TW201106964A - A motilin-link peptide compound offering absorptivity via mucous administration - Google Patents

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Description

201106964 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種類似腸動素的胜肽化合物，對於特 徵爲機能性消化不良症、糖尿病性胃不全麻痺、胃食道逆 流症、過敏性腸症候群、小腸內細菌過剩增殖症、結腸僞 性堵塞症、麻痺性腸堵塞、慢性特發性僞性腸堵塞、及術 後性腸堵塞等消化道機能異常之症狀的治療爲有用，具消 化道運動刺激活性及經黏膜投予時具有高吸收性。 【先前技術】 腸動素係從腸部平滑肌單離之由22個胺基酸構成之 生理活性胜肽，其構造於1 9 73年首次由豬腸動素的單離而 爲人明瞭（非專利文獻1、2)。1 99 5年，人腸動素經單離、 鑑定~，解明與豬腸動素具有相同構造（非專利文獻3)。 腸動素之生理機能，已知相關於空腹期觀察到的空腹 期肛側傳播性強收縮帶（Interdigestive Migrating Complex, 以下簡稱IMC)。IMC，係將從消化道剝落的上皮或黏膜、 分泌液等消化道內容物推壓流到消化道下部，發揮消化道 內之掃除作用的一種生理機能。健康正常人，在空腹期從 十二指腸或空腸，以約1 〇 〇分鐘的間隔分泌腸動素，伴隨 著血漿中腸動素濃度之上升會發生IMC(非專利文獻4)、若 對於犬、猴或人投予腸動素則會誘發IMC (非專利文獻5、 6、7 )、藉由投予抗腸動素血清而會抑制生理性IM C發生 等，由此，據認爲腸動素分泌會誘發IM C，將消化道內殘 渣除去，藉此，維持食物之消化或消化液分泌等消化道機 201106964 能爲正常（非專利文獻8)。 關於IMC之異常與疾病之相關性，有如下報告：若IMC 降低，則消化道內殘渣堆積在腸管內，造成腸內細菌之異 常增殖，結果由於腸內細菌產生的內毒素而誘發氣體過量 產生、腹脹 '下痢、腹痛等消化器症狀（非專利文獻9)。尤 其，有如下報告：機能性消化不良症、術後性腸堵塞或慢性 特發性僞性腸堵塞等於伴隨消化道機能異常之疾病，IMC 之發生降低或未發生（非專利文獻13)，或於活體內之內因 性腸動素之分泌量降低或腸動素作用之降低與消化道運動 機能之異常、降低相關（非專利文獻1 4)。過敏性腸症候群， 係爲即便不存在發炎或腫瘤等基礎的疾病，會有以大腸爲 中心之下部消化道機能異常造成腹痛、腹脹感等慢性腹部 不快感、便秘、下痢等通便異狀的慢性腸障礙。過敏性腸 症候群發病的患者當中，據報告：至少有一部分腸內細菌叢 會變化，引起菌種變化或異常增殖等（非專利文獻9)，據認 爲，IMC之發生降低造成消化道內殘渣在腸管內堆積係腸 內細菌叢變化等原因之一。 對應於此等伴隨消化道機能異常的疾病，現在的第一 選擇藥物，爲多巴胺受體拮抗藥、選擇性的血清素5 — HT4 作動藥、副交感神經刺激藥等消化道運動機能改善內服 藥。但是，利用此等治療藥進行之治療，雖有呈現症狀暫 時改善的症例，但是也有很多未認爲有治療效果，現狀爲， 醫師及患者對於現在的消化道運動機能改善內服藥的滿足 度低。因此，殷切希望提供基於新的作用機轉的治療藥， 201106964 期待藉由對於伴隨消化道機能異常之患者從外部投予腸動 素受體作動藥，使消化道機能正常化，連結於症狀緩和或 疾病治癒。 至今爲止，從據報告紅黴素及其相關化合物作爲腸動 素作動藥具有活性以來，已有人以伴隨消化道機能異常之 患者作爲對象進行低分子腸動素作動藥之臨床試驗（非專 利文獻19、20)、以經口劑形式供臨床試驗者也存在多數（非 專利文獻21、22)。但是，此等的多數，會表現與作爲腸動 素作動藥之作用無關的副作用（H ERG抑制或精子形成缺 陷、致癌性）、或由於反復投予導致藥效減弱等理由，因此 作爲醫藥品之開發受中斷，現在並沒有以消化道機能改善 藥上市者。 有人對胜肽性化合物，以伴隨消化道機能異常之患者 作爲對象’實施使用天然型腸動素、或胜狀性腸動素作動 藥之臨床試驗（非專利文獻15、16)。但是，關於此等胜肽 化合物的臨床試驗及動物實驗，現狀爲投予路徑僅有靜脈 內投予之報告’難以對於患者長期間反復投予，還沒確認 治療效果。 例如類似腸動素的胜肽化合物，Baxter公司已開發 Atilmotin(專利文獻1)、三和化學已開發SK- 896(專利文獻 2)。前者係以提高活體內半衰期爲目的所創製的化合物， 利用據認爲是腸動素之主要代謝臟器的腎臟（非專利文獻 1 7)的均質物上清’以代謝實驗已確認代謝安定性提高（專 利文獻1)、血漿中半衰期爲約10分鐘，爲腸動素的約3 201106964 倍長（非專利文獻1 8)。後者係以製造有效率化爲目的而設 計的化合物。又，兩者均維持腸動素同等消化道運動亢進 活性。但是，任一化合物’均與腸動素同樣’投予路徑限 於靜脈內投予，有治療限於在醫療設施內，無法長期間使 用的問題。因此，並非爲基於腸動素原本具有的利用將消 化道內殘渣除去維持消化道機能爲正常的作用的藥物，現 狀爲無法確認其治療效果。 又，有人開發將就腸動素的第1 3位胺基酸，即甲硫胺 酸，爲了提高製造效率而取代爲白胺酸的胜肽（專利文獻 3)。但是，生物學上之活性與腸動素爲同等，投予路徑限 定於靜脈內投予，因此未解決無法長期間使用的問題。 由以上，爲了開發基於腸動素原本的作用的新穎治療 藥，希望將胜肽性腸動素作動藥以能使用長期間投予之非 侵襲性投予路徑的醫藥品的形式提供。 [先前技術文獻] [非專利文獻] [非專利文獻 l]Brown J et al.，Can J Biochem，51， 533(1973) [非專利文獻 2]Schubert H et al.，Can J Biochem, 52, 7(1974) [非專利文獻 3]De Clercq et al·，Regul Pept, 55，79(1995) [非專利文獻4 ]伊藤、日消誌9 3，5 1 7 ( 1 9 9 6) [非專利文獻 5]Nakaya M et al·，Peptides, 4，439(1983) [非專利文獻 6]Y〇g〇 K et al.，Dig Dis Sci, 52, 3112(2007) 201106964 [非專利文獻 7]Haans J et al·，Neurogastroenterol Motil, 18， 637(2006) [非專利文獻8]草野等、MB Gastro，1，47 ( 1 99 1 ) [非專利文獻 9]Pimentel M et al·，Dig Dis Sci, 47, 2639 (2002) [非專利文獻 1 0 ] Pardo A et al·, Hepatology 3 1，858 (2000) [非專利文獻 ll]Castiglione F et al.，Aliment Pharmacol Ther. 1 8,1 1 0 7 (2003 ) [非專利文獻 12]Henry C. Lin，JAMA. 292，852 (2004) [非專利文獻 13]Labo G et al.，Gastroenterology, 90，20 (1986) [非專利文獻 14]Kusano M et al.，Am J Gastroenterol ,92, 481(1997) [非專利文獻 15] Kamerling I et al·，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 284, G776(2003) [非專利文獻 16]Park M-I et al.，Neurogastroenterol Motil, 1 8, 28 (2006) [非專利文獻 17]Jenssen TG et al., Scand J Gastroenterol, 19, 717(1984) [非專利文獻 18]Peeters TL et al., Neurogastroenterol Motil, 1 8, 1 (2006) [非專利文獻 19]Janssens J et al., N Engl J Med, 322, 1028(1990) [非專利文獻 20]Stacher G et al·，Gut, 34，1 6 6 ( 1 993 ) [非專利文獻 21]Choi MG et al.，J Pharmacol Exp Ther， 201106964 285, 37(1998) [非專利文獻 22]Netzer P et al.，Aliment Pharmac 16, 1481 (2002) [專利文獻] [專利文獻1 ]日本特開平7 - 7 0 1 7 8 [專利文獻2]日本特公平7-42319 [專利文獻3 ]日本特開昭5 2 - 4 6 0 6 8 【發明内容】 [發明欲解決之課題] [發明欲解決之課題] 本發明之目的在於，提供維持天然型腸動素之 運動刺激活性，且於經黏膜投予賦予高吸收性之類 素的胜肽化合物。 [解決課題之方法] 本案發明人等，爲了解決如此的課題，首先推 侵襲性經黏膜投予時腸動素是否受到分解，使用肺 上清進行腸動素之分解實驗。其結果，了解到腸動 分解，並藉由鑑定其分解物，假定就腸動素之分解 言，C末端由於二羧基肽酶而分解。 基於此等結果，本案發明人等，藉由將2 1位之 取代爲脯胺酸，而抑制C末端受二羧基肽酶分解， 於經黏膜投予時呈高吸收性之類似腸動素的胜肽化 乃完成本發明。又，由於明白N末端之苯丙胺酸受 因此，顯示N末端之第1位胺基酸與第2位胺基酸 〇 1 Th er, 消化道 似腸動 測在非 均質物 素受到 路徑而 甘胺酸 可得到 合物， 分解， 之間的 201106964 醯胺鍵改爲後述非胜肽鍵結-P S i [ C Η 2 Ν Η ]-鍵結，貢獻於代 謝安定性更加提高。 (i) 了解到本發明具體而言，藉由製作以2 1位之胺基酸 取代爲脯胺酸爲特徵之含有以下式（1 ): XI Val X2 lie Phe Thr Tyr Gly X3 Leu Gin Arg X4 Gin Glu Lys Glu Arg X5 Lys Pro Gin (式 1) ( S E Q ID N 〇 : 2 ) [式中，各胺基酸間之鍵結除了 XI-Val間之鍵結以外全部 爲醯胺鍵； XI爲芳香族胺基酸或雜芳香族胺基酸： XI-Val間之鍵結爲醯胺鍵或以下式2 Η Η I (式 2) NI末端側-(|-N- C末端側 Η 表示之鍵結； Χ2爲脯胺酸或肌胺酸； Χ3爲麩胺酸或天冬氨酸； Χ4爲甲硫胺酸或白胺酸； Χ5爲天冬醯胺或脯胺酸] 表示之序列之化合物、或其藥學上可容許之鹽，且具有與 天然型腸動素同等之消化道運動刺激活性及於經黏膜投予 之高吸收性的胜肽化合物，能解決上述課題。 又，本發明也包含以下發明。 (Π)如（0之化合物或其藥學上可容許之鹽，其中，（式 ^ 之XI爲苯丙胺酸（Phe)、酪胺酸（Tyr) '及色胺酸（Trp^ 201106964 月女基酸’此外’爲β-局苯甘胺酸（Phg(C#CH2))、乙醯基萘 基丙胺酸（Ac-Nal)。 (iii) 如（Π)之化合物或其藥學上可容許之鹽，其中（式υ 之XI爲苯丙胺酸或β -高苯甘胺酸。 (iv) —種以選自由SEQ ID NO: 3〜15構成之群組之序列 表示之化合物或其藥學上可容許之鹽。 (v) —種以SEQIDNO:4表示之化合物或其藥學上可容許 之鹽。 (vi) —種以SEQ ID NO: 6表示之化合物或其藥學上可容 許之鹽。 (νϋ) 一種以SEQ ID NO: 8表示之化合物或其藥學上可容 許之鹽。 (viii) 一種醫藥組成物，用於治療伴隨消化道機能異常之 疾病，包含（i)〜（vii)中任一項之胜肽化合物或其藥學上可 容許之鹽。 (ix) 如（viii)之醫藥組成物，其中伴隨消化道機能異常之疾 病，係伴隨消化道運動活性之基礎水平降低者。 (X)如（viii)之醫藥組成物，其中伴隨消化道機能異常之疾 病，係機能性消化不良症、糖尿病性胃不全麻痺、胃食道 逆流症、過敏性腸症候群、小腸內細菌過剩增殖症、結腸 僞性堵塞症、麻痺性腸堵塞、慢性特發性僞性腸堵塞或術 後性腸堵塞。 (xi)如（viii)〜（X)中任一項之醫藥組成物，其中醫藥組成 物爲經黏膜投予用。 -10 201106964 (X i i)如（X i)之醫藥組成物’其中經黏膜投予爲經肺投予或 經鼻投予。 (xiii)如（xii)之醫藥組成物，其中經黏膜投予係經鼻投予。 (X i v)—種以機能性消化不良症 '糖尿病性胃不全麻痺、 胃食道逆流症、過敏性腸症候群、小腸內細菌過剩增殖症、 結腸僞性堵塞症、麻痒性腸堵塞、慢性特發性僞性腸堵塞、 及術後性腸堵塞等消化道運動活性之基礎水平降低爲特徵 之症狀之治療方法，包含對於個體投予（v i i i)記載之醫藥組 成物。 [發明之效果] 本發明之新穎之類似腸動素的胜肽化合物，具有類似 腸動素之消化道運動刺激活性，且於經黏膜投予呈高吸收 效率。因此，本發明之化合物可使用在治療伴隨消化道機 能異常之疾病（例如，以消化道機能運動活性之基礎水平降 低爲特徵之症狀）。伴隨消化道機能異常之疾病，例如：機 能性消化不良症、糖尿病性胃不全麻痺、胃食道逆流症、 過敏性腸症候群、小腸內細菌過剩增殖症、結腸僞性堵塞 症、麻痺性腸堵塞、慢性特發性僞性腸堵塞、及術後性腸 堵塞等症狀。又，於經黏膜投予的吸收效率比起天然型腸 動素較高，治療患者時能以較低投予量達成有效的血漿中 濃度。 【實施方式】 [實施發明之形態] 天然型腸動素，已知N末端部分爲表現活性所必要， -11 - 201106964 且天然型腸動素從6位蘇胺酸附近到C末端側在溶液中形 成 α 螺旋構造[Andersson A. & Maier L.,J· Biomol. NMR, 24, 1 03 - 1 1 2(2 002)]，但於活性中心外於α螺旋構造導入變異的 衍生物，受體活化能力降低[Miller P et al.，Peptides, 16, 11-18 (1995)]。基於此等文獻得到的見解，本案發明人等 推測α螺旋構造貢獻於N末端之活性中心之安定化。亦即’ 認爲由於存在α螺旋構造，使Ν末端之活性中心構造受保 因此，當進行如遮斷腸動素之分解路徑的構造改變 時，選擇對於伴隨α螺旋構造之不安定化之活性降低無影 響之部位。 腸動素之Ν末端1位之胺基酸（稱爲XI)，由於爲受體 活化所必要，希望防止其分解。爲了賦予對於分解酵素之 耐性，據認爲延長從Ν末端胺基至X 1 -Val間之胜肽鍵結之 距離，或將X 1 -Val間之胜肽鍵結取代爲非醯胺鍵，對於分 解耐性之獲得爲有用。 又，X2於天然型腸動素爲脯胺酸，限制了化合物之立 體構造，因此，據認爲藉由提高自由度能控制受體活化能 力。X3於天然型腸動素爲麩胺酸，與6位蘇胺酸在側鏈間 形成氫鍵，據認爲貢獻於形成從6位至c末端側的α螺旋 構造[Andersson A. & Maier L.，J. Biomol. NMR, 24， 103-112(2002)]。X3取代爲丙胺酸或D型麩胺酸時，已知 受體活化能力會大幅降低[Miller P. et al., Peptides, 16, 1 1 - 1 8 ( 1 995) ； Peeters T.L., et al., Peptides, 13, 1103-1107 -12- 201106964 〇992)]’因此，χ3希望從L型酸性胺基酸中選擇。關於 χ4 ’於天然型腸動素爲甲硫胺酸，由於側鏈氧化，受體活 化能力會降低。因此’希望取代爲與甲硫胺酸在側鏈之大 小大致同等的白胺酸。 腸動素從C末端側由於二羧基肽酶受分解。據認爲， 天然型腸動素之C末端側之胺基酸取代爲脯胺酸，會固定 胜肽鍵結之二面角，且由於配位於二羧基肽酶之基質結合 部位或活性中心時之立體構造障礙而獲得分解耐性。 另一方面，由於腸動素之α螺旋構造對於受體活化能 力爲重要’據認爲取代爲形成α螺旋構造爲困難之脯胺酸 的取代部位有所限定。由以上觀點，料想Χ5及、或2 1位 之脯胺酸取代。 由如此的觀點，本案發明人等設計、合成衍生物，使 用肺均質物上清進行分解實驗、及使用摘出腸管進行收縮 實驗。且，天然型腸動素之2 1位之甘胺酸取代爲脯胺酸的 一系列本發明之類似腸動素的胜肽化合物，利用體內經黏 膜投予實驗，確認比起天然型腸動素呈現更高吸收性，且 維持與天然型腸動素同樣之IMC誘發活性，乃完成本發明》 本發明之胜肽化合物，係特徵爲2 1位之胺基酸爲脯胺 酸取代之以含有下列通式（1): XI Val X2 lie Phe Thr Tyr Gly X3 Leu Gin Arg X4 Gin Glu Lys Glu Arg X5 Lys Pro Gin (式 1 ) ( S E Q ID N O : 2) [式中，各胺基酸間之鍵結除了 x卜Val間之鍵結以外’全 部爲醯胺鍵； -13- 201106964 XI-Val間之鍵結爲醯胺鍵或以下式2 Η Η I (式 2) N末翻-Cj-N- C末職丨丨 Η 表示之鍵結； XI爲芳香族胺基酸或雜芳香族胺基酸； Χ2爲脯胺酸或肌胺酸； Χ3爲麩胺酸或天冬氨酸； X 4爲甲硫胺酸或白胺酸； X 5爲天冬醯胺或脯胺酸] 表示之序列之化合物、或其藥學上可容許之鹽，兼有以下 特徵：與天然型腸動素具有同樣的消化道運動刺激活性及 於經黏膜投予呈高吸收性。 上述式1中，XI爲芳香族胺基酸或雜芳香族胺基酸。 此等芳香族胺基酸或雜芳香族胺基酸，係指內部含有芳香 環之胺基酸的任一者，例如：苯丙胺酸（Phe)、酪胺酸（Tyr)、 及色胺酸（Trp)等α-胺基酸，此外，包含β_高苯甘胺酸 (Phg(C#CH2))、乙醯基萘基丙胺酸（Ac-Nal)等。本發明中， 苯丙胺酸、β-高苯甘胺酸（Phg(C#CH2)) '乙醯基萘基丙胺 酸（Ac-Nal)，爲較佳之XI位胺基酸之例。 上述式1中，XI可使用L型胺基酸也可使用d型胺基 酸。習知技術中至今爲止已製作出關於腸動素之第1位胺 基酸’將L型胺基酸取代爲D型胺基酸之變異體（Miller p. et al.，Peptides，1 6, 1 1 - 1 8 ( 1 99 5 ))，且顯示其活性可維持。 -14- 201106964 上述式1中’X2爲脯胺酸（Pro)或肌胺酸（也稱爲gar、 N-甲基甘胺酸' MeGly) ; X3爲麩胺酸（Glu)或天冬氨酸 (Asp); X4爲甲硫胺酸（Met)或白胺酸（Leu);且，X5爲天 冬醯胺（Asn)或脯胺酸（Pro)。此等以XI〜χ5表示的胺基 酸，可使用任何的組合。 上述式1之胜肽化合物中，第1位胺基酸（XI)與第2 位胺基酸（Val)之間的鍵結，爲醯胺鍵或以下式2 Η Η I (式 2) N末麵-j-N- C末麵 Η 之鍵結。式2之鍵結也稱爲 -psi[CH2NH] -鍵結之鍵結。Xl-Val間之鍵結，不論構成.XI 之胺基酸種類，可爲醯胺鍵或-psi[CH2NH]-鍵鍵結任一鍵 結。 本發明之上述式1之化合物，包含例如以下序列表示 之化合物、或其醫藥上可容許之鹽：
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met
Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 3)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu
Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 4)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Leu
Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 5)；
Phg(C#CH2) Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 6)； -15- 201106964
Phg(C#CH2) Val Sar lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 7)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met
Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 8)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu
Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 9)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met
Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 10)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu
Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 11)；
Phg(C#CH2) Val Sar lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg
Met Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 12)；
Ac-Nal Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg
Met Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 13)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Leu
Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 14)；
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Met
Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 15)。 本發明之化合物可依照常法得到。例如，可藉由化學 合成 '僅爲L型天然胺基酸所構成之胜肽時，可利用重組 DNA技術' 或此等組合以製造。 胜肽之化學合成法，已確立各種方法，本發明之化合 物也可利用公知之方法輕易製造。例如，可使用古典的胜 K合成法或固相法。具體而言，將附有保護基的胺基酸以 -16- 201106964 液相法及/或固相法縮合，使胜肽鏈延長，視需要將N末端 保護基以脈畊等鹼切斷後，以酸將所有保護基、樹脂除去， 並將得到之粗生成物使用凝膠過濾、超過濾、透析、 SDS-PAGE、各種層析等分離精製方法精製，也可得到本發 明之胜肽。例如，可依照「生化學實驗講座1蛋白質之化 學」第4卷第2章、第3章（東京化學同人）、或「續醫藥 品之開發1 4 胜肽合成」（廣川書店）等成書記載的方法製 造。 本發明之化合物當中，具有關於胺基酸間之鍵結爲以 (式2)表示之-psi[CH2NH]-鍵結的化合物，也可利用化學合 成得到。例如合成（式 1)中，Xl-Val間之鍵結爲 -psi[CH2NH]-鍵結之化合物時’從C末端至2位胺基酸（式 1中爲Val)，以上述方法使胜肽鏈伸長後，將2位胺基酸 之α胺基之保護基以化學性切斷後，將Boc或Fmoc-胺基 酸醛利用氰基三氫硼酸鈉/1 %乙酸之還原烷基化反應導 入，並與上述同樣以酸進行脫樹脂、保護，得到粗生成物， 並使用凝膠過濾、超過濾、透析、SDS-PAGE、各種層析等 分離精製方法精製，藉此可得到目的之胜肽類似物。 僅由L型天然胺基酸構成之胜肽，可利用重組DNA技 術製造。具體而言，培養經過具有編碼爲本發明之胜肽序 列之DN A的表現載體轉形的寄主細胞，由該培養物可採取 目的之胜肽。 插入基因的載體，例如大腸菌之載體（PBR3 22、 PUC18、pUC19 等）、枯草菌之載體（pUBUO、pTP5、pC194 -17- 201106964 等）、酵母之載體（YEp型、YRp型、Yip型）、或動物細胞 之載體（反轉錄病毒、牛痘病毒等）等，即使爲其他者，只 要能在寄主細胞內安定地保持目的基因都可即便爲使用。 將該載體導入適當的寄主細胞。就將目的基因插入質體之 方法或導入寄主細胞之方法，例如可利用 Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989)記載之方法。 上述質體中，爲了表現目的之胜肽基因，係將啓動子 連接在該基因之上游使能作用。本發明中，可使用的啓動 子，只要是能對應於目的基因表現使用之寄主細胞的適當 啓動子即可。例如，轉形之寄主細胞爲大腸桿菌 (Escherichia)屬時，可使用lac啓動子' trp啓動子、lpp 啓動子、XPL啓動子、recA啓動子等；芽孢桿菌（Bacillus) 屬時，可使用SP01啓動子、SP02啓動子、penP啓動子等； 酵母時，可使用GAP啓動子、PH05啓動子、ADH啓動子 等；動物細胞時，可使用SV40啓動子、CMV啓動子、反 轉錄病毒來源的啓動子等。 使用含有如上述方式得到之目的基因的載體將寄主細 胞轉形時’寄主細胞可使用細菌（例如，大腸桿菌 (Escherichia)屬、芽孢桿菌（Bacillus)屬等）、酵母（糖化酵 母（Saccharomyces)屬、畢赤酵母（pichia)屬 '念珠菌酵母 (Candida)屬等）、動物細胞（CHO細胞、COS細胞等）等。培 養時之培養基’以液體培養基爲適當，該培養基中尤佳爲 含有培養之轉形細胞生長需要的碳源、氮源等。視所望， 也可添加維生素類 '成長促進因子' 血清等。在此，從含 -18- 201106964 有本發明之胜肽衍生物之培養液精製本發明之化合物時， 可使用與利用化學合成取得胜肽化合物時爲同樣的分離精 製方法。 本發明之化合物，可使用於治療伴隨消化道機能異常 之疾病（例如，特徵爲消化道運動活性之基礎水平降低的症 狀）。所謂消化道機能異常，係無關儘管於內視鏡或血液檢 査等不認爲有發炎或潰瘍等明顯的器質異常，係爲表示消 化道之不快症狀的狀態，依照國際診斷基準R Ο Μ E111基準 (Gastroenterology 130 : 1377-1556，2006)總稱爲機能性消 化道障礙之疾病群，依其症狀而細微分類、定義。伴隨消 化道機能異常之疾病，例如：機能性消化不良症、糖尿病性 胃不全麻痺、胃食道逆流症、過敏性腸症候群、小腸內細 菌過剩增殖症、結腸僞性堵塞症、麻痺性腸堵塞、慢性特 發性僞性腸堵塞、及術後性腸堵塞等症狀。 又，消化道機能異常除了腹痛、噁心、嘔吐、下痢、 便秘、胸熱、腹脹感、食慾不振等自覺症狀以外，可利用 消化道內壓測定、胃液檢査、胃內pH監控、胃排出能力檢 査、消化道X線檢査、內視鏡檢査等進行診斷。 本發明之化合物或其藥學上可容許之鹽，可於對於賦 予目的消化道運動刺激活性爲充分之量中，直接使用或與 熟知之藥學上可容許之擔體、賦形劑、增量劑等混合而對 於包含人在內的動物使用。 本發明中，藥學上可容許之鹽，例如與無機鹼之鹽、 與有機鹼之鹽、與無機酸之鹽、與有機酸之鹽、與鹼性或 -19- 201106964 酸性胺基酸之鹽等，但只要是一般可使用之鹽即可，不限 於上述者。 本發明之胜肽化合物，也可使用皮下注射、肌肉內注 射、靜脈注射等注射的投予路徑。又，本發明之胜肽化合 物，由於在經黏膜投予可賦予高吸收量，故投予路徑，可 使用經黏膜之投予路徑，亦即經口、經鼻、經肺、經口腔 黏膜、經陰道、點眼等非注射之路徑。希望爲經口、經鼻 及經肺投予，最希望爲經肺及經鼻投予。 上述疾病之治療使用本化合物時，投予量視患者之狀 態、目的之治療效果之程度、投予路徑、投予次數等而異， 對於人之投予量’可從 0.0 1 pg/kg之低用量起變化。較佳 之投予量，爲0.01〜50(^g/kg，更佳爲0.05〜lOOpg/kg。 其量希望爲1日投予1〜3次。 本發明之胜肽化合物或其在藥學上可容許之鹽，可與 藥學上可容許之擔體組合使用。藥學上可容許之擔體，可 使用就製劑素材而言慣用之各種有機或無機擔體物質，固 體製劑中可配合賦形劑 '潤滑劑、黏結劑、崩散劑；液狀 製劑中可配合溶劑、溶解輔助劑、懸浮化劑、等張化劑、 緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑等。賦形劑之代表例有乳糖， 潤滑劑之代表例有滑石、膠體矽土。溶劑之代表例，有注 射用水、丙二醇、麻油、玉米油，懸浮化劑有硬脂基三乙 醇胺、月桂基硫酸鈉、月桂基胺基丙酸、卵磷脂、單硬脂 酸甘油等界面活性劑’但只要是一般可用之製劑素材，此 等以外也可使用。 -20- 201106964 [實施例] 以下利用實施例、比較例等具體説明本發明，但本發 明不限於此等實施例。 本實施例中，主要簡寫的含意如下。
Phg(C#CH2): L-β-高苯甘胺酸 Ac-Nal :乙醯基萘基丙胺酸 Sar : L-肌胺酸 CH2-NH: -psi[CH2NH]-鍵結（也稱爲假鍵結）
Fmoc:苐基甲氧基羰基 Boc:第三丁氧基羰基 TFA :三氟乙酸 Trt :三苯甲基 HBTU:N-氧化N-[(1H-苯并三唑-1-基（二甲胺基）亞甲 基]-N-甲基甲烷銨六氟磷酸酯 HOBt : 1-羥基苯并三唑 DCC : N，N’-二環己基羰二亞胺 TIPS :三異丙基矽烷。 化合物之合成 考量腸動素之以分解酵素之分解路徑、13位甲硫胺n 之安定性，及腸動素生理活性之維持等，合成以下所示類 似腸動素的胜肽化合物。又，就比較對象而言，也實施天 然型腸動素之合成。比較化合物1及2、化合物1〜13之 胺基酸序列如下。 天然型腸動素：phe Val Pro Ue Phe Thr Tyr Gly Glu Leu -21 - 201106964
Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln(SEQ ID NO: 1)； 比較化合物〗（13Leu-腸動素）：Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln(SEQ ID NO: 16)； 比較化合物 2(MT139):Phe*Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly G1 u Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln(SEQ ID NO: 17)； 化合物 1(MT095) : Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 3)； 化合物 2(MT114): Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 4)； 化合物 3(MT116) : Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 5)； 化合物 4(MT124) ： Phg(C#CH2) Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 6)； 化合物 5 (MT 1 26) ： Phg(C#CH2) Val Sar lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 7)； 化合物 6(MT140): Phe* Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu -22- 201106964
Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 8)； 化合物 7(MT141)： Phe*Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 9)； 化合物 8(MT 1 07) ： Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 10)； 化合物 9(MT115): Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO : 1 1 )； 化合物 10(MT125)： Phg(C#CH2) Val Sar lie Phe Thr Tyr
Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 12); 化合物 1 1 (MT 1 2 8)： Ac-Nal Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 13)； 化合物 12(MT154) ： Phe* Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO: 14)； 化合物 13 (MT 1 5 5)： Phe* Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln(SEQ ID NO : 1 5)。 此等化合物之中，第1位胺基酸（亦即相當於XI)與Val -23- 201106964 之間之鍵結，於使用13丨[(^2>111]-鍵結時’其鍵結以「！1!」 表示。 胜肽鏈之延長，主要使用胜肽合成機（43 3 A、Applied Biosystems公司製），以Fmoc法構建保護胜肽衍生物-樹 脂，最後於N末端導入Boc-胺基酸。得到之保護胜肽樹脂’ 以三氟乙酸（TFA)、或各種的含有清除劑的稀釋TFA脫保 護，將游離的胜肽供精製。以使用C 1 8管柱逆相HP LC精 製並且確認純度，以質量分析確認構造° 本發明之胜肽化合物，可以通常之胜肽合成法合成， 代表的合成例、化合物 1(MT095)及化合物 6(MT140)之合 成例如下。 實施例1:化合物1(MT095)之合成 本實施例，以化學合成化合物1(MT095、SEQIDNO:3) 爲目的進行。
Fmoc-Gln(Trt)-Alko樹脂（渡邊化學公司製、47.6 mg、 0.03 mmol)以20 %哌阱處理20分鐘後，從SEQ ID NO: 3 之C末端側起，依序反複以HBTU/HOBt導入Fmoc-胺基酸 導入及以哌阱脫Fmoc，構建Fmoc-胜肽-樹脂。最後，以 DCC/HOBt導入Boc-Phe-OH後，將得至[J的保護胜肽樹月旨力口 入90 %三氟乙酸、其他含苯酚、水、TIPS之脫保護試藥（5.〇 m L)，於室溫攪拌2小時。將樹脂濾去，並濃縮濾液後，於 殘渣加入醚進行沉澱。濾取沉澱並乾燥，得到粗胜肽約3 0 mg。 將本品溶解於1 ·〇 mL之1 N乙酸，添加於lnertsi 1 PREp -24- 201106964 ODS 管柱（(p20mm><250 mm、GL Sciences 公司製），於 〇·ι% 三氟乙酸中，以乙腈0%〜50%之直線梯度（流速：10 mL/min) 洗提50分鐘。以UV(220 nm)監控，分取目的片段後冷凍 乾燥，得到約5.0 mg之目的物。 將得到的目的物，添加於Inerts il PREP ODS管柱（φ4.6 111111><25〇111111、0[8(^611068公司製），於0.1%三氣乙酸中， 以乙腈5%〜65%之直線梯度（流速：1.5 mL/min)洗提30分 鐘，以UV(220 nm)監控，藉此測定目的物之純度。 將得到的目的物以 MALDI TOF-MS (Dal tonics B IF LEX IE、Bruker公司製）確認分子量，且利用胺基酸分析（於6 N-HC1中於110°C處理24小時，水解成胺基酸，並以HPLC 定量各胺基酸）確認胜肽含量。MALDI-TOF MS測定値： 2 73 8.7 1 8 (理論値2 7 3 9.2 )、分析HP LC純度 96.0%、利用 胺基酸分析得到之胜肽含量：643 pg/mg。 實施例2:化合物6(MT140)之合成 本實施例係以化學合成化合物6(MT140、SEQIDNO: 8) 爲目的進行。 將 Fm〇c-Gln(Trt)-Alk〇樹脂（渡邊化學公司製、47.6 mg、0.03 mmol)以20 %哌畊處理20分鐘之後，從SEQ ID NO: 8之C末端側起依序反複以HBTU/HOBt進行Fmoc-胺基酸 導入及以哌阱脫Fmoc，構建Fmoc-胜肽-樹脂。最後以氰基 三氫硼酸鈉/1%乙酸導入Boc-Phe醛後，將得到之保護胜肽 樹脂加入90%三氟乙酸、其他含有苯酚、水、TIPS之脫保 護試藥（5.0 inL)，於室溫攪拌2小時。將樹脂濾去，濃縮 -25- 201106964 濾液後，於殘渣中加入醚使沉澱。濾取沉澱，乾燥得到粗 胜肽約3 0 m g。 將本品溶解於hOmL之1 N乙酸’添加於InertsilPREP ODS 管柱（cp20mm><250 mm、GL Sciences 公司製），於 0.1% 三氟乙酸中，以乙腈〇%〜50%之直線梯度（流速：10 mL/min) 洗提50分鐘。以UV(220 nm)監控，分取目的區後冷凍乾 燥，得到約5.Omg之目的物。 將得到的目的物添加到Inertsil PREP ODS管柱（φ4.6 mmx250 mm、GL Sciences公司製），於0.1 %三氟乙酸中， 以乙腈5%〜65%之直線梯度（流速：1.51^/!!11|1)洗提30分 鐘，以UV(2 2 0 nm)監控，藉此測定目的物純度。 得到之目的物，以 MALDITOF-MS (Daltonics BIFLEX HI、Bruker公司製）確認分子量。MALDI-TOF MS測定値： 2 7 2 5 · 0 4 0 (理論値2 7 2 5 · 2)、分析Η P L C純度9 8 · 7 %、以胺基 酸分析得到之胜狀含量：707pg/mg。 以下以同樣手法，製造天然型腸動素、及化合物1〜 13(各爲SEQIDNO:3〜15)，及比較化合物1及2(各爲SEQ ID Ν Ο : 1 6及1 7)。此等之M S値及以胺基酸分析得到之胜 肽含量，各整理在表1。 -26- 201106964 表1 :化合物之MS値及胜肽含量 化合物名 構造 胜肽含量(％) (胺基酸分析） MS測定値 (理論値） 天然型 腸動素 FVPIFTYGELQRMQEKERNKGQ (SEQIDNO: 1) 88.6 2698.382 (2699.1) 比較化合物1 (13Leu-腸動素） FVPIFTYGELQRLQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 16) 73.1 2680.432 (2681.0) 比較化合物2 (MT139) F*VPIFTYGELQRMQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 17) 71.8 2683.998 (2685.1) 化合物1 (MT095) FVPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 3) 64.3 2738.718 (2739.2) 化合物2 (MT114) FVPIFTYGELQRLQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 4) 75.8 2720.544 (2721.1) 化合物3 (MT116) FVPIFTYGDLQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 5) 76.8 2689.574 (2690.1) 化合物4 (MT124) Phg(C#CH2)-VPIFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 6) 75.7 2703.920 (2704.1) 化合物5 (MT126) Phg(C#CH2)-V-Sar-IFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 7) 58.3 2677.60 (2677.0) 化合物6 (MT140) F*VPIF 丁 YGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 8) 70.7 2725.040 (2725.2) 化合物7 (MT141) F*VPIFTYGELQRLQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 9) 70.3 2706.980 (2707.1) 化合物8 (MT107) FVPIFTYGELQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 10) - 2721.272 (2722.2) 化合物9 (MT115) FVPIFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 11) - 2703.463 (2704.1) 化合物10 (MT125) Phg(C#CH2)-V-Sar-IFTYGELQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 12) - 2695.845 (2695.1) 化合物11 (MT128) Ac-Nal-VPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 13) - 2830.62 (2831.2) 化合物12 (MT154) F*VPIFTYGDLQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 14) - 2676.598 (2676.1) 化合物13 (MT155) F*VPIFTYGDLQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 15) - 2693.923 (2694.2) -27- 201106964 註：關於化合物8〜13，不測定胺基酸含量。又 化合物2、化合物6、7、12及13中，「*」表示胺 之鍵結爲_psi[CH2NH]_鍵結。 實施例3:空腹期IMC誘發活性之測定 本實施例，係使用實施例1及2記載之方法製 合物，以測定犬體內於空腹期之肛側傳播性強收縮帯 誘發活性爲目的進行。 化合物之空腹期IMC誘發活性，係依照ITOH 方法(Zen Itoh et a 1, Gastroenterologia Japoni 2 7 5 - 2 8 3 , 1 9 7 7 )，將力轉換器縫在犬的消化道，於清 定消化道收縮運動以實施。亦即，於麻醉下在犬的 部、十二指腸、空腸、回腸的漿膜面沿輪狀肌，施 力轉換器之手術後，將轉換器之變形借助於放大器 錄計輸出。 於清醒下，於空腹期自然發生之IMC結束約1 後（胃之強收縮1 〇分鐘後），急速地對於靜脈投予天 動素或腸動素衍生物化合物0.1 Kg/kg，觀察消化道 動。由於受測物質投予誘發胃之強收縮且此等傳播 二指腸者定義爲IMC，將於O.lpg/kg誘發IMC之化 定爲有IMC誘發活性。 第1圖各顯示將0.1 pg/kg之天然型腸動素、 4(MT124)及化合物6(MT140)進行靜脈內投予時關 期IMC誘發活性之圖，表2顯示天然型腸動素及腸 生物化合物之空腹期IMC誘發活性之有無。第1圖 ，比較 基酸間 作的化 * (IMC) 等人之 c a 12; 醒下測 胃前庭 加縫住 對於記 〇分鐘 然型腸 收縮運 直到十 合物判 化合物 於空腹 動素衍 中，箭 -28- 201106964 號表示天然型腸動素、化合％ 4及6之投予時期。於第i 圖所示’投予天然型腸動素時（圖中，以「τ」表示之時點）， 於同卽底郃開始收縮，且其收縮持續約丨〇分鐘。胃前底部 之收縮開始後緊接著其收縮傳播到十二指腸，與胃前底部 之情形同樣地其收縮持續約10分鐘。化合物4(ΜΤ124)及 化合物6 (Μ Τ 1 4 0 )進行靜脈內投予之情形，亦爲可見到與投 予如上述天然型腸動素之收縮樣式同樣的收縮樣式。又， 如第1圖及表2所示’不僅是天然型腸動素、化合物 4(ΜΤ124)及化合物6(ΜΤ140)，任一腸動素衍生物化合物也 與自然發生之IMC誘發同樣的空腹期IMC，其強度與天然 型腸動素大致爲同程度。 -29- 201106964 表2:對犬靜脈內投予天然型腸動素及腸動素衍生物時 之空腹期IMC誘發活性 化合物名 投予量 (Pg/kg) IMC誘發活性 天然型 腸動素 0.1 有活性 比較化合物1 (13Leu-腸動素） 0.1 有活性 比較化合物2 (MT139) 0.1 有活性 化合物1 (MT095) 0.1 有活性 化合物2 (MT114) 0.1 有活性 化合物3 (MT116) 0.1 有活性 化合物4 (MT124) 0.1 有活性 化合物5 (MT126) 0.1 有活性 化合物6 (MT140) 0.1 有活性 化合物7 (MT141) 0.1 有活性 化合物8 (MT107) 0.1 有活性 化合物9 (MT115) 0.1 有活性 化合物10 (MT125) 0.1 有活性 -30- 201106964 由此等結果可知：於實施例1及2製作之所有化合物， 具有與天然型腸動素同樣的空腹期IMC誘發活性。 比較例1:使用大鼠進行靜脈內投予之天然型腸動素 之藥物動態實驗 將天然型腸動素對大鼠進行靜脈內投予，測定血漿中 濃度。 靜脈內投予，使用預先在大腿動脈插入聚乙烯管 (PE-5 0、Clay Adams公司製）之大鼠實施。就試驗系而言， 係於7週齡之雄性SD系大鼠（日本Charles river公司製）1 群取3隻供實驗。將天然型腸動素溶解於5 %甘露醇溶液， 製備lOOpg/mL之溶液，將此溶液以lmL/kg之投予容量從 尾靜脈使用注射筒及26G之注射針（均爲Terumo公司製） 投予。投予前、及投予後1、3、5、10、20、30及60分鐘 後，從插入在大腿動脈的聚乙烯管採取血液。 對於採取之血液立即添加1/100容量之10 % EDTA. 2Na · 2H20溶液後，離心以將血漿分離。於血漿中立即添 加1/10容量之5,000 IU/mL抑肽酶溶液並混合，保管在 -8 0 °C直到供測定爲止。 天然型腸動素之血漿中濃度測定，係依照使用抗腸動 素抗體之放射免疫分析（RIA)法實施。亦即，於血漿試樣中 加入抗腸動素抗體後，加入[125I-Tyr7]腸動素使競合反應。 於其中加入二次抗體，使結合於抗腸動素抗體之腸動素沉 澱，分離上清後，以γ-計數器（PerkinElmer公司製）測定沉 澱片段中之放射能。 -31 · 201106964 得到之血漿中之天然型腸動素濃度變遷如第2圖所 示。又，從得到之血漿中天然型腸動素濃度之變遷，計算 於時間0時，血漿中濃度（C0)及血漿中濃度曲線下面積 (AUC)作爲藥物速度論的參數而言。C0使用外插法，AUC 以梯形法求取。其結果，天然型腸動素以10C^g/kg之用量 進行靜脈內投予時之C0，經計算爲1797 ng/mL、AUC經 計算爲3598 ng·分/mL。 實施例4:使用大鼠進行經肺投予時之天然型腸動素 及腸動素衍生物化合物之藥物動態實驗 本實施例中，目的爲將天然型腸動素及腸動素衍生物 化含物對於大鼠進行經肺投予，並使用RIA法測定之後之 血漿中濃度之變化。又，使用RIA法時，可檢測出全部呈 現抗腸動素抗體與抗原抗體反應之物質，因此，有可能也 檢測到未變化體以外與抗體反應之代謝物。故，將天然型 腸動素及腸動素衍生物化合物對於大鼠進行經肺投予，將 得到之血漿進行HP LC區分，測定各片段中之免疫活性， 藉此了解與抗體反應之物質爲未變化體，確認RIA法爲適 於測定血漿中濃度之變化的方法。 亦即，於7週齡之雄性SD系大鼠（日本Charles river 公司製）之氣管插入聚乙稀管（PE-240、Clay Adams公司 製）’將天然型腸動素或化合物2(MT114)溶解於0.1N乙酸 水溶液製備爲1 mg/mL之溶液，將此溶液25μί使用氣管 內液體噴霧裝置（MicroSprayer: Penn Century公司製），對 於氣管之聚乙烯管內投予。投予5分鐘後，從腹大動脈採 -32- 201106964 取血液’將採取的血液與比較例1同樣地處理，將血漿分 離。將採取的血漿使用Sep-Pak C 1 8卡匣（Waters公司製） 進行前處理，其次，將試樣注入裝有Cosmosil 5C18管柱 (Nacalai公司製）的HPLC(LC-10A,島津製作所製），實施 區分。對於各試樣，從剛注入試樣起到40分鐘爲止，每1 分鐘採取洗提液，以RIA法測定各區分中之免疫活性。其 結果，於任一血漿試樣中均僅在與投予之化合物（未變化體） 對應的洗提位置檢測到免疫活性峰部，未觀察到其他峰 部。由以上結果，經肺投予後之血漿中檢測到的化合物爲 未變化體之化合物，暗示存在代謝物的可能性非常小，故 顯示R IA法適於作爲本實施例之測定法。 試樣之經肺投予也與上述同樣，使用預先在大腿動脈 插入聚乙烯管之大鼠實施。試驗系，就7〜1 0週齡之雄性 SD系大鼠（日本Charles river公司製）ι群以3隻供實驗。 將天然型腸動素或腸動素衍生物化合物溶解於0.1 N乙酸 水溶液，製備1 mg/mL之溶液，並將此溶液25pL使用氣 管內液體噴霧装置（MicroSprayer : Penn Century公司製）投 予到氣管之聚乙烯管內。投予前、及投予後5、10、20、 3 0及60分鐘後從插入在大腿動脈的聚乙烯管採取血液。 將採取之血液與比較例1以同樣處理，將血漿分離，以RIA 法測定血漿中天然型腸動素及腸動素衍生物化合物濃度。 又’測定時’將各衍生物作爲標準物質製作檢量線，求出 血漿中濃度。 第3圖顯示將天然型腸動素、化合物2(MT114)及化合 -33- 201106964 物6 (Μ Τ 1 4 0)經肺投予後，此等化合物於血漿中之濃度變 遷。如第3圖所示，與將天然型腸動素對於大鼠經肺投予 後，於血漿中腸動素濃度之變遷比較，化合物2(ΜΤ114)及 化合物6(ΜΤ140)對於大鼠經肺投予後之血漿中化合物濃 度’以投予後之峰部血漿中濃度較高，係比起天然型腸動 素，顯示能更長時間於活體內維持高濃度。 從依照此等試驗得到之血漿中之天然型腸動素或腸動 素衍生物化合物濃度變遷，計算最高血漿中濃度（Cmax)及 血漿中濃度曲線下面積（AUC)作爲藥物速度論的參數。 Cmax取實測値，AUC以梯形法求出。使用此等値，以下列 數式計算生物學的利用率（生體利用率：BA)(%)。 B A(%) = [(AUC/Dose)/(AUC(motilin」v)/Dose(motilin_iv))] X 100 AUC :經肺投予後之AUC(ng .分/mL)
Dose:經肺投予之投予量（pg/kg) AUC(motilin」v) ••天然型腸動素靜脈內投予後之AUC(ng .分/mL) Dose(motilin_iv):天然型腸動素靜脈內投予之投予量（pg/kg)。 又，天然型腸動素及腸動素衍生物化合物之藥物速度論 的參數表示於以下之表3。
S -34- 201106964 表3 :對於大鼠經肺投予天然型腸動素及腸動素衍生物化 合物時之藥物速度論的參數 化合物名 投予量 Cmax AUC BA (pg/rat) (Pg/kg) (ng/mL) (ng·分/mL) (%) 天然型 腸動素 25 80.7±2.6 7.84±0·98 94.9±5.7 3.3±0.1 比較化合物1 (13Leu-腸動素） 25 62.5 士 0.0 4.53±2.86 63.3 士 36.6 2.8±1.6 比較化合物2 (MT139) 25 81.6±3.0 9·30±3·09 118.6±41.0 4.1±1.6 化合物1 (MT095) 25 62.6±2.6 9.09±0.53 119.3±15.0 5.3±0.6 化合物2 (MT114) 25 92.7±3.4 26.60±11.30 350.4士 146.6 10.4±4.3 化合物3 (MT116) 25 82.4±1.6 24.60±5.80 281.8±24.0 9.5±0.9 化合物4 (MT124) 25 70.4±9.9 14.6U8.23 281.3士201.7 11.0±7.2 化合物5 (MT126) 25 86.2±0.0 14.81±7.78 175.3±90.7 5.7±2.9 化合物ό (ΜΤ140) 25 92.7±3.4 34.22±19.97 380.4±191.5 11.5±6.1 化合物7 (ΜΤ141) 25 83.5±4.7 17.20±7.18 194.3±47.9 6.4±1.3 化合物9 (ΜΤ115) 25 56.4±1.5 8.99±5_99 115.5±64.2 5.7±3.1 化合物10 (ΜΤ125) 25 89.3±0.0 6.10±1.50 189.5±25.5 5.9±0.8 化合物12 (ΜΤ154) 25 83.6±5.6 30.09士 15.79 565.3±341.1 18.7±10.7 化合物13 (ΜΤ155) 25 91.5±1.9 18.42±10.40 185.4±48.5 5.6±1.5 -35- 201106964 如表3中所示之結果’化合物1 (天然型腸動素之21 位胺基酸甘胺酸取代爲脯胺酸。21Pro-腸動素、SEQIDNO: 3)對於大鼠經肺投予時之生物學的利用率（以下簡稱爲BA) 爲5 · 3 %，與天然型腸動素經肺投予時之生物學的利用率 (3 .3%)相比爲較高。又，將化合物2(天然型腸動素之13位 胺基酸甲硫胺酸取代爲白胺酸，又，2 1位胺基酸取代爲脯 胺酸。13Leu-、21Pro-腸動素、SEQ ID NO: 4)對於大鼠經肺 投予時之BA爲10.4%，比起比較化合物l(13Leu-腸動素、 SEQ ID NO: 16)(2.8%) ’BA顯著提高。又，將化合物 6(-psi[CH2NH]-鍵結、21Pro-腸動素、SEQ ID NO: 8)經肺投 予時之BA爲11.5%，比起比較化合物2(-psi[CH2NH]-腸動 素、SEQ ID NO: 17)(4.1%)，BA顯著提高。如此，21位取 代爲脯胺酸之腸動素衍生物化合物1〜1 3，於大鼠經肺投 予時之 BA爲 5.3〜18.7%，比起天然型腸動素之 ΒΑ(3· 3 %)，均較爲提高。從此結果，認爲藉由將天然型腸 動素或類似腸動素的胜肽化合物之2 1位取代爲脯胺酸，經 肺投予時之吸收性提高。 如以上，將2 1位取代爲脯胺酸之腸動素衍生物化合物 1〜1 3對於大鼠經肺投予時，由黏膜吸收到活體內之吸收 效率顯著提高（參照表3)，其結果，比起天然型腸動素，顯 示經吸收之化合物於活體內之濃度更長時間維持爲高。 比較例2:使用猴進行靜脈內投予之天然型腸動素及 腸動素衍生物化合物之藥物動態實驗 本比較例中，將天然型腸動素及腸動素衍生物化合物 -36- 201106964 •對於猴進行靜脈內投予，測定血漿中濃度。 試驗系’將8〜9歲之雄性食蟹猴（n =各1〜2)供實驗。 將天然型腸動素及化合物2溶解於5 %甘露醇溶液，製備 100pg/mL之溶液’並將此溶液以〇.1 mL/kg之投予容量， 從右橈側皮靜脈使用注射筒及注射針（均爲Terumo公司製） 投予。投予前、及投予後5、10、15、20、30及60分鐘後， 從左橈側皮靜脈採取血液。 將採取的血液立即添加1/100容量之10%EDTA. 2Na • 2H2〇溶液後，離心將血漿分離。將血漿立即添加1/1〇 容量之5,000 IU/tnL抑肽酶溶液並混合，保管於-8CTC直到 供測定爲止。 天然型腸動素及腸動素衍生物化合物之血漿中濃度測 定，依照使用抗腸動素抗體之放射免疫分析（RIA)法實施。 亦即’於血漿試樣中加入抗腸動素抗體之後，加入 [1251-Tyr7]腸動素使競爭反應。於其中加入二次抗體，使結 合於抗腸動素抗體之腸動素沉澱，將上清分離後，以γ-計 數器（PerkinElmer公司製）測定沉澱片段中之放射能。 得到之血漿中天然型腸動素濃度變遷如第4圖。又， 從得到之天然型腸動素及腸動素衍生物化合物之血漿中濃 度變遷’計算於時間0之血漿中濃度（C0)及血漿中濃度曲 線下面積（AUC)作爲藥物速度論的參數。C0以外插法求 取’ AUC以梯形法求取。其結果，天然型腸動素及化合物 2以lOpg/kg之用量進行靜脈內投予時，計算得C0爲233 及 273 ng/mL’ AUC 爲 786 及 926 ng.分 /mL。 -37- 201106964 實施例5:使用猴進行經鼻投予之天然型腸動素及腸 動素衍生物化合物之藥物動態實驗 本實施例中’目的爲將天然型腸動素及腸動素衍生物 化合物對猴進行經鼻投予，以RIA法測定之後之血漿中濃 度之變化。 實驗使用10〜11歲之雄性食蟹猴。將天然型腸動素或 化合物2與結晶纖維素以1 : 4 0的比例混合，製備經鼻製 劑，將2 0 m g充塡於明膠膠囊。將1個膠囊以經鼻投予用 裝置（日立automotive公司製）投予到食蟹猴的右鼻腔內。 投予前、及投予後5、10、15' 20、30、60、120及180分 鐘後’從橈側皮靜脈採取血液。將採取的血液與比較例2 同樣處理’將血漿分離’以RIA法測定血漿中天然型腸動 素及腸動素衍生物化合物濃度。又，測定時，使用各衍生 物作爲標準物質製作檢量線，求取血漿中濃度。 將天然型腸動素及化合物2(MT114)對猴經鼻投予 後’此等化合物之血漿中濃度變遷如第5圖所示。如第5 圖所示’與將天然型腸動素對猴經鼻投予後之血漿中腸動 素濃度之變遷比較，將化合物2(MT114)對猴經鼻投予後之 血漿中化合物濃度於投予後之峰部血漿中濃度較高，顯示 比起天然型腸動素’能於活體內維持更長時間爲高濃度。 由依照此等試驗得到之血發中之天然型腸動素或腸動 素衍生物化合物濃度變遷，計算最高血漿中濃度（Cmax)及 血漿中濃度曲線下面積（AUC)作爲藥物速度論的參數。 C m a X由實測値求取’ A U C以梯形法求取。使用此等値，以 5 -38- 201106964 下列數式計算生物學的利用率（生體利用率：BA) (%)。 BA(%)=[(AUC/Dose)/(AUC(iv)/Dose(iv))]xlOO AUC:經鼻投予後之AUC(ng·分/mL)
Dose:經鼻投予之投予量（pg/kg) AUC(iv):各化合物進行靜脈內投予後之AUC(ng .分/mL) D〇Se(iv):各化合物進行靜脈內投予時之投予量（pg/kg)。 又，以下表4顯示天然型腸動素及腸動素衍生物化合 物之藥物速度論的參數。 表4:對猴經鼻投予天然型腸動素及腸動素衍生物化合物 時之藥物速度論的參數（N=l〜2之平均値） 化合物名 投予量 Cmax AUC BA (pg/monkey) (gg/kg) (ng/mL) (ng.分/mL) (%) 天然型 腸動素 523 85.0 13.6 241 3.6 化合物2 (MT114) 540 80.6 23.5 361 5.1 如表4中所示之結果，將化合物2對猴經鼻投予時之 生物學的利用率（以下簡稱BA)爲5.1%，比起天然型腸動素 經鼻投予時之生物學的利用率（3.6%)爲較高。如以上，將 2 1位取代爲脯胺酸之腸動素衍生物化合物2對猴經鼻投予 時，由黏膜吸收到活體內之吸收效率提高，其結果顯示， 比起天然型腸動素，經吸收之化合物於活體內之濃度維持 較長時間爲高。 -39- 201106964 [產業利用性] 本發明係關於新穎的類似腸動素的胜肽化合物。本發 明之類似腸動素的胜肽化合物或其藥學上可容許之鹽，由 於具有有效的消化道運動刺激活性及經黏膜投予之高吸收 性，故能夠治療起因於消化道機能異常之疾病（例如，特徵 爲消化道運動活性之基礎水平降低的症狀）。起因於消化道 機能異常之疾病，例如：機能性消化不良症、糖尿病性胃不 全麻痺、胃食道逆流症、過敏性腸症候群、小腸內細菌過 剩增殖症、結腸僞性堵塞症、麻痺性腸堵塞、慢性特發性 僞性腸堵塞、及術後性腸堵塞等症狀。包含天然型腸動素 在內之習知之胜肽性腸動素作動藥係僅對靜脈內直接注 射’但是藉由提供本發明之化合物，能進行經黏膜投予在 內的靜脈內投予以外的投予，由大幅減輕患者負擔之觀 點’於産業上很有利用性。 【圖式之簡單説明】 第1圖顯示天然型腸動素、化合物4及化合物6進行 靜脈內投予時之空腹期IMC誘發活性圖。 第2圖顯示對大鼠將天然型腸動素進行靜脈內投予後 之血漿中濃度變遷圖。 第3圖顯示天然型腸動素、化合物2 (MT114)及化合物 6(ΜΤ14〇)經肺投予後之血漿中濃度變遷圖。 第4圖顯示將天然型腸動素及化合物2(MT114)對猴進 行靜脈內投予後之血漿中濃度變遷圖。 第5圖顯示將天然型腸動素及化合物2(MT 11 4)對猴經 -40- 201106964 鼻投予後之血漿中濃度變遷圖 【主要元件符號說明】 姐〇 201106964 【序列表自由文】 SEQ ID NO: 1爲人腸動素之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 2爲腸動素類似體之胺基酸序列。 SEQ ID NO·· 3爲化合物1(MT095)之胺基酸序列。 SEQ ID NO·· 4爲化合物2(MT1M)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 5爲化合物3(MT116)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 6爲化合物4(MT124)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 7爲化合物5(MT126)之胺基酸序列。 SEQ ID NO·· 8爲化合物6(MT140)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 9爲化合物7(MT141)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 10爲化合物8(MT107)之胺基酸序列。 SEQ ID NO·· 11爲化合物9(MT115)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 12爲化合物10(MT125)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 13爲化合物11 (MT128)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 14爲化合物12(MT154)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 15爲化合物13(MT155)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 16爲比較化合物lpLeu-腸動_之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 17爲比較化合物2(MT139)之胺基酸序列。 【序列表】
SEQUENCE LISTING <110〉 DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED. <120> Peptide Compounds Homologous to Motilin. <130> 10070 <150> JP 2009-177107 <151> 2009-07-29 <160> 17 <170〉 Patentln version 3.1 <210〉 1 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens 201106964 <400〉 1
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Asn Lys Gly Gin 20 <210> 2 <211〉 22 <212> PRT <213〉Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Motilin homologues. <220>
<221> MISC_FEATljRE <222> (1)..(1) <223> an aromatic amino acid or a heterocyclic aromatic amino acid <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> ⑶·.⑶ <223> proline or sarcosine (Sar； or Nhmethylglycine, MeGly) <220>
<221> MISCJFEATORE <222> ⑼..⑼ <223> aspartic acid or glutamic acid <220〉
<221> MISC_FEATURE 201106964 <222〉 （13)..(13) <223> methionine or leucine <220> <221> MISCJ^EATURE <222> (19)..(19) <223> proline or asparagine <400> 2
Xaa Val Xaa He Phe Thr Tyr Gly Xaa Leu Gin Arg Xaa Gin Glu Lys 1 5 10 15
Glu Arg Xaa Lys Pro Gin 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213〉 Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Compound 1 (MT095). <400> 3
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Asn Lys Pro Gin 20 <210> 4 201106964 <211> 22 <212> PRT <213〉Artificial <220〉 <223> Amino acid sequence of Compound 2 (MT114). <400> 4
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 1 5 10 15
Glu Arg Asn Lys Pro Gin 20 <210〉5 . <211> 22 <212> PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> Amino acid sequence of Compound 3 (Mil16). <400〉 5
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Pro Lys Pro Gin 20 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213〉 Artificial 201106964 <220> <223> Amino acid sequence of Compound 4 (MT124〉. <220>
<221> MISC_FEATURE <222〉（1)..(1) <223> beta-homophenylglycine (Phg(C#CH2)) <400> 6
Xaa Val Pro He Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 1 5. 10 15
Glu Arg Pro Lys Pro Gin 20 <210〉 7 <211〉 22 <212〉 PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Compound 5 (ifT126). <220>
<221> mSCJEATURE <222〉（1) ‘ ‘（1) <223> beta-homophenylglycine (Phg(C#CH2)) <220> <221〉MISCLFEATURE <222〉（3)..(3) <223> sarcosine (Sax； or N-methylglycine, MeGly) 201106964 <400> 7
Xaa Val Xaa lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 1 5 10 15
Glu Arg Pro Lys Pro Gin 20 <210> 8 <211〉 22 <212> PRT <213〉 Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Canpound 6 〇ίΓ140). <400> 8
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Asn Lys Pro Gin 20 <210> 9 <211〉22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Compound 7 (MT141). <400> 9 201106964
Phe Val Pro He Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Asn Lys Pro Gin 20 <210〉 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Compound 8 (MT107). <400> 10 \
Phe Val Pro He Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys 1 5 10 15
Glu Arg Pro Lys Pro Gin 20 <210> 11 <211> 22 <212〉 PRT <213> Artificial <220> <223> Aniino acid sequence of Confound 9 (MT115). <400> 11
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 15 10 15 201106964
Glu Arg Pro Lys Pro Gin '20 <210> 12 <211〉 22 <212> PRT <213〉 Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Compound 10 (ΜΓ125). <220〉
<221> MISC_PEATURE <222〉(1)..(1) <223> beta-homophenylglycine (Phg(C#CH2)) <220> <221> MISC.FEATUKE <222> (3)..(3) <223> sarcosine (Sar； or N-methylglycine, MeGly) <400> 12
Xaa Val Xaa lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin 61u Lys 1 5 10 15
Glu Arg Pro Lys Pro Gin 20 <210〉 13 <211> 22 <212> PRT <213〉 Artificial 201106964 <220> <223> Amino acid sequence of Compound 11 (MT128). <220〉
<221> MISCJ^ATURE <222〉（1)..(1) <223> acetylnaphthylalanine (Ac-Nal) <400> 13
Xaa Val.Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys 1 5 10 15
Glu Arg Asn Lys Pro Gin 20 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213〉 Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Compound 12 (MT154). <400> 14
Phe Val Pro lie Phe Ώιτ Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Pro Lys Pro Gin 20 <210〉 15 201106964 <211> 22 <212> PRT <213〉 Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Compound 13 (MT1S5). <400> 15
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys 1 5 10 15
Glu Arg Pro Lys Pro Gin 20 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213〉 Artificial <220> <223> Amino acid sequence of Reference Confound 1 (13Leu-Motilin). <400> 16
Phe Val Pro He Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Leu Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Asn Lys Gly Gin 20 <210> 17 <211〉 22 <212> PRT <213〉 Artificial -10- 201106964 <220〉 <223〉Amino acid sequence of Reference Compound 2 (MT139). <400> 17
Phe Val Pro lie Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gin Arg Met Gin Glu Lys 15 10 15
Glu Arg Asn Lys Gly Gin 20 -11-

Claims (1)

  1. 201106964 七、申請專利範圍： 1. 一種以下通式1之序列表示之化合物、或其藥學上可容 許之鹽： 通式1 : XI Val X2 lie Phe Thr Tyr Gly X3 Leu Gin Arg X4 Gin Glu Lys Glu Arg X5 Lys Pro Gin (式i) [式中，各胺基酸間之鍵結除了 X 1 - Val間之鍵結以外均爲 醯胺鍵； XI-Val間之鍵結爲醯胺鍵或以下式2 I Ϊ N末ί®則 了 N C末5¾¾ Η 表示之鍵結； XI爲芳香族胺基酸或雜芳香族胺基酸； Χ2爲脯胺酸或肌胺酸； Χ3爲麩胺酸或天冬氨酸； Χ4爲甲硫胺酸或白胺酸； X 5爲天冬醯胺或脯胺酸]。 2 .如申請專利範圍第1項之化合物、或其藥學上可容許之 鹽，其中XI爲苯丙胺酸或β -高苯甘胺酸。 3. —種以選自由SEQ ID Ν0:3至15構成之群組之序列表示 之化合物、或其藥學上可容許之鹽。 4. 一種醫藥組成物，用於治療伴隨消化道機能異常之疾 病，包含如申請專利範圍第1至3項中任一項之化合物、 201106964 或其藥學上可容許之鹽。 5 .如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中伴隨消化道 機能異常之疾病，選自由機能性消化不良症、糖尿病性 胃不全麻痺、胃食道逆流症、過敏性腸症候群、小腸內 細菌過剩增殖症、結腸僞性堵塞症、麻痺性腸堵塞、慢 性特發性僞性腸堵塞、及術後性腸堵塞構成之群組。 6. 如申請專利範圍第4或5項之醫藥組成物，其中醫藥組 成物爲經黏膜投予用醫藥組成物。 7. 如申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中經黏膜投予 爲經肺或經鼻。
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