201103552 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體上係關於一種微生物’特定言之一種食品級 細菌。本發明之一項實施例係關於一種屬於諸如乳桿菌 屬、雙叉桿菌屬及其組合之非複製性益生菌’例如物種副 乾赂乳桿菌（Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳酸桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)、長雙叉桿菌（Bifidobacterium longum)、乳雙叉桿菌（Bifidobacterium lactis)、短型雙叉 桿菌（Bifidobacterium breve)及其組合，及關於該等細菌之 應用。本發明之一項實施例係關於一種非複製性益生菌， 及其於製備組合物上之用途’以用於治療或預防與免疫防 禦受損相關之病症。 【先前技術】 益生菌之定義可為··一種微生物，當呈適當數量投與 時，可為宿主提供健康益處[FAQ/WHO (2001) Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria o Report of a
Joint FAQ/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritiona Properties of Probotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria]。因 此，大部份已公開之文獻係關於活益生菌。然而，有些探 討非複製性細菌所傳遞之健康益處的研究得出結論：使益 生菌加熱失活通常導致其原本之健康益處喪失 (Rachmilewitz，D.，K.等人，2004，Gastroenterology 126 : 148205.doc 201103552 520-528 ； Castagliuolo, I.，等人.，2005，FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43 : 197-204 ; Gill, H. S.及 K. J. Rutherfurd· 2001，Br. J. Nutr. 86 : 285-289 ; Kaila，M.，等 人，.1995，Arch. Dis. Child 72 : 51-53 ; Wagner，R_ D.，等 人.，2000, J. Food Prot. 63 : 638-644)。 然而’ 一些研究顯示，滅活之益生菌可能仍保留一些健 康益處。其可能取決於例如所採用之滅活方法 (Rachmilewitz，D” K·等人，2004，Gestroenterology 126: 520-528 ’ Gill, H. S.及 Κ· J. Rutherfurd. 2001，Br. J. Nutr, 86 : 285-289)。文獻中所採用殺死益生菌菌株之技術大部 份係熱處理、γ-輻射、UV_處理或化學藥劑（福馬林、多聚 甲醛）。 於現今之食品工業中，通常向食品添加益生菌，該等食 品在低溫過程t貯存較長時間及/或經過處理以減少細菌 含量。然而，減少產品中細菌含量、長的貯存時間、及任 一種加工法（諸如喷霧乾燥等）均減少產品中活益生菌之含 量。然而’如前所述，減少產品中活益生菌含量在技術中 通常等同於使益生菌原本之健康功效減少或甚至喪失。 雖然已發現包括特定之滅活益生菌的一些製劑可保留一 坠健：功效’其令人振奮，但通常認為活益生菌具有比失 活之益.生g更佳或至少相同之功效。 然而，希望右_ ^ <t 可利用之微生物細胞製劑，其在失活 後具有改善的或新的健康益處。 免疫防禦受招可^ t ^ / -又扣'對個體之健康及狀態造成許多負面影 148205.doc 201103552 響。其可例如4致感染風險增加及/或嚴重程度提 高。其亦可能促進或加重與免疫缺陷相關之病症，或導致 過敏。 因此，加強免疫防禦對所有年齡層之所有個體保護身體 具有重要性。特定言之，其對免疫系統受損或暫時受抑制 之個體重要，諸如對新生兒、老年人、高壓力狀態下之個 體、服用免疫抑制藥物之患者、接受輻射療法或化學療法 之患者，或發展出過敏性疾病之個體。 對抗感染及免疫缺陷相關之疾病之天然防紫尤其意指， 宿主可以建立高效且快速之先天免疫防禦，其包括使例如 活化巨喔細胞及自然殺手細胞β此外，高效免疫防禦亦指 宿主能夠向下調節諸如發生於過敏時之過度活化之免疫系 統。 因應病原體之胞嗤作用的巨噬細胞之殺傷活性通常伴隨 諸如TNF-α、IL-6、IL-1、及IL-12之促發炎性細胞激素瞬 時力口強（Shoda，L，，等人.，2000，Infection and Immunity 68 : 5139-5 145) »由包括巨噬細胞之抗原呈現細胞所產生之IL_ 12活化天然殺手細胞，產生iFN-γ，並透過使可產生IFN-γ 之T助手細胞分化，促進後天免疫反應之發展。此外，參 與自體分泌環路之TNF-ct及IFN-γ激發胞噬細胞之殺傷活性 (Soehnlein, 〇·，等人.，2008, Journal of Clinical Investigation 1 18 : 3491-3502)。相反，由許多類型之免疫 細胞所產生之IL-10抑制巨噬細胞及樹突狀細胞產生諸如 IL-1、IL-6、IL12及TNF-α之促發炎性細胞激素（Mosser， 148205.doc -6· 201103552 D.、及 Zhang，X.，2008，Immunological Revievis 226 : 205-218)。已知特定之活益生菌菌株可於活體外激發諸如IL-12 及TNF-α之促發炎性細胞激素，此與大鼠腹腔之巨噬細胞 # 之胞嗡活性加強有關（Ishida-Fujii，K.，2007，Biosc.
Biotechnol. Biochem 71 ： 866-873) 〇 已報導人類（健康成人及老年人）食用活益生菌或含有益 生菌之食品可加強巨噬細胞之胞噬活性及/或自然殺手細 胞之殺傷活性，此說明有些活益生菌菌株具有加強免疫之 功效（Sheih，Y-H.，等人.，2001，J Ameriacn College Nutrition 20 : 149-156 ; Chiang, B.，等人·，2000, European J Clinical Nutrition 54: 849-855 ; Parra，M.，等人.，2004，J Physiol
Biochem 60 : 85-92 ; Nagao，F.，等人，2000，Bi〇sc Biotechnol Biochen 64 : 2706-2708) ° 然而，相關技術中仍然需要含有對宿主之免疫系統具有 有益功效之益生菌的微生物細胞製劑，其中該等細胞製劑 僅當在不允許微生物細胞複製及/或保持存活之條件下處 理時才發揮有益功效，或在該等條件下功效特別佳。 因此，本發明之標的為進一步改善相關技術，並提供一 . 種微生物細胞製劑，其在某些條件下可對宿主之免疫系統 - 顯示出新穎或改善之有益效應’在該等條件下，微生物細 胞係在不允許其複製及/或保持存活的方式下處理。 、 獨立專利申請範圍之主題可解決該標的。附屬專利申請 範圍進一步發展本發明。 月 先前技術通常教示··熱處理益生菌導致其有益健康性能 ϊ £ 148205.doc - 201103552 部份或完全喪失。僅於例外之案例中，其會保留一些所測 °式之健康益處（Verdu 等人.，2004，Gastroenterology, 127，1〇 第 826 頁及其下，Rousseaux，2〇〇7，Nature Medicine, 13，第 35頁及其下；Kamiya等人，2〇〇6，〇ut，55，第ι91頁及其 下）。 現在，本發明驚奇發現，益生菌菌株可在經熱處理之 後’加強激發例如人類細胞產生促發炎性細胞激素之能 力。已在一些乳桿菌、雙叉桿菌中觀察到此效應。 非複製性益生菌微生物具有優勢：其比其活的對應物更 易處理。此外，其具有更高之貯藏安定性，且所需要之嚴 格封裝條件更少。 非複製性益生菌微生物允許發展出許多種功能食品，該 等食。〇之性質原本不允許在無其他保護措施之情形下添加 活益生菌。其可在例如榖片棒' 果汁、UHT-飲料、貯存安 疋性食品中發揮作用。 此外，於免疫受損之消費者中，活益生菌的使用可能受 到限制，此係因為有可能發展出菌血症之風險。於本發明 中本發明者提供一種方法，其提出一種具有於活體外加 強免疫之性能的非活的細菌，而不受其原先之免疫性能影 響。可提供一種在活菌時不具有加強免疫性能的細菌，其 具有改善的加強免疫性能。 此外，所提供含非複製性益生菌微生物之食品可以讓例 如粉末狀營養組合物進行熱復水。 因此，現在可能產生一種非複製性益生菌微生物，其加 148205.doc 201103552 強免疫防禦之功效比其活的對應物更強。 雖然先前技術通常教示，經熱處理後呈非複製性之細菌 在發揮其益生菌性能上通常比活細胞低效，但本發明者能 夠證實，經熱處理之益生菌比其活的對應物更能激發免疫 系統。 【發明内容】 口此本發明係關於一種包括益生菌之組合物，該等益 生菌經過至少約7(TC下熱處理至少約3分鐘後，而呈非複 製性。 本發明亦關於一種包括益生菌之組合物，該等益生菌經 過至少約70°c下熱處理至少約3分鐘後，而呈非複製性， 該組合物係用於治療或預防與免疫防紫受損相關之疾病。 本發明係關於一種以經過至少約7(rc下熱處理至少約3 分鐘後呈非複製性之益生菌於製備組合物上之用途，以用 於治療或預防與免疫防禦受損相關之疾病。 【實施方式】 因此，本發明之非複製性益生菌可用於製備一種用於加 強免疫防禦之組合物。 「非複製性」意指由傳統細胞塗佈法測得，無存活細胞 及/或菌洛形成早位。該等傳統細胞塗佈法概述於微生物 # t # t ： James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A -den. 2005· Modern f〇〇d如⑽心㈣第7版，响咖
Science，NewYork，N.Y.79〇p。通常，可由如下現象顯示
不存在存活細胞：接種不同，、普痒4 A 设裡小丨J，辰度之細菌製劑（「非複製 148205.doc 201103552 性」樣本），並於適宜條件下培養（於有氧及/或無氧氛圍下 培養至少24 h)之後，於瓊脂盤中無可見菌落，或於液體生 長培養基中渾濁度不增加。 例如，可藉由熱處理，特定言之低溫/長時熱處理，使 雙叉桿菌（諸如長雙叉桿菌（Bifidobacterium longum)、乳雙 叉桿菌（Bifidobacterium . lactis)及短型雙叉桿菌 (Bifidobacterium breve))或乳桿菌（諸如副乾絡乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)或鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus rhamnosus))呈非複製性。 至少95重量％，較佳至少97.5重量％，更佳至少99重量％ 之益生菌生質呈非複製性，且最佳所有益生菌均呈非複製 性。 藉由熱處理使益生菌呈非複製性。可於約70至150°C之 溫度範圍内，熱處理約3分鐘至2小時，較佳於80至140°C 之範圍内，熱處理5分鐘至40分鐘。 如熟習此項技術者咸暸解，熱處理時間越長及/或溫度 越高，被破壞及/或釋放之細菌細胞或細菌性化合物更 多。 益生菌係可由以下組成之群中選出：乳桿菌種屬，雙叉 桿菌種屬或其組合，諸如物種副乾酪乳桿菌、鼠李糖乳酸 桿菌、長雙叉桿菌、乳雙叉桿菌、短型雙叉桿菌或其組 合，例如菌株副乾酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳酸桿菌 NCC4007、長雙叉桿菌NCC3001、乳雙叉桿菌NCC2818、 短型雙叉桿菌NCC2950或其組合。 148205.doc -10- 201103552 長雙叉桿菌NCC3001係依布達佩斯條約，以ATCC BAA-999 寄存 ，且可 例如以 商品名 BB536獲自 曰本森 永乳業 (Morinaga Milk Industry)有限公司。 乳雙叉桿菌NC02818係依布達佩斯條約，以CNCM I-3446寄存。 鼠李糖乳酸桿菌NCC4007係依布達佩斯條約，以 CGMCC 1.3724 寄存。 副乾酪乳桿菌NCC2461係依布達佩斯條約，以CNCM I-2116寄存。 短型雙叉桿菌NCC2950(A菌株）係依布達佩斯條約，以 CNCM 1-3865 寄存。 藉由活體外之免疫特性證實非複製性益生菌之加強免疫 之功效。所採用之活體外模型使用獲自人類周邊血液單核 細胞（PBMC)之細胞激素特性，且係相關技術中廣泛接受 用於測試免疫調節性化合物之標準模型（Schultz等人.， 2003, Journal of Dairy Research 70，165-173 ; Taylor等人.， 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-123 5 ； Kekkonen等人.，2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203) 〇 已有許多作者/研究團隊採用活體外PBMC分析，例如根 據其免疫特性（亦即其抗-或促-發炎特性）將益生菌分類 (Kekkonen等人.，2008，World Journal of Gastroenterology, 14，1192-1203)。例如，已顯示：在小鼠結腸炎模型中， 該分析可預測候選益生菌之抗-發炎功效（Foligne, B.,等 148205.doc 11 201103552 人·，2007，World J. Gastroenterol. 13 : 236-243)。此夕卜，該 分析法通常作為臨床試驗之讀數，且顯示可產生與臨床結 果相一致之結果（Schultz 等人，2003, Journal of Dairy Research 70，165-13 ; Taylor 等人·，2006，Clinical and Experimental Allergy, 36，1227-1235)。 在過去幾十年中，過敏性疾病逐步增加，且被WHO認定 係當前之流行病。通常認為過敏之原因為免疫系統中Thl 與Th2反應之間失去平衡，導致過度偏向產生Th2介體。因 此，可藉由恢復免疫系統之Thl與Th2之間的適宜平衡’而 減輕、向下調節或預防過敏。其意指：必須減少Th2反應 或至少暫時加強Thl反應。後.者可為免疫加強反應之特 性，並通常伴隨例如高含量之IFNY、TNF_a及1L·12。 (Kekkonen等人.，2008, World Journal of Gastroenterology, 14，1192-1203 ; Viljanen M.等人.，2005，Allergy, 60，494-500)。 本發明可治療或預防與免疫防禦受損相關之疾病。 因此，使用本發明所製得組合物可治療或預防之與免疫 防禦受損相關之疾病沒有特別限制° 例如’其可自以下組成之群中選出：感染’特定言之細 菌、病毒、真菌及/或寄生蟲感染；吞噬細胞功能缺陷； 低度至重度免疫抑制（諸如由塵力或免疫抑制藥物、化學 療法或輻射療法所誘發者）；夭然狀癌下之免疫能力較弱 之免疫系統（諸如新生兒或老年人之免疫系統）；過敏；及 其組合。 148205.doc -12- 201103552 ;本發明中閨述之組合物亦加強個體對疫苗，特定言之 口服疫苗之反應。 同樣地，#田士 & 之用本發明所製得組合物之種類沒有特別限 制。例如，盆'ΰΓ ϋ ^ 馬W樂組合物、營養藥劑、食品添加劑、 寵物食品、食品或飲料。 毛月、’且σ物可為任—種類之組合物。該組合物之投與 方式可為例如經口、經腸、非經腸（經皮下或經肌内）、經 外部或經眼投與。 &例如’其可為自以下組成之群中選出的組合物：食物組 °物、食品（包括窥物食品）、飲料 '營養調配物、餵養調 配物S養藥劑、食品添加劑、醫藥組合物、化妝品組合 物、及藥物。 /食扣添加劑或藥物可呈例如錠劑、膠囊、藥丸或液體之 形式4等組合物可進一步含有保護性水膠體(諸如膠 f、蛋白質、改質殿粉）、枯合劑、成膜劑、囊封劑/材 料、外壁/殼材料、基質化合物、包衣、乳化劑' 界面活 ^丨增♦劑（油、脂肪、蠟、卵磷脂等）、吸附劑、載 d填充劑、共化合物、分散劑、濕潤劑、加工助劑(溶 ⑴增机劑、口味掩盍劑、增重劑、膠凝劑、形成凝膠 劑、抗氧化劑及抗微生物劑。其亦可含有常用醫藥添加劑 及佐劑、賦形劑及稀釋劑，包括但不限於水、任一來源之 明膠、植物膠質、木質素磺竣鹽、滑石、糖、澱粉、阿拉 伯膠植物油、聚烧基二醇、調味劑、防腐劍、安定劑、 乳化劑、緩衝劑、潤滑劑、著色劑、濕潤劑、填充劑、 148205.doc -13- 201103552 等。 此外，根據諸如USRDA之政府機關之建議，料組合物 可含有適於經口、經舌下、經外部、經眼、經腸或非經腸 (例如經皮下、經肌内)投與之有機或無機載劑材料、及維 生素、微量礦物質元素及其他微量營養素。 取決於本發明組合物之目標用途，組合物可進一步包括 、藥劑例如’可使用緩解疼痛或發燒之藥劑，以使與 免疫防禦弱化相關之疾病所引起之不舒適感降至最低。 可添加安定劑，使組合物及其成份安定。 可添加調味劑及/或著色劑，以調整口味及賦予組合物 顏色，使得其易於鑑別及/或易於接受。 乂可添加益菌素。益菌素可支持益生菌在變成非複製性之 前生長，或在消化日夺，刺激腸冑中之有益微生物生長。益 菌素亦可與存在於組合⑯中及/或可能添加之活益生菌協 同作用。 益菌素」意指不可消化但可促進腸道中有益健康之微 生物及/或益生菌生長之食物β其不會在攝人該食物之個 體的胃及/或小腸上部中分解且/或不會在其GI道中吸收， 但是會由胃腸道細菌及/或由益生菌發酵。益菌素為例 如，如 Glenn R. Gibson 及 Marcel B R〇berfr〇id，Dietary
Modulation of the Human Colonic Micr〇biota ： Introducing the Concept of Prebiotics，J. Nutr· 1995 125 : 14〇11412 中 所定義。 根據本發明可使用之益菌素沒有特別限制，且其包括可 148205.doc -14- 201103552 促進腸道中之益生菌及/或有益健康之細菌生長的所有食 物物質。其較佳自以下組成之群中選出：寡糖、視需要： 括果糖、半乳糖、甘露糖；腾食纖維，特定言之可溶性= 維、大旦纖維；菊糖；或其混合物。較佳之益菌 / 糖叫半乳寡糖(GOS)、異麥芽寡糖(IM〇);木寡： (xos)、阿拉伯-木寡糖（AX0S)、甘露寡糖（m〇s)、大 糖、糖基簾糖類寡糖⑽）、乳果寡糖（LS)、乳糖（la) 麥芽酮寡糖（palatinose_oligosaccharides(pA〇))、麥芽寡 糖、膠質及/或水解物、果膠、殿粉及/或其水解物。夕春 可與本發明中所述之非複製性益生菌—起使用所有益生 性微生物。該種所添加之益生菌較佳可自以下組成之群令 選出：雙叉桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、鍵 球菌屬、丙酸桿菌屬、小球菌屬、大腸桿菌、酵母菌屬、 克魯維酵母屬（KlUyveromyces)、釀酒酵母屬、裂殖酵母 屬、結合酵母屬、耶羅威亞酵母屬（Yarr〇wia)、念珠菌 屬，特疋έ之，自以下物種所組成之群中選出：長雙又桿 菌、乳雙叉桿菌、動物雙叉桿菌（Bificl〇bacterium animalis)、短型雙叉桿菌、嬰兒雙又桿菌（Bifid〇bacterium infantis)、雙岐雙叉桿菌（Bifid〇bacterium碰如⑷、青少 年又叉才干讀（Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸性乳桿菌 (Lactobacillus acid〇philus)、凱氏乳桿菌（Lact〇bacilIus casei)、副乾酪乳桿菌、唾液乳桿菌（Lact〇bacii.ius salivarius)、胚芽乳桿菌（LactobaciUus piantarum)、發酵乳 桿菌（Lactobacillus fermentum)、約氏乳桿菌（Lactobacillus S 1 148205.doc -15- 201103552 johnsonii)、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)、加氏乳 桿菌（Lacotbacillus gasseri)、鼠李糖乳酸桿菌、乳球菌 屬，諸如雷特氏乳球菌、乳酪明串珠菌（Lactococcus cremoris)、二丁酮乳球菌（Lactococcus diacetylactis)、原 腸球菌（Enterococcus faecium)、糞腸球菌（Enterococcus faecalis)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、保拉第酵 母菌（Saccharomyces boulardii)、裂殖酵母菌 (Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母菌 (Kluyveromyces lactis)、解脂耶羅威亞酵母菌（Yarrowia lypolitica)或其混合物，較佳係自以下組成之群中選出： 約氏乳桿菌（NCC533 ; CNCM 1-1225)、長雙叉桿菌 (NCC490 ; CNCM 1-2170)、長雙又桿菌（NCC2705 ; CNCM 1-2618)、長雙叉桿菌（NCC3001 ; ATCC BAA-999)、乳雙 叉桿菌（NCC2818 ; CNCM 1-3446)、短型雙叉桿菌 (NCC2950)、副乾酪乳桿菌（NCC2461 ; CNCM 1-2116)、鼠 李糖乳酸桿菌GG (ATCC53103)、鼠李糖乳酸桿菌 LPR(NCC4007 ; CGMCC 1.3724)、糞腸球菌 SF 68 (NCIMB10415)及其混合物。所有該等益生菌均可呈活菌 或呈非複製形式添加。 使用本發明製得之組合物可設計用於任一種哺乳動物， 但較佳設計用於人類或寵物。 例如，其可設計用於免疫系統弱化或暫時受抑制之個體 (諸如新生兒、老年人）、處於高壓力環境中之個體、服用 免疫抑制性藥物之患者、接受放射療法或化學療法之患 148205.doc 201103552 者0 本發明組合物亦可與疫苗共同投與，以加強疫苗之功 效共同投與包括自疫苗療程之前3個月、疫苗療程期 間至疫苗療程之後2個月，經相同或不同途徑投與。 、所技與本發明組合物之數量足以至少部份治療與疾病、 感染及其病理效應相關之免疫缺陷。將足以達成此目的之 數里定義》「治療有效劑量」。可有效達成此目的之數量 取決於热習此項技術者所知之—些因素，諸如疾病之性質 及嚴重程度、患者之體重及一般狀態、及所採用之特定益 生菌菌株。 i 於預防應用時’向易於或者處於發展免疫疾病或感染風 險中之患者投與數量足以至少部份降低發展免疫疾病之風 險的根據本發明組合物。定義該數量&「預防有效劑 量」。同樣，精確之數量取決於數種疾病及患者之特定= 素’諸如患者之健康狀態及體重、及所㈣之細_菌株的 種類。 彼等熟習此項技術；#能夠豸當調I治療有效劑量及/ 預防有效劑量。 本發明組合物通常包括治療有效劑量及/或預防有效 量之非複製性益生菌。 治療有效劑量及/或預防有效劑量通常係指每份日劑 中之細菌質量，其相當於約1〇4至1〇12 cfu。因此，治療; 效及/或預防有效劑量可為每份曰劑量含約〇 〇〇5 mg非複製性益生菌。 148205.doc 201103552 於數量數值之術語令，非複製性益生菌在組合物中之含 置相當於每公克乾組合物中含1〇2至1〇12 cfu。顯然，非複 製性細菌不會形成菌落；因此，該術語應理解為、獲自1二 至1〇12efu/g複製性細菌之非複製性細菌之數量。A包括失 活或死亡或呈諸如DNA、細胞質内容物或細胞壁=之片 段的細菌。換言之’組合物所含之細菌數量係以相同數量 細菌的菌落形成能力表示，其假定所有細 管其事實上係呈非複製性，諸如失活或死亡、經片段= 忒等狀態中之任一種之混合或所有該等狀態。 益生菌含量較佳等價於每公克乾組合物中含iq4至…❶ cfu’更佳等價於每公克乾組合物中含1〇5至1〇9也。 本發明亦包括所有認為係、日常飲食所必須的維生素及礦 物貝，且係呈營養上顯著量。已择定某些維生素及礦物質 之最少需求量。視需要存在於組合物中之礦物質、維生素 及其他營養素之實例包括維生素A、維生㈣、維生素 以、維生細、維生素B12'維生素£、維生素κ、維生素 C、維生素D、葉酸、肌醇、菸鹼酸、生物素、泛酸、膽 驗m、鐵、鎮、銅、鋅、猛、氣、舒、鈉； 西鉻、鉬、牛續酸、及L_肉驗。礦物質通常係呈鹽形式 :加。所存在之特定鑛物質及其他維生素及其數量將取決 於目標消費者。 ^明組合物可包括至少—種蛋白質源’至少一種碳水 化口物源，及至少一種脂質源。 了使用適宜之任一膳食蛋白哲,, 贫蛋白質，例如動物蛋白質（諸如 148205.doc 201103552 奶蛋白質、肉蛋白質、及卵蛋白質）；植物蛋白質（諸如大 豆蛋白質、小麥蛋白質、米蛋白質、及豌豆蛋白質）；該 等蛋白質之部份或完全水解物、游離胺基酸之混合物；及 其組合。若需要經水解之蛋白質，可依需要及如技術中已 知者進行水解製程。以諸如酪蛋白及乳清之奶蛋白、及大 豆蛋白特別佳。當提及乳清蛋白質時，蛋白質源可以酸乳 /月或甜乳清或其混合物為基質，且可包括呈任一所需比例 之α-乳白蛋白及卜乳球蛋白。然而’特定言之，若組合物 為一種餵養嬰兒之調配物，該蛋白質源較佳係以經改質之 甜乳清為基底。 若本發明組合物包括蛋白質源，則組合物中蛋白質或蛋 白質等價物含量通常為每100 kcal組合物中含1.6-7.5 g。 特別對於營養調配物，蛋白質源應保證滿足必需胺基酸 之最少需求量。 若組合物包括碳水化合物源，並不特別限制所使用之碳 水化合物之種類。可使用適宜之任一碳水化合物，例如蔗 糖、乳糖 '葡萄糖、果糖、玉米糠漿固體、麥芽糊精、澱 粉及其混合物。可使用不同碳水化合物源之組合。碳水化 合物較佳可提供組合物能量之30%至80%。例如，组合物 之碳水化合物源含量可為每1 〇〇 kcal組合物中含9-18 g。 若組合物包括脂質源，並不特別限制所採用之脂質之種 類。若組合物包括脂質源，該脂質源可提供組合物能量之 50/〇至70。/。。可添加諸如DHA ' ARA及/或EPA之長鏈n-3及/ 或n-6多不飽和脂肪酸。使用菜籽油、玉米油、高油酸葵 148205.doc -19- 201103552 *、、及中鏈長之二酸甘油酯油的摻合物，可獲得適宜之 月曰肪特丨生。組合物之脂質源含量可為每100 kcal組合物中 含 1.5-7 g 〇 亦可添加腾食纖維。其可溶解或不可溶解，且通常以該 等兩種_之摻合物.較佳。適宜之膳食纖料包括大豆、 ，豆、燕#、果夥、瓜耳豆膠、阿拉伯膠、果寡糖、半乳 寡糖f液酸-乳糖及獲自動物奶類之寡糖。較佳之纖維 摻合物為菊糖與較短鏈之果寡糖之混合物。 根據本發明之食品包括飲料，特定言之以奶或優路乳為 基底之飲料m ’諸如優赂乳、冰㈣、或以乳絡為 基底之產品；水果汁及飲料；營養調配物，諸如例如為嬰 兒兒里、月少年、成人、老年人或患重病之個體補充營 養之調配物’穀片及穀片棒；以奶為基底之粉末、用於溶 解於例如水性或以奶為基底之液體、咖啡、奶精、湯、抹 醬中的粉末。 本發明組合物包括非複製性益生菌。 非複製性益生菌可自以下所組成之群中選出：乳桿菌 屬、雙叉桿菌屬、及其組合，諸如物種副乾酪乳桿菌、鼠 李糖乳酸桿菌、長雙叉桿菌、乳雙又桿菌、短型雙又桿菌 及其組合’例如菌株副乾酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳酉 桿菌NCC4007、長雙叉桿菌NCC3001、乳雔5 4曰 又人才干菌 NCC2818、短型雙叉桿菌NCC2950及其組合。 可藉由熱處理使益生菌呈非複製性，例如於約7〇至 15 0 C之溫度乾圍内熱處理約3分鐘至2小時，較佳於$ 〇 148205.doc -20- 201103552 l4〇eC之範圍内熱處理5分鐘至40分鐘。 可藉由技術中已知之任一方法製得該組合物。例如，若 組合物為營養調配物（諸如餵食嬰兒之調配物），其製備方 法可為：依適宜比例摻合蛋白質源、碳水化合物源、及脂 肪源。若採用該種方法，可於摻合物中添加乳化劑。可於 此時添加維生素及礦物質，但通常稍後添加，以避免熱降 解。可在摻合之前，们壬-親脂性維生素、乳化劑等雜 於脂肪源中。隨後可混合入水（較佳為已經過逆渗透之 水），形成液態混合物。 ' 隨後可熱處理液態混合物，以減少細菌含量。例如，可 快速將液態混合物加熱至約7〇至15〇t範園内之严产，並 保持約3分鐘至2小時’較佳加熱至8〇至14〇。。範二：並 保分鐘至40分鐘。進行方式可為注射蒸汽或藉由熱交 換器，例如平板熱交換器β 隨後可例如藉由快速冷卻，將液態混合物冷卻至約60t: 虜C。隨後可將均質化之混合物進一步冷卻，以添加任 一熱敏感性組分，諸如維生素及礦物質。 通常於此時校正均質化混合物之pH及固形物含量。將均 質化混合物轉移至適宜之乾燥儀器，諸如喷霧乾燥機、冷 束乾燥機、或滾筒㈣劑，並轉化絲末。粉末之含水量 應少於約5重量％。 可根據相關技術中已知之任一種適宜方法培養益生菌 並例如藉由冷凍乾燥或喷霧乾燥，添加至營養組合物。^ 後’可在熱處理組合物以減少細菌含量之前，將益生❼ 148205.doc -21- 201103552 加至組合物中。其自動會使得益生菌呈非複製性。 通常’使用非複製性益生菌具有以下優勢：可在熱處理 步驟（例如殺菌步驟）之前，方便將細菌添加至任一組合物 中。可藉由溫和熱處理較長時間完成該種殺菌法。依此方 式，可避免必須在加熱步驟之後再將細菌組分添加至產 品，使得（同時）節省—個製造步驟，並降低加熱步驟之後 被細菌污染之風險。 或者，當然亦可獨立熱處理該等益生菌，且隨後作為非 複製性益生菌添加至組合物。含可遞送健康益處的非複製 性益生菌之添加劑亦容許讓食物組合物粉末進行熱復水。 若將向組合物另外添加任一益生菌，可根據任一適宜方 法培養所選之盈生菌，並藉由例如凍乾術或喷霧乾燥術製 備’以用於添加至組合物。或者，可自專業供應商獲得已 製備成適於添加至食品之形式的細菌製劑。 本毛明者首次於本文中闡述一種提高益生菌於治療或預 防與免疫缺陷相關之疾病上的功效的方法。本方法包括藉 由熱處理，使至少一部份益生菌呈非複製性。 本發明之一項實施例因此係一種提高益生菌功效的方 法忒等益生菌係自以下組成之群中選出··乳桿菌屬、雙 叉桿菌屬及其組合，諸如物種副祕乳桿菌、鼠李糖乳= 柃菌I雙叉桿菌、乳雙叉桿菌、短型雙又桿菌及其組 合’例如®株副乾酿乳桿菌NCC2461、I李糖乳酸桿菌 NCC4007、長雙叉桿菌NcC3〇〇1、乳雙又桿菌敗咖卜 短型雙叉桿HNCC295G及其級合，以在投與之後治療或預 148205.doc •22· 201103552 防與免疫防禦受損相關 步驟，使得至少-部份兴生菌…方法包括處理益生菌之 非複製性。 卩^ “⑼如雙叉桿m桿菌）呈 :處！法可為在投與之前熱處理，例如於約7〇,15(rc 之狐度靶圍内熱處理約3分 ^ r ^ 里主2小時，杈佳於80至i4〇t 之範圍内熱處理約5分鐘至4〇分鐘。 該處理法（例如熱處理益生菌）可導致至少95%,較佳至 :践，更佳至少㈣，最佳所有之益生菌呈非複製 /發明方法可用於提高益生菌於治療或預防與免疫防紫 受損相關之病症上的功效。 :了改善細菌製劑之安定性及口味，可在攝入該組合物 之前’將非複製性益生菌添加至計晝食用之組合物。依此 方式，可攝入包括非複製性益生菌之組合物，並可使用該 組合物之其他組分，使得該組合物適於其目的。 或者，該方法可包括添加活益生菌至組合物之步驟，且 隨後在投與之前處理含有益生菌之組合物，以使至少一部 份益生菌呈非複製性。 彼等熟習此項技術者應瞭解，在不脫離所揭示之本發明 之範圍下，可自由組合文中所述之本發明之所有特徵。特 定言之，所闡述之關於本發明用途之特徵可應用於本發明 之組合物及方法，反之亦然。 自以下實例及圖示可瞭解本發明之其他優勢及特徵。 圖1顯示在活體外，在經過熱處理之細菌激發後，人類 148205.doc •23· 201103552 PBMC分泌之細胞激素增加。 圖2顯示，於接受生理食鹽水攻毒之對OVA敏感之小鼠 (負對照）、接受OVA攻毒之對OVA敏感之小鼠（正對照）及 接受OVA及經熱處理之活的短型雙叉桿菌NCC2950攻毒之 對OVA敏感之小鼠中所觀察到之腹瀉強度百分比。結果以 腹瀉強度百分比（自4組獨立實驗計算之平均值士SEM)表 示，且以正對照（經過敏原致敏及攻毒）組中所發展出之症 狀相當於100%之腹瀉強度。 實例： 方法 細菌製備法： 使用五種益生菌菌株用於研究非複製性益生菌加強免疫 之性能：3種雙叉桿菌（長雙叉桿菌NCC3 001、乳雙叉桿菌 NCC2818、短型雙叉桿菌NCC2950)及2種乳桿菌（副乾酪乳 桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。 於37°C下，依批次發酵之方式使細菌細胞於MRS上生長 16至18 h，且不控制pH。將細菌細胞離心（5,000 X g， 4°C )，並再懸浮於磷酸鹽缓衝生理食鹽水中，隨後稀釋於 生理食鹽水中，以使最終濃度為約101Q cfu/ml。於水浴 中，在85°C下熱處理以下四種菌20 min :長雙叉桿菌 NCC3001、乳雙叉桿菌NCC2818、副乾酪乳桿菌 NCC2461 '鼠李糖乳桿菌NCC4007。於水浴中，在90°C下 熱處理短型乳桿菌NCC2950 30分鐘。將經熱處理之細菌懸 浮液分成等份，並於-8〇°C下冷凍保存，直至使用。於 148205.doc -24· 201103552 PBS·甘油15¼中，於-80°C下貯存活的細菌，直至使用。 細菌製劑之活體外免疫特性 分析活的及經熱處理之細菌製劑的免疫特性（亦即於活 體外誘發人類血液細胞分泌特定細胞激素之能力）。自血 液濾器分離出人類周邊血液單核細胞（PBMC)。經細胞密 度梯度分離之後，收集單核細胞’並以Hank平衡鹽溶液洗 滌兩次。隨後使細胞再懸浮於補充有1 〇%胎牛血清（法國巴 黎Bioconcept)、1% L-縠胺醢胺（Sigma)、1%青黴素/鏈黴 素（31经11^)及0.1%健大霉素（呂6111&111)^11)(81§111&)之18〇〇\^經 改質之Dulbecco培養基（IMDM，Sigma)中。隨後，於48孔 分析板中，由活菌及經熱處理之細菌（當量7xl06 cfu/孔）與 PBMC(7xl05個細胞/孔）一起培養36小時。於分至兩個分開 的實驗中之8名供體的PBMC上測試活菌及經熱處理的細菌 的功效。在培養36 h之後，冷凍培養平板，並保存於-20°C 下，直至測定細胞激素。平行分析活細菌及其經熱處理之 對應物的細胞激素特性（亦即在同一實驗中，針對同一批 次 PBMC)。 在培養36 h之後，根據製造商之說明，藉由ELISA(R&D DuoSet 人類 IL-10、BD OptElA 人類 IL12p40、BD OptElA 人 類TNF、BD OptElA人類IFN-γ)測定細胞培養物上清液中 之細胞激素（IFN-γ、IL-12p40、TNF-α 及 IL-10)含量。IFN-γ、IL-12p40及TNF-a為促發炎性細胞激素，而IL-10為強 力消炎介體。結果以4名供體之平均值（pg/ml) +/- SEM表 示，且代表兩次分別在4名供體中進行之實驗。 148205.doc -25- 201103552 活菌及經熱處理之短型雙叉桿菌NCC2950預防過敏性腹填 之活體内功效 採用小鼠過敏性腹瀉模型測試短型雙叉桿菌 NCC2950(Brandt E.B 等人.JCI 2003 ; 112(11) : 1666-1667) 之促進Thl之功效。經致敏之後（間隔14天’ 2次經腹膜内 注射卵蛋白（OVA)及硫酸鋁鉀；第〇天及第14天）’以0VA 經口攻毒雄性Balb/c小鼠6次（第27、29、32、34、36、39 天），導致產生暫時臨床症狀（腹瀉），且免疫參數（總IgE、 OVA特異性igE、小鼠肥大細胞蛋白酶1，亦即MMCP-1之 血漿濃度）變化。於以OVA致敏之前4天（第-3、-2、-1、〇 天，及第11、12、13及14天），及於攻毒期間（第23至39 天），經胃管投與活菌及已於90。(：下處理30分鐘之短型雙 叉桿菌NCC2950。採用含約1〇9菌落形成單位（Cfu)或當量 cfu/小鼠之曰細菌劑量。 結果 經熱處理之後會誘發「促發炎」細胞激素之分泌 於活體外，測量經熱處理之細菌菌株激發人類周邊血液 單核細胞（PBMC)分泌細胞激素之能力。於同一個活體外 分析中，比較PBMC在受到經過熱處理之細菌激發時之四 種細胞激素的免疫曲線，及PBMC受到活細菌細胞誘發時 之免疫曲線》 將經熱處理之製劑塗佈及分析是否存在任一活菌叶數。 在塗佈後，經熱處理之細菌製劑不產生菌落。 當與人類PBMC—起培養時，活益生菌 町 直玍圏誘發出不同且隨 I48205.doc -26 - 201103552 菌株變化之細胞激素產量（圖1)。對比於其活菌對應物，熱 處理益生菌改變PBMC所產生之細胞激素含量。較之對應 之活細胞，經熱處理之細菌誘發出更多促發炎激素（TNF_ α、IFN-γ、IL]2p4〇)。反之，經熱處理之細菌所誘發之 IL-1〇量類似或低於活細胞（圖丨）。該等數據顯示，經熱處 理之細菌激發免疫系統之能力比其活的對應物更強，且因 此更能加強已弱化之免疫防禦能力。換言之，該活體外數 據說明：經熱處理之後，細菌菌株加強免疫的功效提高。 爲了說明短型乳桿菌NCC2950在經熱處理後對免疫系統 之功效提高（相對於活細胞）’在動物過敏性腹瀉模型中同 時測試活菌及經熱處理之短型乳桿菌NCC2950。 相較於正對照組’在接受經熱處理之短型乳桿菌 NCC2950處理之後，腹瀉強度顯著且一致地下降 (41.1%士4.8)’而在接受活的短型乳桿菌>^€2950處理之 後，腹瀉強度僅降低20±28.3%。該等結果證實：經熱處理 之短型乳桿菌NCC2950在抵抗過敏性腹瀉上，比其活菌對 應物顯示更強的保護功效（圖2)。 因此，本發明顯示：經熱處理之後，改善了益生菌加強 免疫防禦之能力。 【圖式簡單說明】 圖1顯示在活體外，在經過熱處理之細菌激發後，人類 PBMC分泌之細胞激素增加。 圖2顯示，於接受生理食鹽水攻毒之對〇VA敏感之小鼠 (負對照）：接受OVA攻毒之對OVA敏感之小鼠（正對照）及 148205.doc -27- 201103552 接受OVA及經熱處理之活的短型雙又桿菌（Bifidobacterium breve)NCC2950攻毒之對OVA敏感之小鼠中所觀察到之腹 瀉強度百分比。 148205.doc 28-