfikowana enzymem beta-galaktozydazą. Następnie elektroda robocza WEn 7 została wyzerowana buforem (została przygotowana do pracy, czyli zwilżona roztworem zerującym służącym do aktywowania elektrody), a następnie naniesiono na nią próbkę 2 w postaci roztworu zawierającego laktozę, fig. 5 pokazuje wyraźną zmianę impedancji pod wpływem obecności laktozy.

Jako eksperyment kontrolny zastosowano próbkę bez laktozy. Jak pokazuje rysunek fig. 6, czujnik 1 nie wykazuje zmian pod wpływem obecności próbki kontrolnej.

P r z y k ł a d 3

Badanie oddziaływania DNA na elektrodach

Elektrody robocze WEn 7 od 1 do 8 przed pomiarem czyszczono H2SO4. Przeprowadzono pomiar elektrod roboczych WEn 7 czystych, a następnie wytworzono na nich materiał sensoryczny 9. Materiał sensoryczny 9 wykonano poprzez:

• Naniesienie postaci SH-DNA (ssDNA) modyfikującego i pozostawiano w temp. pokojowej na czas od 2-24 h.

• Następnie naniesienie 10 μl roztworu MCH (DNA komplementarne, CssDNA) i przemycie buforem PBSo pH 7.4 w celu usunięcia niezwiązanych molekuł.

Tak przygotowany czujnik 1 z materiałem sensorycznym 9 umożliwia przeprowadzenie pomiarów, np. metodą Elektrochemicznej Spektroskopii Impedancyjnej, które wykazują oddziaływanie SH-DNA modyfikującego (który jest przyłączony do powierzchni elektrody) z DNA komplementarnym, które znajduje się w mierzonej próbce.

W yniki przedstawiono na wykresie (fig. 7) na którym widać wzrost impedancji spowodowany oddziaływaniem DNA komplementarnego z DNA modyfikującym.

P r z y k ł a d 4

Badanie oddziaływania sensora na podłożu miedzianym - wirus H1N1 560:

• modyfikacja powierzchni sensora warstwą biologiczną (przeciwciałem anty-M1) • tzw. „zerowanie” sensora zmodyfikowanego przeciwciałem - etap pierwszy właściwego pomiaru aktywności biologicznej sensora, w wyniku którego wysuszona warstwa peptydu zostaje przygotowana do testów,

PL 239 378 B1 • badanie oddziaływania sensora z próbką negatywną w postaci sztucznej śliny w połączeniu z 1% tritonem X • badanie oddziaływania sensora z próbką zawierającą wirusa H1N1

Wyniki przedstawiono na fig. 8

Wnioski: sensor zbudowany na podłożu miedzianym, zmodyfikowanym przeciwciałem:

• wykazuje niewielką zmianę impedancji pod wpływem oddziaływania z próbką negatywną w postaci sztucznej śliny w połączeniu z 1% tritonem X;

• wykazuje wyraźną zmianę (wzrost) impedancji pod wpływem oddziaływania peptydu z próbką zawierającą wirusa.

Claims

1. Czujnik do pomiarów impedancyjnych próbki czynnika biologicznego lub chemicznego w układzie potencjostatu zawierający elektrodę odniesienia RE i elektrodę zliczającą CE, z wyprowadzonymi kontaktami elektrycznymi na krawędź czujnika w formie złącza krawędziowego, który posiada n elektrod roboczych WEn (7), gdzie n > 2, przy czym elektroda odniesienia RE (3) jest wspólna dla wszystkich elektrod roboczych WEn (7), a jej fragment znajdujący się obok elektrody roboczej WEn (7) tworzy segment pomiarowy (8) RE-CE-Wen, przy czym elektrody robocze WEn (7) mają kształt jednakowych kół i są położone symetrycznie względem elektrody zliczającej CE (4), przy czym elektroda odniesienia RE (3) jest położona między elektrodą zliczającą CE (4) a elektrodami roboczymi WEn (7), znamienny tym, że brzegi elektrody zliczającej CE (4) mają kształt wycinków okręgów współśrodkowych z kołami tworzącymi elektrody robocze WEn (7), kształt elektrody odniesienia RE (3) odpowiada obrysowi elektrody zliczającej CE (4), przy czym korzystnie n jest w zakresie od 2 do 256.

2. Czujnik według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej dwie, a korzystnie wszystkie elektrody WEn (7) pokryte są od strony wierzchniej warstwą materiału sensorycznego (9), to jest materiału, który reaguje tylko z jednym rodzajem czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce (2).

3. Czujnik według zastrz. 2 znamienny tym, że co najmniej dwie elektrody WEn (7) pokryte są różnymi materiałami sensorycznymi (9).

4. Czujnik według zastrz. 1,2 albo 3, znamienny tym, że materiał sensoryczny (9) jest materiałem typu biologicznego lub syntetycznego, a zwłaszcza stanowi przeciwciała selektywne, fragmenty przeciwciał, peptydy, sekwencje kwasów nukleinowych do wykrywania czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce (2).

5. Czujnik według dowolnego z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że posiada dodatkowe elektrody (13) zwierane i/lub niezwierane do kodowania numeru elektrody roboczej WEn (7), gdzie n > 2 a korzystnie n jest w zakresie od 2 do 256.

6. Czujnik według dowolnego z zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że układ elektrod roboczych WEn (7), elektrody zliczającej CE (4) i elektrody odniesienia RE (7) tworzą powtarzające się segmenty pomiarowe (8) o identycznym kształcie, a w każdym segmencie pomiarowym (8) odległości między elektrodą roboczą WEn (7), elektrodą zliczającą CE (4) i elektrodą odniesienia RE (3) są takie same, a ponadto pola powierzchni elektrod roboczych WEn (7), fragmentu elektrody zliczającej CE (4) i fragmentu elektrody odniesienia RE (3) są odpowiednio takie same w każdym segmencie.

7. Czujnik według dowolnego z zastrz. od 1 do 6, znamienny tym, że układ i kształt elektrod roboczych WEn (7), elektrody odniesienia RE (3) i elektrody zliczającej CE (4) posiada oś symetrii.

8. Czujnik według dowolnego z zastrz. od 1 do 7, znamienny tym, że złącze krawędziowe posiada pola stykowe (11) tworzące obwód elektryczny oddzielny od elektrod WEn (7), elektrody odniesienia RE (3) i elektrody zliczającej CE (4), przeznaczony do identyfikacji prawidłowego umieszczenia czujnika (1) w gnieździe układu pomiarowego przez zwarcie styków gniazda pomiarowego podczas umieszczania czujnika (1) w tym gnieździe.

9. Czujnik według dowolnego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że złącze krawędziowe jest wtykiem HDMI (ang. High Definition Multimedia Interface, multimedialny interfejs wysokiej rozdzielczości) lub DisplayPort (uniwersalny interfejs cyfrowy).

PL 239 378 B1

10. Sposób wykrywania czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce, znamienny tym, że próbkę (2) czynnika biologicznego lub chemicznego w postaci zawiesiny lub roztworu umieszcza się w czujniku określonym w dowolnym z poprzedzających zastrzeżeń od 1 do 10 tak, że wszystkie elektrody robocze WEn (7), elektrodę zliczającą CE (4) i elektrodę odniesienia RE (3) pokrywa się wspomnianą próbką (2) w postaci zawiesiny lub roztworu, a następnie prowadzi się jednocześnie od 2 do 256 pomiarów impedancyjnych próbki (2), zwłaszcza techniką spektroskopii impedancyjnej lub woltamperometrii i na podstawie wyników tych pomiarów stwierdza się obecność czynnika biologicznego lub chemicznego w próbce (2).

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że pomiary prowadzi się w konfiguracji odwróconej, w której elektroda odniesienia RE (3) pracuje jako elektroda zliczająca CE (4), a elektroda zliczająca CE (4) pracuje jako elektroda odniesienia RE (3).

12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że pomiary prowadzi się w konfiguracji odwróconej, w której elektroda robocza WEn (3) pracuje jako elektroda zliczająca CE (4), a elektroda zliczająca CE (4) pracuje jako elektroda robocza WEn (7).

13. Sposób według zastrz. 10, 11 albo 12, znamienny tym, że czynnikiem biologicznym lub chemicznym są patogeny, zwłaszcza wirusy, bakterie, grzyby białka i ich fragmenty w tym enzymy, przeciwciała, białka budulcowe, fragmenty przeciwciał, peptydy, affibody, kwasy nukleinowe i sekwencje nukleotydowe w tym jedno i dwuniciowe DNA, RNA, aptamery, krótkie sekwencje nukleotydowe kwasy tłuszczowe, cukry, glikolipidy, glikopeptydy, inne organiczne związki chemiczne takie jak pestycydy, antybiotyki, związki nieorganiczne, w tym metale ciężkie.