TW201124530A - IMP-3 oligopeptides and vaccines including the same - Google Patents

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201124530 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於生物科學領域，更特別針對癌症治療領 特別是，本發明係關於新穎之寡胜肽，其當作癌症疫 苗以及治療與預防腫瘤之藥物為非常有效。 【先前技術】 已證實CD8陽性細胞毒殺性τ淋巴球（cyt〇t〇xic T-Lymphocytes，CTLs )辨認來自建造於主要組織相容性抗 原複合物（major histocompatibility complex， MHC) class I分子上之腫瘤相關抗原（tum〇r_ass〇ciated ant igens，TAAs)的抗原決定位胜肽，且之後殺死腫瘤細 胞。自從發現黑色素瘤抗原（me 1 an⑽a ant igen, MAGE)家 族為腫瘤相關抗原之第一個例子，主要藉由免疫方法，已 發現許多其他腫瘤相關抗原（NPL 1/Boon T，Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon T & van der Bruggen P， J Exp Med 1996 Mar 1， 183(3): 725-9)。這 些腫瘤相關抗原的一些目前受到臨床發展為免疫治療標 的。

能誘導有效且專一之抗腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗 原的辨認成為於多種形式癌症中之胜肽疫苗接種策略 (vaccination strategies)之更進一步發展與臨床研究的 根據為正進行著（NPL 3，Harris CC，J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield LH 201124530 et aJ., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers JL et al,, Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al. , J Immunol 1996 May 1, 1 56(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al. , Cancer Res 1 997 Oct 1 5, 57(20 )： 4465-8; NPL 8, Fujie T al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi M et al., Int J Cancer 1 9 99 May 5, 8 1 ( 3 ): 459-66; NPL 10, Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94)。迄今為止，已有許多利用這些與腫瘤相關抗原衍 生之胜狀的床5式驗報導。不幸地，到目前為止，在這些 癌症疫苗試驗中僅能觀察到很低的客觀反應率（〇b jective response rate) (NPL 11, Belli F et aJ., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20)： 4169-80; NPL 12, CouliePGei^y., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13, Rosenberg SA ei a/.， Nat Med 2004 Sep， 1 0(9): 909-1 5 )。因此， 仍然需要新穎之腫瘤相關抗原的鑑定來作為免疫治療標 的0 為此目的’已於小細胞肺癌（small cen iung cancers， SCLCs)(PTL 1/W02007/013665)與食道癌（PTL 2/W02007/01 3671 )中鑑定一些向上調控之基因，經由使用 基因體寬度cDNA微陣列之基因表現輪廓的分析。這些基因 已被足地研究，隨著自其中鑑定出為免疫治療標的之好的 候選物的希望。為了於免疫治療中專一以癌細胞為標的， 較佳之腫瘤相關彳几原應為主要由癌細胞所表現，而正常健 201124530 康組織具有限制或不表現。 作為免疫治療標的之較佳的腫瘤相關抗原係對於 細胞增殖與存活為必須的那些。此腫瘤相關抗原可將廣： 敘述之癌細胞免疫逃脫（lmmuneescape)的風險最小化，而 癌細胞免疫逃脫為治療性驅使免疫筛選的結果，歸因於腫 瘤相關抗原的刪除、突變或向下調控。 藉由使用含有23, 040個基因之基因體寬度cDNA微陣 列的基因表現輪廓，IMP-3蛋白質激酶（IMP-3 )被鑑定為 在肺癌中向上調控之基因之一（NPL3/KikucM at al.，int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805)。IMP-3 之表現為於 大於8 0 %之具有肺癌與食道癌之病患中的腫瘤細胞中被向 上調控。同時，IMP-3不被表現於任何其他正常重要器官 中，除了睪丸。整體而言，這些事實建議IMP-3可適用為 具有IMP-3向上調控之腫瘤之病患的癌症免疫治療的標 的。先前已揭露來自IMP-3之胜肽其具有專一之抗外生表 現IMP-3與HLA-A* 0201之標的細胞的細胞毒殺性T淋巴球 誘導能力（參見W02008/1 02557(PTL3)，於此重複其結果 為第4圖）。 【引用文獻】 專利文獻（Patent Literature) [PTL 1] W02004/031413 [PTL 2] W02007/013665 [PTL 3] W02007/013671 6 201124530 [PTL 4] W02006/090810 [Non Patent Literature] [NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 [NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1 996 Oct 16, 88(20): 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH et al. , Cancer Res 1 999 Jul 1, 59(13): 3134-42 [NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1 999 Nov 1, 59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al. , J Immunol 1 996 May 1, 156(9): 3308-14 [NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1 997 Oct 15, 57(20): 4465-8 [NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1 999 Jan 18, 80(2): 169-72 [NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 [NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 201124530 [NPL 11] Belli F et al. , J Clin Oncol 2 0 02 Oct 15, 20(20): 4169-80 [NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 [NPL 14] T. Kikuchi et al. , Oncogene. 2003 Apr 10; 22(14): 2192-205 【發明内容】 本發明部分基於發現新穎之胜肽，其可作為免疫治療 之標的。由於腫瘤相關抗原（tumor-associated antigens， TAAs)有時被免疫系統感知為“自身”且因此沒有天生的 免疫抗原性（immunogenicity)，所以適合標的的發現極度 重要。已確認IMP-3在如肺癌及食道癌的癌症中為向上調 控，為了進一步分析，本發明以被GenBank登錄編號 NM_006547. 2 (SEQ ID NO: 21)的基因編碼之 imp-3 蛋白質 (SEQ ID NO: 22)為標的。特別是，包含強力誘導細胞毒殺 性T淋巴球對對應的分子產生專一性反應的抗原決定位胜 肽的/#户基因產物，其被選擇出來研究。在本發明的說 明書内容中’胃邊血液單核細胞（咐响㈣bi〇〇d mononuclear cells，PBMCs)取得自健康的捐贈者，其受 到本發明之胜肽的刺激。專一性辨認經個別之胜肽脈衝的 8 201124530 HLA-A2 陽性目標細胞的細胞毒殺性τ淋巴球已被 建立，且HLA-Α2 限制的抗原決定位胜肽也已被 確認，其可誘導抗表現於腫瘤細胞表面的丨Mp_ 3所產生之 強而專一的免疫反應。整合來說，這些結果顯示IMP_3為 強效致免疫性，且其抗原決定位為腫瘤免疫療法的有效標 的。 因此，本發明之一目的為提供具有具有細胞毒殺性τ 淋巴球誘導能力之寡胜肽，其為擇自下列序列辨識號卜3、 5及6的胺基酸序列。此外，本發明亦將經修飾的胜肽納 入考罝，上述胜肽具有擇自下列序列辨識號1、3、5或6 的胺基酸序列，其中一、二或多個胺基酸被至少一個突變 擇自由下列所組成之群組：取代、刪除、插入及加入，突 變或替換，只要所產生的經修飾之胜肽維持原本之細胞毒 殺性Τ淋巴球誘導能力。 當投予一個體時，本發明之寡胜肽被表現於抗原呈現 細胞之表面，以便誘導將分別之胜肽做為目標之細胞毒殺 性Τ淋巴球。因此，本發明之一目標為提供表現任何本發 明之胜肽的抗原呈現細胞以及外吐小體，以及其相關之誘 導抗原呈現細胞的方法。 藉由本發明之IΜ Ρ - 3养胜肽或編碼出此寡胜肽的多核 苷酸’以及表現這類ΙΜΡ-3寡胜肽之外吐小體及抗原呈現 細胞’來誘導抗腫瘤免疫反應。因此，本發明尚有一目的 為提供藥學試劑或藥學組合物，其包含上述之寡胜肽或編 碼出此寡胜肽的多核苷酸、或相關之外吐小體及抗原呈現 201124530 細胞，作為其有效成分。本發明之上述藥學試劑或藥學組 合物特別可作為疫苗使用。 本發明之另一目的為提供一用於擇自下列群組織至 ^ 目的之方法：癌症（腫瘤）的治療、防治（例如預防）、 及預防其手術後之復發’以及其誘導細胞毒殺性τ淋巴球 的方法、誘導抗腫瘤免疫性的方法，這類方法包括下列步 驟：投予IMP-3寡胜肽、編碼出IMP-3寡胜肽之多核苷酸、 或表現IMP-3多胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞、或本發 明之藥學試劑或組合物’至有需要之個體中。此外，本發 明之細胞毒殺性.T淋巴球亦可作為一抗癌疫苗使用。目標 癌症的例子包括，但不限於肺癌及食道癌。 具體地，本發明提供下列[1 ]至[29 ]; [U —種經分離的寡胜肽’包括序列辨識號：1、3、5 及6之胺基酸序列。 [2 ] —種經分離的寡胜肽’具有細胞毒殺性τ淋巴球 誘導能力，其中該寡胜肽係包括選自下列序列辨識號：1、 3、5及6之胺基酸序列，其中1、2或數個胺基酸被取代、 刪除及/或加入。 [3]如第[2]項所述之經分離的寡胜肽，其中該寡胜肽 具有一或兩者之下列特徵： (a) 自N端之第二個胺基酸為白氨酸或曱硫丁氨酸； 以及 (b) C端胺基酸為纈氨酸或白氨酸。 [4 ] 一種經分離之多核苷酸，其編碼出第[i ]至[3 ]項 10 201124530 之任一項的寡胜肽。 [5 ] —種誘導具有細胞毒殺性τ淋巴球誘導能力之抗 原呈現細胞的方法，其中該方法係利用第[1 ]至[3 ]項之任 一項所述之募胜肽。 [6 ]如第[5 ]項所述之誘導具有細胞桊殺性T淋巴球 誘導能力之抗原呈現細胞的方法，其中該方法包括一步 驟，該步驟係擇自由下列所組成之群組： (a) 利用第[1]至[3]項之任一項所述之寡胜肽與一抗 原呈現細胞相接觸，以及 (b) 將編碼出第[1 ]至[3 ]項之任一頊之寡胜肽的一多 核苷酸引入一抗原呈現細胞。 [7 ]如第[5 ]或[6 ]項所述之誘導具有細胞毒殺性τ淋 巴球誘導能力之抗原呈現細胞的方法，其中該抗原呈現細 胞至少表現一 HLA-A2抗原於其表面上。 [8] -種誘導細胞毒殺性丁淋巴球的方法，係利用第 [1]至[3]項之任一項所述之募胜肽。 [9] 如第[8]項所述之誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方 法’其中該方法包括一步驟，該步驟係擇自由下列所組 之群組： 利用一抗原呈現細胞 性Τ細胞相接觸，其中 丹1F该外吐小體於其表面上表現第[ 至[3 ]項之任一項所〜— . 負所述之泰胜肽與一人類白血球組織抗原 的複合物，以及 ⑻將-編碼出可形成一丁細胞受體次單元的多胜肽 11 201124530 之多核苦酸，引入第[1]至[3]項之任一項所述之寡胜狀與 一人類白血球組織抗原的複合物於一細胞表面上。 [1 0 ]第[9 ]項所述之誘導細胞毒殺性T淋巴球的方 法，其中該人類白血球組織抗原為HLA-A2。 [11 ] 一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其以第[i ] 至[3]項之任一項之該寡胜肽為標的。 [12 ]如第[11 ]項所述之細胞毒殺性τ淋巴球，其中所 述之細胞毒殺性T淋巴球可結合至第[1 ]至[3 ]項之任—項 所述之养胜肽與一人類白血球組織抗原的複合物於—細胞 表面上。 [13 ]如第[π ]項所述之細胞毒殺性τ淋巴球，其中該 人類白血球組織抗原為HLA-A2。 [14 ] 一種經分離之細胞毒殺性τ淋巴球，係藉由利用 第[1]至[3]項之任一項所述之寡胜肽來誘導。 [15 ]如第[14 ]項所述之細胞毒殺性τ淋巴球，其藉由 第[8]至[10]項之任一項所述之方法來誘導。 [1 6 ] —種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血 球組織抗原與第[1 ]至[3 ]項之任一項之寡胜肽的複合物於 其表面上。 [17 ]如第[16 ]項所述之抗原呈現細胞，其中該人類白 血球組織抗原為HLA-A2。 [18 ]如第[16 ]或[17 ]項所述之抗原呈現細胞，其藉由 第[5]至[7]項之任一項所述之方法來誘導。 [19 ] 一種於一個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方 12 201124530 法’其中該方法包括施予該個體一疫苗，該疫苗包括至少 一活性成分，該活性成分係擇自由下列所組成之群組. (a) —或多個第[1]至[3]項之任一項之募胜肽，戍_ 其免疫活性片段； (b) —或多個編碼出第[1]至[3]項之任—項之募胜狀 的多核苷酸，或一其免疫活性片段； (C) 一或多個第[11]至[15]項之任一項所述之經分離 之細胞毒殺性T淋巴球；以及 (d) —或多個第[1 6 ]至[18 ]項所述之經分離之抗原呈 現細胞。 [20]如第[19]項所述之於一個體中誘等—抗癌症之 免疫反應的方法，其中所述之個體為HLA-A2陽性。 [21 ] —種藥學試劑，用於癌症之治療及/或防治，及/ 或預防其手術後復發，其中該試劑包括—藥學上可接受之 載體，以及至少一活性成分，其擇自由下列所組成之群組： (a) —或多個第[1]至[3]項之任一項之寡胜肽，或一 其免疫活性片段； (b) —或多個編碼出第[n至[3]項之任一項之寡胜肽 的多核苷酸’或一其免疫活性片段； (c) —或多個抗原呈現細胞，其表現第[丨]至[3 ]項之 任項工頁之寡胜肽與一人類白血ί求組織抗原白㈣复合物於其 表面上；以及 (d) —或多個細胞毒殺性τ淋巴球，其可結合至第[)] 至[3]項之任一項㈣之寡胜肽與一丨类員白血i组織抗原 13 201124530 的複合物於一細胞表面上。 [22 ] —種藥學試劑’用於誘導細胞毒殺性τ淋巴球， 其中該試劑包括一藥學上可接受之載體，以及至少—活性 成分擇自由下列所組成之群組： (a) —或多個第[川至[3]項之任一項之寡胜肽，或一 其免疫活性片段； (b) —或多個編碼出申請專利範圍第[丨]至[3 ]項之任 員之秦胜狀的多核苦酸，或一其免疫活性片段； (c) 或多個抗原呈現細胞，其表現申請專利範圍第 [1 ]至[3 ]項之任一項所述之寡胜肽與一人類白血球組織抗 原的複合物於一細胞表面上。 [2 3 ]如第[21 ]或[2 2 ]項所述之藥學試劑，其被配製來 用以投予一個體’其中所述之個體為hLA_A2陽性。 [24] 如第[21]至[23]項之任一項所述之藥學試劑，其 為一疫苗。 [25] —種活性成分的用途，其中該活性成分擇自由下 列所組成之群組： (a) —或多個第[1]至[3]項之任一項之寡胜肽； (b) —或多個以一可表達的形式編碼出第[丨]至[3]項 之任一項之寡胜肽的多核苷酸； (c) 一或多個抗原呈現細胞，其表現第[丨]至[3]項之 任一項之募胜肽與一人類白血球組織抗原的複合物於其表 面上；以及 (d) —或多個細胞毒殺性τ淋巴球，在製造一治療癌 14 201124530 症之藥學組合物或試劑中，其可結合至第[1 ]至[3 ]項之任 一項所述之寡胜肽與一人_白血球組織抗原的複合物於一 細胞表面上。 [2 6 ]如第[2 5 ]項所述之活性成分的用途，其中該藥學 組合物或試劑被配製來用以投予一個體，其中所述之個體 為HLA-A2陽性。 [27 ] —種經分離之寡脞肽，其包括一胺基酸序列擇自 由下列序列辨識號：1、3、5及6所組成之群組，用於一 個體中的癌症之治療及/或防治，及/或預防其手術後復 發，其中該個體為HLA-A2陽性。 [2 8 ] —種經分離之寡胜肽，其包括一胺基酸序列擇自 由下列序列辨識號：1、3、5及6所組成之群組，其中i、 2或數個胺基酸被取代、刪除及/或加入，且該寡胜肽具有 細胞毒殺性T淋巴球之誘導能力，其用於一個體中的癌症 之'°療及/或防治，及/或預防其手術後復發，其中該個體 為HLA-A2陽性。 [29]如第[28]項所述之經分離的募胜肽，其中該寡胜 肽具有或兩者之下列特徵： ()自之第二個胺基酸為白氨酸或甲硫丁氨酸； 以及 (b) C端胺基酸為纈氨酸或白氨酸。 除了 卜、+. ，、上返，¥以下詳細說明被閱讀並結合伴隨之圖式 與貫施例，夫益^ 不發明之其他目的與特徵會變的更完全地明 白然而，可瞭解的是，上面之本發明内容與以下之詳細 15 201124530 說明兩者為示範之實施例，並不限制本發明或本發明其他 替代實施例。特別是，當關於一些特定實施例於此敘述之 本發明，可以瞭解的是，敘述為本發明之說明，且並不建 構為本發明之限制。各種修飾與應用可被熟悉此技藝人士 想到，而無背離本發明精神與範圍，如所附申請專利範圍 所述。同樣地，本發明之其他…特徵、好處與優點自 此内容與下述之特定實施例，為清楚的，且對於熟悉此技 藝人士而言可立即明白。此種㈣、特徵、好處與優點自 上：結合伴隨實施例、資料、圖式與所有要被自其單獨或 隨著考慮引人;iF、此之參考文獻而描述的所有合理推論為清 楚的。 【實施方式】 雖然於本發明實施例之實施或測試中可使用相似0 同於在此敘述之那些的任何方法與材料，但是現在敘述較 佳之方法7L件與材料。然而在敘述本發明材料與方法之 刖，需瞭解的是，本發明並不限於敛述於此之特定大小、 形狀、尺寸、材料、方^ 方法予、步驟荨，例如按照慣例實驗 法及/或最佳化可將其變更。.兩 、 ^ 也而瞭解的是’於此敘述中使 用之專門用語僅是為了私、+w± , 马了敛逑特別之變化形式或實施例，且 非用來限定本發明之申請專利範圍。

各個於本說明書中與B 挺及之各刊物、專利或專利申請的 發明’於此處被具體引用作 、 乍為參考文獻。然而，於此處並 沒有被解釋為承認本發明盞 、, 賞奶無法主張優先發明。 16 201124530 除非特別定義，於此使用屬與本發明之所有技術或、 子用°°為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。如、 發生抵觸，將以本發明說明書，包括定義，將會控制。此 外，該材料、方法、以及實施例僅用於說明而非用於限定 於此使用之單字“一，，與“該，，意指“至少—，， 除非 以別的方式明確指出。 於此可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽，，與“蛋 白質意指胺基酸殘基之一聚合物。此用語適用於胺基酸 聚合物，於其中一或多個胺基酸殘基為經修飾之殘基戈非 自然發生之殘基，例如對應自然發生胺基酸之人工化學模 仿物’與自然發生胺基酸聚合物。 有時候於本說明書中所使用之”寡胜肽”—辭，係指 長度具有20或少於20個，典型為15個或少於15個的胺 基酸殘基之胜肽，且其典型上係由約8至丨丨個殘基，通常 為9或10個殘基所構成。在整本說明書中，除非特別說明， 否則”胜肽”一辭係與”寡胜肽”一辭同義。 於此處所使用之用語“胺基酸”意指自然發生與合成 之胺基酸，及胺基酸類似物與胺基酸模仿物，其與自然發 生之胺基酸起相似作用。自然發生胺基酸為基因密碼所編 碼的那些與於細胞中在轉譯後被修飾的那些（例如羥脯氨 酸（hydroxypi^line) 、 T -羧基谷氨酸 (gamma-carboxyglutamate)與 〇-碟 絲 & 酸 (Ο-phosphoserine))。“胺基酸類似物，，一辭意指具有與 201124530 自然發生胺基酸相同之基礎化學結構（一 〇：碳鍵結至一 氫、一叛基、一胺基與一 R基）的化合物，但具有一經修 飾之R基或經修飾之骨架（例如，同絲氨酸（homoserine)、 降免氨酸（norleucine)、曱硫丁氛酸（methionine)、亞石風 (sulfoxide)、甲基硫氨確（methionine methyl sulfonium))。措辭“胺基酸模仿物”意指化學化合物其 與一般胺基酸具有不同結構，但有相似的功能。 可藉由由 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature

Commi ss i on所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符 號來指出於此處之胺基酸。 於此處可互相替換使用用語“基因，’、“多核普 酸”、“核苷酸”與“核酸”，且除非特別指出，否則其 與胺基酸相似，乃藉由其一般接受的單一字母編碼來表示。 此處使用之用語”試劑（agent )，，及“組合物 (composition) ”可互相替換使用，其意指一產物’包括 於特定量中特定成分，與任何產物其直接或間接來自於特 定量之特定成分的組合。此用語與”藥學的，，修飾與相 關，意指涵蓋一產物’其包括一活性成分與形成載體：丨, 性成分，及任何產物其直接或間接來自任兩個或多個成伤 之組合、複合或聚集’或來自一或多個成分之解離，或來 自一或多個成分之反應或相互作用的其他形式。因此，名 本發明内容中’可互相替換使用用語”藥學試劑”以石 “藥學組合物，，’其意指藉由混合本發明之產物與藥學」 或生理上可接受之載體’所製成的任何試劑、物質、或乡」 18 201124530 合物。如此處所使用之措辭“藥學上可接受之載體，，或 “生理上可接受之載體”意指藥學上或生理上可接受之材 料、組合物、物質或裁劑，包括，但不限於一液體或固體 填充料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或套膜材料，其與自一器 官或身體之一部分攜帶或運輸標的支架的多重藥效基團 (subject scaffolded polypharmacophores)至另一器官 或身體之一部分相關。 本發明之藥學試劑或組合物，提供了疫苗之特別用 途，，。在本發明的内容中，，’疫苗（vaccine)，，一辭又稱為 免疫原性組合物（i_un〇genicc〇mp〇siti〇n)，，，意 才曰物質，其在接種至動物方面，具有降低抗腫瘤免疫性 之功效。 此處所述之有效成分（act i ve ingredient)，，一辭， 係指在試劑或組合物中的物質，其具有生物或生理活性。 特別是’在藥學試劑或組合物中，”冑效成分，，意指表現 目‘之蕖予功效（〇bjective pharmac〇i〇gicai effect) 的物質。例如，以用於治療或預防癌症的藥學試劑或組合 物來5兄，在試劑或組合物中的活性成分會直接或間接在癌 症細胞及/或組織上，產生至少一種生物或生理作用。較佳 地，這樣的作用可包括降低或抑制癌症細胞的生長、破壞 或殺死癌症細胞及/或組織等等。典型上’有效成份的間接 影響與細胞毒殺性T淋巴球（CTLs)辨認或殺死癌細胞有 關。在制定之前，”有效成分，，又稱為，，主體（—1 k )，，、’， 樂物（drug substance) ” 或”技術產物（technical 19 201124530 product) ” 。 除非以別的方式定義’用語“癌症”意指過度表現 /#户-c?基因之癌症，其例子包括，但不限於肺癌（lung cancer)與食道癌（esophageal cancer)。 除非以別的方式定義，於此可替換使用且以別的方式 特別指出用語“細胞毒殺性T淋巴球”、“細胞毒殺性τ 細胞與‘‘ CTL”以意指T淋巴球之次族群，且除非以別的 方式指出，意指T淋巴球之次群組（sub-group)可辨認非自 身細胞（例如，腫瘤細胞、被病毒感染之細胞），且誘導 這些細胞死亡。 除非特別定義，於此使用之用語“套組”被使用於關 於試劑與其他材料之組合。與此考慮之套組包括微陣列、 晶片、標誌等。並無打算使用語“套組”限制於試劑及/ 或材料之特定組合。 如此處所使用，在文中的患者或病人’其描述措辭” HLA-A2陽性”意指此患者或病人擁有同型接合 (homozygously )或異型接合（heterozygously)的 HLA-A2 抗原基因，且HLA_A2抗原表現於患者或病人的細胞中，作 為HLA抗原。 本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之“治 療與預防之内容中’一治療被視為“有效”，若其 導致臨床優點’例如於基因之表現中的減少、或: 個體中癌症之大小、普遍程度（prevalence)或轉移潛力的 減少。當治療為預防性（prophylacticaUy)提供時，“有 20 201124530 效”意指減緩或預防癌症形成’或預防或減輕癌症之臨床 症狀。有效性被確認於相關之診斷或治療特定腫瘤形式的 任何已知方法。 本發明之方法與組合物之範圍提供用途 治，，與“預防，，之内容中，此類用詞為與此交意： 任何活性，其減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率。防 治與預防可發生於“初期、第二期與第三期預防層級，，。 初期防治與預防避免了疾病之發展，而第二期與第三期層 級之防治與預防包括藉由恢復功能與減少疾病相關併： 症，以疾病之發展與症狀之浮現及減少已建立之疾病之負 向發展的防治與預防為目的。或者，治療或預防可包括一 f範圍之預防疾病治療’其以減緩特別疾病之嚴重度為目 仏’例如減少腫瘤之增殖與轉移。 在本發明内容中，癌症之治療及/或預防，或，及/或 其手術後復發的預防包括任何下列步驟，例如癌細胞之手 術移除、似癌細胞之生長抑制、腫瘤之衰退或退化、痒發 生之減缓與抑制的誘導、腫瘤退化與血管新生抑制:誘 導。癌症之有效治療及/或預防減少致死率與改善 二 =個體的預後、減低癌症標記於血液中的程度與減緩:隨 者癌症之可積測症狀。例如，症狀之減輕或改 治療及/或預防，苴包括 效 -已括10%、20%、30%或更加減輕， 或達到一穩定疾病的狀態。 在：：：内容中’用語“抗體”意指免疫球蛋白心 又專-與選定蛋白質或其片段反應…抗體可包括 21 201124530 人類抗體、靈長類抗體、嵌合抗體（chimeric an1：ib〇dy)、 雙專一抗體（bispecific antibody)、人源化抗體、與其他 蛋白質或放射標誌融合之抗體，與抗體片段。此外，此處 之抗體被使用於最大效用且特別包含完整單株抗體、多株 抗體、形成自至少兩個完整抗體之多專一抗體 (multispecific antibody)(例如雙專一抗體）與抗體片 段，只要其存在所需生物活性。一 “抗體，，意指所有之種 類（例如，IgA、IgD、IgE、IgG 與 IgM)。 11.胜肽 為了證明來自IMP-3之胜肽作用如一被細胞毒殺性τ 淋巴球（CTLs)所辨認之抗原，分析來自ΙΜρ_3之胜肽（序 列辨識號_ 2 2 )以確定是否其為由一般遇到hlΑ對偶基因 (a 11 e 1 e)之HLA-A2 (人類白血球組織抗原）（例如]抑別7 及乂抑烈沒）所限制之抗原決定位（antigen epi topes )(Date Y et aJ., Tissue Antigens 47： 93-101, 1996; Kondo A et al. , J Immunol 155: 430 7-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 1 52 : 391 3-24，1 994)。確認來自 IMP-3 之 HLA-A2 結合胜肽的候選物，根據其對HLA-A2之結合親和力 (binding affinities )。在藉由以載有這些胜肽之樹突 細胞（dendritic cells，DCs)於體外刺激 Τ細胞後，使用各個胜肽成功建立細胞毒殺性Τ淋巴球： 這些被建立的細胞毒殺性Τ淋巴球表現出強而專一之 抵抗目標細胞的細胞毒殺性Τ淋巴球之活性，而此目標細 22 201124530 胞受到分別的胜肽脈衝，且細胞亦表現出HLK_A*〇2〇i以及 IMP-3。此處這些結果證明imp_3為一由細胞毒殺性τ淋巴 球所辨認之抗原，且被測試之胜肽為由HU — A2 (例如 胸撕及#讓）限制《IMP-3的抗原決定位胜肽 (epitope peptides)。 由於/#户-《?基因於大多數的癌症組織中，如肺癌及食 道癌，被過度表現，所以其為一良好之免疫治療標的。因 此，本發明提供對應於IMP-3之細胞毒殺性τ淋巴球辨認 之抗原決定位的寡胜肽，如九胜肽（n〇napeptides，胜肽 由九個胺基酸殘基所組成）與十胜.肽（decapeptides，胜 肽由十個胺基酸殘基所組成）。特別是，本發明之寡胜肽 的較佳實施例包括擇自具有下列序列辨識號：丨、3、5及6 之胺基酸序列的胜肽。 通常可使用現今於例如網路可得之軟體程式，例如於 Parker IZ et a 1. , J Immunol 1994 Jan 1, 152(1)： 163-75, 中所敘述的那些，來計算於電腦模擬中（加幻.//c〇)介於 各種胜肽與HLA抗原間之結合親和力。例如，如於概述於， 例如，Lafuente EM 以 s/.， Current Pharmaceutlcal

Design，2009，15，3209-3220 中之 Parker KC 以 a/.，J

Immunol 1 994 Jan 1，1 52( 1 ): 1 63-75,以及 Kuzushima K e i a人 ’ B1 ood 2001，98(6): 1872-81 中所述可測量與 hla 抗原之結合親和力。測量親和力之方法敘述於，例如於

Journal of Immunological Methods, 1995, 185· 181-190· 與 Protein Science, 2000，9: 1 838-1846 中。因此可藉 23 201124530 由利用此類已知程式來辨認本發明，其涵蓋與HLA結合的 IMP-3胜肽。 本發明之寡胜肽可於側面具有額外之胺基酸殘基，只 要所產生之胜肽維持它們的細胞毒殺性T淋巴球誘導能 力°這類具有細胞毒殺性T淋巴球誘導能力的胜肽，典型 上少於約4 0個胺基酸，通常少於約2 〇個胺基酸’更常少 於約15個胺基酸。在本發明之寡胜肽側面的特別胺基酸序 列（例如’擇自具有下列序列辨識號：1、3、5及6之胺 基酸序列的胜肽）並非限定但可由任何種類之胺基酸所構 成’只要它們不減少原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘導 能力。因此’本發明亦提供了具有細胞毒殺性T淋巴球誘 導能力的胜肽、以及具有擇自下列序列辨識號：1、3、5 及6之胺基酸序列的胜肽。 一般而言’於一蛋白質中一、二或多個胺基酸之修飾， 不會影響蛋白質的功能，且在一些例子中，甚至增強原始 蛋白質所需之功能。事實上，已知經修飾之胜肽（即，當 與原始參考序列比較時，包括胺基酸序列之胜肽，其中一、 二或多個胺基酸殘基已被修飾（即，取代、刪除、加入或 插入））維持原始胜肽的生物活性（Mark ef a/.，Proc Nat 1 Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith,

Nucleic Acids Res 1982, 10： 6487-500;

Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1 982, 7 9 : 6 4 0 9 -13)。因此，於一實施例中，本發明之募胜肽可 具有細胞毒殺性T淋巴球誘導能力，與具有擇自下列序列 24 201124530 辨識號：1、3、5及6之胺基酸序列的胺基酸兩者，其中 加入、插入、刪除及/或取代一、二、或多個胺基酸。 熟悉此技藝人士認定對一胺基酸序列改蠻—一 又 早一私基 酸或一小百分比之胺基酸的個別加入或取代，傾向產生保 存原始胺基酸支鏈的特性。因此，它們通常被稱為“保守 取代(conservative substitutions)” 式“仅 一 _ 保寸修飾 (conservative modifications)”，其中—蛋白質之改變 產生一具有與原始蛋白質之性質與功能相似的經修飾蛋白 質。提供功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所 熟知。所欲之保守的胺基酸支鏈的特徵的例子包括，例如 疏水胺基酸（A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、親水胺基酸（r D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)與具有下列共同官能基或 特徵之支鏈：一脂肪族支鏈（G，A，V，L，I，P); —含經 基支鏈（S，T，Y);含硫原子支鏈（C，M);含叛酸與胺基支 鏈（D，N, E，Q);含鹼支鏈（R，K，H);以及含芳香族的支 鏈（Η，F, Y，W)。此外’下列八個族群各包含於本技術領 域中被接受為保守取代之胺基酸： 1) 丙氨酸（Α)、甘氨酸（G); 2) 天門冬氨酸（D)、麩氨酸（Ε); 3) 天門冬醯胺（Ν)、麩胺醯胺（Q); 4) 精氨酸（R)、離氨酸〇〇 ; 5) 異白氨酸（I)、白氨酸（L)、曱硫丁氨酸（μ )、纈 氨酸（V); 6) 苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Υ)、色氨酸（W); 25 201124530 7) 絲氨酸（S)、蘇氨酸（T);以及 8) 半胱氨酸（C)、甲硫丁氨酸（Μ)(參見Creighton， Proteins 1984)。 此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而， 本發明之胜肽並不限於此’且可包括非保守修飾，只要經 修飾之胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘導能 力。更進一步而言’經修飾之胜肽不排除多形變體 (polymorphic variant)之細胞毒殺性τ淋巴球誘導的胜 肽、種間同質體（interspecies homologues)與 IMP-3 對偶 基因（al leles)。 為了維持必須之細胞毒殺性T淋巴球誘導能力，可修 飾（插入、删除、加入及/或取代）一小數目（例如一、二 或數個）或小百分比之胺基酸。此處用語“數個’，指5或 更少個胺基酸’例如4個、3個或更少。被修飾之胺基酸 之百分比較佳為20%或更少，例如，15%或更少，甚至更 佳為10%或更少，或1至5%。 當使用於文中之免疫治療時’本發明之胜肽應被表現 於一細胞或外吐小體之表面上’較佳作為一具有HLA抗原 之複合物。因此’較佳為選擇胜肽其不止誘導細胞毒殺性 T淋巴球也具有對HLA抗原之高親和力《為達此目的，胜 肽可藉由胺基酸殘基之取代、插入、刪除及/或加入來修飾 以產生具經改善之結合親和力的經修飾之胜狀。除了自然 表現之胜肽外’由於已知藉由結合至HLA抗原表現之胜肽 序列的規則（J Immunol 1 994，152: 391 3; Immunogenetics 26 201124530 1 995，41: 178; J immunol 1 994，1 55: 43〇7),能夠將基 於此規則之修倚引入本發明之致免疫性胜肽。 例如為了增加HLA-A24結合親和力，可需要以白氨 酸或甲硫丁氨酸取代N端的第二個胺基酸，及/或以纈氨酸 或白氨酸取代位於C端之胺基酸。因此，本發明也包括具 有序列辨識唬.1、3、5及6之胺基酸序列的胜肽，其中 具有上述序列辨識號之胺基酸序列的胜肽的N端的第二個 私:基^被白氣酸或甲硫丁氨酸取代’及/或其中[端胺基酸 被纈氨酸或白氨酸取代。 不止可於末端胺基酸，也可於胜肽之潛在Tcr辨認位 置將取代引入。一些研究已證實於在一胜肽中的胺基酸取 代可等於或比原來更好，例如CAH、p5 3 ( 264_;:⑴Her_2/neu ( 3 6 9 - 3 m或 gplOO (2。9_217) (Zaremba 以 cancei· Res· 57, 4570 4577, 1997, T. Κ. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1 ; 1 68(3):1 338-47. , S. 〇. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53， 307-314)。 本發明也考慮將胺基酸加入本說明書所揭示之序列 中。例如’一、二個或數個胺基酸也可被加至所述胜肽之 N及/或C端。本發明也包括具有高HLA抗原結合親和力且 維持細胞毋殺性T淋巴球誘導能力之此種經修飾的胜肽。 然而’當胜肽序列與一具有不同功能之外生或内生蛋 白質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導副作用，例 27 201124530 如自體免疫疾病（aut〇immune disorders)及/或抗特定物 質之過敏症候群（al 1 ergic Sympt〇ms )。因此，較佳為使 用可得之資料庫優先執行同源搜尋（h〇m〇i〇gy searches )，以避免胜肽之胺基酸序列符合其他蛋白質之 胺基酸序列的情況。當與目標胜肽比較時，不存在具有一 或兩個胺基酸之差異的胜肽之同源搜尋變得清楚時，為了 增加其與HLA抗原之結合親和力，及/或增加其細胞毒殺性 T淋巴球誘導能力而不具副作用之任何危險，可修飾目標 胺基酸。 雖然如上述之具有對HLA抗原南結合親和力的胜肽被 預期為问效J3b，但根據作為指不之南親和表現而被選擇之 候選胜肽，更進一步被測試細胞毒殺性τ淋巴球誘導能力 的表現。此處措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘導能力”意指 當表現於抗原呈現細胞（antigen-presenting cel Is )時， 胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球的能力。此外，“細胞毒殺 性Τ淋巴球誘導能力”包括胜肽誘導細胞毒殺性Τ淋巴球 活化（activation )、細胞毒殺性 T 淋巴球增殖 (proliferation)、促進細胞毒殺性T淋巴球分解目標細 胞與增加細胞毒殺性T淋巴球IFN- τ產生的能力。 藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞（例如B_ 淋巴球、巨嗤細胞與樹突細胞）或更專一地來自人類周邊 血液單核細胞之樹突細胞’並在以胜肽刺激之後與CD8陽 性細胞混合’且之後測量由抗目標細胞之細胞毒殺性T淋 巴球產生並釋放之1FT來達成細胞毒殺性τ淋巴球誘導 28 201124530 能力的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類 HLA之基因轉殖動物（例如，於BenMohamedL, KrishnanR， Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8)： 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A^〇2〇l/DRl transgenic mice： dependent on HLA class II restricted T(H) response 中的描述）。例如可以”Cr放射性標示（radi〇_Ubeled) 目標細胞，且可從自目標細胞釋放出的放射活性計算細胞 毒殺活性。或者在攜帶經固定之胜肽之抗原呈現細胞存在 下’藉由測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放的 IFN-r，且使用抗IFN_r單株抗體來使於培養基上之抑制 區可見來分析細胞毒殺性T淋巴球誘導能力。 由於如上述測試胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球誘導能 力，發現對於HLA抗原具有高結合親合力的胜肽並不需要 具有高細胞毒殺性Τ淋巴球誘導能力。然而，在識別和評 估这些胜肽中，發現擇自下列具有序列辨識號：1、3、5 及6之胺基酸序列的寡胜肽，#同對於HU抗原具有高結 合親合力，表現出特別高的細胞毒殺性τ淋巴球誘導能 力 口此，這些胜肽乃作為本發明之較佳實施例的例證。 除了上述修飾之外，本發明胜肽也可連接其他物質， 要所產生之經連接的胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性τ 淋巴球誘導月b力。丨合物質的例子包括但不限於：胜肽、 脂質、糖與糖鏈、乙醯基’ Λ然與合成之聚合物等。本發 29 201124530 明胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化及/或磷酸化， 其提供修飾不損壞原始胜肽之生物活性。此修飾可被執行 以授予額外之功能（例如目標功能與傳送功能）或穩定多 胜肽。 例如，為了 /77 F/叩增加多胜肽之穩定度，本技術領 域已知引入D-胺基酸 '胺基酸模仿物或非天然胺基酸；此 内容也適合本發明之多胜肽。可以一些方法分析一多胜肽 的穩定度。例如，可使用肽酶與多種生物培養基，例如人 類血漿與血清’來測試穩定度（參見，例如Verhoef ，

Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986’ 11: 291-302)。 此外’本發明之胜肽可透過間隔物（spacers )或連接 物（1 inkers )連接至他胜肽。其他胜肽的例子包括但不限 於.竹生自腫瘤相關抗原（T A A s )的可誘導細胞毒殺性τ 淋的胜狀。或者’可透過間隔物或連接物連接二或更多個 本發明之胜肽。透過間隔物或連接物連接之胜肽可彼此相 同或相異。上述之間隔物或連接物的種類並非特別限定， 其可由胜肽所構成，更佳由具有一或多個裂解位（Cleavage site )的胜肽所構成，上述胜肽可被如胜肽晦 (peptidases)、蛋白酶（proteases)、以及蛋白晦體 (proteasomes )等酵素所切割。上述間隔物或連接物的例 子包括但不限於：AAY(P. M. Daftarianeia/. , JTrans Med 2007, 5:26) ^ AAA ' NKRK (R. P. M. Sutmuller et aj., J Immunol. 2000，165: 7308-731 5 )、或一至多個離氨酸 殘基（S. Ota ei a/.，Can Res. 62，147卜 1476，K. S. 30 201124530

Kawamura efw.， j Immun〇i_ 2002， 168: 5709-5715)。 本發明考慮了透過間隔物或連接物連接至其他胜肽的胜 肽。 ¥本發明之胜肽包括一半胱氨酸殘基（cyStejn res 1 due )’此胜肽傾向於透過半胱氨酸殘基的sjj基團之 間的雙硫鍵形成二聚體（d i mers )。因此，本發明之胜肽 的二聚體亦包含於本發明之胜肽中。 此處，本發明之胜肽也可被描述為“〗Mp_3多胜肽” 或“ IMP-3寡胜肽”。 Π I_ IMP-3胜肽之製備 使用熟知之技術可製備本發明之胜肽。例如，使用重 組DMA技術或化學合成可以合成方法地製備胜肽。本發明 胜肽可單獨合成，或由兩或多個胜肽所構成之較長多胜 肽。之後可分離此胜肽，即純化或分離以使其實質上無其 他自然發生之宿主細胞蛋白f與其片段或任何其他化學物 質0 例如聰基化、支鏈氧化或 胜肽之生物活性。其他修 本發明胜狀亦可包含修飾， 磷酸化，其提供修飾不損壞原始 D-胺基酸或 飾包括可用來，例如増加胜肽之血清半衰期之 其他胺基酸模仿物的合併。 但不限於 藉由根據經選擇之胺基酸序列的化學合成可獲得本發 明之胜肽。適合此合成之—般胜肽合成方法的例子包括， 31 201124530 (i) 胜肽合成（Peptide Synthesis) Interscience， New York, 1966; (ii) 蛋白質（The Proteins), Vol. 2， Academic Press, New York, 1976; (iii) 胜肽合成（Peptide Synthesis)(in Japanese), Maruzen Co., 1975; (iv) 胜肽合成之基礎與實驗（Basics and Experiment of Peptide Synthesis) (in Japanese), Maruzen Co., 1 985; (v) 藥學的發展（Development of Pharmaceuticals) (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991; (vi) W099/67288 ;以及 (vii) Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2， “Solid Phase Peptide Synthesis” ， Academic Press, New York， 1980， 100-118 。 或者，藉由適應任何已知產生胜肽之基因工程方法可 獲得本發明之胜肽（例如’ Morrison J，J Bacteriology 1977, 132: 349_51, Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu ei a/.) 1983, 101: 347-62)。 例如’首先製備一適合之載體’其懷有一多核苷酸其編碼 出目標胜肽於一可表達的形式中（例如，調控序列之下游 相當於啟動子序列）’並將載體轉殖進入適合之宿主細胞。 之後培養宿主細胞以產生感興趣之胜肽。使用一 /万 32 201124530 轉譯系統可i/7 f/ 產生胜肽。 IV.多核苷酸 本發明也提供一多核苷酸，其編碼出任何本發明上述 之胜肽。這些包括來自自然發生之基因（GenBank

Accession No. NM_00 6 547. 2 (序列辨識號：21 ))的核苷 酸序列與具有其之保守修飾之核苷酸序列的那些。此處措 辭“保守修飾之核苷酸序列”指序列其編碼出相同或實質 上相同之胺基酸序列。由於基因密碼的退化，一大份之功 月b相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。例如，密碼A、 GCC、GCG與GCU皆編碼出胺基酸丙氨酸。因此，於藉由 一密碼具體指定丙氨酸之每個位置，可改變密碼成為任何 上述不會改變編碼出之胜肽的對應密碼。此核酸變化為 沈默變化（si lent variation)” ，其為保守修飾變化的 一種。此處編碼出一胜肽之每個核酸序列也描述核酸之每 種可能的沈默變化。具有一般知識者明白於一核酸中各密 碼（除了 AUG ’其原本為曱硫丁氨酸之唯一密碼、與TGG 其原本為色氨酸之唯一密碼）可被修飾以產生一功能相同 刀子。因此編碼出一胜肽之核酸的各沈默變化係為於各所 揭露之序列中被暗示性描述。 本發明之多核苷酸可由DNA、RNA以及其衍生物所組 成如本技術領域所熟知’ DNA由鹼基所適當地組成，例 如自然發生之驗基A、T、c與G，而T於RNA中為U所取 代。A悉此技藝人士可瞭解非自然發生鹼基也被包含於本 33 201124530 發明中。 本發明之多核苷酸可編碼出本發明之多個胜肽，其彼 此之間具有或不具有介於中間之胺基酸序列。例如介於中 間之胺基酸序列可提供多核苷酸或經轉譯之胜肽—裂解位 (c 1 eavage s i te )(例如酵素辨認序列）。更進一步而言， 多核苷酸可包括任何額外之序列至編碼出本發明胜肽之編 碼序列。例如，多核苷酸可為一重組多核苷酸，其包括胜 肽表現所需之調控序列（regulatory序列s)，或可為一 具有標誌基因（marker genes )與此類之表現載體（質體， plasmid)。一般而言，可製備此重組多核苷酸，藉由經由 使用一般重組技術’例如聚合酶（P 〇 1 y m e r a s e s )與内切酶 (endonucleases )之多核苷酸操作〇 可使用重組與化學合成技術兩者以產生本發明之多核 苷酸。例如’藉由插進入一適合之載體（vect〇r )可產生 一多核苦酸’當轉染進入一勝任細胞（competent ceii) 時’其可被表現。或者，使用聚合酶鏈反應（p〇lymerase chain reaction，PCR)技術或表現於適合的宿主可將一多 核苷酸放大（參見，例如Sambrook a厶，Mol ecu 1 ar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，New York, 1 989 )。或者，使用固態技術如 於 Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1 992，48: 2223-31 1; Matthes ei a人，EMBO J 1 984，3: 801-5 中 所敘述’可合成多核苷酸。 包含本發明之多胜肽以及庇護載體的宿主細胞（host 34 201124530 cells)之載體亦包含於本發明中。 V.外吐小體（exosomes) 本如月進步地知:供稱為外吐小體（exosomes )的胞 間囊泡（intracellular vesicles)，其以複合物呈現，且 形成於其表面上之本發明的胜肽與人類白血球抗原之間。 利用例如 Japanese Patent Application Kohyo

Publications Nos. Hei 1卜51 0507 與 W099/03499 所詳述 的方法以及從接受治療和/或預防之病人所得的抗原表現 細胞可製備外吐小體。可以類似於本發明的胜肽之方式， 如疫苗般地接種。 包含在複合物中的人類白血球抗原形式必須與需要治 療和/或預防之個體的人類白血球抗原形式相符。高度表現 於曰本人與高加索人之中的HLA — A2型之使用有助於獲得 有效的結果’且次型’如HLA-A2 ( f與〆似％)也 k供用途。一般在臨床上，需接受治療之病患的人類白血 球抗原形式係進行預先的研究，這可適當地選擇對此抗原 具有咼度結合親合力的胜肽或經由抗原表現具有細胞毒性 T淋巴細胞誘導性的胜肽。此外，為了獲得具有高度結合 親合力與細胞毒性T淋巴細胞誘導性兩者的胜肽，可以天 然產生之TKK部分胜肽的胺基酸序列為基礎，然後進行i、 2或數個胺基酸的取代、插入、刪除及/或添加。 當運用本發明之外吐小體的HLA-A2 ( f /?別/)抗原， 具有擇自下列序列辨識號：1、3、5及6之胺基酸序列的 35 201124530 胜肽提供了特別的用途。 v I.抗原呈現細胞 本發明也提供經分離之抗原呈現細胞’其以形成於其 表面的HLA抗原與本發明之胜肽之間的複合物呈現。藉由 與本發明之胜肽接觸，或引入編碼出本發明之胜肽的寡胜 肽，抗原呈現細胞可來自受到治療及/或採取預防之病患， 且藉由其本身或與包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒 叙性T淋巴球之其他藥物結合可被投予如一疫苗。 抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突 細胞、蘭格罕細胞（Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞 與活化之T細胞，已知其表現蛋白質（pr〇te丨nace〇us)抗原 於其細胞表面以被淋巴球所辨認。由於樹突細胞為一典型 抗原呈現細胞，其於抗原呈現細胞中具最強之細胞毒殺性 T淋巴球誘導作用’樹突細胞供給使用如本發明之抗原呈 現細胞。 例如’藉由誘導來自周邊血液單核細胞（monocytes ) 之樹大細胞（DCs) ’然後以ez f/fo或FiFo 與本發明胜肽接觸（刺激），可獲得一抗原呈現細胞。當 本發明之胜肽投予至一個體，於個體身體内誘導表現本發 明胜肽之抗原呈現細胞》，，誘導抗原呈現細胞”一辭，包 括接觸（刺激）一細胞，其具有本發明之胜肽、或編碼出 這類胜肽的核苷酸’以便以形成於其表面的HLA抗原與本 發明之胜肽之間的複合物呈現。因此，藉由在將本發明胜 36 201124530 肽投予至一個體後，自此個體收集抗原呈現細胞可獲得本 發明之杬原呈現細胞。或者，藉由將自個體收集之抗原呈 現細胞與本發明胜肽接觸，可獲得本發明之抗原呈現細胞。 τ將本發明之抗原呈現細胞本身投予至—個體以誘導 於個體中之抗癌免疫反應，例如像疫苗一般。亦可將本發 明之抗原呈現細胞以與其他藥物結合的形式投予，上述其 他藥品包括包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性τ 淋巴球。心Fi丨/〇投予可包括以下步驟： a :自一第一個體收集抗原呈現細胞， b :以胜肽接觸步驟a之抗原呈現細胞，以及 c ·將胜肽承載之抗原呈現細胞投予一第二個體。 第一個體與第二個體可為相同個體或可為不同個體。 或者，根據本發明，提供本發明胜肽於製造—誘導抗原呈 現細胞之藥學試劑或組合物的料。此外，本發明：供製 造誘導抗原呈現細胞之藥學試劑或組合物的方法或製程， 其中’此方法包括混合或配製具有藥學上可接受之載體的 胜肽的步驟…卜，本發明尚提供了製造治療癌症（包括 肺癌及食道癌）的藥學試劑或組合物的方法或製程，其中， 此方法包括混合或配製具有藥學上可接受之載體的胜肽的 步驟。更進-#，本發明也提供用於誘導抗原呈現細胞之 本發明胜肽。自步，驟b獲得之抗原呈現細胞可做為疫苗被 投予至個體。本發明更提供了用來治療包括肺癌及食道癌 的癌症之胜肽。 根據本發明的一範例 本發明之抗原呈現細胞具高程 37 201124530 度細胞毒殺性τ淋巴球誘導能力。在用語“高程度細胞毒 殺性τ淋巴球誘導能力”中，高程度乃相對於藉由抗原呈 現細胞沒有與胜肽接觸或與無法誘導細胞毒殺性τ淋巴球 之胜肽接觸的程度而言。藉由包括//? 將包含編碼出 本發明之胜肽的多核苷酸的基因，轉移至抗原呈現細胞的 步驟的方法與上述之方法，可製備此種具高程度細胞毒殺 性τ淋巴球誘導能力之抗原呈現細胞。此經引入之基因可 為DNA或RNA开^式。引入方法的例子包括，並無特別限制， 可使用各種於此領域一般被執行的方法，例如脂質體轉染 (lipofection)、電穿孔法（electr〇p〇rati〇n)以及磷酸鈣 方法。更特別地，可執行其如CancerRes 1 996, 56: 5672_' J 1~1 1 998, 1 61: 5607-1 3; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of

International Publication No. 2000-509281 中所述。 藉由轉移基因進人抗原呈現細胞，基因遭遇轉錄、轉釋與 此類於細胞中，且之後所獲得之蛋白質藉自脈 或Class U處理，並經由一呈現途徑進行以與呈現胜肽。 上 原 明 原 在-較佳實施例中，本發明之抗原呈現細胞於其表面 ，以HLA抗原與具有擇自下列序列辨識號：丨、3、5及6 胺基酸序列的胜肽的複合物呈現。更佳為，本發明之抗 呈現細胞在其表面上樓帶HLA_A2抗原。換句話說，本發 之抗原呈現細胞，在其表面上更佳地表現出hla_a2抗 或者’與HLA抗原形成複合物之寡胜肽，可為具有擇 下列序列辨識號：卜3、5及6之胺基酸序列的募胜狀， 38 201124530 其中可取代、插入、刪除；5 / +丄 、夂/或加入一、二、或數個胺基酸； 例如，從N端算起的筮-加& & —個胺基酸，可被白氨酸或甲硫丁 氨酸取代，及/或C端惫其納-Γ 土酉欠可被顯氣酸或白氨酸取代。 v 11 毋殺τ細胞（細胞毒殺性τ淋巴球，CTLs) 抗任何本發明胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球增強π 以癌症細胞為標的之免疫反應，且因此就其本身而 言’可使用為疫苗以相似於胜肽之方式。@此本發明提供 經分離之細胞毒殺性Τ淋巴球其藉由任何本發明之胜肽專 一地被誘導或活化。 可藉由（1)將本發明胜肽投予至一個體，然後收集來 自該個體的細胞毒殺性了淋巴球；或⑺將來自個體之抗 原呈現細胞、與CD8陽性細胞、或周邊血液單核淋巴球， 與本發明之胜肽接觸（刺激），以獲得此種細胞 毒殺性Τ淋巴球，之後，將細胞毒殺性τ淋巴球分離。 藉由利用表現本發明之胜肽的抗原呈現細胞的刺激， 來誘導的細胞毒殺性Τ淋巴球，其可來自—受到治療及/ 或預防之病患，且藉由其本身，或藉由與包括本發明之胜 狀或為了調節作用之外吐小體的其他藥物結合可被投予。 所獲得之細胞毒殺性Τ淋巴球產生專一抗目標細胞的作 用’而此目標細胞其表現本發明胜肽，或者例如，用於誘 導之相同胜肽。換句話說，透過本身的Τ細胞受體（T ce丄J receptor )’所獲得之細胞毒殺性Τ淋巴球能夠辨認（接 合至）在目標細胞上形成於HLA抗原與本發明之胜肽之門 39 201124530 的複合物’然後攻敏θ 4 擎目払細胞，以誘導目標細胞的 目標細胞可為内咮，卜4主 。 ⑽幻生表現IMP-3的細胞，例如癌 被/#户基因轉举夕々^ π 或 朵之.，，田胞·，且由於藉由胜肽刺激表 明胜肽於細胞表面少Λ h 表面之細胞，也可做為經活化之細胞 T淋巴球攻擊的目許士 ± “ — 1 目橾。在一較佳實施例中，目標細胞在其 表面上攜帶HLA-A2抗原’並以形成於HLA抗原與的本發明 胜肽之間的複合物在其表面上呈現。 VI11. τ細胞受體（TCR) 本發明也提供一組合物，其包括由編碼出可形成τ細 胞受體之次單位之多胜肽的核酸序列，與其使用方法。τ 細胞受體之次單位，α和点，具有形成τ細胞受體的能力， 其授與專一性至抗腫瘤細胞的τ細胞，上述腫瘤細胞表現 IΜ Ρ 3藉由使用本技術領域所知的方法，以一或多個本發 明之胜肽所誘導之表現於細胞毒殺性Τ淋巴球中τ細胞受 體的α-與支鏈之核酸序列，其可被分離或利用來建立 合適的載體’此載體可高效率地調解基因轉移至初期人類 淋巴球中（primary human lymphocytes) (W02007/032255 and Morgan RA，ei a人，J Immunol, 171，3287 (2003))。 例如，喜好以聚合酶鏈鎖反應方法來分析T細胞受體。用 於分析之聚合酶鍵鎖反應引子可為，例如5，-R引子 (5’ -gtctaccaggcattcgcttcat-3’ ）為 5， 端引子（序 列 辨識號 ：23 ) 與 3-TRa-C 引 子 (5’ -tcagctggaccacagccgcagcgt-3’ ）專一於 τ 細胞受 40 201124530 體alpha鏈c區（序列辨識號：24 ) 、3-TRb-Cl引子 (5 __tcaSaaatcctttctcttgac-3’ ）專一於 T 細胞受體 beta鏈C1區（序列辨識號：43)或3_TRbe1：a_c2引子（5’ _ ctagcctctggaatcctttctctt-3，）專一於 T 細胞受體 beta 鏈C2區（序列辨識號：26 )為3， 端引子，但不限於此。 載體的範例包括’但不限於：逆轉錄病毒載體（retr〇viral vectors )。有利的情況乃，本發明提供一現成的組合物， 其允許快速修飾病患擁有的τ細胞（或另一種哺乳動物的 τ細胞），以快速且輕鬆地製造以高親合力表現丨Mp_3胜 肽之經修飾的T細胞，並且選擇性地有效修飾心叩與 π η呈現imp-3胜肽之目標細胞的殺害特性。引出之 τ細胞受體可以高親合力結合表現IMp_3胜肽之目標細 胞’且視需要與居中有效殺死表現IMp一3 之目標細胞。 編碼出T細胞受體次單位的核酸序列可合併進入適合 之載體’例如反轉錄病毒載體。這些載體為本技術領域所 熟知。通常包含其之核酸或載體可被轉移至—τ細胞，例 如-來自-病患之Τ細胞。有用地，本發明提供—現成 (〇fHhe-she⑴的組合物允許快速修飾病人所擁有之τ 細胞（或其他哺乳動物之那些）卩快速簡單產生具有優秀 之癌症細胞殺死特性的經修飾τ細胞。 特定之Τ細胞受體ι奎 . ΗίΑ ν ®了專—地辨認本發明之-胜肽盥 HLA分子之複合物，办τ « a > ,、 &稷口物“細胞党體於τ細胞表面時 細胞抗目標細胞之專—活抖。站丄7 、’α 丁 舌性稭由任何已知方法可確認上 41 201124530 述複合物之專一辨認’且其較佳方法包括，例如’使用HLA 刀子與本發明胜狀之多聚體染色（multimer staining)分 析’與酵素結合免疫斑點分析（enZyme_linked immunoSp〇t assay, ELISP0T)。藉由執行ELiSP〇T分析，其可確認於 細胞表面上表現T細胞受體的τ細胞，藉由τ細胞受體來 辨⑽細胞’以及確s忍息在細胞内（i nt race 11 u 1 ar 1 y )傳 遞。也可藉由已知的方法來確認，當此複合物存在於T細 胞表面上時’上述複合物可給予一 T細胞毒殺活性。較佳 方法包括’例如’抗HLA陽性目標細胞的細胞毒殺活性， 如鉻（chromium)釋放分析。 本發明也提供細胞毒殺性T淋巴球，其藉由以編碼出 Τ細胞丈體次單元多胜肽的核酸的轉導（transducti〇n)， 來製備’其中τ細胞受體次單元多胜肽與iMp_3胜肽結合， 例如’在文中的HLA-A2的中具有序列編碼：1、3、5及6 的IMP-3胜肽。經轉導之細胞毒殺性τ淋巴球可以>〇 自引導至癌症細胞，且可藉由熟知的培養方法叩擴 張（例如 ’ Kawakami ei a/.，J Immunol·，142，3452-3461 ( 1 989))。本發明之T細胞也可用來形成一致免疫組合物， 其於而要療或保s蒦之病患中’可有效治療及/或預防癌 症（W02006/031221)。 IX.藥學試劑或組合物 由於與正常組織相較，於癌症中，imp_3表現受到提 升調控（up-regulated)，本發明之胜肽或編碼出此類胜 42 201124530 肽之多核苷酸可用來癌症之治療及/或預防，及/或用來預 防其手術後之復發。因&，本發明提供—藥學試劑或电人 物用於癌症或腫瘤之治療及/或防治（叩吻⑽s)，及: 或用於手術後之復發的預防（prevent丨⑽），此類試劑咬 組：物包括作為活性成分之一或多個本發明胜肽，或編碼 出廷類胜肽之多核苷酸。或者’本發明之胜肽可表現於任 何前述外吐小體或細胞表面，例如抗原呈現細胞’以用來 作為藥學試劑或組合物。此外，上述以本發明任何胜狀為 標的之細胞毒殺性τ淋巴球也可用來作為本發明藥學試劑 或組合物之活性成^在本發明内文中，措辭“以胜狀為 標的（targetlngapeptide) ’，係關於細胞毒殺性了細胞 的活性’其意指細胞毒殺性T細胞，透過本身白”細胞受 體，辨S忍（例如接人5、,— Urn /ν V u如，接σ至）一複合物，上述複合物形成於 HLA抗原以及一位於目標細胞表面上的胜狀之間，然後， 攻擊目標細胞以誘導目標細胞的死亡。 在另一實施例中，本發明也在製造用H療或預防癌 症或腫瘤 < 藥學試劑或組合物中提供-;舌性成分的使用， 其擇自： (a) 本發明之胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 本發明之抗原呈現細胞；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者，本發明更提供一用以治療癌症或腫瘤的活性成 43 201124530 分擇自： (a )本發明之胜肽； (b)於一可表現之形式 肽的核酸； 馬出如此處揭露之此種胜 (c )發明之抗原呈現細胞；以及 (d)本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者’本發明更提供一製造用以治療癌症或腫瘤之寧 學組合物或試劑的方法或製程1中方法或製程包括將一 藥學上或生理上可接受之載體與— 活性成分一起配製的步 驟，活性成分擇自： (a )本發明之胜肽； ⑸於-可表現之形式’編瑪出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 本發明之抗原呈現細胞；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球， 為活性成分。 在另-實施例中，本發明也提供一製造用以治療癌症 或腫瘤之藥學組合物或試劑的方法或製程，其中方法或製 程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一 起混合的步驟’其中活性成分擇自. (a) 本發明之胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 本發明之抗原呈現細胞；以及 44 201124530 (d)本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者’本發明之藥學組合物或試劑可兼用於防治癌症 或腫瘤及預防其手術後之復發，或用於上述兩者之一。 本發明之藥學組合物或試劑可用於治療及^防治癌 症或腫瘤’及/或其手術後復發的預防於—個體或病患中二 個體或病患包括人類與任何其他哺乳動物，其包括，但不 限於小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、雜、狗、綿羊、山羊、 豬牛、馬 '猴子、狒狒與黑猩猩，特別是一商業上重要 動物或被馴養了的動物。 ” 根據本發明，已發現具有擇自下列序列辨識號：卜3、 5及6之胺基酸序列的寡胜肽，其為HU_A2限制之抗原決 定位胜肽，可誘導強而專—之免疫反應。目此，包括任何 :有擇自下列序列辨識號：卜3、5或6之胺基酸序列的 寡胜肽之本發明藥學試劑或組合物’特別適合投予HLA抗 原為HLA-A2之個冑。此處所用” HU抗原為Hu,之個 體意指擁有同型接合或異型接合的HLA-A2基因，其以 HLA抗原a表現於個體的細胞中。換句話說，上述個體係為 HLA A2陽性。相同的應用至包括編碼出任何這些寡胜狀之 多核苷酸的藥學試劑或組合物。 由本發明藥學組合物治療之癌症或腫 其中關於.3(例如，為過度表現）之所有種類之2 或腫瘤，句，/ , 例如肺癌及食道癌。尤其是，本發明之筚 學試劑或組人犏& , .、 ° 李父佳應用於胰臟癌（pancreatic cancer)。 x月藥予S式劑或組合物可包括除了上述活性成分 45 201124530 外，具有誘導細胞毒殺性τ淋巴球抗似癌細胞之能力的其 他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苷酸、其他表現此 其他胜肽之細胞或此類。於此，具有誘導細胞毒殺性τ淋 巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽由癌症專一抗原所例示 (例如，經定義之腫瘤相關抗原），但不限於此。 若需要，本發明之藥學試劑或組合物可視需要包括其 他治療物質為-活性成分，只要此物質不抑制活性成分之 抗腫瘤功效，活性成分例如任何本發明胜肽。例如，配方 可包括抗發炎試劑、止痛劑、化學治療與其類似。除了包 括其他治療物質於藥劑其本身中，也可將本發明之藥劑或 組合物與-或多個其他生理組合物相繼或同時投予。藥劑 與生理試劑或組合物的量 7里依-，例如：使用何種生理試 鈉、要治療之疾病與投藥的計畫盥方式 的是’除了此處特別提/之成分外，本發明之 ==或組合物可包括本技術領域-般之其他試劑或组 。物，其具有關於討論中之配方形式。 在本發明一實施例中，本發 被包含於製锆夕亦。+ 樂子忒剤或組合物可 於裏&之商品與套組，i 病，例如饵、广 、3對於要被治療之疾 癌症的病理情況有用之材料。製造之冉… 具有-標籤之任何本發明藥…了匕括 的容哭句μ Μ組合物的容器 包括瓶、小瓶(vial)與試 、。 科，例如破璃或塑膠。於容器上之：y、各種材 物為用來治療或預防疾病…广“曰出試劑或組合 投藥指示等。 、 4夕個情況。標籤也可指出 46 201124530 除了上述谷益外，套組包括本發明藥學試劑或組合物 可視需要更進一步包括—第二容器，其儲藏一藥學上可接 受之稀釋液。其可更包括商 枯商業或使用者觀點需要之盆他材 料’包括其他緩衝溶液、稀釋液、遽器 '針、注射器與具 有使用說明之包裝插入物。 藥學試劑或組合物若需要可被呈現於-包（pack)或— 分配器’其可包含含有活性成分之―或多單位劑量形式。 包裝可例如包括金屬或塑膠羯，例如-泡棉箱(blister pack)。包或分配器可伴隨著投藥指示。 .在本發明的另-實施例中，本發明之胜肽亦可以藥學 上可接受之鹽類的形式投予。鹽類之較佳實施例包括鹼金 屬鹽類、金屬鹽類、有機鹼鹽類、有機酸鹽類、以及無機 酸鹽類。 (1)藥學試劑或組合物包含胜肽作為活性成分 可直接投予本發明胜肽為一藥學試劑或組合物，若需 要的話，其已被一般配方方法所配製。在之後的例子，除 了本發明胜肽外、若適合可包括載體、賦形劑與原始做為 藥物使用之此類而無特別限制。上述載體的例子為滅菌水 生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體（culture fluid) 與此類。更進一步而言，若必須，藥學試劑或組合物可含 女定劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此類。本發明之 藥學試劑或組合物可用來抗癌目的。 可將本發明之胜肽製備為一組合，其由兩或更多個本 發明之胜肽所組成’以誘導細胞毒殺性τ淋巴球。 47 201124530 胜肽組合可以雞尾酒形式執行或可使用標準技術彼此結 合。例如，胜肽可被化學連接或表現如一單一融合多胜肽 序列。結合之胜肽可為相同或不同。藉由投予本發明之胜 肽’藉由HLA抗原高密度呈現胜肽於抗原呈現細胞上，之 後對形成於呈現胜肽與HLA抗原之間的複合物專一反應之 細胞毒殺性T淋巴球被誘導。或者，抗原呈現細胞，其表 現任何本發明之胜肽於其細胞表面’可藉由刺激衍生自具 有本發明胜肽之個體的抗原呈現細胞（例如，樹突細胞） 獲得抗原呈現細胞，且可投予抗原呈現細胞至個體中，使 個體中的細胞毒殺性T淋巴球被誘導，以及增加對於像是 肺炎及食道癌細胞等的癌症細胞的攻擊。 治療及/或預防癌症或腫瘤之藥學試劑或組合物，其包 括一本發明之胜肽作為活性成分，也可包含一已知為有效 建立細胞免疫力之佐劑。或者藥學試劑或組合物可與其他 活性成分一起被投予，或可以配製成細粒被投予。佐劑指 一化合物，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予（或依次） 時，其增強抗蛋白質之免疫反應。於此考慮之佐劑，包括 於文獻（Clin Microbiol Rev 1 994，7: 277-89 )中所描述 的那些。適合之佐劑的例子包括’但不限於磷酸鋁、氫氧 化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等等。 此外’於微脂體（1 iposome)配方與細粒配方中，胜肽 連結至幾個微米直徑之小珠’且於配方中，可便利地使用 連結至胜肽之脂質。 在本發明另一實施例中，本發明胜肽也可以一藥學上 48 201124530 可接受之鹽類被投予。上述鹽類的較佳實施例包括鹼金屬 ’類金屬鹽類、有機驗鹽類、有機酸鹽類、以及無機酸 5類。如此處所使“藥學上可接受之鹽類”意指維持化 合物生物有效性與特性及獲得自與無機酸或驗，例如鹽 酋文氫溴駄、硫酸 '硝酸、磷酸、曱基磺酸（methanesui f⑽卜 acid)、乙基磺酸（e1±anesulf〇nic、對曱笨磺酸 (p-toluenesuif〇nic acid)、水楊酸（saHcylic acid)與 其類似物反應的那些。較佳鹽類之例子包括具有鹼金屬之 鹽、具金屬之鹽、具有機鹼之鹽、具有機酸之鹽與具無機 酸之鹽。 在一些貫施例中’本發明之藥學試劑或組合物可更包 括一成分其啟動細胞毒殺性T淋巴球。已定義脂質為可//? FJ FO啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性τ淋巴球的試劑或組合 物。例如’可將棕櫊酸殘基黏附至離氨酸殘基之ε -與α 一 胺基，且之後連結至本發明之一胜肽。之後脂質胜肽可被 直接投予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於一佐劑 中。如脂質啟動細胞毒殺性τ淋巴球反應之另一例子，及 脂蛋白，例如三軟脂酸-S甘油半胱氨酰絲氨酰基絲 氨 酸 （tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine ’ P3CSS)可使用來啟動細胞毒殺性T淋巴球，當共 價附加至一合適之胜肽（參見，例如Deresetal.，Nature 1989， 342: 56卜4)。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域。 49 201124530 可執仃單-人投藥或藉由多次投藥追加。本發明之胜肽劑量 可適合地調整根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥 方法與此類，且本發明之胜肽劑量一般為〇 . 〇 〇 1 至 1〇〇〇心’例如0.001邶至1〇〇〇岐，例如〇1邶至1〇邺， 且可於數天至數個月投藥一次。熟悉此技藝人士可適合地 選擇一合適的劑量。 (2 )藥學試劑或組合物包含多核苷酸為活性成分 本發明之藥學試劑或組合物也可包括編碼出此處揭露 之胜肽的核酸於一可表達之形式中β.此處措辭“於一可表 達之形式中”意指多核苷酸，當引入一細胞，會 被表現成一誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一代表實施例 中，感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多核苷酸 而δ必須之調控要素。可裝配多核苷酸以達到穩定插入目 標細胞之基因體（參見，例如敘述同源重組盒式載體 (cassette vector)的 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12。）參見，例如 w〇lff et al., Science 1 990， 247: 1465-8; U. S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,1 18； 5,736,524; 5,679,647； and WO 98/04720。DNA輸送技術的例子包括“裸DNA ( naked DNA) 、經促進（bupivacaine、聚合物、胜肽居中之） 之輸送、陽離子脂質複合物與顆粒居中之（“基因搶，gene gun” ）或壓力居t之傳送（參見，例如u. S. Patent No. 5, 922, 687 )。 50 201124530 本發明之胜狀也可驻 l 7错由病毒或細囷載體來表現。表現 載體的例子包括減弱病I广士，办丨l + &乃届，佰主，例如牛痘或禽痘。此方法 包括使用牛痘病毒，例如a 一截體以本馆π J ^ 戟體以表現編碼出胜肽之核 苷酸序列。藉由引入_宿主 屮舌 佰主’此重組之牛痘病毒表現致免 疫胜狀且因此引起一务芦应庙。私&广止 尤反反應於免疫步驟中為有效之牛 痘載體與方法敘述於，例如u. PatentN。· 4 722，請。 另一實施例包括卡介苗（Bac⑴e Calmette Guerin， BCG)。BCG 載體敘述於 St〇ver et al.，Nat㈣ i99i, 35i: 4 5 6 6 0中。對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例 如腺與腺病毒相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏 菌（Salmonella ty phi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其 類似為明顯的。參見，例如Shata et al .，M〇1 Med T〇day 2000， 6: 66-71; Shedlock et al·， J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al.， In Vivo 2000， 14: 571-85。 輸送多核苷酸進入一個體可為直接，於其例子中，個 體直接暴露於一攜帶多核苷酸之載體，或為間接，於其例 子中，細胞首先//7 f/ iro以感興趣之多核苷酸轉形，之後 將細胞轉殖進入個體。此兩方法分別為已知，為& vjvo 與ez 基因治療。 基因治療之方法之大體回顧，參見Goldspiel ei a/.， Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu,

Biotherapy 1991， 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev

Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260： 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 51 201124530 1993， 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215。也可用於本發明之於重組j)NA技術中一 般熟知的方法如於eds_ Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wi 1 ey & Sons, NY, 1993; and Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual’ Stockton Press, NY，1 990 中所述。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域提 供使用。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。於適合載 體中或於以編碼出本發明之胜肽的多核苷酸轉形之細胞中 的多核苷酸的劑量可適合地調整，根據要治療之疾病、病 患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量 般為 0· 001 mg 至 1 00 〇 mg ’ 例如 0. 001 mg 至 1 〇〇〇 mg， 例如0_ 1 mg至10 mg ’且可於每數天一次至每數個月一 次投藥。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。 X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性 τ淋巴球的方法 可使用本發明之胜肽與編碼出此胜肽之多核苷酸來製 備或誘導抗原呈現細胞與細胞毒殺性Τ淋巴球。也可使用 本發明之外吐小體與抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性Τ淋 巴球，如同誘導對癌症或腫瘤的免疫反應一樣。胜肽、多 核替酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物結 合使用’只要化合物不抑制其細胞毒殺性Τ淋巴球誘導能 52 201124530 力。因此，任何上述之本發明藥學物質或組合物可用來誘 導細胞毋殺性τ淋巴球’且除此之外，包括胜肽與多核苷 酸的那些也可用來誘導抗原呈現細胞，如下所解釋。此外， 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球亦可用於誘導對癌症或腫瘤 的免疫反應。 (1) 誘導抗原呈現細胞的方法 本發明提供使用本發明之胜肽或編碼出此胜肽之多核 皆酸來誘導抗原呈現細胞的方法。抗原呈現細胞的誘導的 執行如前面段落” VI·抗原呈現細胞”所描述。本發明亦 提供具有高細胞毒殺性τ淋巴球誘導能力之抗原呈現細胞 的誘導方法’此誘導亦已陳述於前面項目” VI.抗原呈現 細胞”。 較佳地，抗原呈現細胞的誘導方法包括至少一擇自下 述的步驟： a :利用本發明之胜肽與抗原呈現細胞相接觸；以及 b :將編碼出本發明之胜肽的多核苷酸，以一可表達的 方式’引入抗原呈現細胞中。 類誘導抗原里現細胞的方法。為了 或u 心執行此方法較佳//7 ko或ei κ/ 執行，可自要 破治療的個體或HLA抗原與要被治療的個體相同之他人， 來獲得抗原呈現細胞。在較佳實施例中’藉由本發明之方 法攜帶HLA-A2抗原於其表面，來誘導抗原呈現細胞。 (2) 誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法 53 201124530 本發明也提供使用本發明夕日+ 义卬不知明之胜肽、編碼出此胜肽之多 核苷酸、或表現此胜肽之外吐 &外吐小體或抗原呈現細胞，來誘 導細胞毒殺性τ淋巴球的方法。 本發明也提供使用編碼出—多胜肽之多核苦酸來誘導 細胞錢性T淋巴球的方法，此多胜肽具形成—^田胞受 體次単位的能力，@此T細胞受體次單位辨認“列如，接 合至）-本發明胜肽與HLA抗原之複合物。較佳為誘導 細胞毒殺性T淋巴球的方法可包括至少一步驟擇自： a :將一 CD8陽性T細胞與一抗原呈現細胞及/或一外 吐小體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體表現一 hla 抗原與本發明胜肽之複合物於其表面，以及 b :將-多核苷酸引入一 CD8陽性τ細胞，其中該多 核苷酸編碼出一多胜肽，該多胜肽具形成一 τ細胞受體次 單位的能力’而該Τ細胞受體次單位辨認一本發明胜肽與 HLA抗原之複合物。 當本發明之胜肽被投予至一個體時，於個體體内誘導 細胞毒殺性Τ淋巴球，並增強以與腫瘤相關之内皮為目標 的免疫反應的強度。或者，上述胜肽以及編碼出此胜肽之 多核苷酸可被用於一 以叩的治療方法，其中個體衍生 的抗原呈現細胞、以及CD8陽性細胞、或周邊血液單核白 血球（peripheral blood mononuciear leuk〇cytes)，如 與本發明之胜肽接觸（受刺激），且在誘導細胞毒 殺性T淋巴球後，經活化之細胞毒殺性τ淋巴球可返回至 個體。例如，方法可包括步驟： 54 201124530 a :自個體收集抗原呈現細胞 將胜肽與步驟a之抗原呈現細胞接觸， 、c:將步驟b之抗原呈現細胞與⑽陽性了細胞混合 並共培養以誘導細胞毒殺性T淋巴球，以及 d .收集來自步驟c的共培養之CD8陽性細胞。 ，或者’根據本發明，提供利用本發明之胜肽來製備_ 誘導細胞毒殺性τ淋巴球的藥學試劑或組合物。此外，本 發明提供製造-誘導細胞毒殺性τ淋巴球之藥學試劑或組 :物的方法或製程，其中該方法包括將本發明之胜肽與藥 學上接受之載體一起混合或配製的步驟。此外，本發明亦 提供用來誘導細胞毒殺性Τ淋巴球的本發明之胜肽。 上述CD8陽性τ細胞具有細胞毒殺活性，其得自於步 驟d，可作為疫苗被投予至一個體。亦可但不限於，藉由 將編碼出本發明之胜肽的基因轉殖進入抗原呈現細胞，如 上述段落 VI ·抗原呈現細胞”所詳細描述，來獲得於上 述步驟c中與CD8陽性T細胞混合之抗原呈現細胞。因此， 任何有效呈現本發明之胜肽給T細胞的抗原呈現細胞或外 吐小體，皆可用於本發明之方法。 (3)誘導免疫反應的方法 本發明更提供誘導個體内抗癌症，如肺癌及食道癌 之免疫反應的方法。本方法包括本發明之一疫苗的施打 其疫苗包括： (a) —或多個本發明之寡胜肽，或其免疫活性片段； 55 201124530 (b) —或多個編碼出上述寡胜肽之多核苷酸或（£1)之 免疫活性片段； (c) 一或多個本發明之獨立分離的細胞毒殺性τ淋巴 球 (d) —或多個本發明之獨立分離的抗原呈現細胞；或 (e) —或多個與τ細胞受體編碼基因分離以及利用τ 細胞受體編碼基因轉殖（transformed)的T細胞 在本發明中’以這些活性成份可治療過度表現IMP-3 之癌症。此類癌症的例子包括，但不限於肺癌與食道癌。 因此，在包括活性成分之疫苗或藥學組合物的投予前，其 較佳為確認，當與相同器官之正常組織相較時，IMp_3之 表現程度於要被治療之癌細胞或組織中是否被提高。因 此，在一實施例中，本發明提供治療（過度）表現一3 之癌症的方法，此種方法可包括步驟： 1)測疋獲得自具有癌症要治療之個體的癌細胞或組 織中的IMP-3表現程度； 11)與正常控制組比較imp_3表現程度；以及 in)扠予擇自上述的至少一成份至與正常 控制組相較具有過度表現IMp_3之癌症的個體。 或者，本發明也可提供包含擇自上述（&)至（(〇的至 -成份的疫苗或藥學組合物，其用於投予至具有過度表 IMP-3之癌症的個體。換句話說，本發明更提供鑑定要 以本發明IMP_3多胜肽治療之個體的方法，此類方法包 測定來自個體之癌細胞或組織中@ IMP-3表現程度的 56 201124530 :右，中與基因之正常控制組相車交’此程度増加指出個體 :可以本發明IMP-3多胜肽治療之癌症。本發明之 癌的方法於以下更詳細敘述。 僚 可將任何源自個體之細胞或組織用於 1 m r <3表現之、、則 疋’只要其包括IMP-3之目標轉錄或轉譯產物。適^ 的例子包括，不限於身體組織或液體、例如血液：唾 與尿液。較佳為’生物樣本包含一細胞族群，纟包括—a 皮細胞，更佳為源自個體之細胞或組織包含—細：族群上 其包括-上皮細胞，更佳為—癌症上皮細胞或_來自 疑癌化之組織的上皮細胞…卜，若需要，細胞可自所# ^身體組織或液體被純化，且之後使用為源自個體之^ 要藉由本發明之方法治療之個體，較佳為 物。示範之哺乳類動物包括’但不限 人類靈長類動物、小鼠、大鼠1、猫、馬盘/類、非 發明，測定獲得自—個體之癌症細胞或组織中 ?MP-3表現程度。使用本技術領域已知方法可 物程度測定表現程度。例如，藉' 祕人、 F 口々杰Q例如，北方 雜S )使用探針可將ϊMP-3的mRNA ^量。可於—晶片、一 :列上執行㈣。陣列之使用較佳為用於偵測I; 王度。利IMP-3的序列資訊’孰 " 種摆4+ , .、、、’以此技蟄人士可製備此 :探針。例如，IMP-3的C舰可被使用為探針。若需要， :以適合之標諸來標純針’例如染劑、營光物 素，且基因的表現程度可被偵剛為雜合標諸的強戶： 57 201124530 此外，藉由擴大偵測方法（amplificati〇n_base detectin method)(例如，RT_pCR)使用引子可將丨肿勺 (序列辨識號：21)的轉錄產物進行定量。根據基因之可 獲得序列資訊可製備此種引子。 特別是，用於本方法之探針或引子於嚴厲 (stringent)、適度嚴厲、低嚴厲條件下雜合至lMp_3的 mRNA。如此處使用，措辭“嚴厲（雜合’ hybridizati〇n) 條件”意指在此在條件下探針或引子會雜合至其目標序 列，而不是其他序列。嚴厲條件為序列依賴 (sequence-dependent)，且在不同環境下會不同。比起較 短之序列，於咼溫下觀察到較長序列之特定雜合。一般而 言，在一定義之離子強度與pH下所選擇之嚴格條件的溫度 為低於一特定序列之熔點（Tm)約5°C。Tm為溫度（在一定 義之離子強度與pH與核酸濃度下），於其下在平衡下 %之互補至目標序列的探針雜合至目標序列。由於目標序 列通常存在過量，所以於Tm，在平衡下50%之探針被佔 據。一般而言，嚴苛條件為於其中鹽濃度低於〇 M鈉離 子，一般約0· 01至1.0 Μ鈉離子（或其他鹽）於pH 7 〇 至8. 3 ’且對於短探針或引子（例如，1 〇至5 〇個核苷酸） 而言溫度為至少約30°C ’對於較長探針或引子而言溫度為 至少約60°C。也可以添加去穩定試劑（destabiHzing agents)，例如甲醯胺（formamide)來達到嚴苛條件。 上述探針或引子可能為特定尺寸，其尺寸範圍自至少 10個核苷酸、至少12個核苷酸、至少15個核苦酸、至少 58 201124530 2 0個核苷酸、黾 至ν 25個核苷酸、至少3〇個核苷酸，且上 述探針或引子可限ρ _ r疋其尺寸乾圍為5-10個核苷酸、10-15 個核苷酸、1 5 - 2 0個桉：if醅、9 η。 1U核甘I 20~25個核苷酸、以及25-30 個核苷酸。 或者’為了本發明之診斷可偵測轉譯產物。例如，可 僧測序列辨識號：22的IMp_3蛋白質之量。駭作為轉錄 產物之蛋白質的量的方法包括免疫分析方丨其使用—抗 體專-辨認此蛋白f。抗體可為單株或多株。此外’抗體 之任何片&或修飾（例如嵌合型抗體 antlb〇dy)、SCFV、Fab、F(ab，）”Fv 等）可被用來偵測， 只要：段或經修飾之抗體維持對im卜3蛋白質的結合能 力。這些用於蛋白質债測之這些種類的抗體的製備方法為 本技術領域所熟知，且任何 饮π万法可被使用於本發明中以製 備此種抗體與其等同物（equivalent)。 如根據/#户-J基因棘考吝& 土 U轉#產物偵測/#户-<?基因之表現程 度的另一方法，使用抗IMp_3 变曰為之抗體經由免疫組織 化子(1随1111〇1^51；0(：1^11^(：3'1、八_^-1·, nenucal)分析可測量到染色強度。即， 於此測量中’強的染色指出 贪白貝/程度之增加的存在，且 同時/#户j基因之高表現程度。 可確認於癌症細胞中包括9 # 招t… 甲匕括’心基因之目標基因的表 ,^ ^ 权於目心基因之控制組程度（例 如’於正㊉細胞中的程度） 切 w 、力口，例如 10%、25%、或 50 %，或增加大於1. i倍、大 .n ^ ^ 、1· 5倍、大於2. 0倍、大於 5· 〇倍、大於1〇. 〇倍或更多。 59 201124530 藉由使用先前自一個體/個體群，其疾病階段（癌的或 非癌的）^已知的個體’收集並儲存的樣本控制組織程度 可^癌細胞同時測定。此外，獲得自具有癌症要被治療之 -器官的非癌區域的正常細胞被使用為正常控制組。或 者，根據獲得自分析先前測定之來自其疾病程度已知之個 體之樣本中之基因的表現程度的結果冑由統計方 法，可測定控制組之程度。此外，控制組程度可為來自自 先前測試細胞之表現輪廓的資料庫。並且’根據本發明— 方面於-生物樣本中之/评―；基因的表現程度，可與多個 控制組程度比較，其控制組程度被測定自多個參 較佳為使用一控制組程度測定自一參考樣本，其來自一組 織形式相似於源自個體生物樣本之組織形式。此外，較佳 為使用具有已知疾病階段之群組中的/#户—3基因的表現程 度的標準值(standardval ue)。標準值可獲得自本技術領 f任何已知的方法。例如，平均值+/_2標準差或平均值 標準差，可被使用為標準值。 本發明之内容中，測定自已知為非癌症之生物樣本的 控制組程度被意指為一 “正常控制組程度”。另一方面， 控制組程度測定自一癌的生物組織，其意指為一“癌的控 制組程度。可將介於樣本表現程度與控制組程度間的不 同標準化至控制核酸的表現程度，例如管家基因 (housekeeping gene)，根據細胞之癌症與非癌程度已知其 表現程度並無不同。示範之控制基因包括，但不限於沒肌 動蛋白（beta actin)、甘油醛_3一磷酸去氫酶 60 201124530 核糖蛋 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)與 白PI。 當與正常控制組程度相較/#户_3基因的表現程度被增 加或相似/等同於癌控制組程度’可診斷個體為具有癌症要 被治療。 更特別地，本發明提供（i)診斷一個體是否具有癌症 要被療，及/或（丄丄）冑擇要癌症治療之個冑的方法， 其方法包括步驟： a) 測定在癌症細胞或組織中，IMp_3的表現程度，癌 症細胞或組織獲得自被懷疑具有要 、令胥被冶療之癌症的個體； b) 與正常控制組比較IMP-3之表現程度； c) 若IMP-3之表現程度盥正堂松 加 又〃止吊控制組程度相較被增 則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及 d) 若個體於步驟c)中被診 症 研句具有要被治療之癌 則選擇要癌症治療之個體。 或者，此種方法包括步驟： a) 測定在癌症細胞或組織中 、产：^丄、 iMP —3的表現程度，癌 ;正、·用I或組織獲得自被懷疑具有要被汐 σ療之癌症的個體； b) 與癌症控制組比較ιμρ_3之表現程度； 〇若ΙΜΡ-3之表現程度相 度

Hl. ^ ^ , Α ^寻於癌症控制組程 則矽斷個體為具有要被治療之癌症；以及 症 d)若個體於步驟c)中被 要 則選擇要癌症治療之個體。 、有要被治療之癌 本發明也提供一套組以測定—、曲、☆ k %可被以本發明 61 201124530 … 癌症的個體’其在評估及/或監押特定 的癌症治療的功效中亦為有用的，尤其β广 控特疋 適合癌症之說明例子包括，…：其疋癌症免疫治療。 別的β，泰η/ 肺癌與食道癌。更特 之其且乂佳包括至少一用以相來自個體癌細胞中 土因的表現程度的試劑，此類試劑擇自下列群組： (a) —試劑用以偵測户—j基因的岫⑽； (b) —試劑用以偵測戶—j基因的蛋白質；以及 (〇 一試劑用以债測，^基因之蛋白質的生物活 性。 適合用以偵'則，心基因之_Α之試劑的例子包括核 酸其專一結合或辨認ΙΜΡ-3邏’例如，具有對於ιμρ:3 mRNA之一部分互補的序列的寡核苷酸。這些種類之寡核苷 酸以專一於IMP-3mRNA之引子與探針為例子。根據本技術 領域所熟知的方法可製備這些種類之寡核苷酸。若需要， 用以偵測IMP-3 mRNA之試劑可被固定於固體基質（matrix) 上。此外，大於一個之用以偵測IMP_3 mRNA的試劑可被包 含於套組中。 另一方面’適合用以偵測IMP-3蛋白質之試劑的例子 可包括對於IMP-3蛋白質的抗體。抗體可為單株或多株。 此外’抗體之任何片段或修飾（例如嵌合型抗體（chimerie antibody)、scFv、Fab、F(ab，）2、Fv 等）可被用來作為 試劑，只要片段或經修飾之抗體維持對IMP-3蛋白質或其 免疫活性片段的結合能力。這些用於蛋白質偵測之這些種 類的抗體的製備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可 62 201124530 被使用於本發明中以製備此種抗體盘 (eQU1Valent)n可㈣號產生分子經由直接連接或 一間接標諸技術來將抗體進行標諸。標諸與標諸抗體之方 法與偵測抗體對其目標的纟士人*太 〕、，° σ為本技術領域所熟知，且任 何標誌與方法可被使用於本發明。 力外，大於一個之用於 偵測IMP-3蛋白質的試劑可被包括於套組中。 套組可包含多於-個之前述試劑。例如，獲得自沒有 癌症或遭受癌症之個體的組織樣本可作為有用的控制組試 劑。本發明之套組可更包括商業或使用者肖度所需之其他 材料’包括緩衝溶液、稀.釋液、《器、注射針、注射器與 具有使用之操作指南的包裝插入物（例如，書面、磁帶或 ._等）。這些試劑或此類可保持於—具有標認之容器。 適合之容器包括瓶子、小玻璃瓶(vial)與試驗試管。容器 可形成自多樣化之材料，例如玻璃或塑膠。 如同本發明之一實施例，當試劑為抗IMP-3inRNA之探 針時，試劑可被固定於一固體基質上，例如一多孔條 ⑽⑽s strip)以形成至少一錢位。多孔條之測量或债 測區可包括複數個位置，各含有—核冑（探針）。一測試 1'可3有負及/或正控制組的位置。或者，控制組之位置 y位於與測5式條分離之_條。視需要而定，不同之偵測位 可匕3不同里之經固定之核酸，即一較高量於第一偵測位 中且-較低含量於隨後之位置中。藉由測試樣本的加入， 顯7^可偵測訊號之—些位置提供-於樣本中IMP-3 niRNA存 在之里的疋量指不。偵測位可被設置於任何適合之可偵測

S 63 201124530 形狀且一般為在橫跨一 中。 測°式條之寬度的條狀物或點的形狀 發月之套組可更包括"'正控制組樣本或IMP-3標準 檨：。藉由收集IMP_3正之樣本可製備本發明之正控制組 樣本且之後分析它們的勝3程度。或者，可將經純化之 IMP-3蛋白質或多核|酸加至不表現iMp —3之細胞以形成 正樣本（positive sample)或imp_3標準樣本。於本發明 中，經純化之IMP-3可為重組蛋白f。正控制組樣本之 IMP-3程度為，例如，大於臨界值（⑶* 〇ff 。 呈現下列實施例以說明本發明與以協助熟悉此技藝人 士製造與使用本發明。實施例並不傾向於在其他方面限制 本發明範圍任何方式中。 【實施例】 材料舆方法 小鼠 人類白血球抗原-A2 ( HLA-A2 )基因轉殖_ ( Tg)小鼠； 引入人類冷 2m - HLA-A2. 1(-yi 抑別人 a 1, a 2 )-H-2Db (α 3穿透膜細胞質）單股建構基因H-2Db和沒2m雙基 因刪除（double knockout)的小鼠，其生產於瑞典國際開 發署-署逆轉錄酶病毒（Department SIDA-Retrovirus， Unite d， Immunite Cellulaire Antivirale, Institute Pasteur, France)，並由 Dr. F. A. Lemonnier 所提供之。 此小鼠由雄本大學動物資源及發展中心繼代飼養（C e n t e r 64 201124530 for Animal Resources and Development of Kumamoto U n i v e r s i t y )，且遵照雄本大學的動物照顧指南來處理。 細胞株 PANC1、A549、Lu99、MCF7、SW620、SOepl 以及 T2， TAP-基因缺陷（TAP-def ici ent )以及 HLA-A2 陽性 (乂屻別/)細胞株，其為自 Riken Cell Bank, Tsukuba， Japan所購得。IMP-3陽性的表現由逆轉錄聚合酶鏈所反應 分析（reverse transcription-polymerase chain reaction analysis)實驗來鑑定。 血液樣本 本實驗的進行係利用分離自HLA-A2陽性捐血者的周邊 血液單核細胞（Peripheral blood mononuclear cells; PBMCs )，其由曰本雄本大學的機構審查委員會 (Institutional Review Board of Kumamoto University, Kumamoto，Japan)所提供。四位具有肺癌的病患之血液樣 本，分別標不為病患1、病患3、病患4、及病患丨〇3，係 在取得雄本大學附設醫院中的病患之正式的書面通知同意 書後，於常規診斷程序中獲得。血液樣本亦獲得自hu_a2 …撕）陽性健康捐贈者，分別標示為捐贈I卜捐贈者 2扣贈者3，並已取得正式的書面通知同意書。所有的樣 本接採匿名、隨機編碼、以及保存於攝氏負8〇度下，直到 使用前。 65 201124530 衍生自IMP-3的胜肽之人選 利 用 接合預 測 軟 體 ” BIMAS” (http://www-bimas.cit. nih. gov/molbio/hla_bind) (Parker et al. , J Immunol 1994, 152(1): 163-75, Kuzushima ei a/.，Blood 2001，98(6): 1872-81 )來預測 可能接合至HLA-A2 (4屻分子之衍生自IMP-3的胜肽。 這些胜肽以及 HLA-A2U吖別/)限制型 HIV 胜肽 (SLYNTYATL)係由 American Peptide Company, Sunnyvale, CA，USA所合成，並確保其純度大於95%。 小鼠之IMP-3活性細胞毒殺性T淋巴球的誘導 利用5 xlO5衍生自樹突細胞（BM-DCs )的同源基因之 骨髓對HLA-A2 Tg小鼠進行免疫，此樹突細胞在第7天及 第14天接受候選胜肽的脈衝。在第21天，自免疫小鼠中 分離CD4_的脾臟細胞’其受到各個胜肽之BM-DCs的脈衝持 續長達6天的刺激。IMF- r的產生係藉由酵素結合免疫斑 點分析法（enzyme-linked immunospot assay，ELISP0T) 來债測。 人類之IMP-3活性細胞毒殺性τ淋巴球的誘導 藉由 Ficoll Conray 也、度梯度離心（Ficoll-Conray density gradient centrifugation)的方法來分離來自 HLA-A2 (A*020 1 )陽性捐贈者之肝素化血液（heparinized 66 201124530 blood)的周邊血單核細胞（PMCs)，以產生周邊血液單核 細胞衍生的樹突細胞。樹突細胞，於4 micro_g/mL万2小 球蛋白（beta2-iniCr〇gl〇bulin) (Sigma-Aldrich, St. Lou i s, M0，USA)的存在下，在攝氏37度下，於含有2%經 熱處理去活性的自體移植血聚（heaf—jnactivated autologous Plasma)的 AIM—V (Invitr〇gen Japan， T〇ky〇,

Japan)中’持續兩天受到2〇 micro_g/mL候選胜肽的脈衝。 然後’上述細胞接受輻射（4〇 Gy)並與CD8陽性τ細胞 一起培養。這些培養物培養於24孔（24_well )培養皿中， 每個孔中含有1 X 1 〇5個經胜肽脈衝的樹突細胞、2 χ 1 〇6個 CD8陽性τ細胞 '以及5 ng/mL人類重組白介素-7 ( human recombinant IL-7) (Wako，Osaka, Japan)，於含有 2%經 熱處理去活性的自體移植血漿的A i μ-V中。兩天後，補充 人類重組白介素—2( human recombinant IL-2)(PeproTech， Rocky Hill, NJ，USA)於這些培養物中，其最終濃度為2〇 IU/mL。於第7天及第14天，利用相同的程序，外加兩個 具有胜肽承載之自體移殖樹突細胞的刺激。在最後一次刺 激之後六天，藉由INF-γ酵素結合免疫斑點分析（ELISp〇T assay )，以及“Cr釋放分析，來進行經誘導的細胞毒殺性 τ淋巴球之抗原專一性反應的研究。在INF_ τ酵素結合免 疫斑點分析中，以具有同源胜肽（c〇gnate peptides)或 热關 HIV 胜肽（irreievant HIV peptide)之 T2 (1 X 1〇4/ 孔）的脈衝，來刺激細胞毒殺性T淋巴球（1 X 105 CeUs丨 孔）。在51Cr釋放分析中’細胞毒殺性τ淋巴球，於指定 67 201124530 的效/乾比（ef f ector/target rat io )下，與作為目標細 胞的經胜肽脈衝之T2細胞或癌細胞（5 x 1 03/孔）共培養， 而標準 Cr釋放分析的操作如前面所描述（Komori H eiaA,

Clin Cancer Res. 2006 May 1;12(9):2689-97)。 細胞毒殺性T淋巴球的細胞表面的溶酶艟相關膜蛋白 CD107a ( lysosomal-associated membrane protein-1, LAMP-1)的暴露分析 在抗原刺激之後’藉由抗CD107a抗體，來偵測細胞毒 殺性T淋巴球的細胞表面之溶酶體相關膜蛋白cd丨〇7a的暴 露。IMP-3胜肽專一性細胞毒殺性τ淋巴球受到同源胜肽 或無關HIV胜肽的刺激，以有螢光素標記 (FITC-conjugated)抗 CDl〇7a mAb 或小鼠免疫球蛋白 G1 (I gG 1 )的存在作為控制組。這些細胞毒殺性τ淋巴球培 養5小時於攝氏37度的環境下，隨後用pE共軛之人類CD8 mAb將其染色。所有的胜肽最終濃度皆為i mg/ml。結果顯 示CD8陽性T細胞的進出受到限制。 藉由anti-HLA-class !單株抗髖來抑制細胞毒殺性τ 淋巴球反應 anti-HLA-class I的抑制操作方式如前所述（K〇m〇ri η etal., Clin Cancer Res. 2006 May 1； l 2 ( 9) : 2689-97) 〇 特別是，在將Lu99目標細胞分別培養於如卜（ mAb (W6/32, IgG2a).t anti-HLA-DR mAb (HLA-class II mAb) 68 201124530 (H-DR-1，IgG2a) —小時之後，將Lu99細胞，與衍生自藉 由同源胜肽的刺激所得到之肺癌病患的細胞毒殺性T淋巴 球共培養。 統計分析 藉由INF- τ酵素結合免疫斑點分析（EL I SPOT assay ) 所得到的數據上之差異，係利用雙尾學生 t試驗 (two-tailed Student’ s i-test)來計算其統計學上之 顯著性。戶<0. 05表示有顯著差異。利用商業的統計套裝 軟體（SPSS for Windows, version 11.0，Chicago, IL， U S A )來執行上述的統計分析。 結果 預測衍生自IMP-3的HLA-A2結合蛋白 表1顯示按照結合親合力以從強至弱依序排列之 IMP-3的HLA-A2U卹別/)結合蛋白。總共篩選出20個具有 HLA-A2U抑別/)結合能力可能性的胜肽。 表一、衍生自IMP-3的HLA-A2U^i^?/)結合^ 白 序列辨識號 位置 胺基酸序列 HLA-A2 結合分數 1 199-207 RLLVPTQFV 1415.4 2 280-288 KILAHNNFV 681.2 3 552-560 KIQEILTQV 315.6 4 92-100 LQWEVLDSL 141.2 5 26-34 KIPVSGPFL 56.5 6 515-523 NLSSAEVVV 28.5 7 223-231 KQTQSKIDV 24.7 8 367-375 GLNLNALGL 21.4 69 201124530 9 99-107 SLLVQYGW 20.6 10 374-382 GLFPPTSGM 18.4 11 423-431 KQGQHIKQL 17.4 12 143-151 QLENFTLKV 16.9 13 407-415 TVHLFIPAL 16.3 14 502-510 VIGKGGKTV 16.3 15 263-271 IMHKEAQDI 12.8 16 429-437 KQLSRFAGA 12.4 17 105-113 GVVESCEQV 12.2 18 513-521 LQNLSSAEV 12.0 19 409-417 HLFIPALSV 8.8 20 321-329 YNPERTITV 8.6 預測HLA-A2轉殖基因小鼠之IMP-3活性細胞毒殺性Τ 淋巴球以及HLA-A2限制之細胞毒殺性Τ淋巴球 為了測試哪一個胜肽可誘導胜肽活性細胞毒殺性Τ淋 巴球，//? f/ ire»刺激經兩次9單位胜肽（9 - me r pe p t i d e s ) 免疫之HLA-A2 “謂轉殖基因（Tg)小鼠的CD4_脾臟細 胞，如”材料與方法”所述。發現受到IΜ P - 3 - 5 5 2 - 5 6 0 (S E Q ID NO: 3) 、 IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及 IMP-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽刺激的 CD4-脾臟細 胞，對受到同源胜肽脈衝之同源基因BM-DCs反應，而產生 了 INF- 7。與單獨抗BM-DCs的INF- 7相比較，這些CD4-脾臟細胞辨認抗原呈現細胞並且產生INF- r (尸〈0. 05)(第 1 圖）。這些結果顯示 IMP-3-552-560 (SEQ ID N0: 3)、 IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及 IMP-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽可誘導在HLA-A2 Tg小鼠中對產生INF-r具 有強活性的細胞毒殺性T淋巴球。 70 201124530 誘導IMP-3活性人類細胞毒殺性τ淋巴球以及HLA-A2 限制之人類細胞毒殺性Τ淋巴球

藉由具有 IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1) ' IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) 、 IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及 IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽之 PBMCs 的 刺激’ IMP-3活性細胞毒殺性τ淋巴球產生自HLA-A2 (A*0 20 1 )陽性健康捐贈者！的PBMCs。藉由INF_ 7酵素結 合免疫斑點分析，來檢驗抗胜肽脈衝T2細胞的I NF- r的 產生。細胞毒殺性T淋巴球表現出INF- 7的高生產力，其 中此INF-γ係抗經同源IMP_3胜肽脈衝之T2細胞，且上 述的高生產力係指，與抗經無關ΗIV胜肽（i rre 1 evan t ΗIV peptide )脈衝之T2細胞相比較而言，其具有顯著差異（p <〇.〇5)(第 2 圓）。這些結果顯示，imP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1)、IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3)、IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及 IMP-3-5 1 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽可誘 導對這些胜肽具有專一性的人類細胞毒殺性T淋巴球。此 外，分析在 IMP-3-1 99-207 (SEQ ID Ν0: 1)、ΙΜΡ-3-552-560 (SEQ ID NO: 3)、IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及 IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽專一性的細胞毒殺性 Τ'淋巴球之細胞表面上的CD107a之暴露，以檢驗細胞毒殺 活性。利用IMP_3 —552_560 (SEQ ID N〇: 3)胜肽來刺激細 胞毒殺性T淋巴球，並利用anti-CDl〇7a niAb或小鼠免疫 球蛋白G ( mouse IgG)來將其染色以作為控制組（第3a 圓）。經無關HIV胜肽刺激之細胞毒殺性τ淋巴球，亦利 201124530 用anti-CD10 7a mAb或小鼠免疫球蛋白G ( mouse IgG)來 將其染色（右邊版面）。利用IMP-3-552-560 (SEQ ID NO. 3)胜肽的刺激’在5. 7%的所有CD8陽性細胞中偵測到CD8 陽性/CD1 07a陽性細胞（左邊版面）。作為非專一性訊息， 在0. 7%的細胞中偵測到利用小鼠免疫球蛋白g的染色，以 及在1 _ 5%的經ΗIV胜肽刺激的細胞中偵測到cj)8陽性 /CD1 07a陽性細胞’其中以經HIV胜肽刺激的細胞作為陰 性控制組（中間舆右邊版面）。CD107a通常不會表現於細 胞毒殺性T淋巴球的細胞表面’只有在活性去顆粒作用 (active degranulation)期間會暴露出來（Betts M et al.

J Immunol Methods. 2003 Oct 1; 281(1-2) ：65-78) > 上 述結果顯示’細胞毒殺性T淋巴球會對IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1) 、 IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) 、 IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及 IMP-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜

肽反應’而產生細胞毒殺活性。藉由51 Cr釋放分析 (51Cr-release assays)，來檢驗抗胜肽脈衝的T2細胞之 細胞毒殺活性（第3B圖）。來自健康捐贈者的PBMCs之 經誘導的細胞毒殺性T淋巴球，對經imp-3-1 99-207 (SEQ ID NO: 1)或 IMP-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽脈衝的 T2細胞’表現出細胞毒殺活性，然而其不會對經無關 ΗIV-A2胜肽脈衝的T2細胞’表現出細胞毒殺活性。這些 結果顯示’這些細胞毒殺性Τ淋巴球具有胜肽專一性 (peptide-specific)的細胞毒殺性。 72 201124530 誘導來自肺癌患者之IMp_3活性細胞毒殺性T淋巴球 舆HLA-A2限制之細胞毒殺性τ淋巴球 藉由 IMP-3-552-560 (SEQ ID Ν0: 3)、 ΙΜΡ-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及 imp-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽， 來誘導來自HLA-A2 (A*020 1 )陽性肺癌患者的PBMCs之 IMP-3專一性的細胞毒殺性τ淋巴球。在第4A圖中，來自 肺癌病患（標示為病患14與病患1 〇 3 )的細胞毒殺性T淋 巴球’對經IMP-3-26-34 (SEQ ID N0: 5)胜肽脈衝（右邊 版面）以及對經IMP-3-51 5-523 (SEQ ID N0: 6)胜肽脈衝 (左邊版面）之T2細胞，分別表現出有INF- r的產生。 與經無關ΗIV胜肽脈衝之T2細胞相比較，其顯著地表現出 高INF- τ的產生活性〈〇. 〇5)，且INF- τ的產生對這些 胜肽有專一性。51 Cr釋放分析實驗顯示，來自其他肺癌病 患（標示為病患4與病患3 )之PBMCs的細胞毒殺性T淋 巴球，對經IMP-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽脈衝（左 邊版面）以及對經IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)胜肽脈衝 (右邊版面）之T2細胞，表現出細胞毒殺活性，但對經無 關ΗIV胜肽脈衝（第4B圖）之T2細胞，則未表現出細胞 毒殺活性。這些結果顯示，不僅是使用健康捐贈者的 PBMCs ’包括使用肺癌病患的PBMCs，這些胜肽皆可誘導對 胜肽具有專一性的細胞毒殺性T淋巴球。 抗IMP-3及HLA-A2陽性癌細胞株的細胞毒殺性T淋巴 球之細胞毒殺活性 73 201124530 利用 Cr釋放分析’來檢驗殺死表現imP-3與HLA-A2 U抑^/)兩者之人類癌細胞株的能力。如第5A圖所示， 來自經 IMP-3-552-560 (SEQ ID N0: 3)胜肽、IMP —3_26_34 (SEQ ID NO: 5)胜肽、IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6)胜 肽、以及IMP-3-1 99-207 (SEQ ID NO: l)胜肽脈衝之健康 才月贈者2的P B M C s誘導的細胞毒殺性T淋巴球，對p a N C -1 表現出細胞毒殺活性’表現出IΜ P - 3與HL A - A 2 ( J_/) 兩者。另一方面’上述的這些細胞毒殺性T淋巴球不會對 MCF7表現出細胞毒殺活性，其只表現出HLA-A2 而沒有表現出IMP-3 ;或對A549而言，只表現出imp-3 .而 沒有表現出HLA-A2 U抑烈7)。此外，來自經IMP-3-552-560 (SEQ ID N0: 3)胜肽、IMP-3-26-34 (SEQ ID N0: 5)胜 肽、IMP-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽誘導之肺癌病患 (標示為病患14與病患4)的PBMCs誘發的細胞毒殺性τ 淋巴球，對PANC-1 (IMP-3陽性，HLA-A2陽性）亦表現出 細胞毒殺活性，但不會對MCF7 ( IMP-3陰性，HLA-A2陽性） 與A549 (IMP-3陽性，HLA-A2陰性）表現出細胞毒殺活性 (第 5B 圖）。來自經 imP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1)或 IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6)胜肽脈衝之健康捐贈者的 PBMCs產生的細胞毒殺性τ淋巴球細胞株，對MCF7/IMP-3 細胞（以基因轉染MCF7細胞；HLA-A2陽性、IMP-3 陽性）’但不會對MCF7細胞（HLA-A2陽性，IMP-3陰性）， 表現出細胞毒殺活性（第5C圈）。來自經IMP-3-1 99-207 (SEQ ID NO: 1)或 IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6)胜 74 201124530 肽脈衝之健康捐贈者的pBMCs產生的細胞毒殺性T淋巴球 細胞株，對SW620，SKHepl，但不會對Α549細胞（HLA-A2 陰性，IMP-3陽性）或MCF7細胞（HLA-A2陽性，imp-3陰 性）’表現出細胞毒殺活性（第5D圖）。 藉由anti-HLA-class I單株抗體來抑制細胞毒殺性τ 淋巴球反應 為了證實經誘導的細胞毒殺性T淋巴球會以 HLA-class I限制的方式，辨認目標細胞，利用抗HLA-Ciass I (W6/32， IgG2a) 、 HLA-DR (H-DR-1， IgG2a) 、 anti-HLA-A2 mAb (BB7. 2)之單株抗體’來阻斷細胞毒殺性τ淋巴球的抗 原專一性反應’以執行抑制分析。在第6Α圓中，藉由產生 自經 ΙΜΡ-3-552-560 (SEQ ID Ν0: 3)胜肽（左邊版面）、 IMP-3-26-34 (SEQ ID N0: 5)胜肽（中間版面）、或 IMP-3-5 1 5-523 (SEQ ID N0: 6)胜肽（右邊版面）刺激之 肺癌患者14的細胞毒殺性T淋巴球，來抑制I nf - r的產 生’並利用INF- r酵素結合免疫斑點分析來檢驗其抑制情 形。藉由施予W6/32 ’顯著地抑制抗Lu99細胞之INF - 7的 產生戶<0. 05)，但抗Lu99細胞之INF- r的產生並不會 丈到施予H-DR-1的抑制。這些結果清楚地顯示，這些細胞 毋殺性T淋巴球以HLA-c 1 ass I限制的方式，辨認表現出 IMP-3的目標細胞。此外’抗HLA-class I與HLA-A2的阻 斷抗體（blocking mAb)，顯著地抑制INF_ r的產生與細 胞毒殺活性，但INF- r的產生與細胞毒殺活性並不會受到 75 201124530 控制組 anti-HLA-class Ii mAb的抑制（第6B-D圈）。這 些結果清楚地顯示，在癌 A 况、、田胞中’這些胜肽自IMP-3蛋白 自然的處理而成，且表現於 '文中的HLA-A2中，好讓胜肽誘 導的細胞毒殺性T淋巴球辨認。 IMP-3抗原的胜狀輿装 兴具他蛋白質之間的同琢分析 (Homology analysis) IMP-3-199-207 (SEQ ID NO： l). IMP-3-552-560 (SEQ NO: 3)、IMP|26_34 ⑽ ID N〇: 5)以及

IMP 3 515 523 (SEQ ID NO: 6)胜肽刺激的細胞毒殺性T 淋巴球，表現出顯著且專一的細胞毒殺性τ淋巴球活性。 上述結果可能導因於ΙΜΡ一3一199_2〇7 (SEQ ID Ν〇: υ、 IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3)、IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6)胺基酸的序列，其 與衍生自其他已知可使人類免疫系統過敏之分子的胜肽同 源。為了排除上述的可能性，利用如BLAST運算的查詢 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /blast/blast.cgi)，來 進行這些胺基酸序列的同源分析，其中BLAST運算的查詢 顯示沒有與這些胺基酸序列顯著同源的序列。上述同源分 析的結果顯示，IMP-3-1 99-207 (SEQ ID NO: 1)、 IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) > IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5)以及IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6)胺基酸的序列是獨 76 201124530 一無一的，因此，就我們所知，這些分子提高對於一些不 相關分子的免疫反應之可能性乃微乎其微^。 總結來說 ’ IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1)、 IMP-3-552-560 (SEQ ID NO： 3) ' IMP-3-26-34 (SEQ ID NO· 5)以及IMP-3-51 5-523 (SEQ ID NO: 6)胺基酸被確定為新 穎之衍生自IMP-3的HLA-A2 (A*020 1 )限制之抗原決定位 胜肽’並且被證明其能夠用於具有I mp_3表現腫瘤的 HLA-A2 (A*020 1 )陽性病患，作為癌症疫苗。 產業利用性 本發明鑑疋了新的腫瘤相關抗原（tumor — assoc丨e(j antigens，TAAs) ’特別是那些可強力誘導專一性抗腫瘤免 疫反應的腫瘤相關抗原。這些腫瘤相關抗原值得更進一步 發展對於癌症的胜肽疫苗接種策略之臨床應用。 所有引用於本說明書中的專利、專利應用、以及公開 發表論文已納入參考文獻中。 雖然已詳細描述本發明並參照其具體實施例，然可瞭 解的是，以上描述係為性質上的示範與說明，其旨在說明 本發明與其最佳實施例。透過常規的試驗，任何所屬技術 領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍 内’當可作各種不同之更動與潤飾。因此本發明之保護範 圍並不限於以上描述，當視後附之申請專利範圍所界定者 77 201124530 為準。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示在轉殖基因小鼠體内之經誘導的細胞毒殺 性τ淋巴球上’ INF- r之酵素結合免疫斑點分析法 (enzyme-linked immunospot assay，ELISP0T)的結果。 受到胜肽（SEQ ID NOs: 3、5及6)刺激的細胞毒殺性τ淋 巴球，當與控制組相比較時，表現出強INF- 7*產生的反應 (上方版面）。誤差線（error bars )表示標準偏差 (standard deviation，SD)。統計學上的顯著差異以星 號（* P〈 0. 0 5 )標示。二重複孔之酵素結合免疫斑點分析法 計算的示範照片顯示於下方版面。細胞毒殺性T淋巴球經 SEQ ID N0: 6胜肽的BM-DC脈衝，表現出203至226點/ 孔（spots/well)(下方版面的左邊），然而，細胞毒殺 性T淋巴球在沒有添加胜肽的BM-DC中，表現出74至1 〇5 spots/well (下方版面的右邊）。 第2圈由一系列線圖所組成’顯示在健康捐贈者1的 人類細胞毒殺性T淋巴球上，IF N - τ'酵素結合免疫吸附分 析的結果。受到SEQ ID NOs : 1、3、5及6胜肽刺激的人 類細胞毒殺性T淋巴球，當與受到無關HIV胜肽脈衝的樣 本相比較時，表現出強抗受到SEQ ID NOs ·· 1、3、5及6胜 肽脈衝之T2細胞的INF- τ產生的反應。誤差線表示標準 偏差。 第3圈由一系列分佈圖（A)及線狀圖（B)所組成，顯示 78 201124530 2導來自HLA-A2陽性之肺癌患者及健康捐贈者的丨肿^專 一性的人類細胞毒殺性T淋巴球的結果。（A)部分表示螢光 活化細胞分選技術（fluorescence —activated s〇rter ’ FACS)分析的結果，其偵測在受到η N〇s:丄、 3或6胜肽刺激後的健康捐贈者丨或肺癌患者丨的人類細 肊毋杈性T淋巴球上之CDl 07a的表現。利用有螢光素標記 (nTC-conjUgated)之抗CD1〇7a抗體（上方版面），或 以螢光素標記之抗小鼠免疫球蛋白G ( IgG1)作為控制組 (中間版面），來將受到胜肽刺激的人類細胞毒殺性τ淋 巴球染色。作為刺激的陰性控制組（negative c〇ni;r〇1 )， 利用HI V胜肽來刺激細胞毒殺性τ淋巴球，並利用有蝥光 素標記（FITC-conjugated)之抗CD107a抗體將細胞毒殺 性T淋巴球染色（下方版面）。當細胞毒殺性τ淋巴球受 到SEQ I β NOs : 1、3、5或6胜肽刺激時，於細胞毒殺性τ 淋巴球上偵測CD 107a與控制組相比較下之表現。（B)部分 顯示在51Cr釋放分析中，抗受到同源ιΜΡ_3衍生之胜肽脈 衝的Τ2細胞之IΜΡ-3專一性的細胞毒殺性τ淋巴球的細胞 毒殺性。抗受到SEQ ID NO: 1 (中空三角形；左邊及中間 版面）或SEQ ID N0: 6 (中空三角形；右邊版面）胜肽以 及無關ΗIV - A 2 (實心三角形）胜肽脈衝的τ 2細胞之細胞 毒殺性T淋巴球的細胞毒殺性f 第4圖由一系列柱狀圖（A)及線狀圖（β )所組成，顯示 誘導來自三位肺癌患者的週邊血液單核細胞（PBMCs )之 IMP-3專一性的細胞毒殺性T淋巴球的結果。（a )部分顯 79 201124530 示，自受到SEQ ID NO: 5胜肽刺激肺癌患者14，以及受 到SEQ ID N0 : 6胜肽刺激肺癌患者1 〇 3的週邊血液單核細 胞誘導的細胞毒殺性T淋巴球，其表現出抗受到同源胜肽 脈衝之T2細胞的INF- r產生，與受到無關ΗIV胜肽脈衝 的樣本相比較具有顯著差異。統計學上的顯著差異以星號 (* Ρ <0. 05)標示。誤差線表示標準偏差。（Β)部分顯示， 當與受到無關HI V胜肽脈衝的樣本相比較時，自受到SEQ ID NO : 3胜肽刺激肺癌患者4，以及受到SEQ ID NO: 5胜肽 刺激肺癌患者3的週邊血液單核細胞誘導的細胞毒殺性τ 淋巴球，其表現出抗受到同源胜肽脈衝之T2細胞的細胞毒 殺活性。 第5圈由一系列的線狀圖所組成，顯示利用内源性表 現 IMP-3 (endogenously expressing IMP-3)的細胞毒殺 性T淋巴球及癌細胞株之51Cr釋放分析的結果。（A)部分表 示，自受到SEQ ID NOs : 1、3、5及6胜肽刺激的健康捐 贈者2之週邊血液單核細胞誘導的細胞毒殺性T淋巴球， 其表現出細胞毒殺活性。這些細胞毒殺性T淋巴球表現出 抗PANC-1 (IMP-3 +，HLA-A2 + )的細胞毒殺活性，但未表現 出抗 MCF7 (IMP_3_，HLA-A2 + )以及抗 A549 (IMP-3 +，HLA-A2 — ) 的細胞毒殺活性。（B)部分表示，藉由51Cr釋放分析來读 測’自受到SEQ ID NOs : $及5胜肽刺激的肺癌患者14， 以及自受到SEQ ID NOs : 6胜肽刺激的患者4之週邊血液 單核細胞誘導的細胞毒殺性T淋巴球之細胞毒殺活性。這 些細胞毒殺性T淋巴球表現出抗PANC-1 (IMP-3 +，HLA-A2 + ) 80 201124530 的細胞毒殺活性’但未表現出抗M C F 7 ( IΜ P - 3，H L A - A 2 +) 以及抗A549 (IMP-3 +，HLA-A20的細胞毒殺活性。（C)部分 表示，藉由51Cr釋放分析來分析，抗MCF7/IMP3 (中空圓 形；利用基因轉染MCF7細胞）或抗MCF7 (實心圓 形）或A549 (實心菱形）的IMP-3專一性的細胞毒殺性T 淋巴球之細胞毒殺活性。（D)部分表示，藉由51Cr釋放分析 來分析，抗SW620 C中空三角形）、抗SKHepl (中空菱形）、 抗MCF7 (實心圓形）或A549 (實心菱形）的IMP-3專一性 的細胞毒殺性T淋巴球之細胞毒殺活性。這些產生自無論 受到SEQ ID NOs: 1或者受到及受到SEQ ID NOs: 6胜肽 刺激的徤康捐贈者之細胞毒殺性T淋巴球細胞株，其表現 出抗SW620、SKHepl的細胞毒殺活性，但未表現出抗[F7 (IMP-3·，HLA-A2 + )以及抗 A549 (ΙΜΡ-3 +，HLA-A2 )的細胞 毒殺活性。 第6圖由一系列柱狀圖（a、Β、C)以及線狀圖（c)所組 成’顯示利用 anti-HLA class I mAb (W6/32，IgG2a)或 anti-HLA-A2 mAb對細胞毒殺性T淋巴球反應的抑制。藉 由IFN - 7酵素結合免疫吸附分析，來彳貞測自受到seq I ρ N〇s : 1、3、5及6胜肽刺激的肺癌患者14之週邊血液單 核細胞誘導的細胞毒殺性τ淋巴球的活性。藉由W6/32顯 著地抑制受到細胞毒殺性T淋巴球調控之INF- 7"的產生， 但INF- γ的產生與細胞毒殺活性並不會受到控制組 anti-HLA-class 11 mAb的抑制（第6B-D圖）。誤差線表 示標準偏差。統計學上的顯著差異以星號（* p <〇. 〇5)標 81 201124530 示。受到細胞毒殺性T淋巴球調控之丨NF_ 7的產生（b)或 細胞毒殺性（C及D)顯示於後面圖式。中空圓形：pANC1 ; 實心圓形：PANC1 + W6/32 ;方形：PANC1 + c〇ntr〇1 mAb。 柱狀圖顯示，當細胞毒殺性τ淋巴球細胞株與pANCi (中 空柱形）' PANCl + control mAb (中空；、 柱形）、或PANC1 +阻斷抗體（blocking mAb)(實心柱形）並 7 ^丹培養時，INF_ r的產生（B)或細胞毒殺性（D)。個別來自兩個 數據表現出相似的結果。在（B)部分中，統 立試驗的 異以星號標示。 予上的顯著差 【主要元件符號說明】 無 82 201124530 序列表 〈110>腫瘤療法.科學股份有限公司 <120>丨MP-3寡胜肽及其疫苗

<130> 0NC-A0921-TW <150> US 61/265,657 〈151> 2009-12-01 <150> US 61/371,434 <151〉 2010-08/06 <160> 26 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人工 <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 1

Arg Leu Leu Val Pro Thr Gin Phe Val 1 5 〈210〉 2 <211> 9 〈212〉 PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 2 201124530

Lys lie Leu Ala His Asn Asn Phe Val 1 5 <210> 3 〈211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 3

Lys lie Gin Glu lie Leu Thr Gin Val 1 5 <210〉 4 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉 人工 〈220〉 〈223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 4 Leu Gin Trp Glu Val Leu Asp Ser Leu 1 5 <210〉 5 <211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉 人工 〈220〉 〈223〉 人工合成胜肽序列 〈400〉 5 201124530

Lys lie Pro Val Ser Gly Pro Phe Leu 1 5 <210> 6 〈211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 〈400> 6

Asn Leu Ser Ser Ala Glu Val Val Val 1 5 <210〉 7 〈211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 7

Lys Gin Thr Gin Ser Lys lie Asp Val 1 5 <210〉 8 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 8 201124530

Gly Leu Asn Leu Asn Ala Leu Gly Leu 1 5 〈210〉 9 〈211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 9

Ser Leu Leu Val Gin Tyr Gly Val Val 1 5 〈210〉 10 〈211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工 〈220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 10 6ly Leu Phe Pro Pro Thr Ser Gly Met 1 5 <210〉 11 <211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 〈400> 11 4 201124530

Lys Gin Gly Gin His lie Lys Gin Leu 1 5 <210〉 12 〈211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 12

Gin Leu Glu Asn Phe Thr Leu Lys Val 1 5 〈210〉 13 <211> 9 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 13

Thr Val His Leu Phe lie Pro Ala Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工 〈220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 14 201124530

Val lie Gly Lys Gly Gly Lys Thr Val 1 5 <210> 15 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 15 lie Met His Lys Glu Ala Gin Asp Me 1 5 〈210〉 16 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 16

Lys Gin Leu Ser Arg Phe Ala Gly Ala 1 5 〈210〉 17 〈211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工 〈220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 17 201124530

Gly Val Val Glu Ser Cys Glu Gin Val 1 5 <210> 18 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 18

Leu Gin Asn Leu Ser Ser Ala Glu Val 1 5 <210〉 19 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213>人工 〈220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 19

His Leu Phe lie Pro Ala Leu Ser Val 1 5 〈210〉 20 〈211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 20 201124530

Tyr Asn Pro Glu Arg Thr lie Thr Val 〈210〉 21 <211> 4168 <212> DNA <213〉人類 <400〉 21 aagacttagg aagactggtg gatgcgtttg ggttgtagct aggctttttc ttttctttct 60 cttttaaaac acatctagac aaggaaaaaa caagcctcgg atctgatttt tcactcctcg 120 ttcttgtgct tggttcttac tgtgtttgtg tattttaaag gcgagaagac gaggggaaca 180 aaaccagctg gatccatcca tcaccgtggg tggttttaat ttttcgtttt ttctcgttat 240 ttttttttaa acaaccactc ttcacaatga acaaactgta tatcggaaac ctcagcgaga 300 acgccgcccc ctcggaccta gaaagtatct tcaaggacgc caagatcccg gtgtcgggac 360 ccttcctggt gaagactggc tacgcgttcg tggactgccc ggacgagagc tgggccctca 420 aggccatcga ggcgctttca ggtaaaatag aactgcacgg gaaacccata gaagttgagc 480 actcggtccc aaaaaggcaa aggattcgga aacttcagat acgaaatatc ccgcctcatt 540 tacagtggga ggtgctggat agtttactag tccagtatgg agtggtggag agctgtgagc 600 aagtgaacac tgactcggaa actgcagttg taaatgtaac ctattccagt aaggaccaag 660 ctagacaagc actagacaaa ctgaatggat ttcagttaga gaatttcacc ttgaaagtag 720 cctatatccc tgatgaaatg gccgcccagc aaaacccctt gcagcagccc cgaggtcgcc 780 gggggcttgg gcagaggggc tcctcaaggc aggggtctcc aggatccgta tccaagcaga 840 aaccatgtga tttgcctctg cgcctgctgg ttcccaccca atttgttgga gccatcatag 900 960 gaaaagaagg tgccaccatt cggaacatca ccaaacagac ccagtctaaa atcgatgtcc 8 201124530 accgtaaaga aaatgcgggg gctgctgaga gcacctctgc ggcttgtaag tctattctgg aattcacaga agagatcccc ttgaagattt ttggtaaaga aggaagaaat cttaaaaaaa tatctccatt gcaggaattg acgctgtata atgttgagac atgtgccaaa gctgaggagg aaaatgatat tgcttctatg aatcttcaag ccttgggtct gttcccaccc acttcaggga ccatgactcc tccctacccg cagtttgagc tcccagctct atcagtcggt gccatcatcg ctcgctttgc tggagcttca attaagattg ggatggtgat tatcactgga ccaccagagg gaaaaattaa agaagaaaac tttgttagtc tcagagtgcc atcctttgct gctggcagag aacttcagaa tttgtcaagt gcagaagttg atgaccaagt ggttgtcaaa ataactggtc aaattcagga aattctgact caggtaaagc gaccacctca gtcaagacgg aagtaaaggc ccaaaccaaa gacagattgc ttaaccaaca atgcacaagt ttttacctag ccagttgttt ctctgtgaga atgtatactt tatgctctct agtcgattac tatcctctct actcctgaag 1020 agattatgca taaggaagct caagatataa 1080 tagctcataa taactttgtt ggacgtctta 1140 ttgagcaaga cacagacact aaaatcacga 1200 atccagaacg cactattaca gttaaaggca 1260 agatcatgaa gaaaatcagg gagtcttatg 1320 cacatttaat tcctggatta aatctgaacg 1380 tgccacctcc cacctcaggg cccccttcag 1440 aatcagaaac ggagactgtt catctgttta 1500 gcaagcaggg ccagcacatc aagcagcttt 1560 ctccagcgga agcaccagat gctaaagtga 1620 ctcagttcaa ggctcaggga agaatttatg 1680 ctaaagaaga ggtgaaactt gaagctcata 1740 ttattggaaa aggaggcaaa acggtgaatg 1800 ttgtccctcg tgaccagaca cctgatgaga 1860 acttctatgc ttgccaggtt gcccagagaa 1920 agcaccaaca acagaaggct ctgcaaagtg 1980 tcaggaaaca gcccaccaca gaggcagatg 2040 gatgggcgct gaccccctat ccagaatcac 2100 ctgaggacca ggcaactttt gaactcctgt 2160 gaaatgtatg acacccagct ttaaaacaaa 2220 201124530 caaacaaaca aacaaaaaaa gggtggggga ctttgttgta gtctcacagt ataacagata gccagaaatt ggcttaatga tgctttcact aattgttaaa attggatcag aataattatc agaaaaactg ttctcagttt tatttttacc gctgaatggt gttggcaggg gtattaaacg agtaatacaa tgaaaagcaa aattgttcct gatagaagtc caaccgtttt ttaaaaaata ggcaaattaa gatttttact tctggctggt ttttttgagg cttttgacac agttattagt gcctagtatc tggagagcag cactaccatt tgacggtact aacaaagtgg tcgcaggaga gagacttcag ttttttgttt agctacatga gactatcaat acctaaagaa agtgcatcag caaaaagcaa gctttagctt gtcttatagg atgggacagt catagatggt gtgacagtgt gggccagcac tgtcatgagc ctcactaagc taaaaaaaaa aaattagact ccaccttaag gtgcaatcag ttctttgaaa aaaaagtcaa atataatttg aatgactgtg aaaacatatg cttgacagca aagcccagta cgtacaattg gggagggaaa gagaagagct ctgcacttcc 2280 ttctaattct tcttaatatt cccccataat 2340 aaattcatca aatagattgc tcctaaatcc 2400 acaggaactt aaatgttaag ccattagcat 2460 taacactaac atgagtaacc taagggaagt 2520 tgcattttta ctcaactacc tcaggtattc 2580 tttttttgaa aattttatat actttataat 2640 aatttaaaat ttaacagcaa tcagctaaca 2700 gacagtaaag ctggaaaatt aatttcaggg 2760 taaatcaaat gttcaaaaat acggagcagt 2820 tattctttca tttatagttg ggaaagtttt 2880 ttttggaacg gctggtttaa atggcttcag 2940 ttgaatgcat aataaatgct ttgtgcttct 3000 tgaagagatg caagactttc aactgactgg 3060 atgcttagtt tgccactaca cttcagacca 3120 ttaaacgcaa caaaaggcta catttccatg 3180 tattttgaag atttttaagc actgataaat 3240 tagtaaagta taacaggatt tctgtatact 3300 aagatagaga atacaagaaa agtttttggg 3360 acctttgata acgaactcat ttgctcactc 3420 tgttgggtgt gggtggtctc caaggccacg 3480 10 201124530 ctgctctctg aattgatttt ttgagttttg tttgtaagat gatcacagtc atgttacact 3540 gatctaaagg acatatatat aaccctttaa aaaaaaaatc actgcctcat tcttatttca 3600 agatgaattt ctatacagac tagatgtttt tctgaagatc aattagacat tttgaaaatg 3660 atttaaagtg ttttccttaa tgttctctga aaacaagttt cttttgtagt tttaaccaaa 3720 aaagtgccct ttttgtcact ggattctcct agcattcatg attttttttt catacaatga 3780 attaaaattg ctaaaatcat ggactggctt tctggttgga tttcaggtaa gatgtgttta 3840 aggccagagc ttttctcagt atttgatttt tttccccaat atttgatttt ttaaaaatat 3900 acacataggt gctgcattta tatctgctgg tttaaattct gtcatatttc acttctagcc 3960 ttttagtatg gcaaatcata ttttactttt acttaagcat ttgtaatttg gagtatctgg 4020 tactagctaa gaaataattc tataattgag ttttgtactc accatatatg gatcattcct 4080 catgtataat gtgccccaaa tgcagcttca ttttccagat accttgacgc agaataaatt 4140 ttttcatcat ttaggtgcaa aaaaaaaa 4168 <210〉 22 〈211〉 579 <212> PRT <213〉人類 〈400〉 22

Met Asn Lys Leu Tyr lie Gly Asn Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser 15 10 15

Asp Leu Glu Ser lie Phe Lys Asp Ala Lys lie Pro Val Ser Gly Pro 20 25 30

Phe Leu Val Lys Thr Gly Tyr Ala Phe Val Asp Cys Pro Asp Glu Ser 11 201124530 35 40 45

Trp Ala Leu Lys Ala lie Glu Ala Leu Ser Gly Lys lie Glu Leu His 50 55 60

Gly Lys Pro lie Glu Val Glu His Ser Val Pro Lys Arg Gin Arg lie 65 70 75 80

Arg Lys Leu 6ln lie Arg Asn lie Pro Pro His Leu Gin Trp Glu Val 85 90 95

Leu Asp Ser Leu Leu Val Gin Tyr Gly Val Val Glu Ser Cys Glu Gin 100 105 110

Val Asn Thr Asp Ser Glu Thr Ala Val Val Asn Val Thr Tyr Ser Ser 115 120 125

Lys Asp Gin Ala Arg Gin Ala Leu Asp Lys Leu Asn Gly Phe Gin Leu 130 135 140

Glu Asn Phe Thr Leu Lys Val Ala Tyr lie Pro Asp Glu Met Ala Ala 145 150 155 160

Gin Gin Asn Pro Leu Gin Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gly Leu Gly Gin 165 170 175

Arg Gly Ser Ser Arg Gin Gly Ser Pro Gly Ser Val Ser Lys Gin Lys 180 185 190

Pro Cys Asp Leu Pro Leu Arg Leu Leu Val Pro Thr Gin Phe Val Gly 195 200 205 12 201124530

Ala lie lie Gly Lys Glu Gly Ala Thr lie Arg Asn lie Thr Lys Gin 210 215 220

Thr Gin Ser Lys lie Asp Val His Arg Lys Glu Asn Ala Gly Ala Ala 225 230 235 240

Glu Lys Ser lie Thr lie Leu Ser Thr Pro Glu Gly Thr Ser Ala Ala 245 250 255

Cys Lys Ser lie Leu Glu lie Met His Lys Glu Ala Gin Asp lie Lys 260 265 270

Phe Thr Glu Glu lie Pro Leu Lys lie Leu Ala His Asn Asn Phe Val 275 280 285

Gly Arg Leu lie Gly Lys Glu Gly Arg Asn Leu Lys Lys lie Glu Gin 290 295 300

Asp Thr Asp Thr Lys Me Thr lie Ser Pro Leu Gin Glu Leu Thr Leu 305 310 315 320

Tyr Asn Pro Glu Arg Thr lie Thr Val Lys Gly Asn Val Glu Thr Cys 325 330 335

Ala Lys Ala Glu Glu Glu lie Met Lys Lys lie Arg Glu Ser Tyr Glu 340 345 350

Asn Asp lie Ala Ser Met Asn Leu Gin Ala His Leu lie Pro Gly Leu 355 360 365

Asn Leu Asn Ala Leu Gly Leu Phe Pro Pro Thr Ser Gly Met Pro Pro 13 201124530 370 375 380

Pro Thr Ser Gly Pro Pro Ser Ala Met Thr Pro Pro Tyr Pro Gin Phe 385 390 395 400

Glu Gin Ser 6lu Thr Glu Thr Val His Leu Phe lie Pro Ala Leu Ser 405 410 415

Val Gly Ala lie lie Gly Lys Gin Gly Gin His lie Lys Gin Leu Ser 420 425 430

Arg Phe Ala Gly Ala Ser lie Lys lie Ala Pro Ala Glu Ala Pro Asp 435 440 445

Ala Lys Val Arg Met Val lie lie Thr Gly Pro Pro Glu Ala Gin Phe 450 455 460

Lys Ala Gin Gly Arg lie Tyr Gly Lys lie Lys Glu Glu Asn Phe Val 465 470 475 480

Ser Pro Lys Glu Glu Val Lys Leu Glu Ala His lie Arg Val Pro Ser 485 490 495

Phe Ala Ala Gly Arg Val lie Gly Lys Gly Gly Lys Thr Val Asn Glu 500 505 510

Leu Gin Asn Leu Ser Ser Ala Glu Val Val Val Pro Arg Asp Gin Thr 515 520 525

Pro Asp Glu Asn Asp Gin Val Val Val Lys lie Thr Gly His Phe Tyr 530 535 540 14 201124530

Ala Cys Gin Val Ala Gin Arg Lys lie Gin Glu lie Leu Thr Gin Val 545 550 555 560

Lys Gin His 61 n Gin Gin Lys Ala Leu Gin Ser Gly Pro Pro Gin Ser 565 570 575

Arg Arg Lys 〈210〉 23 <211> 22 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> 〈223>人工序列 〈400> 23 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210〉 24 〈211〉 24 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 〈223>人工序列 <400> 24 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 25 <211> 21 〈212〉 DNA <213〉 人工序列 s 15 201124530 <220〉 〈223>人工序列 <400> 25 tcagaaatcc tttctcttga c

<210〉 26 <211〉 24 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉人工序列 <400> 26 ctagcctctg gaatcctttc tctt

Claims (1)

1. 201124530 七、申請專利範圍： 1. —種經分離的募胜肽’包括序列辨識號：丨、3、 5及6之胺基酸序列。 2. 一種經分離的寡胜肽，具有細胞毒殺性τ淋巴球誘 導能力，其中該寡胜肽係包括擇自下列序列辨識號：丨、3、 5及6之胺基酸序列，其中丨、2或數個胺基酸被取代、刪 除及/或加入。 3·如申請專利範圍第2項所述之經分離的寡胜肽，其 中该养胜肽具有一或兩者之下列特徵： (a) 自Ν端之第二個胺基酸為白氨酸或曱硫丁氨酸； 以及 (b) C端胺基酸為線氣酸或白氨酸。 4. 一種經分離之多核苷酸’其編碼出申請專利範圍第 1至3項之任一項的寡胜肽。 5. 一種誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘導能力之抗 原呈現細胞的方法，其中該方法係利用申請專利範圍第i 至3項之任一項所述之募胜肽。 6，如申請專利範圍第5項所述之誘導具有細胞毒殺性 淋巴球誘V %力之彳几原壬現細胞的方法，其中該方法包 括一步驟，該步驟係擇自由下列所組成之群組： (a) 利用申請專利範圍第1至3項之任一項所述之寡 胜肽與一抗原呈現細胞相接觸，以及 (b) 將編碼出申請專利範圍第1至3項之任一項之寡 胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。 201124530 7. 如申請專利範圍第5或6項所述之誘導具有細胞毒 殺性T淋巴球誘導能力之抗原呈現細胞的方法，其中該抗 原呈現細胞至少表現—HLA-A2抗原於其表面。 8. 一種誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法，係利用申請 專利fe圍第1至3項之任一項所述之寡胜肽。 9 ·如申請專利範圍第8項所述之誘導細胞毒殺性τ淋 巴球的方法，其中該方法包括一步驟，該步驟係擇自由下 列所组成之群組： (a) 利用一抗原呈現細胞及/或一外吐小體與CD8陽 I1生T、·’©胞相接觸，其中該外吐小體於其表面上表現申請專 利範圍第1至3項之任一項所述之寡胜肽與一人類白血球 組織抗原的複合物，以及 (b) 將一編碼出可形成一 T細胞受體次單元的多胜肽 之夕核普’引入申請專利範圍第1至3項之任一項所述 之寡胜狀與一人類白血球組織抗原的複合物於一細胞表面 上。 10. 申请專利範圍第9項所述之誘導細胞毒殺性τ淋 巴球的方法’其中該人類白血球組織抗原為HLA-A2。 11. 一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其以申請專 利範圍第1至3項之任一項之該寡胜肽為標的。 1 2.如申請專利範圍第丨丨項所述之細胞毒殺性τ淋巴 球’其中所述之細胞毒殺性T淋巴球可結合至申請專利範 圍第1至3項之任一項所述之寡胜肽與一人類白血球組織 抗原的複合物於一細胞表面上。 2 201124530 13·如申請專利範圍第11項所述之細胞毒殺性T淋巴 球’其中該人類白血球組織抗原為HLA-A2。 14. 一種經分離之細胞毒殺性Τ淋巴球，係藉由利用 申請專利範圍第1至3項之任一項所述之寡胜肽來誘導。 1 5 ·如申請專利範圍第14項所述之細胞毒殺性Τ淋巴 球，其藉由申請專利範圍第8至10項之任一項所述之方法 來誘導。 16. 一種經分離之抗原呈現細胞，其表現〆人類白血 球組織抗原與申請專利範圍第1至3項之任一項之寡胜狀 的複合物於其表面上。 1 7.如申請專利範圍第1 6項所述之抗原呈現細胞，其 中該人類白血球組織抗原為hla_a2。 1 8 ·如申請專利範圍第1 6或1 7項所述之抗原呈現細 胞’其藉由申請專利範圍第5至7項之任一項所述之方法 來誘導。 19. 一種於一個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方 '’其中該方法包括施予該個體一疫苗，該疫苗包括至少 居丨生成分’該活性成分係擇自由下列所組成之群組： (a) —或多個申請專利範圍第1至3項之任一項之寡 胜狀’或一其免疫活性片段； (b) —或多個編碼出申請專利範圍第1至3項之任一 項之寡胜肽的多核苷酸，或一其免疫活性片段； (c) 一或多個申清專利範圍第丨丨至丨5項之任一項所 述之經分離之細胞毒殺性τ淋巴球；以及 201124530 (d) —或多個申請專利範圍第16至18項所述之經分 離之抗原呈現細胞。 20.如申請專利範圍第19項所述之於一個體中誘導 一抗癌症之免疫反應的方法，其中所述之個體為HLA_A2陽 性。 21· 一種藥學試劑，用於癌症之治療及/或防治，及/ 或預防其手術後復發’其中該試劑包括一藥學上可接受之 載體，以及至少一活性成分，其擇自由下列所組成之群組： (a) —或多個申請專利範圍第J至3項之任一項之寡 胜肽，或一其免疫活性片段； 請导 項 (b) —或多個編碼 項之寡胜肽的多核苷酸，或一其免疫活性片段； (〇 -或多個抗原呈現細胞，其表現申請專利範圍負 1至3項之任一項項之寡胜肽與-人類白血球組織抗原备 複合物於其表面上；以及 ⑷-或多個細胞毒殺性了淋巴球，其可結合至 專利耗圍第1至3項之任_項所述之寡胜肽與—人類白土 球組織抗原的複合物於一細胞表面上。 22·-種藥學試劑，用於誘導細胞毒殺性τ淋巴球， 其中該試劑包括一藥學上 ^ am 1 予上J接又之載體，以及至少-活性 成刀擇自由下列所組成之群組： ⑷-或多㈣請專利範圍第i至3項之任 胜肽，或—其免疫活性片段； 、之寡 ⑻-或多個編碼出申請專利範圍第U 3項之任— 4 201124530 項之募胜肽的多核苷酸，或一其免疫活性片段； (C)—或多個抗原呈現細胞，其表現申請專利範圍第 1至3項之任一項所述之养胜肽與一人類白血球組織抗原 的複合物於一細胞表面上。 23·如申請專利範圍第21或22項所述之藥學試劑， 其被配製來用以投予一個體，其中所述之個體為hla_a2陽 性。 24. 如申請專利範圍第21至23項之任一項所述之藥 學試劑，其為一疫苗。 25. -種活性成分的用途，其中該活性成分擇自由下 列所組成之群組： (a) —或多個^青專利範圍第丨至3項之任一項之寡 胜肽； (b) 一或多個以-可表達的形式編碼出申請專利範圍 第1至3項之任一項之寡胜肽的多核苷酸； (C )—或多個4几原呈現么田日έϊ , 4；^ ^ ^ 兄、、田胞’其表現申請專利範圍第 1至3項之任一項之寡胜肽盥一人 /、 人頬白血球組織抗原的複 合物於其表面上，以及 ⑷—或多個細胞毒殺性了淋巴球，在製造-治療癌 人類白血球組織抗原的 症之藥學組合物或試料，其可結合至巾請專利範圍第丄 至3項之任一項所述之寡胜肽與 複合物於一細胞表面上。 途 26.如申請專利範圍第25 其中該藥學組合物或試劑被 項所述之活性成分的用 配製來用以投予一個體， 201124530 其中所述之個體為HLA-A2陽性。 27. —種經分離之寡胜肽，其包括一胺基酸序列擇自 由下列序列辨識號.1、3、5及6所組成之群組，用於一 個體中的癌症之治療及/或防治，及/或預防其手術後復 發’其中該個體為HLA-A2陽性 28.種經刀離之寡胜肽，纟包括一胺基酸序列擇自 由下列序列辨識號小3、5及6所組成之群組，其中卜 2或數個胺基酸被取代、删险 爾J k及/或加入，且該寡胜肽具有 細胞毒殺性T淋巴球之誘藤妒+ ^ 八 < 必导把力’其用於一個體中的癌症 之治療及/或防治，及/或預防甘 > 乂卞貝防其手術後復發，其中該個體 為HLA-A2陽性。 29·如申請專利範圍第28項所述之經分離的寡胜 肽，其中該养胜肽具有一或兩者之下列特徵： U)自N端之第二個胺基酸為白氨酸或曱硫丁氨酸； 以及 (b) C端胺基酸為纈氨酸或白氨酸。 6