MX2012006126A

MX2012006126A - Oligopeptidos imp-3 y vacunas que incluyen los mismos.

Info

Publication number: MX2012006126A
Application number: MX2012006126A
Authority: MX
Inventors: Yusuke Nakamura; Takuya Tsunoda; Yasuharu Nishimura; Michiko Harao; Yusuke Tomita
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-06-19
Also published as: EP2507256A1; RU2550695C2; AU2010327878B2; WO2011067920A1; SG10201407944TA; IL219976A0; CN102741271B; CA2782271A1; US20120308590A1; AU2010327878A1; TW201124530A; JP2013511958A; RU2012127358A; KR20120099106A; SG181107A1; CN102741271A; BR112012013139A2; EP2507256A4

Abstract

Se describen en este documento oligopéptidos que tienen inducibilidad de células T citotóxicas y son adecuadas para el uso en el contexto de la inmunoterapia contra el cáncer, de manera más particular vacunas contra el cáncer. Ejemplos notables incluyen oligopéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6, en donde 1, 2 o varios aminoácidos se sustituyen, se suprimen, se insertan o se agregan opcionalmente siempre y cuando retengan la infusibilidad de células T citotóxicas de los oligopéptidos originales.. También se describen formulaciones farmacéuticas o "fármacos" relacionados con estos oligopéptidos adecuados para tratar o prevenir cánceres o tumores, así como también la recurrencia post-operativa de los mismos.

Description

OLIGOPEPTIDOS IMP-3 Y VACUNAS QUE INCLUYEN LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente . invención se refiere al campo de ciencia biológica, más específicamente al campo de terapia contra el cáncer. En particular, la presente invención se refiere a oligopéptidos novedosos que son extremadamente efectivos como vacunas contra el cáncer y fármacos para tratar y prevenir tumores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha demostrado que los T-linfocitos citotóxicos (CTLs) CD8 positivos reconocen péptidos epítopos derivados de los antígenos asociados a tumor (TAAs) encontrados en las moléculas de clase I de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) , y luego extermina las células tumorales. Puesto que el descubrimiento de la familia de antígeno de melanoma (MAGE) como el primer ejemplo de TAAs, muchos otros TAAs se han descubierto, en primer lugar a . través de procedimientos inmunológicos (NPL 1, ???p T, Int J Cáncer 8 de Mayo de 1993, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1 de Marzo de 1996, 183(3): 725-9). Algunos de estos TAAs están actualmente sometiéndose a desarrollo clínico como objetivos inmunoterapéuticos-.

Está en curso la identificación de nuevos TAAs, capaces de inducir respuestas inmunitarias antitumorales potentes y especificas que garanticen un desarrollo adicional e investigación clínica de estrategias de vacunación de péptidos para varios tipos de- cáncer. (NPL 3, Harris CC, J Nati Cáncer Inst 16 de Octubre de 1996, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield LH y colaboradores, Cáncer Res 1 de Julio de 1999, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers JL y colaboradores, Cáncer Res 1 de Noviembre de 1999, 59(21): 5554-9; NPL 6, van der Burg SH y colaboradores, J Immunol 1 de Mayo de 1996, 156(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka F y colaboradores, Cáncer Res 15 de Octubre de 1997, 57(20): 4465-8; NPL 8, Fujie T y colaboradores, Int J Cáncer 18 de Enero de 1999, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi M y colaboradores, Int J Cáncer 5 de Mayo de 1999, 81(3): 459-66; NPL 10, Oiso M y colaboradores, Int J Cáncer 5 de Mayo de 1999, 81(3): 387-94). Hasta hoy, ha habido varios reportes de ensayos clínicos que utilizan estos péptidos derivados de antígeno asociados a tumor. Desafortunadamente, se ha ¦ observado una baja tasa de respuesta objetiva en estos ensayos de vacuna contra el cáncer hasta ahora (NPL 11, Belli F y colaboradores, J Clin Oncol 15 de Octubre de.2002, 20(20): 4169-80; NPL 12, Coulie PG y colaboradores, Immunol Rev Octubre de 2002, 188: 33-42; NPL 13, Rosenberg SA y colaboradores, Nat Med Septiembre de 2004, 10(9): 909-15). Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad por la identificación de TAAs novedosos útiles como objetivos inmunoterapéuticos .

Con esa finalidad, a través del perfil de expresión génica con un microarreglo de cDNA de genoma completo que contiene 23,040 genes, el IMP-3 (proteina 3 de enlace de mRNA de factor II de crecimiento similar a insulina) se ha identificado como un gen regulado por incremento en cáncer de pulmón y de esófago (NPL 14, T. Kikuchi y colaboradores, Oncogene. 10 de Abril de 2003; 22(14): 2192-205, PTL 1, WO2004/031413, PTL 2, WO2007/013665, PTL 3, WO2007 /013671 ) . Se ha observado que la expresión de IMP-3 que se regula específicamente por incremento en las células tumorales de más de 90% de los pacientes con cáncer pero no se expresa en otro órganos vitales normales, excepto para testículos y placenta. Adicionalmente, la regulación por decremento de la expresión de IMP-3 con el método de interferencia de RNA se ha mostrado que suprime el crecimiento celular en las líneas de células cancerosas que expresan IMP-3. Una solicitud previa, WO2006/090810, describe péptidos derivados de IMP-3 (también descrito como K0C1) que tiene actividad inductora de CTL específica contra células tumorales que expresan exógenamente K0C1 (IMP-3) y HLA-A24. Aunque estos péptidos pueden ser adecuados para pacientes del tipo HLA-A24, sigue habiendo una necesidad por péptidos inductores de CTL para otros pacientes de tipo HLA.

Lista de Referencias Literatura de Patente [PTL 1] WO2004/031413 · [PTL 2] WO2007/013665 [PTL 3] WO2007/013671 [PTL 4] WO2006/090.810 Literatura No de Patente [NPL 1] Boon T, Int J Cáncer 8 de Mayo de 1993, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1 de Marzo de 1996, 183(3): 725-9 [NPL 3] Harris CC, J Nati Cáncer- Inst 16 de Octubre de 1996, 88(20): 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH'y colaboradores, Cáncer Res 1 de Julio de 1999, 59 (13) : 3134-42 [NPL 5] Vissers JL y colaboradores, Cáncer Res 1 de Noviembre de 1999, 59 (21) : 5.554-9 [NPL 6] van der Burg SH y colaboradores, J Immunol 1 de Mayo de 1996, 156 (9) : 3308-14 [NPL 7] Tanaka F y colaboradores, Cáncer Res 15 de Octubre de 1997, 57 (20) : 4465-8 [NPL 8] Fujie T y colaboradores, · Int J Cáncer 18 de Enero de 1999, 80 (2) : 169-72 [NPL 9] Kikuchi M. y colaboradores, Int J Cáncer 5 de Mayo de 1999, 81(3) : 459-66 [NPL 10] Oiso M y colaboradores, Int J Cáncer 5 de Mayo de 1999, 81(3) : 387-94 [NPL 11] Belli F y colaboradores, J Clin Oncol 15 de Octubre de 2002, 20 (20) : 4169-80 [NPL 12] Coulie PG y colaboradores, Immunol Rev Octubre de 2002, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA y colaboradores, Nat Med Septiembre de 2004, 10 (9) : 909-15 [NPL 14] T. Kikuchi y colaboradores, Oncogene . 10 de Abril de 2003; 22 (14) : 2192-205 SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de péptidos novedosos que pueden servir como objetivos de inmunoterapia . Debido a que los TAAs son en general percibidos por el sistema inmunitario como "propios" y por lo tanto no tienen frecuentemente inmunogenicidad innata, el descubrimi'ento de objetivos apropiados es de importancia extrema. El reconocimiento de que el IMP-3 se ha identificado como regulado por incremento en cánceres tales como cáncer de pulmón y cáncer de esófago, la presente invención fija como objetivo la proteina IMP-3 '(SEQ ID NO: 22) codificada por el gen de No. de Acceso de GenBank NM_006547.2 (SEQ ID 'NO: 21) para análisis futuros. En particular, se seleccionaron para estudio productos del gen IMP-3 que contienen péptidos epitopos que inducen respuestas CTL sorprendentemente potentes especificas a las moléculas correspondientes. En el contexto de la presente invención, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de un donador sano se estimularon utilizando los péptidos de la presente invención. Se establecieron los CTLs que reconocen específicamente células objetivo positivas HLA-A2 (A*0201) pulsadas con los péptidos respectivos, y se identificaron péptidos epitopos restringidos de HLA-A2 (A*0201) que pueden inducir respuestas inmunitarias potentes y específicas contra IMP-3 expresado sobre la superficie de células tumorales . Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que IMP-3 es fuertemente inmunogénico y los epitopos del mismo son objetivos efectivos para la inmunoterapia tumoral.

Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar oligopéptidos que tengan inducibilidad de CTL así como también una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6. Además, la presente invención contempla péptidos modificados, que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 o 6, en donde uno, dos o varios aminoácidos son mutados o alterados mediante por lo menos una de mutación seleccionada del grupo que consiste de sustitución, supresión, inserción y adición, siempre y cuando los oligopéptidos modificados resultantes retengan la inducibilidad del CTL de. los péptidos originales.

Cuando se administran a un sujeto, los presentes oligopéptidos se presentan sobre la superficie de las células que expresan antigeno para inducir los CTLs que fijan como objetivo los péptidos respectivos. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar células que presentan antigenos y exosomas que presentan cualquiera de los presentes péptidos, asi como también métodos para inducir células que presentan antigeno¦ asociadas con los mismos.

Una respuesta inmunitaria antitumoral se induce por la administración de los presentes oligopéptidos IMP-3 o polinucleótidos que codifican los oligopéptidos, asi como también exosomas y células que presentan antigeno que presentan tales oligopéptidos IMP-3. Por lo tanto, aún es otro objetivo de la presente invención proporcionar agentes farmacéuticos o composiciones farmacéuticas que contengan los oligopéptidos o polinucleótidos que los codifican, o los exosomas asociados y células que presentan antigeno, como sus ingredientes activos. Los agentes farmacéuticos o composiciones farmacéuticas de la presente invención encuentran uso particular como vacunas.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar métodos para por lo menos un propósito seleccionado del grupo que consiste de tratamiento, profilaxis de (es decir, prevención) cánceres (tumores) , y prevención de la recurrencia post-operativa del mismo, asi como también métodos para inducir CTLs, métodos para inducir inmunidad antitumoral, estos métodos incluyen la etapa de administrar los. oligopéptidos IMP-3, polinucleótidos que codifican los oligopéptidos IMP-3, exosomas o las células que presentan antigeno que presentan polipéptidos IMP-3 o los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención, a un sujeto en necesidad del mismo. Además, los CTLs de la presente invención también encuentran uso como vacunas contra el cáncer. Ejemplos de cánceres objetivos incluyen, pero no se limitan a cáncer de pulmón y cáncer de esófago .

Más específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente: [1] Un oligopéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6, [2] Un oligopéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6, en donde 1, 2, o varios aminoácido ( s ) se sustituyen, suprimen, insertan y/o agregan, en donde además el oligopéptido tiene inducibilidad (CTL) de linfocitos T citotóxicos, [3] El oligopéptido de [2], en donde el oligopéptido tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido del N-terminal es leucina o metionina, y (b) el aminoácido C-terminal es valina o leucina, [4] un polinucleótido aislado que codifica el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], [5] Un método para inducir una célula que presenta antígeno que tiene inducibilidad de CTL al utilizar un oligopéptido como se expone en cualquiera de [1] a [3], [6] El método de [5], en donde el método comprende una etapa seleccionada -del grupo que consiste de: (a) poner¦ en contacto una célula que presenta antígeno con el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], y (b) introducir un polinucleótido que codifica el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] en una célula que presenta antígeno, [7] El método de [5] o [6], en donde la célula que presenta antigeno expresa por lo menos un antigeno HLA-A2 sobre su superficie, [8] Un método para inducir 'CTL al utilizar el oligopéptido como se expone en cualquiera de [1] a [3], [9] El método de [8], en donde el método comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste de: (a) poner en contacto una célula T CD8 positiva con una célula que presente antigeno y/o un exosoma que presente un complejo del oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antigeno HLA sobre su superficie, e (b) introducir un- polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad de receptor de células T (TCR) que se enlaza a un complejo del oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antigeno HLA sobre una superficie celular que presenta antigeno, en una célula T CD8 positiva, [10] El método de [9], en donde el antigeno HLA es HLA-A2, [11] Un CTL aislado que fija como objetivo el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], [12] El CTL de [11], en donde el CTL es capaz de enlazarse a un complejo del oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antigeno de HLA sobre una superficie celular, [13] El CTL de [12], en donde el antigeno HLA es HLA-A2, [14] Un CTL aislado que se induce al utilizar el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], [15] El CTL de [14], en donde el CTL se induce por el método de cualquiera de [8] a [10], [16] Una célula que presenta antigeno aislada que presenta sobre su superficie un complejo de un antigeno de HLA y el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], [17] La célula que presente antigeno de [16], en donde el antigeno HLA es HLA-A2, [18] La célula que presente antígeno de [16] o [17], donde la célula que presenta antigeno se induce por cualquiera del método de [5] a [7], [19] Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra, un cáncer en un sujeto, el método que comprende la etapa de administrar al sujeto una vacuna que comprende por lo menos un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido (s) de cualquiera de [1] a [3], o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (b) uno o más polinucleótido ( s ) que codifica el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (c) uno o más CTL(s)- aislado de cualquiera de [11] a [15]; y (d) una o más. célula (s) que presenta antígeno aislada de cualquiera de [16] a [18], [20] El método de [19], en donde el sujeto es HLA-A2 positivo, [21] Un agente farmacéutico para el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operativa del mismo, en donde el agente comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un ingrediente ( s ) activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido ( s ) de cualquiera de [1] a [3], o un fragmento inmunologicamente activo del mismo; (b) uno o más polinucleótido ( s ) que codifica el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], o un fragmento inmunologicamente activo del mismo; (c) una o más célula (s) que presenta antígeno que presenta un complejo del oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antígeno HLA; y (d) uno o más CTL(s) que es capaz de enlazarse a un complejo del oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antígeno HLA sobre una superficie' celular, [22] Un agente farmacéutico para inducir CTLs, en donde el agente comprende un . vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un ingrediente (s) activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido (s) de cualquiera de [1] a [3] , o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (b) uno o más 'polinucleótido (s) que codifica el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3], o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (c) una o más célula (s) que presenta antigeno que presente un complejo de oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antigeno HLA, [23] El agente farmacéutico de [21] o [22], en donde el agente ¦ farmacéutico se formula para la administración a un sujeto quien es HLA-A2 positivo, [24] El agente farmacéutico de cualquiera de [21] a [23], que es una vacuna, [25] Uso de un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido ( s ) de cualquiera de [1] a [3]; (b) uno o más polinucleótido (s) que codifica el oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] en una forma expresable; (c) una o más célula (s) que presenta antigeno que presente un complejo de oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antigeno HLA sobre su superficie; y (d) uno o más CTL(s) que es capaz de enlazarse a un complejo del oligopéptido de cualquiera de [1] a [3] y un antigeno HLA sobre una superficie celular,¦ en la manufactura de una composición farmacéutica o agente para tratar cáncer, y [26] El uso de [25], en donde la composición farmacéutica o agente se formula para la administración a un sujeto quien es HLA-A2 positivo, [27] Un oligopéptido aislado ,que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6, para el uso en el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operativa del mismo en un sujeto quien es HLA-A2 positivo, [28] Un oligopéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6, en donde 1, 2, o varios aminoácido (s) se sustituyen, suprimen, insertan y/o agregan, en donde además el oligopéptido tiene inducibilidad de linfocitos T citotóxicos (CTL) , para el uso en el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operativa del mismo en un sujeto quien es HLA-A2 positivo, y [29] El . oligopéptido de [28] , en donde el oligopéptido tiene una o . ambas de las siguientes características : (a) el segundo aminoácido del N-terminal es leucina o metionina, y (b) el aminoácido C-terminal es valina o leucina.

Además de lo anterior, otros objetivos y características de la invención serán más totalmente evidentes cuando la siguiente descripción detallada se lea en conjunción con las figuras y ejemplos acompañantes. Sin embargo, se va a entender que tanto el sumario de la invención y la siguiente descripción detallada son de modalidades ejemplificadas y no restrictivas de la invención u otras modalidades alternas de la invención. En particular, mientras que la invención se describe en este documento con referencia a una variedad de modalidades específicas, se apreciará que la descripción es ilustrativa de la invención y no se considera como limitante de la invención. Varias modificaciones y aplicaciones se les pueden ocurrir a aquellas personas quien es experto en la técnica, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, como se describe por las reivindicaciones adjuntas. Del mismo modo, otros objetivos, características, beneficios y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de este, sumario y ciertas modalidades descritas posteriormente, y serán fácilmente evidentes para aquellas personas expertas en la técnica. Estos objetivos, características, beneficios y ventajas serán evidentes de lo anterior en conjunción con los ejemplos acompañantes, datos, figuras y todas las interferencias razonables que se extraen de las mismas, solas o con consideración de las referencias incorporadas en este documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Varios aspectos y aplicaciones de la presente invención serán evidentes para el artífice experto en consideración de la breve descripción de las figuras y la descripción detallada de la presente invención y sus modalidades preferidas que siguen.

La Figura 1 representa los resultados de un ensayo ELISPOT para IFN-gamma sobre CTLs que se indujeron en ratones transgénicos HLA-A2. Los CTLs estimulados con péptidos (SEQ ID NOs: 3, 5 y 6) mostraron potentes respuestas productivas de IFN-gamma como es comparado con los controles (panel superior) . Las barras de error representan desviación estándar (SD) . Las diferencias estadísticamente significativas se indican con asteriscos (* P <0.05). También se muestran fotografías ejemplares de conteos ELISPOT de pocilios triplicados (panel inferior) . Los CTLs mostraron 203 i"7 · a 226 puntos/pocilio en .respuesta a BM-DC pulsado con el péptido de SEQ ID NO: 6 (paneles del lado izquierdo), mientras que mostraron 74 a 105 puntos/pocilio en presencia de BM-DC sin carga de péptido (paneles del lado derecho) .

La Figura 2 se compone de una serie de gráficas de barra que representan los resultados de un ensayo ELISPOT para IFN-gamma en CTLs humanos de un donador sano. Los CTLs humanos estimulados con péptidos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6 mostraron potentes respuestas productivas de IFN-gamma contra células T2 pulsadas con péptidos cognados como es comparado con esas pulsadas con péptido del VIH irrelevante (P <0.05). Las barras de error representan SD.

Las Figuras 3A-3B se compone de una serie de gráficas de distribución (Fig. 3A) y de lineas (Fig. 3B) que representan la inducción de CTLs humanos específicos de IMP-3 de células T CD8+ de pacientes con cáncer de pulmón HLA-A2 positivo y donadores sanos. La Parte de la Fig. (3A) presenta los resultados del . análisis FACS (clasificador de células activado con fluorescencia) para detectar la expresión de CD107a sobre la superficie celular, de los CTLs humanos de 1 donador sano o un paciente con cáncer de pulmón después de la estimulación con el péptido de SEQ ID NOs: 1, 3 o 6. Los CTLs estimulados con el péptido se estimularon con anticuerpo anti-CD107a conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceina) (panel superior) o IgGl anti-ratón conjugado con FITC como control (panel central) . Como control negativo de estimulación, los CTLs se estimularon con el péptido del VIH y se tiñeron con anticuerpo anti-CD107a conjugado con FITC (panel inferior) . La expresión de CD107a se detectó en los CTLs cuando se estimularon con el péptido SEQ ID NO: 1, 3 o 6 como es comparado con el control. La parte (3B) representa la citotoxicidad de los CTLs específicos de IMP-3 contra células T2 pulsadas con los péptidos derivados de IMP3 cognados. La citotoxicidad de los CTLs contra las células T2 pulsadas con el péptido de SEQ ID NO: 1 (triangulo abierto; paneles izquierdo y central) o el péptido de SEQ ID NO: 6 (triangulo abierto; panel, derecho) y células T2 pulsadas con péptidos de VIH-A2 irrelevantes (triangulo cerrado) en un ensayo, de liberación 51Cr. Cada valor representa el porcentaje de lisis específica calculada con base en los valores medios de un ensayo por triplicado.

Las Figuras 4A-4B se componen de una serie de gráficas de barra (Fig. 4A) y de línea (Fig. 4B) que representan la inducción de CTLs específicos de IMP-3 de PBMCs de tres pacientes con cáncer de pulmón. La Parte (Fig. 4A) representa los CTLs inducidos de PBMCs de 1 pacientes mediante la estimulación con el péptido de SEQ ID NO: 5 y 103 pacientes con el péptido de SEQ ID NO: 6 mostraron producción de IFN-gamma significativa contra células T2 pulsadas con péptidos cognados como es comparado con aquellas pulsadas con péptido de VIH irrelevante. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con asteriscos (* P <0.05). Las barras de error representa SD. La Parte (4B) representa los CTLs inducidos de PBMCs de 4 pacientes con cáncer de pulmón con el péptido de SEQ ID' NO: 3 y 3 pacientes con el péptido de SEQ ID NO: 5 mostraron actividad citotóxica contra células T2 pulsadas con péptidos cognados como es comparado con aquellas pulsadas con el péptido de VIH irrelevante.

Las Figuras 5A-5D se componen de una serie de gráficas de líneas que representan los resultados del ensayo de liberación de 51Cr utilizando CTLs y líneas de células tumorales que expresan endógenamente IMP-3. La Parte de la (Fig. 5A) presenta las actividades citotóxicas de los CTLs inducidos de PBMCs de 2 donadores sanos mediante la estimulación con péptidos de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6. Estos CTLs mostraron actividad citotóxica contra PANC-1 (IMP-3+, HLA-A2+) , pero no mostraron actividad citotóxica contra MCF7 (IMP-3-, HLA-A2+ ) y A549 (IMP-3+ , HLA-A2-). La Parte de la (Fig. 5B) presenta las actividades citotóxicas de los CTLs inducidos de PBMCs de 14 pacientes con cáncer de pulmón mediante la estimulación con péptidos de SEQ ID NOs: 3 y 5, y 4 pacientes con el péptido de SEQ ID NO: 6 se detectaron por el ensayo de liberación de 51Cr. Estos CTLs mostraron actividad citotóxica contra PANC-1 (I P-3+, HLA-A2+) , pero no mostraron actividad citotóxica contra CF7 (IMP-3-, HLA-A2+) y A549 (IMP-3+ , HLA-A2-) . La parte de la (Fig. 5C) presenta las actividades citotóxicas de CTLs específicos de IMP-3 contra MCF7/IMP3 (círculo abierto; MCF7 células MCF7 transíectadas con el gen IMP-3) o MCF7 (círculos cerrados) analizado por el ensayo de liberación 51Cr. La Parte de la (Fig. 5D) presenta las actividades citotóxicas de los CTLs específicos de IMP-3 contra SW620 (triángulo abierto) , SKHepl (rombo abierto), MCF7 (círculo cerrado) o A549 (rombo cerrado) analizados por el ensayo de liberación de 51Cr. Las líneas de CTL generadas de los donadores sanos mediante estimulación con ya sea el péptido de SEQ ID NO: 1 o el péptido de SEQ ID NO: 6 mostraron actividad citotóxica contra S 620, SKHepl pero no contra A549 (HLA-A2-, IMP-3+) o células MCF7 (HLA-A2+ , IMP-3-) ..

Las Figuras 6A-6D se componen de una serie de gráficas de barra (Figs. 6A, 6B, 6D) y gráficas de línea (Fig. 6C) que representan la inhibición de respuestas CTL por el mAb clase I anti-HLA (W6/32, IgG2a) o mAb antÍ-HLA-A2. Las actividades de CTL inducidas de PBMCs de 14 pacientes con cáncer de pulmón mediante la estimulación con péptidos SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6 se detectaron por el ensayo ELISPOT para IFN-gamma (A) . La producción de IFN-gamma mediada por los CTLs se inhibió notablemente por W6/32, mientras que no se detectó inhibición de la producción de IFN-gamma por el tratamiento con mAb anti-HLA-DR (H-DR-1, IgG2a) . Las barras de error representan SD. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con asteriscos (* P < 0.05). Se indica la producción de IFN-gammá (6B) y citotoxicidad ( 6C y 6D) mediada por CTLs. Círculo abierto, PANC1; Círculo cerrado, PANC1 + W6/32; Cuadrado, PANC1 + mAb de control. Las barras indican la producción de IFN-gamma (B) o citotoxicidad (6D) cuando las líneas de CTL generadas se co-cultivaron con PANC1 (barras abiertas) , PANC1 + control mAb (barras abiertas) o PANC1 + mAb de bloqueo (barras cerradas) . Se muestran datos representativos de dos experimentos independientes con. resultados similares. Las diferencias estadísticamente significativas en (6B) se indican con asteriscos. Las Figuras 6C-6D son la continuación de las Figuras 6A-6B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden utilizar en la práctica o prueba de las modalidades de la presente invención, los métodos preferidos, dispositivos y materiales ahora se describen. Sin embargo, antes de que se describen los presentes, materiales y métodos, se va a entender que la presente invención se limita a los tamaños, formas, dimensiones, 'materiales, metodologías, protocolos particulares, etcétera descritos en este documento, ya que estos pueden variar de acuerdo con experimentación y optimización de rutina. También se va a entender que la terminología utilizada en la descripción es para el propósito de describir las versiones particulares o modalidades solamente, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención que se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas-.

La descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente mencionada en esta especificación se incorpora específicamente a manera de referencia en su totalidad en este documento. Sin embargo, nada en este documento se va a considerar como una admisión de que la invención no tiene derecho a anteceder esa descripción en virtud de la invención anterior.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos y científicos utilizados en este documento tiene el mismo significado como ¦ es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica la cual la presente invención pertenece. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, lo controlarán. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser limitantes. I. Definiciones Las palabras "un", ¦ "una", "el" y "la" como se utilizan en este documento proponen "por lo menos uno" a menos que se indique específicamente de otra manera.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican a los polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido son un residuo modificado, o un residuo no de origen natural, tal como un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como también polímeros de aminoácido de origen natural.

El término "oligopéptido" utilizado algunas veces en la presente especificación se utiliza para referirse a péptido que son 20 residuos o menos, típicamente 15 residuos o menos en longitud y se componente típicamente de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos, frecuentemente 9 o 10 residuos. Por toda la presente especificación, el término "péptido" se utiliza para el mismo significado como el término "oligopéptido" a menos que se indique específicamente de otra manera.

El término "aminoácido" como se utiliza en este documento se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como- también análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que tienen función similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como también aquellos modificados después de la traducción en las células (por ejemplo hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, y O-fosfoserina) . La frase "análogo de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un · alfa-carbón enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxi, un grupo amino y un grupo R) como un aminoácido de origen natural pero tienen un grupo R modificado o cadenas principales modificadas (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, metil-sulfonio de metionina) . La frase "mimético de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen diferentes estructuras pero funciones similares a los aminoácidos generales. Los aminoácidos pueden ser referidos en este¦ documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los . términos "gen", "polinucleótidos" , "nucleótidos" y "ácidos nucleicos" se utilizan intercambiablemente en este documento a menos que se indique específicamente de otra manera y son similares a los aminoácidos referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

Los términos "agente" y "composición" se utilizan intercambiablemente en este documento para referirse a un producto que incluye los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como también cualquier producto que resulte, directa o. indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas. Estos términos en relación con el modificador "farmacéutico" se proponen para abarcar un producto que incluye el ingrediente (s) activo, y cualquier ingrediente ( s ) inerte que constituye al vehículo, así como también cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación, formación en complejo o agregación de cualquiera de dos o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno- o más de los ingredientes. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, los términos "agente farmacéutico" y "composición farmacéutica" se utilizan intercambiablemente para referirse a cualquier agente, sustancia o composición hecha al mezclar un producto de la presente invención y un vehículo farmacéutico o fisiológicamente aceptable. La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable", como se utiliza en este documento, propone un material farmacéutica o fisiológicamente aceptable, composición, sustancia o vehículo, incluyendo pero no limitado a, un relleno líquido sólido, diluyente, excipiente, solvente o material de encapsulacion, implicados en llevar o transportar los polifarmacóforos de andamio sujeto de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención encuentran uso particular como vacunas. En el contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (también referida como una "composición inmunogénica" ) se refiere a una sustancia que tiene la función de inducir inmunidad antitumoral en la inoculación en animales.

El término "ingrediente activo" se refiere en este documento a una sustancia en un agente o composición que es biológicamente o fisiológicamente activa. De manera particular, en un agente o composición farmacéutica, "ingrediente activo" se refiere a una sustancia que muestra un efecto farmacológico objetivo. Por ejemplo, en caso de agentes o composiciones farmacéuticas para el uso en el tratamiento o prevención de cáncer, los ingredientes activos en los agentes o composiciones pueden conducir a por lo menos una acción biológica o fisiológica en las células y/o tejidos cancerosos directa o indirectamente. De manera preferente, esta acción puede incluir reducir o inhibir el crecimiento de células cancerosas, dañar o exterminar células y/o tejidos cancerosos, y asi sucesivamente. Típicamente, el efecto indirecto de los ingredientes activos son las inducciones de los CTLs que reconocen o exterminan células cancerosas. Antes de ser formulado, "ingrediente activo" también se refiere como "volumen", "sustancia de fármaco" o "producto técnico".

A menos que se defina de otra manera, el término "cáncer" se refiere a los cánceres que sobre expresan el gen IMP-3, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón y cáncer de esófago. A menos que se defina de otra manera, el término "linfocito T citotóxico", "célula T citotóxica" y "CTL" se utilizan intercambiablemente en este documento y, a menos que se . indique específicamente de otra manera, se refieren, a un subgrupo de linfocitos T que son capaces de reconocer células extrañas (por ejemplo, células tumorales, células infectadas con' virus) y de inducir la muerte de estas células. A menos que se defina de otra manera, el término "kit" como se utiliza en este documento, se utiliza en referencia a una combinación de reactivos y otros materiales. Se contempla en este documento que el kit puede incluir microarreglo, chip, marcador, y así sucesivamente. No se propone que el término "kit" se limite a una combinación particular de reactivos y/o materiales. Como se utiliza en este documento, en el contexto de un sujeto o paciente, la frase "HLA-A2 positivo" se refiere a que el sujeto o paciente posee homocigóticamente o heterocigóticamente el gen de antigeno de HLA-A2, y el antigeno HLA-A2 se expresa en las células del sujeto o paciente como un antigeno HLÁ.

Al grado en que los métodos y composiciones de la presente invención encuentran utilidad en el contexto del "tratamiento" de cáncer, un tratamiento¦ se considera "eficaz" si conduce a un beneficio clínico tal como, reducción en la expresión de la expresión del IMP-3, o una disminución en tamaño, prevalencia, o potencial metastásico del cáncer en el sujeto. Cuando el tratamiento se aplica profilácticamente, "eficaz" significa que retarda o previene que se formen cánceres o previene o alivia un síntoma clínico de cáncer. La eficacia se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o ¦ tratar el tipo de tumor particular.

Al grado en que los métodos y composiciones de la presente invención encuentran utilidad en el contexto de la "prevención" y "profilaxis" de cáncer, estos términos se utilizan intercambiablemente en este documento para referirse a cualquier actividad que reduzca la carga de mortalidad o morbidez de ,1a enfermedad.. La prevención y profilaxis puede llevarse a cabo "en niveles de prevención primarios, secundarios y terciarios". Mientras que la prevención y profilaxis primaria evita el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundarios y terciarios de prevención y profilaxis abarcan actividades dirigidas a la prevención y profilaxis de la progresión de una enfermedad y la emergencia de síntomas así como también reducción del impacto negativo de una enfermedad ya establecida al restaurar la función y al reducir las complicaciones relacionadas a la enfermedad. Alternativamente, la prevención y profilaxis pueden incluir una amplia gama de terapias profilácticas dirigidas a aliviar la gravedad del trastorno particular, por ejemplo reducir la proliferación y metástasis de tumores.

En el contexto de la presente invención, el tratamiento y/o profilaxis de cáncer y/o prevención de recurrencia post-operativa del mismo incluyen cualquiera de las siguientes etapas, tal como la remoción quirúrgica de células cancerosas, la inhibición de crecimiento de células cancerosas, la involución o regresión de un tumor, la inducción de remisión y supresión de la ocurrencia de cáncer, la regresión tumoral' y la reducción o inhibición de metástasis. El tratamiento efectivo y/o la profilaxis de cáncer disminuyen la mortalidad y mejora la prognosis de los individuos que tienen cáncer, disminuye los niveles de marcadores tumorales y en la sangre, y alivia síntomas detectables que acompañan el cáncer. Por ejemplo, la reducción o mejora de los síntomas constituye tratar efectivamente y/o la profilaxis incluye 10%, 20%, 30% o más reducción, o logra un estado de enfermedad estable.

En el contexto de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que son especialmente reactivos a una proteína designada o péptido ' de la misma. Un anticuerpo puede incluir anticuerpos humanos, ' anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos fusionados a otras proteínas o radioetiquetas, y fragmentos de anticuerpo. Adicionalmente , un anticuerpo en este documento se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos ) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada. Un "anticuerpo" indica todas las clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) .

II. Péptidos Para demostrar que los péptidos derivados de la función de IMP-3 como un antigeno reconocido por linfocitos T citotóxicos (CTLs), los péptidos derivados de IMP-3 (SEQ ID NO: 22) se analizaron para determinar si fueron epitopos de antigeno restringidos por HLA-A2 (ex. A*0201 y A*0206) que son alelos HLA comúnmente encontrados (Date Y y colaboradores, Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A y colaboradores, J Iiranu.no1 155: 4307-12, 1995; Kubo RT y colaboradores, J Immunol 152: 3913-24, 199(4). Los candidatos de los péptidos de enlace HLA-A2 derivados de IMP-3 se identificaron con base en sus afinidades de enlace a HLA-A2. Después de la estimulación in vitro de las células T por células dendriticas (DCs) cargadas con estos péptidos, los CTLs se establecieron exitosamente utilizando cada uno de los péptidos, particularmente los péptidos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6.

Estos CTLs establecidos muestran actividad de CTL especifica potente contra células objetivo pulsadas con péptidos respectivos y también células que expresan HLA-A*0201 y IMP-3. Estos resultados en este documento muestran que el IMP-3 es un antigeno reconocido por el CTL y que los péptidos pueden ser péptidos de epitopo de IMP-3 restringidos por HLA-A2 (ex. A*0201 y A*0206) . Puesto que el gen IMP-3 se sobre expresa en la mayoría de tejidos cancerosos, tal como cáncer de pulmón y cáncer de esófago, es un buen objetivo para la inmunoterapia . De esta manera, la presente invención proporciona oligopéptidos tales como nonapéptidos (péptidos compuestos de nueve residuos de aminoácido) y decapéptidos (péptidos compuestos de diez residuos de aminoácido) que corresponden a los epítopos reconocidos de CTL de I P-3. Ejemplos particularmente preferidos de oligopéptidos de la presente invención incluyen péptidos que tienen un secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6.

En general, los programas de software actualmente disponibles en el Internet, tales como aquellos descritos por Parker KC y colaboradores, J Immunol 1 de Enero de 1994, 152(1): 163-75, se pueden utilizar para calcular las afinidades de enlace entre arios péptidos y antígenos HLA in silico". La afinidad de enlace con los antígenos HLA se puede medir como se describe, por ejemplo, en la referencia de Parker KC y colaboradores, J Immunol 1 de Enero de 1994, 152(1): 163-75; y Kuzushima K y colaboradores, Blood 2001, 98(6): 1872-81. Los métodos para determinar la afinidad de enlace se describen,' por ejemplo, en the Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190 and Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. De esta manera, la presente invención abarca péptidos de IMP-3 que se enlazan con los antigenos HLA identificados útilizando estos programas conocidos.

Los oligopéptidos de la presente invención se pueden flanquear con residuos de aminoácido adicionales siempre y cuando el péptido resultante retenga su inducibilidad de CTL. Estos péptidos que tienen inducibilidad de CTL son típicamente menores que aproximadamente 40 aminoácidos, frecuentemente menores que aproximadamente 20 aminoácidos, usualmente menores que aproximadamente 15 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos particulares que flanquean los oligopéptidos de la presente invención (por ejemplo, oligopéptidos compuestos de la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6) no se limita y se puede componer de cualquier clase de aminoácidos siempre y cuando no deterioren la inducibilidad de CTL del péptido original. De esta manera, la presente invención también proporciona péptidos que tienen inducibilidad de CTL y la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6.

En general, la modificación de uno, dos o varios aminoácidos en una proteina no afectarán la función de la proteina, y en algunos casos aumentará aún la función deseada de la proteina original. De hecho, los péptidos modificados (es decir, péptidos compuestos de una secuencia de aminoácidos en la cual uno, dos o varios residuos de aminoácido se han modificado (es decir, sustituido, suprimido, agregado y/o insertado) como es comparado con una secuencia de referencia original) se ha sabido que retienen la actividad biológica del péptido original (Mark y colaboradores, Proc Nati Acad Sci EUA 1984, 81: 5662-6; Zoller y Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland y colaboradores, Proc Nati Acad Sci EUA 1982, 79: 6409-13). De esta manera, en una modalidad, los oligopéptidos de la presente invención pueden tener tanto inducibilidad de CTL como una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6 en donde uno, dos o varios aminoácidos se agregan, se insertan, se suprimen, y/o se sustituyen.

Esas personas de experiencia en la técnica reconocen que las adiciones individuales o sustituciones a una secuencia de aminoácidos que altera un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácido tienden a dar por resultado la conservación de las propiedades de la cadena lateral del aminoácido original. Como tal, son referidos convencionalmente como "sustituciones conservadoras" o "modificaciones conservadoras", en donde la alteración de una proteina da por resultado una proteina modificada que tiene propiedades y funciones análogas a la proteina original. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Ejemplos de características de cadena lateral de aminoácido que son . deseables para conservar incluyen, por ejemplo, aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) , aminoácidos hidrofilicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) , y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I,· P) ; un grupo hidroxilo que contiene cadena lateral (S, T, Y) ; un átomo de azufre que contiene cadena lateral (C, M) ; un ácido carboxílico y amida que contienen cadena lateral (D, N, E, Q) ; una base que contienen cadena lateral (R, K, H) ; y un aromático que contiene cadena lateral (H, F, Y, W) . Además, los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son aceptados en la técnica como sustituciones conservadoras para uno por el otro : 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E) ; 3) Aspar'agina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptófano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins 1984) .

Estos péptidos conservadoramente modificados también son considerados que son péptidos de la presente invención. Sin embargo, los péptidos de la presente invención no se restringen a lo mismo y pueden incluir modificaciones no conservadoras, siempre y cuando el péptido modificado retenga la inducibilidad de CTL del péptido original. Adicionalmente, los péptidos modificados no deben excluir péptidos inducibles de CTL de variantes polimórficas , homólogos de inter-especies, y alelos de IMP-3.

Para retener el requisito de inducibilidad de CTL se pueden modificar (insertar, suprimir, agregar y/o sustituir) un pequeño número (por ejemplo, 1, 2 o varios) o un pequeño porcentaje de aminoácidos. En este documento, el término "varios" significa 5 o menos aminoácidos, por ejemplo, 4 o 3 o menos. El porcentaje de aminoácidos que se modifica es de manera preferente 20% o menos, de manera más preferente 15% o menos, de manera aún más preferente 10% o menos o 1 a 5%.

Cuando se utiliza en el contexto de inmunoterapia, los péptidos de la presente invención se deben ' presentar sobre la superficie de una célula o exosoma, de manera preferente como un complejo con un antígeno HLA. Por lo tanto, es preferible seleccionar péptidos que no solamente inducen los CTLs sino también poseen alta afinidad de enlace al antigeno HLA. Con esa finalidad, los péptidos se pueden modificar por sustitución, inserción, supresión, y/o adición de los residuos de aminoácido para producir un péptido modificado que tenga afinidad de enlace mejorada. Además de los péptidos que se expresan naturalmente, puesto que la regularidad de las secuencias de péptidos expresada por el enlace a los antigenos HLA ya es conocida (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), las modificaciones con base en esta regularidad se pueden introducir en- los péptidos inmunogénicos de la invención.

Por ejemplo, puede ser deseable sustituir el segundo aminoácido .del N-terminal sustituida con leucina o metionina, y/o el aminoácido en la C-terminal con valina o leucina a fin de incrementar la afinidad de enlace de HLA-A24. De esta manera, los péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6 en donde el segundo aminoácido del N-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs se sustituye con leucina o metionina y/o en donde la C-terminal de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs se sustituye con valina o leucina, son abarcados por la presente invención.

Las sustituciones se pueden introducir no solamente en los aminoácidos terminales sino también en la posición del reconocimiento potencial, de TCR de los péptidos. Varios estudios han mostrado que las sustituciones de aminoácidos en un péptido pueden ser iguales a o mejores que la original, por ejemplo CAPI, p53 (26 -272) , Her-2/neu (369-377> o gplOO (209-217) (Zaremba y colaboradores Cáncer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann y colaboradores J Immunol. (2002) ¦ 1 de Febrero; 168 (3) : 1338-4 . , S. 0. Dionne y colaboradores Cáncer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne y colaboradores Cáncer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314). La presente invención también contempla la adición de aminoácidos a las secuencias dadas a conocer en este documento. Por ejemplo, uno, dos o varios aminoácidos también se pueden agregar a la N y/o C-terminal de los péptidos descritos. Estos péptidos modificados que tienen alta afinidad de enlace al antigeno HLA y retienen la inducibilidad de CTL también se incluyen en la presente invención.

Sin embargo, cuando la secuencia de péptidos es idéntica a una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteina endógena o exógena que tiene una función diferente, efectos secundarios tal como trastornos autoinmunitarios y/o síntomas alérgicos contra sustancias específicas se puede inducir. Por lo tanto, es preferible primero realizar investigaciones de homología utilizando base de datos disponibles para evitar situaciones en las cuales la secuencia del péptido iguala la secuencia de aminoácidos de otra proteína. Cuando es claro de las investigaciones de homología que no existen péptidos con diferencias tampoco como 1 o 2 aminoácidos como es comparado con el péptido objetivo, el péptido objetivo se puede modificar a fin de incrementar su afinidad de . enlace con antígenos HLA, y/o incrementar su inducibilidad de CTL sin ningún peligro de estos efectos secundarios.

Aunque los péptidos que tienen alta afinidad de enlace a los antígenos HLA como se describe en lo anterior se espera que sean sumamente efectivos, los péptidos candidatos, que se seleccionan de acuerdo con la presencia de alta afinidad de enlace como un indicador, se examinan adicionalmente para la presencia de inducibilidad de CTL. En este documento, la frase "inducibilidad de CTL" indica la capacidad del péptido para . inducir linfocitos citotóxicos (CTLs) cuando están presentes en células que presentan antígeno. Además, "inducibilidad de CTL" incluye la capacidad del péptido para inducir la activación de CTL, proliferación de CTL, promueve la lisis de CTL de células objetivo, e incrementa la producción de IFN-gamma de CTL.

La confirmación de la inducibilidad de CTL se logra al inducir células que presentan antigeno que llevan antigenos MHC humanos (por ejemplo, B-linfocitos , macrófagos, y células dendriticas ¦ (DCs) ) , o específicamente más de DCs derivadas de leucocitos mononucleares de sangre periférica humana, y después de la estimulación con los péptidos, al mezclar con células CD8 positivas, y luego al medir el IFN-gamma producido y liberado por ios CTLs contra las células objetivo. Como el sistema de reacción, se pueden utilizar animales transgénicos que se han producido para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, aquellos descritos por BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol Agosto de 2000, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Por ejemplo, las células objetivo se pueden radioetiquetar con 51Cr y tal, la actividad citotóxica se puede calcular de la radioactividad liberada de las células objetivo. Alternativamente, la inducibilidad de CTL se puede evaluar al medir el IFN-gamma producido y liberado por los CTLs en presencia de células que presentan antígeno (APCs) que llevan péptidos inmovilizados y al visualizar la zona de inhibición en el medio utilizando anticuerpos monoclonales anti-IFN-gamma .

Como resultado de examinar la inducibilidad de CTL de los péptidos como se describe en lo anterior, se descubrió que estos péptidos que tienen alta afinidad de enlace a un antigeno HLA no tuvieron necesariamente alta inducibilidad de CTL. Sin embargo, de esos péptidos identificados y evaluados, los oligopéptidos seleccionados de péptidos que tienen secuencias de aminoácidos indicadas por SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6, se descubrió que muestran inducibilidad de CTL particularmente alta asi como también alta afinidad de enlace a un antigeno HLA. De esta manera, estos péptidos se ejemplifican como modalidades preferidas de la presente invención.

Además de las modificaciones descritas en lo anterior, los péptidos de la presente invención también se pueden enlazar a otras sustancias . siempre y cuando el péptido enlazado resultante retenga la inducibilidad de CTL necesaria del péptido original. Ejemplos de sustancias adecuadas incluyen, pero no se limitan a: péptidos, lipidos, azúcar y cadenas de azúcar, grupos acetilo, polímeros naturales y sintéticos, etcétera. Los péptidos pueden contener modificaciones tal como glicosilación, oxidación de cadena lateral, o fosforilación, etcétera con la condición de que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Estás clases de modificaciones se pueden realizar para conferir funciones adicionales (por ejemplo, función objetiva y función de suministro) o para estabilizar el polipéptido.

Por ejemplo, para incrementar la estabilidad in vivo de un polipéptido, se conoce en la técnica introducir aminoácidos D, miméticos de aminoácido o aminoácidos no naturales; este concepto también se puede adaptar a los presentes polipéptidos . La estabilidad de un polipéptido se puede someter a ensayo en una variedad de formas. Por ejemplo, peptidasas y ' varios medios biológicos, tales como plasma y suero humano, se pueden utilizar para someter a prueba la estabilidad (véase, por ejemplo, Verhoef y colaboradores, Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302) .

Además, los péptidos de la presente invención se pueden enlazar a otros péptidos a · través de espaciadores o ligaduras. Ejemplos de otros péptidos incluyen, pero no se limitan a, péptidos inducibles de CTL derivados de otros TAAs. Alternativamente, dos o más péptidos de la presente invención se pueden enlazar a través de espaciadores o ligaduras. Los péptidos enlazados a través de espaciadores o ligaduras pueden ser los mismos o diferentes entre si. La clase de espaciadores y ligaduras no se limita específicamente, e incluyen aquellos compuestos de péptidos, de manera más preferente aquellos compuestos de péptidos que tienen uno o más sitios de escisión que son capaces de ser escindidos por enzimas tales como peptidasas, proteasas y proteosomas. Ejemplos de ligaduras o espaciadores incluyen, pero no se limitan a: AAY (P.- M. Daftarian y colaboradores, J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller y colaboradores, J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) o, uno a varios residuos de lisina (S. Ota y colaboradores, Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura y colaboradores, J Immunol. 2002, 168: 5709-5715). La presente invención contempla péptidos enlazados a otros péptidos a través de espaciadores o ligaduras.

Cuando los péptidos de la presente invención incluyen un residuo de cisteína, los péptidos tienden a formar dímeros a través de un enlace de disulfuro entre los grupos SH de los residuos de cisteína. Por lo tanto, los dímeros del péptido de la presente invención también se incluyen péptidos de la presente invención. En este documento, los péptidos de la presente invención también se pueden describir como "péptido (s) IMP-3", "polipéptido (s) IMP-3" o "oligopéptido IMP-3".

III. Preparación de péptidos IMP-3 Los péptidos de la presente invención se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar sintéticamente, utilizando tecnología de DNA recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar individualmente o como polipéptidos más largos compuestos de dos o más péptidos.. Los péptidos luego se pueden aislar es decir, purificar o aislar para estar sustancialmente libre de otras proteínas de células hospederas de origen natural y fragmentos de las mismas, o cualquier otra sustancia química.

Los péptidos de la presente invención también pueden contener modificaciones, tal como glicosilación, oxidación de cadena lateral, o fosforilación con la condición de que estas modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Otras modificaciones ilustrativas incluyen la incorporación de aminoácidos D otros miméticos de aminoácido que se pueden utilizar, por ejemplo, para incrementar la vida media en suero de los péptidos.

Un péptido de la presente invención se puede obtener a través de síntesis química con base en la secuencia de aminoácidos seleccionada. Ejemplos de métodos de síntesis de péptido convencionales que se pueden adaptar a la síntesis incluyen, pero no se limitan a: (i) Peptide Synthesis, Interscience, Nueva York, 1966; (ii) The Protei s, Vol. 2, Academic Press, Nueva York, 1976; (iii) Peptide Synthesis (in Japanese) , Maruzen Co . , 1975; (iv) Basles and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985; (v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991; (vi) W099/67288; y (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Péptidos Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, Nueva York, 1980, 100-118.

Alternativamente, los presentes péptidos se pueden obtener adaptando cualquier método de ingeniería genética conocido para producir' péptidos (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu y colaboradores) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, primero, un vector adecuado que aloja un polipéptido que codifica el péptido objetivo en una forma expresable (por ejemplo, cadena abajo de una secuencia reguladora que corresponde a una. secuencia promotora) se prepara y se transforma en una célula hospedera adecuada. La célula hospedera después se cultiva para producir el péptido de interés. El péptido también se puede producir in vitro adaptando un sistema, de traducción in vitro.

IV. Polinucleótidos La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica cualquiera de los péptidos mencionados en lo anterior de la presente invención. Estas incluyen polinucleótidos derivados de gen IMP-3 de origen natural (No. de Acceso de GenBank NM_006547.2 (SEQ ID NO: 21)) asi como también aquellos que tienen una secuencia de nucleótidos conservadoramente modificada del mismo. En este documento, la frase "secuencia de nucleótidos conservadoramente modificada" se refiere a secuencias que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG, y GCU codifican el aminoácido de alanina. De esta manera, en cada posición donde una alanina se especifica por un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácidos nucleicos en este documento que codifica un péptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente- el único codón para triptófano) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un péptido se describe implícitamente en cada secuencia dada a conocer.

El polinucleotido de la presente invención se puede componer de DNA, RNA, y derivados de los mismos. Como es bien conocido en la técnica, un DNA se compone adecuadamente de bases tales como bases de origen .natural A, T, C, y G, y T se reemplaza por U en un RNA. Una persona de experiencia reconocerá que las bases no de origen natural también se incluyen en polinucleótidos . El polinucleotido de la presente invención puede codificar múltiples péptidos de la presente invención con o sin secuencias de aminoácidos de intervención en medio. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de intervención puede proporcionar un sitio de escisión (por ejemplo, secuencia de reconocimiento de enzima) del polinucleotido o los péptidos traducidos. Adicionalmente, el polinucleotido puede incluir cualquier secuencia adicional a la secuencia de codificación que codifica el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleotido puede ser un polinucleotido recombinante que incluye secuencias reguladoras requeridas para la expresión del péptido o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores por el estilo. En general, estos polinucleótidos recombinantes se pueden preparar mediante la manipulación de polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales utilizando, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas .

Ambas técnicas de síntesis recombinante y química se pueden utilizar para producir los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleotido se puede producir mediante la inserción en un vector apropiado, que se puede expresar cuando se transfecta en una célula competente. Alternativamente, un polinucleotido se puede amplificar utilizando técnicas de PCR o expresión en hospederos adecuados (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989) . Alternativamente, un polinucleotido se puede sintetizar utilizando las técnicas de fase sólida, como se describe por Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes y colaboradores, EMBO J 1984, 3: 801-5. Los vectores que contienen el polinucleótido de la presente invención y células hospederas que alojan los vectores también se incluyen en la presente invención.

V. Exosomas La presente invención proporciona además vesículas intracelulares , referidas como exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de esta invención y antígenos HLA o su superficie. Los exosomas se pueden preparar, por ejemplo, utilizando los métodos detallados en las publicaciones de Solicitudes de Patentes Japonesas Kohyo Nos. Hei 11-510507 y WO99/03499, y se pueden preparar utilizando APCs obtenidos de pacientes quienes se someten a tratamiento y/o prevención. Los exosomas de esta invención se pueden inocular como vacunas, en una forma similar a los péptidos de esta invención.

El tipo de antígenos HLA contenidos en los complejos debe igualar a aquel del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. El uso del tipo HLA-A2 que se expresa altamente entre los Japoneses y Caucásicos es favorable para obtener resultados efectivos, y subtipos tales como HLA-A2 (A*0201 y A*0206) también encuentran uso. Típicamente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga con anticipación, lo cual permite la selección apropiada de péptidos que tienen altos niveles de afinidad de enlace al antigeno particular, o que tienen inducibilidad de CTL por la presentación de antigeno. Adicionalmente, a fin de obtener péptidos que tienen tanto alta afinidad de enlace como inducibilidad de CTL, substitución, inserción, supresión y/o adición de 1, 2, o varios aminoácidos se puede realizar con base en la secuencia de aminoácido del péptido parcial IMP-3 de origen natural. Cuando se utiliza el antígeno HLA-A2 (A*0201) para el exosoma de la presente invención, los péptidos que tienen la secuencia seleccionada de entre SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6 encuentran uso particular.

VI. Células que presentan antigeno (APCs) La presente invención también proporciona células que presentan antígeno aisladas (APCs) que presentan complejos formados entre los antígenos HLA y los péptidos de esta invención sobre su superficie. Las APCs que se obtienen al poner en contacto los péptidos de esta invención, o al introducir los polinucleótidos que codifica los péptidos de esta invención en una forma expresable se pueden derivar de pacientes quienes se someten a tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar como vacunas solas o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de esta invención, exosomas, o células T citotóxicas.

Las APCs no se limitan a una clase particular de células e incluyen células dendríticas (DCs) , células de Langerhans, macrófagos, células B, y células T activadas, que se saben presentan antigenos proteinicos sobre su superficie celular para ser reconocidas por los linfocitos. Puesto que la DC es una APC representativa que tiene la acción inductora de CTL más potente entre las APCs, las DCs encuentran uso como las APCs de la presente invención.

Por ejemplo, una APC se puede obtener al inducir DCs de monocitos de sangre periférica y luego ponerlas en contacto (estimulándolas) con los péptidos de esta invención in vitro, ex vivo o in vivo. Guando los péptidos de esta invención se administran a los sujetos, las APCs que presentan los péptidos de esta invención se inducen en el cuero del sujeto. La frase "que induce APC" incluye poner en contacto (estimular) una célula con los péptidos de la presente invención, o nucleótidos que codifican estos péptidos, para presentar complejos formados entre los antigenos HLA y los péptidos de la presente invención sobre la superficie de la célula. Por lo tanto, las APCs de la presente invención se pueden obtener al recolectar las APCs del sujeto después de administrar los péptidos de la presente invención al sujeto. Alternativamente, las APCs de la presente invención se pueden obtener al poner en contacto las APCs recolectadas de un sujeto con el péptido de la presente invención.

Las APCs de la presente invención solas se pueden administrar a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer en el sujeto, por ejemplo como una vacuna. Las APCs de la presente invención también se pueden administrar en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos, ' exosomas o CTLs de la presente invención. La administración ex vivo puede incluir las etapas de: a: recolectar las APCs de un primer sujeto; b: poner en contacto las APCs de la etapa a con el péptido; y c: administrar las APCs cargadas con péptido a un segundo sujeto.

El primer sujeto y el segundo sujeto pueden ser el mismo individuo, o pueden ser diferentes individuos. Alternativamente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de los péptidos de la presente invención para manufacturar un agente o composición farmacéutica que induzca células que presentan antigeno. Además, la presente invención proporciona un método o proceso para manufacturar un agente o composición farmacéutica para inducir células que presentan antigeno, en donde el método incluye la etapa de administrar o formular el péptido de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por otra parte, la presente invención proporciona un método o proceso para manufacturar un agente o composición farmacéutica para tratar cánceres incluyendo cáncer de pulmón y cáncer de esófago, en donde el método incluye la etapa de administrar o formular el péptido de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención también proporciona los péptidos de la presente invención para inducir células que presentan antígeno. Las APCs obtenidas mediante la etapa b se pueden administrar al sujeto como una vacuna. La presente invención proporciona además los péptidos para tratar cánceres incluyendo cáncer de pulmón y cáncer de esófago.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, las APCs de la presente invención tienen un alto nivel de inducibilidad de CTL. En el término de "alto nivel de inducibilidad de CTL", el alto nivel es relativo con el nivel de aquel de las APCs puestas en contacto sin péptido o péptidos que no puedan inducir CTLs. Estas APCs que tienen un alto nivel de inducibilidad de CTL se pueden preparar mediante un método que incluye la etapa de transferir genes que contienen polinucleótidos que codifican los péptidos de esta invención a las APCs in vitro. Los agentes introducidos pueden estar en la forma de DNAs o RNAs . Los ejemplos de métodos para introducción incluyen, sin limitaciones particulares, varios métodos realizados convencionalmente en este campo, tal como lipofección, electroporación, y método de fosfato de calcio. Más' específicamente, se pueden realizar como se describe en Cáncer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Internacional No. 2000-509281. Al transferir el gen- en una APC, el gen se somete a la transcripción, traducción, y tal en la célula, y luego la proteína obtenida se procesa por MHC Clase I o Clase II, y procede a través de una ruta de presentación para presentar los péptidos.

En una modalidad preferida, las APCs de la presente invención presentan sobré su · superficie un complejo de un antígeno HLA y un oligopéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6. De manera preferente, las APCs de la presente invención llevan el antígeno HLA-A2 sobre su- superficie. En otras palabras, las APCs de la presente invención expresan de manera preferente el antígeno HLA-A2 sobre su superficie. Alternativamente, el oligopéptido para formar el complejo con un antígeno HLA puede ser un oligopéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6, en donde uno, dos o varios aminoácidos se sustituyen, se insertan, se suprimen y/o se agregan; por ejemplo, el segundo aminoácido del N-terminal se puede sustituir con leucina o metionina, y/o el aminoácido C-terminal se puede sustituir con valina o leucina.

VII. Células T citotóxicas (Linfocitos T citotoxicos : CTLs) Una célula . citotóxica inducida contra cualquiera de los péptidos de la presente invención potencia la respuesta inmunitaria que fija como objetivo el endotelio asociado a tumor in vivo y de esta manera se puede utilizar como vacunas, en una forma similar a los péptidos per se. De esta manera, la presente invención también proporciona células T citotóxicas aisladas que se inducen específicamente o se activan mediante cualquiera de los presentes péptidos. Estas células T citotóxicas se pueden obtener al (1) administrar el péptido de la presente invención a un sujeto, y luego al recolectar las células T citotóxicas del sujeto, o (2) poner en contacto (estimular) APCs derivadas del sujeto, y células CD8 positiva, o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con los péptidos de la presente invención y luego al aislar las células T citotóxicas.

Las células T citotóxicas, que se han inducido mediante estimulación con¦ las APCs que presenta los péptidos de esta invención, se pueden derivar de pacientes quienes se someten a tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar solas o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de esta invención o exosomas para el propósito de efectos reguladores. Las células T citotóxicas obtenidas actúan específicamente contra las células objetivo que presentan los péptidos de esta invención, o por ejemplo, los mismos péptidos utilizados para la inducción. En otras palabras, las células T citotóxicas obtenidas son capaces de reconocer (es decir, enlazarse a) un complejo formado entre el antígeno HLA y el péptido de la presente invención sobre una superficie de célula objetivo a través de su receptor de célula T, y luego atacar la célula objetivo para inducir la muerte de la célula objetivo. Las células objetivo pueden ser células que expresan endógenamente IMP-3, o células que son transíectadas con el gen IMP-3; y las células que presentan un péptido de esta invención sobre la superficie celular debido a la estimulación por el péptido también pueden servir como objetivos del ataque activado de CTL. En una modalidad preferida, las células objetivo llevan el antígeno HLA-A2 sobre su superficie y presentan un complejo formado entre HLA-A2 y el péptido de la presente invención sobre su superficie.

VIII. Receptor de células T (TCR) La presente invención también proporciona una composición que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad de un receptor de células T (TCR) , y métodos para utilizar la misma. Las subunidades de TCR, alfa y beta, tienen la capacidad de formar TCRs que confieren especificidad a las células T contra células tumorales que presentan IMP-3. Al utilizar los métodos conocidos en la técnica, la secuencia de ácidos nucleicos de las cadenas TCR alfa y beta expresadas en los CTLs inducidos con uno o más péptidos de esta invención can se pueden aislar y utilizar para construir vectores adecuados que pueden mediar un gen altamente eficiente que se transfiere en los linfocitos humanos primarios (WO2007/032255 y Morgan RA, y colaboradores, J Immunol, 171, 3287 (2003) ) . Por ejemplo, el método PCR se prefiere para analizar el TCR. Los cebadores de PCR para el análisis pueden ser, por ejemplo, cebadores 5'-R (5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3' ) como cebadores del lado 5' (SEQ ID NO: 23) y cebadores 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3' ) especifico a la región C de cadena alfa TCR (SEQ ID NO:¦ 24), cebadores 3-TRb-Cl (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3' ) específicos a la región Cl de cadena beta TCR (SEQ ID NO: 25) o cebadores 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3' ) específicos a la región C2 de la cadena beta TCR (SEQ ID NO:¦ 26) como cebadores de lado 3', pero no se limita. Vectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales . Ventajosamente, la invención proporciona una composición comercial que permite la rápida modificación de las células T del propio paciente (o aquellas de otro mamífero) para producir rápida y fácilmente células T modificadas que tienen propiedades de exterminio de células cancerosas- excelente. El TCRs derivado puede enlazarse a células objetivo que expresan el péptido IMP-3 con alta avidez,' y median opcionalmente el exterminio eficiente de las células objetivo que presentan el péptido IMP-3 in vivo e in vitro.

Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades TCR se pueden incorporar en vectores adecuados por ejemplo vectores retrovirales. Estos vectores son bien conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos o los vectores que los contienen se pueden transferir útilmente en una célula T, por ejemplo, una célula T de un paciente. Ventajosamente, la invención proporciona una- composición comercial que permite la rápida modificación de células T propias de un paciente (o aquellas de otro mamífero) para producir rápida y fácilmente células T modificadas que tienen excelentes propiedades de exterminio de células cancerosas.

El TCR específico es un receptor capaz de reconocer específicamente un complejo de un péptido de la presente invención y la molécula HLA, dando una actividad especifica de células T contra la célula objetivo cuando el TCR está sobre la superficie de la célula T. un reconocimiento especifico del complejo anterior, se puede confirmar mediante cualquier método conocido, y los métodos preferidos incluyen, por ejemplo, análisis de tetrámero utilizando una molécula HLA y un péptido de la invención, y el ensayo ELISPOT. Al realizar el ensayo ELISPOT, se puede confirmar que una célula T que expresa el TCR sobre la superficie celular reconoce una célula por la TCR, y que la señal se transmite intracelularmente . La confirmación de que el complejo mencionado en lo anterior puede proporcionar una actividad citotóxica de célula T cuando el complejo existe sobre la superficie de la célula T también se puede llevar a cabo por un método conocido. Un método preferido incluye, por ejemplo, la determinación de la actividad citotóxica contra una célula objetivo de HLA positivo, tal como ensayo de liberación de cromo.

También, la presente invención proporciona CTLs que se preparan mediante la traducción con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de subunidades de TCR que se enlazan al péptido IMP-3 por ejemplo SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6 en el contexto de HLA-A2. Los CTLs transducidos son capaces de enfocarse a células cancerosas in vivo, y se pueden expandir mediante métodos de cultivo bien conocidos in vitro (por ejemplo, Kawakami y colaboradores, J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Las células T de la invención se pueden utilizar para formar una ' composición inmunogénica útil en el tratamiento o la prevención de cáncer en un paciente en necesidad de terapia o protección (WO2006/031221) .

IX. Agentes o composiciones farmacéuticas Puesto que la expresión de IMP-3 se regula por incremento en varios cánceres como es comparado con el tejido normal, los péptidos de esta invención o polinucleótidos que codifican estos péptidos se pueden utilizar para el tratamiento y/o para la profilaxis de cáncer o tumor, y/o prevención de recurrencia posoperativa del mismo. De esta manera, la presente invención proporciona un agente o composición farmacéutica para tratar y/o para prevenir cáncer o tumor, y/o prevenir la recurrencia post-operativa del mismo, que incluye como un ingrediente activo uno o más de los péptidos de esta invención, o polinucleótidos que codifican los péptidos. Alternativamente, los presentes péptidos se pueden expresar sobre la superficie de cualquiera de los exosomas o células anteriores, tal como APCs para el uso como agentes o composición farmacéutica. Además, las células T citotóxicas anteriormente mencionadas que fijan como objetivo cualquiera de los péptidos de la presente invención también se pueden utilizar como el ingrediente activo de los presentes agentes o composiciones farmacéuticas. En el contexto de la presente invención, la frase "péptido que fi.ja como objetivo" con respecto a la actividad de una célula T citotóxica indica que la célula T citotóxica reconoce (es decir, se enlaza a) un complejo formado entre un antigeno HLA y un péptido sobre la superficie celular objetivo a través de su receptor de células T, y luego ataca la célula objetivo para inducir la muerte de la célula objetivo.

En otra modalidad,' la presente invención también proporciona el uso de un ingrediente activo seleccionado de entre : (a) un péptido de la presente invención, (b) un ácido nucleico que codifica este péptido como se da a conocer en este documento en una forma expresable, (c) una APC de la presente invención, y (d) células T citotoxicas de la presente invención en la manufactura de una composición farmacéutica o agente para tratar cáncer o tumor.

Alternativamente, la presente invención proporciona además un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención, (b) un ácido nucleico que codifica este péptido como se da a conocer en este documento en una forma expresable, (c) una APC de la presente invención, y (d) células T citotóxicas de la presente invención para el uso en el tratamiento de cáncer o tumor.

Alternativamente, la presente invención proporciona además un método o proceso para manufacturar una composición o agente farmacéutico para tratar cáncer o tumor, en donde el método o proceso incluye la etapa de formular un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención, (b) un ácido nucleico' que codifica este péptido como se da a conocer en este documento en una forma expresable, (c) una APC de la presente invención, y (d) células T citotóxicas de la presente invención Como ingredientes activos.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona un método o proceso para manufacturar una composición o agente farmacéutico para tratar cáncer o tumor, en donde el método o proceso incluye la etapa de mezclar un ingrediente activo con un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, en donde el ingrediente activo se selecciona de entre: (a) un péptido de la presente invención, (b) un ácido nucleico que codifica este péptido como se da a conocer en este documento en una forma expresable, (c) una APC de la presente invención, y (d) células T citotóxicas de la presente invención. Alternativamente, la composición o agente farmacéutico de la presente invención se puede utilizar para cualquiera o ambos de la profilaxis de cáncer o tumor y prevención de recurrencia post-operativa del mismo.

Los agentes -o composiciones farmacéuticas de la presente invención . se pueden utilizar para tratar y/o prevenir cánceres o tumores y/o prevención de recurrencia post-operativa de. los mismos en sujetos o pacientes que incluyen humano y cualquier otro mamífero que incluyen, pero no se limita a, ratón, rata, cobayo, conejo, gato, perro, oveja, cabra, cerdo, ganado vacuno, caballo, mono, mandril, y chimpancé, particularmente un animal comercialmente importante o un animal domesticado.

De acuerdo con la presente invención, los oligopéptidos qué tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6 se ha descubierto que son péptidos de epitopos restringidos de HLA-A2 que pueden inducir una respuesta inmunitaria potente y especifica. Por lo tanto, los presentes agentes o composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de estos oligopéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 o 6 son particularmente adecuados para la administración a sujetos cuyo antigeno HLA es HLA-A2. Como se utiliza en este documento, "sujetos cuyo antigeno HLA es HLA-A2" significa sujetos quienes poseen homocigóticamente o heterocigóticamente el gen HLA-A2 y HLA-A2 se expresa en células de los sujetos como un antígeno HLA. En otras palabras, los sujetos son HLA-A2 positivo. Lo mismo aplica a agentes o composiciones farmacéuticas que incluyen polinucleótidos que codifican cualquiera de estos oligopéptidos.

Los cánceres o tumores que se tratan por los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención no se limitan e incluyen todas las clases de cánceres o tumores en donde se implica el IMP-3, incluyendo por ejemplo, cáncer de pulmón y cáncer de esófago. En particular, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención se aplican de manera preferente al cáncer pancreático.

Los presentes agentes o composiciones farmacéuticas pueden contener además de los ingredientes activos mencionados en lo anterior, otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTLs contra células cancerosas, otros polinucleótidos que codifican los otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, o de este tipo. En este documento, los otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTLs contra células cancerosas se ejemplifican por antigenos específicos de cáncer (por ejemplo, TAAs identificados), pero no se limitan a los mismos.

Si es necesario, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras sustancias terapéuticas como un ingrediente activo, siempre y cuando la sustancia no inhiba el efecto antitumoral del ingrediente activo, por ejemplo, cualquiera de los péptidos presentes. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir agentes anti-inflamatorios, analgésicos, quimioterapéuticos , y similar. Además de incluir otras sustancias terapéuticas en el médicamente mismo, los medicamentos de la presente invención también se pueden administrar secuencial o concurrentemente con el uno o más de otros agentes o composiciones farmacológicos. Las cantidades de medicamento y agente o composiciones farmacológicas dependen, por ejemplo, en qué tipo de agente (s) farmacológico o composición (s ) se utilizan, la enfermedad que se trata, y el programa y vías de administración.

Se debe entender que la adición en los ingredientes mencionados particularmente en este documento, los agentes o composiciones farmacéuticos de esta invención pueden incluir otros agentes o composiciones convencionales en la técnica que tienen en cuenta el tipo de formulación en cuestión. En una modalidad de la presente invención, los presentes agentes o composiciones farmacéuticos se pueden incluir en artículos de manufactura y kits que contienen materiales útiles para tratar las condiciones patológicas, de la enfermedad que se trata, por ejemplo, cáncer. El artículo de manufactura puede incluir un recipiente de · cualquiera de los presentes agentes o composiciones farmacéuticos con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen botellas, frasquitos, y tubos de prueba. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tal como vidrio o plástico. La etiqueta sobre el ' recipiente debe indicar el agente o composiciones que se utilizan para el tratamiento o prevención de una o más condiciones de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar instrucciones para la administración y así sucesivamente.

Además del recipiente descrito en lo anterior, un kit que incluye un agente o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir opcionalmente además un segundo recipiente que aloja un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos en paquete con instrucciones para el uso .

Los agentes o composiciones farmacéuticas pueden, si se desea, ser presentados en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede, por ejemplo, incluir lámina delgada de metal o plástico, tal como un paquete en lámina al vacio. El paquete o dispositivo dispensador se pueden acompañar por instrucciones para la administración. En otra modalidad de la presente invención, los péptidos de la presente invención también se pueden administrar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos preferibles de las sales incluyen sales con un metal alcalino, sales con un metal, sales con una base orgánica, sales con un ácido orgánico y sales con un ácido inorgánico. (1) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos como el ingrediente activo.

Los péptidos de esta invención se pueden administrar directamente como un agente o composiciones farmacéuticas, o si es .necesario, se pueden formular mediante métodos de formulación convencionales. En el último caso, además de los péptidos de esta invención, vehículos, excipientes, y tales que se utilizan ordinariamente para fármacos se pueden incluir como apropiados sin limitaciones particulares. Ejemplos de estos vehículos son agua esterilizada, solución salina fisiológica, solución amortiguadora de fosfato, fluido de cultivo y otros. Adicionalmente, los agentes o composiciones farmacéuticas pueden contener como sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservadores, surfactantes y otros. Los agentes o composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden utilizar para propósitos anti-cáncer.

Los péptidos de esta invención se pueden preparar como una combinación, compuesta de dos o más de péptidos de la presente invención, para inducir los CTLs in vivo. La combinación de péptido puede tomar la forma de un cóctel o se puede conjugar entre sí utilizando técnicas estándares. Por ejemplo, los péptidos se pueden enlazar o expresar químicamente como una sola secuencia de polipéptido de fusión. Los péptidos en la combinación pueden ser los mismos o diferentes. Al administrar los péptidos de esta invención, los péptidos se presentan en una alta densidad por los antígenos HLA sobre APCs, luego se inducen los CTLs que reaccionan específicamente hacia el complejo formado entre el péptido expresado y el antígeno HLA. Alternativamente, las APCs que presentan cualquiera de los péptidos de esta invención sobre su superficie celular, que se pueden obtener al estimular las APCs (por ejemplo, DCs) derivadas de un sujeto con los péptidos de esta invención, se pueden administrar al sujeto, y como resultado, los CTLs se inducen en el sujeto y se puede incrementar la agresividad hacia las células cancerosas, tal como células de cáncer de pulmón y cáncer de esófago.

Los agentes o composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o prevención de cáncer o tumor, que incluyen un péptido de esta invención- como el ingrediente activo, también pueden incluir un adyuvante conocido por establecer efectivamente la inmunidad celular. Alternativamente, los agentes o composiciones farmacéuticas se pueden administrar con otros ingredientes activos o administrar mediante formulación en gránulos. Un adyuvante se refiere a un compuesto que potencia la respuesta inmunitaria contra la proteína cuando se administra conjuntamente (o sucesivamente) con la proteína que tiene actividad inmunológica . Los adyuvantes contemplados en este documento incluyen aquellos descritos en la literatura (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89) . Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alumbre, toxina de la cólera, toxina de la salmonella y otros, pero no se limitan a los. mismos. Adicionalmente, las formulaciones de liposomas, formulaciones granulares en las cuales el péptido se enlaza a cuentas de diámetro de pocos micrómetros, y formulaciones en las cuales un lipido se enlaza al péptido se pueden utilizar convenientemente.

En otra modalidad de la presente invención, los péptidos de la presente invención también se pueden administrar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Ejemplos preferibles de las sales incluyen sales con un metal alcalino, sales con un metal, sales con una base orgánica, sales con un ácido orgánico, y sales con un ácido inorgánico. Como se utiliza en este documento, "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad y propiedades biológicas del compuesto y las cuales se obtienen mediante la reacción con ácidos inorgánicos o bases tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similar. Ejemplos de sales preferidas incluyen sales con un metal alcalino, sales con un metal, sales con una base .orgánica, sales con un ácido orgánico y sales con un ácido inorgánico.

En algunas modalidades, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir además un componente que seba los CTLs. Los lipidos se han identificado como agentes o composiciones capaces de cebar los CTLs in vivo contra los antigenos virales. Por ejemplo, los residuos de ácido palmitico se pueden adherir a los grupos épsilon y alfa-amino de un residuo de lisina y luego enlazarse a un péptido de la presente invención. El péptido lipidado luego se puede administrar ya sea directamente en una micela o partícula, incorporar en un liposoma, o emulsionarse en un adyuvante. Como otro ejemplo de cebado de lipidos de las respuestas de CTL, las lipoproteinas de E. coli, tal como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) se puede utilizar para cebar CTLs cuando se une covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres y colaboradores, Nature 1989, 342: 561-4).

El método de administración puede ser oral, intradérmica, subcutánea, inyección intravenosa, u otros, y la administración sistémica o administración local a la vecindad de los sitios objetivo. La administración se puede realizar mediante una sola administración o reforzar mediante múltiples administraciones. La dosis de los péptidos de esta invención se pueden ajustar apropiadamente de acuerdo con la enfermedad que se tratar, edad del paciente, peso, método de administración, y otros, y es ordinariamente de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.1 mg a 10 mg, y se puede administrar una vez en pocos días a pocos meses. Una persona experta en la técnica puede seleccionar apropiadamente una dosis adecuada. (2) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo.

Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener ácidos nucleicos que codifican los péptidos dados a conocer en este documento en una forma expresable. En este documento, la frase "en una forma expresable" significa que el polinucleótido, cuando se introduce en una célula, se expresará in vivo como un polipéptido que induce' inmunidad anti-tumoral . En una modalidad ejemplificada, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés incluye elementos reguladores necesarios para la expresión del polinucleótido. El polinucleótido ( s ) se puede equipar para lograr la inserción estable en el genoma de la célula objetivo (véase, por ejemplo, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 para una descripción de vectores de cásete de recombinación homólogos) . Véase, por ejemplo, Wolff y colaboradores, Science 1990, 247: 1465-8; Patentes de E.U.A. Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; y WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de suministro basados en DNA incluyen " DNA desnudo", suministro facilitado (mediado por bupivacaína, polímeros, péptido) , complejos de lípidos catiónicos, y suministro mediado por partículas ("pistola génica") o mediados con presión (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5, 922, 687) .

Los péptidos ' de la presente invención también se pueden expresar por vectores virales o bacterianos. Ejemplos de vectores de expresión incluyen hospederos virales atenuados, tales, como vaccinia o viruela aviar. Este procedimiento implica el uso de virus de vaccinia, por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. En la introducción en un hospedero, el virus de vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico, y por consiguiente induce una respuesta inmunitaria. Los vectores .de vaccinia y métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,722,848. Otro ejemplo es BCG (Bacille Calmette Guerin) . Los vectores de BCG se describen por Stover y colaboradores, Nature 1991, 351: 456-60. Una amplia variedad de vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica por ejemplo, serán evidentes vectores de virus adeno- y adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax destoxificado y similares. Véase, por ejemplo, Shata y colaboradores, Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock y colaboradores, J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp y colaboradores, In Vivo 2000, 14: 571-85.

El suministro de un polinucleótido en un sujeto puede ser ya sea directo, caso en el cual el sujeto se expone directamente a un vector que lleva polinucleótido, o indirecta, caso en el cual, las células primero se transforman con el polinucleótido de interés in vitro, ' luego las células se trasplantan en · el sujeto. Estos dos procedimientos son conocidos, respectivamente, como terapias génicas in vivo y ex vivo. Para revisiones generales de los métodos de la terapia génica, véase Goldspiel y colaboradores, Clinical . Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de DNA recombinante que se pueden utilizar para la presente invención se describen en eds . Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; y Krieger, Gene. Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

El método de administración puede ser oral, intradérmico, subcutáneo, inyección intravenosa, u otros, y las administración sistémica o administración local a la vecindad de los sitios objetivos encuentra uso. La administración se puede realizar mediante una sola administración o reforzar por múltiples administraciones. La dosis del polinucleótido en el vehículo o células adecuadas transformadas con los polinucleótidos que codifica los péptidos de esta invención se pueden ajustar apropiadamente de acuerdo con la enfermedad que se trata, edad del paciente, peso, método de administración, y otros, y es ordinariamente de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.1 mg a 10 mg, y se pueden administrar una vez cada pocos días a una vez cada pocos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar apropiadamente la dosis adecuada .

X. Métodos que utilizan los péptidos, exosomas, APCs y CTLs Los péptidos de la presente invención y polinucleótidos que codifican estos péptidos se pueden utilizar para inducir APCs y CTLs, así como también para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer o tumor. Los exosomas y APCs de la presente invención también se pueden utilizar para inducir CTLs, así como también para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer o tumor.

Los péptidos, polinucleotidos, exosomas y APCs se pueden utilizar en combinación con cualquier otro compuesto siempre y cuando el compuesto no inhiba su inducibilidad de CTL. De esta manera, cualquiera de los agentes o composiciones farmacéuticos mencionados en lo anterior de la presente invención se pueden utilizar para inducir CTLs, y además de lo mismo, aquellos. que incluyen los péptidos y polinucleotidos también se pueden utilizar para inducir APCs como se plantea posteriormente. Además, los CTLs de la presente invención también se pueden utilizar para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer o tumor. (1) Método para inducir células que presentan antigeno (APCs) La presente invención proporciona métodos para inducir APCs utilizando los péptidos de esta invención o polinucleotidos que codifican los péptidos. La inducción de APCs se puede realizar . como se describe en lo anterior en la sección "VI. Células que presentan antigeno". Esta invención también proporciona un método para inducir APCs que tienen un alto nivel de inducibilidad de CTL, la inducción de la cual también se ha mencionado bajo el articulo de "VI. Células que presentan antigeno", supra. De manera preferente, los métodos para inducir APCs incluyen por lo menos una etapa seleccionada de entre: a: poner en contacto las APCs con un péptido de la presente invención, y . b: introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención en una forma expresable en las APCs. Estos métodos para inducir las APCs se realizan de manera preferente in vitro o ex vivo. Para realizar los métodos in vitro o ex vivo, las' APCs se pueden obtener del sujeto que se trata u otros cuyos antigenos HLA son los mismos como el sujeto que se trata. En una modalidad preferida, las APCs inducidas por los presentes métodos llevan los antigenos HLA-A2 sobre su superficie. (2) Método pa a inducir CTLs La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs utilizando los péptidos de esta invención, polinucleótidos que codifican los péptidos, o exosomas o APCs que presentan los péptidos. La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs utilizando un polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar un subunidad de receptor de células T (TCR) que reconoce (es decir, que se enlaza a) un complejo de los péptidos de la presente invención y antigenos HLA. De manera preferente, los métodos para inducir CTLs incluyen por lo menos una etapa seleccionada de entre: a: poner en contacto una célula CD8 positiva con una célula que presenta antígeno y/o una exosoma que presenta sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención, y b: inducir 'un polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad TCR que reconoce un complejo de un péptido de la presente invención y un antígeno HLA en una célula T CD8 positiva.

Cuando los péptidos de la presente invención se administran a un sujeto, los CTLs se inducen en el cuerpo del sujeto, y la resistencia de la respuesta inmunitaria que fija como objetivo del endotelio asociado a tumor se potencia. Alternativamente, los péptidos y polinucleótidos que codifican los péptidos se pueden utilizar para un método terapéutico ex vivo, ' en el cual las APCs derivadas del sujeto, y las células CD8 positivas, o leucocitos mononucleares de sangre periférica se ponen en contacto (estimulan) con los' péptidos de esta invención in vitro, y después de inducir los CTLs, las células de CTL activadas se regresan al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas de: a: recolectar las APCs del sujeto, b: poner en contacto el péptido con las APCs de la etapa a, c: mezclar las APCs de la etapa b con células T CD8+, y co-cultivar para inducir las CTLs, y d: recolectar las células T CD8+ del co-cultivo de la etapa c.

Alternativamente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de péptidos de esta invención para manufacturar un agente o composición farmacéutica que induce CTLs. Además, la presente invención proporciona un método o proceso para manufacturar un agente o composición farmacéutica que induce las CTLs, en donde el método incluye la etapa de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención también proporciona el péptido de la presente invención para inducir las CTLs.

Las células T CD8+ que tienen actividad citotóxica obtenidas por la etapa d se pueden administrar al sujeto como una vacuna. Las APCs que se mezclan con las células T CD8+ en la etapa c anterior también se pueden preparar al transferir genes que codifican los presentes péptidos en las APCs como se detalla en lo anterior en la sección "VI. Células que presentan antígeno"; pero no se. limitan a las mismas. Por consiguiente, cualquier APCs o exosomas que presentan efectivamente los presentes péptidos a las células T se pueden utilizar para el presente método. (3) Método para inducir una respuesta inmunitaria La presente, invención proporciona además métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer, tal como cáncer de pulmón y cáncer de esófago, en un sujeto. Los métodos incluyen la administración de una vacuna de la presente invención, que incluye: (a) uno o más oligopéptidos de la presente invención, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (b) uno o más polinucleótidos que codifica el oligopéptidos o el fragmento inmunológicamente activo de (a); (c) uno o más CTLs aislados de la presente invención; (d) uno o más células que presentan antigeno aisladas de la presente invención; o (e) uno o más células T aisladas y transformadas con un gen de codificación TCR.

En el contexto de la presente invención, el cáncer que sobre expresa IMP-3 se puede tratar con estos ingredientes activos. Ejemplos de estos cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón y cáncer de esófago. Por consiguiente, antes de la administración de las vacunas o composiciones farmacéuticas que contienen los ingredientes activos, es preferible confirmar si el nivel de expresión de IMP-3 en las células cancerosas o tejidos que se tratan se potencia como es comparado con las células normales del mismo órgano. De esta manera, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer (que sobre) expresa IMP-3, el método que puede incluir las etapas de: i) determinar el nivel de expresión de IMP-3 en células cancerosas o tejido (s) obtenidos de un sujeto con el cáncer que se trata; ii) comparar el nivel de expresión de IMP-3 con control normal; y iii) administrar por lo menos un componente seleccionado de entre (a) a (d) descritos en lo anterior a un sujeto con cáncer que sobre, expresa IMP-3 comparado con el control normal. Alternativamente, la presente invención puede proporcionar una vacuna o composición farmacéutica que incluye por lo menos un componente seleccionado de entre (a) a (d) descritos en lo anterior, para el uso en administrar a un sujeto que tiene cáncer que sobre expresa IMP-3. En otras palabras, la presente invención proporciona además un método para identificar un sujeto que se trata con un polipéptido IMP-3 de la presente invención, este método que incluye la etapa de determinar un nivel de expresión de IMP-3 en células cancerosas derivadas de un sujeto o tejido (s), en donde un incremento del nivel, comparado con un nivel de control normal del gen indica que el sujeto tiene cáncer que se puede tratar con el polipéptido IMP-3 de la presente invención. Los métodos para tratar cáncer de la presente invención se describen con más detalle posteriormente.

Cualquier célula o 'tejido, derivados de un sujeto se pueden utilizar para' la determinación de la expresión de IMP-3 siempre y cuando incluya el producto de transcripción o traducción objetivo de IMP-3. Los ejemplos de muestras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, tejidos y fluidos corporales, tales como sangre, esputo y orina. De manera preferente, la muestra de célula o tejido derivado de un sujeto contiene una población de células que incluyen una célula epitelial, de manera más preferente una célula epitelial cancerosa o una célula epitelial derivada de tejido sospechoso de ser canceroso'. Además, si es necesario, la célula se puede purificar de tejidos y fluidos corporales obtenidos, y lueqo utilizar como la muestra derivada del sujeto. Un sujeto que se trata por el presente método es de manera preferente un mamífero. Mamíferos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo y vaca.

De acuerdo con la presente invención, se determina el nivel de expresión de IMP-3 en células o tejidos cancerosos obtenidos de un sujeto. El nivel de expresión se puede determinar en el nivel de producto de transcripción, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el mRNA de IMP-3 se puede cuantificar usando sondas mediante métodos de hibridación (por ejemplo, hibridación Northern). La detección se puede llevar a cabo en un chip o un arreglo. El uso de un arreglo es preferible para detectar el nivel de expresión de IMP-3. Aquellas personas expertas en la técnica pueden preparar estas sondas utilizando la información de secuencia de IMP-3. Por ejemplo, el cDNA de IMP-3 se puede utilizar como las sondas. Si es necesario, las sondas se pueden etiquetas con una etiqueta adecuada, tales como tintes, sustancias fluorescentes e isótopos, y el nivel de expresión del gen se puede detectar como la intensidad de las etiquetas hibridadas.

Adicionalmente, el producto de transcripción de IMP-3 (por ejemplo/ SEQ ID NO: 21) se puede cuantificar utilizando cebadores mediante métodos de detección basados en amplificación (por ejemplo, RT-PCR) . Estos cebadores se pueden preparar con base en la información de secuencia disponible del gen. Específicamente, una sonda o cebador utilizados por el presente método se híbrida bajo condiciones rigurosas, moderadamente rigurosas, o poco rigurosas al mRNA de IMP-3. Como se utiliza en este documento, la frase "condiciones rigurosas (hibridación)" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda o cebador se hibridará a su secuencia objetivo, pero no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes bajo diferentes circunstancias. La hibridación especifica de secuencias más largas se observa en altas temperaturas que las secuencias más cortas. En general, la temperatura de una condición rigurosa se selecciona que sea de aproximadamente 5 grados Centígrados menor que el punto de fusión térmica (Tm). para una secuencia específica en una resistencia iónica definida y pH. La Tm es la temperatura (bajo una resistencia iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico) en el cual 50% de las sondas complementarias a su secuencia objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio. Puesto que las secuencias objetivo están generalmente presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas se ocupan en el equilibrio. Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente ión de sodio 1.0 M, típicamente de manera aproximada de ión de sodio 0.01 a 1.0 M (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos de aproximadamente 30 grados Centígrados para sondas o cebadores cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 grados Centígrados para sondas o cebadores más largos. Las condiciones rigurosas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tal como formamida.

Las sondas o cebadores pueden ser de tamaños específicos. Los tamaños pueden variar de por lo menos 10 nucleótidos, por lo menos 12 nucleótidos, por lo menos 15 nucleótidos, por lo menos 20 nucleótidos, por lo menos 25 nucleótidos, por lo menos 30 nucleótidos y las sondas y cebadores pueden variar en tamaño de 5-10 nucleótidos, 10-15 nucleótidos, 15-20 nucleótidos, 20-25 nucleótidos y 25-30 nucleótidos. Alternativamente, el producto de traducción se puede detectar para diagnóstico de la presente invención. Por ejemplo, la cantidad e proteína IMP-3 (SEQ ID NO: 22) se puede determinar. Los métodos para determinar la cantidad de la proteína como el producto de traducción incluyen métodos de inmunoensayo que utilizan un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Adicionalmente, cualquier fragmento o modificación (por ejemplo, anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etcétera) del anticuerpo se puede utilizar para la detección, siempre y cuando el fragmento o anticuerpo modificado retenga la capacidad de enlace a la proteína IMP-3. Los métodos para preparar estas clases de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y cualquier método se puede emplear en la presente invención para preparar estos anticuerpos equivalentes de los mismos.

Como otro método para detectar el nivel de expresión del gen IMP-3 con base en su producto de traducción, la intensidad ' de tinción se puede medir a través de un análisis inmunohistoquimico utilizando un anticuerpo contra la proteina IMP-3. Particularmente, en esta medición, la tinción potente indica la presencia/nivel incrementado de la proteina y, al mismo tiempo, el nivel de expresión alto del gen IMP-3. El nivel de expresión de un gen objetivo, por ejemplo, el gen IMP-3, en células cancerosas se puede determinar para ser- implementado si el nivel se incrementa del nivel de control (por ejemplo, el nivel en las células normales) del gen objetivo por, por ejemplo, 10%, 25%, o 50%; o se incrementa a más de i.l veces,, más de 1.5 veces, más de 2.0 veces, más de 5.0 veces, más de 10.0 veces, o más.

El nivel de control se puede determinar al mismo tiempo como las células cancerosas, al utilizar una muestra (s) recolectada y almacenada previamente de un sujeto/sujetos cuyo estado (s) de enfermedad (canceroso o no canceroso) se conoce. Además, las células normales obtenidas de regiones no cancerosas de un órgano que tiene el cáncer que se trata se puede utilizar como el control normal. Alternativamente, el nivel de control se puede determinar por un método estadístico con base en los resultados obtenidos al analizar el nivel (es) de expresión previamente determinado del gen IMP-3 en las muestras del sujeto cuyos estados de enfermedad son conocidos. Adicionalmente, el nivel de control se puede derivar de una base de datos de patrones de expresión de células previamente sometidas a prueba. Por otra parte, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, el nivel de expresión del gen IMP-3 en una muestra biológica se puede comparar con múltiples niveles de control determinados de múltiples muestras de referencia. Se prefiere utilizar un nivel de control determinado de una muestra de referencia derivada de un tipo de tejido similar a aquel de la muestra biológica derivada del sujeto. Por otra parte, se prefiere utilizar el valor estándar de los niveles de expresión del gen IMP-3 en una población con un estado de enfermedad conocido. El valor estándar se puede obtener mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un intervalo de medio +/- 2 S.D. o medio +/- 3 S.D. se puede utilizar como el valor estándar.

En el contexto de la presente invención, un nivel de control determinado de una muestra biológica que se sabe que no es canceroso es referido como un "nivel de control normal". Por otra parte, si el nivel de control se determina de una muestra biológica cancerosa, será referido como un "nivel de control canceroso". La diferencia entre un nivel de expresión de muestra y un nivel de control se puede normalizar a nivel de expresión de los ácidos nucleicos de control, por ejemplo, genes de limpieza, cuyos niveles de expresión se sabe que no difieren dependiendo del estado canceroso o no canceroso de la célula. Los genes de control ejemplares incluyen, pero no se limitan a, beta-actina, gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa, y proteina ribosomal Pl . Cuando el nivel de. expresión del gen IMP-3 se incrementa como es comparado con el nivel de control normal, o es similar/equivalente al nivel de control canceroso, el sujeto se puede diagnosticar con' cáncer que se trata.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método de (i) diagnosticar si un sujeto tiene cáncer que se trata, y/o (ii) seleccionar un sujeto para el tratamiento contra el cáncer, el método que incluye las etapas de: a) determinar el nivel de expresión de IMP-3 en células o tejido (s) cancerosos obtenidos de un sujeto quien se sospecha que tiene el cáncer que se trata; b) comparar el nivel de expresión de IMP-3 con un nivel de control normal; c) diagnosticar al sujeto que tiene el cáncer que se trata, si el nivel de expresión de IMP-3 se incrementa como es comparado con el nivel de control normal; y d) seleccionar al sujeto para el tratamiento contra el cáncer, si el sujeto se diagnostica por tener el cáncer que se trata, en la etapa c) .

Alternativamente, este método incluye las etapas de: a) determinar el nivel de expresión de IMP-3 en células o tejido (s) cancerosos obtenidos de un sujeto quien se sospecha que tiene el cáncer que. se trata; b) comparar el nivel de expresión de IMP-3 con un nivel de control canceroso; c) diagnosticar al sujeto que tiene el cáncer que se trata, si el nivel de expresión de IMP-3 es similar o equivalente al nivel de control canceroso; y d) seleccionar el sujeto para el tratamiento contra el cáncer, si el sujeto se diagnostica por tener el cáncer que se trata, en la .etapa c) .

La presente invención también proporciona un kit para determinar un sujeto que padece de cáncer que se puede tratar con el polipéptido ???-3 de la presente invención, que también puede ser útil en evaluar y/o supervisar la eficacia de una terapia contra el cáncer particular, de manera más particular una inmunoterapia contra el cáncer. Ejemplos ilustrativos de cánce-res adecuados incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón y cáncer de esófago. De manera más particular, el kit incluye de manera preferente por lo menos un reactivo para detectar la expresión del gen IMP-3 en células cancerosas derivadas de un sujeto, este reactivos se selecciona del grupo de: . (a) un reactivo para detectar mRNA del gen IMP-3; (b) un reactivo para detectar la proteína IMP-3; y (c) un reactivo para detectar la actividad biológica de la proteína IMP-3.

Los ejemplos de reactivos adecuados para detectar el mRNA del gen IMP-3 incluyen ácidos nucleicos que se enlazan específicamente a o identifican el mRNA de IMP-3, tal como oligonucleótidos que tienen una secuencia de complementariedad a una porción del mRNA de IMP-3. Estas clases de oligonucleótidos se. ejemplifican por cebadores, y sondas que son específicas al mRNA de IMP-3. Estas clases de oligonucleótidos se pueden preparar con base en métodos bien conocidos en la técnica. Si es necesario, el reactivo para detectar el mRNA de IMP-3 .se puede inmovilizar sobre una matriz sólida. Por. otra parte, más de un reactivo para detectar el mRNA de IMP-3 se puede incluir en el kit.

Por otra parte, ejemplos de reactivos adecuados para detectar la proteína IMP-3 incluyen anticuerpos a la proteína IMP-3. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Adicionalmente, . cualquier fragmento o modificación (por ejemplo, anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etcétera) del anticuerpo se pueden utilizar como el reactivo, siempre y cuando el fragmento o anticuerpo modificado retenga la capacidad de enlace a la proteina IMP-3. Los métodos para preparar estos pesos de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y cualquier método se puede emplear en la presente invención para preparar estos anticuerpos equivalentes de los mismos. Adicionalmente, el anticuerpo se puede etiquetar con moléculas generadoras de señal a través del enlace directo o una técnica de etiquetado indirecto. Las etiquetas y métodos para etiquetar anticuerpos y detectar enlaces de los anticuerpos a sus objetivos son bien conocidos en la técnica, y cualquier etiqueta y método se pueden emplear para la presente invención. Por otra parte, más de un reactivo para detectar la proteína IiyjP-3 se puede incluir en el kit .

El kit puede contener más de uno de los reactivos mencionados en lo anterior. Por ejemplo, las muestras de tejido obtenidas de . los sujetos sin cáncer o que padecen de cáncer, pueden servir como reactivos de control útiles. Un kit de la presente invención puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de paquete (por ejemplo, escritos, de cinta, CD-ROM, etcétera) con instrucciones para el uso. Estos reactivos y otros se pueden retener en un recipiente con una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen botellas, frasquitos y tubos de prueba. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tal como vidrio o plástico.

Como una modalidad de la presente invención, cuando el reactivo es una sonda contra el mRNA de IMP-3, el reactivo se puede inmovilizar sobre una matriz sólida, tal como una tira porosa para formar por lo menos un sitio de detección. La región de medición o detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de sitios, que contiene cada uno un ácido nucleico (sonda). Una tira de prueba también puede contener sitios para controles negativos y/o positivos. Alternativamente, los sitios de control se pueden localizar sobre una tira separada de la tira de prueba. Opcionalmente, los diferentes sitios de detección pueden contener diferentes cantidades de ácidos nucleicos inmovilizados, es decir, una mayor cantidad en el primer sitio de detección y menores cantidades en sitios subsecuentes. En la adición de muestra de prueba, el número de sitios que expresan una señal detectable proporciona una indicación cuantitativa de la cantidad de mRNA de IMP-3 presente en la muestra. Los sitios de detección se pueden configurar en cualquier forma adecuadamente detectable y están típicamente en la forma de una barra o punto que abarcan el ancho de una tira de prueba.

El kit de la présente . invención puede incluir además una muestra de control positivo o muestra estándar de IMP-3. La muestra de control positivo de la presente invención se puede preparar al recolectar muestras positivas de IMP-3 y luego someter a ensayo sus niveles IMP-3. Alternativamente, una proteina IMP-3 purificada o polinucleótido se pueden agregar a las células que no expresan IMP-3 para formar la muestra positiva o la muestra estándar IMP-3. En . la presente invención, el IMP-3 purificado puede ser una proteína recombinante . El nivel IMP-3 de la muestra de control positiva es, por ejemplo, más del valor de corte. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a una persona de experiencia ordinaria en hacer y utilizar la misma. Los ejemplos no se limitan en ninguna forma para limitar de otra manera el alcance de la invención.

EJEMPLOS Materiales y Métodos Ratones Ratones transgénicos (Tg) de antígeno de leucocitos humanos (HLA)-A2; ratones genéticamente deficientes dobles H-2Db y beta2m introducidos con un gen de constructo de monocadena citoplásmico de (transmembrana 3 alfa) beta2m-HLA-A2.1 (HLA-A*0201, alfa 1, alfa 2)-H-2Db humano se generaron en the Department . SIDA-Retrovirus, Unite d' Immunite Cellulaire Antivirale, Institute Pasteur, France and kindly provided by Dr. F.A. Lemonnier. Los ratones se mantuvieron en El Centro para Recursos y Desarrollo de Animales de la Universidad de Kumamoto y se manejaron de acuerdo con las guias de cuidado animal de la Universidad de Kumamoto.

Linea de células Lineas de células PANC1, A549, Lu99, MCF7 , SW620, SKHepl y deficientes de T2, TAP y positivas de HLA-A2 (A*0201), se compararon de Riken Cell Bank, Tsukuba, Japón. La expresión del IMP-3 se determinó mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa.

Muestras de sangre Las investigaciones hechas al utilizar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de donadores de HLA-A2-positivos se aprobaron por el Consejo de Revisión Institucional de la Universidad de Kumamoto, Kumamoto, Japón. Las muestras de sangre de 4 pacientes con cáncer de pulmón, designadas paciente 1, paciente 3 y paciente 4, paciente 14 y paciente 103, se obtuvieron durante procedimientos de. diagnóstico de rutina después de obtener los consentimientos informados escritos formales por los pacientes en Kumamoto University Hospital. Las muestras de sangre también se obtuvieron de donadores sanos con HLA-A2 (A*0201 ) -positivos, designados, donador 1, donador 2 y donador 3, después de recibir el consentimiento informado escrito. Todas las muestras fueron anónimas, se enumeraron aleatoriamente y se almacenaron a -80 grados Centígrados hasta el uso.

Selección candidato de péptidos derivados de IMP-3 Los péptidos derivados de IMP-3 que se pueden enlazar posiblemente a la molécula HLA-A2 (A*0201) se predijeron utilizando un software de predicción de enlace "BIMAS" (htt : //www-bimas . cit . nih . gov/molbio/hla_bind) (Parker y colaboradores, J Immunol 1994, 152(1): 163-75, Kuzushima y colaboradores, Blood 2001, 98(6): 1872-81). Estos péptidos y el péptido de VIH restringido de HLA-A2 (A*0201) (SLYNTYATL) se sintetizaron por American Peptide Company, Sunnyvale, CA, EUA con la pureza de >95%.

Inducción de los CTLs de ratón de IMP-3 reactivo Ratones HLA-A2 Tg se inmunizaron con 5 X105 células dendríticas derivadas de médula ósea singénica (BM-DCs) pulsadas con péptidos candidatos in vivo en el 7 y 14. En el día 21, células del bazo CD4-aisladas de los ratones inmunizados se estimularon con BM-DCs pulsadas con cada péptido durante 6 días. Se detectó la producción de IFN-gamma por un ensayo de inmunopuntos enlazado a enzimas (ELISPOT) . Inducción de CTLs humanos de IMP-3 reactivo Las PBMCs de sangre heparinizada de donadores de HLA-A2 (A*0201 ) -positivo se. aislaron por medio de centrifugación gradiente de densidad Ficoll-Conray para generar DCs derivadas de monocitos periféricos. Las DCs se pulsaron con 20 micro-g/mL de los péptidos candidatos en presencia de 4 micro-g/mL de beta2-microglobulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) durante 2 horas a 37 grados Centígrados en AIM-V (Invitrogen Japan, Tokio, Japón) que contienen 2% de plasma autólogo inactivado con calor. Las células después se irradiaron (40 Gy) y se incubaron con las células T CD8+. Estos cultivos se colocaron en placas de 24 pocilios, cada pocilio contuvo 1 X 105 DCs pulsadas con péptido, 2 X 106 células T CD8+ y 5 ng/mL de IL-7 recombinante humano (Wako, Osaka, Japan) en 2 mL de AIM-V con 2% de plasma autólogo. Después de 2 días, estos cultivos se suplementaron con IL-2 recombinante humano (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA) a una concentración final de 20 IU/mL. Dos estimulaciones semanales adicionales con DCs autólogas, cargadas con péptido, que .utilizan el mismo procedimiento, se llevaron a cabo en los' días 7 y 14. Seis días después de la última estimulación, las respuestas específicas de antígeno de los CTLs inducidos se investigaron por el ensayo ELISPOT para IFN-gamma y el ensayo de liberación 51Cr. Para el ensayo ELISPOT para IFN-gamma, los CTLs (1 X 105 células/pocilio) se estimularon con T2 (I X' lOVpocillo) pulsado con péptidos cognados o el péptido de IH irrelevante. Para el ensayo de liberación 51Cr, los CTLs se co-cultivaron con células T2 pulsadas con péptido o células cancerosas como células objetivo (5 X 10'3/pocilio) en la relación de efectos/objetivo indicada y un ensayo de liberación 51Cr estándar se hizo como se describe previamente (Komori. H y colaboradores, Clin Cáncer Res. 2006 May 1 ; 12 ( 9 ) : 2689-97 ) .

Análisis de la exposición de CD107a (LAMP-1; proteina-1 de membrana asociada lisosomal) sobre la superficie celular de los CTLs . La exposición de CD107a sobre la superficie celular de los CTLs después de la estimulación con el antigeno se detectó por el anticuerpo anti-CD107a. Los CTLs específicos del péptido IMP-3 se estimularon con el péptido cognado o el péptido de VIH irrelevante en presencia de mAb de anti-CD107a conjugado con FITC o IgGl de ratón común. Estos CTLs se cultivaron durante 5 horas a 37 grados Centígrados y se tiñeron subsecuentemente con mAb CD8 antihumano conjugado con PR. Todos los péptidos se utilizaron en una concentración final de 1 microgramo/ml . los eventos mostrados se acumulan para las células T CD8+..

Inhibición de las respuestas de CTL por el anticuerpo monoclonal anti-HLA-clase I La inhibición de HLA clase I se hizo como se describe previamente (Komori H y colaboradores, Clin Cáncer Res. 2006 May 1; 12 ( 9) : 2689-97 ) . Específicamente, después de que se incubaron las células objetivo Lu99 con mAb anti-HLA clase I (W6/32, IgG2a) o mAb anti-HLA-DR (mAb de HLA clase II) (H-DR-1, IgG2a) , respectivamente, durante 1 hora, las células Lu99 se co-cultivaron con CTLs derivados de pacientes con cáncer de pulmón mediante la estimulación con péptidos cognados .

Análisis estadístico La prueba t de Student de dos colas se utilizó para evaluar la importancia estadística de las diferentes en los datos obtenidos por el ensayo ELISPOT para IFN-gamma. Un valor de P <0.05 se consideró que es significativo. El análisis estadístico se realizó utilizando un paquete de software estadístico comercial (SPSS for Windows, versión 11.0, Chicago, IL, EUA) . .

Resultados Predicción de los péptidos de enlace de HLA-A2 derivados de IMP-3 La Tabla 1 muestra los péptidos de enlace HLA-A2 (A*0201) de IMP-3 en orden en afinidad de enlace más alta (Tabla 1) . Se seleccionó un total de 20 péptidos con capacidad de enlace HLA-A2 (A*0201) potencial.

Péptidos de enlace HLA-A2 (A*0201) derivados de IMP-3 Inducción de CTLs de ???-3-reactivo y HLA-A2-restringido utilizando ratones transgénicos HLA-A2 Para probar cual de los péptidos puede inducir linfocitos T citotóxicos reactivos al péptido (CTLs), células el bazo CD4-de ratones transgénicos (Tg) HLA-A2 (A*0201) inmunizados dos veces con péptidos 9-mer se estimularon in vitro como se describe en Materiales y Métodos. Se descubrió que las células del bazo CD4-estimuladas con péptidos IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) produjeron IFN-gamma en respuesta a las BM-DCs singénicas pulsadas con péptidos cognados. Comparada con la producción de IFN-gamma contra las BM-DCs solas, estas células del bazo CD4-reconocieron células que presentan antigeno y produjeron IFN-gamma (P <0.05) (Figura 1) . Estos resultados mostraron que los péptidos IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) podrían inducir CTLs que tienen la actividad potente de la producción de IFN-gamma y en los ratones HLA-A2 Tg.

Inducción de CTLs humanos IMP-3 reactivos y HLA-A2 restringidos Se generaron CTLs IMP-3 reactivos de PBMCs de un donador sano de HLA-A2 (A*0201 ) -positivo por la estimulación de PBMCs con péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1), IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) . La producción de IFN-gamma contra células T2 pulsadas con péptido se examinó por el ensayo ELISPOT IFN-gamma. Los CTLs mostraron una producción de IFN-gamma potente contra células T2 pulsadas con péptidos IMP-3 cognados con una diferencia significativa comparada con aquella contra las células T2 pulsadas con péptido de HIV irrelevante (P <0.05) (Figura 2). Estos resultados indican que los péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1), IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) podrían inducir CTLs humanos específicos a esos péptido. Adicionalmente, la exposición de CD107a sobre la superficie celular de los CTLs específicos de los péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1), IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) se analizó para examinar la actividad citolítica. Los CTLs se estimularon con péptido IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) y se tiñeron con mAb anti-CD107a o IgG de ratón como un control (Figura 3A) . Los CTLs estimulados con el péptido de HIV irrelevante también se tiñeron con mAb anti-CD107a (panel derecho) . Se detectaron las células CD8+/CD107a+ en 5.7% de todas las células de CD8+ mediante estimulación con el péptido IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) (panel izquierdo) . Como una señal no específica, la tinción con IgG de ratón se detectó en 0.7% de las células y las células CD8+/CD107a+ se detectaron en 1.5% de las células estimuladas con el péptido de HIV como un control negativo (paneles centra y derecho) . Como CD107a no se presenta usualmente sobre la superficie celular de los CTLs pero se expone solamente durante la desgranulación activa (Betts M y colaboradores, J Immunol Methods . 1 de Octubre de 2003; 281 ( 1-2 ): 65-78 ) , este resultado indica que los CTLs muestran una actividad citotóxica en respuesta al péptido IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1),· IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) péptido y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) . La actividad citotóxica contra las células T2 pulsadas con péptidos se examinó por los ensayos de liberación de 51Cr (Figura 3B) . Los CTLs inducidos de las PBMCs de donadores sanos mostraron actividad citotóxica a las células T2 pulsadas con el péptido IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1) o IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6), pero no a las células T2 pulsadas con un péptido de HIV-A2 irrelevante. Estos resultados indican que estos CTLs tienen una citotoxicidad especifica de péptido.

Inducción de CTLs y. ???-3-reactivo y HLA-A2-restringidos de PBMCs de pacientes con cáncer de pulmón Los CTLs y IMP-3 específicos se indujeron de PBMCs de pacientes con cáncer de pulmón de HLA-A2 (A*0201)-positivos por la estimulación con péptidos IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID' NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) . En la Figura 4A, los CTLs de pacientes con cáncer de pulmón, designados como paciente 14 y paciente 103, mostraron una producción de IFN-gamma contra las células T2 pulsadas con el péptido IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) péptido (panel izquierdo) y el péptido IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) (panel derecho), respectivamente. Comparadas con las células T2 pulsadas con el péptido de HIV irrelevante, mostraron significativamente actividad potente de la producción de IFN-gamma especifica a esos péptidos (*P <0.05). El ensayo de liberación de 51Cr reveló que los CTLs de las PBMCs de otros dos pacientes con cáncer de pulmón, designados paciente 4 y paciente 3, mostraron actividad citotóxica a las células T2 pulsadas con el péptido IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) (panel izquierdo) y el péptido IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) (panel derecho) , sin mostrar actividad citotóxica a las células T2 pulsadas con el péptido de HIV irrelevante (Figura 4B) . Estos resultados indican que estos péptidos inducen CTLs específicos a los péptidos que no solamente utilizan PBMCs de donadores sanos sino también utilizan aquellas de pacientes con cáncer de pulmón.

Actividad citotóxica de los CTLs contra la línea de células cancerosas IMP-3 y HLA-A2 positivas La capacidad de exterminar líneas de células cancerosas humanas que expresan tanto IMP-3 como HLA-A2 (A*0201) se examinó por el ensayo de liberación de 51Cr. Como se muestra en la Figura 5A, los CTLs inducidos de PBMCs del donador sano 2 por la estimulación con el péptido IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), el péptido IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5), el péptido IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) y IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1) mostraron actividad citotóxica contra PANC-1, que expresa tanto IMP-3 como HLA-A2 (A*0201) . Por otra parte, no mostraron actividad citotóxica contra MCF7, que expresa HLA-A2 (A*0201) pero no IMP-3, o A549, que expresa I P-3 pero no HLA-A2 (A*0201) . Adicionalmente , los CTLs inducidos de PBMCs de los pacientes con cáncer de pulmón, designados paciente 14 y paciente 4, por la estimulación con los péptidos que tienen el péptido IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), el péptido IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5), el péptido IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) también mostraron actividad citotóxica contra PANC-1 (IMP-3+, HLA-A2+) sin mostrar citotoxicidad contra MCF7 (IMP-3-, HLA-A2+ ) y A549 (IMP-.3+, HLA-A2-) (Figura 5B) . Las líneas CTL generadas de los donadores sanos por la estimulación con los péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1) o IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) , mostraron citotoxicidad contra MCF7/IMP-3 (células MCF7 transfectadas con el gen IMP-3; HLA-A2 +, IMP-3 +) pero no contra las células MCF7 (HLA-A2 +, IMP-3-) (Figura 5C) . las lineas de CTL generadas de los donadores sanos mediante la estimulación con ya sea IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1) o IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) mostraron actividad citotóxica contra SW620, SKHepl pero no contra A549 (HLA-A2-, IMP-3+) o células MCF7 (HLA-A2+ , IMP-3-) (Figura 5D) .

Inhibición de respuestas de CTL por el anticuerpo monoclonal anti-HLA-clase I Para confirmar que los CTLs inducidos reconocen las células objetivo en la manera HLA-clase I-restringida, se realizó el ensayo de inhibición utilizando el anticuerpo monoclonal contra HLA-clase I (W6/32, IgG2a) , HLA-DR (H-DR-1, IgG2a) , mAb anti-HLA-A2 (BB7.2) para bloquear las repuestas especificas de antigeno de los CTLs. En la Figura 6A, la inhibición de la producción de IFN-gamma por los CTLs generados del paciente 14 con cáncer de pulmón por la estimulación con el péptido I P-3-552-560 (SEQ ID NO: 3) (panel izquierdo), el péptido IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) (panel central) o el péptido IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) (panel derecho) se examinó por el ensayo ELISPOT IFN-gamma. La producción de IFN-gamma contra las células Lu99 se inhibió significativamente, por el tratamiento con W6/32, pero no por el tratamiento con H-DR-1 (*P <0.05). Estos resultados indican claramente que estos CTLs reconocieron las células objetivo que expresan IMP-3 en una manera HLA-clase I-restringida. Adicionalmente, la producción de IFN-gamma y la citotoxicidad se inhibieron significativamente por el bloqueo de mAb contra HLA-clase I- y HLA-A2, pero no por el mAb anti-HLA-clase II de control (Figura 6B-D) . Estos resultados indican claramente que estos péptidos se procesaron naturalmente de la proteina IMP-3 en células cancerosas y se presentaron en el contexto de HLA-A2 para ser reconocidos por los CTLs inducidos de péptido Análisis de homología entre los péptidos antigénicos IMP3 y otras proteínas Los CTLs estimulados con los péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1), IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) mostraron actividad de CTL significativa y específica. Este resultado puede ser debido al hecho de que las secuencias de los péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1), IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) son homologas a los péptidos derivados de otras moléculas que se sabe que sintetizan el sistema inmunitario humano. Para excluir esta posibilidad, se realizaron análisis de homología para estas secuencias de péptido utilizando como consultas al algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /blast/blast . cgi) que ' no reveló secuencias con homología significativa a aquellas secuencias de péptidos. Los resultados de los análisis de homología indican que las secuencias de los péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1), IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) son únicas y de esta manera, hay poca posibilidad, de que el mejor conocimiento de los inventores, estas moléculas elevan las respuestas inmunológicas no propuestas a algunas moléculas no relacionadas.

En conclusión, los péptidos IMP-3-199-207 (SEQ ID NO: 1), IMP-3-552-560 (SEQ ID NO: 3), IMP-3-26-34 (SEQ ID NO: 5) y IMP-3-515-523 (SEQ ID NO: 6) se identificaron como péptidos de epitopo HLA-A2 (A*0201 ) -restringidos novedosos derivados de IMP-3 y se mostró que son aplicables como vacunas contra el cáncer para pacientes HLA-A2 (A*0201)-positivos con tumores que expresan IMP-3.

Aplicabilidad Industrial La presente invención identifica nuevos TAAs, particularmente aquellos que inducen respuestas inmunitarias anti-tumorales potentes y especificas. Estos TAAs garantizan el desarrollo adicional de aplicaciones clínicas de estrategias de vacunación del péptido en el cáncer. Todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones citadas en este documento se incorporan a manera de referencia. Mientras que la invención se ha descrito con detalle y con referencia a modalidades específicas de la misma, se va a entender que la descripción anterior es ejemplar y explicativa en naturaleza y se propone para ilustrar la invención y sus modalidades preferidas. A través de experimentación de rutina, una persona experta en la técnica reconocerá fácilmente que se pueden .hacer varios cambios y modificaciones en la misma sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. De esta manera, la invención se propone para ser definida no por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un oligopéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6.

2. Un oligopéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6, en donde 1, 2, o varios aminoácido ( s ) se sustituyen, suprimen, insertan y/o agregan, en donde además el oligopéptido tiene inducibilidad de linfocitos T citotóxicos (CTL) .

3. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el oligopéptido tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido del N-terminal es leucina o metionina, y (b) el aminoácido C-terminal es valina o leucina.

4. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica el peptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un método para inducir una célula que presenta antigeno que tiene inducibilidad de CTL, caracterizado porque utiliza un oligopéptido como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el método comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste de: (a) poner en contacto una célula que presenta antigeno con el oligopéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, e (b) introducir un polinucleótido que codifica el oligopéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una célula que presenta antigeno.

7. El método de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque la célula que presenta antigeno expresa por lo menos un antigeno HLA-A2 sobre su superficie.

8. Un método para inducir CTL, caracterizado porque utiliza el oligopéptido como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el método comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste de: (a) poner en contacto una célula T CD8-positiva con una célula que presenta antigeno y/o un exosoma que presenta un complejo del oligopéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un antigeno HLA sobre su superficie, y (b) introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad de receptor de células T (TCR) que se enlaza a un complejo del oligopéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un antigeno HLA sobre una superficie celular, en una célula T CD8-positiva .

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el antigeno HLA es HLA-A2.

11. Un CTL aislado, caracterizado porque fija como objetivo el oligopéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. El CTL de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el CTL es capaz de enlazarse a un complejo del oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 y un antigeno HLA sobre una superficie celular.

13. El CTL de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el antigeno HLA es HLA-A2.

14. Un CTL aislado, caracterizado porque se induce al utilizar el oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3.

15. El CTL de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el CTL se induce por el método de cualquiera de reivindicaciones 8 a 10.

16. Una célula que presenta antigeno aislada, caracterizada porque presenta sobre su superficie un complejo de un antigeno HLA y el oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3.

17. La célula que presenta antigeno de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el antigeno HLA es HLA-A2.

18. La célula que presenta antigeno de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque la célula que presenta antigeno se induce por el método de cualquiera de reivindicaciones 5 a 7.

19. Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un cáncer en un sujeto, el método caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto una vacuna que comprende por lo menos un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido ( s ) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,' o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (b) uno o más polinucleótido (s) que codifica el oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (c) uno o más CTL(s) aislados de cualquiera de reivindicaciones 11 a 15; y (d) una o más célula (s) que presenta antigeno aislada de conformidad con la reivindicación 16 o 18.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el sujeto es HLA-A2 positivo.

21. Un agente farmacéutico para el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operativa del mismo, caracterizado porque el agente comprende un vehículo · farmacéuticamente aceptable y por lo menos un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido ( s ) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (b) uno o más de un polinucleótido ( s ) que codifica por lo menos un oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3, o fragmento inmunológicamente activo del mismo; (c) una o más célula (s) que presentan antígenos que presenten un complejo de oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 y un antígeno HLA sobre su superficie; y . (d) uno o más CTL(s) que es capaz de enlazarse a un complejo del oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 y el antigeno HLA sobre una superficie celular.

22. Un agente farmacéutico para inducir los CTLs, caracterizado porque el agente comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido ( s ) de cualquiera de reivindicaciones 1 ¦ a 3, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (b) uno o más polinucleótido ( s ) que codifica por lo menos un oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo; (c) una o más célula (s) que presenta antígeno que presente un complejo de oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones l a 3 'y un antígeno HLA sobre su superficie.

23. El agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 21 o 22, caracterizado porque el agente farmacéutico se formula para la administración a un sujeto quien es HLA-A2 positivo.

24. El agente farmacéutico de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque es una vacuna.

25. Uso de un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste de: (a) uno o más oligopéptido (s) de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3; (b) uno o más polinucleótido (s) que codifica el oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 en una forma expresable; (c) una o más célula (s) que presenta antigeno que presente un complejo de oligopéptido de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 y un antigeno HLA sobre su superficie; y (d) uno o más CTL(s) que es capaz de enlazarse a un complejo del oligopéptido de .cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 y un antigeno HLA sobre una superficie celular, en la manufactura de una composición farmacéutica o agente para tratar cáncer.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la composición farmacéutica o agente se formula para la administración a un sujeto quien es HLA-A2 positivo.

27. Un oligopéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6, para el uso en el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operativa del mismo en un sujeto quien es HLA-A2 positivo.

28. Un oligopéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y 6, en donde 1, 2, o varios aminoácido ( s ) se sustituyen, suprimen, insertan y/o agregan, en donde además el oligopéptido tiene inducibilidad de linfocitos T citotóxicos (CTL) , para el uso en el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operativa del mismo en un sujeto quien es HLA-A2 positivo.

29. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el oligopéptido tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido del N-terminal es leucina o metionina, y (b) el aminoácido C-terminal es valina o leucina.