TW201113372A - Tumoricidal, bactericidal, or viricidal macrophage activation - Google Patents

Description

201113372 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於巨噬細胞之活化方法及治療癌症、處理細 菌病原體及病毒病原體之方法。詳言之，使Gc蛋白活體内 或離體轉化為Gc-巨噬細胞活化因子（GcMAF)。該GcMAF 活化巨噬細胞，該等巨噬細胞可隨後靶向癌細胞、細菌病 原體及/或病毒病原體。或者，巨噬細胞係藉由使其活體 内或離體與GcMAF接觸來活化。視情況而定，在接受本發 明之巨噬細胞活化處理的患者中藉由使該患者的血液與固 定於惰性介質上之α-Ν-乙醯半乳糖胺酶結合配位體接觸來 使α-Ν-乙醯半乳糖胺酶失活。 【先前技術】 對習知治療模態具有抗.性之轉移的不受控制之生長為癌 症死亡的主要原因。轉移起因於先前存在於原發贅瘤内之 特化惡性細胞的非隨機擴散。該等轉移可能源於無性繁 殖’且不同轉移可起源於不同祖細胞。此外，轉移性細胞 可展現與良性非轉移性細胞相比自發突變率升高。該資料 可解釋以下臨床觀察結果：多發性轉移可展現對相同治療 模態的不同敏感性。該等發現表明散播性轉移之成功療法 將必須克服贅生異質性及抗性演變之難題。 ' 經適當活化之巨噬細胞可滿足該等高要求標準。巨噬細 胞可藉由與含有免疫調節劑之磷脂小泡（脂質體）相互作用 來活化而成為殺腫瘤巨噬細胞。殺腫瘤巨噬細胞可在活體 外及活體内識別及破壞贅生性細胞，㈣贅生性細胞則： I50374.doc 201113372 文損害。儘管巨嗟細胞區分致瘤細胞與正常細胞之精確機 制不明，但其與腫瘤細胞特徵（諸如免疫原性、轉移潛力 及對細胞毒性藥物之敏感性)無關。此外，巨噬細胞破壞 腫瘤細胞表面上不與腫瘤細胞抗性之演變相關。 另外，經活化之巨噬細胞為針對細菌及病毒侵襲形成免 疫反應所不可或缺的。由於活化機制在三種反應（殺腫 瘤、殺菌、殺病毒）中為相同的，因此巨噬細胞之活化在 針對腫瘤、細菌及病毒攻擊之宿主免疫反應中具有應用。 維生素D結合蛋白（亦稱為1)]81>或Gc蛋白）為動物之間的 一種進化保守性醣蛋白（C〇〇ke及Haddad, Endocrine Rev. 10:294 1989)。動物DBP可與人類DBP產生血清學交叉反應 (Ogata等人，Comp. Bioch. Physiol. 90B:193，1988)。動物 DBP在一些物種中為遺傳多態性血漿蛋白質且具有約 52,000之相對分子量。其通常構成動物中約〇 5%之血漿蛋 白。血漿濃度一般為約260 pg/ml。稱為「群組特異性成分 (group specific component)」或「Gc蛋白」之人類DBP 的 多態性可藉由凝膠電泳分析證明，其顯示兩種主要表型：

Gel 及 Gc2(Hirschfeld等人，Nature 185:93 1，I960)。已報 導Gc 1及Gc2基因之整個核苦酸編碼序列及所預測之胺基 酸序列（Cooke等人 ’ J_ Clin. Invest. 76:2420，1985 ; Yang 等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7994，1985)。Gel 可 進一步分成Gclf及Gels亞型’其電泳遷移為兩條帶，即 「快」帶及「慢」帶（Svasti等人，Biochem. 18:1611， 1979)。 150374.doc 201113372 巨噬細胞之活化為宿主針對癌症及細菌與病毒病原體之 免疫防禦機制中之第一主要步驟，其特徵在於其隨之引起 吞噬細胞活性增強。巨噬細胞活化需要B淋巴細胞及τ淋巴 細胞功能，該等功能以逐步方式改變DBP/Gc蛋白，從而 產生GcMAF»圖1中之反應「a」顯示Gc蛋白如何與由b細 胞所表現之β-半乳糖苷酶反應形成中間Gc蛋白產物，其隨 後與由T細胞所表現之唾液酸酶反應形成GcMAF。 α-Ν-乙醯半乳糖胺酶（Nagalase)為可如圖1中之反應（b)所 示阻止Gc蛋白轉化為Gc-MAF的酶。（χ-Ν-乙醯半乳糖胺酶 與Gc蛋白反應產生脫糖基化之Gc蛋白產物，此可防止形 成GcMAF及隨後活化巨嗤細胞^ α-Ν-乙醯半乳糖胺酶係由 許多癌細胞及一些細菌及病毒病原體產生且為癌細胞及其 他病原體試圖避免宿主免疫系統所藉助之機制。血液中α_ Ν-乙醯半乳糖胺酶之量測法可用作一種診斷手段，諸如用 於在癌症診斷及治療期間診斷癌症及監測腫瘤負荷。

GcMAF應不同於Τ細胞淋巴介質巨噬細胞活化因子（亦稱 為Ύ-干擾素）’後者係由產生淋巴介質之T細胞以少量產生 或藉由遺傳工程改造以醫藥級級別獲得。

Yamamoto US 5，177,001、5，177,002、5,326,749 及 6,410,269揭示由Gc蛋白及Gc蛋白之較小結構域製備 GcMAF之方法，從而產生CdMAF。隨後將由Yamam〇t〇製 造之MAF產物注入患者體内以治療癌症及其他病原性疾 病。本發明提供一種藉由活體内或離體治療來活化患者自 身巨噬細胞之新穎治療，其中使該等巨噬細胞與MAF接觸 150374.doc 201113372 或使Gc蛋白與產生GcmaF之酶接觸。使患者血液之富含 白血球的部分與固定於去除裝置（aphoretic device)或微流 體裝置内諸如聚合物珠粒或膜之惰性支撐物/介質上的 MAF及/或酶接觸。另外，α_Ν_乙醯半乳糖胺酶可藉由將& Ν-乙酸半乳糖胺酶配位體固定於固體支撐物及使血液與經 固定之α-Ν-乙醯半乳糖胺酶配位體接觸而自患者血液中移 除。 【發明内容】 根據本發明製備及使用之GcMAF係在活體内及/或離體 地以治療性方式及由哺乳動物血液血漿中循環之DBP/Gc 蛋白產生。另外，α-Ν-乙醯半乳糖胺酶可根據本發明自患 者血液中移除，由此減少α_Ν•乙醯半乳糖胺酶對於體内產 生GcMAF之抑制作用。 在本文中’吾等詳述藉助於以不同策略處理全血及血漿 之裝置活化巨噬細胞的活體内及離體方法，該等策略均基 於一般熟習此項技術者所熟知之標準去除及/或微流體原 理。就此而言，本發明包括一種體外方法，其中在體外處 理患者血液及/或血漿且使其返回至患者血管系統中。或 者，可將微流體裝置植入身體中來處理巨噬細胞及/或血 漿。 策略#1 :進行標準白血球去除術（leukapheresis):自哺 乳動物移取至少5 0 0 c c富含白血球之企槳。隨後使該富含 白血球之血漿通過含有經固定之GcMAI^^a_N_乙醯半乳糖 月女鉍結合配位體或兩者之表面。作為與經固定之GcMAF直 150374.doc 201113372 接接觸的副作用’巨嗤細胞可能活化。α_Ν_乙醯半乳糖胺 辦對於巨嗟細胞活化之任何長期抑制作用可藉由用α ν乙 醯半乳糖胺酶結合配位體自血漿移除心沐乙醯半乳糖胺酶 來減輕。隨後將經如此處理的富含白血球之血漿再輸回至 哺乳動物體内以治療細菌感染、病毒感染（諸如c型肝炎） 或惡性腫瘤。 策略#2 :使哺乳動物血液流經含有（&)與α·Ν_乙醯半乳糖 胺酶結合配位體結合之珠粒、（1^與卩_半乳糖苷酶結合之珠 粒、（c)與唾液酸酶或α_甘露糖苷酶（a_mannidase)結合之珠 粒、或（a)、（b)及（c)之組合之流化床的去除過濾器。免疫 抑制α-Ν-乙醯半乳糖胺酶將被結合於過濾器中，從而減低 其全身效應，同時與β-半乳糖苷酶及唾液酸酶結合之珠粒 將使哺乳動物自身之Gc蛋白轉化為GcMAF以用於活化巨 噬細胞。隨後將經如此處理之血液再輸回至哺乳動物（患 者）體内以治療細菌感染、病毒感染（諸如c型肝炎）或惡性 腫瘤。 策略#3 : —般將表面具有經固定之GcMAF的微流體裝置 呈遞給白血球，且由此活化巨噬細胞。或者，血聚通過具 有經固定之β-半乳糖苷酶及經固定之唾液酸酶的表面而使 患者自身的血漿Gc蛋白轉化為GcMAF。另外，相同表面 亦可呈遞α-Ν-乙醯半乳糖胺酶結合配位體以降低其全身抑 制劑的作用。 【實施方式】 吾等將關於在活體外由哺乳動物之Gc蛋白形成GcMaf 150374.doc 201113372 的Yamamoto, N.之美國專利5，177,〇〇1及5，177,〇〇2以引用的 方式併入本文中。本發明之不同點在於使白血球直接活體 内或離體地但即時地暴露於GcMAF，或由循環Gc蛋白直 接活體内或離體地但即時地產生内源性GcMAF。 貫穿本說明書提及「一個實施例」、「一實施例」或類似 用語意謂與該實施例相關所描述之特定特徵、結構或特性 均包括於本發明之至少一個實施例中。因此，貫穿本說明 書出現之短語「在一個實施例中」、「在一實施例中」及類 似用語可（但並非必定）均指同一實施例。 在實施本發明時，對患者進行活體内或離體治療，其中 使該患者之巨噬細胞活化且視情況降低α_Ν_乙醯半乳糖胺 酶之抑制作用。患者之巨噬細胞可藉由以下步驟來活化： (a)使患者血液之富含巨噬細胞的部分與固定於惰性介質或 固體支撐物之GcMAF接觸，藉以使GCMAF與巨噬細胞反 應，從而活化巨噬細胞；及（b)使富含&蛋白之患者血漿 與可使Gc蛋白轉化為GcMAF2酶接觸，當經過處理之血 漿再輸回至患者血管系統中時，GcMAF可隨後活化巨噬細, 胞。亦可使用固定於惰性介質之α_Ν乙醯半乳糖胺酶配位 體來降低ct-N-乙醯半乳糖胺酶對免疫系統所具有之抑制作 用，特定而言減少Gc蛋白之脫糖基化。 如本文所用之微流體裝置係指在具有經固定之結合或催 化劑之生物相谷表面上進行細胞揀選或提供血漿之層流裴 置。微流體裝置可與小泵一起位於體外，或在無泵下植入 體内，利用壓降來進行驅動。微流體裝置為吾人所熟知且 150374.doc 201113372 可購自 Micronics，Inc., Seattle, WA, USA。類似地，白血 球去除術及血衆去除術（P】asmaph〇reSiS)系統為一般熟習此 項技術者所熟知且可購自多個來源。 在本發明之一個實施例中，以白血球去除法活化巨噬細 胞’其中分離出血液之白血球部分（富含巨噬細胞）且使其 與固定在生物相容表面上之MAF接觸。使白血球部分中之 活化巨嗤細胞返回到患者體内，其中該等巨噬細胞可執行 其控制癌症、病毒病原體及細菌病原體之免疫功能。亦可 採用血管内之微流體揀選構造進行巨嗟細胞活化，使得巨 噬細胞及單核細胞以數毫升/分鐘之速率通過固定有Maf 之表面，其可在不超過7日之時段内使所有已知巨噬細胞 前驅體100%暴露於MAF ^該等巨噬細胞可執行其控制癌 症、病毒病原體及細菌病原體之免疫功能。 在另一實施例中，由患者血液進行血漿去除術，使血漿 與經固定之α-N-乙醯半乳糖胺酶配位體接觸，而自血榮中 移除α-Ν-乙醯半乳糖胺酶，其中α_Ν_乙醯半乳糖胺酶結合 於該配位體且被捕獲於電泳設備中。使經過處理之血漿在 除去已結合之α-Ν-乙醯半乳糖胺酶後再返回到患者體内， 此可降低α - Ν -乙醯半乳糖胺酶通常在血液中循環時所展現 之免疫抑制作用。使用微流體裝置進行類似方法，其中使 血毁與固定於該微流體裝置内之α-Ν_乙醯半乳糖胺酶配位 體接觸^ 在另一貫施例中’ GcMAF係藉由去除法或血漿去除法產 生’其中自全血分離出血槳且在固定於生物相容固體支撐 150374,doc -10- 201113372 物（諸如珠粒或膜）上之β_半乳糖苷酶及唾液酸酶上通過或 與其接觸。β-半乳糖苷酶及唾液酸酶使GC蛋白轉化為 GcMAF。參見圖1。隨後將血躁中產生之所得GcMaf再輸 回至患者體内，其中該GcMAF可活化循環之巨噬細胞。在 一較佳貫施例中，亦使血漿與α_Ν-乙酿半乳糖胺酶配位體 接觸’以降低α-Ν-乙醯半乳糖胺酶濃度。當輸回至患者血 管系統中時，該降低之α-N-乙醯半乳糖胺酶濃度允許 GcMAF在活化巨噬細胞時能較好地相互作用。 圖1為展示藉由微流體裝置對哺乳動物血液所作的各種 處理之流程圖。患者血液流入微流體裝置中，其中分離器 10使血漿與血細胞（RBC、WBC、血小板）分離。出於診斷 目的11，藉由量測可指示疾病有無之電解質lla、細胞因 子lib、細胞因子受體llc、癌症特異性生物標記物11(1、 神經結醣脂lie、α·Ν-乙醯半乳糖胺酶nf、Gc蛋白llg、 總流量llh或其他所需化合物之存在/不存在來分析一部分 血水。卩边後使其餘血聚或在不進行診斷測試之情況下的全 部企漿與經固定之配位體接觸以自血漿12、13中移除特異 性乾•向之化合物’例如用α·Ν-乙醯半乳糖胺酶配位體j2a 來移除α-Ν-乙醯半乳糖胺酶及用可溶抑制劑配位體13a來 移除免疫系統之特異性可溶抑制劑。免疫系統之可溶性抑 制劑13b的清單包括神經結醣脂；所有已知生長因子，最 值得注意的是TNF-α、TGF-β及變異體、PDGF、EGF、IGF 及變異體、FGF及變異體、及VEGF ;所有已知發炎性細 胞因子受體，最值得注意的是TNF-a家族-TNF-R1、TNF- 150374.doc 201113372 R2、CD40L、NGFR、TRAIL及變異體、FASL、IL-1R1、 IL1R2、IL-2R、IL-3R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、GM-CSFR、IL-9R、IL-12R及紅血球生成素受體。亦可使血漿 與經固定之酶14接觸以在血毁中產生新的化合物，諸如使 Gc蛋白轉化為Gc-巨噬細胞活化因子（GcMAF)所需的酶（β-半乳糖苷酶、唾液酸酶、α-甘露糖苷酶）14a。視情況可將 前驅體化合物（生物或重組前驅體化合物）添加至血漿中以 便增加所需化合物之產生。在產生GCMAF的情況下，將 Gc蛋白添加14b至血漿中，隨後使血漿與經固定之酶14接 觸。在用經固定之酶處理血漿來產生化合物或用經固定之 配位體處理血漿來移除化合物之後，可在血漿處理後診斷 測試15中分析一部分血漿以量測該血漿處理之有效性。此 後，將經處理之血漿在與1 〇中分離之血細胞組合或未組合 的情況下輸回至患者血管系統中。 亦可處理10中分離之紅血球（RBC)、白血球（WBC)及血 小板。在一個實施例中，使WBC與RBC及血小板分離17， 以形成具有高濃度之WBC的物流18。進一步分離巨噬細胞 19，藉由使巨噬細胞與巨噬細胞活化表面20(諸如經固定 之GcMAF)接觸來活化巨噬細胞或藉由使巨噬細胞與抗原 接觸來誘發疫苗21。可分離22經處理之巨噬細胞且投與患 者或再與患者血漿23及其他血細胞組合以返回到患者血管 系統2。或者，可將疫苗誘發之巨噬細胞23視情況保留於 儲集器24中，隨後再與富含T細胞、B細胞及粒細胞25之 WBC部分組合且此後使其返回到患者血管系統20中。 150374.doc -12- 201113372 在不偏離本發明之精神或本質特性的情況下可以其他特 疋形式來實施本發明。所述實施例在所有方面皆應理解為 僅為說明性而非限制性的。因此，本發明之範_係由隨附 申請專利範圍而非由前述描述内容所指示。屬於中請專利 範圍等政性之思義及範圍内的所有改變應包含於其範疇 内。 【圖式簡單說明】 圖1展示（a)藉由Gc蛋白彻丄r» A ^ 皮白與由Β細胞及Τ細胞產生之酶反應 來產生MAF的反應、（μ ϋ丄 \Τ . ^ ()藉由α-Ν-乙醯半乳糖胺酶使（^蛋 白脫糖基化之反應及疋，t ()Gc蛋白與經固定之酶的反應；及 圖2為展示藉由微流體驻 體裝置對哺乳動物血液所作的各種 處理之流程圖。 150374.doc 13

Claims (1)

1. 201113372 七、申請專利範圍：

   —®藉由使用體外系統活化巨噬細胞來誘發哺乳動物體 内之殺腫瘤、殺菌或殺病毒反應的方法，其包括使該哺 礼動物之也液的白血球部.分與（a)GcMAF或（b) —或多種 可自Gc蛋白前驅體產生内源性gcmaF之酶接觸。 一種藉由使用體外系統活化巨噬細胞來誘發哺乳動物體 内之殺腫瘤、殺菌或殺病毒反應的方法，其包括藉由將 與惰性介質結合之結合配位體併入該體外系統中，降低 該哺乳動物也漿中的α-Ν-乙醯半乳糖胺酶（Nagalase)含 量0 3.如凊求項1之方法，其中GcMAMi固定於惰性介質上， 且使巨噬細胞暴露於該經固定之GcMAF，藉以活化該等 巨嗟細胞。 士 '月求項1之方法’其中該一或多種酶為卜半乳糖苷酶、 垂液酸酶、α-甘露糖苷酶或其組合，且該等酶被固定於 惰性介質上。 5. 如請求項1之方法，其中該惰性介質可為中空纖維、大 孔珠粒、基於纖維素之纖維、合成纖維、基於二氧化矽 之顆粒、合成膜、塗有生理學中性物質之表面、聚不飽 和磷脂醯膽鹼或聚合物表面。 6. 如叫求項2之方法，其中適當的結合配位體為該目標在 自然界中特異性結合之結合搭配物之片段、單株抗體、 夕株抗體、設計者合成肽（designer synthetic peptide)、 重組產生之單株抗體或重組產生之多株抗體。 150374.doc 201113372 7. 一種藉由使用微流體系統活化巨噬細胞來誘發哺乳動物 體内之殺腫瘤、殺菌或殺病毒反應的方法，其包括在該 哺乳動物體内植入微流體裝置，此使其白血球部分與 GcMAF或一或多種可自Gc蛋白前驅體產生内源性 GcMAF之酶接觸。 8 · 種藉由使用微流體系統活化巨嗟細胞來誘發哺乳動物 體内之殺腫瘤、殺菌或殺病毒反應的方法，其包括在該 哺乳動物體内植入微流體系統，此藉由將與惰性介質結 合之結合配位體併入該微流體裝置中，來降低該哺乳動 物之血漿中的α_Ν•乙醯半乳糖胺酶含量。 9.如凊求項8之方法，其中適當的結合配位體為該目標在 自J界中特異性結合之結合搭配物之片段、單株抗體、 夕株杬體、设計者合成肽、重組產生之單株抗體或重組 產生之多株抗體。 10·如叫求項7之方法，其十GcMAF被固定於惰性介質上且 使巨嗟細胞暴露於該經固定之GcMAF。 11·如請求項7之方法，其中該一或多種酶為卜半乳糖普酶、 唾液酸酶、α-甘露糖㈣或其組合，且該等酶被固定於 惰性介質上。 々仴求項8至11申任一項之方法，其中該惰性介質可為 中工纖維、大孔珠粒、基於纖維素之纖維、合成纖維、 基於二氧化石夕之顆粒、合成膜、塗有生理學令性物質之 表面、聚不飽和磷脂醯膽鹼或聚合物表面。 13.如咐求項7之方法’其令該微流體裝置被植入哺乳動物 150374.doc 201113372 血管系統中。 14. 如吻求項7之方法，其中該微流體裝置被附接至可佩戴 之栗、可佩戴之血槳分雜势 _ 丄μ .. 庆刀離器、可佩戴之電源供應器且Μ 由榣準導管連接至血管 曰 订動且不被㈣至支持系統。 充刀 150374.doc